JP5940731B2

JP5940731B2 - Ｓ−アリル−ｌ−システインを有効成分として含む眼疾患予防または治療用組成物、およびこれを含む医薬製剤

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Publication number: JP5940731B2
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Description

本発明は、眼疾患予防用または治療用組成物に関する。より詳しくは、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)を有効成分として含み、眼疾患の予防または治療に有用な組成物、およびこれを用いる方法に関する。

一般に、眼の奥の網膜の中央にある網膜組織を黄斑と呼ぶが、殆どの視細胞がここに集まっている。黄斑は、物体の像が結ばれる部分の中心であるから、視力に非常に重要な役割を担っている。様々な原因により黄斑部に変性が生じて視力障害を起こす眼科疾患を黄斑変性（症）という。黄斑変性（Macular Degeneration、ＭＤ）は、緑内障、糖尿病性網膜疾患とともに三大失明疾患の一つとして知られている。

前記黄斑変性は乾性と湿性の２類型に大別される。乾性黄斑変性は、視力喪失を引き起こす主要原因となるが、乾性黄斑変性では、網膜の下にある組織が碌に機能しなくなって、徐々に、光を認知する網膜細胞の機能が低下し且つ網膜細胞が消失する。一方、湿性黄斑変性は、乾性黄斑変性よりは稀に現れるが、微細な新生血管が網膜層の下から生えてきて、これにより黄斑から出血が生じたり体液が漏れ出たりして傷跡を残す可能性がある。このような血管、出血、体液、傷跡による黄斑損傷は、短い期間の間発生して突然の視力低下を引き起こすことがあり、時間が経つほど視力が急激に低下する。

加齢性黄斑変性（age-related macular degeneration、ＡＭＤ）の正確な病因は未だ明確に解明されていないが、一般に老化に伴う網膜上皮細胞(RPE cell)への色素物質の過剰蓄積が加齢性黄斑変性の初期進行段階に現れるものと知られており、全トランスレチナール(All-trans-retinal)とエタノールアミン(ethanolamine)の合成によって生成されるＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニル−エタノールアミン（Ａ２Ｅ）は、代表的に網膜上皮細胞に蓄積される物質であって、光により一重項酸素(singlet oxygen)を生成し、炭素間二重結合部位が酸化しながら網膜色素上皮細胞(RPE cell)に損傷を起こすおそれがある。

但し、前記黄斑変性のメカニズムが明確に解明されていないので、現時点では加齢性黄斑変性の完全な治療を期待することは難しい。ところが、早期に適切な措置を取ることにより、黄斑変性の進行による視力喪失を最小限に抑えることが重要である。最近、抗酸化ビタミンと亜鉛（Ｚｎ）が加齢性黄斑変性の進行を防ぐものと明らかになって治療に応用されており、新生血管が生えてくる湿性加齢黄斑変性の場合はお早めにレーザー治療を施行すると急速な悪化を防ぐことができる。しかし、これらの治療は未だ満足すべき結果を出していない。よって、加齢性黄斑変性は何よりも予防が重要であるといえる。

全体加齢性黄斑変性患者の多くを占めている萎縮性黄斑変性は網膜色素上皮細胞に沈着する脂肪褐色素のリポフスチン(lipofuscin)が密接に関連していることが多くの研究を介して明らかになっている。

網膜上皮細胞は、一生の間に日差変動によって昼間は桿体細胞、夜は錐体細胞を消化して光受容体のディスクを分解、消化し、この過程で分解されない物質をリポフスチン(lipofuscin)という。また、機能を失った隣接の網膜色素上皮と光受容体（photoreceptor）も除去しなければならないため、益々負担が増加してリポフスチンが蓄積される。リポフスチンは非分解性ビスレチノイド付加生成物(non degradable bisretinoid adduct)が主成分として知られているが、その主要生合成は次のとおりである。１）網膜に光が照射されると、一次的に光を吸収する光受容細胞(photoreceptor cell)で１１−ｃｉｓ−レチナール(11-cis-retinal)が光異性化(photoisomerization)によってその反応産物たるビタミンＡアルデヒド(vitamin A aldehyde)（全トランスレチナール）を生成する。２）こうして生成された全トランスレチナール(all-trans-retinal)は、光受容体から網膜色素上皮に転移し、一連の縮合反応を介してリポフスチン蛍光団(lipofuscin fluorophore)を生成し、生成されたリポフスチン蛍光団は、光依存性脂質過酸化反応(light-dependent lipid peroxidation)を媒介して、結果的に網膜細胞に損傷を与えて視力減少および失明を起こす。リポフスチン蛍光団(lipoiuscin fluorophore)は、特に、人体内で代謝が活発な分裂終了細胞(postmitotic cell)（心筋細胞、神経細胞、網膜上皮細胞）から主に生成されると知られている。現在まで分離されて知られているリポフスチン蛍光団(lipofuscin fluorophore)としては、Ａ２Ｅおよびその二重結合誘導体、Ｉｓｏ−Ａ２Ｅ、並びにａｔＲＡＬｄｉｍｅｒ(all-trans-retinal dimer conjugate)などがある。

これらの化合物はいずれも、視覚サイクル(visual cycle)から遊離した全トランスレチナール（all-trans-retinal、全トランス型）とホスファチジルエタノールアミン(Phosphatidyl Ethanolamine)が縮合されて生成されるＡ２ＰＥのリン酸基が加水分解されて生成されるものと明らかになった。１分子の全トランスレチナール(all-trans-retinal)がＰＥとＳｃｈｉｆｆｂａｓｅ反応によって形成されるＮＲＰＥは、光受容体特異的なＡＴＰ結合カセットトラスポーター(ATP-binding cassette transporter)であるＡＢＣＡ４の基質(substrate)であることが明らかになった。正常的な視覚サイクル(visual cycle)から離脱したＮＲＰＥに別の分子の全トランスレチナール(all-trans-retinal)が結合するときにＡ２ＰＥが生成され、これは特定の環境の下、例えば強い光や酸化的ストレスなどで促進されることが報告された(Sparrow et al, Vision Res, 2003. 43(28):2983-90)。

様々な先行研究を通じて、このように生成されるＡ２Ｅの量が年齢に応じて増加し、これらの化合物は強い光を照射されたときに一重項酸素(singlet oxygen)を媒介とする光酸化を経ることを報告した。また、光酸化によって生成されたＡ２Ｅの酸化物が加齢性黄斑変性の代表的な原因の一つとして認められている炎症反応を誘発しうる重要な因子であることを、免疫補体を用いた実験によって明らかにした。

一方、黄斑変性症の市場は医薬品と保健機能食品に大別される。現在、韓国内で加齢性黄斑変性症の治療剤として承認され市販されている医薬品は、湿性黄斑変性治療剤たるラニビズマブ（ルセンティス）(Ranibizumab(Lucentis))だけであって、乾性黄変性症の治療剤は未だない実情である。ラニビズマブ(Ranibizumab)は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦＡ）を認識して遮断する(blocking)ヒト化単クローン抗体(humanized monoclonal antibody)であって、湿性黄斑変性症の視力を回復または維持させる効果があると知られている。ところが、米国のジェネンテック社は、臨床試験を介してラニビズマブ(Ranibizumab)が脳卒中の発病リスクを高める可能性もあると警告している。また、ラニビズマブ(Ranibizumab)は、価格が高価であるうえ、眼内に注射する製剤であって投与が不便であるという欠点がある。

一方、保健機能食品分野では、個別認定型として承認されたルテイン(lutein)１件であって、非常に少ない。ルテインは、網膜の黄斑を保護する成分であって、黄斑色素密度を維持させて黄斑の変性を予防することができるが、ルテインなどのカロチノイドを含有したサプリメントを長時間使用すると、肺癌の発病リスクが高くなるという研究結果があり、特に喫煙者はさらに危険であると確認された。したがって、喫煙患者がルテイン関連製品を服用することは危険である。

この他にも、韓国食品医薬品安全庁で機能性原料として承認していないが、その効能があると報告された天然物には、ルテインの如く黄斑色素として存在するゼアキサンチン(zeaxanthin)とベリー類に含まれているアントシアニン（anthocyanin）成分などがあるが、未だ黄斑変性症関連の研究が非常に足りないことが事実であるので、高齢者だけでなく、中高年層にもわたって黄斑変性症の患者が増えている現在の社会的な現象とともに、それに対する治療法も足りない状況で、黄斑変性の予防に役立つ医薬品および保健機能食品の開発が切実に求められている。

一方、ニンニクは、ネギ属(Allium genus)の一種であって、抗細菌、抗真菌、抗酸化作用および抗癌作用があることが明らかになり(Ankri et al, Microbes Infect. 1(2), pp 125-129, 1999)、血栓症(thrombosis)、炎症(inflammation)および細胞の酸化的ストレス(oxidative stress)を防ぐものと知られて(Sener et al, Mol Nutr Food Res. 51(11), ppl345-1352, 2007)注目を受ける生薬素材である。ニンニクは、非常に多様な成分を含むが、これらの成分には、抗真菌、抗癌効果を持つエルボシド(eruboside)−Ｂなどのステロイドサポニン(Matsuura H et al, ChemPharm Bull(Tokyo), 36:3659-3663, 1988)、コレステロール低下作用を有するグリコシド分画（Slowing et al, J Nutr., 131, pp 994S-9S, 2001）、血小板凝集阻害効果を有するβ−クロロゲニン(Rahman K et al, J. Nutr. 2006)などの非硫黄化合物(nonsulfur compounds)、および様々な種類の有機硫黄化合物(organosulfur compounds)などが含まれる。この中でも、熟成したニンニクの有効成分の一つであるＳ−アリル−Ｌ−システイン（ＳＡＣ）は、抗酸化剤の役割を果たすものと知られており、このような抗酸化活性により動脈硬化にも抑制効果を示し、いくつかの癌細胞株に対しても抗癌活性(Proceedings of the American Association for Cancer Research, 30, pl81, 1989)を示すなど、様々な効能が報告された。

それだけでなく、四塩化炭素で誘導した肝損傷Ｒａｔモデルにおいて、損傷した肝細胞を回復するＳ−アリル−Ｌ−システインの有意な効果を確認することができ(チェスニョン, 2009, Effects of S-Allyl Cysteine on carbon tetrachloride- induced liver injury in rats）、ヘリコバクター・ピロリに感染したマウスからＳ−アリル−Ｌ−システインの抗保護効果があることが報告された(バンソンヒェ, 2010, Protective effect of S-allyl-L-cysteine(SAC) on Helicobacter pylori-infected mice)。

また、韓国公開特許第１０−２０１１−００３２６４１号（発明の名称：Ｓ−アリル−Ｌ−システインを有効成分として含む胃腸疾患予防または治療用組成物）では、Ｓ−アリル−Ｌ−システインがヘリコバクター菌の感染を抑制し、ヘリコバクターによる胃損傷を保護する効能が報告された。

本明細書全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準および本発明の内容がより明確に説明される。しかし、Ｓ−アリル−Ｌ−システインを用いた加齢性黄斑変性の予防および治療法については報告されていない。

そこで、本発明者は、現時点では完全な治療を期待することが難しいので、何よりも予防が重要である加齢性黄斑変性の予防および治療の改善に役立つ治療用組成物を開発するために鋭意研究努力し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)およびその薬学的に許容される塩またはその誘導体を有効成分として含む、光酸化阻害活性を示す眼疾患予防または治療用組成物を提供することにある。前記眼疾患予防または治療用組成物は、網膜色素上皮細胞内へのＡ２Ｅの蓄積を阻害し、Ａ２Ｅの酸化を抑制して病因を根本的に予防および治療することができる。
本発明の他の目的は、前記眼疾患予防または治療用組成物を用いて製造した医薬製剤を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明の一実施態様に係る眼疾患予防または治療用組成物は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-ally-L-cysteine)、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物または水和物を有効成分として含み、光酸化阻害活性を示すものである。

前記眼疾患予防または治療用組成物は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物または水和物を有効成分として含み、網膜色素上皮細胞内のＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニル−エタノールアミン（Ａ２Ｅ）の酸化を抑制するものであってもよい。
前記眼疾患は、加齢性黄斑変性または網膜変性疾患であってもよい。
前記眼疾患予防または治療用組成物は、前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインを５〜９９．９重量％で含んでもよい。

前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、ネギ属(Allium genus)植物から分離精製されたもの、合成されたもの、および発酵によって製造されたものよりなる群から選ばれたいずれか一つであってもよい。
前記眼疾患予防または治療用組成物は、抗炎症剤または抗酸化剤をさらに含んでもよい。

前記抗炎症剤は、イブプロフェン(ibuprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)、フルルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(fenoprofen)、ナプロキセン(naproxen)、ピキシカム(piroxicam)、テキノシカム(tenoxicam)、イソキシカム(isoxicam)、メロキシカム(meloxicam)、インドメタシン(indomethacin)、アセクロフェナク(aceclofenac)、ジクロフェナク(diclofenac)、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記抗酸化剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロチノイド、亜鉛、銅、鉄、マンガン、ルテイン、ゼアキサンチン、セレニウム、グルタチオン（ＧＨＳ）、リコピン(lycopene)、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであってもよい。

本発明の他の一実施態様に係る医薬製剤は、前記眼疾患予防または治療用組成物を含む、経口投与用製剤、粘膜適用製剤、注射剤、吸入剤および外用剤よりなる群から選ばれるものであってもよい。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の一実施態様に係る眼疾患予防または治療用組成物は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン（S-allyl-L-cysteine）、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物または水和物を有効成分として含み、光酸化阻害活性を示すものである。

また、前記眼疾患予防または治療用組成物は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物または水和物を有効成分として含み、網膜色素上皮細胞内のＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニル−エタノールアミン（Ａ２Ｅ）の酸化を抑制するものであってもよい。

前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、熟成したニンニクの有効成分の一つであって、このような抗酸化活性により動脈硬化に対しても抑制効果を示し、幾つかの癌細胞株に対しても抗癌活性(Proceedings of the American Association for Cancer Research, 30, pl81, 1989)を示すなど、様々な効能が報告されている。

前記薬学的に許容される塩は、所望の薬理学的効果と黄斑変性予防および治療改善効果を有する前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインの化合物の塩を示す。このような塩は酸付加塩や第４級アンモニウム塩などである。酸付加塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩およびリン酸塩などの無機酸塩、または、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩およびメタンスルホン酸塩などの有機酸塩である。また、第４級アンモニウム塩は、例えば、ヨウ化メチル、臭化メチル、ヨウ化エチル、臭化エチルなどの低級アルキルハロゲン化物；メチルメタンスルホネート、エチルメタンスルホネートなどの低級アルキルスルホネート; メチル−ｐ−トルエンスルホネートなどの低級アルキルアリールスルホネートなどの第４級アンモニウム塩でありうる。

また、Ｓ−アリル−Ｌ−システインまたはその薬学的に許容される塩は溶媒和物または水和物として存在するものもあるので、本発明の治療剤の有効成分としてはこれらの溶媒和物または水和物を用いることができる。

前記薬学的に許容される誘導体は、化合物の構造の一部を他の原子または原子団で置換して得られる化合物を意味する。例えば、メチル誘導体や塩素誘導体などがある。これは、基本構造を持っている化合物から様々な誘導体を合成することにより、元の化合物に比べてより高い薬効を持つ薬品を開発することができる。

前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインの誘導体は、前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインの化合物を用いて、当業界における通常の方法（例：Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5th ed., 1：172-178 and 949-982(1995)）によって容易に製造できる。
前記眼疾患は加齢性黄斑変性または網膜変性疾患であってもよい。

前記黄斑変性（macular degeneration、ＭＤ）は、黄斑の損傷によって中心視力が破壊される現象を意味する。前記黄斑変性疾患は、乾性黄斑変性、湿性黄斑変性、加齢性黄斑変性、近視性黄斑変性および特発性黄斑変性などを含むことができるが、好ましくは、加齢性黄斑変性(age related macular degeneration)である。特に、前記加齢性黄斑変性でより顕著な光酸化阻害活性を示した。より詳しくは、前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインの細胞保護能を評価するために、Ａ２Ｅの蓄積した網膜色素上皮細胞株（Arising retinal pigment epithelia cell line、ＡＲＰＥ−１９）から青色光によるアポトーシスを誘導した結果、Ｓ−アリル−Ｌ−システインが網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９）を濃度依存的に保護することを確認することができる。

前記眼疾患予防または治療用組成物は、前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインを５〜９９．９重量％で含むことができ、好ましくは５〜６０重量％で含む。上記の範囲による場合、網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９）を濃度依存的に保護して眼疾患予防または治療効果が高く、副作用もないという利点を持つ。
前記眼疾患予防または治療用組成物は、抗炎症剤または抗酸化剤をさらに含んでもよい。

前記抗炎症剤は、イブプロフェン(ibuprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)、フルルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(feno-profen)、ナプロキセン(naproxen)、ピキシカム(piroxicam)、テキノシカム(tenoxicam)、イソキシカム(isoxicam)、メロキシカム(meloxicam)、インドメタシン(indomethacin)、アセクロフェナク(aceclofenac)、ジクロフェナク(diclofenac)、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記抗酸化剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロチノイド、亜鉛、銅、鉄、マンガン、ルテイン、ゼアキサンチン、セレニウム、グルタチオン（ＧＨＳ）、リコピン、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであってもよい。

前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、ネギ属(Allium genus)の植物から分離精製される或いは合成されるものでありうる。より具体的に、前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、天然または合成のものを使用することができ、ヨーロッパ公開特許公報ＥＰ０４２９０８０Ａ１に開示された方法によって、ニンニク(garlic)、エレファントガーリック(elephant garlic)、タマネギ(onion)、春マネネギ(scallion)などのネギ属(Allium genus)の植物から製造でき、その他に合成、発酵など、当該技術分野における公知の様々な方法によって製造できる。それだけでなく、このような天然または合成のＳ−アリル−Ｌ−システインは、直接製造する他に、市販品が使用できる。

本発明の他の一実施態様に係る医薬製剤は、前記眼疾患予防または治療用組成物を含む経口投与用製剤、粘膜適用製剤、注射剤、吸入剤および外用剤よりなる群から選ばれるものでありうる。

前記医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含むものでありうる。前記担体は、薬学製剤の使用の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の薬学的組成物は、上記の成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬学的に許容される担体および製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences（19th ed., 1995）に詳細に記載されている。

医薬製剤は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に経口または非経口などの多様な経路で投与することができ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与することができる。好ましくは、非経口投与の中でも、経皮投与、より好ましくは塗布による局所投与（topical application）方式で適用される。

前記医薬製剤の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感応性などの要因によって多様に処方できる。本発明の薬学的組成物の投与量は、経口型剤形の場合、成人を基準に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回〜数回に分けて投与することができ、外用剤の場合には、成人を基準に１日当たり１．０〜３．０ｍＬの量を１日１回〜５回に分けて塗布することを１ヶ月以上続けることがよい。但し、前記投与量は、本発明の範囲を限定するものではない。

前記医薬製剤は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液などを含む薬学的製剤に適したいずれの形態でも使用することができ、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

本発明に係る眼疾患予防または治療用組成物は、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)を有効成分として含有することにより、網膜色素上皮細胞内へのＡ２Ｅの蓄積を阻害し、Ａ２Ｅの酸化を抑制する。従って、前記眼疾患予防または治療用組成物は、加齢性黄斑変性または網膜変性疾患を含む眼疾患に対して優れた予防または治療効果を示すことができる。
また、前記眼疾患予防または治療用組成物を含む医薬製剤は、眼疾患の予防または治療効果を奏する。

Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の光酸化抑制活性を評価したグラフである。ヒトの網膜色素上皮細胞株（ＡＰＲＥ−１９）を用いたＡ２Ｅ光酸化阻害活性を評価したグラフである。

以下、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施し得るように、本発明の実施例について詳細に説明する。ところが、本発明は、様々な互いに異なる形態で実施でき、ここで説明する実施例に限定されない。

一方、本明細書全体にわたって、特定の物質の濃度を示すために使用される「％」は、特別に言及がない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

［製造例：細胞培養］
本発明の実験および分析に使用された網膜色素上皮細胞株（Arising retinal pigment epithelia cell line、ＡＲＰＥ−１９：ＡＴＣＣｎｏ．ＣＲＬ−２３０２）は、分譲を受け（ＡＲＰＥ−１９、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ）、従来の文献に記述された方法で継代培養した(Sparrow, J. Retal., Α2Ε, a1ipofuscinfluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999, 40(12), 2988-95)。

前記培養方法を具体的に説明すると、樹立された網膜色素上皮細胞株を、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、アンフォテリシンＢが含まれている抗生剤（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）と１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）が含まれているＤＭＥＭ培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で培養した。細胞を培養皿の底に付着させた後、培養皿に細胞が満杯になると、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を含む培地で１：４の割合でトリプシン(trypsin)処理して継代培養した。
細胞を実験に使用する際には、５×１０個の細胞数で６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅに接種(seeding)して実験に使用した。

［実験例１：Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の光酸化抑制活性］
青色光によって酸化したＡ２Ｅに対するＳ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の酸化抑制能実験
青色光によって酸化したＡ２Ｅに対するＳ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の酸化抑制能を測定するために、１００μＭのΑ２ΕをＰＢＳ(phosphate buffered saline)に最終濃度が２０μＭとなるように溶解させ、９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅにそれぞれ２００μＬずつ添加した後、この溶液に陰性対照群および陽性対照群（ルテイン：２０μΜ）または所定の濃度（S-allyl-cysteine：１、１０、１００μΜ）で希釈された試料を添加した。

上述した濃度でＳ−アリル−Ｌ−システインを各ｗｅｌｌに混入し、よく混ぜられるようにピペットを用いて混合した。その後、中心波長４３０ｎｍ程度の青色光を放出するＬＥＤランプを用いて、試料の入ったマイクロプレート(microplate)に対して、Ａ２Ｅの吸光度が１／２に減るまで光酸化を誘導した。ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて、光酸化誘導前と後の吸光度を測定した。測定された吸光度値は、Ａ２Ｅ標準曲線を用いて濃度を求めた後、青色光の照射前と照射後の濃度差によって酸化Ａ２Ｅの濃度を求めた。このことから、試験試料のＡ２Ｅ光酸化阻害能は下記の計算式１に基づいて計算した。下記の計算式１において、Ａｂｓ．は吸光度(absorbance)を意味する。

［計算式１］
Ａ＝Ａｂｓ. ｏｆＡ２Ｅ−Ａｂｓ. ｏｆＡ２Ｅ＋ｂｌｕｅｌｉｇｈｔ
Ｂ＝｛Ａｂｓ. ｏｆＡ２Ｅ＋ｓａｍｐｌｅ）−Ａｂｓ. ｏｆｓａｍｐｌｅ｝−
｛（Ａｂｓ. ｏｆＡ２Ｅ＋ｓａｍｐｌｅ＋ｂｌｕｅｌｉｇｈｔ）−
（Ａｂｓ. ｏｆｓａｍｐｌｅ−Ａｂｓ. ｏｆｓａｍｐｌｅ＋ｂｌｕｅｌｉｇｈｔ）｝

［実験例２：ヒトの網膜色素上皮細胞株（ＡＰＲＥ−１９）を用いたＡ２Ｅ光酸化阻害活性の評価］
Ａ２Ｅの蓄積したヒトの網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９）における青色光によるアポトーシスに対するＳ−アリル−システイン(S-allyl-cysteine)の細胞保護能の実験

９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たりヒトの網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９）５×１０^４個ずつ分注した後、最終濃度が２０μΜとなるようにΑ２Εを処理して７日間蓄積させた。その後、陰性対照群および陽性対照群（ルテイン：２０μΜ）または所定の濃度（S-allyl-cysteine：１、１０、１００μΜ）で希釈された試料を処理し、前述のように青色光を照射した。

その後、ＭＴＴ(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)分析法を用いて細胞の生存率を測定した。このΜＴΤ分析法は、細胞の増殖を測定するための実験室試験法であって、標準比色分析法(standard colorimetric assay)といえる。一般に、血球計(hemocytometer)を用いて生存細胞数を数えたり、光学密度(optical density)を測定したりする方法が使用されるが、多量を測定するときに時間と労力が必要以上に要求されるうえ、不正確な結果をもたらすおそれがある。これを代替するために開発されたＭＴＴａｓｓａｙは、生きている細胞のミトコンドリア脱水素酵素作用(dehydrogenases)によって、黄色の水溶性基質であるＭＴＴ(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)を、紫色を帯びる非水溶性のＭＴＴホルマザン結晶(formazan crystals)に還元させるミトコンドリアの能力を利用する検査法であって、迅速かつ正確に多量の細胞増殖挙動を測定することができる。紫色結晶はＤＭＳＯジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide）に溶解し、吸光度(Optical Density)は５４０ｎｍの波長で最大となり、この波長で測定された吸光度は生きている細胞の数と直線的な相関関係を示す。すなわち、生きている細胞が多いほど、ホルマザン結晶の生成が増加して吸光度が高く測定される。

ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）分析法に基づいて、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを含むＤＭＥＭ培地を添加した後、光を遮断し、培養器(incubator)にて３７℃で２時間反応させた。反応が完了したら、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ．）２ｍＬで細胞を十分に溶かした後、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）でマイクロプレートリーダーを用いて５４０ｎｍでの吸光度を測定した後、Ａ２Ｅとサンプルの両方とも、蓄積していない群（正常対照群(normal control)）に対するパーセント（％）で細胞の生存率を示した。

結論
青色光によって酸化したＡ２Ｅに対するＳ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の酸化抑制能
本発明のＳ−アリル−Ｌ−システインのＡ２Ｅに対する酸化抑制能を確認するために、実験例１と同様の方法によって青色光を照射した後、酸化Ａ２Ｅの濃度を測定し、図１に示した。

図１に示すように、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)１、１０、１００μΜの濃度で、酸化したΑ２Εが、処理していない細胞に比べてそれぞれ２０、３２、４１％低く現れたとともに、陽性対照群であるルテインを処理した群と比較して有意性のある保護活性を示したことが分かるので、このことから、Ｓ−アリル−Ｌ−システインが濃度依存的にΑ２Εに対する酸化抑制能を示すことを確認することができた。

Ａ２Ｅの蓄積したＡＲＰＥ−１９細胞株における青色光によるアポトーシスに対するＳ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の細胞保護能

本発明のＳ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)の細胞保護能を確認するために、実験例２と同様の方法によって青色光を照射した後、ΜＴＴ分析法によって細胞のアポトーシスの程度を測定して図２に示した。

図２に示すように、Ａ２Ｅの蓄積後、青色光を照射した細胞（陰性対照群(negative control)）と陽性対照群との間には有意な差があることを確認した。

Ｓ−アリル−Ｌ−システイン(S-allyl-cysteine)１、１０、１００μΜの濃度で処理した細胞の生存率が、陰性対照群(negative control)の細胞生存率を基準にそれぞれ６３、１３４、１６７％高く現れることにより、Ｓ−アリル−Ｌ−システインがヒトの網膜色素上皮細胞を濃度依存的に保護することを確認することができた。

以上、本発明の好適な実施態様について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、添付の請求の範囲で定義している本発明の基本概念を利用した当業者の様々な変形および改良形態も本発明の権利範囲に属するのである。

Claims

Ｓ−アリル−Ｌ−システイン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物または水和物を有効成分として含み、網膜色素上皮細胞内のＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニル−エタノールアミン（Ａ２Ｅ）の光酸化を抑制することを特徴とする、乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物。
前記眼疾患予防または治療用組成物が前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインを５〜９９．９重量％で含むことを特徴とする、請求項１に記載の乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物。
前記Ｓ−アリル−Ｌ−システインは、ネギ属(Allium genus)植物から分離精製されたもの、合成されたもの、および発酵によって製造されたものよりなる群から選ばれたいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物。
前記眼疾患予防または治療用組成物が抗炎症剤または抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物。
前記抗炎症剤は、イブプロフェン(ibuprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)、フルルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(feno-profen)、ナプロキセン(naproxen)、ピキシカム(piroxicam)、テキノシカム(tenoxicam)、イソキシカム(isoxicam)、メロキシカム(meloxicam)、インドメタシン(indomethacin)、アセクロフェナク(aceclofenac)、ジクロフェナク(diclofenac)、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであり、
前記抗酸化剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロチノイド、亜鉛、銅、鉄、マンガン、ルテイン、ゼアキサンチン、セレニウム、グルタチオン（ＧＨＳ）、リコピン、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする、請求項４に記載の乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物。
請求項１に記載の乾性加齢性黄斑変性予防または治療用組成物を含む経口投与用製剤、粘膜適用製剤、注射剤、吸入剤および外用剤よりなる群から選ばれる医薬製剤。