JP5865382B2 - 歯牙骨移植材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、抜去歯や骨のような人体硬組織を用いて骨移植材を製造する方法に関するものであって、特に、同じ又は同種の自身の抜去歯を用いた骨移植材の製造方法及びそれにより製造された骨移植材に関する。

整形外科及び歯科領域において骨移植材は、自身の骨、同種骨（他人の骨）、異種骨（主に、牛骨）、合成骨（カルシウム複合体）などがある。これらの中で細胞、有無機質及びタンパク質が含まれた自身の骨が最も良い移植材であるが、新たな傷を作るという短所がある。

同種骨は、免疫反応が少しあるため、抗原性を減らすために冷凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）または凍結−乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）を行わなければならず、主に骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＢＭＰ」と略称する）及びコラーゲンを用いるカルシウムをとり除いた脱灰骨の方が、非脱灰骨より臨床結果が良いと知られている。

異種骨は、免疫反応が高いため、有機質をとり除いた無機質（カルシウム複合体）のみを使用し、骨再生能力においては自身の骨や同種骨に比べて低い。また、狂牛病の危険があるため、一部では合成カルシウム複合体である合成骨を使う。

骨移植材が早い骨形成を見せるためには、新生血管が早く形成され、細胞が増殖されることができる環境を提供しなければならないので、自身の骨や同種骨からカルシウムをとり除くことが重要な過程である。

歯牙が骨移植材料として使用されることができるというのは、従来の研究から明かになってきたが、動物実験の水準にとどまっていた。

歯牙を骨移植材料として適用するための従来技術では、韓国特許公開第２０１０−０４０４２７号に記載の発明が挙げられるが、ここではインプラント手術が求められる患者の歯牙を取り出し、これをパウダーに粉砕した後、粉砕された歯牙を洗浄し、洗浄された歯牙を脱水、脱脂及び脱灰し、凍結乾燥した上でその歯牙を患者のインプラントが手術される歯槽骨に適用して、歯槽骨にインプラント手術する方法で自身の歯牙を移植材として適用する方法が記載されている。

このような方法によれば、患者の歯牙の抜去歯を用いて骨移植材に製造して活用するまでに１０日以上がかかるという問題がある。

本発明は、抜去歯や骨のような人体硬組織を処理して骨移植材に製造するための所要時間を画期的に縮めることができる骨移植材の製造方法及びそれにより製造された骨移植材を提供しようとする。

また、本発明は、抜去歯を別の移管措置を行わずに現場内で移植材への製造が可能な骨移植材の製造方法及びそれにより製造された骨移植材を提供しようとする。

本発明の技術的課題は上述に限らず、言及されていない他の技術的課題は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、以下に示す課題を解決するための手段によって明確に理解することができる。

上記課題を達成するための本発明の一実施形態では、抜去歯及び骨から選択される少なくとも１種の人体硬組織に、少なくとも１段階の化学的試薬処理の段階を実施して骨移植材を製造する方法であって、化学的試薬処理の段階は、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理を含む超音波処理を伴う方法を提供する。

本発明の望ましい一実施形態では、脱灰の効率と組職の破壊発生を防止することができるという側面において、超音波処理が超音波周波数１５ｋＨｚ乃至４０ｋＨｚの範囲で行われる。

本発明の望ましい一実施形態では、人体硬組織の外部及び内部での効果的な脱灰を考えるとき、真空超音波処理が１０ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）乃至７００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の範囲の真空で行われる。より望ましくは、真空超音波処理が１００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）乃至６００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の範囲の真空で行われる。

本発明の望ましい一実施形態では、超音波の強さと真空を効率的に組み合わせて脱灰効果を極大化させるという側面において、超音波処理は、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理、減圧を伴わずに超音波を照射する非真空超音波処理及び減圧下で超音波を照射する真空超音波処理を順次に行うことができる。

本発明の望ましい一実施形態によれば、化学的試薬処理の段階は、温度範囲が常温乃至６０℃の条件下で行われる。

本発明の望ましい一実施形態によれば、化学的試薬処理の段階の他に、洗浄のための目的ではない蒸溜水処理の段階を含み、蒸溜水処理の段階は超音波処理を伴う方法を提供する。

本発明の具体的な一実施形態において、抜去歯の脱灰を考えるとき、抜去歯の軟組織及び歯髄を取り除き、洗浄する段階（段階Ｓ１）；段階Ｓ１を経た歯牙の歯冠と歯根を分離し、分離された歯冠及び歯根に少なくとも一つの穴を形成する段階（段階Ｓ２）；段階Ｓ２を経た歯牙を洗浄する段階（段階Ｓ３）；段階Ｓ３を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩酸溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する段階（段階Ｓ４）;を含むことができる。また、段階Ｓ４を経た歯牙を、超音波処理を伴うプロテアーゼ阻害剤が含まれるＰＢＳ溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する段階（段階Ｓ５）；段階Ｓ５を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化カルシウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する段階（段階Ｓ６）；段階Ｓ６を経た歯牙を、超音波処理を伴うＥＤＴＡ溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する段階（段階Ｓ７）;を含む方法を提供し、さらにコラーゲンをゼラチン化する場合であれば、段階Ｓ７を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化リチウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する段階（段階Ｓ８）；段階Ｓ８を経た歯牙を、超音波処理を伴う蒸溜水中に浸漬する段階（段階Ｓ９）をさらに含むこともできる。加工された歯牙は、冷凍保存するか、または凍結乾燥して室温で保管することができ、必要によってＥＯガス滅菌を行うことができる。

本発明の一実施形態により抜去歯を用いて、別の移管措置を行わずに現場内で直接的に骨移植材を製造することができ、一実施形態による骨移植材の製造方法において、抜去歯は、滅菌された生理食塩水、蒸溜水またはエタノールに浸漬して冷蔵、または浸漬溶液を除去した後、冷凍保存されたものであることができる。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法における段階Ｓ４での浸漬は、骨形成に係るタンパク質などを保存するための点を考えるとき、常温乃至６０℃の温度範囲で６０分乃至７５分間行われることが望ましい。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法において、骨形成に係るタンパク質などを保存し、不要なタンパク質をとり除くための点を考えるとき、段階Ｓ５、段階Ｓ６、段階Ｓ７及び段階Ｓ８での浸漬は、常温乃至６０℃の温度範囲で５乃至１０分間行われることが望ましい。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法において、骨形成に係るタンパク質などを保存するための点を考えるとき、段階Ｓ５及び段階Ｓ７での浸漬は、ｐＨ７乃至ｐＨ８の条件下で行われることができる。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法において、骨形成に係るタンパク質などを保存し、迅速に無機成分をとり除くための点を考えるとき、段階Ｓ４での塩酸溶液は、濃度が０.５Ｎ乃至２Ｎの範囲であることが望ましい。より望ましくは、段階Ｓ４での塩酸溶液は、濃度が０.５Ｎ乃至０.６Ｎの範囲であることが望ましい。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法は、抜去歯を用いて、別の移管措置なしに現場内で行われることができる。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法は、保管を必要とする場合、段階Ｓ９を経た歯牙を滅菌状態で冷凍保存する段階を含むことができる。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法は、保管を必要とする場合、段階Ｓ９を経た歯牙を滅菌状態で冷凍保存する段階後または製造して直ちに凍結乾燥して室温で保管することができ、この場合、必要によって付加的な滅菌のためにＥＯガス滅菌をさらに行うこともできる。

また、上記から選ばれたいずれか一つの製造方法により得られる骨移植材を提供することを特徴とする。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法は、抜去歯などの人体硬組織を化学的試薬処理して骨移植材で適宜製造することにおいて、真空超音波処理を含む超音波処理を伴うことにより、試薬処理の時間を画期的に縮めることができ、また抜かれた歯を別の移管措置を行わずに現場内で処理することができるので、抜去歯を用いて少なくとも２時間以内に移植材として活用可能である。

上述のように、本発明は、抜去歯や骨のような人体硬組織を処理して骨移植材に製造することにかかる所要時間を画期的に縮めることができ、抜去歯を別の移管措置を行わずに現場内で移植材への製造が可能であるというメリットがある。

本発明の一実施形態により減圧下で超音波を照射する超音波処理を伴って、化学的処理を行った人体硬組織の電子顕微鏡写真。 減圧しない状態で超音波を照射する超音波処理を伴って、化学的処理を行った人体硬組織の電子顕微鏡写真。 本発明の一実施形態によって処理された歯牙移植材のウエスタンブロットの結果を示した写真。 本発明の一実施形態によって処理された歯牙移植材のＳＥＭの結果を示した写真。 本発明の一実施形態によって処理された歯牙移植材をＸＲＤ分析した結果を示した写真。 本発明の骨移植材の製造過程のうち、段階Ｓ１〜Ｓ３の間で保存溶液により、処理前の細菌培養結果と処理後の細菌培養結果に関する写真。

Ａ：エタノールに保存して処理を始めた場合、エタノールにより処理前にも滅菌状態であり、処理後にも滅菌状態であることを確認
Ｂ：生理食塩水に保存して処理を始めた場合、処理前には滅菌状態ではないが、処理後には滅菌状態であることを確認
Ｃ：生理食塩水に保存して処理を始めた場合、処理前には滅菌状態ではないが、処理後には滅菌状態であることを確認

以下、本発明をより詳しく説明する。

本発明は、骨移植材及びその製造方法に関するものであって、特に自身の歯牙や骨のような人体硬組織を用いて骨移植材に製造する方法に関する。これは当然、同種歯牙及び同種骨移植材の加工時にも適用されることができる。

また、人体硬組織は、硬組織の病理的所見により摘出された骨組職を含む。

下記では、特に人体硬組織の中でも歯牙を中心に記載するが、これが歯牙のみに限られるものではない。

歯槽骨移植材は、歯槽骨の特性上、咀嚼圧に耐える骨で置換（Ｂｏｎｅ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）されなければならない。歯牙の構成成分のうち、有機物は歯槽骨のような第１タイプコラーゲン（Ｔｙｐｅ １ Ｃｏｌｌａｇｅｎ）であり、無機物は骨の置換（Ｂｏｎｅ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）過程の因子で構成されている。

本発明は、このように歯槽骨と構成成分が同一な捨てられる歯牙を用いて歯槽骨治療のための移植材に作る方法に関する。

上記及び以下の記載で、「捨てられる歯牙」または「抜去歯」は、神経治療や補綴治療された歯牙、または虫歯のある歯牙をいずれも含み、これは自身の歯牙や同種歯牙を全て含むものとする。

本発明の骨移植材の製造方法は、抜去歯を用いて、化学的試薬処理を通じて骨移植材に製造する方法であって、化学的試薬処理とは、多様な目的、一例として抜去歯の脱脂、脱灰、抜かれた歯からの多様な成分の抽出など、骨移植材化のための全ての過程を含み、これは少なくとも１段階の化学的試薬処理の段階を含む。

本発明では、化学的試薬処理が、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理を含む超音波処理を伴って、化学的試薬処理の効率を著しく高めることにより、全体処理時間を画期的に縮めることができる。

超音波処理において、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理の場合は、超音波周波数の他に、真空程度によりキャビテーション現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を制御することで、溶液中の試料、本発明では抜去歯などの人体硬組織の表面に付けられている気泡の除去及び試料内部の奥深い所までの浸透を誘導することができる。

真空超音波処理が歯牙の化学的試薬処理で発揮する機作を明確には説明し難しいが、予測してみると、与えられた超音波周波数（超音波の強さ）の範囲で真空超音波処理を伴う化学的試薬処理を行う場合、減圧のスタート段階では、キャビテーションの相対的な大きさが大きい状態で破壊力が強いため、歯牙表面の象牙質カルシウム成分をとり除き始め、一定圧力の以下に減圧される場合（低圧の場合）、すなわち真空度が一定範囲内にある場合であれば、試料内の微細空気のような超音波の伝達を邪魔する要素においては、負圧を通じてとり除くことができ、キャビテーションの相対的な大きさが最小化され、破壊力は弱いが、除去された象牙質の中にキャビテ（ｃａｖｉｔｙ）が浸透されて目的とする化学的処理が行われる。

真空が大きくなるほどキャビテーションの相対的な大きさは減り、一定真空以上に減圧される場合は、キャビテーションの大きさに及ぶ影響が大きく変わらない。

このような点を考えるとき、真空超音波処理時、１０ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）乃至７００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の範囲の真空が望ましい。より望ましくは、１００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）乃至６００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の真空が望ましい。真空が弱すぎると、真空の効果が相対的に貧弱であるため、本発明で追求する結果がかなり遅く発現されるという問題点がある。

上記及び以下において、「真空超音波処理を含む超音波処理」とは、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理の以外に、他の超音波処理方法まで全て含むものとする。

本発明の望ましい一実施形態において、超音波処理は、周波数範囲１５ｋＨｚ乃至４０ｋＨｚの内で行われることが、化学的試薬処理の効率を極大化しつつもそれによる組職の破壊を防止することができる側面で望ましい。より望ましくは、２０ｋＨｚ乃至４０ｋＨｚの範囲内で行う。一例として、周波数が大きくなる場合は、超音波の強さが弱くて試薬処理の効率を満たしにくく、周波数が小さい場合は、超音波の強さが大きくなって試薬処理の効率を満たす一方、組職の破壊が発生する余地がある。

本発明において、最も望ましい超音波処理は、真空超音波処理と非真空超音波処理が並行されることができる。ここで、非真空超音波処理とは、減圧を伴わない超音波処理であることが理解できる。具体的には真空超音波処理、非真空超音波処理及び真空超音波処理が順次に行われることが望ましい。

一例として、化学的試薬処理のとき、一定超音波周波数内で減圧を始めると、すなわち真空超音波処理を行うと、超音波の浸透を邪魔する歯牙と骨組職中の微細空間（象牙細管、Ｖｏｌｋｍａｎ’ｓ ｃａｎａｌ）内の空気をとり除き、以後、減圧の解除によって非真空状態で超音波処理を行うと、キャビテーションはまた最大化されて硬組織表面での意図する化学的試薬処理を促進することができる。また一定時間後に再減圧すると、すなわち真空超音波処理を行うと、超音波の伝達を邪魔する微細空気などをとり除き、キャビテーションはまた最小化されて超音波の浸透力が増加されるため、硬組織内部の化学的処理効果を促進し、化学的処理が生じた部位の破壊を最小化することになる。

真空超音波処理／非真空超音波処理／真空超音波処理の時間的な分配は、超音波の強さと試料の状態などにより変わることができる。

化学的試薬処理時の超音波の処理において、減圧の有無による効果を確認するために、それぞれ初期重量が異なる人体硬組織を用いて真空超音波処理（超音波周波数２０ｋＨｚで６００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の真空をかける）を伴う塩酸溶液（０.６Ｎ濃度）５０乃至２００ｍｌの中に６０分間浸漬した場合と、真空をかけずに超音波周波数２０ｋＨｚ条件で超音波処理して同一条件で試薬処理した場合の硬組織の重量変化を測定して化学的試薬処理の効果を確認した結果、下表１及び２のような結果を得ることができた。提示された実験資料は、０.６Ｎ濃度の塩酸溶液を使用しており、また本発明の望ましい塩酸溶液の濃度範囲でも類似した結果が得られることを確認した。また、対照群として、韓国特許公開第２０１０−０４０４２７号に記載した既存の方法で化学的試薬処理後に重量変化を観察して表３の結果を得た。

重量は、該当時間に組職を取り出して蒸溜水で洗浄した後、乾いたガーゼで表面の水気をとり除く方法で乾燥した上で、その重量を１／１００ｇ単位の秤（モデル名：ＭＷＰ、（株）ＣＡＳ製）を用いて測定した。

重量減少率は、下式１に基づいて算出した。
＜式１＞
重量減少率（％）＝（試料の初期重量−該当時間経過後の試料の重量）／初期重量×１００
重量減少率は、間接的に塩酸溶液で処理して所望の目的を達成した化学的試薬処理の効率を示す。

上記表１から分かるように、超音波と真空を同時に行った場合は６０分経過時に４０％以上の無機質減少を確認することができ、上記表２から分かるように、真空をかけずに超音波のみを行った場合は約３０％台の無機質減少だけとなり、上記表３から分かるように、超音波及び真空をいずれも使わない場合は４０％台まで無機質が減少するために最小４８時間以上の時間経過が必要である。上述した本発明の望ましい超音波範囲と、望ましい真空（負圧）範囲の多様な値を選択した場合でも上表１から表３と類似している結果が実験的に得られた。

結局、本発明の製造方法と従来の加工方法を使って、脱灰時、初期歯牙の重みの約４０％以上除去される時間が、本発明の場合は約６０〜７０分であり、従来の場合は約４８時間以上かかることが確認された。

表１の結果から、真空超音波処理を伴った化学的試薬処理と非真空超音波処理を伴った化学的試薬処理の場合、超音波と真空を全て使って製造した試料１を６０分間化学的処理した結果物を電子顕微鏡（ＬＥＯ１５３０、ＣＡＬ ＺＥＩＳＳ−ＮＯＲＡＮ ＴＨＥＲＭＯＦＩＸＨＥＲ社製）で観察してその結果を図１に示し、超音波のみを使って製造した試料１を６０分間化学的処理した結果物に対する電子顕微鏡写真を図２に示した。

本発明の目的のうち一つが別の移管措置なしに現場内で化学的試薬処理を早く行うためであるが、このような点を考えると、主な化学的試薬処理は１時間程度がかかり、また化学的試薬処理の効率が４０％以上となることが望ましい。

結果的に、減圧下で超音波を照射する真空超音波処理は、骨移植材を製造するための試料の化学的試薬処理で効果的に作用することが分かる。

当然、化学的試薬処理のみならず、洗浄工程ではない蒸溜水処理工程でも同様に超音波処理を伴うことで、全体処理時間を画期的に縮めることができる。

このように抜かれた歯から骨移植材に製造することにおいて、超音波処理を伴う化学的試薬処理を行う場合、抜かれた歯を処理することにかかる時間が最大２時間程度、望ましくは１.５時間程度なので、抜去歯を別の移管措置なしに現場内で処理することができる。

本発明の一実施形態によれば、化学的試薬処理時に超音波処理とともに化学的試薬処理に使われる試薬の特性を考えて適正温度に昇温させると、工程処理効率をさらに向上させることができる。ここで、適正温度の一例としては常温乃至６０℃範囲であることが望ましい。ここでの昇温は超音波処理に起因する自然的昇温を含むことは言うまでもない。

本発明の一実施形態による骨移植材の製造方法をより具体的に説明すると、まず、抜かれた歯の軟組織及び歯髄をとり除き、洗浄する（段階Ｓ１）。

上述のように本発明の方法によれば、自身の歯牙を用いて短時間内に化学的処理を通じて移植材へ製造することが可能であるため、抜去歯は滅菌された生理食塩水、蒸溜水またはエタノールに浸清した状態のものであれば十分である。

抜去歯を用いて専門加工業社に処理を要請すると、抜歯後に保管及び運送のために抜去歯を冷蔵または冷凍保存する過程が必要となるが、本発明ではこのような過程を略することができる。もし、患者の移植手術が延期されることが生ずると、抜歯された状態、抜歯後に軟組織と歯髄をとり除き、歯冠と歯根を分離して穴を形成した状態または処理を施行した状態など、どのような過程でも冷蔵または冷凍保存することができる。

段階Ｓ１において、軟組織及び歯髄の除去のためには、３乃至７％濃度（ｗ/ｗ）の過酸化水素水溶液またはエタノールを使うことができ、物理的撹拌を並行してその効率を向上させることも考えられる。

次に、段階Ｓ１を経た歯牙の歯冠と歯根を分離し、分離された歯冠及び歯根にいくつかの小さい穴を形成する（段階Ｓ２）。

歯冠及び歯根の分離時に、歯根が厚い場合は縦分離または所望の形態への横分離など、分離の形態には特に限られてはいない。

歯冠及び歯根に穴を形成することは、短時間内の試薬透過効果を上げながら新生血管の浸透を容易にできる効率を高めることができるからである。

歯冠及び歯根に穴を形成する方法には、特に限られてはおらず、一例として高速切削器具（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｂｕｒ）などを用いることができ、穴の数も特に制限はないが、歯牙の形態を維持しながら試薬透過効果などを高めることを考えると、歯牙面積１ｃｍ^２当たり１０乃至１６個の穴を形成することが望ましい。

次に、段階Ｓ２を経た歯牙を洗浄する（段階Ｓ３）。

洗浄には生理食塩水または蒸溜水を用いることができ、超音波浴槽を使うこともできる。また、洗浄には過酸化水素を用いることもできる。

本発明によれば、上記段階Ｓ１から段階Ｓ３までの過程を経るための所要時間は１５分以内なら十分である。このように所要時間を減らすことができるのは、後続される化学的試薬処理にかかる時間を画期的に縮めることができるため、現場内で上述の段階を行うことができるからである。

次に、段階Ｓ３を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩酸溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する（段階Ｓ４）。

段階Ｓ４は、抜去歯の無機質をとり除き、酸溶解タンパク質を抽出するための過程であって、抜かれた歯の無機質や酸溶解タンパク質は骨誘導のための様々なタンパク質の活性化を遅延させ、初期骨形成の段階で重要な新生血管化を阻害するので、とり除くか、抽出しなければならない。

このとき、塩酸溶液の濃度は０.５Ｎ乃至２Ｎの範囲のものが使われることができ、また、０.５Ｎ乃至０.６Ｎの範囲の濃度が、様々なタンパク質などの有効有機質を保存しながら無機質をとり除くことができる側面からより望ましい。塩酸の濃度が濃すぎる場合は、脱灰の速度が増加されるが、有機質の損傷がひどいため、移植材への機能が低下される結果をもたらす。超音波処理を伴うと共に昇温して常温乃至６０℃の範囲で行うことが様々なタンパク質の変性を防止する側面から望ましく、処理時間は６０分乃至７５分程度なら十分である。

一方、歯冠の場合は、無機質成分が約９５％であり、塩酸溶液中での浸漬時間を調整することで、残存無機質量を調節することが可能であるところ、もし抜去歯を、無機質を含み、物理的吸水性を遅延させるための移植材として使おうとする場合であれば、塩酸溶液中での浸漬時間を約３０分内外に調整することもできる。この場合、無機質を含有した移植材でも使うことができるため、臨床的に多様に使われることができる。

塩酸溶液の量は、抜かれた歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり５０乃至１００ｍｌの体積となる量で使うことができる。

上記のように、超音波処理を伴う酸溶液で処理した後、引き上げて洗浄するが、洗浄は蒸溜水を用いて行われることができる。

上記のような段階Ｓ１乃至Ｓ４を経ることで歯牙の脱灰は完了することができる。

本段階で上述のような真空超音波処理、非真空超音波処理を繰り返して行う場合であれば、減圧（真空開始、ｖａｃｕｕｍ−ｏｎ）と、以後大気圧（真空終了、ｖａｃｕｕｍ−ｏｆｆ）の周期で一定時間の間に繰り返して行うと、脱灰効果を最大化させることができる。

次に、段階Ｓ４を経た歯牙を、超音波処理を伴うプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ（リン酸緩衝液）中に浸漬し、引き上げて洗浄する（段階Ｓ５）。

段階Ｓ５は、抜去歯（歯冠）の非コラーゲン性タンパク因子（ＮＣＰｓ；ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＥＸ：ＤＭＰ（ｄｅｎｔｉｎ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＳＰ（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｉｎ）などを保存するための処理段階であって、様々なタンパク質は化学的処理の段階中に除去されるか、減少されなくて維持されて、移植材に製造された時も保存されないと移植材としての機能を発揮することができない。

このとき、リン酸緩衝溶液は、いろいろな酵素をとり除いて様々なタンパク質を保存するために、ヨード酢酸とアジ化ナトリウムが含まれた状態でｐＨが７乃至８程度、より望ましくはｐＨ７.４程度に調節されたものである。

超音波処理を伴うと共に昇温して常温乃至６０℃の温度範囲で行うことが望ましく、処理時間は５分乃至１０分程度なら十分である。

リン酸緩衝溶液の量は、抜去歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり１０乃至２０ｍｌの体積となる量で使うことができる。

超音波処理を伴うリン酸緩衝溶液で処理した後、引き上げて洗浄するが、洗浄は蒸溜水を用いて行うことができる。

次に、段階Ｓ５を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化カルシウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する（段階Ｓ６）。

段階Ｓ６は、抜去歯（歯冠）中の低分子量プロテオグリカン類（ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）を抽出する段階であり、このとき、塩化カルシウム溶液は濃度が１.５乃至２.５Ｍであることが望ましい。プロテオグリカン類を抽出するためには塩化カルシウム溶液の以外に、塩化リチウム溶液、塩化グアニジン溶液（４乃至５Ｍ）またはウレア（６乃至８Ｍ）などを使うこともできる。その他に、塩化カリウム溶液などを考えることもできる。

超音波処理を伴うと共に昇温して常温乃至６０℃の温度範囲で行うことが望ましく、処理時間は５分乃至１０分程度なら十分である。

塩化カルシウム溶液の量は、抜去歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり１０乃至２０ｍｌの体積となる量で使うことができる。

超音波処理を伴う塩化カルシウム溶液で処理した後、引き上げて洗浄するが、洗浄は蒸溜水を用いて行われることができる。

次に、段階Ｓ６を経た歯牙を、超音波処理を伴うＥＤＴＡ溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する（段階Ｓ７）。

段階Ｓ７のＥＤＴＡ溶液は、ｐＨが７乃至８程度、より望ましくはｐＨ７.４程度に調節されたものが望ましい。

超音波処理を伴うと共に昇温して常温乃至６０℃の温度範囲で行うことが望ましく、処理時間は５分乃至１０分程度なら十分である。

ＥＤＴＡ溶液の量は、抜去歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり１０乃至２０ｍｌの体積となる量で使うことができる。

超音波処理を伴うＥＤＴＡ溶液で処理した後、引き上げて洗浄するが、洗浄は蒸溜水を用いて行うことができる。

更に、コラーゲンをゼラチン化しようとする場合であれば、段階Ｓ７を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化リチウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する（段階Ｓ８）。

段階Ｓ８は、ゼラチン化する段階であって、具体的にはコラーゲンフィブリルを収縮させ、歯牙のコラーゲンをゼラチンに変えるための段階である。

このとき、塩化リチウム溶液は、その濃度が７乃至９Ｍ程度に調節されたものが望ましい。

超音波処理を伴うと共に昇温して常温乃至６０℃の温度範囲で行うことが望ましく、処理時間は５分乃至１０分程度なら十分である。

塩化リチウム溶液の量は、抜去歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり１０乃至２０ｍｌの体積となる量で使うことができる。

超音波処理を伴う塩化リチウム溶液で処理した後、引き上げて洗浄するが、洗浄は蒸溜水を用いて行うことができる。

段階Ｓ８を経た歯牙を、超音波処理を伴う蒸溜水中に浸漬する（段階Ｓ９）。

段階Ｓ９は水溶性コラーゲンを抽出する段階であり、このとき、超音波処理を伴う蒸溜水中に少なくとも２回繰り返して浸漬することが、抽出効率を高めることができるという点で望ましい。

蒸溜水の量は、抜去歯が浸漬されることができる程度の量であれば、それに限定はなく、望ましくは容器の大きさを考えて歯牙一つ当たり５０乃至２０００ｍｌの体積となる量で使うことができる。

上述の段階中で段階Ｓ８と段階Ｓ９の場合は歯牙のコラーゲンをゼラチン化させようとする段階であって、もし歯牙固有のコラーゲンを用いようとする場合であれば、該当の段階を略することができる。

上述の全過程において化学的試薬処理に使われる試薬は、当然、滅菌過程を経たものである。

加工された歯牙は、冷凍保存するか、または凍結乾燥して室温で保管することができ、凍結乾燥した場合、密封状態により長期間保管することができ、必要によってＥＯガス滅菌を実施することができる。

上述した全過程を通じて抜去歯から骨移植材を製造するためにかかる時間は長くても２時間程度である。

必要により各段階を略する場合、処理時間は短縮可能である。

減圧処理は、超音波処理をする全ての段階で適用されることができる。減圧処理は必ず超音波処理と並行されなければならないものではない。処理しようとする歯牙や骨の状態によって処理時間が最も長くかかるＳ４段階のみに適用することで十分なこともある。しかし、処理時間を縮めるためには超音波処理される全ての段階で適用することが望ましい。

減圧は、真空開始（ｖａｃｃｕｍ−ｏｎ）を通じて始めて減圧される状態を維持し続けることができる。しかし、本発明では、減圧を適用する時、真空印加のサイクル（周期）を調節して超音波キャビテーションが調節され、究極的に処理時間が短縮されるということを確認した。

超音波とともに減圧を適用する場合に真空印加の周期を調節する方法は、真空装置をオンにして歯牙あるいは骨が処理される装置内部の圧力を大気圧より低く減圧を始め、一定時間後、真空装置をオフにして装置内部を大気圧と平衡になるように維持させる。真空印加の周期は、減圧（真空開始、ｖａｃｕｕｍ−ｏｎ）と大気圧（真空終了、ｖａｃｕｕｍ−ｏｆｆ）の時間の割合が１：１から１：４の範囲であることが望ましかった。例えば、減圧（真空開始、ｖａｃｕｕｍ−ｏｎ）４０秒と以後大気圧（真空終了、ｖａｃｕｕｍ−ｏｆｆ）１２０秒の周期で繰り返すことができる。上記減圧の適用時間は、真空装置の効率により異なるが、通常３０秒から２分程度が望ましいと示された。短すぎる場合は真空の影響が及ぶ時間的な余裕がなく、長すぎる場合は真空の効果がこれ以上発現されなかった。このように真空の印加と大気圧へのリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）を通じて、歯牙と溶液の反応を阻害する微細部位の空気滴を効果的にとり除き、超音波キャビテーション（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）の伝達を（各処理段階に合わせて）極大化させることができる。

ここで、減圧作動と大気圧作動の時間割合は、真空装置をオフさせた後に処理装置がどれだけ早く大気圧と平衡に至るかによる問題であって、真空装置の構造的特徴によって変わることもできる。すなわち、どれだけ早く目標真空に到逹し、どれだけ早く大気圧と平衡になるかによる。一般的に、減圧時間の過度な増加や長すぎる減圧−大気圧の交換周期は、脱灰効果を増大させないか、減少させるものと示された。

このように処理して得られる骨移植材は、直接的に抜歯された患者の抜歯部位にそのまま植立されることができ、自身の歯牙を用いた既存移植材の製造方法に比べて同等以上の効果を奏することができる。

［試験例１］
本発明の骨移植材の製造方法（段階Ｓ１〜Ｓ９）を経て処理された歯牙移植材内に含んでいるタンパク質の存在を、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じて確認してみた。

ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）は、探そうとするタンパク質を標的化する抗体を用いて抗原−抗体反応を通じて特定のタンパク質を検出する技法である。

対象サンプルとしては、下記のように、総３種のサンプルを準備し、４種の標的タンパク質を共に準備した。

−対象サンプル
１）本発明の骨移植材の全製造過程＜１＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ９）、０.６Ｎ ＨＣＬ使用、真空繰り返し
２）本発明の骨移植材の製造過程中＜２＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ４、段階Ｓ９）までのみ処理（一部試薬処理の省略）、０.６Ｎ ＨＣＬ使用、真空繰り返し
３）本発明の骨移植材の全製造過程＜３＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ９）、１.０Ｎ ＨＣＬ使用、真空
４）一般的な方法で加工した移植材＜４＞０.６Ｎ ＨＣＬ使用、真空は使用しない

−標的タンパク質
１）ＤＭＰ−１（５７ｋＤａ）：骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の誘導に係るタンパク質
２）ＤＳＰ（５４ｋＤａ）：ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｉｎで象牙質（ｄｅｎｔｉｎ）形成に関与
３）ＭＭＰ−２（７４ｋＤａ）、４）ＭＭＰ−２０（５４ｋＤａ）: 傷の治癒、骨の成長、血管の形成、組職材の形成に関与

その結果、図３に示したように、本発明の製造過程を経た対象サンプル＜１＞の場合、歯牙組職に含まれている骨形成に係る成長因子タンパク質であるＤＭＰ−１（５７ｋＤａ）、ＤＳＰ（５４ｋＤａ）、ＭＭＰ−２（７４ｋＤａ）が、その他の方法で加工した結果（対象サンプル＜２＞＜３＞＜４＞）より格段に優秀なことが確認された。

［試験例２］
本発明の骨移植材の製造方法（段階Ｓ１〜Ｓ９）を経て処理された歯牙移植材においては、ＳＥＭを通じて確認した。

対象サンプルとしては、総５種のサンプルを準備した。

−対象サンプル
１）本発明の骨移植材の全製造過程＜１＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ９）、０.６Ｎ ＨＣＬ使用（脱灰時間７０分）、真空繰り返し
２）本発明の骨移植材の製造過程中＜２＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ４、段階Ｓ９：一部試薬処理しない）までのみ処理、０.６Ｎ ＨＣＬ使用（脱灰時間７０分）、真空繰り返し
３）本発明の骨移植材の全製造過程＜３＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ９）、１.０Ｎ ＨＣＬ使用、脱灰時間７０分、真空
４）一般的な骨移植材の全製造過程＜４＞（段階Ｓ１〜段階Ｓ９）、０.６Ｎ ＨＣＬ使用、脱灰時間６３時間、真空使用しない
５）ＧＢＭ＜５＞（ｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ；人体肋骨を用いて加工された移植材）、０.６Ｎ ＨＣＬ使用、脱灰時間２４時間、真空使用しない

ＳＥＭ確認結果、図４に示したように、本発明の製造過程を経た対象サンプル＜１＞の場合、既に移植材として検証された対象サンプル＜５＞のＧＢＭ（同種骨膜）と最も類似した表面を示すことにより、対象サンプル＜１＞が加工処理に最適状態を示すことが分かった。

対象サンプル＜２＞の場合、脱灰だけを進行させて象牙細管の一部が観察され、対象サンプル＜１＞及び＜５＞と外形状が類似しているように見えるが、分子生物学的な水準でコラーゲンをはじめタンパク質の再配列に制限があるため、ウエスタンブロットでタンパク質の発現が対象サンプル＜１＞に比べて著しく低下していることが観察され、生体内で成長因子の流出と効果発現に相当な制限があるように見える。対象サンプル＜３＞の場合、１.０ ＨＣＬで脱灰させることにより、対象サンプル＜１＞と比べると、比較的粗い表面が観察され、象牙質内の成長因子が損傷されたことが分かった。

対象サンプル＜４＞の場合、約４０％以上脱灰を進めるために、６３時間が必要となり（人体肋骨の場合、約２４〜３６時間）、長期間の脱灰溶液露出で象牙細管は見えるが、コラーゲンの再配列を観察することができず、ウエスタンブロットで成長因子の発現されないことが分かった。

［試験例３］
上記試験例２の対象サンプル＜１＞の結晶構造を分析するために、ＸＲＤ分析を行った。

その結果、図５に示したように、全体組成でカルシウム成分が十分に除去された状態であることが分かり、特にポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）別に確認したところ、ポジション１,２,３,４,５によって内側から表面に進むほどカルシウム成分が多く除去されたことを確認することができた。

これは、本発明の製造過程、段階Ｓ１〜Ｓ３を経る間に歯牙表面に穴を形成することが、内側のカルシウム成分をとり除くことに役に立つことが分かった。

［試験例４］
本発明の製造過程、段階Ｓ１〜Ｓ３の歯牙の保存溶液により処理前の滅菌状態及び処理後の滅菌状態を確認した。

本発明の段階Ｓ１〜Ｓ３の歯牙を、図６Ａに示したようにエタノールに保存し、図６Ｂ（汚染が酷い）、図６Ｃ（比較的に汚染がひどくない）に示したように生理食塩水に保存してみた。

その結果、処理後、いずれも滅菌が可能であることが分かり、処理前の保存溶液をエタノールとする場合、抜歯直後の汚染状態である歯牙がエタノール保存のみで滅菌状態を維持することが分かった。

以上で説明したように、本発明は、抜去歯や骨のような人体硬組織を処理して骨移植材に製造することにかかる所要時間を画期的に縮めることができ、抜去歯を別の移管措置を行わずに現場内で移植材への製造が可能であり、自身の歯牙を用いることにより臨床に適用する時にも副作用なしに使用可能であり、優れた骨治癒を示すことが分かる。

上記の本発明は、望ましい実施形態及び試験例を中心に説明したが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の本質的な技術範囲内で上記本発明の詳細な説明と異なる形態の実施形態及び試験例を具現することもできる。ここで、本発明の本質的な技術範囲は、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は本発明に含まれたものと解釈されるものとする。

Claims (13)

1. 人体硬組織である抜去歯から少なくとも１段階の化学的試薬処理の段階を実施して歯牙骨移植材を製造する方法において、
   抜去歯の軟組織及び歯髄をとり除き、洗浄する第１段階；
   前記第１段階を経た歯牙の歯冠と歯根を分離し、該分離された歯冠及び歯根に少なくとも一つの穴を形成する第２段階；
   前記第２段階を経た歯牙を洗浄する第３段階；及び
   前記第３段階を経た歯牙を、減圧下で真空超音波処理を伴って０.５Ｎ乃至０．６Ｎの塩酸溶液中に浸漬し、前記第３段階を経た歯牙を引き上げて洗浄する第４段階;を含み、
   前記第４段階は、前記減圧下で真空超音波処理を行うことにより、キャビテーションを制御できることを特徴とする歯牙骨移植材の製造方法。
2. 前記真空超音波処理は、超音波周波数２０ｋＨｚ乃至４０ｋＨｚの範囲で行われる請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
3. 前記真空超音波処理は、１００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）乃至６００ｍｍＨｇ（ｔｏｒｒ）の範囲の真空で行われる請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
4. 前記真空超音波処理は、
   減圧下で超音波を照射する真空超音波処理であり、当該真空超音波処理のほかに、
   減圧を伴わずに超音波を照射する非真空超音波処理を行い、更に減圧下で超音波を照射する真空超音波処理を順次に行う請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
5. 前記化学的試薬処理の段階は、温度範囲が常温乃至６０℃の条件下で行われる請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
6. 洗浄のための目的ではない蒸溜水処理の段階を含み、該蒸溜水処理の段階は、真空超音波処理を伴う請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
7. 前記第４段階を経た歯牙を、超音波処理を伴うプロテアーゼ阻害剤が含まれるＰＢＳ溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する第５段階；
   前記第５段階を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化カルシウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する第６段階；及び
   前記第６段階を経た歯牙を、超音波処理を伴うＥＤＴＡ溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する第７段階；
   を含む請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
8. 前記第７段階を経た歯牙を、超音波処理を伴う塩化リチウム溶液中に浸漬し、引き上げて洗浄する第８段階；及び
   前記第８段階を経た歯牙を、超音波処理を伴う蒸溜水中に浸漬する第９段階；
   を含む請求項７に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
9. 前記抜去歯は、滅菌された生理食塩水、蒸溜水またはエタノールに保存される請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
10. 前記第４段階での浸漬は、常温乃至６０℃の温度範囲で６０分乃至７５分間行われる請求項１に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
11. 前記第５段階及び前記第７段階での浸漬は、ｐＨ７乃至８の条件下で行われる請求項７に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
12. 前記第８段階での浸漬は、常温乃至６０℃の温度範囲で５分乃至１０分間行われる請求項８に記載の歯牙骨移植材の製造方法。
13. 前記第９段階を経た歯牙を滅菌状態で冷凍保存する段階をさらに含む請求項８に記載の歯牙骨移植材の製造方法。