KR20180091415A - 고삼 추출물 또는 마트린을 포함하는 진정 또는 수면유도용 조성물 - Google Patents

고삼 추출물 또는 마트린을 포함하는 진정 또는 수면유도용 조성물 Download PDF

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정선용
이현주
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경희대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 고삼 추출물 또는 마트린을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면유도용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품에 대한 것으로, 카페인에 대한 진정 효과를 나타내고, 뇌에서의 5-HT 수준 및 c-Fos 발현 수준을 증가시킴으로써 수면을 유도하는 뛰어난 효과를 나타낸다. 또한, 수면 중 각성 시간을 상당히 감소시키고 NREM 시간을 증가시킴으로써 수면의 질 또한 향상시킬 수 있다.

Description

고삼 추출물 또는 마트린을 포함하는 진정 또는 수면유도용 조성물{COMPOSITION CONTAINING SOPHORA FLAVESCENS EXTRACT OR MATRINE FOR SEDATION OR SLEEPING INDUCTION}
본 발명은 고삼 추출물 또는 마트린을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면유도용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품에 대한 것이다.
수면은 삶의 질을 평가하는 필수적인 건강 요소이다. 수면 장애는 항상성의 조절장애를 일으키고 염증 관련 질환 및 만성 질환에 취약해지도록 한다. 벤조디아제핀은 불면증 치료를 위해 가장 일반적으로 사용되는 약물이지만 기분장애, 폐질환, 인지결손과 같은 부작용을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 부작용에 따라, 천연 대안제의 개발이 중요시되고 있다.
고삼(Sophora flavescens; SF)은 콩과(Fabaceae family)에 속하는 여러해살이풀로서, 이의 뿌리는 열, 이질, 통증 등의 치료에 사용되는 전통 치료제로서 사용되어왔다. 고삼은 항-감염 효과, 항-로타바이러스 효과, 상처 회복 효과 및 미백 효과가 있다고 보고되었다. 마트린(Matrine)은 고삼의 생활성 성분 중 하나인 알칼로이드로서 심장 질환, 염증 및 종양에 약리학적 효과가 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 고삼 및 마트린의 진정 효과 또는 수면 유도 효과에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.
1. 한국공개특허 제10-2015-0004158호
본 발명은 고삼 추출물 및 이의 생활성 성분인 마트린이 진정 효과 및 수면 유도 효과가 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고삼 추출물 또는 마트린(matrine)을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면 유도용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고삼 추출물 또는 마트린(matrine)을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 조합들로 추출한 것일 수 있으며, 예를 들어 에탄올 또는 메탄올로 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 고삼 추출물은 10 ~ 1000 mg/ml의 농도, 예를 들어, 100 ~ 1000 mg/ml, 400 ~ 1000 mg/ml, 6000 ~ 1000 mg/ml, 10 ~ 800 mg/ml, 10 ~ 500 mg/m 또는 400 ~ 800 mg/ml의 농도일 수 있으며, 상기 마트린은 10 ~ 500 mg/ml의 농도, 예를 들어, 100 ~ 500 mg/ml, 200 ~ 500 mg/ml, 10 ~ 300 mg/ml 또는 10 ~ 100 mg/ml의 농도일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 카페인에 대한 진정 효과를 나타낼 수 있으며, 예를 들어, 카페인에 의해 유도되는 신체 또는 장기의 과잉활동에 대한 진정 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 뇌에서의 5-HT 수준 및 c-Fos 발현 수준을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 수면 동안 각성 시간을 감소시키고 NREM 수면 시간을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 고삼 추출물 및 이의 생활성 성분인 마트린의 진정 효과 및 수면 유도 효과를 최초로 입증한 것으로, 카페인에 대한 진정 효과를 나타내고, 뇌에서의 5-HT 수준 및 c-Fos 발현 수준을 증가시킴으로써 수면을 유도하는 뛰어난 효과를 나타낸다. 또한, 수면 중 각성 시간을 상당히 감소시키고 NREM 시간을 증가시킴으로써 수면의 질 또한 향상시킬 수 있다.
도 1은 카페인-유도 과잉활동에 대한 (a) 고삼 및 (b) 마트린의 효과를 나타낸다. 각 컬럼은 평균값 ± SEM을 나타낸다. * P<0.05 vs 식염수처리 그룹, #P<0.05 vs 카페인 처리 그룹; one-way ANOVA.
도 2는 수면 구조에 대한 고삼의 효과를 나타낸 것이다. 암흑 상태 동안의 각성(a), REM 수면(b) 및 NREM 수면(c)의 비율에서의 변화가 고삼 처리 그룹에서 나타났다. 데이터는 수면-각성 상태에서 보내는 백분율 시간의 평균 ± SEM으로 나타냈다. * P<0.05 vs 식염수 처리 그룹; one-way ANOVA.
도 3은 수면 구조에 대한 마트린의 효과를 나타낸 것이다. 암흑 상태 동안의 각성(a), REM 수면(b) 및 NREM 수면(c)의 비율에서의 변화가 마트린 처리 그룹에서 나타났다. 데이터는 수면-각성 상태에서 보내는 백분율 시간의 평균 ± SEM으로 나타냈다. * P<0.05 vs 식염수 처리 그룹; one-way ANOVA.
도 4는 5-HT 농도에 대한 고삼 및 마트린의 효과를 나타낸 것이다. (a) 고삼 및 (b)마트린 처리 그룹에서의 피질에서의 평균(±SEM) 5-HT 수준을 나타냈다. P<0.05 및 **P<0.01 vs 식염수처리
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 고삼 추출물 또는 마트린을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면유도용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것이다.
상기 고삼 추출물 및 마트린에 의한 진정 효과 및 수면 유도 효과를 locomotor activity test 및 EEG 분석을 통해 조사하였으며, 근본적인 신경 메커니즘은 뇌에서의 면역화학 c-Fos 면역반응성 및 5-HT를 면역조직화학적 방법 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)로 평가하였다.
전시상하부에 위치한 복외측 시작전 부위(ventrolateral preoptic area; VLPO)는 수면 조절 중추 및 수면유도 약물의 분자 표적으로서 작용한다. 수면 활성 뉴런은 수면 중 Fos 단백질의 면역조직화학적 탐지에 의해 확인되었다. 그러므로, VLPO 영역의 활성화가 초기 수면 상태를 나타내는 것이 가능하다. VLPO의 뉴런은 수면-각성 항상성 조절에 가장 중요한 신경전달물질 중 하나인 세로토닌(5-HT) 및 이의 수용체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 고삼 추출물 및 마트린은 피질 및 VLPO에서의 5-HT 수준 및 VLPO에서의 c-Fos 발현 수준을 상당히 증가시킬 수 있다.
수면-각성 상태는 electroencephalogram (EEG) 주파수의 시프트를 측정하여 평가되는 것으로, 각성기에서 비-REM(NREM)으로, 그 후 REM으로의 연속적인 전환이 계속된다. 각성은 고주파의 우세 및 낮은 진폭 EEG로 확인되고, NREM은 EEG에서의 서파(slow waves) 사이에 배치된 스핀들(spindles)의 존재를 근거로 점수를 매긴다. REM 동안의 EEG 파워는 저주파 δ-파에서 상당히 감소하고 θ-파 활성의 범위 내에서 증가한다. 고삼 추출물 및 마트린의 처리로 인해 수면 중 각성 시간이 상당히 감소되고 NREM 시간이 증가하였다.
본 발명에 따른 고삼 추출물 또는 마트린을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면 유도용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 고삼 추출물 또는 마트린을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 건강기능식품으로도 사용할 수 있다. 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”또는 “건강기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
하기 실시예의 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 나타냈다. 상이한 그룹 사이의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 후 Tukey’s post-hoc test로 분석하였다. 피질에서의 고삼의 5-HT 수준(도 3의 (A))을 ANOVA 후 LSD post-hoc test로 분석하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 23 (IBM) 소프트웨어(Chicago, IL, U.S.A.)를 사용하여 평가하였다. 0.05 미만의 P값은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
제조예 1. 고삼 추출물의 제조
고삼(SF)은 동우당 제약(경북 영천)에서 구매하였다. 고삼의 증거 표본은 경희대 한의학과에 위치한 식물 표본실에 기탁된 것이다(Reference No. KH-SFLM01). 건조된 고삼(200 g)을 초음파 바스 내에서 10배 부피의 70% 메탄올로 추출하고 Whatman filter paper(Maidstone, UK)로 여과하였다. 추출물을 감압(760 mmHg) 하에서 rotary evaporator(Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)를이용하여 22.8 w/w%로 농축시켰다. 마트린은 EOS MED CHEM Co., Ltd.(중국 지난)에서 구입하였다.
제조예 2. 동물 모델의 제조
동물에 대해 실시된 모든 실험 과정은 경희대학교 윤리위원회의 승인(KHUAP(SE)-13-041) 및 US National Institutes of Health (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition, revised 2011)에 따라 구성되었다. 7주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫(Samtaco Animal Corp., Gyeonggi-do, Korea)(310360 g)을 20~25℃의 온도 및 45-65%의 습도가 유지되는 공기 조절 장치가 있는 방에서 12:12 h 명/암 주기(오전 8시에 점등)로 사육하였다. 동물은 실험 전 7일 동안 물 및 음식에 임의로 접근하게 하여 순응시켰다.
제조예 1에서와 같이 제조된 고삼의 메탄올 추출물을 0.9% 식염수에 400mg/ml (SF400) 또는 800mg/ml (SF800) 농도로 용해시킨 후 체중에 대해 10 ml/1kg 용량으로 경구(p.o.) 투여하였다. 마트린을 30mg/ml (M30) 또는 100mg/ml (M100)의 농도로 0.9% 식염수에 용해시킨 후 체중에 대해 1 ml/1kg의 용량으로 복강내(i.p.) 주사하였다.
실시예 1. locomotor 활성의 측정
Locomotor 활성은 카페인-유도 과잉활동 동물 모델에서 고삼 및 마트린의 진정 효과를 평가하기 위해 측정되었다. 카페인은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 카페인을 0.9% 식염수에 10 mg/ml의 농도로 용해한 후 1 ml/1kg의 용량으로 1회 복강내(i.p.) 투여하였다. 고삼 400mg/kg, 고삼 800mg/kg, 마트린 30mg/kg 또는 마트린 100mg/kg을 카페인 주입 30분 전에 투여하고 locomotor 활성을 검은색 폴리에틸렌 직육면체(30*30*45cm) 내에서 측정하였다. 움직인 거리를 2시간 동안 S-MART 프로그램(Panlab Co., Barcelona, Spain)을 사용하는 computerized video-tracking system으로 모니터링하였다. 처음 1시간은 적응 기간으로 간주되었으며, 이후의 1시간 동안의 데이터를 수집하여 locomotor 활성을 분석하여 도 1에 나타냈다.
도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 고삼 800mg/kg이 처리된 그룹은 locomotor 활성에서 상당한 감소를 보였으며[F(3,18)=5.510, p<0.05, 도 1의 (A)] 마트린-투여 그룹은 투여량 의존 경향으로 움직임이 감소되었다[F(3, 27)=1.990, p=0.142, 도 1의 (B)].
실시예 2. 동물 모델의 수술
동물을 5개 그룹(대조; 고삼 400 및 800mg/kg 그룹; 마트린 30 및 100mg/kg 그룹, 그룹 당 6마리)으로 나누었다. stereotaxic atlas (Paxinos et al., 1985)에 기재된 바에 따라 다중그래프 기록(polygraphic recording)을 위해 Electroencephalogram(EEG) 전극을 이식하였다. 펜토바르비탈(40mg/kg, i.p.)로 수술 마취하고, 랫에게 만성적으로 해드 마운트(head mount)를 이식하였다. 3개의 스테인레스 스틸 스크류를 두개골에 미리 뚫어놓은 구멍으로 해드 마운트를 통해 이식하고, 장치를 치과용 시멘트로 고정시켰다. 그런 다음 모든 전극으로부터의 전기줄을 치과용 시멘트로 두개골에 고정시키고 추가 스크류를 두개골에 커넥터를 고정하기 위해 삽입하였다. 수술 후, 회복을 위해 각 랫을 7일 동안 개별적인 투명 배럴에 있도록 하였다.
실시예 3. Electroencephalography (EEG)
실시예 2의 수술에서 회복한 후, 랫이 시험 전에 기록 조건에 익숙해지게 하였다. 고삼 및 마트린의 경구 투여는 EEG 기록 10분 전에 실시하였다. 기록은 오후 8시에 시작하여 12-h EEG 및 활성을 모든 랫에 대해서 기록하였다. 각성, NREM 및 REM 수면의 시간량을 프로페셔널 동물 수면 분석 소프트웨어인 SleepSign Ver. 3 software (Kissei Comtec, Nagano, Japan)를 사용하여 10초 epoch에서의 디지털 데이터로부터 결정하였다. 소프트웨어는 고-주파 저-진폭 EEG로서 각성을 구분하였으며, NREM은 EEG에서의 서파 사이에 위치한 스핀들의 존재를 근거로 하여 점수를 매겼다. REM 동안의 EEG 파워는 저주파 δ-파(0.75- 4 Hz)에서 상당히 감소하고 θ-파 활성(5.0-9.0 Hz, 7.5 Hz에서 피크)의 범위에서 증가하였다.
결과는 도 2에 나타냈으며, 고삼(800 mg/kg) 처리 군에서는 각성 시간이 상당히 감소하였으며 NREM 시간이 증가하였다[F(2,17)=4.810, p<0.05 및 F(2,17)=4,467, p<0.05, 도 2의 (A) 및 (C)]. REM 수면에서의 유의미한 변화는 관찰되지 않았으나, 약간의 증가가 투여량-의존적 방식으로 관찰되었다[F(2,17)=0.556, p=0.585, 도2.(B)]. 마트린(30mg/kg) 처리 그룹에서는 각성 시간이 상당히 감소하였으며[F(2,17)=2.885, p<0.05, 도 2의 (D)] REM 및 NREM 수면에서의 증가 경향이 관찰되었다[F(2,17)=0.591, p=0.566 and F(2,17)=2.316, p=0.133, 도 2의 (E) 및 (F)].
실시예 4. 세로토닌(5-HT) 수준의 측정
EEG 기록 후, 동물을 펜토바르비탈나트륨(80 mg/kg, administered i.p.)으로 깊이 마취시키고 뇌를 즉시 제거하여 설치류 뇌 매트릭스(ASI instruments Inc., MI, U.S.A.)를 사용해 관상(coronally) 절개하였다. 뇌의 피질 및 VLPO 영역을 콜드 플레이트 상에 도려내고 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 수득된 조직을 균질화시키고 얼음으로 차갑게 한 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Korea)과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후 원심분리하였다(4℃에서 5분 동안 10,000g). 상청액을 깨끗한 튜브로 옮기고 이중 분취량의 5-HT 농도를 제조업자(Labor Diagnostika Nord, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 지침에 따라 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 키트로 평가하였다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 고삼 및 마트린 둘 다 뇌의 피질 영역에서 상당히 증가된 5-HT 수준을 보였다[F(2,11)=5.999, p<0.05 및 F(2,15)=10.616, p<0.01, 각각 도 3의 (A) 및 (B)]. 그러나, VLPO 영역에서, 고삼-처리 그룹만이 상당히 증가된 5-HT 농도를 나타낸 반면[F(2,11)=9.617, p<0.01, 도 3의 (C)], 마트린-처리 그룹은 투여량 의존 방식으로 5-HT 수준의 증가 경향을 보였다[F(2.10)=4.438, p=0.05, 도 3의 (D)].
실시예 5. c-Fos 면역조직화학
고삼 또는 마트린을 투여하고 24시간 후에, 모든 랫을 펜토바르비탈나트륨(80 mg/kg, i.p.)으로 깊이 마취시켰다. 포름알데히드의 4% 용액(Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA)으로 경심 관류(transcardial perfusion)시킨 후 뇌를 제거하고, 그 후 24시간 동안 동일한 고정액으로 후-고정시키고, 72시간 동안 20% 수크로스를 함유하는 PBS 내에 위치시켰다. cryostat microtome(CM1850UV, Leica Microsystems Inc., Wetzlar, Germany)을 이용하여 30 μm 두께의 연속적인 관상 절개로 절단하였다. 절단물을 -20℃에서 보관하고 이들 슬라이스를 자유-부유 절단물으로서 조직화학적으로 처리하였다. 뇌 절단물을 0.2% Triton X-100를 함유하는 PBS (PBST)로 3회 세척하였다. c-fos에 대항하는 일차 토끼 모노클로날 항체(10%v/v 일반 염소 혈청과 함께 PBST 내에서 1:2000으로 희석됨, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Texas, USA)를 사용하였으며 절단물을 일정하게 교반하면서 4℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후, 절단물을 2%v/v 일반 염소 혈청을 갖는 PBST 내에서 1:2000으로 희석된 비오틴화 염소 항-토끼(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 절단물을 실온에서 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 시약(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) 내에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 추가 세척한 후, 조직을 디아미노벤즈아딘 퍼옥사다아제 기질 키트(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 사용하여 현상시켰다. 절단물을 슬라이드에 올리고 공기건조시킨 후 현미경 관찰을 위해 커버 글래스로 덮었다. VLPO에서의 면역양성 뉴런의 수(AP, bremga로부터 0.00 내지 -0.36)를 Paxinos & Watson에 따라 100 x 100 μm를 측정하는 microscope rectangle grid를 사용하여 200x 배율로 계수하였다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, VLPO에서의 c-Fos 면역반응성 뉴런이 고삼 및 마트린 처리 그룹에서 더 높았다[F(4,28)=4.243, p<0.05]. 특히, 고삼 400mg/kg 및 고삼 800mg/kg 그룹에서 상당한 증가를 보였으며(p<0.05), 마트린 그룹은 VLPO에서 c-Fos 발현이 증가하는 경향을 보였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 고삼 추출물 또는 마트린(matrine)을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면 유도용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 조합들로 추출한 것인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 고삼 추출물은 10 ~ 1000 mg/ml의 농도인 것인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 마트린은 10 ~ 500 mg/ml의 농도인 것인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 카페인에 대한 진정 효과를 갖는 것인 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌에서의 5-HT 수준 및 c-Fos 발현 수준을 증가시키는 것인 조성물
  7. 고삼 추출물 또는 마트린(matrine)을 유효성분으로 포함하는 진정 또는 수면 개선용 건강기능성 식품.
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