JP5832787B2 - ジンクフィンガータンパク質を使用する機能ゲノミクス - Google Patents
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Description
本出願は、1999年1月12日提出、USSN 09/229007、および1999年1月12日提出、USSN 09/229037に関し、両方は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
適用なし。
本発明は、機能ゲノミクスおよび標的確認適用のための、組換えジンクフィンガータンパク質を使用する遺伝子発現を調節する方法を提供する。
目的の遺伝子の機能の決定は、薬物発見のための潜在的なゲノム標的を同定するために重要である。次いで、特定の機能または表現型に関連する遺伝子は、治療化合物の発見のために標的として検査され得る。歴史的に、特定の遺伝子の機能は、生物学的系(例えば、細胞またはトランスフェニック動物)における表現型の特定の機能を有する遺伝子の発現を関連付けることによって同定されている。
従って、本発明は、例えば、薬物発見、標的確認または機能ゲノミクスのための、選択された表現型に関連する遺伝子(単数または複数)を同定する初めての方法を提供する。
(導入)
本明細書中に記載される場合、本発明は、遺伝子発現の表現型結果および機能を決定するためのアッセイにおいて使用されるジンクフィンガータンパク質を提供する。集中した大量の配列決定の努力と組み合わせて、分析技術における最近の発達は、以前に入手可能であったよりも多くの多数の分子標的を同定および特徴付けるための機会を創出してきた。遺伝子およびこれらの機能についてのこの新しい情報は、基本的な生物学的理解に沿って速度を増し、そして、治療処置のための多数の新しい標的を提供する。いくつかの場合では、分析用ツールは、新しいデータの産生に追いついていない。例は、グローバル差次的遺伝子発現の測定における最近の発達によって提供される。これらの方法は、遺伝子発現マイクロアレイ、差次的なcDNAクローニング頻度、減算的ハイブリダイゼーションおよび差次的表示法によって代表されるが、異なった組織においてかまたは特定の刺激に応答して上方制御または下方制御される遺伝子を非常に迅速に同定し得る。ますます、このような方法が、形質転換、腫瘍進行、炎症性反応、神経学的障害などの生物学的プロセスを探求するために使用されている。当業者は、所定の生理学的現象と相関する差次的に発現される遺伝子の長い列挙を、現在非常に簡単に作製し得るが、差次的に発現された遺伝子と表現型との間の原因となる関係を示すことは困難である。現在まで、差次的に発現された遺伝子に機能を割り当てるための簡単な方法は、差次的な遺伝子発現をモニターする能力に追いついていない。
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに起因する意味を有する。
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton,Proteins(1984)を参照のこと)。
本発明のジンクフィンガータンパク質を、選択した候補遺伝子において選択した標的部位を認識するように操作する。代表的には、任意の適切なCys2His2ジンクフィンガータンパク質(例えば、SP−1、SP−1CまたはZIF268)からの骨格を、操作されるジンクフィンガータンパク質についての足場として使用する(例えば、Jacobs、EMBO J.11:4507(1992);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 90:2256−2260(1993)を参照のこと)。次いで、多数の方法を使用して、その標的について高親和性を有するジンクフィンガータンパク質(例えば、好ましくは、約25nM未満のKdを有する)を設計しそして選択し得る。上記のように、ジンクフィンガータンパク質は、高親和性を伴って、標的の候補遺伝子における任意の適切な標的部位に結合するように設計または選択され得る。同時係属中の特許出願USSN09/229,007(1999年1月12日出願)(本明細書中で参考として援用される)は、選択された標的部位についてのジンクフィンガータンパク質の設計、構築および発現のための方法を包括的に記載する。
(x、a)、(y、b)および(z、c)の少なくとも1つは、(G,K)であり、そして NおよびKは、IUPAC−IUBの多義性コードである。
であり、ここで、D可能なサブ部位を強調表示する。xおよびyの両方がGであるがzはGでなく、そしてaおよびbがKである場合、その標的部位は、以下のように2つの重複するD可能なサブ部位を有する:
であり、このような部位の一方を、ボールドで表し、そして他方を斜体字で表す。x、yおよびzの3つすべてがGであり、そしてa、bおよびcがKである場合、その標的セグメントは、以下のような3つのD可能なサブ部位を含む:
ここで、D可能なサブ部位は、ボールド、斜体字、および下線によって表される。
ジンクフィンガータンパク質ポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を用いて作製され得る。本発明における一般的使用法を開示する基本書は、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版、1989),Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら、編、1994)を含む。さらに、本質的に任意の核酸を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。
本発明のジンクフィンガータンパク質は、必要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合され得る。ジンクフィンガータンパク質は、1つ以上の調節ドメイン、あるいは、同じドメインかまたは2つの異なるドメインの2つのコピーである2つ以上のドメインを有する、2つ以上の調節ドメインと共有的にかまたは非共有的に結合され得る。この調節ドメインは、ジンクフィンガータンパク質へ共有的に連結され得る(例えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タンパク質の一部として)。ジンクフィンガータンパク質はまた、非共有的二量体化ドメインを介して調節ドメインと結合され得る(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質(例えば、O’Shea,Science 254:539(1991),Barahmand−Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121−128(1996);Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Hoら、Nature 382:822−826(1996);およびPomeranzら、Biochem.37:965(1998)を参照のこと))。調節ドメインは、ジンクフィンガータンパク質のC末端またはN末端を含む、任意の適切な位置でジンクフィンガータンパク質と結合され得る。
選択のZFPをコードする核酸は、代表的に、複製、発現のための(例えば、Kdを決定するための)原核生物細胞または真核生物細胞中に形質転換するためのベクター中にクローニングされる。このようなベクターは、代表的に、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸またはタンパク質の産生の保存または操作のための原核生物ベクター(例えば、プラスミド)またはシャトルベクター、または昆虫ベクターのような真核生物ベクターであり、あるいは、ジンクフィンガータンパク質の発現および必要に応じて遺伝子発現の制御のためのウイルスベクターのような原核生物ベクター(例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど)である。次いで、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞(好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞)、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞へ投与され得る。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、哺乳動物細胞または標的組織に、操作されたジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を導入するために使用され得る。このような方法は、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸をインビトロまたはインビボで細胞に投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒクル(例えば、リポソーム)と複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームであるかまたはゲノムに組み込まれるかのいずれかである、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含む。遺伝子治療の手順の概説については、Anderson、Science 256:808〜813(1992);NabelおよびFelgner、TIBTECH 11:211〜217(1993);MitaniおよびCaskey、TIBTECH 11:162〜166(1993);Dillon、TIBTECH 11:167〜175(1993);Miller、Nature 357:455〜460(1992);Van Brunt、Biotechnology 6(10);1149〜1154(1988);Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35〜36(1995);KremerおよびPerricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31〜44(1995);Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology DoerflerおよびBohm(編)(1995);ならびにYuら、Gene Therapy 1:13〜26(1994)を参照のこと。
ポリペプチド化合物(例えば、ジンクフィンガータンパク質)の投与における重要な因子は、このポリペプチドが細胞の形質膜、または核のような細胞内区画の膜を横切る能力を有することを確実にすることである。細胞膜は、非イオン性の親油性化合物に対して自由に透過性であり、かつ極性化合物、巨大分子、および治療剤または診断剤に対して固有に不透過性である、脂質タンパク質の二重層から構成される。しかし、細胞膜を横切るジンクフィンガータンパク質のようなポリペプチドを輸送する能力を有する、タンパク質およびリポソームのような他の化合物が記載されている。
種々のアッセイを使用して、選択された表現型と候補遺伝子の関連を決定し得る。ジンクフィンガータンパク質により調節される特定の遺伝子の活性は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパク質レベルまたはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖;レポーター遺伝子の転写活性化または転写抑制;セカンドメッセンジャーレベル(例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca2+);サイトカインおよびホルモンの産生レベル;ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イムノアッセイ(例えば、抗体を用いるELISAおよび免疫組織化学アッセイ)、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、RNase保護、ノーザン、インサイチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究)、比色定量アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイ、cDNAアレイ研究などを使用して、評価され得る。
種々のアッセイを使用して、選択された表現型と候補遺伝子との関連性を決定し得る。ジンクフィンガータンパク質により調節される特定の遺伝子の活性は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパク質レベルまたはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖;レポーター遺伝子の転写活性化または転写抑制;セカンドメッセンジャーレベル(例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca2+);サイトカインおよびホルモンの産生レベル;ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イムノアッセイ(例えば、抗体を用いるELISAおよび免疫組織化学アッセイ)、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、RNase保護、ノーザン、インサイチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究)、比色定量アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイ、cDNAアレイ研究などを使用して、評価され得る。
ジンクフィンガータンパク質技術のさらなる適用は、細胞株およびトランスジェニック動物における遺伝子発現を操作することである。一旦、選択した候補遺伝子がある表現型と関連し、そしてこの候補遺伝子が薬物治療標的として確認されると、細胞およびトランスジェニック動物ベースのアッセイが、高処理能薬物スクリーニングの目的のために開発される。候補遺伝子を発現する細胞株または動物は、候補遺伝子の発現を調節するジンクフィンガータンパク質を供給される。このジンクフィンガータンパク質は、代表的には、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸として提供されるが、タンパク質としてもまた投与され得る。次いで、この細胞株または動物は、候補遺伝子および選択した表現型に対するこの化合物の効果を決定するために、試験化合物と接触される。ジンクフィンガータンパク質技術は、高処理能細胞ベースアッセイおよび高処理能動物アッセイについての改良である。例えば、ジンクフィンガータンパク質の発現は、低分子系を用いる条件でなされ得るからである。
本発明の状況において被験体または細胞に投与される用量は、所望の表現型をもたらすのに充分であるべきである。特定の投与レジメが、実験設定(例えば、機能的ゲノム研究における設定、および細胞または動物モデルにおける設定)における表現型の変化を決定するために有用であり得る。用量は、用いられる特定のジンクフィンガータンパク質の効力およびKd、標的細胞の核の容量、および細胞または患者の状態、ならびに処置される細胞または患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の細胞または患者における特定の化合物もしくはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
ジンクフィンガータンパク質をコードする発現ベクターの適切な用量はまた、プロモーターからのジンクフィンガータンパク質発現の平均速度および細胞内のジンクフィンガータンパク質分解の平均速度を考慮することによって計算され得る。好ましくは、野生型または変異体HSV TKのような弱いプロモーターが、上記のように使用される。マイクログラムのジンクフィンガータンパク質の用量は、利用される特定のジンクフィンガータンパク質の分子量を考慮に入れることによって計算される。
ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガータンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子発現の調節のために、被験体または細胞に直接的に投与され得る。有効な量の投与は、ジンクフィンガータンパク質を導入して、組織または細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。ジンクフィンガータンパク質は、任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアとともに投与される。このような調節物の適切な投与方法は、当業者に利用可能でありかつ周知であり、そして1を超える経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりもより直接的かつより効果的な反応をしばしば提供し得る。
以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、限定する目的ではない。当業者は、変更または改変されて基本的に類似した結果を生じ得る種々の決定的ではないパラメーターを容易に認識する。
標的確認における重要な考慮は、標的遺伝子と得られる表現型との間の相関関係を十分に決定しかつ実際に評価することである。本実施例は、ジンクフィンガータンパク質技術の使用を実証して、例えば、遺伝子の発現または遺伝子産物の機能を調節し得る、治療用化合物の開発のための標的として遺伝子を確認することを実証する。このプロセスは、以下の単純な仮説に基づく(図1)。
ジンクフィンガータンパク質についてのDNA標的部位を、標的遺伝子の転写部位の周囲の領域において選択した。主な標的を、転写開始部位の約1kb上流の領域内で選択した。ここで、エンハンサーエレメントの大部分が配置される。各3−フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、9bpのDNA配列を認識する。DNA結合特異性を増加させるために、近接する2つの3−フィンガーのジンクフィンガータンパク質を9bp配列(Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:5525〜5530(1997))を標的にするように共に融合した。
高い生化学的アフィニティーおよび特異性を有するジンクフィンガータンパク質を、pcDNA−NVFまたはpcDNA−NKF中のKpnI部位およびBamHI部位にサブクローニングした(図2)。pcDNA−NVF構築物は、核局在シグナル、単純ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン、およびFlagペプチドをコードするCMVプロモーター制御配列を含む。この構築物を、哺乳動物細胞に導入した場合に、標的化遺伝子を上方制御するように設計した。pcDNA−NKF構築物は、VP16ドメインに代わってKruppel関連ボックス(KRAB)抑制ドメインを含み、そしてこれを標的化遺伝子の下方制御に用いた。これらの構築物を、同時係属出願であるUSSN 09/229037に詳細に記載する。
であり、ここで、フィンガーに下線を付す。これらのコントロール構築物を用いて、DNA結合ドメインの非存在下での調節ドメイン(VP16またはKRAB)の効果を確認した。pc−ZFP−catプラスミドは、特定の設計したジンクフィンガータンパク質を発現するが、機能的ドメイン(VP16またはKRAB)を、pcDNA3.1/CATベクター(nt1442〜1677)(Invitrogen,CA)中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子から単離される234bpフラグメントと交換した(図2)。このコントロールプラスミドを用いて、DNA結合ドメインが単独で遺伝子発現に対する任意の効果を有するか否かを試験する。他のコントロールは、異なるDNA配列および非特異的ジンクフィンガータンパク質標的配列を含むレポーターを認識するジンクフィンガータンパク質を発現するエフェクターを含む。
アセンブルされたジンクフィンガータンパク質のKpnI−BamHI DNAフラグメントを、pMAL−KNBベクターのKpnI−BamHI部位にクローン化した。設計されたジンクフィンガータンパク質が、その標的部位に結合する能力を、E.coliから組換えタンパク質を発現および精製すること、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を実施することによって、確認した。上記に示したタンパク質の結合親和性(Kd)は、EMSAによって決定された場合、20nMであった。次いで、このKpnI−BamHI ZFPフラグメントを、pcDNA−NVFベクターのKpnI−BamHI部位にサブクローン化し、そしてpcV−VF471Aと命名した。M6−1892S部位の3つの縦列反復配列を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、そしてpGLP−VF471x3と命名した。
単純レポーター系とネイティブなレポーター系との間の差異は、ネイティブなレポータープラスミド構築物が、標的遺伝子のプロモーターを含むということである。ネイティブなレポーター系に固有の利点は、単一のネイティブなレポータープラスミド構築物を使用して、そのプロモーターの状況下で、複数のジンクフィンガータンパク質の効果を分析し得るということである。
これらの操作されたジンクフィンガータンパク質が、細胞培養物において内因性のヒトおよびマウスのVEGF遺伝子を活性化または抑制し得るか否かを試験するために、一過的なトランスフェクション実験を実施した。ヒト293細胞およびマウス乳房上皮細胞C127I(Shimaら、JBC 271:3877(1996))は、低レベルの内因性VEGFタンパク質を発現し、これを使用して、VEGF活性化に対するジンクフィンガータンパク質の効果を評価した。ヒト膠芽腫U87MG細胞、マウス神経芽腫NB41細胞(Levyら、Growth Factors 2:9(1989))およびラット神経膠腫GS−9L細胞(Connら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1323(1990))は、高レベルの内因性VEGFタンパク質を発現し、これを、ジンクフィンガータンパク質の抑制効果を試験するために使用する。これらの細胞を、翌日に約70%コンフルエンスに到達する密度で、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。0.1〜1gのエフェクターDNAを、通常、細胞型に依存してLipofectamineまたはGenePORTERトランスフェクション試薬のいずれかを用いて、細胞をトランスフェクトするために使用する。トランスフェクションの約14時間後、細胞に、新鮮培地を給餌し、そしてさらに24時間培養する。次いで、この培地を収集し、そして内因性VEGFレベルを、VEGF ELISAアッセイキット(R&D Systems、MN)を使用して測定する。
第1ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が、VEGF遺伝子に対する効果に起因し、そして他の副作用(例えば、代替的な遺伝子標的の調節)に起因しないことを確認するために、第1ジンクフィンガータンパク質の部位とは異なる部位でVEGF遺伝子を標的化する第2ジンクフィンガータンパク質を操作した。表1に示されるように、2つの第2ジンクフィンガータンパク質はまた、培養細胞中で内因性VEGF遺伝子発現を活性化する。これらの結果は、ジンクフィンガータンパク質技術を使用して、遺伝子発現を調節し得、そして治療のための標的として遺伝子を確認し得ることを示す。
第1および第2ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が、VEGF遺伝子に対する特異的効果に起因し、そしていかなる非特異的DNA結合または鎮圧(squelching)効果にも起因しないことを確認するために、VEGF生理に関与しない遺伝子を標的化する第3ジンクフィンガータンパク質を、ネガティブコントロールとして使用する。例えば、ヒトEPO遺伝子発現を調節するために設計されたジンクフィンガータンパク質を、特異性コントロール(実施例IIを参照のこと)として使用する。EPOはまた、低酸素によって影響を及ぼされ、従って、低酸素アッセイを使用するVEGF標的確証のためのコントロールとして有用である。VEGF阻害は、特異的に、糖尿病性網膜症を覆す。この結果は、薬物の発見および開発のための分子標的としてのVEGFを確証する。
糖尿病性網膜症は、労働者年齢の個体間における失明の最も一般的な原因である。VEGF発現の増加は、糖尿病性網膜症の病理の主要な誘因である。この疾患を処置するためのストラテジーの1つは、治療的化合物を使用して、内因性VEGF遺伝子発現を阻害することである。上記のように、ジンクフィンガータンパク質は、治療剤としてVEGFを確証するための手段を提供する。アデノ随伴ウイルス(AAV)および/またはレトロウイルスに基づいたウイルスベクターを、上記のように構築する。これらのウイルスベクターは、上記のようなKRAB抑制ドメインと融合されたジンクフィンガータンパク質を発現する。これらのウイルスを産生し、精製し、そして動物中に注射する。操作されたジンクフィンガータンパク質の効力を、以前に記載された(Admaisら、Arch.Ophthalmol.114:66(1996);Pierceら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:905(1995);Aielloら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:10457(1995);Smithら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.35:101、1994)ような網膜新生血管形成の抑制によって、評価する。すべての必要なコントロール(第2および第3のジンクフィンガータンパク質を発現するウイルスベクターを含む)もまた、使用される。
側副動脈の発達を増強するための、VEGFによる末梢新脈管形成の刺激は、虚血性脈管疾患を有する患者のための潜在的に新規な治療形態である。上記と同じストラテジーを使用し、マウス末梢動脈疾患モデルを用いて、標的としてのVEGFを確証する。VP16活性化ドメインに融合されたジンクフィンガータンパク質を発現するAAVまたはレトロウイルスベクターを、上記のように構築する。ジンクフィンガータンパク質の効力を、以前に記載された手順(Couffinhalら、Am.J.Pathol.152:1667(1998);Takashitaら、Lab.Invst.75:487(1996);Isnerら、Human Gene Therapy 7:959(1996))と同様に評価する。すべての必要なコントロール(第2および第3のジンクフィンガータンパク質を発現するウイルスベクターを含む)もまた、使用される。VEGFの過剰発現は、側副動脈成長を誘発する。この結果は、薬物の発見および開発のための標的としてのVEGFを確証する。
哺乳動物の赤血球生成を、増殖および分化シグナルを与える特定の因子による赤血球前駆体の刺激を介して調節する。低酸素は、多くの生理学的に関連したプロセスを制御する遺伝子の発現を誘導する強力なシグナルである(Ratcliffeら、J.Exp.Biol.201:1153(1998))。このプロセスの1つは、特定の組織が、さらなる赤血球の生成のための因子を放出することを「要求」することである。この現象は、低酸素条件を用いて異なる細胞株および/または組織を刺激すること、培養物上清をサンプリングすること、そしてマウス骨髄培養物由来の赤血球コロニー形成単位の刺激について試験することによって検出され得る。この様式において、低酸素に応答することが見出された細胞株または組織は、低酸素誘導可能様式で、赤血球生成増殖因子を発現する可能性がある。低酸素処理に際してこのような細胞または組織において示差的に発現される遺伝子の分析は、赤血球生成増殖因子発現遺伝子の同定へと導く。ジンクフィンガータンパク質技術は、このような示差的な遺伝子発現実験のための分析ツールとして、そして仮定上の赤血球生成増殖因子遺伝子を確証するために使用され得る。
いくつかの乳房腫瘍の増殖は、ホルモンエストロゲンの持続的存在に依存する。エストロゲンは、トランスフォームされた表現型の維持に必要とされる遺伝子のアップレギュレーションに関与する可能性がある。これらの組織由来の細胞株(例えば、MCF−7、BT20、およびT47D)は、培養における増殖についての、このエストロゲン依存性を保持する。従って、エストロゲンは、依存的細胞株において必須の遺伝子の発現を刺激するようである。これらのエストロゲン誘導性遺伝子の発見は、乳癌を処置するための新たな薬物の開発のために有用な分子標的である。エストロゲン依存性細胞増殖に必要とされるエストロゲン誘導性遺伝子を同定するためのジンクフィンガータンパク質の使用が、本明細書中に記載される。さらに、新たに発見された標的を、ジンクフィンガータンパク質および適切なコントロールを使用して確証する。
MCF−7細胞を、エストロゲン(エストラジオール)の非存在下で、短期間(1週間)および長期間(28週間)増殖させ、基底レベルに達するまでエストラジオール誘導性遺伝子の転写を可能にする。フェノールレッドを欠きかつ10%チャコール除去(stripped)ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone)、10μg/mlのインスリンおよび0.5nMのエストラジオールを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む162mlフラスコ中で、細胞を増殖させる。80%コンフルエンシーを達成したらすぐ、細胞をトリプシン処理し、そしてエストラジオールを欠く新鮮培地に移す。このフラスコを5%のCO2の加湿雰囲気下で37℃にてインキュベートする。
上記のように、そして同時係属中の出願(USSN09/229037)に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリストの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に標的化可能な9bpの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配列を得るためおよび上記で生成されたcDNA配列の精度を確実にするために、以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索することを含む。
リプレッサー研究のために、個々のジンクフィンガータンパク質を保有する細胞を、エストロゲン依存性機能をブロックすることに起因する増殖の欠損についてアッセイする。エストロゲンレセプターが、MCF−7における増殖に必須であることが証明され、従って、これらの細胞は、ER遺伝子または他のエストロゲン依存性機能が下方制御について標的化される場合、増殖に失敗する。
リストの各メンバーの活性化をまた行い、MCF−7細胞のエストロゲン依存性増殖についてアッセイする。真核生物発現ベクターを上記のように構築する。Lipofectamine(GIBCO−BRL製の市販されるリポソーム調製物)を用いてトランスフェクションを行う。全てのプラスミドDNAを、Qiagen Midi DNA精製システムを使用して調製する。上記のようにトランスフェクションを行う。
さらなる試験によって、この1回目のリプレッサーおよびアクチベーター研究の間に同定された候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク質を、候補遺伝子における異なりかつ別々の2つの標的部位を標的化するように設計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、18bpを認識する6フィンガー分子を形成するために、2つの3フィンガージンクフィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。
腫瘍増殖に対する変更された標的遺伝子発現の効果を、ヌードマウスにおける異種移植片により評価する。ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を、上記のようにアデノ随伴ウイルス(AAV)またはレトロウイルスベースのウイルスベクターにクローン化する。このジンクフィンガータンパク質をKRABまたはVP16ドメインのいずれかに融合する。得られた組換えウイスルを生成し、精製しそしてMCF−7細胞を感染するために使用する。これらのトランスジェニック細胞を、皮下的にヌードマウスへ導入する(Bisseryら、Semin.Oncol.22:3〜16(1995))。腫瘍を、腫瘍重量を見積もるために1週間に2度測定する(Bisseryら、Semin.Oncol.22:3〜16(1995);Kubotaら,J.Surg.Oncol.64:155〜121(1997))。この実験を、腫瘍が100〜300mgの重量を得るかまたは動物が死亡するまで進められる。
植物油の質を、成分の脂肪酸側鎖の飽和程度により部分的に決定する。過剰な不飽和(1または2個の二重結合より多い)は、酸化および酸敗する傾向がより高い粗悪な油を生じる。油生産種子における生合成機構の構成要素は、不飽和の程度を決定する。産物が脂肪酸不飽和に関与する遺伝子の発現を阻害することによって、高品質の油を生じ得る。ジンクフィンガータンパク質を、脂肪酸飽和のレベルを設定する際に役割を果たす遺伝子を同定するための、示差的遺伝子発現実験のためのプローブとして使用する。第1、第2および第3のジンクフィンガータンパク質を使用して、新たに発見された遺伝子機能を確認する。最終的に、高品質の油を生成するトランスジェニック植物を作製する。
出発材料は、ダイズ(Glycine max)種子または植物のいずれかである。変異誘発を、化学的処理またはランダムDNA挿入のいずれかにより行う(Katavicら,Plant.Physiol.108:399〜409(1995);Martienssen,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:2021〜2026(1998);Hohn&Puchta,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:8321〜8323(1999);Facciottiら,Nature Biotech.17:593〜597(1999))。
脂肪酸および脂質組成物を、Katavic(Plant Physiol.108:399〜409(1995))の方法に従って、約20〜30個のM3種子について決定する。成熟植物組織もまた、同様に分析する。種子を、脂肪酸飽和の程度に従ってカテゴリーに分類する。
上記のように、そして同時係属中の出願(USSN09/229037)に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリストの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に標的化可能な9bpの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配列を得るためおよび上記で生成されたcDNA配列の精度を確実にするために、以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索することを含む。
さらなる試験を使用して、1回目のこのリプレッサーおよびアクチベーター研究の間に同定される候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク質を、候補遺伝子における異なりかつ別々の2つの標的部位を標的化するように設計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、18bpを認識する6フィンガー分子を形成するために、2つの3フィンガージンクフィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。
Claims (29)
- 細胞において遺伝子と選択された表現型との関連性を明らかにするインビトロ方法であって、該方法は、
(i)内因性の第1の候補遺伝子を選択する工程、
(ii)該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合するように設計された第1のジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む第1の融合タンパク質、および第2の遺伝子の第2の標的部位に結合するように設計された第2のジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む第2の融合タンパク質を提供する工程、
(iii)該第1および第2の融合タンパク質を第1および第2の細胞にそれぞれ導入する工程であって、該第1および第2の細胞が該第1および第2の遺伝子を含む工程、
(iv)該第1の融合タンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で該第1の細胞を培養し、且つ該第2の融合タンパク質が該第2の遺伝子と接触する条件下で該第2の細胞を培養する工程であって、該第2の遺伝子は第2の候補遺伝子又は対照遺伝子であり、該第1および第2の融合タンパク質が、該第1および該第2の遺伝子の発現を調節する、工程、ならびに
(v)選択された表現型について該第1および第2の細胞をアッセイする工程であって、第1の融合タンパク質を導入する前の第1の細胞と比較して又は第2の細胞と比較して、該第1の細胞における選択された表現型の変化が該第1の候補遺伝子と選択された表現型との間の関連を示す工程、を含む方法。 - 前記第2の遺伝子が、対照遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の候補遺伝子が、少なくとも200ヌクレオチド長のESTによって部分的にコードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の候補遺伝子および前記第2の遺伝子の両方が、前記選択された表現型と関連する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の細胞が同一の細胞であり、該細胞が、前記第1および第2の遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の遺伝子の発現が、少なくとも50%抑制される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の遺伝子の発現が、少なくとも150%活性化される、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質の発現が、外因性薬剤の投与によって誘導される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2の融合タンパク質が少なくとも2つの調節ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトランスフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の融合タンパク質の各々が、プロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発現ベクターを前記細胞に投与する第1の工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質の発現が、小分子の制御下にある、請求項12に記載の方法。
- 前記第1の融合タンパク質の発現、および前記第2の融合タンパク質の発現が、異なる小分子の制御下にあり、該第1および第2の融合タンパク質が、同じ細胞において発現される、請求項13に記載の方法。
- 前記第1および第2の融合タンパク質の両方が、遺伝子発現を抑制する調節ドメインを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項12に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞が、各融合タンパク質の1.5×106個未満のコピーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の上流にある、請求項1に記載の方法。
- 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位に隣接している、請求項1に記載の方法。
- 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項1に記載の方法。
- 細胞において遺伝子と選択された表現型との関連性を明らかにするインビトロ方法であって、該方法は、
(i)複数の内因性候補遺伝子を同定する工程、
(ii)前記候補遺伝子の一つに存在する標的部位に結合するように設計されたジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む融合タンパク質を提供する工程、
(iii)該融合タンパク質を細胞に導入する工程、
(iv)該融合タンパク質が結合するように設計された候補遺伝子と、該融合タンパク質が接触する条件下で該細胞を培養する工程であって、該融合タンパク質が該候補遺伝子の発現を調節する、工程、
(v)該候補遺伝子の発現パターンを決定し、該融合タンパク質が接触させられた該候補遺伝子が選択された表現型と関連するか否かを決定する工程、ならびに
(vi)各候補遺伝子について、工程(ii)〜(v)を繰り返す工程、
を包含する、方法。 - 細胞において遺伝子と選択された表現型との関連性を明らかにするインビトロ方法であって、該方法は、
(i)内因性の第1の候補遺伝子を選択する工程、
(ii)該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合するように設計された第1のジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む第1の融合タンパク質、および該第1の候補遺伝子の第2の標的部位に結合する第2のジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む第2の融合タンパク質を提供する工程、
(iii)該第1のおよび第2の融合タンパク質を第1のおよび第2の細胞にそれぞれ導入する工程であって、該第1および第2の細胞が該第1の候補遺伝子を含む工程、
(iv)該第1の融合タンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で該第1の細胞を培養し、且つ該第2の融合タンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第2の細胞を培養する工程であって、該第1および第2の融合タンパク質が、該第1の候補遺伝子の発現を調節する、工程、ならびに
(v)選択された表現型について該第1および第2の細胞をアッセイする工程であって、第1および第2の融合タンパク質を導入する前の第1および第2の細胞と比較して、該第1および第2の細胞における選択された表現型の変化が該第1の候補遺伝子と選択された表現型との間の関連を示す工程、を含む方法。 - 前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項26に記載の方法。
- 前記発現の調節が遺伝子発現の活性化である、請求項1に記載の方法。
- 細胞において遺伝子と選択された表現型との関連性を明らかにするインビトロ方法であって、該方法は、
(i)内因性の第1の候補遺伝子を選択する工程;
(ii)該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合するように設計された第1のジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとを含む第1の融合タンパク質を提供する工程、
(iii)該第1の融合タンパク質を第1の細胞に導入する工程であって、該第1の細胞が該第1の遺伝子を含む工程、、
(iv)該第1の融合タンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で該第1の細胞を培養する工程であって、該第1の融合タンパク質は、該第1の候補遺伝子の発現を調節する、工程、ならびに
(v)選択された表現型についてアッセイする工程であって、第1の融合タンパク質を導入する前の第1の細胞と比較して、該第1の細胞における選択された表現型の変化が該第1の候補遺伝子と選択された表現型との間の関連を示す工程、を含む方法。
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