JP6967222B2 - 脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法 - Google Patents

脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6967222B2
JP6967222B2 JP2017556480A JP2017556480A JP6967222B2 JP 6967222 B2 JP6967222 B2 JP 6967222B2 JP 2017556480 A JP2017556480 A JP 2017556480A JP 2017556480 A JP2017556480 A JP 2017556480A JP 6967222 B2 JP6967222 B2 JP 6967222B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
emt
drusen
acid
cells
rpe cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017556480A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2017104833A1 (ja
Inventor
眞一郎 丹羽
大 小倉
秀美 水沼
洋子 新井
孝弘 黒瀬
良宏 高井
陽子 三ツ口
万里代 守屋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Link Genomics Inc
Original Assignee
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Link Genomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rohto Pharmaceutical Co Ltd, Link Genomics Inc filed Critical Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPWO2017104833A1 publication Critical patent/JPWO2017104833A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6967222B2 publication Critical patent/JP6967222B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/38Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404Indoles, e.g. pindolol
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42Oxazoles
    • A61K31/4211,3-Oxazoles, e.g. pemoline, trimethadione
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425Thiazoles
    • A61K31/4261,3-Thiazoles
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47Quinolines; Isoquinolines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

本発明は、脈絡膜の新生血管の予防又は治療用医薬に関する。
また、本発明は、ドルーゼン抑制剤、及びそのような薬剤の評価又はスクリーニング方法に関する。
脈絡膜新生血管(Choroidal Neovascularization、CNV)は、眼底の黄斑部において、脈絡膜から新生血管が生じる疾患であり、加齢黄斑変性症(Age−related Macular Degeneration、AMD)のほか、網膜色素線条症、病的近視、眼ヒストプラスマ症や外傷後の脈絡膜破裂等において見られる。
脈絡膜新生血管は脆弱であるため、血液成分が滲出し、網膜浮腫や網膜下液の貯留を引き起こす。また、脆弱な新生血管が破れて出血することで、視力低下に影響を及ぼす障害が加速的に進行する(非特許文献1)。
例えば、加齢黄斑変性症における脈絡膜新生血管に対しては、新生血管を阻害する抗VEGF薬等の血管新生阻害剤が用いられている(非特許文献2)。
AMDは、加齢等の要因により、網膜の黄斑部が障害されて視力の喪失を来たす疾患である。AMDが進行すると、物体や線状の物が歪んで見え(変視症)、色が識別出来なくなり、光に対して敏感になることがあり、Quality of Lifeに大きな影響を与えるようになる。さらに重症化すると、視界の一部が欠けたり(中心暗点等)、失明に至ることもある(非特許文献3)。
AMDは、特徴的な病態により大別すると、Wet AMD(滲出型AMD)と、Dry AMD(萎縮型AMD)とに分類される。Wet AMDは、異常な新生血管とその破綻を特徴とする類型である。Wet AMDは、網膜色素上皮細胞(Retinal Pigment Epithelium、RPE細胞)下の脈絡膜から血管が新生し、これらの脆弱な血管から血液成分が滲出し、網膜浮腫や網膜下液の貯留が起こる。また、脆弱な血管が破れて出血することで、視力低下に影響を及ぼす障害が加速的に進行する(非特許文献1)。
AMDの治療法として、Wet AMDに対しては、血管新生を阻害する抗VEGF(vascular endothelial growth factor)薬等の血管新生阻害剤が用いられている(非特許文献2)。
一方、Dry AMDは、視力、眼底所見、画像所見、除外規定、重症度分類等の基準から診断される疾患である(非特許文献4)。ドルーゼンと呼ばれる構造物により、視細胞が不整を来すことが一因であると考えられている(非特許文献5)。一部のDry AMDは、Wet AMDに移行する例があるとの報告がある。
岩田 英嗣ら(2011). 加齢黄斑変性 現代医学 59巻1号 133〜138 平山 真理子ら(2011). 滲出型加齢黄斑変性における抗VEGF治療 医学のあゆみ Vol.236 1165〜1167 石田 晋ら(2010). 加齢とAMD Pharma Medica Vol.28,No.12,9−12 高橋 寛二ら(2015). 萎縮型加齢黄斑変性の診断基準 日眼会誌 119,671−677 安川 力(2011).Seminar 5.加齢黄斑変性(AMD)の前駆病変とその症状 Geriatric Medicine Vol.49,No.4 409〜412
本発明は、CNVの予防及び/又は治療剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、ドルーゼン抑制剤を提供することを目的とする。
VEGFをターゲットとした抗体等を用いた新生血管の阻害は対症療法であり、VEGFを産生する細胞自体の働きを抑えたり、改善させるものではない。また、抗体等の生物学的製剤は治療期間が長引くほど高額な医療費が必要となる。さらに、眼内注射を必要とする医薬では、侵襲性が高く、患者の負担が大きい。したがって、CNVの根治治療のための、侵襲性が低く、経済的な治療薬が強く求められている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDs)、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及びトロンボキサンA2受容体拮抗剤が網膜色素上皮細胞(RPE細胞)の上皮間葉転換(Epithelial−Mesenchymal Transition:EMT)を抑制することにより、RPE細胞におけるVEGFの発現を抑制し、脈絡膜新生血管を予防及び/又は治療することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
[1]
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有する、脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤;
[2]
経口剤である、前記[1]に記載の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤;
[3]
前記脈絡膜新生血管が、加齢性黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)、又は網膜血管腫状増殖(RAP)において生じる、前記[1]又は[2]に記載の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤;
に関する。
また、本発明では、ドルーゼンを抑制することにより、Dry AMDにおける視野の歪み等の症状を改善することができるものと期待される。しかしながら、Dry AMDの有効な治療薬は存在せず、根治のための治療薬が強く求められている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ドルーゼンは、RPE細胞が上皮間葉転換(Epithelial−Mesenchymal Transition:EMT)を引き起こしたことに起因する構造体であるという新たな知見を得た。この知見に基づき、本発明者らは、簡便にRPE細胞においてEMTを誘導できること、RPE細胞においてドルーゼンを再現し得ること、RPE細胞におけるEMTを抑制できるEMT抑制化合物を評価又はスクリーニングし、これらの化合物がRPE細胞におけるドルーゼンを抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
[4]
網膜色素上皮細胞の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物を有効成分として含有する、ドルーゼン抑制剤;
[5]
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、前記細胞における間葉系マーカー又は細胞外マトリックスの発現を抑制する薬剤である、前記[4]に記載のドルーゼン抑制剤;
[6]
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、Cadherin3、MMP1、及びMMP7からなる群より選択される少なくとも1種であり、並びに/又は、
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、及びTNCからなる群より選択される少なくとも1種である、前記[5]に記載のドルーゼン抑制剤;
[7]
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及び/又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤である、前記[4]〜[6]のいずれかに記載のドルーゼン抑制剤;
[8]
前記非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、並びに/又は、
前記トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、前記[7]に記載のドルーゼン抑制剤;に関する。
また、本発明は、
[9]
プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤を有効成分として含有し、
該アルドース還元酵素が、エパルレスタット及び/又はその薬学的に許容できる塩である、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤;
[10]
前記プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤が、スリンダク及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、並びに/又は、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、前記[9]に記載の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤;に関する。
また、本発明は、
[11]
血管新生阻害剤と、
前記[4]〜[8]のいずれかに記載のドルーゼン抑制剤とを組み合わせてなる、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤に関する。
また、本発明は、
[12]
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞における上皮間葉転換の抑制を測定することを含む、ドルーゼン抑制剤の評価又はスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、
[13]
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞の集塊の抑制を測定することを含む、ドルーゼン抑制剤の評価又はスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、
[14]
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞における上皮間葉転換の抑制を測定することを含む、加齢黄斑変性症予防・治療薬の評価又はスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、
[15]
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞の集塊の抑制を測定することを含む、加齢黄斑変性症予防・治療薬の評価又はスクリーニング方法に関する。
本発明の化合物は、RPE細胞のEMTを抑制することでVEGFの発現を抑制できるため、脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤として有用である。さらに、本発明は、医薬品として十分な安全性を有するものである。
また、別の観点から、本発明によれば、EMT抑制化合物を用いてドルーゼンを効果的に抑制することが可能となる。
図1は、RPE細胞におけるEMT誘導をEMTマーカー分子の発現変化により検証した結果を示すグラフである。 図2は、RPE細胞におけるEMT誘導を経時的なEMTマーカー発現変化により検証した結果を示す図である。 図3は、オキサプロジンが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図4は、エパルレスタットが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図5は、ザフィルルカストが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図6は、アンレキサノクスが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図7は、ザルトプロフェンが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図8は、フルフェナム酸アルミニウムが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図9は、メフェナム酸が、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図10は、スリンダクが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図11は、チアプロフェン酸が、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図12は、セラトロダストが、RPE細胞のEMTを抑制することを示すグラフである。 図13は、オキサプロジンによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図14は、エパルレスタットによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図15は、ザルトプロフェンによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図16は、エトドラクによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図17は、インドメタシンによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図18は、フルフェナム酸アルミニウムによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図19は、メフェナム酸による、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図20は、セラトロダストによる、RPE細胞のVEGF及びEMTマーカーの発現量への影響を検証した結果を示すグラフである。 図21は、ザルトプロフェンのCNV抑制効果をレーザー誘発線維化試験により検証した結果を示すグラフである。 図22は、ザルトプロフェンのCNV抑制効果をレーザー誘発線維化試験により検証した結果を示す蛍光眼底写真である。 図23は、ザルトプロフェンのEMT抑制効果をレーザー誘発線維化試験により検証した結果を示すグラフである。 図24は、ザルトプロフェンのEMT抑制効果をレーザー誘発線維化試験により検証した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図25は、ザルトプロフェンのEMT抑制効果をレーザー誘発線維化試験により検証した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図26は、AMD患者ドルーゼンにおけるRPE細胞の形態を示した染色写真を、健常者のRPE細胞の形態を示した染色写真と比較したものである。 図27は、AMD患者ドルーゼンにおけるRPE細胞の上皮系マーカーの染色性を示す免疫染色写真を、健常者のRPE細胞の上皮系マーカーの染色性を示す免疫染色写真と比較したものである。 図28は、AMD患者ドルーゼンにおけるRPE細胞の間葉系マーカーの染色性を示す免疫染色写真を、健常者のRPE細胞の間葉系マーカーの染色性を示す免疫染色写真と比較したものである。 図29は、AMDモデル動物におけるRPE細胞の上皮系マーカー及び間葉系マーカーの染色性を示す免疫染色写真を、健常モデル動物におけるRPE細胞の上皮系マーカー及び間葉系マーカーの染色性を示す免疫染色写真と比較したものである。 図30は、RPE細胞におけるEMT誘導を運動能の亢進により検証した結果を示すグラフ及び写真である。 図31は、RPE細胞におけるEMT誘導をドルーゼン様構造体の形成により検証した結果を示す写真である。 図32は、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、EMT抑制化合物により運動能の亢進が抑制されることを示すグラフである。 図33は、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、EMT抑制化合物により運動能の亢進が抑制されることを示すグラフである。 図34は、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、EMT抑制化合物により運動能の亢進が抑制されることを示すグラフである。 図35は、EMT抑制化合物が、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、ドルーゼン様構造体を抑制することを示す写真である。 図36は、EMT抑制化合物が、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、ドルーゼン様構造体を抑制することを示す写真である。 図37は、EMT抑制化合物が、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、ドルーゼン様構造体を抑制することを示す写真である。 図38は、EMT抑制化合物が、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、ドルーゼン様構造体を抑制することを示す写真である。 図39は、EMT抑制化合物が、RPE細胞のEMT誘導モデルにおいて、ドルーゼン様構造体を抑制することを示す写真である。 図40は、ドルーゼン抑制評価のためのin vivoモデル試験におけるドルーゼン様構造体の誘導結果を示す写真である。 図41は、誘導されたドルーゼン様構造体におけるE−Cadherinの染色結果を示す写真である。 図42は、誘導されたドルーゼン様構造体におけるCytokeratinの染色結果を示す写真である。 図43は、誘導されたドルーゼン様構造体におけるFibronectinの染色結果を示す写真である。 図44は、誘導されたドルーゼン様構造体におけるVimentinの染色結果を示す写真である。 図45は、ドルーゼン様構造体形成に対するオキサプロジンの薬理評価をHE染色で示した写真である。 図46は、ドルーゼン様構造体形成に対するオキサプロジンの薬理評価をE−Cadherinの免疫染色で示した写真である。 図47は、ドルーゼン様構造体形成に対するオキサプロジンの薬理評価をFibronectinの免疫染色で示した写真である。 図48は、ドルーゼン様構造体形成に対するエパルレスタットの薬理評価をHE染色で示した写真である。 図49は、ドルーゼン様構造体形成に対するエパルレスタットの薬理評価をE−Cadherinの免疫染色で示した写真である。 図50は、ドルーゼン様構造体形成に対するエパルレスタットの薬理評価をFibronectinの免疫染色で示した写真である。 図51は、ドルーゼン様構造体形成に対するザルトプロフェンの薬理評価をHE染色で示した写真である。 図52は、ドルーゼン様構造体形成に対するザルトプロフェンの薬理評価をE−Cadherinの免疫染色で示した写真である。 図53は、ドルーゼン様構造体形成に対するザルトプロフェンの薬理評価をFibronectinの免疫染色で示した写真である。
以下、本発明を詳細に説明する。
[脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤]
本発明の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤は、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有する。
本明細書において、「脈絡膜新生血管(CNV)」とは、眼底の脈絡膜から新しい血管が発生、増殖及び/又は伸展することをいう。限定はされないが、脈絡膜から生じた新生血管は、Bruch膜及び/又は網膜色素上皮細胞が存在する層を通って伸展する。CNVは、公知の方法により検査を行うことが可能である。限定はされないが、CNVは、例えば、フルオレセイン等の蛍光色素を用いた眼底血管造影法により検査をすることができる。
本明細書において、「網膜色素上皮細胞(RPE細胞)」とは、眼の網膜下に存在する単層の立方上皮細胞をいう。
本発明者らは、RPE細胞における上皮間葉転換(EMT)がCNVの主因であると推測している。本明細書において「上皮間葉転換(EMT)」とは、上皮細胞において、上皮性の形質が失われ、間葉系の形質を獲得するようになる現象をいう。上皮細胞における細胞間接着が解除されることにより、細胞の形態が変化し、運動能を獲得する。上皮細胞として発現していた上皮系マーカーは発現が抑制され、間葉系マーカーの発現や細胞外マトリクス(ECM)の分泌が亢進するようになる(本明細書において、上皮系マーカー、間葉系マーカー、及び/又はECMをEMTマーカーとも呼ぶ)。
本発明者らは、CNVの発生について、以下の仮説を立て、検証を行った。本発明者らは、何らかの外的刺激により、RPE細胞においてEMTが生じると、RPE細胞が変性して、ドルーゼンを生じることを見出している。ドルーゼンを形成する過程でBruch膜から剥離されたRPE細胞は、Bruch膜直下の脈絡膜毛細管板からの酸素と栄養の供給が遮断されるため、局所的な低酸素状態によりVEGFや一部のMMPsの分泌が亢進するものと考えられる。また、ドルーゼンの形成に至らない場合であっても、RPE細胞においてEMTが生じることにより、RPE細胞から間葉系マーカーや細胞外マトリクスとともにVEGFや一部のMMPsの分泌が亢進することが考えられる。これらのMMPsにより、Bruch膜に分解及び穿孔が生じ、VEGFにより脈絡膜からの血管新生が誘導される。
新生血管は脆弱であるため、血液の漏出が起こりやすい。また、脆弱な新生血管の破裂により網膜下出血が生じると急激に視力低下を来たし、失明に繋がり得る。
CNVに関連する疾患(ICD10:国際疾病分類第10版(2003年改定))としては、例えば、加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、ドルーゼン、滲出性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)、滲出性網膜症、中心性漿液性網脈絡膜症、中心性漿液性脈絡膜症、出血性網膜色素上皮剥離、増殖性硝子体網膜症、増殖性網膜症、漿液性網膜色素上皮剥離、特発性脈絡膜新生血管、網膜浮腫、網膜血管新生、網膜血管腫状増殖(RAP)、網膜血管障害、萎縮型加齢黄斑変性、血管新生性黄斑症、軟性ドルーゼン、近視性脈絡膜新生血管、黄斑変性、黄斑症、黄斑部血管走行異常、黄斑障害等が挙げられる。
これらの疾患に対する効能効果としては、例えば、中心窩下脈絡膜新生血管を伴う加齢黄斑変性が挙げられる。
また、CNVに関連する疾患(標準病名ICD10)としては、例えば、近視性脈絡膜新生血管、特発性脈絡膜新生血管等が挙げられる。
これらの疾患に対する効能効果としては、例えば、病的近視における脈絡膜新生血管が挙げられる。
また、CNVに関連する疾患(標準病名ICD10)としては、例えば、糖尿病黄斑浮腫、1型糖尿病性黄斑浮腫、1型糖尿病黄斑症、2型糖尿病性黄斑浮腫、2型糖尿病黄斑症、糖尿病黄斑症等が挙げられる。
これらの疾患に対する効能効果としては、例えば、糖尿病黄斑浮腫が挙げられる。
また、CNVに関連する疾患(標準病名ICD10)としては、例えば、網膜静脈閉塞症による黄斑浮腫、網膜中心静脈塞栓症、網膜中心静脈血栓症、網膜中心静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症による黄斑浮腫、網膜静脈血栓症、網膜静脈閉塞症等が挙げられる。
これらの疾患に対する効能効果としては、例えば、網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫が挙げられる。
加齢黄斑変性(AMD)の分類としては、Dry AMDとWet AMDとの大別の他、初期AMD、中期AMD又は後期AMDとの分類、非進行性AMD又は進行性AMDとの分類等が報告されている。限定はされないが、Wet AMDの特殊型としては、網膜血管腫状増殖(RAP)がある。
限定はされないが、CNVにおける新生血管は、Bruch膜やRPE細胞の上方で様々な方向に伸展する場合もあるが、ポリープ状脈絡膜血管症(polypoidal choroidal vasculopathy:PCV)のようにRPE細胞下でポリープ状の新生血管を形成する場合もある。
滲出型AMDには、中心窩を含むCNVを伴う病態が知られている。このようなAMDは典型AMD、PCV、又はRAPの3病型に分けられることがあり、初回治療が個々に選択され得る。
本明細書においては、CNVが生じている網膜疾患であれば、いかなる分類に基づく疾患であっても予防及び/又は治療の対象となる。
AMDの分類において、特にWet AMD(滲出型AMD)は、漏血や湿潤化を経て、中心窩下にCNVを生じ、このCNV周囲に網膜下出血が見られることが多いため、CNVとの関連が強い。
このような推測されるCNV発生のメカニズムに基づくと、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩は、それぞれ、RPE細胞のEMTを強く抑制することで、CNVの発生や伸展に関与するVEGFやMMPs等の産生を抑制することに繋がり、CNVを根本から予防及び/又は治療できることが期待される。
公知の方法により、EMTが生じていること、又はEMTが抑制されていることを測定又は評価することができる。限定はされないが、例えば、上皮性の形質が失われることは、後述の上皮系マーカーの発現を測定することにより確認することができる。また、例えば、間葉系の形質を獲得することは、後述の間葉系マーカーの発現や細胞外マトリクス(ECM)の分泌を測定することにより確認することができる。遺伝子の発現やタンパク質の発現又は分泌は、マイクロアレイ、リアルタイムPCR法、PCR法、ウエスタンブロット法、ELISA法、免疫組織染色等の公知の方法により測定することができる。また、例えば、運動能の亢進は、ギムザ染色等の組織染色、Invasion Assay法等の公知の方法により測定することができる。また、例えば、細胞の形態変化は、HE染色等の組織染色等の公知の方法により測定することができる。
本明細書において「予防」とは、個体において、疾患や症状の発症を防止すること、疾患の発症を遅らせること、又は疾患の再発を防止することをいう。
本明細書において「治療」とは、個体において、疾患の症状を軽減すること、疾患の症状を消失させること、又は疾患の症状の維持、又は症状の進行、重症化、悪化若しくは増悪を抑えることをいう。
本明細書において、「RPE細胞のEMTを抑制する」とは、RPE細胞における上皮系の形質が失われることを抑えること、間葉系の形質を獲得することを抑えること、又は獲得した間葉系の形質を失わせることをいう。限定はされないが、例えば、RPE細胞において、上皮系マーカーの発現が維持されること、間葉系マーカーの発現が抑制されること、ECMの発現及び/又は分泌が抑制されること、又は運動能の亢進が抑制されることを検出することで、RPE細胞のEMT抑制を評価することが可能である。
RPE細胞のEMT抑制活性を有する化合物(本明細書において、EMT抑制化合物ともいう)は、上皮細胞においてEMTへの抑制活性が知られている化合物を含む。EMT抑制化合物には、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及びトロンボキサンA2受容体拮抗剤が含まれ、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト又はこれらの薬学的に許容できる塩が用いられる。EMT抑制化合物は、血液−網膜関門(BRB)の透過性の観点から、脂溶性等のBRB透過性に関与する因子が優れているものが好ましい。限定はされないが、脂溶性が高い化合物は、BRB透過性が優れているため、眼に直接送達しない経口投与等の場合であっても、網膜疾患に対する高い予防・治療効果が期待される。また、EMT抑制化合物は、症状によって長期投与が可能な観点から、副作用が少ない化合物であることが好ましい。副作用としては、限定はされないが、食欲不振、下痢、口内炎、消化不良、胃炎、掻痒感、肝機能異常等が挙げられる。これらのBRB透過性及び/又は副作用の観点から、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト又はこれらの薬学的に許容できる塩が好ましい。これらの成分は、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
本明細書において、「薬学的に許容できる塩」は、特に制限されないが、具体的には、有機酸塩、無機酸塩、有機塩基、または無機塩基が挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酪酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩等のモノカルボン酸塩;フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩等の多価カルボン酸塩;乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等のオキシカルボン酸塩;メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩等の有機スルホン酸塩が例示される。無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩が例示される。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン、トリピリジン、ピコリン、エチレンジアミン等の有機アミンとの塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アンモニウム塩; ナトリウムまたはカリウム等アルカリ金属、カルシウムまたはマグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム等の金属との塩等の各種の塩が挙げられる。これらの塩は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。「薬学的に許容される塩」には、塩の溶媒和物又は水和物を含んでいてもよい。
本発明者らは、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種が、間葉系マーカー又は細胞外マトリックス(ECM)の発現を顕著に抑制することを見出している。
本明細書において、間葉系マーカーは、限定されず、公知の間葉系マーカーを用いることが可能であるが、例えば、Snail(SNAI1)、Slug(SNAI2)、マトリクックスメタロプロテアーゼ1(MMP1)、MMP7、MMP2、MMP3、MMP9、N−カドヘリン(CDH2)、CDH3、ZEB1、ZEB2(SIP1)、α−SMA、ビメンチン(VIM)、FSP−1、β−カテニン(β−catenin)、OB−カドヘリン、α5β1インテグリン、シンデカン1(Syndecan−1)、ETS、Twist1、Goosecoid、LEF−1、FOXC2、miR10b、miR21、RDX、RHOA、TJP1、CTNNB1、HAS2、SERPINE1、MSN、TCF3、ITGAV等が挙げられる。EMT抑制を評価するために、これらの間葉系マーカーは、1種を用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
RPE細胞におけるEMT抑制を効果的に評価可能であることから、間葉系マーカーは、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、及びVIMからなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、Snail、Slug、CDH3、MMP1、及びMMP7からなる群より選択される少なくとも1種がより好ましい。
本明細書において、ECMは、限定されず、公知のECMをマーカーとして用いることが可能であるが、例えば、コラーゲンタイプ5α3(COL5A3)、COL6A3、ラミニンγ2(LAMC2)、Hyaluronan−Mediated Motility Receptor(HMMR)、テネイシンC(TNC)、フィブロネクチン1(FN1)、COL1A1、COL1A2、COL5A1、COL5A2、COL11A2、COL13A1、COL16A1、COL27A1、chondroitin sulfate proteoglycan 4(CSPG4)、ラミニンβ3(LAMB3)、セルグリシン(SRGN)、SPARC等が挙げられる。EMT抑制を評価するために、これらのECMは、マーカーとして1種を用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
RPE細胞におけるEMT抑制を効果的に評価可能であることから、ECMは、COL5A3、COL6A3、ラミニンγ2(LAMC2)、Hyaluronan−Mediated Motility Receptor(HMMR)、テネイシンC(TNC)、COL1A1、COL1A2、SRGN、FN1、COL5A2、COL13A1、及びLAMB3からなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、COL5A3、COL6A3、ラミニンγ2(LAMC2)、Hyaluronan−Mediated Motility Receptor(HMMR)、及びテネイシンC(TNC)からなる群より選択される少なくとも1種がより好ましい。
また、本明細書において、上皮系マーカーは、限定されず、公知の上皮系マーカーを用いることが可能であるが、例えば、ID1、ID2、MUC1、サイトケラチン18(KRT18)、THBS1、VIL2、E−カドヘリン(CDH1)等が挙げられる。これらの上皮系マーカーは、1種を用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
本明細書において、EMT抑制化合物としては、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト又はこれらの薬学的に許容できる塩の他、上皮細胞においてEMTへの抑制活性が知られている化合物や成分が含まれ得る。限定はされないが、例えば、Alisertib、MK−0457(Tozasertib)、PHA−739358(danusertib)、AMG−900、Barasertib、CYC116、MLN8054、Baicalin、Baicalein、Lupeol、Istanbulin A、Phytol、Diphenyl difluoroketone (EF24)、Crucmin、Phloroglucinol、Plumbagin、Rapamycin、FK506(Tacrolimus)、Thalidomide、LY550410、SB−505124、SD−208、TAPI−0、TAPI−1、JNJ−38877605、PF−04217903、AG1478(Tyrphostin)、Erlotinib、Gefitinib、Lapatinib、PD153035、PD158780、WHI−P154、BMS−536924、A83−01、D4476、LY−364947、SB−431542、SD−208、AZD6244(Selumetinib)、CI−1040、PD0325901、GDC−0941(Pictilisib)、PI−103、PIK−90、ZSTK474、API−2、AZD0530(Saracatinib)、PP1、2−Hydroxycinnamaldehyde、5−aza−dC、BI 5700、Celecoxib、CX−4945(Silmitasertib)、Disulfiram、Eribulin mesyate、Evodiamine、EW−7203、Fasudil、Nintedanib、Fuzheng Huayu recipe、Grape seed proanthocyanidins、Vorinostat、Herbimycin A、Entinostat、Honokiol、NPI−0052、Methacycline、Dasatinib、Ki26894、NSC 74859、NVP−LDE−225(Erismodegib)、Palbociclib、Pinocembrin、Salvianolic Acid B、Sorafenib、Resveratrol、S−Allylcysteine、Silibinin meglumine、Simvastatin、Centchroman、ML327、GN−25、Trichostatin A、Sarasinoside A1、Panobinostat、Danusertib、Cystatin C、Thymoquinone、Ulinastatin、Dendrofalconerol A (DF−A)、ジンセノサイド(人参サポニン)、ツルウメモドキ種子エキス、サリシン(セイヨウシロヤナギエキス)、サリチル酸、ヤブジラミエキス、オストール、ミュスカダンブドウ皮エキス、Tongxinluo、プロシアニジンC1(桂皮)、アシュワガンダ根エキス(Withania somnifera root extract)、Qingyihuaji、ローゼルエキス、没食子酸エピガロカテキン、プロアントシアニジン(ブドウ種子エキス)、サルビアノリン酸B等が挙げられる。
[滲出型加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤]
Wet AMDに用いられる既存の血管新生阻害剤は、抗体を用いた医薬が中心であるため、治療費が高額になるという問題点がある。特に、Wet AMDの治療においては、投薬を中止すると再び血管新生が生じ、失明の危険性が高まり得る。本発明を用いることにより、血管新生阻害剤の用量、投与間隔、投与回数を抑えることが可能となり、医療経済上の効果を期待し得る。本発明により、RPE細胞におけるEMTを抑制することは、Dry AMDがWet AMDへ移行することを阻止すること、或いは、Wet AMDの根本的な治療となることも期待される。本発明により、RPE細胞におけるEMTを抑制することができるため、本発明をVEGF産生抑制剤又はVEGF発現抑制剤として用いることも可能である。
[EMT誘導モデル]
本発明者らは、上皮性細胞に対して刺激を与えることを含む方法により、インビトロにおいて、EMTを誘導するモデルを開発している。EMT誘導モデルを用いることにより、各種の上皮性細胞においてEMTによる影響を評価することが可能となる。また、各種の上皮性細胞において、薬剤がEMTを抑制するかどうかを評価及び/又はスクリーニングすることが可能となる。
上皮性細胞は、公知の上皮性細胞であれば特に制限されないが、EMTによる影響を評価する観点から、上皮性細胞はRPE細胞を用いることが好ましく、ヒトRPE細胞であることがより好ましく、RPE細胞株であるARPE−19を用いることが更に好ましい。このようなRPE細胞を用いたEMT誘導モデルは、遺伝子発現、タンパク質の分泌、運動能、Focus形成等においてEMTを評価することが可能である。
上皮性細胞に対して与える刺激は、薬物による刺激、機械的操作による刺激、電気的操作による刺激等が挙げられ、特に制限されないが、顕著にEMTを誘導し得る観点から、薬物を細胞に接触させることを含む刺激が好ましい。上記の薬物としては、限定はされないが、サイトカイン、増殖因子、及びケモカインからなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。
刺激に用いられるサイトカインとしては、公知の物質を用いることが可能であるが、例えば、インターロイキン1β(IL−1β)、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−16、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、インターフェロンγ(INF−γ)等が挙げられる。サイトカインは、顕著にEMTを誘導し得る観点から、IL−1β、IL−6、INF−γ、及びTNF−αからなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、IL−1β、IL−6、及びTNF−αからなる群より選択される少なくとも1種がより好ましく、IL−1β及び/又はTNF−αが更に好ましい。サイトカインは、単独で用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
刺激に用いられる増殖因子としては、公知の物質を用いることが可能であるが、例えば、トランスフォーミング増殖因子(TGF−β)、線維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factors;FGFs)、肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor;HGF)、上皮細胞増殖因子(epidermal growth factor;EGF)、血小板由来増殖因子(platelet−derived growth factor;PDGF)等が挙げられる。増殖因子は、顕著にEMTを誘導し得る観点から、TGF−β、EGF、及びFGFsからなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、TGF−β及び/又はEGFがより好ましい。増殖因子は、単独で用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
刺激に用いられるケモカインとしては、公知の物質を用いることが可能であるが、例えば、IL−8、マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP−1α)、Monocyte Chemoattractant Protein−1(MCP−1)、RANTES(regulated on activation normal T cell expressed and secreted)、エオタキシン(eotaxin)等が挙げられる。ケモカインは、顕著にEMTを誘導し得る観点から、MIP−1α、MCP−1、及びRANTESからなる群より選択される少なくとも1種が好ましく、MIP−1α及び/又はMCP−1がより好ましい。ケモカインは、単独で用いることも可能であり、組み合わせて用いることも可能である。
上記の刺激は、例えば、IL−1β、IL−6、INF−γ、及びTNF−αからなる群より選択される少なくとも1種のサイトカイン、TGF−β、EGF、及びFGFsからなる群より選択される少なくとも1種の増殖因子、及びMIP−1α、MCP−1、及びRANTESからなる群より選択される少なくとも1種のケモカインを組み合わせて用いることが可能である。
刺激におけるサイトカイン、増殖因子、又はケモカインの濃度は、上皮性細胞の種類、細胞の状態、サイトカイン等の種類等により適宜調整され得るが、例えば、1ng/mL以上であることが好ましく、5ng/mL以上であることがより好ましく、10ng/mL以上であることが更に好ましく、15ng/mL以上であることが特に好ましく、20ng/mL以上であることが最も好ましい。また、サイトカイン、増殖因子、又はケモカインの濃度は、1μg/mL以下であることが好ましく、700ng/mL以下であることがより好ましく、500ng/mL以下であることが更に好ましく、200ng/mL以下であることが特に好ましく、100ng/mL以下であることが最も好ましい。また、サイトカイン、増殖因子、又はケモカインの濃度は、1ng/mL〜1μg/mLであることが好ましく、5〜700ng/mLであることがより好ましく、10〜500ng/mLであることが更に好ましく、15〜200ng/mLであることが特に好ましく、20〜100ng/mLであることが最も好ましい。
限定はされないが、サイトカインがIL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12、IL−13、又はIL−16である場合は、サイトカインの濃度は、1ng/mL〜1μg/mLであることが好ましく、5〜700ng/mLであることがより好ましく、10〜500ng/mLであることが更に好ましく、15〜200ng/mLであることが特に好ましく、20〜100ng/mLであることが最も好ましい。
また、限定はされないが、サイトカイン又はケモカインがINF−γ、TNF−α、MIP−1αである場合は、その濃度は、10ng/mL〜1μg/mLであることが好ましく、20〜800ng/mLであることがより好ましく、30〜700ng/mLであることが更に好ましく、40〜600ng/mLであることが特に好ましく、50〜500ng/mLであることが最も好ましい。
また、限定はされないが、増殖因子がTGF−β、EGFである場合は、増殖因子の濃度は、1〜200ng/mLであることが好ましく、2〜100ng/mLであることがより好ましく、3〜50ng/mLであることが更に好ましく、4〜600ng/mLであることが特に好ましく、5〜25ng/mLであることが最も好ましい。
刺激における反応時間は、上皮性細胞の種類、細胞の状態、サイトカイン等の種類等により適宜調整され得るが、例えば、少なくとも5分以上とすることが可能であり、EMTにおいて上皮性の形質が失われ間葉性の形質を獲得することの観点から、少なくとも10分以上とすることが好ましく、少なくとも1時間以上とすることがより好ましく、少なくとも10時間以上とすることが更に好ましく、少なくとも24時間以上とすることが特に好ましく、少なくとも48時間以上とすることが最も好ましい。また、刺激における反応時間は、例えば120時間以内とすることが可能であり、EMTにおいて上皮性の形質が失われ間葉性の形質を獲得することの観点から、108時間以内とすることが好ましく、96時間以内とすることがより好ましく、84時間以内とすることが更に好ましく、72時間以内とすることが特に好ましく、60時間以内とすることが最も好ましい。また、刺激における反応時間は、例えば5分〜120時間とすることが可能であり、EMTにおいて上皮性の形質が失われ間葉性の形質を獲得することの観点から、10分〜108時間とすることが好ましく、1〜96時間とすることがより好ましく、10〜84時間とすることが更に好ましく、24〜72時間とすることが特に好ましく、48〜60時間とすることが最も好ましい。
刺激における反応温度は、上皮性細胞の種類、細胞の状態、サイトカイン等の種類等により適宜調整され得るが、例えば、4〜50℃とすることが可能であり、10〜45℃が好ましく、20℃〜40℃がより好ましく、30〜37℃が更に好ましい。
細胞にEMTが誘導されたか否かを評価する方法としては、限定はされないが、上皮性細胞に対する刺激の前及び/又は後における、上皮系マーカー、間葉系マーカー及びECMからなる群より選択される少なくとも1種の発現(分泌)を測定すること、細胞の形態変化を観察すること、又は細胞の運動能の変化を測定することが挙げられる。限定はされないが、RPE細胞にEMTが誘導されると、上皮系マーカーは抑制される、間葉系マーカーが亢進する、運動能が亢進する、及び/又は細胞形態が紡錘状に変形し、細胞同士が凝集してドルーゼン様構造体(Focus)を形成する等の現象が確認される。
遺伝子の発現やタンパク質の発現又は分泌は、マイクロアレイ、リアルタイムPCR法、PCR法、ウエスタンブロット法、ELISA法、免疫組織染色等の公知の方法により測定することができる。運動能の変化は、ギムザ染色等の組織染色、Invasion Assay法等の公知の方法により測定することができる。また、例えば、細胞の形態変化は、HE染色等の組織染色等の公知の方法により測定することができる。
[CNV抑制の評価]
EMT誘導モデルを用いて、インビトロにおいてCNVの抑制を評価することができる。すなわち、RPE細胞においてEMTを誘導した後、薬剤の存在下と非存在下とのVEGFの発現量を比較することで、薬剤がRPE細胞におけるVEGFの発現を抑えることによるCNVの抑制を評価することができる。EMTの状態の測定には、例えば、上皮系マーカー、間葉系マーカー及びECMからなる群より選択される少なくとも1種の発現(分泌)を測定することが挙げられる。RPE細胞におけるEMTが抑制されると、間葉系マーカー及び/若しくはECMが抑制される。EMTマーカーやVEGFの発現は、例えば、mRNAの発現量により評価することができる。
細胞からRNAを抽出するステップは、公知のRNA抽出方法を用いることが可能である。市販のRNA抽出キット等を用いることが好ましい。
mRNAの発現を定量分析するステップは、限定はされないが、リアルタイムPCR法を用いることが好ましい。リアルタイムPCR法で測定するEMTマーカーとしては、上記の上皮系マーカー、間葉系マーカー、ECM等のEMTマーカーを用いることが可能であるが、再現性よくリアルタイムPCR法で測定し得るEMTマーカーを用いる観点から、上皮系マーカーとしては、ID1、ID2、MUC1、サイトケラチン18(KRT18)、THBS1、VIL2、E−カドヘリン(CDH1)が好ましく、MUC1、サイトケラチン18(KRT18)、E−カドヘリン(CDH1)がより好ましい。間葉系マーカーとしては、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、ビメンチンが好ましく、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、ビメンチンがより好ましい。また、ECMとしては、再現性よくリアルタイムPCR法で測定し得るEMTマーカーを用いる観点から、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、CSPG4、SRGN、FN1、VIM、COL5A2、COL13A1、LAMB3が好ましく、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、FN1がより好ましい。
[ドルーゼン抑制剤]
本発明のドルーゼン抑制剤は、網膜色素上皮細胞(RPE細胞)の上皮間葉転換(EMT)抑制活性を有する化合物を有効成分として含有する。
本明細書において、「ドルーゼン」とは、健常の高齢者にもみられる加齢性変化でRPE細胞の下またはその周辺に存在する沈着物をいう。組織学的にはRPE細胞の基底膜とBruch膜の間の膠原線維層における多形性物質の沈着で、構成成分は、細胞内小器官等の細胞成分、細胞膜様残渣物、非エステル化コレステロール、補体、RPE細胞の分泌物などである。ドルーゼンを形成する黄斑部の沈着物は電子顕微鏡によりRPE細胞の基底膜内側に存在するbasal laminar depositと外側に存在するbasal linear depositがある。
一説によると、ヒトにおいてドルーゼンは、検眼鏡所見により、硬性ドルーゼン(63μm以下)と軟性ドルーゼン(63μm以上)とに分類することができると考えられている。軟性ドルーゼンは融合するとconfluent drusenと呼ばれ、ドルーゼンが融合・拡大して網膜色素上皮剥離(PED)が生じたものはDrusenoid PEDと呼ばれる。また、近年では、更に別のドルーゼンとして分類されるpseudodrusenが、予後に影響するため臨床上重要であることが報告されている。本明細書において、「ドルーゼン」には、硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼンに加えて、pseudodrusen等のドルーゼンに類似する沈着物又は構造物も含まれる。
日本におけるAMDの診断基準では、前駆病変として軟性ドルーゼン(63μm以上)とRPE細胞異常が含まれている。従来、ドルーゼンは、その形成のメカニズムが知られておらず、根本的に予防や治療を行うことが困難であった。本発明を完成するに際して、本発明者らは、ドルーゼンはRPE細胞がEMTを引き起こしたことに起因する構造体であるとの新たな知見を得た。
本発明者らは、RPE細胞を始めとする上皮細胞は、老化、UV光等の外部刺激によりその形質を変化させ、細胞外マトリックスの分泌亢進、運動能の獲得等を保有する形質(これを間葉性の形質という)を獲得する事を予測した。このことからドルーゼンは黄斑部で生じている網膜色素上皮細胞の形質転換により生成される事が強く推察される。
そこで発明者らは、網膜色素上皮細胞株(ARPE−19)を用いて、細胞が形質転換する事により、細胞外マトリックスの分泌亢進、運動能の獲得等を保有する形質を獲得する事、そして最終的に細胞成分とその分泌物からなるドルーゼンと同等の集塊(Focusとも言う)を形成する事を確認し、その発生機序を検証するとともに、同一のプロセスで生成されるこのドルーゼン様構造体(集塊(Focus))が、生体に生じるドルーゼンと同等のものである事の確証を得た。
本明細書において、「ドルーゼン抑制」とは、形成されたドルーゼンの数を減少させること若しくは分解すること、又は形成されたドルーゼンの大きさ(直径、面積、体積等により適宜に規定され得る)が縮小若しくは増大することを防止することをいい、新たなドルーゼンの形成を防止することも含む。限定はされないが、形成されたドルーゼンの数を減少させる場合は、例えば、薬剤を処理しないコントロールと比較して、少なくとも5%以上ドルーゼンの数が減少するものであり、10%以上が好ましく、20%以上が更に好ましく、30%以上が特に好ましく、40%以上が最も好ましい。ドルーゼンの数は、公知の方法により評価することができるが、例えば、眼底写真を用いることが可能である。また、限定はされないが、形成されたドルーゼンの大きさが縮小若しくは増大することを防止する場合は、例えば、薬剤を処理しないコントロールと比較して、少なくともドルーゼンの大きさが変化しないことであり、5%以上縮小することが好ましく、10%以上縮小することがより好ましく、20%以上縮小することが更に好ましく、30%以上縮小することが特に好ましく、40%以上縮小することが最も好ましい。ドルーゼンの大きさは、公知の方法により評価することができるが、例えば、眼底写真、スペクトラルドメイン光干渉断層計(SD−OCT)所見、フルオレセインやインドシアニングリーン等による蛍光眼底造影等を用いることが可能である。また、限定はされないが、新たなドルーゼンの形成を防止する場合は、例えば、薬剤を処理しないコントロールと比較して、少なくとも5%以上新たなドルーゼンの形成を防止するものであり、10%以上が好ましく、20%以上が更に好ましく、30%以上が特に好ましく、40%以上が最も好ましい。新たなドルーゼンの形成は、公知の方法により評価することができるが、例えば、眼底写真、蛍光眼底造影等を用いることが可能である。ドルーゼン抑制の評価方法は、適正な評価が可能であれば特に限定はされないが、ドルーゼンの数、厚み、体積から総合的に評価されることが好ましい。
ドルーゼンの形成は、AMDの病態の進行、即ち視野や視力の低下に相関する。一説によると、網膜におけるドルーゼンの数が増加すること、また、個々のドルーゼンの形成が進み、大きさが増大することにより、Dry AMDの病態が進行し、地図状萎縮等の症状が観察されるようになるとの報告がある。また、ドルーゼンの生成に伴いドルーゼン下の脈絡膜において新生血管が生じ、Wet AMDに特徴的である網膜浮腫や、網膜下液の貯留が認められるようになる。この新生血管は脆弱で破綻が生じるとAMDが、Dry AMDからWet AMDへ移行する症例があるとの報告がある。
また新生血管の誘導因子であるVEGF(vascular endothelial growth factor;血管内皮細胞増殖因子)、またその受容体であるVEGFR(血管内皮細胞増殖因子受容体)は細胞にEMTが生じる際に発現が亢進することが知られているが、Dry AMDの病態であるドルーゼン形成がEMTによるものであるとの新たな知見に基づくと、Dry AMDにおいても、ドルーゼンが生じていれば血管新生が誘起されているものと推測される。
よって、ドルーゼンを抑制することは、Dry AMDを予防・治療することに加えて、Wet AMDを予防・治療することにも繋がり、Wet AMDに移行する前段階のDry AMDにおける血管新生を予防・治療することにも繋がるものと考えられる。
また、本発明者らは、AMDの病態が非常にゆっくりと進行していく場合の原因の1つとして、新たに生成されるドルーゼンと、分解(抑制)されるドルーゼンとのバランスにあるとの仮説を立てている。以下、具体的に説明する。健常者においても、加齢性変化により、ドルーゼンは生成されるが、分解(抑制)されることが優勢であるため、このようなバランス関係を保つ間は、AMDの病態が進行し難い。しかしながら、このバランス関係において均衡が崩れ、ドルーゼンの生成が分解(抑制)より優勢となると、徐々にドルーゼンが残存し、AMDの病態が進行するようになる。本発明者らは、このバランス関係に強く影響を与える要因がEMTであると推測している。すなわち、健常者ではEMTが抑制されているため、RPE細胞は本来の上皮性の形質を維持するが、加齢や外的刺激等により、EMTの亢進が優勢となるとRPE細胞は上皮性の形質を失い、間葉系の形質を有するようになる。後述の実施例において示すように、間葉系の形質を獲得したRPE細胞では、ドルーゼンの構成要素であるコラーゲン等のECMの生成が亢進する。一方、生体において、これらのECMは分解酵素MMP(matrix metalloproteinases)により分解されるが、EMTの亢進によりMMPの活性を抑制するTIMP(tissue inhibitors of metalloproteinases)の発現も亢進する。MMPの活性が抑制される事により、ECMが分解されず、ドルーゼンの分解が抑制される。結果として、EMTの亢進によりドルーゼンが亢進し、AMDが進行する。
また、EMTを抑制する事により、ドルーゼンの構成要素であるコラーゲン等のECMの発現が抑制され、またTIMPの発現が抑制されるためMMP等の活性が有意に発現され、ECMの分解が促進される。結果として、ドルーゼンの生成が抑制されAMDの進行が抑制されると共にドルーゼンの有意な分解によるAMDの治癒が期待される。本発明者らは、生体においては、EMTの亢進により、TIMPによる抑制機構が働き、ドルーゼンの生成が優勢になり、AMDの病態が徐々に進行するものと推測している。
このような推測されるAMD進行のメカニズムに基づくと、外的因子によりEMTを抑制することで、間葉系の形質に関する因子の過剰発現を抑制し、及び/又は生体におけるドルーゼン分解の機構を十分に働かせることにより、ドルーゼンの生成と分解のバランス関係を改善し得る。本発明者らは、生体におけるドルーゼンを再現可能な細胞モデルを確立し、その細胞モデルを用いてEMTを抑制する化合物を評価、スクリーニングし、その化合物によりドルーゼンが抑制されるか否かも検証している。
AMDの分類としては、Dry AMDとWet AMDとの大別の他、初期AMD、中期AMD又は後期AMDとの分類、非進行性AMD又は進行性AMDとの分類等が報告されている。本明細書においては、ドルーゼンが発症・増悪に関与するAMDであれば、いかなる分類であっても予防及び/又は治療の対象となる。
初期AMD、中期AMD又は後期AMDとの分類は、NIHにより提唱されている(NIH Eligibility Categories:A Randomized, Placebo−Controlled, Clinical Trial of High−Dose Supplementation With Vitamins C and E, Beta Carotene, and Zinc for Age−Related Macular Degeneration and Vision Loss Arch Ophthalmol. 2001 October ; 119(10): 1417-1436)。この分類は、一方の眼におけるドルーゼンのサイズ(Drusen Size)、ドルーゼンのエリア(Drusen Area)、色素異常(Pigment Abnormalities)、及び他方の眼の症状により、AMDのカテゴリーをNo AMD(カテゴリー1)、初期AMD(カテゴリー2)、中期AMD(カテゴリー3a、3b)、後期AMD(カテゴリー4a、4b)に分けるものである。
No AMD(カテゴリー1)は、一方の眼におけるドルーゼンのサイズにおいて、無い又は小さい(63μm未満)であり、ドルーゼンのエリアにおいて、直径125μmの円未満(5〜15個のドルーゼン)であり、色素異常が無い、且つ他方の眼においても同様の症状である場合をいう。この分類によれば、No AMD(カテゴリー1)においても、ドルーゼンが生じているため、本発明のドルーゼン抑制剤による予防及び/又は治療の対象となり得る。
ドルーゼンのサイズ及びエリアがより増大した症状に分類される初期AMDや中期AMDでは、本発明のドルーゼン抑制剤がより効果的に用いられるものと推測される。
ドルーゼンはRPE細胞がEMTを引き起こしたことに起因する構造体であるとの新たな知見に基づくと、RPE細胞におけるEMTを抑制することによりドルーゼンが抑制されることが理解される。
RPE細胞のEMT抑制活性を有する化合物(本明細書において、EMT抑制化合物ともいう)は、上述のように、上皮細胞においてEMTへの抑制活性が知られている化合物を含む。RPE細胞においてEMTを抑制する化合物としては、本発明において新たに見出したRPE細胞株におけるEMT誘導モデルを用いて、EMTの抑制が認められた化合物も含まれる。
限定はされないが、EMT抑制化合物は、間葉系マーカー又は細胞外マトリックス(ECM)の発現を抑制する薬剤であり得る。
本発明のドルーゼン抑制剤において、EMT抑制化合物は、限定はされないが、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及び/又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤であり得る。
非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDs)は、限定はされないが、例えば、オキサプロジン、ザルトプロフェン、プラノプロフェン、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、ナプロキセン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、フェノプロフェンカルシウム、ナプロキセン、ピケトプロレン、ピルプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン、キシモプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム等のプロピオン酸系NSAIDs;アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、アンフェナクナトリウム、アントルメチングアシル、ブフェキサマク、シンメタシン、クロピラク、フェルビナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、グルカメタシン、イブフェナク、インドメタシン、インドメタシン ファルネシル、イソフェゾラック、イソキセパック、ロナゾラック、メチアジン酸、オキサメタシン、ピラゾラック、プログルメタシン、チアラミド、トルメチン、トロペシン、ゾメピラック、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、スリンダク、ナブトメン、フェンブフェン、マレイン酸プログルメタシン、モフェゾラク等のアリール酢酸系NSAIDs;エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、フルフェナム酸アルミニウム、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルメート、テロフェナマート、トルフェナム酸等のアミノアリールカルボン酸系NSAIDs;ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェン、キセンブシン等のアリール酪酸系NSAIDs;クリダナク、ケトロラック、チノリジン等のアリールカルボン酸系NSAIDs;アセトアミノサロール、ベノリレート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサラート、フェンドサール、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸 1−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドo−酢酸、サリチル硫酸、サルサレート、スルファサラジン等のサリチル酸系NSAIDs;メフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸等のフェナム酸系NSAIDs;ブコローム等のピリミジン系NSAIDs;アンピロキシカム、テノキシカム、ピロキシカム、メロキシカム、ロルノキシカム、ドロキシカム、イソキシカム等のオキシカム系NSAIDs;エピリゾール、ジフェナミゾール等のピラゾール系NSAIDs;アパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン等のピラゾロン系NSAIDs;塩酸チアラミド、エモルファゾン等の塩基性NSAIDs等、又はこれらの薬学的に許容できる塩が挙げられる。これらのNSAIDsは1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。これらのNSAIDsは、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
これらのNSAIDsのなかでも、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、プロピオン酸系NSAIDs、アミノアリールカルボン酸系NSAIDs又はアリール酢酸系NSAIDsが好ましく、プロピオン酸系NSAIDs、フェナム酸系NSAIDs又はアリール酢酸系NSAIDsがより好ましく、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種がより好ましく、ザルトプロフェン、オキサプロジン、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種が更に好ましい。
アルドース還元酵素阻害剤は、限定はされないが、例えば、エパルレスタット、ゼナレスタット、スタチール、ソルビニール等が挙げられる。これらのアルドース還元酵素阻害剤は1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。これらのアルドース還元酵素阻害剤は、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
これらのアルドース還元酵素阻害剤のなかでも、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、エパルレスタット及び/又はその薬学的に許容できる塩が好ましい。
ロイコトリエン受容体拮抗剤は、限定はされないが、例えば、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト等のシステイニルロイコトリエン1型(CysLT1)受容体の拮抗剤、ジロートン等の5−リポキシゲナーゼ阻害剤等が挙げられる。これらのロイコトリエン受容体拮抗剤は1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。これらのロイコトリエン受容体拮抗剤は、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
これらのロイコトリエン受容体拮抗剤のなかでも、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト等のシステイニルロイコトリエン1型(CysLT1)受容体の拮抗剤が好ましく、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種がより好ましく、ザフィルルカスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩が更に好ましい。
ケミカルメディエーター遊離抑制剤は、限定はされないが、例えば、アンレキサノクス、クロモグリク酸ナトリウム、ペミロラストカリウム、イブジラスト等が挙げられる。これらのケミカルメディエーター遊離抑制剤は1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。これらのケミカルメディエーター遊離抑制剤は、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
これらのケミカルメディエーター遊離抑制剤のなかでも、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩が好ましい。
トロンボキサンA2拮抗薬は、限定はされないが、例えば、トロンボキサンA2受容体拮抗薬又はトロンボキサンA2合成酵素阻害薬が挙げられる。トロンボキサンA2受容体拮抗薬としては、例えば、セラトロダスト又はラマトロパン等が挙げられ、トロンボキサンA2合成酵素阻害薬としては、例えば、塩酸オザグレル等が挙げられる。これらのトロンボキサンA2拮抗薬は1種単独で使用してもよく、また2種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。これらのトロンボキサンA2拮抗薬は、公知の方法により合成して使用しても、市販品を入手して使用してもよい。
これらのトロンボキサンA2拮抗薬のなかでも、顕著なEMT抑制効果を奏する観点から、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩が好ましい。
[加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤]
本発明のドルーゼン抑制剤は、主には、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤として用いられる。このような加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤としては、プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤を有効成分として含有し、上記アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/又はその薬学的に許容できる塩を用いることが可能である。このような有効成分は、[ドルーゼン抑制剤]の項目で説明した成分に準じる。
[血管新生阻害剤との併用]
本発明において、血管新生阻害剤と、本発明のドルーゼン抑制剤とを組み合わせてなる、AMD予防及び/又は治療剤を提供することができる。
本明細書において、「血管新生阻害剤」とは、血管新生を防止する効果を有する薬剤、血管新生の増悪を防止する効果を有する薬剤、又は形成された新生血管を減少若しくは消失させる効果を有する薬剤をいう。血管新生阻害剤としては、限定はされないが、抗VEGF抗体又はそのフラグメント(Fabフラグメント、一本鎖可変フラグメント(scFv)等)、抗VEGF抗体のフラグメントとIgG分子のFcドメインとの融合タンパク質、抗血管新生アプタマー(RNAアプタマー等)等が挙げられる。血管新生阻害剤は、上市されている公知の血管新生阻害剤を用いることも可能であり、限定はされないが、例えば、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、ラニビズマブ(ルセンティス(登録商標))、アフリベルセプト(アイリーア(登録商標))、ペガプタニブナトリウム(マクジェン(登録商標))、ESBA−1008、ラムパリズマブ、MC−1101、ドキシサイクリンヒクラート、エミクススタト塩酸塩等が挙げられる。具体的には、上述のEMT抑制化合物と、血管新生阻害剤とを、患者の症状や状態、期待される治療効果等を総合的に考慮し、適宜に組み合わせて用いることが可能である。
AMDでは、形成されたドルーゼン下の脈絡膜において血管新生が生じることが知られており、ドルーゼン下の血管新生を阻害することと、ドルーゼンを抑制することとが相俟って、優れたAMDの予防・治療効果が得られるものと推測される。AMDにおいて血管新生が生じる分類としては、Wet AMD、初期及び/又は中期AMDが挙げられる。初期及び/又は中期AMDでは、ドルーゼンの数や大きさが増大することに加えて、脆弱な新生血管が生成しているものと推測される。また、Dry AMDにおいても、ドルーゼンが生じている場合は、血管新生が誘起されていることが推測される。この脆弱な新生血管からの血液成分が滲出することや、脆弱な血管が破れることでWet AMDへの移行が急速に進行する。また、脆弱血管が微小にでも生じ得る初期AMDから予防的に治療を開始することが重要であると考えられる。よって、本発明において、ドルーゼン抑制剤は、血管新生阻害剤と併用されることによって、好ましくはWet AMDの予防及び/又は治療に用いられ、より好ましくは中期AMDの予防及び/又は治療に用いられ、更に好ましくは初期及び/又は中期AMDの予防及び/又は治療に用いられる。
本発明のドルーゼン抑制剤を併用薬として用いることにより、血管新生阻害剤の用量、投与間隔、投与回数を抑えることが可能となり、医療経済上の効果を期待し得る。
また、一つの実施形態において、本発明のドルーゼン抑制剤は、光線力学療法(PDT)と併用して治療に用いられ得る。光線力学療法では、新生血管に選択的に移行するVerteporfin等の薬剤を使用されるが、レーザー照射により正常な脈絡膜も多少の傷害を受けることが知られている。よって、光線力学療法におけるVerteporfin等の薬剤の用量や、レーザーの照射時間・照射量を低減しつつ、本発明のドルーゼン抑制剤を用いることで、効果的なAMDの予防及び/又は治療が行い得る。
また、一つの実施形態において、本発明のドルーゼン抑制剤は、血管新生阻害剤と、光線力学療法とを適宜に組合せてAMDの予防及び/又は治療に用いることも可能である。
[EMT誘導モデル]の項目で述べたRPE細胞を用いたEMT誘導モデルは、遺伝子発現、タンパク質の分泌、運動能、Focus形成等において、AMDのドルーゼンと同様の形質を示すため、AMDの細胞モデルとして有効に用いられ得る。
[被験物質の評価又はスクリーニング方法]
上述のEMT誘導モデルを用いて、インビトロにおいて薬剤感受性を評価することができる。さらに本発明のEMT誘導モデルは、ドルーゼン抑制剤の評価又はスクリーニングに有用である。
限定はされないが、例えば、RPE細胞のEMT誘導モデルによってドルーゼンをインビトロにおいて再現し、そのようなドルーゼン様構造体を異なる濃度の被験薬剤存在下または不存在下で接触させ、薬剤の添加前後におけるドルーゼン様構造体の状態を測定して比較することによって薬剤の評価又はスクリーニングが行われ得る。また、薬剤の評価又はスクリーニングは、RPE細胞において、薬剤の存在下又は非存在下でEMTを誘導し、薬剤の存在下又は非存在下におけるドルーゼン様構造体の状態を測定して比較することによっても行われ得る。ドルーゼン様構造体の状態の測定には、例えば、上皮系マーカー、間葉系マーカー及びECMからなる群より選択される少なくとも1種の発現(分泌)を測定すること、細胞の形態変化を観察すること、又は細胞の運動能の変化を測定することが挙げられる。RPE細胞におけるEMTが抑制されると、間葉系マーカー及び/若しくはECMが抑制される、運動能が抑制される、並びに/又は細胞形態が紡錘状から立方状に変形し、ドルーゼン様構造体(Focus)の形成が抑制される等の現象が確認される。
ドルーゼン様構造体(Focus)の形成度により、薬剤の評価及び/又はスクリーニングを行う場合、限定はされないが、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導すること、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させること、細胞のドルーゼン様構造体(Focus)の形成を測定することを含む方法により行うことができる。一つの実施態様において、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導することと、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させることは同時に行うことも可能である。一つの実施態様において、上記の方法は、接触反応後に細胞を固定することを含むことも可能である。
RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させるステップにおいては、被験薬剤の濃度を低濃度から高濃度まで段階に分けて反応させることを含む。被験薬剤の濃度は、薬剤の種類等により、適宜調整され得るが、例えば、0μM(非存在下、非添加時)〜500μMとすることができ、0.1〜400μMであってもよく、0.5〜300μMであってもよい。
RPE細胞と被験薬剤との接触反応時間は、例えば5分〜120時間とすることが可能であり、EMTの抑制によって間葉性の形質が十分に抑制されることの観点から、10分〜108時間とすることが好ましく、1〜96時間とすることがより好ましく、10〜84時間とすることが更に好ましく、24〜72時間とすることが特に好ましく、48〜60時間とすることが最も好ましい。
RPE細胞と被験薬剤との接触反応温度は、薬剤の種類等により、適宜調整され得るが、例えば、4〜50℃とすることが可能であり、10〜45℃が好ましく、20℃〜40℃がより好ましく、30〜37℃が更に好ましい。
接触反応後に細胞を固定するステップにおいて、細胞の固定方法としては、公知の方法を用いることが可能である。限定はされないが、例えば、パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定することが可能である。
細胞のドルーゼン様構造体(Focus)の形成を測定するステップにおいて、更に細胞を染色すること、及び/又はドルーゼン様構造体(Focus)の形成率又は形成抑制率を解析することを含むことができる。
細胞の染色は、限定されず、公知の染色法を用いることが可能であるが、蛍光染色が好ましく、蛍光物質による核染色及び/又はアクチン染色がより好ましい。核染色としては、例えば、7−AAD(7−aminoactinomycin D)、Acridine Orange、DAPI、DMAO、Ethidium Bromide、Hoechst、Propidium Iodide (PI)等が挙げられ、染色性の観点から、Hoechstが好ましい。アクチン染色としては、例えば、ファロイジンが好ましく用いられる。
ドルーゼン様構造体(Focus)の形成率又は形成抑制率の解析は、例えば、候補薬剤の非添加時のドルーゼン様構造体(Focus)の形成状態と、特定の濃度の候補薬剤添加時のドルーゼン様構造体(Focus)の形成状態とを画像化し、数値化することを含む。さらに、両者の数値データを対比することにより、ドルーゼン様構造体(Focus)形成率又は形成抑制率を算出することを含む。ドルーゼン様構造体(Focus)の形成状態を画像化し、数値化することは、公知の画像化技術、数値化技術により行うことが可能であるが、例えば、ドルーゼン様構造体(Focus)の直径、面積、体積等を指標にすることが可能であり、より正確で再現性の高い解析を行う観点から、ドルーゼン様構造体(Focus)の体積を測定して数値化することが好ましく、ドルーゼン様構造体(Focus)の数、厚み、体積を総合評価して数値化することも好ましい。
間葉系マーカー及び/若しくはECMの抑制により、薬剤の評価及び/又はスクリーニングを行う場合、限定はされないが、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導すること、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させること、接触反応後に細胞からRNAを抽出すること、mRNAの発現を定量分析することを含む方法により行うことができる。一つの実施態様において、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導することと、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させることは同時に行うことも可能である。
EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導するステップ、及びRPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させるステップは、ドルーゼン様構造体(Focus)の形成度の項目に準じる。
接触反応後に細胞からRNAを抽出するステップは、公知のRNA抽出方法を用いることが可能である。市販のRNA抽出キット等を用いることが好ましい。
mRNAの発現を定量分析するステップは、限定はされないが、リアルタイムPCR法を用いることが好ましい。リアルタイムPCR法で測定するEMTマーカーとしては、上記のドルーゼン抑制剤の項目で説明した間葉系マーカー、ECM等のEMTマーカーを用いることが可能であるが、再現性よくリアルタイムPCR法で測定し得るEMTマーカーを用いる観点から、間葉系マーカーとしては、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2が好ましく、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7がより好ましい。また、ECMとしては、再現性よくリアルタイムPCR法で測定し得るEMTマーカーを用いる観点から、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、CSPG4、SRGN、FN1、VIM、COL5A2、COL13A1、LAMB3が好ましく、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNCがより好ましい。
運動能の抑制により、薬剤の評価及び/又はスクリーニングを行う場合、限定はされないが、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導すること、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させること、接触反応後に細胞を回収すること、回収した細胞を用いてInvasion Assayをすることを含む方法により行うことができる。一つの実施態様において、EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導することと、RPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させることは同時に行うことも可能である。
EMT誘導モデルを用いてRPE細胞にEMTを誘導するステップ、及びRPE細胞と被験薬剤とを接触して反応させるステップは、ドルーゼン様構造体(Focus)の形成度の項目に準じる。
接触反応後の細胞は、公知の方法により回収され、市販のInvasion Assayキット等を用いて運動能の評価を行うことが可能である。運動能の評価は、細胞の移動(浸潤)を画像解析すること、及び/又は浸潤細胞数をカウントすることにより行うことが可能である。
ここで、評価される被験薬剤は、既知の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物であってもよく、また上皮間葉転換抑制活性を有することが知られていない化合物であってもよい。さらに、新規に合成された化合物であってもよい。
[製剤等]
本発明は、必要に応じて添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。例えば、経口投与に適した剤型である、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、または丸剤として提供され得る。本発明はまた、非経口投与に適した剤型である、注射剤、眼科用剤または貼布剤として提供され得る。本発明は、これらの製剤の他にドラッグデリバリーシステム化された製剤として提供することもできる。
本発明における脈絡膜新生血管の予防及び/若しくは治療剤、又はドルーゼン抑制剤を使用する場合の用量は、対象とする疾患の種類、患者の年齢、体重、適応症状およびその剤型などによって異なるが、たとえば注射剤では、成人1日1回〜数回で1日あたり約1mg〜約1000mg、経口投与の場合、一般には、成人1日1回〜数回で1日あたり0.01〜10000mg、好ましくは0.1〜5000mg、より好ましくは0.5〜2500mgを1回または数回に分けて投与することができ、注射剤の場合、一般には、成人に対し0.0001〜2000mgを1回または数回に分けて投与することができる。また、点眼剤または挿入剤の場合には、0.000001〜10%(w/v)、好ましくは0.00001〜1%(w/v)、より好ましくは0.0001〜0.1%(w/v)の有効成分濃度のものを1日1回または数回投与することができる。さらに、貼布剤の場合は、成人に対し0.0001〜2000mgを含有する貼布剤を貼布することができる。
本明細書において、「Cmax」とは、投与間隔内で得られる薬剤の最大血漿中濃度をいう。既存の薬剤であれば、薬剤のインタビューフォームや添付文書により求めることができる。Cmaxは、投与後約1〜約48時間、約1〜約20時間、約1〜約18時間、約1〜約16時間、約1〜約12時間、約1〜約10時間、約1〜約8時間、約1〜約6時間、または約1〜約4時間においてもたらされる。
限定はされないが、有効成分として、ザルトプロフェンを使用する場合の用量は、成人の1日量を25〜360mgとすることが好ましく、50〜300mgとすることがより好ましく、70〜260mgとすることが更に好ましく、80〜240mgとすることが特に好ましく、80mgとすることが最も好ましい。また、頓用の場合、ザルトプロフェンの用量は、1日量を80〜160mgとすることができる。ザルトプロフェンの用量は、1日最高量を240mgとすることができる。ザルトプロフェンの場合のCmaxは、20.4μMである(「日本薬局方 ザルトプロフェン錠 非ステロイド性鎮痛・消炎剤 ソルイルビン(登録商標)錠80」医薬品インタビューフォーム、2012年4月(改訂第4版)、単回投与の場合)。ザルトプロフェンの用量は、約20.4μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。また、ザルトプロフェンのCmaxは、配合する添加物の種類等によっては16.8μMであり得る(「非ステロイド性鎮痛・消炎剤 ソレトン錠(登録商標)80 日本薬局方 ザルトプロフェン錠」医薬品インタビューフォーム、2015年8月改訂(第6版)、単回投与の場合)。この場合、ザルトプロフェンの用量は、約16.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、ザルトプロフェンの1日量は240〜360mg、240〜300mg、240〜260mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、ザルトプロフェンの1日量は120〜360mg、120〜300mg、120〜260mg、120〜240mg、120〜220mg、120〜200mg、120〜180mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、ザルトプロフェンの1日量は60〜360mg、60〜300mg、60〜260mg、60〜240mg、60〜200mg、60〜160mg、60〜120mg、60〜80mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、ザルトプロフェンがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、オキサプロジンを使用する場合の用量は、成人の1日量を100〜700mgとすることが好ましく、200〜600mgとすることがより好ましく、300〜500mgとすることが更に好ましく、400mgとすることが特に好ましい。最大薬物血漿中濃度(Cmax)は、公知の方法により算出されるが、オキサプロジンの場合のCmaxは、340.9μMである(「持続性消炎・鎮痛剤 アルボ(登録商標)錠100mg アルボ(登録商標)錠200mg オキサプロジン製剤」医薬品インタビューフォーム、2011年11月(新様式改訂第3版)、反復投与の場合)。オキサプロジンの用量は、約340.9μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、オキサプロジンの1日量は400〜700mg、400〜600mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、オキサプロジンの1日量は200〜700mg、200〜600mg、200〜500mg、200〜400mg、200〜300mgとすることもできる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、オキサプロジンの1日量は100〜700mg、100〜600mg、100〜500mg、100〜400mg、100〜300mg、100〜150mgとすることもできる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、オキサプロジンがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、チアプロフェン酸を使用する場合の用量は、成人の1日量を60〜900mgとすることが好ましく、100〜800mgとすることがより好ましく、150〜700mgとすることが更に好ましく、200mg〜600mgとすることが特に好ましく、600mgとすることが最も好ましい。また、頓用の場合、チアプロフェン酸の用量は、1日量を200mgとすることができる。チアプロフェン酸の用量は、1日最高量を600mgとすることができる。チアプロフェン酸の場合のCmaxは、69.15μMである(「鎮痛・抗炎症剤、スルガム(登録商標)錠100mg、200mg」医薬品インタビューフォーム、2014年8月改訂(改訂第5版)、単回投与の場合)。チアプロフェン酸の用量は、約69.15μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、チアプロフェン酸の1日量は600〜900mg、600〜800mg、600〜700mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、チアプロフェン酸の1日量は300〜900mg、300〜800mg、300〜700mg、300〜600mg、300〜500mg、300〜400mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、チアプロフェン酸の1日量は150〜900mg、150〜800mg、150〜700mg、150〜600mg、150〜500mg、150〜400mg、150〜300mg、150〜250mg、150〜200mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、チアプロフェン酸がBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、フルフェナム酸アルミニウムを使用する場合の用量は、成人の1日量を75〜1250mgとすることが好ましく、150〜1000mgとすることがより好ましく、200〜800mgとすることが更に好ましく、250〜750mgとすることが特に好ましく、375〜750mgとすることが最も好ましい。また、頓用の場合、フルフェナム酸アルミニウムの用量は、1日量を250mgとすることができる。フルフェナム酸アルミニウムの用量は、1日最高量を750mgとすることができる。フルフェナム酸アルミニウムの場合のCmaxは、27.91μMである(「非ステロイド性消炎・鎮痛・解熱剤 オパイリン(登録商標)錠125mg」医薬品インタビューフォーム、2011年12月作成(新様式第4版)、単回投与の場合)。フルフェナム酸アルミニウムの用量は、約27.91μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、フルフェナム酸アルミニウムの1日量は750〜1250mg、750〜1000mg、750〜800mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、フルフェナム酸アルミニウムの1日量は400〜1250mg、400〜1000mg、400〜800mg、400〜750mg、400〜500mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、フルフェナム酸アルミニウムの1日量は200〜1250mg、200〜1000mg、200〜800mg、200〜500mg、200〜400mg、200〜300mg、200〜250mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、フルフェナム酸アルミニウムがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、メフェナム酸を使用する場合の用量は、成人の1日量を150〜2250mgとすることが好ましく、250〜1800mgとすることがより好ましく、400〜1600mgとすることが更に好ましく、500〜1500mgとすることが特に好ましく、1000〜1500mgとすることが最も好ましい。また、頓用の場合、メフェナム酸の用量は、1日量を500mgとすることができる。メフェナム酸の用量は、1日最高量を1500mgとすることができる。メフェナム酸の場合のCmaxは、38.54μMである(「鎮痛・消炎・解熱剤 ポンタール(登録商標)錠250mg」医薬品インタビューフォーム、2015年7月改訂(第9版)、単回投与の場合)。メフェナム酸の用量は、約38.54μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、メフェナム酸の1日量は1000〜2250mg、1000〜1800mg、1000〜1600mg、1000〜1500mg、1000〜1200mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、メフェナム酸の1日量は500〜2250mg、500〜1800mg、500〜1600mg、500〜1500mg、500〜1200mg、500〜1000mg、500〜800mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、メフェナム酸の1日量は150〜2250mg、250〜1800mg、250〜1600mg、250〜1500mg、250〜1200mg、250〜1000mg、250〜800mg、250〜500mg、250〜300mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、メフェナム酸がBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、スリンダクを使用する場合の用量は、成人の1日量を30〜500mgとすることが好ましく、100〜450mgとすることがより好ましく、200〜400mgとすることが更に好ましく、250〜350mgとすることが特に好ましく、300mgとすることが最も好ましい。スリンダクの場合のCmaxは、10.10μMである(「非ステロイド性消炎・鎮痛剤 クリノリル(登録商標)錠50、100」医薬品インタビューフォーム、2011年3月改訂(改訂第3版)、単回投与の場合)。スリンダクの用量は、約10.10μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、スリンダクの1日量は300〜500mg、300〜450mg、300〜400mg、300〜350mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、スリンダクの1日量は200〜500mg、200〜450mg、200〜400mg、200〜350mg、200〜300mg、200〜250mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、スリンダクの1日量は100〜500mg、100〜450mg、100〜400mg、100〜350mg、100〜300mg、100〜250mg、100〜200mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、スリンダクがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、エパルレスタットを使用する場合の用量は、成人の1日量を10〜400mgとすることが好ましく、50〜300mgとすることがより好ましく、100〜200mgとすることが更に好ましく、150mgとすることが特に好ましい。エパルレスタットの場合のCmaxは、12.2μMである(「アルドース還元酵素阻害剤 日本薬局方 エパルレスタット錠 キネダック(登録商標)錠50mg」医薬品インタビューフォーム、2013年11月改訂(第6版)、単回投与の場合)。エパルレスタットの用量は、約12.2μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、エパルレスタットの1日量は150〜400mg、150〜300mg、150〜200mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、エパルレスタットの1日量は75〜400mg、75〜300mg、75〜200mg、75〜150mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、エパルレスタットの1日量は37〜400mg、37〜300mg、37〜200mg、37〜150mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、エパルレスタットがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、ザフィルルカストを使用する場合の用量は、成人の1日量を10〜200mgとすることが好ましく、20〜150mgとすることがより好ましく、30〜100mgとすることが更に好ましく、40〜80mgとすることが特に好ましい。ザフィルルカストの場合のCmaxは、0.8μMである(「ロイコトリエン受容体拮抗剤/気管支喘息治療剤 アコレート(登録商標)錠20mg ザフィルルカスト錠」医薬品インタビューフォーム、2015年1月作成(改訂第9版)、単回投与の場合)。ザフィルルカストの用量は、約0.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、ザフィルルカストの1日量は40〜200mg、40〜150mg、40〜100mg、40〜80mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、ザフィルルカストの1日量は20〜200mg、20〜150mg、20〜100mg、20〜80mg、20〜40mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、ザフィルルカストの1日量は10〜200mg、10〜150mg、10〜100mg、10〜80mg、10〜40mg、10〜20mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、ザフィルルカストがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、アンレキサノクスを使用する場合の用量は、成人の1日量を10〜150mgとすることが好ましく、15〜100mgとすることがより好ましく、20〜80mgとすることが更に好ましく、25〜50mgとすることが特に好ましい。アンレキサノクスの場合のCmaxは、16.0μMである(「喘息・アレルギー性鼻炎治療剤 日本薬局方 アンレキサノクス錠 ソルファ(登録商標)25mg錠 ソルファ(登録商標)50mg錠」医薬品インタビューフォーム、2012年10月改訂(改訂第2版)、単回投与の場合)。アンレキサノクスの用量は、約16.0μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、アンレキサノクスの1日量は75〜150mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、アンレキサノクスの1日量は37〜150mg、37〜100mg、37〜75mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、アンレキサノクスの1日量は18〜150mg、18〜100mg、18〜75mg、18〜37mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、アンレキサノクスがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
限定はされないが、有効成分として、セラトロダストを使用する場合の用量は、成人の1日量を8〜120mgとすることが好ましく、25〜110mgとすることがより好ましく、50〜100mgとすることが更に好ましく、70〜90mgとすることが特に好ましく、80mgとすることが最も好ましい。セラトロダストの場合のCmaxは、31.03μMである(「トロンボキサンA2受容体拮抗剤 ブロニカ(登録商標)錠40、80」医薬品インタビューフォーム、2016年10月改訂(第4版)、単回投与の場合)。セラトロダストの用量は、約31.03μM以上のCmaxがもたらされる投与量であることが好ましく、本願発明の効果を奏する限り、Cmaxの1/2量以上やCmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量であってもよい。上記Cmaxがもたらされる観点から、セラトロダストの1日量は80〜120mg、80〜110mg、80〜100mg、80〜90mgとすることができる。上記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる観点から、セラトロダストの1日量は50〜120mg、50〜110mg、50〜100mg、50〜90mg、50〜80mg、50〜70mgとすることができる。上記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる観点から、セラトロダストの1日量は25〜120mg、25〜110mg、25〜100mg、25〜90mg、25〜80mg、25〜60mg、25〜40mgとすることができる。上記の投与は、注射剤又は経口によるものが好ましい。上記の血中濃度がもたらされることで、セラトロダストがBRBを透過し、効果的にCNV又はドルーゼンを抑制することが期待される。
本明細書において、製剤の剤型は特に制限されず、液剤(懸濁剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤など)や、固形製剤(粉末剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤など)であってもよい。
本明細書で提供される製剤は、限定はされないが、4.0〜8.5のpHを有し得る。本発明の効果を顕著に奏する観点から、製剤のpHは、4.5以上が好ましく、5.0以上がより好ましく、5.5以上が更に好ましく、6.0以上が特に好ましく、6.5以上が最も好ましい。また、本発明の効果を顕著に奏する観点から、製剤のpHは、8.0以下が好ましく、7.8以下がより好ましく、7.7以下が更に好ましく、7.6以下が特に好ましく、7.5以下が最も好ましい。また、本発明の効果を顕著に奏する観点から、製剤のpHは、4.5〜8.0が好ましく、5.0〜7.8がより好ましく、5.5〜7.7が更に好ましく、6.0〜7.6が特に好ましく、6.5〜7.6が最も好ましい。
[固形製剤]
本明細書で提供される製剤は、安定性などを損なわない限り、製剤の形態に応じて、慣用の担体成分を添加して、慣用の方法により調製できる。例えば、錠剤であれば、粉末状の活性成分と製薬上許容される担体成分(賦形剤など)とを混合して圧縮成形することにより調製できる。さらに、固形製剤のうち顆粒剤などの粉粒剤は、種々の造粒法(押出造粒法、粉砕造粒法、乾式圧密造粒法、流動層造粒法、転動造粒法、高速攪拌造粒法など)により調製してもよく、錠剤は、上記造粒法、打錠法(湿式打錠法、直接打錠法)などを適当に組み合わせて調製できる。錠剤には、糖衣コーティングを施し、糖衣錠としてもよい。さらに、錠剤は単層錠であってもよく、二層錠などの積層錠であってもよい。固形製剤の好ましい剤型は、錠剤(例えば、口中咀嚼型の錠剤)である。
固形製剤において、担体成分又は添加剤としては、例えば、賦形剤(D−ソルビトール、D−マンニトール、キシリトールなどの糖アルコール、ブドウ糖、白糖、乳糖、果糖などの糖類、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、βーシクロデキストリン、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、カオリンなど);崩壊剤(低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプンなど);結合剤(メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステルなど);滑沢剤(ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなど);抗酸化剤(ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、トコフェロール、クエン酸など);コーティング剤(ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、メタアクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタートジエチルアミノアセテート、セラックなど);着色剤(ウコン抽出液、リボフラビン、酸化チタン、カロチン液など);矯味剤(アスパルテーム、アスコルビン酸、ステビア、メントール、カンゾウ粗エキス、単シロップなど);発泡剤(炭酸水素ナトリウムなど);流動化剤(メタケイ酸アルミン酸ナトリウム、軽質無水ケイ酸など)界面活性剤(ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン、ポリソルベート類、ラウリル硫酸ナトリウム、マクロゴール6000等のマクロゴール類、ショ糖脂肪酸エステルなど);可塑剤(クエン酸トリエチル、ポリエチレングリコール、トリアセチン、セタノールなど);甘味剤(ショ糖、マンニトール、アスパルテームなどの天然又は合成甘味剤);着香剤(メントールなど);吸着剤、防腐剤、湿潤剤、帯電防止剤などが挙げられる。
製剤が固形製剤である場合、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、限定はされないが、製剤の全量に対して、0.1〜30重量%とすることができ、0.5〜25重量%であることが好ましく、0.5〜 20重量%であることがより好ましい。また、本化合物の含有量は、0.01〜3重量%であってもよく、0.02〜2重量%であってもよく、0.03〜1重量%であってもよい。
[眼科用剤]
眼科用剤とする場合、性状は特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの性状であってもよい。眼科用剤の種類は特に限定されない。例えば、点眼剤、眼軟膏(水溶性眼軟膏、油溶性眼軟膏)、及び眼内注射剤(例えば、硝子体内注射剤)などが挙げられる。
また、固形状以外の液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの眼科用剤は、水性組成物であってもよく、軟膏剤などのように油性組成物であってもよい。
眼科用剤の調製方法は良く知られている。ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物を、薬学的に許容される基剤又は担体、必要に応じて、薬学的に許容される眼科用製剤用の添加剤、及びその他の有効成分(本化合物以外の生理活性成分又は薬理活性成分)と混合することにより調製できる。
基剤又は担体は、例えば、水;極性溶媒のような水性溶媒;多価アルコール;植物油;油性基剤などが挙げられる。眼内注射剤の基剤又は担体としては、注射用蒸留水または生理用食塩水が挙げられる。基剤又は担体は、1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて使用できる。
眼科用剤とする場合の添加剤としては、例えば、界面活性剤、香料又は清涼化剤、防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤、pH調節剤、等張化剤、キレート剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、及び粘稠化剤などが挙げられる。眼内注射剤には、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、安定化剤、及び防腐剤などが含まれていてもよい。添加剤は、1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて使用できる。
眼科用剤が、固形製剤以外の、例えば、液体状、流動状、ゲル状、又は半固形状などの製剤である場合、眼科用組成物中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、組成物の全体量に対して、0.00001重量%以上とすることができ、0.0001重量%以上が好ましく、0.001重量%以上がより好ましい。また、眼科用組成物中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、組成物の全体量に対して、0.01重量%以上であってもよく、0.1重量%以上であってもよく、1重量%以上であってもよい。上記範囲であれば、網膜疾患の予防、改善、又は治療効果が十分に得られる。
また、眼科用剤が、固形製剤以外の、例えば、液体状、流動状、ゲル状、又は半固形状などの製剤である場合、眼科用組成物中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、組成物の全体量に対して、10重量%以下とすることができ、5重量%以下が好ましく、3重量%以下がより好ましい。上記範囲であれば、網膜疾患の予防、改善、又は治療効果が十分に得られると共に、点眼時に異物感がより少ない製剤となる。
眼科用剤が、固形製剤以外の、例えば、液体状、流動状、ゲル状、又は半固形状などの製剤である場合、眼科用組成物中の本化合物の含有量としては、組成物の全体量に対して、0.00001〜10重量%、0.00001〜5重量%、0.00001〜3重量%、0.0001〜10重量%、0.0001〜5重量%、0.0001〜3重量%、0.001〜10重量%、0.001〜5重量%、0.001〜3重量%、0.01〜10重量%、0.01〜5重量%、0.01〜3重量%、0.1〜10重量%、0.1〜5重量%、0.1〜3重量%、1〜10重量%、1〜5重量%、1〜3重量%とすることができる。
眼科用剤が水分を含む組成物である場合の眼科用剤のpHは、限定はされないが、4以上が好ましく、5.5以上がより好ましく、6以上がさらにより好ましく、6.5以上がさらにより好ましい。上記範囲であれば、本化合物の熱及び光に対する安定性が良好な製剤になる。また、眼科用剤のpHは、9以下が好ましく、8.5以下がより好ましく、8以下がさらにより好ましく、7.5以下がさらにより好ましい。上記範囲であれば、眼への刺激が抑えられる。
[注射剤]
注射剤は、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物を、注射用蒸留水または生理用食塩水などに溶解又は分散させ、例えば日本薬局方記載の公知の方法で調製できる。また、注射剤には、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、安定化剤、及び防腐剤などの薬学的に許容される担体、又はさらに薬学的に許容される注射剤用の添加剤が含まれていてもよい。
注射剤には、網膜疾患の予防、改善、又は治療成分以外の薬理活性成分又は生理活性成分を配合することができる。このような薬理活性成分や生理活性成分として、例えば、神経栄養因子、充血除去成分、眼筋調節薬成分、抗炎症薬成分又は収斂薬成分、抗ヒスタミン薬成分又は抗アレルギー薬成分、ビタミン類、アミノ酸類、抗菌薬成分又は殺菌薬成分などが挙げられる。
注射剤中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、製剤の全量に対して、0.001重量%以上が好ましく、0.01重量%以上がより好ましく、0.1重量%以上がさらにより好ましい。また、80重量%以下が好ましく、60重量%以下がより好ましく、50重量%以下がさらにより好ましい。上記範囲であれば、網膜疾患の予防、改善、又は治療効果が十分に得られる。
注射剤中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、製剤の全量に対して、0.001〜80重量%、0.001〜60重量%、0.001〜50重量%、0.01〜80重量%、0.01〜60重量%、0.01〜50重量%、0.1〜80重量%、0.1〜60重量%、0.1〜50重量%とすることができる。
注射剤において、添加剤、及びザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物以外の薬理活性成分又は生理活性成分は、1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて使用できる。
[カプセル剤]
カプセル剤は、慣用の方法により、カプセル(軟質又は硬質カプセル)内に粉粒剤(粉剤、顆粒剤など)を充填することにより調製できる。製剤がカプセル剤である場合、当該調製物中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、限定はされないが、製剤の全量に対して、0.01〜3重量%とすることができ、0.02〜2重量%であることが好ましく、0.03〜1重量%であることがより好ましい。このような液状調製物を軟カプセル等に充填して、軟カプセル剤等として用いる事が好ましい。
製剤が硬カプセル剤である場合、カプセル剤皮を含まない当該硬カプセル剤用の内容物中のザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種、又はEMT抑制化合物の含有量は、限定はされないが、製剤の全量に対して、0.1〜30重量%とすることができ、0.5〜25重量%であることが好ましく、0.5〜 20重量%であることがより好ましい。また、本化合物の含有量は、0.01〜3重量%であってもよく、0.02〜2重量%であってもよく、0.03〜1重量%であってもよい。
液剤の場合の添加物としては、油性基剤(例えば、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油、綿実油などの植物油;中鎖脂肪酸トリグリセリドなど)、水性基剤(例えば、マクロゴール400、水)、ゲル基剤(例えば、カルボキシビニルポリマー、ガム質など)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート80、硬化ヒマシ油、グリセリン脂肪酸エステル、セスキオレイン酸ソルビタンなど)、懸濁化剤(例えば、カオリン、カルメロースナトリウム、トラガント、サラシミツロウや各種界面活性剤、アラビアゴム、アラビアゴム末、キサンタンガム、大豆レシチンなど)、分散剤、乳化剤、安定化剤、緩衝剤、溶解補助剤、消泡剤(ジメチルポリシロキサン、シリコン消泡剤など)、pH調節剤(クエン酸、リンゴ酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二カリウムなど)、防腐剤(保存剤)、清涼化剤(l−メントール、ハッカ水など)などが挙げられる。またこれらの液剤にはいずれの場合でも、抗酸化剤、甘味剤、酸味剤、着色剤、香料、および呈味剤などを適宜添加してもよい。
液剤は、例えば、各成分を担体成分である水性媒体(精製水、エタノール含有精製水など)に溶解又は分散させ、必要により濾過又は滅菌処理し、所定の容器に充填し、滅菌処理することにより調製できる。
上記組成物は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば医薬品、医薬部外品、機能性食品などとすることができる。
[機能性食品]
本発明は、機能性食品としても提供され得る。本明細書において、機能性食品とは、国や公共団体が許可・指定している医薬品的な効能を有する飲食品又は企業が国等に所定の効果を届け出た内容に基づき機能性を表示した飲食品をいう。機能性食品には、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、老人用食品、健康補助食品(バランス栄養食、サプリメント)等が挙げられる。医薬品的な効能又は機能性を表示したパッケージや容器、添付文書、取扱い説明書等を含む飲食品も含まれる。国等への申請書に医薬品的な効能又は機能性を表示した飲食品も含まれる。このような表示には、脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療に係る表示、AMD、初期・中期AMD、Dry AMD、WetAMD等のAMDへの予防及び/又は治療に係る表示、視野の歪み(変視症)、視野の色調、光過敏、急激な視力低下、中心暗点等のAMDに特徴的な症状の予防、改善、及び/又は治療に係る表示等が挙げられる。
[実施形態]
上述した実施の形態に関し、限定はされないが、本発明は以下の実施形態を開示する。
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有する、脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
経口剤又は注射剤である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記経口剤が、固形製剤である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記固形製剤が、錠剤である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
液剤である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記脈絡膜新生血管が、加齢性黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)、又は網膜血管腫状増殖(RAP)において生じる、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記脈絡膜新生血管が、RPE細胞のEMTによって生じる、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種が、RPE細胞のEMTを抑制するために十分な量で投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種が、RPE細胞における間葉系マーカー又は細胞外マトリックスの発現を抑制するために十分な量で投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、及びVIMからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、SRGN、FN1、COL5A2、COL13A1、及びLAMB3からなる群より選択される少なくとも1種である、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
20.4μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
16.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
340.9μM以上のCmaxがもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
69.15μM以上のCmaxがもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
27.91μM以上のCmaxがもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
38.54μM以上のCmaxがもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
10.10μM以上のCmaxがもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
12.2μM以上のCmaxがもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
0.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
16.0μM以上のCmaxがもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
31.03μM以上のCmaxがもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてザルトプロフェン又はその塩を25〜360mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてオキサプロジン又はその塩を100〜700mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてチアプロフェン酸又はその塩を60〜900mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてフルフェナム酸又はその塩を75〜1250mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてメフェナム酸又はその塩を150〜2250mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてスリンダク又はその塩を30〜500mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてエパルレスタット又はその塩を10〜400mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてザフィルルカスト又はその塩を10〜200mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてアンレキサノクス又はその塩を10〜150mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日量としてセラトロダスト又はその塩を8〜120mg含有する、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日1回ないし3回投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日1回又は2回投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
1日1回投与される、上記の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有する、VEGF産生抑制剤。
ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有する、VEGF発現抑制剤。
網膜色素上皮細胞の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物を有効成分として含有する、ドルーゼン抑制剤。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、前記網膜色素上皮細胞における間葉系マーカー又は細胞外マトリックスの発現を抑制する薬剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、前記網膜色素上皮細胞の運動能の亢進を抑制する薬剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、及びVIMからなる群より選択される少なくとも1種である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、SRGN、FN1、COL5A2、COL13A1、及びLAMB3からなる群より選択される少なくとも1種である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、Cadherin3、MMP1、及びMMP7からなる群より選択される少なくとも1種であり、並びに/又は、
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、及びTNCからなる群より選択される少なくとも1種である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及び/又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記非ステロイド性抗炎症剤が、プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、又はアリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、システイニルロイコトリエン1型(CysLT1)受容体の拮抗剤又は5−リポキシゲナーゼ阻害剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤が、スリンダク及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、並びに/又は、
トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、Alisertib、MK−0457(Tozasertib)、PHA−739358(danusertib)、AMG−900、Barasertib、CYC116、MLN8054、Baicalin、Baicalein、Lupeol、Istanbulin A、Phytol、Diphenyl difluoroketone (EF24)、Crucmin、Phloroglucinol、Plumbagin、Rapamycin、FK506(Tacrolimus)、Thalidomide、LY550410、SB−505124、SD−208、TAPI−0、TAPI−1、JNJ−38877605、PF−04217903、AG1478(Tyrphostin)、Erlotinib、Gefitinib、Lapatinib、PD153035、PD158780、WHI−P154、BMS−536924、A83−01、D4476、LY−364947、SB−431542、SD−208、AZD6244(Selumetinib)、CI−1040、PD0325901、GDC−0941(Pictilisib)、PI−103、PIK−90、ZSTK474、API−2、AZD0530(Saracatinib)、PP1、2−Hydroxycinnamaldehyde、5−aza−dC、BI 5700、Celecoxib、CX−4945(Silmitasertib)、Disulfiram、Eribulin mesyate、Evodiamine、EW−7203、Fasudil、Nintedanib、Fuzheng Huayu recipe、Grape seed proanthocyanidins、Vorinostat、Herbimycin A、Entinostat、Honokiol、NPI−0052、Methacycline、Dasatinib、Ki26894、NSC 74859、NVP−LDE−225(Erismodegib)、Palbociclib、Pinocembrin、Salvianolic Acid B、Sorafenib、Resveratrol、S−Allylcysteine、Silibinin meglumine、Simvastatin、Centchroman、ML327、GN−25、Trichostatin A、Sarasinoside A1、Panobinostat、Danusertib、Cystatin C、Thymoquinone、Ulinastatin、Dendrofalconerol A (DF−A)、ジンセノサイド(人参サポニン)、ツルウメモドキ種子エキス、サリシン(セイヨウシロヤナギエキス)、サリチル酸、ヤブジラミエキス、オストール、ミュスカダンブドウ皮エキス、Tongxinluo、プロシアニジンC1(桂皮)、アシュワガンダ根エキス(Withania somnifera root extract)、Qingyihuaji、ローゼルエキス、没食子酸エピガロカテキン、プロアントシアニジン(ブドウ種子エキス)、及びサルビアノリン酸Bからなる群より選択される少なくとも1種である、上記のドルーゼン抑制剤。
経口剤又は注射剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記経口剤が、固形製剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記固形製剤が、錠剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
液剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記のドルーゼン抑制剤。
20.4μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
16.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザルトプロフェン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
340.9μM以上のCmaxがもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でオキサプロジン又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
69.15μM以上のCmaxがもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でチアプロフェン酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
27.91μM以上のCmaxがもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でフルフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
38.54μM以上のCmaxがもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でメフェナム酸又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
10.10μM以上のCmaxがもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でスリンダク又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
12.2μM以上のCmaxがもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でエパルレスタット又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
0.8μM以上のCmaxがもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でザフィルルカスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
16.0μM以上のCmaxがもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でアンレキサノクス又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
31.03μM以上のCmaxがもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/2量以上の血中濃度がもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
前記Cmaxの1/4量以上の血中濃度がもたらされる投与量でセラトロダスト又はその塩が投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてザルトプロフェン又はその塩を25〜360mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてオキサプロジン又はその塩を100〜700mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてチアプロフェン酸又はその塩を60〜900mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてフルフェナム酸又はその塩を75〜1250mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてメフェナム酸又はその塩を150〜2250mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてスリンダク又はその塩を30〜500mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてエパルレスタット又はその塩を10〜400mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてザフィルルカスト又はその塩を10〜200mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてアンレキサノクス又はその塩を10〜150mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日量としてセラトロダスト又はその塩を8〜120mg含有する、上記のドルーゼン抑制剤。
1日1回ないし3回投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
1日1回又は2回投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
1日1回投与される、上記のドルーゼン抑制剤。
上記のドルーゼン抑制剤を有効成分として含有する、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤。ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤を有効成分として含有し、
該アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/又はその薬学的に許容できる塩である、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤が、スリンダク及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
経口剤又は注射剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記経口剤が、固形製剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記固形製剤が、錠剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
液剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、Dry AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、Wet AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、No AMD、初期AMD及び/又は中期AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
血管新生阻害剤と、
上記のドルーゼン抑制剤とを組み合わせてなる、加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記血管新生阻害剤が、抗VEGF抗体若しくはそのフラグメント、抗VEGF抗体のフラグメントとIgG分子のFcドメインとの融合タンパク質、及び/又は抗血管新生アプタマーである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記血管新生阻害剤が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ペガプタニブナトリウム、ESBA−1008、ラムパリズマブ、MC−1101、ドキシサイクリンヒクラート、及びエミクススタト塩酸塩からなる群より選択される少なくとも1種である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記ドルーゼン抑制剤が、経口剤又は注射剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記経口剤が、固形製剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記固形製剤が、錠剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
液剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、Dry AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、Wet AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
前記加齢黄斑変性症が、No AMD、初期AMD及び/又は中期AMDである、上記の加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤。
インビトロにおいてドルーゼンを誘導する方法であって、
サイトカイン、増殖因子、及びケモカインからなる群より選択される少なくとも1種を、細胞に接触させることを含む方法。
前記細胞が、網膜色素上皮細胞である、上記の方法。
前記細胞が、ARPE−19である、上記の方法。
前記サイトカインが、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−16、TNF−α、及びIFN−γからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の方法。
前記増殖因子が、TGF−β、FGFs、HGF、EGF、及びPDGFからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の方法。
前記ケモカインが、IL−8、MIP−1α、MCP−1、RANTES、及びエオタキシンからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の方法。
前記接触の時間が、10分〜108時間である、上記の方法。
前記接触の温度が、4〜50℃である、上記の方法。
前記ドルーゼンの誘導が、上皮系マーカー、間葉系マーカー、ECMの分泌、運動能の亢進、及び/又はFocusの形成を指標として評価されることを含む、上記の方法。
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞における上皮間葉転換の抑制を測定することを含む、ドルーゼン抑制剤の評価又はスクリーニング方法。
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞の集塊の抑制を測定することを含む、ドルーゼン抑制剤の評価又はスクリーニング方法。
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞における上皮間葉転換の抑制を測定することを含む、加齢黄斑変性症予防・治療薬の評価又はスクリーニング方法。
インビトロにおいて、被験薬剤の存在下で、網膜色素上皮細胞の集塊の抑制を測定することを含む、加齢黄斑変性症予防・治療薬の評価又はスクリーニング方法。
サイトカイン、増殖因子、及びケモカインからなる群より選択される少なくとも1種を、前記網膜色素上皮細胞に接触させることを含む、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記網膜色素上皮細胞が、ARPE−19である、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記サイトカインが、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−16、TNF−α、及びIFN−γからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記増殖因子が、TGF−β、FGFs、HGF、EGF、及びPDGFからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記ケモカインが、IL−8、MIP−1α、MCP−1、RANTES、及びエオタキシンからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記接触の時間が、10分〜108時間である、上記の評価又はスクリーニング方法。
前記接触の温度が、4〜50℃である、上記の評価又はスクリーニング方法。
脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤の製造の為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物の使用。
VEGF産生抑制剤の製造の為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物の使用。
ドルーゼン抑制剤の製造の為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物の使用。
加齢黄斑変性症予防及び/又は治療剤の製造の為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物の使用。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、前記網膜色素上皮細胞における間葉系マーカー又は細胞外マトリックスの発現を抑制する薬剤である、上記化合物の使用。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、及びVIMからなる群より選択される少なくとも1種である、上記化合物の使用。
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、SRGN、FN1、COL5A2、COL13A1、及びLAMB3からなる群より選択される少なくとも1種である、上記化合物の使用。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、Cadherin3、MMP1、及びMMP7からなる群より選択される少なくとも1種であり、並びに/又は、
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、及びTNCからなる群より選択される少なくとも1種である、上記化合物の使用。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及び/又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤である、上記化合物の使用。
前記非ステロイド性抗炎症剤が、プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、又はアリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、システイニルロイコトリエン1型(CysLT1)受容体の拮抗剤又は5−リポキシゲナーゼ阻害剤である、上記化合物の使用。
前記プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤が、スリンダク及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、並びに/又は、
トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、上記化合物の使用。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、Alisertib、MK−0457(Tozasertib)、PHA−739358(danusertib)、AMG−900、Barasertib、CYC116、MLN8054、Baicalin、Baicalein、Lupeol、Istanbulin A、Phytol、Diphenyl difluoroketone (EF24)、Crucmin、Phloroglucinol、Plumbagin、Rapamycin、FK506(Tacrolimus)、Thalidomide、LY550410、SB−505124、SD−208、TAPI−0、TAPI−1、JNJ−38877605、PF−04217903、AG1478(Tyrphostin)、Erlotinib、Gefitinib、Lapatinib、PD153035、PD158780、WHI−P154、BMS−536924、A83−01、D4476、LY−364947、SB−431542、SD−208、AZD6244(Selumetinib)、CI−1040、PD0325901、GDC−0941(Pictilisib)、PI−103、PIK−90、ZSTK474、API−2、AZD0530(Saracatinib)、PP1、2−Hydroxycinnamaldehyde、5−aza−dC、BI 5700、Celecoxib、CX−4945(Silmitasertib)、Disulfiram、Eribulin mesyate、Evodiamine、EW−7203、Fasudil、Nintedanib、Fuzheng Huayu recipe、Grape seed proanthocyanidins、Vorinostat、Herbimycin A、Entinostat、Honokiol、NPI−0052、Methacycline、Dasatinib、Ki26894、NSC 74859、NVP−LDE−225(Erismodegib)、Palbociclib、Pinocembrin、Salvianolic Acid B、Sorafenib、Resveratrol、S−Allylcysteine、Silibinin meglumine、Simvastatin、Centchroman、ML327、GN−25、Trichostatin A、Sarasinoside A1、Panobinostat、Danusertib、Cystatin C、Thymoquinone、Ulinastatin、Dendrofalconerol A (DF−A)、ジンセノサイド(人参サポニン)、ツルウメモドキ種子エキス、サリシン(セイヨウシロヤナギエキス)、サリチル酸、ヤブジラミエキス、オストール、ミュスカダンブドウ皮エキス、Tongxinluo、プロシアニジンC1(桂皮)、アシュワガンダ根エキス(Withania somnifera root extract)、Qingyihuaji、ローゼルエキス、没食子酸エピガロカテキン、プロアントシアニジン(ブドウ種子エキス)、及びサルビアノリン酸Bからなる群より選択される少なくとも1種である、上記化合物の使用。
経口剤又は注射剤である、上記化合物の使用。
前記経口剤が、固形製剤である、上記化合物の使用。
前記固形製剤が、錠剤である、上記化合物の使用。
液剤である、上記化合物の使用。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記化合物の使用。
脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療に使用される為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物。
VEGFの産生抑制に使用される為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物。
ドルーゼン抑制に使用される為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物。
加齢黄斑変性症予防及び/又は治療に使用される為の上皮間葉転換抑制活性を有する化合物。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、前記網膜色素上皮細胞における間葉系マーカー又は細胞外マトリックスの発現を抑制する薬剤である、上記の化合物。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、MMP3、ZEB2、CDH2、及びVIMからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の化合物。
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNC、COL1A1、COL1A2、SRGN、FN1、COL5A2、COL13A1、及びLAMB3からなる群より選択される少なくとも1種である、上記の化合物。
前記間葉系マーカーが、Snail、Slug、Cadherin3、MMP1、及びMMP7からなる群より選択される少なくとも1種であり、並びに/又は、
前記細胞外マトリックスが、COL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、及びTNCからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の化合物。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、非ステロイド性抗炎症剤、アルドース還元酵素阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、及び/又はトロンボキサンA2受容体拮抗剤である、上記の化合物。
前記非ステロイド性抗炎症剤が、プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤、又はアリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、システイニルロイコトリエン1型(CysLT1)受容体の拮抗剤又は5−リポキシゲナーゼ阻害剤である、上記の化合物。
前記プロピオン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アミノアリールカルボン酸系非ステロイド性抗炎症剤が、フルフェナム酸、メフェナム酸及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記アリール酢酸系非ステロイド性抗炎症剤が、スリンダク及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記アルドース還元酵素阻害剤が、エパルレスタット及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、
前記ロイコトリエン受容体拮抗剤が、ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種であり、
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤が、アンレキサノクス及び/若しくはその薬学的に許容できる塩であり、並びに/又は、
トロンボキサンA2受容体拮抗剤が、セラトロダスト及び/若しくはその薬学的に許容できる塩である、上記の化合物。
前記上皮間葉転換抑制活性を有する化合物が、Alisertib、MK−0457(Tozasertib)、PHA−739358(danusertib)、AMG−900、Barasertib、CYC116、MLN8054、Baicalin、Baicalein、Lupeol、Istanbulin A、Phytol、Diphenyl difluoroketone (EF24)、Crucmin、Phloroglucinol、Plumbagin、Rapamycin、FK506(Tacrolimus)、Thalidomide、LY550410、SB−505124、SD−208、TAPI−0、TAPI−1、JNJ−38877605、PF−04217903、AG1478(Tyrphostin)、Erlotinib、Gefitinib、Lapatinib、PD153035、PD158780、WHI−P154、BMS−536924、A83−01、D4476、LY−364947、SB−431542、SD−208、AZD6244(Selumetinib)、CI−1040、PD0325901、GDC−0941(Pictilisib)、PI−103、PIK−90、ZSTK474、API−2、AZD0530(Saracatinib)、PP1、2−Hydroxycinnamaldehyde、5−aza−dC、BI 5700、Celecoxib、CX−4945(Silmitasertib)、Disulfiram、Eribulin mesyate、Evodiamine、EW−7203、Fasudil、Nintedanib、Fuzheng Huayu recipe、Grape seed proanthocyanidins、Vorinostat、Herbimycin A、Entinostat、Honokiol、NPI−0052、Methacycline、Dasatinib、Ki26894、NSC 74859、NVP−LDE−225(Erismodegib)、Palbociclib、Pinocembrin、Salvianolic Acid B、Sorafenib、Resveratrol、S−Allylcysteine、Silibinin meglumine、Simvastatin、Centchroman、ML327、GN−25、Trichostatin A、Sarasinoside A1、Panobinostat、Danusertib、Cystatin C、Thymoquinone、Ulinastatin、Dendrofalconerol A (DF−A)、ジンセノサイド(人参サポニン)、ツルウメモドキ種子エキス、サリシン(セイヨウシロヤナギエキス)、サリチル酸、ヤブジラミエキス、オストール、ミュスカダンブドウ皮エキス、Tongxinluo、プロシアニジンC1(桂皮)、アシュワガンダ根エキス(Withania somnifera root extract)、Qingyihuaji、ローゼルエキス、没食子酸エピガロカテキン、プロアントシアニジン(ブドウ種子エキス)、及びサルビアノリン酸Bからなる群より選択される少なくとも1種である、上記の化合物。
経口剤又は注射剤である、上記の化合物。
前記経口剤が、固形製剤の形態で提供される、上記の化合物。
前記固形製剤が、錠剤である、上記の化合物。
液剤の形態で提供される、上記の化合物。
前記液剤が、眼科用剤又はカプセル剤である、上記の化合物。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
試験例1〜試験例3及び参考試験例2−4は、CNVの予防及び/又は治療に関する試験を示す。
試験例4〜試験例8は、ドルーゼンの予防及び/又は治療に関する試験を示す。
[試験例1.EMT細胞モデルの構築]
試験例1−1 RPE細胞におけるEMTの誘導条件の検討
発明者らは、RPE細胞(網膜色素上皮細胞株:ARPE−19、以下同じ)に対して、サイトカインや増殖因子(TNF−α/IL−1β/TGF−β)を用いて、10通りの条件により刺激を試みる実験を行った結果、顕著なEMT誘導を引き起こすことを見出した。サイトカインや増殖因子を用いたEMT誘導の細胞モデルは、CNVを伴う患者における、推測されるEMT誘導メカニズムを反映したものと考えられる。
その10通りの条件は、以下のとおりである。
(1)TNF−α 100ng/mL
(2)IL−1β 100ng/mL
(3)IL−1β 20ng/mL
(4)TNF−α 500ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(5)TNF−α 200ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(6)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(7)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 10ng/mL
(8)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 25ng/mL
(9)IL−1β 100ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(10)IL−1β 20ng/mL + TGF−β 5ng/mL
試験例1−2 EMTマーカー分子の発現変化によるEMTの検証
刺激後のRPE細胞からRNAを抽出し、発現変化を検証した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例1−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導48時間後に細胞を回収した。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer(QIAGEN社) 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作成した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、得られたRNA2μgからSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社 #11752−250)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNA50ngを鋳型として、リアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、各遺伝子のmRNAの発現を定量分析した。各遺伝子に対する特異的プライマーはInvitrogen社より購入した。各遺伝子Ct(Threshold Cycle)値は内在性コントロールによりノーマライズ後、非処理のサンプルに対する割合を算出した。結果を図1に示す。
図1A及びBに示すように、刺激後のRPE細胞では、上皮系マーカーであるE−Cadherinの発現が低下し(図1A)、間葉系マーカーであるN−Cadherinの発現が亢進していた(図1B)。このようなCadherin switchingは、EMTの代表的な現象である。また、フィブロネクチンに代表される間葉系マーカー(図1C)およびEMT関連転写因子群(Snail、Slug、ZEB1)の亢進(図1E〜G)、及びI型Collagen(COL1A1)に代表されるECMの発現亢進が確認され(図1D)、RPE細胞では刺激によりEMTが誘導されることを確認した。
試験例1−3 マイクロアレイによる経時的なEMTマーカー発現変化の検証
EMT誘導時間における、その時点でのEMT誘導状態の解析を実施した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例1−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導1時間後、4時間後、12時間後、24時間後、48時間後、72時間後に細胞を回収した。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作製した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、Low Input QuickAmp Labeling kit(Agilent Technologies社 #5190−2305)を用いて蛍光ラベルした。ラベル化したcRNAはWhole Human Genome Oligo−DNA Microarray Kit(Agilent Technologies社 #G4112F)に製造業者の定めるプロトコルに従ってハイブリダイズした。ハイブリダイズしたスライドは、Gene Expression Wash Pack(Agilent Technologies社 #5188−5327)を用いて洗浄し、Agilent Microarray Scanner(Agilent Technologies社 #G2505B)でスキャニングを行った。スキャン画像は、Feature Extraction software version 9.5.1(Agilent Technologies社)を用いて数値化した。数値データは、Grobal Normalization法によって標準化した。結果を図2に示す。
図2に示すように、EMTマーカーの低下や亢進のピークは各遺伝子によって、EMT誘導後12時間後であったり、72時間後であったりと、バラツキは生じたが、低下した上皮系マーカー並びに亢進した間葉系マーカー及びECMは以下のとおりである。
EMT誘導により低下した上皮系マーカーとしては、ID1、ID2、MUC1、Cytokeratin18(KRT18)、THBS1、VIL2、E−Cadherin(CDH1)が確認された。また、増殖因子であるTGFB2の低下が確認された。
EMT誘導により亢進した間葉系マーカー及びECMとしては、TWIST1、VIM、CD44、ZEB1、RDX、MMP9、FN1、RHOA、ZEB2、MMP2、TJP1、CTNNB1、MMP3、ETS1、SNAI1、SNAI2、HAS2、SERPINE1、CDH2、MSN、TCF3、SDC1、ITGAV、COL1A1、SPARCが確認された。また、増殖因子であるFGF1、FGF2、TGFB1の亢進が確認された。
[試験例2.CNV抑制試験]
試験例2−1 EMTマーカーの発現変化1
5種の化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)について、上記の細胞モデルを用いてEMT抑制効果を評価した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例1−1に記載の条件によりEMTを誘導し、同時に各化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)を添加し、EMT誘導48時間後に細胞を回収した。コントロールとして、評価化合物(被験薬剤)を非添加のサンプルを用いた。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作成した。各化合物は以下の濃度で用いた。オキサプロジン:300μM、エパルレスタット:30μM、ザフィルルカスト:3μM、アンレキサノクス:30μM、ザルトプロフェン:30μM。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、得られたRNA2μgからSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社 #11752−250)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNA50ngを鋳型として、リアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、各遺伝子のmRNAの発現を定量分析した。各遺伝子に対する特異的プライマーはInvitrogen社より購入した。各遺伝子Ct(Threshold Cycle)値は内在性コントロールによりノーマライズ後、非処理のサンプルに対する割合を算出した。結果を図3〜図7に示す。
図3〜図7の各グラフにおいて、左の棒グラフは、EMTが誘導されていない時の各遺伝子の発現量を示している。真ん中の棒グラフは、EMT誘導時の各遺伝子の発現量を示している。右の棒グラフは、EMT抑制化合物投与時の各遺伝子の発現量を示している。また、図3〜図7は、EMT抑制化合物として、それぞれオキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェンを用いた結果を示している。
本明細書において、各EMTマーカーは以下のように略称でも記載される。
カドヘリン(Cadherin):CDH(CDH2、CDH3等)
マトリックスメタロプロティナーゼ:MMP(MMP1、MMP3、MMP7等)
フィブロネクチン:FN(FN1等)
ビメンチン:VIM
コラーゲンタイプ1α1:COL1A1
コラーゲンタイプ1α2:COL1A2
コラーゲンタイプ5α2:COL5A2
コラーゲンタイプ5α3:COL5A3
コラーゲンタイプ6α3:COL6A3
コラーゲンタイプ13α1:COL13A1
ラミニンβ3:LAMB3
ラミニンγ2:LAMC2
Hyaluronan−Mediated Motility Receptor:HMMR
テネイシンC:TNC
Zinc Finger E−Box Binding Homeobox 2:ZEB2
セルグリシン(Serglycin):SRGN
chondroitin sulfate proteoglycan 4:CSPG4
図3〜7の各グラフにおいて、第1段目は、左からSnail、Slug、CDH3、COL5A3、COL6A3であり、第2段目は、左からMMP1、MMP7、LAMC2、HMMR、TNCである。
図3(オキサプロジン)の第3段目は、左からZEB2、MMP3、COL1A1、COL1A2、CSPG4であり、第4段目は、SRGNである。
図4(エパルレスタット)の第3段目は、左からZEB2、CDH2、FN1、VIM、COL1A1であり、第4段目は、左からCOL1A2、COL5A2、COL13A1、CSPG4、SRGNである。
図5(ザフィルルカスト)の第3段目は、左からMMP3、COL13A1、LAMB3、CSPG4である。
図6(アンレキサノクス)の第3段目は、左からZEB2、CDH2、MMP3、COL1A1、COL13A1である。
図7(ザルトプロフェン)の第3段目は、左からZEB2、FN1、COL13A1、CSPG4である。
図3〜図7に示すように、EMTマーカーのうち、間葉系マーカーであるSnail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、及びECMであるCOL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNCは、いずれのEMT抑制化合物を適用した場合であっても発現が抑制された。これにより、これらの10種のEMTマーカーは、EMT抑制化合物により共通して抑制される指標となることが確認された。これらの10種以外のEMTマーカーであっても、図3に示すように、オキサプロジンでは、ZEB2、MMP3、COL1A1、COL1A2、CSPG4、SRGNの発現低下が確認された。図4に示すように、エパルレスタットでは、ZEB2、CDH2、FN1、VIM、COL1A1、COL1A2、COL5A2、COL13A1、CSPG4、SRGNの発現低下が確認された。図5に示すように、ザフィルルカストでは、MMP3、COL13A1、LAMB3、CSPG4の発現低下が確認された。図6に示すように、アンレキサノクスでは、ZEB2、CDH2、MMP3、COL1A1、COL13A1の発現低下が確認された。図7に示すように、ザルトプロフェンでは、ZEB2、FN1、COL13A1、CSPG4の発現低下が確認された。これらのEMTマーカーも、EMT抑制化合物により抑制される指標となり得ることが確認された。
図3〜図7により、5つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)は、EMTを顕著に抑制することが示された。これらの化合物は、EMTを顕著に抑制することにより、CNVの発生や伸展に関与するVEGF等の産生を抑制することに繋がり、CNVを根本から予防及び/又は治療できると考えられる。
試験例2−2 EMTマーカーの発現変化2
5種の化合物(フルフェナム酸アルミニウム(添加濃度:28μM(Cmax))、メフェナム酸(添加濃度:39μM(Cmax))、スリンダク(添加濃度:100μM)、チアプロフェン酸(添加濃度:1000μM)、セラトロダスト(添加濃度:31μM(Cmax)))について、試験例2−1と同様の方法により、EMTマーカーの発現変化を評価した。結果をそれぞれ図8〜図12に示す。
図8(フルフェナム酸アルミニウム)の第1段目は、左からSnail、Slug、COL5A3、COL6A3、MMP1であり、第2段目は、左からMMP7、LAMC2、HMMR、TNC、FN1であり、第3段目は、左からCOL1A1、COL1A2、COL13A1、CDH2、MMP3であり、第4段目は、左からVIM、CSPG4である。
図9(メフェナム酸)の第1段目は、左からSnail、CDH3、COL5A3、COL6A3、MMP1であり、第2段目は、左からMMP7、LAMC2、HMMR、TNC、FN1であり、第3段目は、左からCOL1A1、COL1A2、COL13A1、MMP3、VIMであり、第4段目は、CSPG4である。
図10(スリンダク)の第1段目は、左からSnail、Slug、CDH3、COL5A3、COL6A3であり、第2段目は、左からMMP1、MMP7、LAMC2、HMMR、TNCであり、第3段目は、左からFN1、CDH2、MMP3、VIM、COL1A1であり、第4段目は、左からCOL1A2、COL13A1、CSPG4、ZEB2である。
図11(チアプロフェン酸)の第1段目は、左からSnail、Slug、CDH3、COL5A3、COL6A3であり、第2段目は、左からMMP1、MMP7、LAMC2、HMMR、TNCであり、第3段目は、左からFN1、CDH2、MMP3、VIM、COL1A1であり、第4段目は、左からCOL1A2、COL13A1、CSPG4、ZEB2である。
図12(セラトロダスト)の第1段目は、左からSnail、CDH3、COL5A3、COL6A3、MMP1であり、第2段目は、左からMMP7、LAMC2、HMMR、TNC、FN1であり、第3段目は、左からCDH2、MMP3、VIM、COL1A1、COL1A2であり、第4段目は、左からCOL13A1、CSPG4、ZEB2である。
図8〜図12に示すように、5種の化合物(フルフェナム酸アルミニウム、メフェナム酸、スリンダク、チアプロフェン酸、セラトロダスト)においても、EMT誘導時におけるEMTマーカーの発現を顕著に抑制することが示された。これらの化合物は、EMTを顕著に抑制することにより、CNVの発生や伸展に関与するVEGF等の産生を抑制することに繋がり、CNVを根本から予防及び/又は治療できると考えられる。
試験例2−3 VEGFの発現変化1
3つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザルトプロフェン)について、上記の細胞モデルを用いてVEGF抑制効果を評価した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例1−1に記載の条件によりEMTを誘導し、同時にオキサプロジン(Cmax:340.9μM)、エパルレスタット(Cmax:12.2μM)、又はザルトプロフェン(Cmax:20.4μM)を添加し、EMT誘導48時間後に細胞を回収した。各化合物は、Cmax、Cmaxの1/2濃度、Cmaxの1/4濃度で添加した。コントロールとして、評価化合物(被験薬剤)を非添加のサンプルを用いた。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作成した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、得られたRNA2μgからSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社 #11752−250)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNA50ngを鋳型として、リアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、各遺伝子のmRNAの発現を定量分析した。各遺伝子に対する特異的プライマーはInvitrogen社より購入した。各遺伝子Ct(Threshold Cycle)値は内在性コントロールによりノーマライズ後、非処理のサンプルに対する割合を算出した。また、各結果について有意差検定(Student t test)を行い、p<0.05である場合に「*」、p<0.01である場合に「**」、を付した。結果を図13〜図15に示す。
図13に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。オキサプロジンはVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した。Cmaxの1/4濃度においても顕著なVEGF抑制効果が認められた(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。オキサプロジンは濃度依存的にこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図14に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。エパルレスタットはVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。エパルレスタットは濃度依存的にこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図15に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。ザルトプロフェンはVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した。Cmaxの1/4濃度においても顕著なVEGF抑制効果が認められた(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。ザルトプロフェンは濃度依存的にこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図13〜図15により、3つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザルトプロフェン)は、EMTを顕著に抑制することにより、VEGFのmRNA発現亢進を抑制することが示された。これらの化合物は、EMTにより発現が亢進するVEGFを抑制することができるため、CNVを根本から予防及び/又は治療できる。また、これらの結果から、EMTを顕著に抑制することができるザフィルルカストやアンレキサノクスでも、VEGFを抑制し、CNVを根本から予防及び/又は治療できるものと考えられる。
参考試験例2−4 VEGFの発現変化2
上記オキサプロジン、ザルトプロフェンとは別のNSAIDsであるエトドラク(Cmax:42.5μM)とインドメタシン(Cmax:2.79μM)について、試験例2−3と同様の方法により、上記の細胞モデルを用いてVEGF抑制効果を評価した。結果をそれぞれ図16又は図17に示す。
図16に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。しかし、エトドラクはVEGFの発現亢進を抑制しなかった(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。しかし、エトドラクはこれらの発現亢進を抑制しなかった。全ての条件で有意差は認められなかった(それぞれB〜D)。
図17に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。しかし、インドメタシンはVEGFの発現亢進を抑制しなかった(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。しかし、インドメタシンはこれらの発現亢進を抑制しなかった。全ての条件で有意差は認められなかった(それぞれB〜D)。
エトドラク及びインドメタシンの結果から、RPE細胞のEMTを抑制できない化合物はVEGFの発現亢進も抑制することができないため、CNVの予防及び/又は治療には有効ではないことが推測された。
試験例2−5 VEGFの発現変化3
3種の化合物(フルフェナム酸アルミニウム(Cmax:27.91μM)、メフェナム酸(Cmax:38.54μM)、セラトロダスト(Cmax:31.03μM))について、上記の細胞モデルを用いてVEGF抑制効果を評価した。試験例2−3と同様の方法により、上記の細胞モデルを用いてVEGF抑制効果を評価した。結果をそれぞれ図18〜図20に示す。
図18に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。フルフェナム酸アルミニウムはVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した。Cmaxの1/4濃度においても顕著なVEGF抑制効果が認められた(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。フルフェナム酸アルミニウムはこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図19に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。メフェナム酸はVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した。Cmaxの1/4濃度においても顕著なVEGF抑制効果が認められた(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。メフェナム酸はこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図20に示すように、RPE細胞において、VEGFはEMTの誘導によりmRNA発現量が亢進した。セラトロダストはVEGFの発現亢進を濃度依存的に抑制した。Cmaxの1/4濃度においても顕著なVEGF抑制効果が認められた(A)。間葉系マーカーであるフィブロネクチン、Snail、ビメンチンはEMTの誘導により発現量が亢進した。セラトロダストはこれらの発現亢進を抑制した(それぞれB〜D)。
図18〜図20に示すように、3つの化合物(フルフェナム酸アルミニウム、メフェナム酸、セラトロダスト)は、EMTを顕著に抑制することにより、VEGFのmRNA発現亢進を抑制することが示された。これらの化合物は、EMTにより発現が亢進するVEGFを抑制することができるため、CNVを根本から予防及び/又は治療できるものと推測される。これらの化合物は、EMTにより発現が亢進するVEGFを抑制することができるため、CNVを根本から予防及び/又は治療できる。また、これらの結果から、EMTを顕著に抑制することができるザフィルルカストやアンレキサノクスでも、VEGFを抑制し、CNVを根本から予防及び/又は治療できるものと考えられる。
[試験例3.CNV抑制評価のためのin vivoモデル試験]
マウスの眼底にレーザーを照射することで、脈絡膜血管新生およびEMTが誘導されることが知られている(参考文献:Ishikawa,et al, Exp Eye Res. 2016 Jan;142:19・25)。そこで、マウスのレーザー照射モデルを用いて、ザルトプロフェンのCNVおよびEMTの抑制効果を評価した。
ザルトプロフェン(東京化成工業株式会社製)0.15gおよびアラビアゴム(和光純薬工業株式会社製)0.75gを水60mLに撹拌することでザルトプロフェン懸濁液を作製した。媒体(Vehicle)はアラビアゴム0.75gを水60mLに溶解撹拌することで作製した。
次に、C57BL/6Jマウス(8週齢、N=13)の眼底に対し、マルチカラーレーザー光凝固装置を用いて、スリットランプ下でレーザー照射を各眼4ヶ所に行った。照射直後より、Vehicleもしくはザルトプロフェン溶液(25mg/kg)を1日1回、3週間経口投与を行い、以下の評価を行った。なお、(1)と(3)は同一個体を用いた。
(1)CNV評価(N=3)
(2)EMT評価:Collagen Type1(N=10)
(3)EMT評価:Vimentin(N=3)
試験例3−1 レーザー照射による脈絡膜血管新生(CNV)に対するザルトプロフェンの抑制効果
レーザー照射2週後に尾静脈よりフルオレサイト静注500mg(日本アルコン株式会社)を投与(1mL/kg)し、投与約1分後に蛍光眼底写真撮影を行った。撮影した蛍光眼底写真より各眼4ヶ所を以下の評価基準をもとにスコアリングした。結果を図21に、代表画像を図22に示す。
[評価基準]
・蛍光なし・・・・・・・・・・・0
・わずかに蛍光を認める・・・・・1
・中等度の蛍光を認める・・・・・2
・強度の傾向を認める・・・・・・3
図21に示すように、レーザー照射によるCNVスコアは、Vehicle投与群に比べてザルトプロフェン投与群は顕著に低い結果となった。
図22において、Arrow HeadはCNVにより蛍光漏出している部分である。図22に示すように、レーザー照射によるCNVは、Vehicle投与群(左の写真)に比べてザルトプロフェン投与群(右の写真)では顕著に抑制された。
試験例3−2 レーザー照射によるEMT(EMT評価:Collagen Type 1)に対するザルトプロフェンの抑制効果
レーザー照射3週後に頸椎脱臼により安楽死させて眼球を摘出し、4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液(和光純薬工業株式会社)で浸漬固定を行った。眼球から角膜、水晶体、網膜を除去して眼杯の状態にし、PBSTで3回洗浄した。次に50%メタノール、そして100%メタノール溶液を用いて脱水処理を行い、ブロッキング液(1%BSA、0.5%TritonX−100/PBS)で60分間インキュベートを行った。さらに1次抗体(抗コラーゲン抗体、Rockland社)で一晩静置した後、2次抗体(Alexa488抗体、Life technologies社)で1時間反応させ、スライドガラスにマウントすることでフラットマウントの染色標本を作製した。標本は顕微鏡を用いて抗Collagen Type 1抗体による染色像の写真撮影を行った後、定量評価を行った。結果を図23に示す。
図23に示すように、レーザー照射により生じたCollagen Type 1染色体積は、Vehicle投与群に比べてザルトプロフェン投与群で有意に低下することが分かった(p<0.05)。すなわち、ザルトプロフェンはEMTに対し、顕著な抑制効果を示すことが明らかとなった。
試験例3−3 レーザー照射によるEMT(EMT評価:Vimentin)に対するザルトプロフェンの抑制効果
レーザー照射3週後に頸椎脱臼により安楽死させて眼球を摘出し、4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(和光純薬工業株式会社製)で浸漬固定を行った。固定した眼球を10%スクロース(和光純薬工業株式会社製)および25%スクロースに各3時間浸漬した後、眼杯を作製した。凍結切片を作製し、スライドガラスに貼付した。顕微鏡にて観察し、レーザー照射部位が確認できるものを選抜した。次に、切片を貼付したスライドガラスを、水で10倍希釈したHistoVT One(ナカライテスク株式会社製)に入れ、70℃で15分間浸漬した。70%エタノール(和光純薬工業株式会社製)で20倍希釈したTrueBlack(Biotium社製)を切片に滴下して室温で数分間静置した後、5%ヤギ血清(ダコ・ジャパン株式会社製)を切片に滴下し、室温で30分間静置してブロッキングした。次に1次抗体(Anti−Vimentin antibody、abcam社製)にCan Get Signal(R) Immunostain Solution B(東洋紡株式会社製)を加えて切片に添加し、一晩静置した。さらに二次抗体(Alexa Fluor546、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)およびHoechst 33342 (株式会社同仁化学研究所製)にCan Get Signal(R) Immunostain Solution B を加えて切片に添加し、30分間静置した。蛍光顕微鏡にて次の条件で観察および撮影を行った。
・Vimentin:励起波長520−550 nm、検出波長580 nm
・核:励起波長330−385 nm、検出波長420 nm
撮影結果を図24および図25に示す。図24はVehicle投与群を示している。図24の左の写真は、明視野画像を示し、右の写真は、Vimentin(赤)と核(青)の重ね合わせ画像を示す。図25において、左の写真は、Vehicle投与群のVimentinを示し、右の写真は、ザルトプロフェン投与群のVimentinを示す。図24および図25において、囲みの中は、レーザー照射によるVimentin陽性領域を示す。
図24に示すように、レーザー照射部位のRPE付近に色素が少ない部分が出現し(左の写真)、間葉系マーカーであるVimentinの染色が確認された(右の写真)。このことから、レーザー照射によりRPEがVimentinを発現し、上皮間葉転換(EMT)を起こしていると考えられる。さらに、図25に示すように、Vehicle投与群のRPEはVimentin陽性であった(左の写真)。一方ザルトプロフェン投与群ではVehicle投与群と比較してVimentin陽性面積が縮小した(右の写真)。
以上のことから、ザルトプロフェンはレーザー照射モデルにおけるEMTを抑制することが明らかとなった。すなわちザルトプロフェンはRPEのEMT抑制を通じてドルーゼン形成を抑制すると考えられる。また、ザルトプロフェンとは異なる他の化合物であっても、EMTを顕著に抑制することができる物であれば、CNVを予防及び/又は治療できるものと推測される。
[4.ヒト検体におけるEMTの証明]
試験例4−1 AMD患者ドルーゼンの形態的観察
ヒト健常者コントロール(Control)サンプル及びAMD患者の網膜色素上皮細胞(RPE細胞)サンプルをNational Disease Research Interchangeから入手した。これらの組織サンプルは、キシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、水5分間で処理し、脱パラフィンした。マイヤーヘマトキシリン溶液で4分間、エオジン液で1分間染色を行った。流水中で5分処理した後、70%エタノール1分、80%エタノール1分、90%エタノール1分、100%エタノール1分×2回、キシレン5分×3回で処理を行い、マリノールを用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後、健常者のRPE細胞およびAMD患者のRPE細胞を観察した。ヘマトキシリン・エオジン染色による染色結果を図26に示す。
図26の観察結果を子細に検討することにより、本発明者らは、健常者コントロールの黄斑部においてはRPE細胞の形態は立方状であり、細胞間接着により整然と単層に整列していること、及びドルーゼンが存在するAMD患者の黄斑部においてはRPE細胞の形態が紡錘状へと変化し、RPE細胞が運動能を獲得して、細胞が重層化していることを見出した。これらの観察結果から、本発明者らは、AMD患者の黄斑部では、RPE細胞の細胞間接着が弱まり、形態変化を生じていることを推察し、RPE細胞に上皮性を消失する現象であるEMT(Epithelial−mesencyamal transition)が生じているとの仮説を立てた。以下の試験例4−2〜4−4では、この仮説に基づき、RPE細胞においてEMTが生じていることを証明するための試験を行った。
試験例4−2 AMD患者ドルーゼンにおける上皮系マーカーの消失
ヒト健常者コントロール(Control)サンプル及びAMD患者の網膜色素上皮細胞(RPE細胞)サンプルにおける上皮系マーカーの消失を免疫組織化学(IHC)により検証した。組織サンプルを気相インキュベーター中で56℃30分間インキュベートした後、キシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、水5分間で処理し、脱パラフィンした。Delicate Melanin Bleach Kit for Special Stains and IHC(Polysciences社 #24909−1)を用いて製造業者のプロトコルに従って組織中のメラニン色素を除去した後、クエン酸バッファー pH6.0を用いて、マイクロウェーブ処理10分間により抗原を賦活化した。室温で30分静置した後、PBSで5分、3%過酸化水素/PBS溶液で5分、PBSで5分処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。3%BSA/PBS溶液中で室温にて30分静置し、組織をブロッキングした。1次抗体として、1.5%BSA/PBS溶液にて500倍に希釈した抗E−Cadherin抗体(BD Biosience社 #610181)および1000倍に希釈した抗Cytokeratin18抗体(Cell signaling Technology社 #4548)を1組織当たり200マイクロリットル滴下し、4℃17時間で組織と反応させた。1次抗体と反応させた組織は、PBSで5分×3回洗浄した後、Mouse on Mouse(M.O.M.)Elite Peroxidase Kit(Vector Laboratories社 #PK−2200)を用いて、室温にて30分間2次抗体と反応させ、PBSで5分×3回洗浄した後、製造業者のプロトコルに従って室温30分にてABC反応を行った。組織をPBSで5分×3回洗浄した後、ImmPACT DAB Peroxidase(HRP)Substrate(Vector Laboratories社 #SK−4105)を用いて、室温3分間で発色を行った。発色させた組織は、New ヘマトキシリン TypeM(武藤化学株式会社 #30141)を用いて染色した後、流水中で3分静置し、70%エタノール1分、80%エタノール1分、90%エタノール1分、100%エタノール1分×2回、キシレン5分×3回で処理を行い、マリノールを用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後、健常者のRPE細胞およびAMD患者のRPE細胞を観察した。結果を図27に示す。
図27に示すように、健常者コントロール(Control)では細胞間接着部位に上皮系マーカーであるE−カドヘリン(E−Cadherin)の染色が確認されたが、AMD患者ドルーゼンの周辺部では細胞間にE−Cadherinの染色は確認されなかった(左の染色写真)。また、健常者コントロールではRPE細胞全体に上皮系マーカーであるサイトケラチン18(Cytokeratin18)の強い染色が確認されたが、AMD患者ドルーゼンの周辺部ではそれに比べてシグナルが低下していた(右の染色写真)。
以上の事から、AMD患者のRPE細胞においては上皮性の喪失、低下が生じている事が確認された。
試験例4−3 AMD患者ドルーゼンにおける間葉系マーカーの亢進
ヒト健常者コントロール(Control)サンプル及びAMD患者の網膜色素上皮細胞(RPE細胞)サンプルにおける間葉系マーカーの亢進を免疫組織化学(IHC)により検証した。組織サンプルを気相インキュベーター中で56℃30分間インキュベートした後、キシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、水5分間で処理し、脱パラフィンした。クエン酸バッファー pH6.0を用いて、マイクロウェーブ処理10分間により抗原を賦活化した。室温で30分静置した後、PBSで5分、3%過酸化水素/PBS溶液で5分、PBSで5分処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。3%BSA/PBS溶液で室温にて30分静置し、組織をブロッキングした。1次抗体として、1.5%BSA/PBS溶液にて100倍に希釈した抗Fibronectin抗体(abcam社 #45688)および10000倍に希釈した抗Vimentin抗体(Sigma−Aldrich社 #6630)を1組織当たり200マイクロリットル滴下し、4℃にて17時間組織と反応させた。1次抗体と反応させた組織は、PBSで5分×3回洗浄した後、抗Fibronectin抗体に対しては、VECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG Kit(Vector Laboratories社 #PK−6101)を、抗Vimentin抗体に対してはMouse on Mouse (M.O.M.) Elite Peroxidase Kit(Vector Laboratories社 #PK−2200)を用いて室温にて30分間2次抗体と反応させた。PBSで5分×3回洗浄した後、製造業者のプロトコルにしたがって室温30分にてABC反応を行った。組織をPBSで5分×3回洗浄した後、ImmPACT AMEC Red Peroxidase(HRP)Substrate(Vector Laboratories社 #SK−4285)を用いて室温3分間で発色を行い、蒸留水で5分間洗浄した。発色させた組織は、New ヘマトキシリン TypeM(武藤化学株式会社 #30141)を用いて染色した後、流水中で3分静置し、VectaMount AQ Aqueous Mounting Medium(Vector Laboratories社 #H−5501)を用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後、健常者のRPE細胞およびAMD患者のRPE細胞を観察した。結果を図28に示す。
図28に示すように、健常者コントロール(Control)の正常部RPE細胞においては、間葉系マーカーであるフィブロネクチン(Fibronectin)の染色はみられなかった。一方で、AMD患者のドルーゼンおよびRPE細胞ではFibronectinは陽性を示した。また、健常者コントロールのRPE細胞においては、間葉系マーカーであるビメンチン(vimentin)の染色は見られなかった。AMD患者ドルーゼンのRPE細胞はvimentin陽性を示した。
以上の解析結果から、AMD患者のRPE細胞は健常時における上皮性の形質を喪失または減弱し、AMDにおいて間葉性の形質を獲得、亢進していることが明らかになった。すなわち、AMDにおいて、RPE細胞は上皮性の形質から間葉性への形質への転換、上皮−間葉転換EMTが生じている事を明らかにした。
試験例4−4 カニクイサルモデルでの検証
健常のカニクイザルコントロール(Control)サンプル及びAMDカニクイザルモデルの網膜色素上皮細胞(RPE細胞)サンプルから切片を作成し、上皮系マーカーの消失および間葉系マーカーの亢進を免疫組織化学(IHC)により検証した。組織サンプルをキシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、蒸留水10分間で処理し、脱パラフィンした。クエン酸バッファー pH6.0を用いて、マイクロウェーブ処理10分間により抗原を賦活化した。室温で30分静置した後、PBSで5分、3%過酸化水素/PBS溶液で5分、PBSで5分処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。3%BSA/PBS溶液で室温にて20分静置し、組織をブロッキングした。1次抗体として、1.5%BSA/PBS溶液にて500倍に希釈した抗E−Cadherin抗体(BD Biosience社 #610181)および2000倍に希釈した抗Cytokeratin18抗体(abcam社 #ab668)、600倍に希釈した抗Fibronectin抗体(Epitomics社 #1574−1)を1組織当たり200マイクロリットル滴下し、4℃にて17時間組織と反応させた。1次抗体と反応させた組織は、PBSで5分×3回洗浄した後、抗E−Cadherin抗体および抗Cytokeratin18抗体に対しては、VECTASTAIN Elite ABC Mouse IgG Kit(Vector Laboratories社 #PK−6102)を用いて、抗Fibronectin抗体に対しては、VECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG Kit(Vector Laboratories社 #PK−6101)を用いて室温にて30分間2次抗体と反応させ、PBSで5分×3回洗浄した後、添付のプロトコルにしたがって室温30分にてABC反応を行った。組織をPBSで5分×3回洗浄した後、抗E−Cadherin抗体に対しては、ImmPACT DAB Peroxidase(HRP)Substrate(Vector Laboratories社 #SK−4105)を用いて、抗Cytokeratin18抗体および抗Fibronectin抗体に対しては、TMB Peroxidase Substrate Kit(Vector Laboratories社 #SK−4400)を用いて室温3分間で発色を行い、蒸留水で5分間洗浄した。発色させた組織は、抗E−Cadherin抗体に対してはNew ヘマトキシリン TypeM(武藤化学株式会社 #30141)を用いて、抗Cytokeratin18抗体および抗Fibronectin抗体に対しては、VECTOR Nuclear Fast Red(Vector Laboratories社 #H−3403)を用いて染色した。流水中で10分静置し、70%エタノール1分、80%エタノール1分、90%エタノール1分、100%エタノール1分×2回、キシレン5分×3回で処理を行い、マリノールを用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後、カニクイザルコントロールのRPE細胞およびAMDのカニクイザルモデルのRPE細胞を観察した。結果を図29に示す。
黄斑は霊長類の中でも高等な霊長類にしか存在せず、黄斑変性症も特定の霊長類にしか存在しない。黄斑変性症の病態を検証するため、黄斑変性症のモデル動物として認知されているカニクイザルにおける病態の解析を実施した。
図29に示すように、RPE細胞の形態について、健常のカニクイサルコントロール(Control)ではRPE細胞は立方状であり、細胞間接着により整然と単層に整列していることが確認された。一方で、AMDのカニクイサルのRPE細胞においては形態が紡錘状へと変化し、ドルーゼンの辺縁部では細胞の重層が確認された。
また、上皮系マーカーについて、健常のカニクイサルコントロール(Control)の黄斑部においてはRPE細胞の細胞間接着部位にE−Cadherinの染色が確認されたが、ドルーゼンが存在するAMDのカニクイサルのRPE細胞においては細胞間にE−Cadherinの染色は確認されなかった。また、健常のカニクイサルコントロールではRPE細胞全体に強いCytokeratin18の染色が確認されたが、AMDのカニクイサルのドルーゼンではControlに比べてシグナルが低下していた。
また、間葉系マーカーについて、AMDのカニクイサルのドルーゼンでは、Fibronectinが染色されており、RPE細胞やドルーゼンへの蓄積が確認された。
上記の試験例における結果から、ドルーゼンのRPE細胞では、EMTが生じていることが確認された。よって、本発明者らは、RPE細胞のEMTを抑制することができれば、ドルーゼンの形成を抑制することに繋がるものと推測した。以下の試験例5−1では、RPE細胞のEMTを抑制する化合物を検索するため、又は候補薬剤がRPE細胞でEMTに与える影響を評価するため、インビトロでRPE細胞にEMTを誘導可能な細胞モデルの検討を行った。
[5.EMT細胞モデルの構築]
試験例5−1 RPE細胞におけるEMTの誘導条件の検討
発明者らは、RPE細胞(網膜色素上皮細胞株:ARPE−19、以下同じ)に対して、サイトカインや増殖因子(TNF−α/IL−1β/TGF−β)を用いて、10通りの条件により刺激を試みる実験を行った結果、顕著なEMT誘導を引き起こすことを見出した。サイトカインや増殖因子を用いたEMT誘導の細胞モデルは、AMD患者における、推測されるEMT誘導メカニズムを反映したものと考えられる。
その10通りの条件は、以下のとおりである。
(1)TNF−α 100ng/mL
(2)IL−1β 100ng/mL
(3)IL−1β 20ng/mL
(4)TNF−α 500ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(5)TNF−α 200ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(6)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(7)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 10ng/mL
(8)TNF−α 100ng/mL + TGF−β 25ng/mL
(9)IL−1β 100ng/mL + TGF−β 5ng/mL
(10)IL−1β 20ng/mL + TGF−β 5ng/mL
試験例5−2 EMTマーカー分子の発現変化によるEMTの検証
刺激後のRPE細胞からRNAを抽出し、発現変化を検証した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導48時間後に細胞を回収した。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer(QIAGEN社) 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作成した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、得られたRNA2μgからSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社 #11752−250)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNA50ngを鋳型として、リアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、各遺伝子のmRNAの発現を定量分析した。各遺伝子に対する特異的プライマーはInvitrogen社より購入した。各遺伝子Ct(Threshold Cycle)値は内在性コントロールによりノーマライズ後、非処理のサンプルに対する割合を算出した。
結果を図1に示す。
図1A及びBに示すように、刺激後のRPE細胞では、上皮系マーカーであるE−Cadherinの発現が低下し(図1A)、間葉系マーカーであるN−Cadherinの発現が亢進していた(図1B)。このようなCadherin switchingは、EMTの代表的な現象である。また、フィブロネクチンに代表される間葉系マーカー(図1C)およびEMT関連転写因子群(Snail、Slug、ZEB1)の亢進(図1E〜G)、及びI型Collagen(COL1A1)に代表されるECMの発現亢進が確認され(図1D)、RPE細胞では刺激によりEMTが誘導されることを確認した。
試験例5−3 マイクロアレイによる経時的なEMTマーカー発現変化の検証
EMT誘導時間における、ドルーゼン様構造の形成と、その時点でのEMT誘導状態の解析を実施した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導1時間後、4時間後、12時間後、24時間後、48時間後、72時間後に細胞を回収した。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作製した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、Low Input QuickAmp Labeling kit(Agilent Technologies社 #5190−2305)を用いて蛍光ラベルした。ラベル化したcRNAはWhole Human Genome Oligo−DNA Microarray Kit(Agilent Technologies社 #G4112F)に製造業者の定めるプロトコルに従ってハイブリダイズした。ハイブリダイズしたスライドは、Gene Expression Wash Pack(Agilent Technologies社 #5188−5327)を用いて洗浄し、Agilent Microarray Scanner(Agilent Technologies社 #G2505B)でスキャニングを行った。スキャン画像は、Feature Extraction software version 9.5.1(Agilent Technologies社)を用いて数値化した。数値データは、Grobal Normalization法によって標準化した。結果を図2に示す。
図2に示すように、EMTマーカーの低下や亢進のピークは各遺伝子によって、EMT誘導後12時間後であったり、72時間後であったりと、バラツキは生じたが、低下した上皮系マーカー並びに亢進した間葉系マーカー及びECMは以下のとおりである。
EMT誘導により低下した上皮系マーカーとしては、ID1、ID2、MUC1、Cytokeratin18(KRT18)、THBS1、VIL2、E−Cadherin(CDH1)、TGFB2が確認された。
EMT誘導により亢進した間葉系マーカー及びECMとしては、FGF2、TWIST1、VIM、CD44、ZEB1、RDX、MMP9、FN1、TGFB1、RHOA、ZEB2、MMP2、TJP1、CTNNB1、MMP3、ETS1、SNAI1、SNAI2、HAS2、FGF1、SERPINE1、CDH2、MSN、TCF3、SDC1、ITGAV、COL1A1、SPARCが確認された。
EMT誘導の24時間後に、RPE細胞を播種したプレートにドルーゼン様構造体が形成された。E−カドヘリン及びサイトケラチン18に代表される上皮系マーカー群の発現低下とフィブロネクチン/ビメンチンに代表される間葉系マーカー及びECM群の発現亢進が確認され、ドルーゼン様構造体の形成とEMT誘導状態の間に明らかな相関が認められた。
よって、ドルーゼン様構造体の形成は、RPE細胞のEMTによって生じることが確認された。
試験例5−4 運動能亢進によるEMT誘導の検証
細胞の運動能・浸潤能の評価法であるInvasion Assay法(細胞浸潤アッセイ)を用いて、EMTによるRPE細胞の運動能亢進を評価した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導24時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、BD Biocoat Matrigel invasion chamber(BD Biosciece社 #354480)に播種し、37℃にてさらに24時間インキュベートした。インキュベート後、製造業者のプロトコルに従って非浸潤細胞を除去した後、100%メタノールを加え室温15分で細胞を固定した。ギムザ染色液(ナカライテスク社 #37114−35)を加え、室温30分で染色した後、PBSで5分間×2回洗浄した。洗浄後、浸潤した細胞が残るメンブレンを回収し、スライドガラス上に封入した。15分以上乾燥させた後、顕微鏡にて観察および画像を撮影し、画像上の細胞数をカウントした。結果を図30に示す。
図30A及びBに示すように、刺激によりRPE細胞の浸潤細胞数が増加し、RPE細胞の運動能亢進が確認された。上皮系の細胞であるRPE細胞は通常運動能を有していない。このように、運動能を本来有していない上皮系の細胞が運動能を獲得することもEMTにおける代表的な現象である。
試験例5−5 EMTを生じたRPE細胞の形態的観察
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、EMT誘導48時間後に細胞を観察した。さらに、プレートの全体像を弱拡大において観察する為、観察後の細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液で室温30分処理し固定化した後、PBSで3回洗浄した。100%メタノールで室温10分×2回処理し、ギムザ染色液(ナカライテスク社 #37114−35)を加え、室温15分で染色した。メタノールで3回洗浄した後、室温3時間で乾燥させた。乾燥した細胞を顕微鏡で観察した。結果を図31に示す。
試験例5−1に記載の条件により、RPE細胞にEMTを誘導した場合、図22Bにおいて矢印で示すように、Focusが生じ、ドルーゼン様構造体の形成が確認された。一方で、EMTを誘導していない場合は、図31Aに示すように、PRE細胞はFocusを形成することなくコンフルエントな状態を維持していた。図31C及びDでは、EMT誘導の有無を弱拡大において観察したものである。RPE細胞にEMTを誘導した場合、図31Dに示すように、ドルーゼン様構造体(Focus)は、AMD患者の眼底写真におけるドルーゼン(図31E)と形態的に近似することが確認された。このことから、RPE細胞においては、EMT誘導による間葉化亢進によりドルーゼン様構造体が形成されることを証明した。また、このRPE細胞におけるドルーゼン様構造体は、AMD患者におけるドルーゼンをインビトロで再現したモデルとして有効に用いることができる。
[6.EMT抑制化合物の評価及び/又はスクリーニング]
試験例6−1 EMTマーカーの発現変化1
上述のように、RPE細胞に刺激を与えることによって、EMTマーカーの変化や運動能の亢進が起こり、ドルーゼン様構造体が形成されることが確認され、EMTの誘導が可能な細胞モデルを構築することができた。この細胞モデルを用いて、EMTを抑制する化合物を選出した。また、この細胞モデルを用いることにより、EMT抑制化合物を評価することが可能である。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、同時に評価化合物(被験薬剤ともいう)を添加した。EMT誘導コントロールとして、評価化合物(被験薬剤)を非添加のサンプルを用いた。EMT誘導48時間後に4%パラホルムアルデヒド溶液で室温30分処理し細胞を固定化した後、PBSで3回洗浄した。0.2%Triton−X/PBS溶液で5分処理し、PBSで3回洗浄した。蛍光染色溶液(0.2% Phalloidin−Alexa 568(Molecular Probes社 #A12380)/0.05% Hochest 33342(Invitrogen社 #H3570)/3%BSA−PBS)にて室温1時間で細胞を染色した後、PBSで5分×3回洗浄を行った。蛍光染色を行った細胞は、Image Express Micro(Molecular Devices社)を用いて画像化し、MetaXpress2.0(Molecular Devices社)を用いて数値化した。数値データからFocusの形成度(Focusレベル)を解析することにより化合物非添加時の数値を基準として以下の式1によりFocus形成抑制率を算出し、各化合物におけるEMT抑制効果を検証した。Focusの形成度(Focusレベル)は、Focusの数と体積を指標として求めた。
(式1)
Figure 0006967222
表中のIC50は以下の式2を用いて算出した。
(式2)
Figure 0006967222
A:50%を挟む高い濃度
B:50%を挟む低い濃度
C:50%を挟む低い濃度での阻害率
D:50%を挟む高い濃度での阻害率
その結果、以下の化合物において、EMT抑制効果が確認された。
Figure 0006967222
上記表1に記載のEMT抑制化合物のうち、代表する5つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)について、上記の細胞モデルを用いてEMT抑制効果を評価した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、同時に代表する5つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)を添加し、EMT誘導48時間後に細胞を回収した。コントロールとして、評価化合物(被験薬剤)を非添加のサンプルを用いた。回収した細胞をPBSで洗浄し、RLT buffer 350μLを加えて、RNA採取用ライセートを作成した。ライセートからRNeasy Micro kit(QIAGEN社 #74004)を用いてトータルRNAを抽出し、得られたRNA2μgからSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社 #11752−250)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNA50ngを鋳型として、リアルタイムPCR(ABI Prism 7500 Sequence Detection System)を製造業者のプロトコールに従って行い、各遺伝子のmRNAの発現を定量分析した。各遺伝子に対する特異的プライマーはInvitrogen社より購入した。各遺伝子Ct(Threshold Cycle)値は内在性コントロールによりノーマライズ後、非処理のサンプルに対する割合を算出した。結果を図3〜図7に示す。
図3〜図7の各グラフにおいて、左の棒グラフは、EMTが誘導されていない時の各遺伝子の発現量を示している。真ん中の棒グラフは、EMT誘導時の各遺伝子の発現量を示している。右の棒グラフは、EMT抑制化合物投与時の各遺伝子の発現量を示している。また、図3〜図7は、EMT抑制化合物として、それぞれオキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェンを用いた結果を示している。
本明細書において、各EMTマーカーは以下のように略称でも記載される。
カドヘリン(Cadherin):CDH(CDH2、CDH3等)
マトリックスメタロプロティナーゼ:MMP(MMP1、MMP3、MMP7等)
フィブロネクチン:FN(FN1等)
ビメンチン:VIM
コラーゲンタイプ1α1:COL1A1
コラーゲンタイプ1α2:COL1A2
コラーゲンタイプ5α2:COL5A2
コラーゲンタイプ5α3:COL5A3
コラーゲンタイプ6α3:COL6A3
コラーゲンタイプ13α1:COL13A1
ラミニンβ3:LAMB3
ラミニンγ2:LAMC2
Hyaluronan−Mediated Motility Receptor:HMMR
テネイシンC:TNC
Zinc Finger E−Box Binding Homeobox 2:ZEB2
セルグリシン(Serglycin):SRGN
chondroitin sulfate proteoglycan 4:CSPG4
図3〜図7に示すように、EMTマーカーのうち、間葉系マーカーであるSnail、Slug、CDH3、MMP1、MMP7、及びECMであるCOL5A3、COL6A3、LAMC2、HMMR、TNCは、いずれのEMT抑制化合物を適用した場合であっても発現が抑制された。これにより、これらの10種のEMTマーカーは、EMT抑制化合物により共通して抑制される指標となることが確認された。これらの10種以外のEMTマーカーであっても、図3に示すように、オキサプロジンでは、ZEB2、MMP3、COL1A1、COL1A2、CSPG4、SRGNの発現低下が確認された。図4に示すように、エパルレスタットでは、ZEB2、CDH2、FN1、VIM、COL1A1、COL1A2、COL5A2、COL13A1、CSPG4、SRGNの発現低下が確認された。図5に示すように、ザフィルルカストでは、MMP3、COL13A1、LAMB3、CSPG4の発現低下が確認された。図6に示すように、アンレキサノクスでは、ZEB2、CDH2、MMP3、COL1A1、COL13A1の発現低下が確認された。図7に示すように、ザルトプロフェンでは、ZEB2、FN1、COL13A1、CSPG4の発現低下が確認された。これらのEMTマーカーも、EMT抑制化合物により抑制される指標となり得ることが確認された。
試験例6−2 EMTマーカーの発現変化2
5種の化合物(フルフェナム酸アルミニウム、メフェナム酸、スリンダク、チアプロフェン酸、セラトロダストについて、試験例6−1と同様の方法によりIC50を求めた。結果を表2に示す。
Figure 0006967222
表2に示すように、EMT抑制効果が確認された5種の化合物(フルフェナム酸アルミニウム(添加濃度:28μM(Cmax))、メフェナム酸(添加濃度:39μM(Cmax))、スリンダク(添加濃度:100μM)、チアプロフェン酸(添加濃度:1000μM)、セラトロダスト(添加濃度:31μM(Cmax)))について、試験例6−1と同様の方法により、EMTマーカーの発現変化を評価した。結果をそれぞれ図8〜図12に示す。
図8〜図12に示すように、5種のEMT抑制化合物(フルフェナム酸アルミニウム、メフェナム酸、スリンダク、チアプロフェン酸、セラトロダスト)においても、EMT誘導時におけるEMTマーカーの発現を低下させることが確認された。
試験例6−3 運動能亢進の抑制試験
上述の試験例5−4に記載したInvasion Assay法を用いて、EMTにより運動能が亢進したRPE細胞において、EMT抑制化合物による影響を確認した。
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、5つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)を添加、EMT誘導24時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、BD Biocoat Matrigel invasion chamber(BD Biosciece社 #354480)に播種し、37℃にてさらに24時間インキュベートした。インキュベート後、製造業者のプロトコルに従って非浸潤細胞を除去した後、100%メタノールを加え室温15分で細胞を固定した。ギムザ染色液(ナカライテスク社 #37114−35)を加え、室温30分で染色した後、PBSで5分間×2回洗浄した。洗浄後、浸潤した細胞が残るメンブレンを回収し、スライドガラス上に封入した。15分以上乾燥させた後、顕微鏡にて観察および画像を撮影し、浸潤した細胞数をカウントした。結果を図32〜図34に示す。
図32〜図34は、EMT抑制化合物として、それぞれエパルレスタット、アンレキサノクス、ザフィルルカストを用いた結果を示している。また、図32〜図34の棒グラフにおいて、左の白抜きの棒グラフは、EMT誘導時のRPE細胞の浸潤細胞数を示し、右の黒色の棒グラフは、左から順に低濃度から高濃度のEMT抑制化合物を添加した場合のRPE細胞の浸潤細胞数を示している。
図32〜図34に示すように、RPE細胞において、EMTにより誘起される運動能が、EMT抑制化合物の濃度依存的に、有意に抑制されることが確認された。
[7.ドルーゼン様構造体抑制試験による薬効評価]
プレートにRPE細胞(ARPE−19)を播種し、5日間、37℃にてインキュベートした。RPE細胞に対して、試験例5−1に記載の条件によりEMTを誘導し、同時に5つの化合物(オキサプロジン、エパルレスタット、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、ザルトプロフェン)を添加、EMT誘導48時間後に細胞を観察した。EMT誘導コントロールとして、評価化合物(被験薬剤)を非添加のサンプルを用いた。観察後の細胞は、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温30分処理し固定化した後、PBSで3回洗浄した。0.2%Triton−X/PBS溶液で5分処理し、PBSで3回洗浄した。蛍光染色溶液(0.2% Phalloidin−Alexa 568(Molecular Probes社 #A12380)/0.05% Hochest33342(Invitrogen社 #H3570)/3%BSA−PBS)にて室温1時間で細胞を染色した後、PBSで5分×3回洗浄を行った。蛍光染色を行った細胞は、Image Express Micro(Molecular Devices社)を用いて画像化し、MetaXpress2.0(Molecular Devices社)を用いて数値化した。数値データからFocusの形成度を解析することにより、非化合物添加時および非EMT誘導時を基準としてFocus形成抑制率を算出し、各化合物におけるEMT抑制効果を検証した。蛍光画像取得後の細胞は全体像を弱拡大にて観察するために100%メタノールで室温10分×2回処理し、ギムザ染色液(ナカライテスク社 #37114−35)を加え、室温15分で染色した。メタノールで3回洗浄した後、室温3時間で乾燥させた。乾燥した細胞を顕微鏡で観察した。結果を図35〜図39に示す。Focusの形成抑制率は、上記の試験例6−1で示す式1により算出した。
図35〜図39は、EMT抑制化合物として、それぞれオキサプロジン、エパルレスタット、アンレキサノクス、ザフィルルカスト、ザルトプロフェンを用いた結果を示している。図35〜図39に示すように、EMT抑制化合物はいずれも、RPE細胞モデルにおいて形成されたドルーゼン様構造体を濃度依存的に抑制することが確認された。すなわち、ドルーゼン様構造体抑制試験におけるIC50値は、オキサプロジンでは61.0μM、エパルレスタットでは16.9μM、アンレキサノクスでは32.5μM、ザフィルルカストでは3.8μM、ザルトプロフェンでは16.5μMであった。
ドルーゼンはRPE細胞がEMTを引き起こしたことに起因する構造体であるとの新たな知見に基づき、ドルーゼンに対してEMT抑制化合物を適用することでドルーゼンを抑制することが示された。この結果から、公知のEMT抑制化合物であっても、ドルーゼンに対して、同様の効果を奏することが推測される。
以下の方法により、5つのEMT抑制化合物について、最大薬物血漿中濃度(Cmax)を各薬剤のインタビューフォーム及び添付文書より求めた。
結果を表3に示す。
Figure 0006967222
表3に示すように、5つのEMT抑制化合物は、AMDに対する効果が期待される程度に十分な血中濃度であった。
[試験例8.ドルーゼン抑制評価のためのin vivoモデル試験]
試験例8−1.後眼部(網膜領域)へのドルーゼン様構造体形成の誘導
(1)後眼部(網膜領域)への炎症誘起によるドルーゼン様構造体の誘導方法
マウス後眼部網膜周辺に、Recombinant Mouse TNF−a (R&D Systems社 #410−MT) 400ngを投与した。
投与方法は以下のとおりである。
1)PBSに溶解したTNF−a(160ng/μL)を2.5μL準備する。
2)マウスの眼球が良く見えるように瞼を押し広げる。
3)軽く抵抗を感じるところまで針を挿入し、薬液を注入する(400ng/一眼)。
(2)眼球組織サンプルの作成方法
投与2週間後に眼球を摘出し、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを作成した。
(3)RPE細胞の形態的観察
組織サンプルは、キシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、水5分間で処理し、脱パラフィンした。マイヤーヘマトキシリン溶液で4分間、エオジン液で1分間染色を行った。流水中で5分処理した後、70%エタノール1分、80%エタノール1分、90%エタノール1分、100%エタノール1分×2回、キシレン5分×3回で処理を行い、マリノールを用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後、無処理のRPE細胞および炎症誘導のRPE細胞を観察した。結果を図40に示す。
図40に示すように、炎症誘導により網膜領域にドルーゼン様構造(点線で囲った部分)が形成された。無処理群の網膜色素上皮細胞は、立方状の形態を示し、隣接する細胞と密着に接しており、1層の整列を示していることが確認された(上の写真)。一方で、炎症誘導後は、1層に整列した網膜色素上皮細胞は観察されず、ドルーゼン様構造体の内部・周囲に存在しており、隣接する細胞との密着な結合が消失し、その形態は立方状から紡錘状に変化していることが確認された(下の写真)。
(4)免疫組織化学による各マーカーの評価方法
ブロックより眼球組織切片を作成した。組織サンプルを気相インキュベーター中で56℃、30分間インキュベートした後、キシレン5分×3回、100%エタノール1分×2回、90%エタノール1分、80%エタノール1分、70%エタノール1分、水5分間で処理し、脱パラフィンした。Delicate Melanin Bleach Kit for Special Stains and IHC(Polysciences社 #24909−1)を用いて製造業者のプロトコルに従って、組織中のメラニン色素を除去した後、クエン酸バッファー pH6.0を用いて、マイクロウェーブ処理10分間により抗原を賦活化した。室温で30分静置した後、PBSで5分、3%過酸化水素/PBS溶液で5分、PBSで5分処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。3%BSA/PBS溶液中で室温にて30分静置し、組織をブロッキングした。1次抗体として、1.5% BSA/PBS溶液にて500倍に希釈した抗E−Cadherin抗体(BD Biosience社 #610182)および1000倍に希釈した抗Cytokeratin抗体(Sigma社 #C2931)および1000倍に希釈した抗Fibronectin抗体(abcam社 #45688)および100倍に希釈した抗Vimentin抗体(Cell signaling Technology社 #5741)を1組織当たり200μL滴下し、4℃、17時間で組織と反応させた。1次抗体と反応させた組織は、PBSで5分×3回洗浄した後、室温にて30分間、2次抗体(抗E−Cadherin抗体および抗Cytokeratin抗体に対してはMouse on Mouse(M.O.M.)Elite Peroxidase Kit(Vector Laboratories社 #PK−2200)、抗Fibronectin抗体および抗Vimentin抗体に対してはVECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG Kit(Vector Laboratories社 #PK−6101))と反応させ、PBSで5分×3回洗浄した後、製造業者のプロトコルに従って室温30分にてABC反応を行った。組織をPBSで5分×3回洗浄した後、ImmPACT AMEC Red Peroxidase(HRP)Substrate(Vector Laboratories社 #SK−4285)を用いて、室温3分間で発色を行った。発色させた組織は、New ヘマトキシリン TypeM(武藤化学株式会社 #30141)を用いて染色した後、流水中で3分静置し、70%エタノール1分、80%エタノール1分、90%エタノール1分、100%エタノール1分×2回、キシレン5分×3回で処理を行い、マリノールを用いて封入した。室温で15分以上乾燥させた後観察した。E−Cadherinについての結果は図41に示す。Cytokeratinについての結果は図42に示す。Fibronectinについての結果は図43に示す。Vimentinについての結果は図44に示す。
図41に示すように、無処理の網膜上皮細胞では細胞間に強陽性のE−Cadherinの染色が見られ、強固な細胞間接着が保持されていた(上の写真)。一方で、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部及びその周囲の網膜色素上皮細胞では染色が消失していた(下の写真)。
図42に示すように、無処理の網膜上皮細胞では細胞間に強陽性のCytokeratinの染色が見られた(上の写真)。一方で、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の特に周囲の網膜色素上皮細胞では染色が消失していた(下の写真)。
図43に示すように、無処理の網膜上皮細胞(点線で囲った部分)ではシグナルは陰性であり、Fibronectinの発現は認められなかった(上の写真)。一方で、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部および周囲では染色が陽性であり、Fibronectinの発現が認められた(下の写真)。
図44に示すように、無処理の網膜上皮細胞(点線で囲った部分)ではシグナルは陰性であり、Vimentinの発現は認められなかった(上の写真)。一方で、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部および周囲では染色が陽性であり、Vimentinの発現が認められた(下の写真)。
試験例8−2.薬理評価:ドルーゼン様構造体形成の抑制効果
(1)後眼部(網膜領域)への炎症誘起によるドルーゼン様構造体の誘導方法
試験例8−1に記載の方法により、マウス後眼部網膜周辺に、Recombinant Mouse TNF−a (R&D Systems社 #410−MT) 400ngを投与した。
(2)評価化合物の投与
評価化合物は0.5%カルボキシメチルセルロース水溶液に懸濁し、オキサプロジンは600mg/kg/dayで、エパルレスタットは600mg/kg/dayで、ザルトプロフェンは40mg/kg/dayになるように14日間、ゾンデを用いて経口投与した。
(3)RPE細胞の形態的観察
試験例8−1に記載の方法により、眼球組織サンプルを調製し、無処理のRPE細胞および炎症誘導のRPE細胞を、それぞれHE染色、E−Cadherinの免疫染色、又はFibronectinの免疫染色で観察した。
オキサプロジンの薬理評価を図45〜図47に示す。エパルレスタットの薬理評価を図48〜図50に示す。ザルトプロフェンの薬理評価を図51〜図53に示す。
図45に示すように、炎症誘導により網膜領域にドルーゼン様構造(点線で囲った部分)が形成された(上の写真)。オキサプロジン投与群では明らかにドルーゼン様構造体の形成が抑制されていた(下の写真)。
炎症誘導後は、1層に整列した網膜色素上皮細胞は観察されず、ドルーゼン様構造体の内部・周囲に存在しており、隣接する細胞との密着な結合が消失し、その形態は立方状から紡錘状に変化していた。一方で、オキサプロジン投与群では立方状の形態を保つ細胞が多く観察された。
図46に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部及びその周囲の網膜色素上皮細胞ではE−Cadherinの染色が消失していた(上の写真)。一方で、オキサプロジン投与群の網膜上皮細胞では細胞間に強陽性の染色が見られ、強固な細胞間接着が保持されていた(下の写真)。
図47に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部および周囲では染色が陽性であり、Fibronectinの発現が認められた(上の写真)。一方で、オキサプロジン投与群ではドルーゼン様構造体の形成が抑制されており、また、染色シグナル強度も弱いことが確認された(下の写真)。
図48に示すように、炎症誘導により網膜領域にドルーゼン様構造(点線で囲った部分)が形成された(上の写真)。エパルレスタット投与群では明らかにドルーゼン様構造体の形成が抑制されていた(下の写真)。
炎症誘導後は、1層に整列した網膜色素上皮細胞は観察されず、ドルーゼン様構造体の内部・周囲に存在しており、隣接する細胞との密着な結合が消失し、その形態は立方状から紡錘状に変化していた。一方で、エパルレスタット投与群では立方状の形態を保つ細胞が多く観察された。
図49に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部及びその周囲の網膜色素上皮細胞ではE−Cadherinの染色が消失していた(上の写真)。一方で、エパルレスタット投与群の網膜上皮細胞では細胞間に強陽性の染色が見られ、強固な細胞間接着が保持されていた(下の写真)。
図50に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部および周囲では染色が陽性であり、Fibronectinの発現が認められた(上の写真)。一方で、エパルレスタット投与群ではドルーゼン様構造体の形成が抑制されており、また、染色シグナル強度も弱いことが確認された(下の写真)。
図51に示すように、炎症誘導により網膜領域にドルーゼン様構造(点線で囲った部分)が形成された(上の写真)。ザルトプロフェン投与群では明らかにドルーゼン様構造体の形成が抑制されていた(下の写真)。
炎症誘導後は、1層に整列した網膜色素上皮細胞は観察されず、ドルーゼン様構造体の内部・周囲に存在しており、隣接する細胞との密着な結合が消失し、その形態は立方状から紡錘状に変化していた。一方で、ザルトプロフェン投与群では立方状の形態を保つ細胞が多く観察された。
図52に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部及びその周囲の網膜色素上皮細胞ではE−Cadherinの染色が消失していた(上の写真)。一方で、ザルトプロフェン投与群の網膜上皮細胞では細胞間に強陽性の染色が見られ、強固な細胞間接着が保持されていた(下の写真)。
図53に示すように、炎症誘導により形成されたドルーゼン様構造体の内部および周囲では染色が陽性であり、Fibronectinの発現が認められた(上の写真)。一方で、ザルトプロフェン投与群ではドルーゼン様構造体の形成が抑制されており、また、染色シグナル強度も弱いことが確認された(下の写真)。
[製剤例]
(処方例1 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。カルメロースカルシウム、ヒプロメロース、結晶セルロース、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウムなどを添加物として、オキサプロジンを100mgもしくは200mgを含む素錠となどとして製造され、通常、成人には1日量400mgを1〜2回に分けて経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減するが、1日最高量は600mgとする。
(処方例2−1 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。カルメロースカルシウム、結晶セルロース、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、乳糖水和物、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、マクロゴール6000を添加物として、ザルトプロフェンを80mg含むフィルムコーティング錠などとして製造され、通常、成人に1回80mgを1日3回経口投与することができる。頓用の場合は、1回80mg〜160mgを経口投与する。
(処方例2−2 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。カルナウバロウ、カルメロースカルシウム、結晶セルロース、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、乳糖水和物、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロースを添加物として、ザルトプロフェンを80mg含むフィルムコーティング錠などとして製造され、通常、成人に1回80mgを1日3回経口投与することができる。頓用の場合は、1回80mg〜160mgを経口投与する。
(処方例3 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。乳糖水和物、結晶セルロース、ポビドン、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、酸化チタンなどを添加物として、ザフィルルカストを20mg含むフィルムコーティング錠などとして製造され、通常、成人には1日40〜80mgを朝食後及び就寝前の2回に分けて経口投与することができる。なお、高齢者の1日投与量は40mg、成人(高齢者を除く)の1日最高量は80mgとする。
(処方例4 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、乳糖水和物などを添加物として、アンレキサノクスを25mgもしくは50mg含む素錠として製造され、通常、成人には症状に応じて1回として25〜50mgを1日3回、朝、夕及び就寝前もしくは朝、昼及び夕に経口投与することができる。
(処方例5 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。D−マンニトール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース、酸化チタン、ポリオキシエチレン(105)ポリオキシプロピレン(5)グリコールなどを添加物として、エパルレスタットを50mg含むフィルムコーティング錠などとして製造され、通常、成人には1回50mgを1日3回毎食前に経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減することができる。
(処方例6 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。トウモロコシデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ヒプロメロース、酸化チタン、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン[160]ポリオキシプロピレン[30]グリコールなどを添加物として、チアプロフェン酸を100mg又は200mg含むフィルムコーティング錠などとして製造され、通常、成人には1回200mgを1日3回経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減することができる。
(処方例7 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。カルメロースカルシウム、ヒプロメロース、結晶セルロース、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウムなどを添加物として、フルフェナム酸アルミニウムを125mgもしくは250mgを含む素錠となどとして製造され、通常、成人には125〜250mgを1日3回に分けて経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減するが、1日最高量は750mgとする。
(処方例8 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。トウモロコシデンプン、ヒプロメロース、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、酸化チタンなどを添加物として、メフェナム酸を250mgを含む素錠となどとして製造され、通常、成人1回500mg、その後6時間毎に1回250mg経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減するが、1日最高量は1500mgとする。
(処方例9 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。セルロース、アルファー化デンプン、ステアリン酸マグネシウムなどを添加物として、スリンダクを50mg又は100mgを含む素錠となどとして製造され、通常、成人1日量300mgを1日2回に分けて経口投与することができる。なお、年齢、症状により適宜増減する。
(処方例10 錠剤)
通常の錠剤の製造方法に基づいて打錠して、錠剤を製造する。ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、乳糖水和物などを添加物として、セラトロダストを40mg又は80mgを含む素錠となどとして製造され、通常、成人1日1回80mgを経口投与することができる。

Claims (3)

  1. ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、エパルレスタット、プランルカスト、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有し、
    経口剤、静脈内投与剤、点眼剤、又は眼軟膏剤である、脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
  2. 前記脈絡膜新生血管が、加齢性黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)、又は網膜血管腫状増殖(RAP)において生じる、請求項1又は2に記載の脈絡膜新生血管の予防及び/又は治療剤。
  3. ザルトプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、フルフェナム酸、メフェナム酸、エパルレスタット、プランルカスト、ザフィルルカスト、アンレキサノクス、セラトロダスト及びこれらの薬学的に許容できる塩からなる群より選択される少なくとも1種を有効成分として含有し、
    経口剤、静脈内投与剤、点眼剤、又は眼軟膏剤である、加齢性黄斑変性症の予防及び/又は治療剤。
JP2017556480A 2015-12-17 2016-12-16 脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法 Active JP6967222B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015246742 2015-12-17
JP2015246742 2015-12-17
JP2016133753 2016-07-05
JP2016133753 2016-07-05
PCT/JP2016/087647 WO2017104833A1 (ja) 2015-12-17 2016-12-16 脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2017104833A1 JPWO2017104833A1 (ja) 2018-10-11
JP6967222B2 true JP6967222B2 (ja) 2021-11-17

Family

ID=59056643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017556480A Active JP6967222B2 (ja) 2015-12-17 2016-12-16 脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10761087B2 (ja)
EP (2) EP3750540B1 (ja)
JP (1) JP6967222B2 (ja)
CN (1) CN108883096A (ja)
ES (2) ES2972329T3 (ja)
TW (2) TWI814700B (ja)
WO (1) WO2017104833A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110585196B (zh) * 2018-06-13 2022-11-04 郭涛 一种治疗及预防眼科疾病的药物及其应用
CN109991055A (zh) * 2019-03-28 2019-07-09 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 多色荧光染料和荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法
CN110496124A (zh) * 2019-04-10 2019-11-26 中山大学附属第五医院 治疗脉管畸形的化合物
CN110604729B (zh) * 2019-10-12 2022-03-11 南通大学 双硫仑联合葡萄籽原花青素在制备用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤药物方面的应用
CN112156172B (zh) * 2020-10-26 2022-11-25 上海交通大学医学院附属第九人民医院 血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用
CN112526038B (zh) * 2020-12-15 2022-07-12 河北科技大学 一种卡洛芬及其有关物质的检测方法
CN112546044B (zh) * 2020-12-23 2022-12-06 广东宏盈科技有限公司 一种噻洛芬酸与异黄酮药物组合物及其应用
CN112926116B (zh) * 2021-03-01 2023-02-17 哈尔滨工业大学 一种基于虚拟现实的体育馆火灾疏散行为数据收集系统及其收集方法
CN114480490A (zh) * 2021-12-31 2022-05-13 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种构建视网膜新生血管性疾病动物模型的方法
CN116371376B (zh) * 2023-03-22 2024-05-24 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种双功能基间苯三酚吸附材料及其制备方法和应用
CN116253831B (zh) * 2023-03-23 2024-03-08 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种吸附间苯三酚的分子印迹材料及其制备方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005294382A1 (en) * 2004-10-04 2006-04-20 Qlt Usa, Inc. Ocular delivery of polymeric delivery formulations
US20070196350A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Bartels Stephen P Compositions and Methods for Effecting Controlled Posterior Vitreous Detachment
US20090253745A1 (en) * 2007-11-28 2009-10-08 Sirion Therapeutics, Inc. Modulators of ocular oxidative stress
US20090270490A1 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods involving aldose reductase inhibition
KR101423631B1 (ko) * 2012-08-17 2014-07-25 주식회사파마킹 에스-알릴엘-시스테인을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 의약제제
MX2015005839A (es) * 2012-11-08 2015-12-17 Clearside Biomedical Inc Metodos y dispositivos para el tratamiento de trastornos oculares en sujetos humanos.
CA2928702A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Children's Medical Center Corporation Methods of treating or preventing vascular diseases of the retina

Also Published As

Publication number Publication date
EP3391883A1 (en) 2018-10-24
TW202345783A (zh) 2023-12-01
EP3391883A4 (en) 2019-04-17
WO2017104833A1 (ja) 2017-06-22
EP3750540A1 (en) 2020-12-16
TWI814700B (zh) 2023-09-11
US10761087B2 (en) 2020-09-01
CN108883096A (zh) 2018-11-23
ES2972329T3 (es) 2024-06-12
ES2819539T3 (es) 2021-04-16
TWI837028B (zh) 2024-03-21
TW201733574A (zh) 2017-10-01
JPWO2017104833A1 (ja) 2018-10-11
US20180364216A1 (en) 2018-12-20
EP3750540B1 (en) 2023-12-13
EP3391883B1 (en) 2020-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6967222B2 (ja) 脈絡膜新生血管抑制剤又はドルーゼン抑制剤およびその評価又はスクリーニング方法
Haritoglou et al. Alpha-lipoic acid for the prevention of diabetic macular edema
CN106132201A (zh) 用于治疗眼部疾病的组合物和方法
CN109789148A (zh) 二氨基吩噻嗪的给药和剂量
IL235395A (en) Use of compounds for the preparation of drugs for the treatment of blind eye diseases
Xie et al. Activated AMPK mitigates diabetes-related cognitive dysfunction by inhibiting hippocampal ferroptosis
KR20090034810A (ko) 멜라토닌 효능제 치료
JP2014515408A (ja) 行動及び精神障害の治療のためのシロ−イノシトール
WO2022150580A1 (en) Treatment of dry eye disease
JP2017533267A (ja) 脳アミロイド血管症の予防及び治療用医薬品を製造するためのエダラボンの使用
TW202313003A (zh) 用於治療憂鬱之組成物及方法
JP2014507475A (ja) シクロベンザプリンを使用してうつ病を処置するための方法および組成物
EP3310353A1 (en) Compositions and methods for treating and diagnosing ocular disorders
US20210267999A1 (en) Use of dopamine and serotonin receptor antagonists for treatment in a subject with retinal degeneration
WO2022123837A1 (ja) 強膜菲薄化治療用点眼剤及び強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法
CA2870353C (en) Compositions and methods for treating and diagnosing ocular disorders
CN106619602B (zh) 益母草碱的用途
WO2023145578A1 (ja) 薬剤点眼による近視誘導モデル
Tokuda et al. The effect of rebamipide on ocular surface disorders induced by latanoprost and timolol in glaucoma patients
Shuang et al. Grp78 alleviates sodium iodate-induced retinal cell injury in vivo and in vitro
Zheng et al. A study of retinopathy analysis in type 2 diabetes patients in Chinese population.
JP2022531484A (ja) 加齢性黄斑変性症を治療するための物質および方法
EA045318B1 (ru) Соединения для лечения глазных болезней, связанных с избыточной васкуляризацией
KR101693069B1 (ko) 신증후군의 예방 또는 치료 활성을 갖는 항산화제의 용도
JP2019524860A (ja) 非アルコール性脂肪肝疾患の治療法

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20180626

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20180626

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191127

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210112

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210319

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210517

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210719

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210916

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20211013

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6967222

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250