JP5898197B2 - 多孔質フルオロポリマー支持体上に固定化された酵素触媒 - Google Patents
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Description
酵素触媒は産業プロセスにおける化学的転換に有用である。酵素触媒の利点としては、比較的低温での触媒活性、特異な反応および生成物、ならびに高選択性への潜在性が挙げられる。固体支持体上の固定化は酵素を安定化してその触媒寿命を長くする。固定化はまた再使用のための触媒の反応からの除去を容易にする。
本発明のある態様は、少なくとも1つの層を有する多孔質フルオロポリマー支持体、および該支持体に固定化された少なくとも1種の酵素触媒を含む、固定化された触媒であって、該支持体が、膜、フィルム、テープ、繊維、中空繊維、チューブ、ブレイド、およびスポンジからなる群から選択され、該支持体の各層の有効孔サイズが該酵素触媒のサイズよりも大きく、該触媒が、触媒活性を2〜50の再使用について維持する、固定化された触媒に関する。
ある態様に従い、本発明は、多孔質フルオロポリマー支持体(例えば、対称多孔質フルオロポリマー支持体)上に固定化された酵素触媒を含む固定化された触媒に関する。本発明はまた、固定化された触媒を製造および使用する方法に関する。
以下の例から分かるように、膜固定化法で高触媒活性が実現され、触媒活性は複数回の再使用について維持された。加えて、酵素触媒は膜表面から洗剤処理で除去でき、膜は新しい触媒を触媒活性の損失なしで再充填できた。多孔質フルオロポリマー膜(PVDFおよびPTFE)は、試験した膜の、最も高い酵素結合および後続の触媒活性を有した。支持しているまたは支持していない多孔質フルオロポリマー膜の両者はともにより良好な性能であった。
酵素充填:3cm×9cmの膜ストリップを巻いて8ドラムガラスバイアルの底部内側に入れた。ストリップはバイアルの内径の周りに若干重なった。支持された膜で、フルオロポリマー側を内側に配置した。乾燥膜を、1mlのエタノールで予湿潤させ、よく排液した。各膜を10mlの水で洗浄し、少なくとも10分間平衡させ、次いでよく排液した。水はエタノール湿潤膜からエタノールを除去したか、または湿潤状態で供給された膜からの保存液(通常グリセロールを含有する)の除去を助けた。予湿潤およびリンスした膜を次いで10mlの結合液で10分間平衡し、次いで排液した。各バイアルに、別の5mlの結合液を添加し、次いで1mlの酵素原液を添加した。バイアルに蓋をし、二次容器内に固定し、次いで水平に4℃で24時間回転させて酵素液剤を膜の表面上に継続的に分布させた。24時間後、タンパク液をサンプリングして、ブラッドフォードアッセイおよびアルブミン標準カーブを用い、相違(固定化の前後)によってタンパク結合を評価した。過剰の酵素液剤を排液し、膜を適切な洗浄バッファー(10ml)で1回リンスし、次いで排液し、同じ洗浄バッファー(10ml)で少なくとも15分間平衡した。洗浄した膜から過剰流体を排液し、4℃(湿った)で活性アッセイを行うまで保管した。
酵素を支持体に結合させたpHと、タンパク充填膜を洗浄したpHとの両者を変えた。酵素液剤のpHはタンパクの表面電荷に大きな影響を有する可能性があり、これが支持体材料とどのように相互作用するか、およびこれがどのように触媒用の基材と相互作用するか、の両者に影響する可能性がある。我々は、pHがタンパク結合、活性および安定性に影響したこと、および理想的なpH条件は異なる支持体材料の間で変わったことを見出した。
予スクリーニング段階中、フルオロポリマー−固定化酵素触媒の性能が1回以上の使用の後に改善したことが分かり、これらの支持体上の酵素触媒では平衡時間が存在する可能性があることが示唆された。また、エチルヘキシルパルミテート試験反応を70℃で行うことは、標準の60℃に亘って反応速度を改善したことが分かった。例1からの幾つかの膜を追加の活性アッセイに選び、これらの観測を試験した。反応条件および分析は前と全く同じに繰り返した。標準の再使用試験では、全組の膜反応器(全16固定化条件を表す)を、まず60℃、次いで再度70℃で再使用した。経時的な生成物への転化%を表3に纏める。
膜−固定化酵素触媒の提案される利点の1つは、不活性触媒の膜からのストリッピングおよびストリッピングされた膜への酵素触媒(例えば新しい酵素触媒)の再固定化の可能性である。これは、例1からの標準の組を用いて試験した。16の同一の標準膜反応器(Lipozyme CALB LをPVDF−M上に固定化し、結合および洗浄(pH7にて))をランダムに4つの処理組に分けた。第1の組(未処理対照)はそのまま用いた。第2の組(ストリッピングさせた対照)を処理に供して膜から酵素をストリッピングさせた。膜を70℃で撹拌しながら12mlの水中Triton X100 2質量%液でストリッピングさせた。ストリッピングステップは2回、各30分間行った。次いで、ストリッピングさせた膜を12mlの水で再度洗浄し、2回70℃で、次いで2回更に室温で洗浄した。標準の第3の組(水再充填)は記載のようにストリッピングさせ、次いで新しい酵素触媒を標準手順に記載の通り再充填したが、エタノール予湿潤ステップは省略した。標準の最後の組(エタノール再充填)は、新しい酵素触媒を標準手順に準拠して再充填した。エタノール予湿潤ステップを含んだ。膜反応器を次いで、例1でのようなEHP活性アッセイを用いて活性について試験した。
酵素原液(Lipozyme CALB L)を3つの異なるMicrodyne Nadirフルオロポリマー支持体(異なる孔サイズを有する)上に、例1に記載する標準手順を用いて固定化した。各々の場合で、膜の有効孔サイズは酵素触媒のサイズを超えた。固定化が生じる温度を変え、4℃または22℃を用いた。担持された触媒の活性はエチルヘキシルパルミテート反応で評価した(例1で記載した)。活性試験の結果を表6に纏める(nd=データなし)。
酵素原液(Lipozyme CALB L)を5つの異なるフルオロポリマー支持体上に標準手順を用いて固定化した。非緩衝水を結合液として用い、水またはpH4のバッファー(Hydrion)を洗浄液として用いた。24時間固定化は22℃で行った。担持された触媒の活性を、エチルヘキシルパルミテート反応で評価した(例1で記載した)。活性試験の結果を表7に纏める。
酵素原液は、水中で、添加界面活性剤の不存在下または存在下で、Candida antarcticaリパーゼBの凍結乾燥物を再構成することによって形成した。凍結乾燥酵素物は、c− LEcta GmbH, Deutscher Platz 5, 04103 Leipzig, Germanyの製品であり、約2.7質量%のタンパクを含有した(ブラッドフォードアッセイに準拠)。非イオン性界面活性剤Tween 20を任意に酵素原液に10mg/mlで添加した。酵素原液をMillipore Immobilon P (PVDF−M)上に、標準手順を用いて固定化した(非緩衝水を結合液および洗浄液の両者として用いたことを除く)。そして24時間固定を22℃で行った。フルオロポリマー−担持された触媒の活性を、標準エチルヘキシルパルミテート反応を用いて評価した(生体触媒系の再使用を含んだ)。表8は、活性アッセイの結果を纏める。
酵素原液は、水中で、添加界面活性剤の不存在下または存在下で、Thermomyces lanuginosusリパーゼの凍結乾燥物を再構成することによって形成した。凍結乾燥酵素物は、BioCatalyticsの製品であり、約2.5質量%のタンパクを含有した(ブラッドフォードアッセイに準拠)。非イオン性界面活性剤Pluronic L35,L61または10R5を任意に酵素原液に5mg/mlで添加した。酵素原液をMillipore Immobilon P(PVDF−M)上に、標準手順を用いて固定化した(非緩衝水を結合液および洗浄液の両者として用いたことを除く)。そして24時間固定を4℃で行った。フルオロポリマー−担持された触媒の活性を、標準エチルヘキシルパルミテート反応を用いて評価した(生体触媒系の再使用を含んだ)。表9は、活性アッセイの結果を纏める。
酵素原液(Novozyme 735、Candida antarcticaリパーゼAの液剤)をMicrodyne Nadirフルオロポリマー支持体(UV150およびUV200)上に、標準手順を用いて固定化した(酵素原液の体積が0.25mlであったことを除く)。非緩衝水を結合液および洗浄液として用いた。24時間固定を22℃で行った。フルオロポリマー−担持された触媒の活性を、標準リパーゼ反応を用いて評価した(生体触媒系の再使用を含んだ)。表10は、活性アッセイの結果を纏める。
酵素原液(Novozyme 735、Candida antarcticaリパーゼAの液剤)をMillipore Immobilon P(PVDF−M)上に、標準手順を用いて固定化した(酵素原液の体積を変えたことを除く)。非緩衝水を結合液として用い、水またはpH4(Hydrion)のいずれかを洗浄液として用いた。24時間固定を22℃で行った。フルオロポリマー−担持された触媒の活性を、標準エチルヘキシルパルミテート反応を用いて評価した(生体触媒系の再使用を含んだ)。表11は、活性アッセイの結果を纏める。
Claims (14)
- 少なくとも1つの層を有する多孔質フルオロポリマー支持体、および、非共有結合によって該支持体に固定化された少なくとも1種の酵素触媒を含む、固定化された触媒であって、
該支持体が、膜、フィルム、テープ、繊維、中空繊維、チューブ、ブレイド、およびスポンジからなる群から選択され、
該支持体の各層の有効孔サイズが該酵素触媒のサイズよりも大きく、
該触媒が、触媒活性を2〜50の再使用について維持し、
該触媒が、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ、脱水酵素、カタラーゼ、水酸化酵素、ニトリラーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、固定化された触媒。 - 多孔質フルオロポリマー膜、および非共有結合によって支持体に固定化された少なくとも1種の酵素触媒を含む、固定化された触媒であって、
該酵素触媒が該膜の両表面上に固定化されており、
該膜の各層の有効孔サイズが該酵素触媒のサイズよりも大きく、
該触媒が、触媒活性を2〜50の再使用について維持し、
該触媒が、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ、脱水酵素、カタラーゼ、水酸化酵素、ニトリラーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、固定化された触媒。 - 該触媒が、単離酵素または酵素混合物の形である、請求項1または2に記載の触媒。
- 請求項1に記載の固定化された触媒を含む、反応器。
- カートリッジを含む、請求項4に記載の反応器。
- 該膜が、対称、疎水性、および/または単層である、請求項2に記載の触媒。
- 請求項2に記載の固定化された触媒を含む、カートリッジ。
- 請求項7に記載のカートリッジを含む、反応器。
- 固定化された触媒の製造方法であって、
少なくとも1種の酵素触媒および支持体を接触させることを含み、
該支持体が、少なくとも1つの層を有し、膜、フィルム、テープ、繊維、中空繊維、チューブ、ブレイド、およびスポンジからなる群から選択され、
該支持体の各層の有効孔サイズが該触媒のサイズよりも大きく、
該触媒が、非共有結合によって該支持体に固定化されており、
該触媒が、触媒活性を2〜50の再使用について維持し、
該触媒が、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ、脱水酵素、カタラーゼ、水酸化酵素、ニトリラーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、方法。 - 触媒をフルオロポリマー支持体からストリッピングして該支持体に結合した任意の触媒を除去すること、および
該フルオロポリマー支持体を少なくとも1種の酵素触媒と接触させること
を更に含む、請求項9に記載の方法。 - 支持体を、水、アルコール、ポリオール、およびこれらの組合せからなる群から選択される予湿潤剤で予湿潤させることを更に含む、請求項9に記載の方法。
- 支持体を触媒と接触させる前に予湿潤剤を支持体から除去する、請求項11に記載の方法。
- 化学物質の製造方法であって、
少なくとも1種の反応物質を、少なくとも1種の固定化された酵素触媒と接触させて化学物質を生成することを含み、
該酵素触媒が多孔質フルオロポリマー支持体上に非共有結合によって固定化されており、
該支持体が少なくとも1つの層を有し、膜、フィルム、テープ、繊維、中空繊維、チューブ、ブレイド、およびスポンジからなる群から選択され、
該支持体の各層の有効孔サイズが該酵素触媒のサイズよりも大きく、
該触媒が、触媒活性を2〜50の再使用について維持し、
該触媒が、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ、脱水酵素、カタラーゼ、水酸化酵素、ニトリラーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、方法。 - 該触媒が、単離酵素、酵素混合物、細胞抽出物、または全細胞の形である、請求項9または13に記載の方法。
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