JP2003527093A - ジンクフィンガータンパク質を使用する機能遺伝学 - Google Patents

ジンクフィンガータンパク質を使用する機能遺伝学

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レイ チャン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法を提供し、この方法は、（ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程；（ｉｉ）この第１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質、および第２の遺伝子の標的部位に結合する第２のジンクフィンガータンパク質を提供する工程；（ｉｉｉ）この第１のジンクフィンガータンパク質が第１の候補遺伝子と接触する条件下で第１の細胞を培養し、そしてこの第２のジンクフィンガータンパク質が第２の候補遺伝子と接触する条件下で第２の細胞を培養する工程であって、ここでこの第１および第２のジンクフィンガータンパク質は、第１および第２の候補遺伝子の発現を調節する工程、ならびに（ｉｖ）選択された表現型についてアッセイする工程であって、これによりこの第１の候補遺伝子がこの選択された表現型と関連するか否かを同定する工程、を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願への相互参照） 本出願は、１９９９年１月１２日提出、ＵＳＳＮ ０９／２２９，００７、お
よび１９９９年１月１２日提出、ＵＳＳＮ ０９／２２９，０３７に関し、両方
は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】 （連邦政府支援の研究および開発に関する声明） 適用なし。
【０００３】 （発明の分野） 本発明は、機能遺伝学および標的確認適用のための、組換えジンクフィンガー
タンパク質を使用する遺伝子発現を調節する方法を提供する。
【０００４】 （発明の背景） 目的の遺伝子の機能の決定は、薬物発見のための潜在的なゲノム標的を同定す
るために重要である。次いで、特定の機能または表現型に関連する遺伝子は、治
療化合物の発見のために標的として検査され得る。歴史的に、特定の遺伝子の機
能は、生物学的系（例えば、細胞またはトランスフェニック動物）における表現
型の特定の機能を有する遺伝子の発現を関連付けることによって同定されている
。
【０００５】 遺伝子の機能を検査するために使用される１つの公知の方法は、細胞または動
物から遺伝子を遺伝子的に除去すること（すなわち、「ノックアウト」を作製す
る）、およびその細胞または動物の表現型（すなわち、任意の変化、例えば、ア
ッセイによって観察可能な形態学的変化、機能的変化など）が変化したか否かを
決定することである。この決定は、この細胞または生物体が遺伝子なしで生存す
るか否かに依存し、そしてこの遺伝子が生存に必要でない場合は、適切ではない
。他の遺伝子が、遺伝子の消失に適合し得る補償機構に供され、そして他の様式
でその機能を補われる。実際に、この補償作用は非常に有効であるため、欠失遺
伝子の本来の機能は見つからずに終わり得る。「ノックアウト」を作製する技術
的プロセスは困難であり、そして大規模な配列情報を必要とし、従って、遺伝子
の広いスケールで行われる場合、莫大な金銭的および技術的資源を必要とする。
【０００６】 別の例において、遺伝子調節のアンチセンス方法および標的リボザイムに依存
する方法は、非常に予測不可能である。新しく発見された遺伝子の機能を実験的
に決定するための別の方法は、強力なプロモーターにより駆動される発現ベクタ
ーにそのｃＤＮＡをクローニングすること、および形質転換された細胞における
その過剰発現の生理学的な結果の測定である。この方法はまた、労働集約的であ
り、そして標的遺伝子の下方制御の生理学的結果をアドレスしない。特徴づけさ
れていない遺伝子の選択的な過剰発現および過少発現を可能にする簡易な方法は
、科学の社会に対して大いに有用である。細胞モデル系、トランスジェニック動
物およびトランスジェニック植物における遺伝子の調節を可能にする方法は、学
術的な研究室、製薬会社、ゲノム関連会社および生物工学産業において広範な用
途を見出す。
【０００７】 標的確認のさらなる使用は、薬物発見のためのインビボおよびインビトロアッ
セイの産生にある。一旦、選択された表現型を生じる遺伝子が同定されると、細
胞株、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物が、有用なタンパ
ク質産物を過剰発現するかまたは有害なタンパク質産物を阻止するように操作さ
れ得る。次いで、これらのモデル系は、高処理スクリーニング方法と共に使用さ
れて、選択した遺伝子の発現を調節するリード治療化合物を同定し、それにより
所望の表現型（例えば、疾患の処置）を提供する。
【０００８】 現在、所定の遺伝子の発現を変化させ得る方法が、当該分野に存在し、これら
の方法は、例えば、リボザイム、アンチセンス技術、低分子調節因子、ｃＤＮＡ
クローンの過剰発現および遺伝子ノックアウトを用いる。これらの方法は、上記
のように、多数の適用には一般的に不十分であることが証明されており、そして
代表的には、インビボにおける高い標的効率または高い特異性のいずれも実証し
なかった。有用な実験的結果および治療的処置のために、これらの特徴は、望ま
しい。
【０００９】 遺伝子発現は、通常、転写因子と呼ばれる、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質
の機能の変化を通じて制御される。これらは、遺伝子の転写開始点に一般的に近
接して（時には大きい距離であるが）結合し、そして典型的には、ＤＮＡ結合ド
メインおよび調節ドメインを含む。。それらは、プロモーターで転写開始複合体
の形成または機能の有効性に影響するように作用する。転写因子は、陽性の様式
（トランスアクチベーション）または陰性の様式（トランスリプレッション）で
作用し得る。転写因子は典型的に両説ドメインを含むが、抑制もまたＤＮＡ結合
ドメインのみによる立体障害によって達成され得る。
【００１０】 転写因子の機能は、構成的（常に「オン」）または条件的であり得る。条件的
な機能は、種々の手段により転写因子上に与えられ得るが、これらの調節機構の
大部分は、細胞質における因子の隔離および誘導性放出ならびに引き続く核転移
、ＤＮＡ結合およびトランスアクチベーション（またはリプレッション）に依存
する。この手段に機能する転写因子の例としては、プロゲステロンレセプター、
ステロール応答エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）およびＮＦ−κＢが挙
げられる。リン酸化に応答する転写因子、またはそれらの同族ＤＮＡの認識配列
に結合するそれらの能力を変化することによる、低分子リガンドの例が存在する
（Ｈｏｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１７０１（１９９４）；Ｇｏｓｓｅｎお
よびＢｕｊａｒｄ，ＰＮＡＳ ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：４９１〜４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２〜４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏ
ｄ ８８：１１４７〜１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７〜７６１（１９９８））。
【００１１】 ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）は、配列特異的様式でＤＮＡに結
合し得るタンパク質である。ジンクフィンガーは、最初、アフリカツメガエル（
Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞由来の転写因子ＴＦＩＩＩＡにおい
て同定された。ジンクフィンガータンパク質は、真核生物において偏在している
。これらのタンパク質の１つのクラス（Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2クラス）を特徴付ける代
表的モチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）2-4−Ｃｙｓ−（Ｘ）12−Ｈｉｓ−（Ｘ）3-5 −Ｈｉｓ（ここでＸは、任意のアミノ酸である）である。単一のフィンガードメ
インは、約３０アミノ酸長であり、そしていくつかの構造的研究は、これが、単
一のβターンの２つのシステインを有するジンクを通じて、整列された（ｃｏ−
ｏｒｄｉｎａｔｅｄ）２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスを含むこ
とを実証している。現在まで、１０，０００個をこえるジンクフィンガー配列が
、数千の公知の転写因子または推定の転写因子において同定されている。ジンク
フィンガータンパク質は、ＤＮＡ認識だけでなく、ＲＮＡ結合およびタンパク質
−タンパク質結合にも関与する。現在、このクラスの分子が全ヒト遺伝子の約２
％を構成すると見積もられている。
【００１２】 マウス転写因子由来の３フィンガードメインである、Ｚｉｆ２６８のＸ線結晶
構造は、同属のＤＮＡ配列との複合体で解析されており、そして、それぞれのフ
ィンガーが、同期的なローテーションおよびＤＮＡの主軸に沿ったフィンガーの
翻訳により次のフィンガーに重ね合わせられ得ることを示す。この構造は、それ
ぞれのフィンガーが、独立して３をこえる塩基対の間隔で、それぞれのＤＮＡト
リプレットサブサイトと接触を生じるそれぞれの認識ヘリックス上の−１，２，
３および６位で側鎖でＤＮＡと、相互作用することを示唆する。Ｚｉｆ２６８の
アミノ末端は、そのＤＮＡ認識サブサイトの３’末端に位置する。いくつかのジ
ンクフィンガーは、標的セグメントにおいて４番目の塩基と結合し得ることが細
菌の結果によって示された（Ｉｓａｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５６１７〜５６２１（１９９７））。４番目の塩基
は、ジンクフィンガーによって認識される他の３つの塩基の逆鎖上にあり、そし
て３塩基サブサイトのすぐ３’側の塩基に相補的である。
【００１３】 Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ複合体の構造はまた、ジンクフィンガータンパク質のＤ
ＮＡ配列特異性が、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置
（−１，２，３および６）でアミノ酸置換を作製することにより変化され得るこ
とを示唆した。この観察を試験するための、ジンクフィンガーコンビナトリアル
ライブラリーを用いるファージ提示実験は、１９９４年の一連の文献に公開され
た（Ｒｅｂａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１〜６７３（１９９４）；Ｊ
ａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５６８９〜５６９５（１
９９４）；Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ ９１：１１１６３〜１１１６７（１９９４）
）。コンビナトリアルライブラリーは、Ｚｉｆ２６８の最初のフィンガーまたは
中間のフィンガーのいずれかにおける無作為化側鎖で構築され、次いで、適切な
ＤＮＡサブサイトが変化したＤＮＡトリプレットにより置換された変化したＺｉ
ｆ２６８結合部位を用いて単離された。導入された変異の性質と結合特異性にお
いて得られた変化との相関は、変化した結合特異性を有するジンクフィンガータ
ンパク質の合理的な設計のための置換規則の部分的なセットを生じた。Ｇｒｅｉ
ｓｍａｎおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７〜６６１（１９９７
）は、ジンクフィンガータンパク質のそれぞれのフィンガーが無作為化および選
択に成功裏に供されるファージ提示方法の詳細について議論する。この文献は、
核ホルモン応答エレメント、ｐ５３標的部位およびＴＡＴＡボックス配列につい
てのジンクフィンガータンパク質の選択を報告した。
【００１４】 組み換えジンクフィンガータンパク質は、培養細胞における一過的に発現され
たレポーター遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有することを報告されている
（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３〜９６（１９
９５）；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ９４：５５２５〜５５３０、１９９７）；および
Ｂｅｅｒｌｉら、ＰＮＡＳ ９５：１４６２８〜１４６３３（１９９８）を参照
のこと）。例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３〜９
６（１９９５）は、Ｏｃｔ−１由来のホメオドメインを有するＺｉｆ２６８由来
の２つのフィンガーを融合することにより新規なＤＮＡ結合タンパク質を設計す
る試みを報告する。次いで、このハイブリッドタンパク質は、キメラタンパク質
として発現されるための転写アクチベーターまたはレプレッサードメインのどち
らかと融合された。そのキメラタンパク質は、その２つの成分のサブサイトのハ
イブリッドを表示する標的部位を結合することが報告された。次いで、この著者
らは、プロモーターに作動可能に連結されるルシフェラーゼ遺伝子、およびプロ
モーターに近接する、キメラＤＮＡ結合タンパク質についてのハイブリッド部位
を含むレポーターベクターを構築した。この著者は、それらのキメラＤＮＡ結合
タンパク質が、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化し得るかまたは抑制し得る
ことを報告した。
【００１５】 Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５
２５〜５５３０（１９９７）は、それぞれ３つのフィンガーを有する２つのコン
ポーネントジンクフィンガータンパク質に連結するためのペプチドスペーサーを
用いることによる複合性のジンクフィンガータンパク質を形成する工程を報告す
る。次いで、この複合性タンパク質は、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメ
インにさらに連結される。得られたキメラタンパク質が、２つのコンポーネント
ジンクフィンガータンパク質により結合される標的セグメントから形成される標
的部位に結合することが報告された。さらに、キメラジンクフィンガータンパク
質は、その標的部位がレポーターに作動可能に連結されたプロモーターに近接し
たレポータープラスミドに挿入された場合、レポーター遺伝子の転写を活性化ま
たは抑制し得ることが報告された。
【００１６】 Ｂｅｅｒｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５
：１４６２８〜１４６３３（１９９８）は、ＫＲＡＢ、ＥＲＤもしくはＳＩＤ転
写リプレッサードメイン、またはＶＰ１６もしくはＶＰ６４転写活性化ドメイン
のいずれかに融合したキメラ６フィンガージンクフィンガータンパク質の構築を
報告する。このキメラジンクフィンガータンパク質は、ヒトｅｒｂＢ−２遺伝子
の５’未翻訳領域における１８ｂｐ標的部位を認識するように設計された。この
構築物を用いて、この研究の著者らは、ｅｒｂＢ−２プロモーターに連結された
、一過性に発現されたレポータールシフェラーゼ構築物の活性化および抑制の両
方を報告する。
【００１７】 さらに、組み換えジンクフィンガータンパク質は、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子を
コードする組み込まれ得たプラスミド構築物の発現を抑制することが報告された
（Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６４２〜６４５（１９９４））。ジンク
フィンガータンパク質が結合する標的セグメントは、ｂｃｒおよびａｂｌをコー
ドする遺伝子を融合する特異的な癌遺伝子転移により作製された接合部位を重複
するように選択された９塩基配列ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＣＣであった。この概念は
、この標的部位に特異的なジンクフィンガータンパク質が、ａｂｌまたはｂｃｒ
コンポーネント遺伝子への結合なく、癌遺伝子に結合することである。この著者
らは、この標的セグメントに結合する改変ジンクフィンガータンパク質を選択す
るためにファージ提示を用いた。次いで、このように単離された改変体ジンクフ
ィンガータンパク質は、細胞株における安定にトランスフェクトされたｂｃｒ−
ａｂｌ構築物の発現を抑制することが報告された。
【００１８】 現在まで、これらの方法は、一過性に発現された既知の遺伝子または既知の外
因性の遺伝子（ゲノムに組み込まれた）のいずれかの調節に焦点をおいていた。
対照的に、候補遺伝子の特異的な調節、または選択された表現型の原因を同定す
るための遺伝子のリストが当該分野で実証されてい内。従って、選択された遺伝
子の生物学的機能を同定する有用な方法、および／または薬物発見のために適切
な標的として遺伝子を確認する有用な方法の必要性が存在する。
【００１９】 （発明の要旨） 従って、本発明は、例えば、薬物発見、標的確認または機能遺伝学のための、
選択された表現型に関連する遺伝子（単数または複数）を同定する初めての方法
を提供する。
【００２０】 １つの局面において、本発明は、候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法を
提供し、この方法は、（ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程；（ｉｉ）この第
１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質
、および第２の遺伝子の標的部位に結合する第２のジンクフィンガータンパク質
を提供する工程；（ｉｉｉ）この第１のジンクフィンガータンパク質が第１の候
補遺伝子と接触する条件下で第１の細胞を培養し、そしてこの第２のジンクフィ
ンガータンパク質が第２の候補遺伝子と接触する条件下で第２の細胞を培養する
工程であって、ここでこの第１および第２のジンクフィンガータンパク質は、第
１および第２の候補遺伝子の発現を調節する工程、ならびに（ｉｖ）選択された
表現型についてアッセイする工程であって、これによりこの第１の候補遺伝子が
この選択された表現型と関連するか否かを同定する工程、を包含する。
【００２１】 別の局面において、本発明は、候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法を提
供し、この方法は、（ｉ）複数の候補遺伝子を同定する工程；（ｉｉ）第１の候
補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質を提供
する工程；（ｉｉｉ）この第１のジンクフィンガータンパク質が第１の候補遺伝
子に接触する条件下で第１の細胞を培養する工程であって、ここでこの第１のジ
ンクフィンガータンパク質が第１の候補遺伝子の発現を調節する、工程；（ｉｖ
）この候補遺伝子の発現パターンを決定し、そしてこの第１の候補遺伝子が選択
された表現型と関連するか否かを決定する工程；ならびに工程（ｉｉ）〜（ｉｖ
）を各候補遺伝子ごとに繰り返す工程、を包含する。
【００２２】 別の局面において、本発明は、候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法を提
供し、この方法は、（ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程；（ｉｉ）この第１
の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガー、およびこの
第１の候補遺伝子の第２の標的部位に結合する第２のジンクフィンガーを提供す
る工程；（ｉｉｉ）この第１のジンクフィンガータンパク質が第１の候補遺伝子
に接触する条件下で第１の細胞を培養し、そして第２のジンクフィンガータンパ
ク質が第１の候補遺伝子と接触する条件下で第２の細胞を培養する工程であって
、ここでこの第１および第２のジンクフィンガータンパク質が第１の候補遺伝子
の発現を調節する、工程；ならびに（ｉｖ）選択された表現型についてアッセイ
する工程であって、それによりこの第１の候補遺伝子がこの選択された表現型と
関連するか否かを同定する工程、を包含する。
【００２３】 別の局面において、本発明は、候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法を提
供し、この方法は、（ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程；（ｉｉ）この第１
の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガータンパク質を
提供する工程；（ｉｉｉ）第１の候補ジンクフィンガータンパク質がこの第１の
候補遺伝子に接触する条件下で第１の細胞を培養する工程であって、個々でこの
第１のジンクフィンガータンパク質がこの第１の候補遺伝子の発現を調節する工
程；ならびに（ｉｖ）選択された表現型についてアッセイする工程であって、こ
れにより、この第１の候補遺伝子が選択された表現型と関連するか否かを同定す
る工程、を包含する。
【００２４】 一実施形態において、この方法は、第１の候補遺伝子の第２の標的部位に結合
する第３のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する。一実
施形態において、この方法は、第２の候補遺伝子の標的部位に結合する第３のジ
ンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する。別の実施形態にお
いて、この方法は、複数の候補遺伝子を選択し、そして各候補遺伝子の標的部位
に結合する複数のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する
。
【００２５】 一実施形態において、第１の候補遺伝子は、少なくとも約２００ヌクレオチド
長のＥＳＴによって部分的にコードされる。一実施形態において、第１の候補遺
伝子および第２の遺伝子の両方は、選択された表現型に関連する。一実施形態に
おいて、第２の遺伝子は、制御遺伝子である。一実施形態において、第１および
第２の細胞は同一の細胞であり、ここでこの細胞は第１および第２の候補遺伝子
を含む。一実施形態において、第１および第２の候補遺伝子は内因性遺伝子であ
る。
【００２６】 一実施形態において、候補遺伝子の発現は、少なくとも約５０％だけ抑制され
る。一実施形態において候補遺伝子の発現は、少なくとも約１５０％活性化され
る。一実施形態において、発現の調節は、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現
の活性化である。一実施形態において、発現の調節は、遺伝子の活性化を妨げる
遺伝子発現の抑制である。
【００２７】 一実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の調節ドメイ
ンを含む融合タンパク質である。一実施形態において、この調節ドメインは、転
写レプレッサ、メチルトランスフェラーゼ、転写活性化剤、ヒストンアセチルト
ランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される。
【００２８】 一実施形態において、細胞は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞
、真菌細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞からなる群から選択される。一実施形
態において、細胞は、約１．５×１０6個未満の各ジンクフィンガータンパク質
のコピーを含む。
【００２９】 一実施形態において、第１および第２のジンクフィンガータンパク質は、プロ
モーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベ
クターによってコードされ、ここで、この方法は、細胞にこの発現ベクターを投
与する第１の工程をさらに包含する。一実施形態において、ジンクフィンガータ
ンパク質の発現は、外因性薬剤の投与によって引き起こされる。一実施形態にお
いて、ジンクフィンガータンパク質の発現は、低分子の制御下にある。一実施形
態において、第１のジンクフィンガータンパク質の発現および第２のジンクフィ
ンガータンパク質の発現は、異なる低分子の制御下にあり、ここで第１および第
２のジンクフィンガータンパク質の両方は、調節ドメインを含む融合タンパク質
であり、そしてここで、第１および第２のジンクフィンガータンパク質は同一の
細胞において発現される。一実施形態において、第１および第２のジンクフィン
ガータンパク質の両方は、レプレッサである調節ドメインを含む。一実施形態に
おいて、第１のジンクフィンガータンパク質は、活性化剤である調節ドメインを
含み、そして第２のジンクフィンガータンパク質は、レプレッサである調節ドメ
インを含む。
【００３０】 一実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形
態において、発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発
現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである。一実施形態において、ジンクフ
ィンガータンパク質は、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によっ
てコードされる。
【００３１】 一実施形態において、標的部位は、候補遺伝子の転写開始部位の上流である。
一実施形態において、標的部位は、候補遺伝子の転写開始部位の下流である。一
実施形態において、標的部位は、候補遺伝子の転写開始部位に隣接している。別
の実施形態において、標的部位は、候補遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポ
リメラーゼ停止部位に隣接している。
【００３２】 （発明の詳細な説明） （導入） 本明細書中に記載される場合、本発明は、遺伝子発現の表現型結果および機能
を決定するためのアッセイにおいて使用されるジンクフィンガータンパク質を提
供する。集中した大量の配列決定の努力と組み合わせて、分析技術における最近
の発達は、以前に入手可能であったよりも多くの多数の分子標的を同定および特
徴付けるための機会を創出してきた。遺伝子およびこれらの機能についてのこの
新しい情報は、基本的な生物学的理解に沿って速度を増し、そして、治療処置の
ための多数の新しい標的を提供する。いくつかの場合では、分析用ツールは、新
しいデータの産生に追いついていない。例は、グローバル差次的遺伝子発現の測
定における最近の発達によって提供される。これらの方法は、遺伝子発現マイク
ロアレイ、差次的なｃＤＮＡクローニング頻度、減算的ハイブリダイゼーション
および差次的表示法によって代表されるが、異なった組織においてかまたは特定
の刺激に応答して上方制御または下方制御される遺伝子を非常に迅速に同定し得
る。ますます、このような方法が、形質転換、腫瘍進行、炎症性反応、神経学的
障害などの生物学的プロセスを探求するために使用されている。当業者は、所定
の生理学的現象と相関する差次的に発現される遺伝子の長い列挙を、現在非常に
簡単に作製し得るが、差次的に発現された遺伝子と表現型との間の原因となる関
係を示すことは困難である。現在まで、差次的に発現された遺伝子に機能を割り
当てるための簡単な方法は、差次的な遺伝子発現をモニターする能力に追いつい
ていない。
【００３３】 しかし、ジンクフィンガータンパク質技術は、差次的な遺伝子発現研究を迅速
に分析するために使用され得る。操作されたジンクフィンガータンパク質は、任
意の候補標的遺伝子を上方制御または下方制御するために簡単に使用され得る。
遺伝子特異的ＤＮＡ結合ドメインを作製するために配列情報はほとんど必要では
ない。このことは、ジンクフィンガータンパク質技術を、不十分に特徴付けられ
た差次的に発現された遺伝子の長い列挙の分析に理想的なものにする。当業者は
、それぞれの候補遺伝子についてジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメイン
を簡単に作製し、人工転写因子を上方制御および下方制御するキメラを作製し、
そして、モデル系において１つずつ候補遺伝子をオンまたはオフに切り替えるこ
とによって、研究中の表現型（形質転換、サイトカインに対する応答など）につ
いて上方制御または下方制御した結果を試験し得る。
【００３４】 さらに、より大きな実験コントロールは、より慣例的な方法によって達成され
得るジンクフィンガータンパク質によって与えられ得る。これは、操作されたジ
ンクフィンガータンパク質の産生および／または機能が、低分子の制御下に配置
され得るためである。このアプローチの例は、Ｔｅｔ−Ｏｎシステム、エクジソ
ン制御システムおよび変異体プロゲステロンレセプターを含むキメラ因子を取り
込むシステムによって提供されるためである。これらのシステムは全て、低分子
制御下にジンクフィンガータンパク質調節因子の機能および／または発現を配置
することによって、目的の任意の候補遺伝子または任意の導入遺伝子に対して、
間接的に低分子制御を付与し得る。１つの実施形態において、細胞は２つのジン
クフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質は、２つの異なっ
た候補遺伝子（すなわち、同一の表現型に関連した２つの遺伝子）、または同一
の候補遺伝子上の２つの異なった標的部位のいずれかを標的化する。それぞれの
ジンクフィンガータンパク質はまた、調節ドメインを含む。それぞれのジンクフ
ィンガータンパク質の発現は、異なった低分子制御下に存在し、遺伝子発現の活
性化または抑制の程度におけるバリエーションを可能にする。
【００３５】 従って、本出願は、遺伝子または選択された表現型に関連する遺伝子を例えば
、薬物発見の標的妥当性についてかまたは機能的ゲノム学について同定するため
にジンクフィンガータンパク質を用いる方法を初めて提供する。本発明は、高い
効率で、特異的に遺伝子を認識するように操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結
合タンパク質を提供する。ジンクフィンガータンパク質を使用する遺伝子発現の
調節は、遺伝子の生物学的機能、またはＥＳＴによって示される遺伝子を決定す
るために、そして、薬物発見のための潜在的な標的遺伝子の機能を確証するため
に使用される。
【００３６】 １つの実施形態では、それぞれの遺伝子を調節するために異なったジンクフィ
ンガータンパク質を使用して、少なくとも２つの異なった遺伝子の発現が調節さ
れている。その遺伝子の一方は候補遺伝子であり、そして、他方の遺伝子はコン
トロール遺伝子または第２の候補遺伝子であり得る。遺伝子を発現する細胞は、
ジンクフィンガータンパク質、またはジンクフィンガータンパク質をコードする
核酸と接触される。両方の遺伝子は、同一の細胞で発現され得るか、または、こ
れらの遺伝子は、異なった細胞でそれぞれ発現され得る。第１および第２の遺伝
子の発現が、ジンクフィンガータンパク質によって調節された後、細胞は選択さ
れた表現型変化についてアッセイされ、これによって、候補遺伝子の機能を同定
する。別の実施形態において、２つのジンクフィンガータンパク質は、２つの異
なった部位で、同一の候補遺伝子を標的化する。本発明の方法は、機能的ゲノム
学（特定の表現型と関連した遺伝子を同定することに代表的に関しする）、およ
び標的の確証（薬物発見アッセイにおける使用に適切な遺伝子を同定することに
代表的に関する）の両方に適用される。
【００３７】 結果として、本発明のジンクフィンガータンパク質は、遺伝子転写の活性化お
よび／または抑制の両方を介して、選択された表現型の原因となる遺伝子を同定
するために使用され得る。プロモーター領域に結合するジンクフィンガータンパ
ク質は、本発明で使用され得るが、ジンクフィンガータンパク質はまた、遺伝子
の他の領域に結合することによって、遺伝子発現を調節し得る。従って、ジンク
フィンガータンパク質を使用して、候補遺伝子の発現を調査するために、広範な
配列情報は必要ではない。従って、ＥＳＴは、これらの生物学的機能を決定する
ために、本発明のアッセイにおいて使用され得る。
【００３８】 さらに、ジンクフィンガータンパク質はまた、調節ドメインに連結され得、転
写を活性化するためかまたは抑制するためのキメラ転写因子を作製する。１つの
実施形態では、ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子が低分子によっ
て制御される分子スイッチに連結される場合、調節の方法は、ジンクフィンガー
タンパク質を使用する。従って、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子発現は条
件的であって、そして低分子を使用して調節され得、これによって、候補遺伝子
発現の条件的な調節を提供する。
【００３９】 このような機能的ゲノム学アッセイは、新規のヒトおよび哺乳動物治療適用の
発見を可能とし、例えば、遺伝的疾患、癌、真菌感染、原生動物感染、細菌感染
、およびウイルス感染、虚血、血管性疾患、関節炎、免疫障害などの処置のため
の新規薬物の発見を含む。表現型における変化についてのアッセイ系の例として
は、例えば、形質転換アッセイ（例えば、増殖、足場依存性、増殖因子依存性、
病巣形成における変化、軟寒天における増殖、ヌードマウスにおける腫瘍増殖、
およびヌードマウスにおける腫瘍血管新生）；アポトーシスアッセイ（例えば、
ＤＮＡラダー化および細胞死、アポトーシスに関与する遺伝子の発現）；シグナ
ル伝達アッセイ（例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３にお
ける変化、ホルモンおよび神経伝達物質の放出における変化）；レセプターアッ
セイ（例えば、エストロゲンレセプターおよび細胞増殖）；増殖因子アッセイ（
例えば、ＥＰＯ、低酸素および赤血球コロニー形成ユニットアッセイ）；酵素産
物アッセイ（例えば、ＦＡＤ−２誘導性油不飽和化）；転写アッセイ（例えば、
レポーター遺伝子アッセイ）；ならびにタンパク質産生アッセイ（例えば、ＶＥ
ＧＦ ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００４０】 １つの実施形態では、多数の候補遺伝子が提供され、そして、最初のジンクフ
ィンガータンパク質が、候補遺伝子の１つの発現を調節するために使用されるが
、他の候補遺伝子の発現パターンが調査される。この工程は、それぞれの候補遺
伝子について反復され、そして、発現パターンにおける変化は、遺伝子の生物学
的機能を決定するために使用される。次いで、この発現データは、選択された表
現型に関連する経路における遺伝子の順序またはカスケードを再構築するために
分析され得る。
【００４１】 本明細書に記載のように、ジンクフィンガータンパク質は、選り抜きの任意の
コントロールまたは候補遺伝子の発現の調節のための、任意の適切な標的を認識
するよう設計され得る。調節に適切な標的遺伝子の例としては、以下が挙げられ
る；ＶＥＧＦ，ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ
Ｃ、Ｓ、Ｘ，およびＰ，ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲ
ン、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＴＮ
Ｆ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿
因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤ
ＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフ
ィン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦレセプターｆｌｔおよびｆｌｋ
、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンギオスタチ
ン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴ
Ｉ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、ＦＡＤ２−１、Δ−１２
デサチュラーゼ、Δ―９デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、アセチルＣ
ｏＡカルボキシラーゼ、アシルＡＣＰチオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピ
ロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素、セルロースシンターゼ、スクロースシン
ターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアー
ゼ、ウイルス遺伝子、原生生物遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子。一般に
、調節されるに適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂
促進因子、走化因子、癌活性（ｏｎｃｏ−ａｃｔｉｖｅ）因子、レセプター、カ
リウムチャネル、Ｇ−タンパク質、シグナル伝達分子および他の疾患関連遺伝子
。
【００４２】 候補遺伝子は、当該分野で公知の方法（例えば、遺伝子発現マイクロアレイ、
差次的ｃＤＮＡクローニング頻度、減算的ハイブリダイゼーション、差次的表示
法によって、目的の細胞または組織からＥＳＴをクローニングすることによって
、ノックアウトの際に致死である遺伝子を同定することによって、特定の発育的
もしくは細胞内事象または発育的もしくは細胞内刺激に応答して上方制御または
下方制御される遺伝子を同定することによって；特定の疾患および病理学的状態
において上方制御または下方制御される遺伝子を同定することによって、変異お
よびＲＦＬＰを同定することによって、遺伝疾患に関連することが公知の染色体
領域と関連した遺伝子を同定することによって、一過的に調節される遺伝子（例
えば、病原性生物において）、ＳＮＰなどに基づいた差異を同定することによっ
て）選択される。
【００４３】 転写因子機能における一般的なテーマは、プロモーターに対する単純な結合お
よび、いくつかの場合において、十分な近接が、一般に必要とされる全てのもの
であることである。プロモーターに対する正確な位置取り、方向、および限界内
での距離は、それほど重要な事項でない。いくつかの場合において、エンハンサ
ーは、目的の遺伝子から大きく離れた距離に位置することが見出される。さらに
、遺伝子発現の抑制のために、しばしば、転写開始の単純な立体的妨害が十分で
ある。これらの特徴は、ジンクフィンガータンパク質のための標的部位の選択に
おいて相当の柔軟性を可能にする。従って、ジンクフィンガータンパク質により
認識される標的部位は、ジンクフィンガータンパク質（必要に応じて、調節ドメ
インに連結される）による遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする標的遺伝
子における任意の適切な部位であり得る。好ましい標的部位は、転写開始部位に
隣接する領域、転写開始部位の下流の領域、または転写開始部位の上流の領域を
含む。さらに、標的部位はまた、エンハンサー領域、リプレッサー部位、ＲＮＡ
ポリメラーゼ停止部位、および特定の調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素
応答エレメント、核レセプター認識因子、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領
域中の部位、または発現配列タグ（ＥＳＴ）コード領域中の部位に位置する。以
下に記載のように、代表的に各々のフィンガーは、２〜４塩基対を認識し、２つ
のフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、４〜７ｂｐの標的部位に結合し
、３つのフィンガーのジンクフィンガータンパク質は６〜１０塩基対の部位に結
合し、そして６つのフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、２つの隣接す
る標的部位（各々の標的部位は、６〜１０塩基対を有する）に結合する。
【００４４】 関連したジンクフィンガータンパク質または個々のジンクフィンガータンパク
質のいずれかによって隣接した標的部分を認識することが、ジンクフィンガータ
ンパク質の増強された結合を産生するために使用され得、それらの標的部位に個
々に結合する場合、ジンクフィンガータンパク質の親和性よりも大きい親和性を
生じる。１つの実施形態では、６フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、
アミノ酸リンカーによって連結された融合タンパク質として産生され、そして、
ジンクフィンガータンパク質は約１８塩基対標的部位を認識する（例えば、Ｌｉ
ｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５２５−
５５３０（１９９７）を参照のこと）。１８塩基対標的部位は、ヒトゲノムにお
いて特異性を提供することが推定される。なぜなら、そのサイズの標的部位は、
３×１０10塩基対毎に１度のみ生じるべきであり、そして、ヒトゲノムのサイズ
は３．５×１０9塩基対であるためである（例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５２５−５５３０（１９９７）を
参照のこと）。別の実施形態において、６フィンガーのジンクフィンガータンパ
ク質の２つの３フィンガー部分は、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末
端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介して共有結合される（例えば
、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５３９（１９９１），Ｂａｒａｈｍ
ａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３
８２：８２２−８２６（１９９６）を参照のこと）。
【００４５】 本明細書中で記載されるように、２つのジンクフィンガータンパク質は、異な
った標的遺伝子（例えば、候補遺伝子および制御遺伝子、または２つの候補遺伝
子、または同じ遺伝子についての２つの異なった標的部位）を認識する細胞に投
与される。必要に応じて、複数のジンクフィンガータンパク質が投与され得、そ
のタンパク質は、同じ遺伝子における２つ以上の異なった標的部位を認識する。
２つの候補遺伝子が調査される場合、第１および第２の遺伝子の両方は、表現型
ごとに必要とされ得る。候補遺伝子は、内因性または外因性遺伝子であり得る。
１つの実施形態において、１つ以上の候補遺伝子は、選択された表現型に関連す
る。
【００４６】 別の実施態様において、ジンクフィンガータンパク質を、以下に記載の少なく
とも１以上の調節ドメインに連結する。好ましい調節ドメインとしては、転写因
子リプレッサーまたはアクチベータードメイン（例えば、ＫＲＡＢおよびＶＰ１
６）、コリプレッサーおよびコアクチベータードメイン、ＤＮＡメチルトランス
フェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、
およびエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が挙げられる。遺伝子発現の抑
制については、代表的に、その遺伝子の発現は、約２０％まで（すなわち、８０
％の非ジンクフィンガータンパク質調節発現）、より好ましくは約５０％まで（
すなわち、５０％の非ジンクフィンガータンパク質調節発現）、より好ましくは
約７５〜１００％まで（すなわち、２５〜０％の非ジンクフィンガータンパク質
調節発現）減少される。遺伝子発現の活性化については、代表的に発現は、約１
．５倍まで（すなわち、１５０％の非ジンクフィンガータンパク質調節発現）、
好ましくは、２倍（すなわち、２００％の非ジンクフィンガータンパク質調節発
現）、より好ましくは、約５〜１０倍（すなわち、５００〜１０００％の非ジン
クフィンガータンパク質調節発現）、少なくとも１００倍以上まで活性化される
。
【００４７】 操作されたジンクフィンガータンパク質アクチベーターおよびリプレッサーの
発現はまた、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎおよび
Ｂｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５
５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：４９１−４
９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１
９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４７−１１５５（１９９
６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７
−７６１（１９９８）を参照のこと）により分類化された低分子系により制御さ
れ得る。これらは、ジンクフィンガータンパク質アクチベーターおよびリプレッ
サーの発現に対する低分子の制御を与え、従って、目的の標的遺伝子に対する低
分子の制御を与える。この有利な特徴は、細胞培養モデル、およびトランスジェ
ニック動物および植物において使用され得る。
【００４８】 （定義） 本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それら
に起因する意味を有する。
【００４９】 「候補遺伝子」とは、細胞、ウイルス、エピソーム、微生物、原生動物、真菌
、動物、植物、葉緑体、またはミトコンドリアの遺伝子をいう。この用語はまた
、微生物またはウイルス感染細胞において天然に存在する微生物またはウイルス
ゲノムの一部である微生物またはウイルス遺伝子をいう。この微生物またはウイ
ルスゲノムは染色体外ゲノムであるか、または宿主染色体に導入され得る。この
用語はまた、内因性または外因性遺伝子ならびにＥＳＴとして同定された細胞性
遺伝子を包含する。しばしば、本発明の候補遺伝子は、生物学的機能が未知の遺
伝子である。選り抜きのアッセイは、この遺伝子が、ジンクフィンガータンパク
質を有する候補遺伝子発現の調節の際に、選択された表現型に関連しているか否
かを決定するために使用される。生物学的機能が公知の場合、代表的に候補遺伝
子は、コントロール遺伝子として作用するか、または、１つ以上のさらなる遺伝
子が、同じ表現型に関連しているか否かを決定するために使用されるか、または
、この遺伝子が、特定の表現型において他の遺伝子と関連しているか否かを決定
するために使用される。
【００５０】 「選択された表現型」は、任意の表現型（例えば、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）
、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、細胞形態、酵素機能、シグナル伝
達、発現パターン、下流発現パターン、レポーター遺伝子活性化、ホルモン放出
、増殖因子放出、神経伝達物質放出、リガンド結合、アポトーシス、および産物
形成における変化などのアッセイにおいて測定され得る任意の観察可能な特徴ま
たは機能的効果）をいう。このようなアッセイとしては、形質転換アッセイ（例
えば、増殖、足場依存性、増殖因子依存性、病巣形成における変化、軟寒天にお
ける増殖、ヌードマウスにおける腫瘍増殖、およびヌードマウスにおける腫瘍血
管新生）；アポトーシスアッセイ（例えば、ＤＮＡラダー化および細胞死、アポ
トーシスに関与する遺伝子の発現）；シグナル伝達アッセイ（例えば、細胞内カ
ルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３における変化、ホルモンおよび神経伝達
物質の放出における変化）；レセプターアッセイ（例えば、エストロゲンレセプ
ターおよび細胞増殖）；増殖因子アッセイ（例えば、ＥＰＯ、低酸素および赤血
球コロニー形成ユニットアッセイ）；酵素産物アッセイ（例えば、ＦＡＤ−２誘
導性油不飽和化）；転写アッセイ（例えば、レポーター遺伝子アッセイ）；なら
びにタンパク質産生アッセイ（例えば、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００５１】 候補遺伝子は、候補遺伝子の遺伝子発現の調節が、選択された表現型における
変化の原因となる場合、選択された表現型に「関連して」いる。
【００５２】 用語「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」とは、ジンクにより安
定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のＤＮＡ結合ド
メインは、代表的に「フィンガー」といわれ、１つのジンクフィンガータンパク
質は、少なくとも１つのフィンガーを有し、代表的には、２つのフィンガー、３
つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。各々のフィンガーは、２〜
４塩基対のＤＮＡに結合し、代表的には３〜４塩基対のＤＮＡに結合する。ジン
クフィンガータンパク質は、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列
に結合する。各々のフィンガーは、代表的に、約３０アミノ酸の、ジンクを構成
するＤＮＡ結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の一つのクラス（Ｃｙ
ｓ2Ｈｉｓ2クラス）を特徴づけする例示的なモチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）2-4
Ｃｙｓ−（Ｘ）12−Ｈｉｓ−（Ｘ）3-5−Ｈｉｓ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸
）である。研究により、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβター
ンの２つのシステイン残基を伴うジンクに結合する２つの無関係なヒスチジン残
基を含むαへリックスからなることが実証されている（例えば、Ｂｅｒｇおよび
Ｓｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１−１０８５（１９９６）を参照のこ
と）。
【００５３】 「標的部位」はジンクフィンガータンパク質により認識される核酸配列である
。単一の標的部位は代表的に約４〜約１０の塩基対を有する。代表的に、２つの
フィンガー化（Ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、４〜７塩基
対の標的部位を認識し、３つのフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、６
〜１０塩基対の標的部位を認識し、６つのフィンガー化ジンクフィンガータンパ
ク質は、２つの隣接した９〜１０塩基対の標的部位を認識する。
【００５４】 用語「隣接標的部位」とは、０〜約５塩基対離れた非重複の標的部位をいう。
【００５５】 「Ｋd」とは、化合物の解離定数をいい、すなわち、所定のアッセイ系（例え
ば、米国特許第５，７８９，５３８号を参照のこと）を用いて測定した場合に、
所定の条件下（すなわち、［標的濃度］＜＜Ｋdの場合）でその標的に対する化
合物の最大の結合の半分を与える（すなわち、その化合物の分子の半分が、標的
に結合する）化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の濃度をいう。Ｋ d を測定するために用いるアッセイ系は、それがジンクフィンガータンパク質の
実際のＫdの最も正確な測定を与えるように選択されるべきである。ジンクフィ
ンガータンパク質の実際のＫdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系を
使用し得る。一つの実施態様において、本発明のジンクフィンガータンパク質の
Ｋdを、本明細書中に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ（「Ｅ
ＭＳＡ」）を、使用して測定する。ジンクフィンガータンパク質の純度または活
性について調整されないかぎり、本明細書中に記載される方法を使用して行なわ
れるＫdの計算は、所定のジンクフィンガータンパク質の実際のＫdの過少評価を
生じ得る。必要に応じて、候補遺伝子の転写調節に使用されるジンクフィンガー
タンパク質のＫｄは、約１００ｎＭ未満、より好ましくは、７５ｎＭ未満、より
好ましくは、約５０ｎＭ未満、最も好ましくは、約２５ｎＭである。
【００５６】 句「転写開始部位に隣接する」とは、転写開始部位の上流または下流のいずれ
かの約５０塩基内にある標的部位をいう。転写開始部位の「上流」とは、転写開
始部位から５’側へ約５０塩基超える標的部位をいう。転写開始部位の「下流」
とは、転写開始部位から３’側へ約５０塩基超える標的部位をいう。
【００５７】 句「ＲＮＡポリメラーゼ終止部位（ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅ）」は、Ｕｐｔａｉ
ｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１１７−１７２（１９９７）
に記載されている。
【００５８】 発現ベクター、核酸、ジンクフィンガータンパク質または送達ビヒクルを、細
胞に「投与する（こと）」とは、形質導入、トランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、転座、融合、食作用、または微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）方
法など、すなわち、タンパク質または核酸が、細胞膜を横切って、そして好まし
くは細胞の核へと輸送され得る任意の手段を含む。これらには、裸のＤＮＡの投
与が含まれる。
【００５９】 「送達ビヒクル」とは、ジンクフィンガータンパク質を投与するために使用さ
れる化合物（例えば、リポソーム、毒素または膜移行ポリペプチド）をいう。送
達ビヒクルはまた、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を投与するた
めに使用され得る（例えば、脂質：核酸複合体、発現ベクター、ウイルスなど）
。
【００６０】 用語、遺伝子の「発現を調節する」、遺伝子の「発現を阻害する」、および遺
伝子の「発現を活性化する」とは、ジンクフィンガータンパク質が遺伝子の転写
を活性化または阻害する能力をいう。活性化には、転写阻害の防御（すなわち、
遺伝子発現の抑制の防御）を含まれ、そして阻害には、転写活性化の防御（すな
わち、遺伝子活性化の防御）を含む。
【００６１】 「遺伝子発現の抑制を防御する遺伝子発現の活性化」とは、ジンクフィンガー
タンパク質がリプレッサー分子の結合をブロックまたは防御する能力をいう。
【００６２】 「遺伝子活性化を防御する遺伝子発現の阻害」とは、ジンクフィンガータンパ
ク質が、アクチベーター分子の結合をブロックまたは防御する能力をいう。
【００６３】 調節は、その標的遺伝子の発現によって間接的にまたは直接的に影響を受ける
任意のパラメータを決定することによってアッセイされ得る。そのようなパラメ
ータとしては、例えば、本明細書中に記載されるような、ＲＮＡまたはタンパク
質レベルにおける変化、タンパク質活性における変化、産物レベルにおける変化
、下流の遺伝子発現における変化、レポーター遺伝子転写における変化（ルシフ
ェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ＧＦＰ（例
えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４（１９９７））；シグナル伝達における変化
、リン酸化および脱リン酸化、レセプター−リガンド相互作用、セカンドメッセ
ンジャー濃度（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３およびＣａ2+）、細胞増殖
、および新生血管形成などが挙げられる。これらのアッセイは、インビトロ、イ
ンビボおよびエキソビボであり得る。そのような機能的効果は、当業者に公知の
任意の手段（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルの測定、ＲＮＡ安定性の
測定、下流またはレポーター遺伝子発現の同定（例えば、化学発光、蛍光、比色
反応、抗体結合、誘導性マーカー、リガンド結合アッセイを介する）；細胞内セ
カンドメッセンジャー（例えば、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３
））における変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；サイトカイン放出な
どにより測定され得る。
【００６４】 ジンクフィンガータンパク質によって遺伝子発現調節のレベルを決定するため
に、ジンクフィンガータンパク質と接触させた細胞を、コントロール細胞（例え
ば、ジンクフィンガータンパク質なし、または非特異的なジンクフィンガータン
パク質を用いる）と比較して、阻害または活性化の程度を試験する。コントロー
ルサンプルには、１００％の相対的な遺伝子発現活性値を与える。遺伝子発現の
調節／阻害は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、約８０％、
好ましくは５０％（すなわち、そのコントロールの０．５倍の活性）、より好ま
しくは２５％、より好ましくは５〜０％である場合に達成される。遺伝子発現の
調節／活性化は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、１１０％
、より好ましくは１５０％（すなわち、そのコントロールの１．５倍の活性）、
より好ましくは２００％〜５００％、より好ましくは１０００％〜２０００％ま
たはそれを超える場合に達成される。
【００６５】 「転写アクチベーター」および「転写リプレッサー」とは、上記のように、転
写を調節する能力を有するタンパク質またはタンパク質のエフェクタードメイン
をいう。そのようなタンパク質としては、例えば、転写因子および補因子（例え
ば、ＫＲＡＢ、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、核因子κＢサブユニットｐ６５、初期
増殖応答因子１、および核ホルモンレセプター、ＶＰ１６、ＶＰ６４），エンド
ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられ
る。アクチベーターおよびリプレッサーとしては、コアクチベーターおよびコリ
プレッサー（例えば、Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４９８−５０２（
１９９８）を参照のこと）が挙げられる。
【００６６】 「調節ドメイン」とは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガータ
ンパク質）に係留される場合に転写調節活性を有する、タンパク質またはタンパ
ク質ドメインをいう。代表的には、調節ドメインは、ジンクフィンガータンパク
質に共有結合的または非共有結合的に連結されて、転写調節をもたらす。あるい
は、ジンクフィンガータンパク質は、単独で調節ドメインを伴わずに転写調節を
もたらすように作用し得る。
【００６７】 用語「異種」とは、相対的な用語であり、核酸の部分に関して使用される場合
は、その核酸が、天然に互いに同じ関係にあるとは見い出されない２つ以上のサ
ブ配列を含むことをいう。例えば、組換え産生される核酸は、代表的に、新たな
機能的核酸を作製するために、合成的に整列させた無関連の遺伝子からの２以上
の配列を有する（例えば、１つの供給源からの１つのプロモーターおよび別の供
給源からのコード領域）。従って、この２つの核酸は、この状況下で互いに異種
である。細胞に添加される場合、その組換え核酸はまた、その細胞の内因性遺伝
子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色体に組み込
まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存
在しない）染色体外核酸を含む。
【００６８】 同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然で互いに同じ関係にある
とは見い出されない２以上のサブ配列を含むことをいう（例えば、２つのサブ配
列が単一の核酸配列によってコードされる「融合タンパク質」）。例えば、組換
え技術への手引きついては、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出を参照のこと。
【００６９】 用語「組換え」とは、例えば、細胞または核酸、タンパク質もしくはベクター
に関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種
核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブの核酸もしくはタンパク質の変
更によって改変されているということか、あるいは、その細胞が、そのように改
変された細胞に由来することをいう。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞
のネイティブ（天然に存在する）形態には見い出されない遺伝子を発現するか、
あるいは通常もしくは異常に発現されるか、過小発現されるかもしくは全く発現
されない、ネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。
【００７０】 「プロモーター」とは、転写を指向する一連の核酸制御配列として定義される
。本明細書において使用される場合、プロモーターとしては、代表的には、転写
開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、特定のＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロ
モーターの場合は、ＴＡＴＡエレメント、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、
ＳＰ−１部位など）が挙げられる。本明細書において使用される場合、プロモー
ターはまた、必要に応じて、遠位エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエ
レメントを含み、これらのエレメントは、転写開始部位から数千塩基対ほどに位
置し得る。このプロモーターは、しばしば、ポリペプチド（例えば、核レセプタ
ー、Ｇａｌ４、ｌａｃリプレッサーなど）のようなＤＮＡ結合部分によるトラン
ス活性化に応答性であるエレメントを有する。
【００７１】 「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件の下で活性で
あるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、特定の環境条件または発
生条件の下で活性であるプロモーターである。
【００７２】 用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモータ
ーまたは一連の転写因子結合部位）と第２の核酸との間の機能的連結をいい、こ
こで、この発現制御配列は、その第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００７３】 「発現ベクター」とは、一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え生成ま
たは合成的に生成された核酸構築物である。このエレメントによって、宿主細胞
における特定の核酸の転写が可能となり、そして必要に応じて、宿主細胞におけ
る発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする。発現ベクターは、ウイルス起
源または非ウイルス起源の、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一
部であり得る。代表的に、発現ベクターは、「発現カセット」を備え、これは、
プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。用語、発現
ベクターはまた、プロモーターに作動可能に連結された裸のＤＮＡを含む。
【００７４】 「宿主細胞」とは、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガータン
パク質をコードする発現ベクターもしくは核酸を含む細胞を意味する。この宿主
細胞は、代表的に、その発現ベクターの複製または発現を支持する。宿主細胞は
、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、酵母、
真菌、原生動物、高等植物、昆虫または両生類の細胞、あるいはＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、２９３、ＣＯＳ−１などのような哺乳動物細胞）であり得、例えば、培養細
胞（インビトロ）、外植片および初代培養物（インビトロおよびエキソビボ）な
らびにインビボの細胞であり得る。
【００７５】 「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボ
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語
は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連結を含む
核酸を含み、これは、合成のもの、天然に存在するもの、および天然に存在しな
いものであり、参照核酸と類似の結合特性を有する。そのようなアナログの例と
しては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチル
ホスホネート、キラルのメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド
、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００７６】 他に言及しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的改変されたその改変体（
例えば、縮重コドン置換体）およびその相補的配列、ならびに明示的に示された
配列を黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、１以上の選択された（ま
たはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に
置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓ
ｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４
））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【００７７】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残
基の重合体をいうために本明細書において交換可能に使用される。この用語はま
た、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な人工
模倣物であるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体および天
然に存在しないアミノ酸重合体にも適用される。
【００７８】 用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならび
に天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミ
ノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードさ
れるもの、および後に改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−
カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログと
は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学的構造（すなわち、水素に結合
したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基）を有する化合物（例えば、
ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホ
ニウム）をいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシ
ン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様
の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学
構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能す
る化学的化合物をいう。
【００７９】 アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨するその一般に公
知の３文字記号によるか、または１文字記号によるかのいずれかによって言及さ
れ得る。ヌクレオチドも同様に、その一般的に受容された一文字コードによって
言及され得る。
【００８０】 「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸および核酸の配列の両方に適用さ
れる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本
質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または、その核酸は本質
的に同一の配列に対して、アミノ酸配列をコードしないことをいう。遺伝子コー
ドの縮重性のために、大多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質
をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべて
、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定され
るすべての位置にて、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更すること
なく、対応する記載されたコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸改
変体は「サイレント改変体」であり、この改変体は、保存的に改変された改変の
１種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた
、その核酸のすべての可能なサイレンと改変体を記載する。当業者は、核酸にお
ける各コドン（通常、メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧ、および
通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して
、機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。従って、ポリペプチ
ドをコードする核酸の各サイレント改変は、各々記載された配列において黙示的
である。
【００８１】 アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列におけるアミノ酸の単一
のアミノ酸または少数の割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または
付加が、その変更が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸置換で生じる場合、「
保存的に改変された改変体」であることを、認識する。機能的に類似のアミノ酸
を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変
された改変体は、本発明の多型性改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加え
て存在し、そしてこれらを除外しない。
【００８２】 以下の８グループは、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む： １）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）； ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）； ７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および ８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ） （例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）
。
【００８３】 （ジンクフィンガータンパク質の設計） 本発明のジンクフィンガータンパク質を、選択した候補遺伝子において選択し
た標的部位を認識するように操作する。代表的には、任意の適切なＣｙｓ2Ｈｉ
ｓ2ジンクフィンガータンパク質（例えば、ＳＰ−１、ＳＰ−１ＣまたはＺＩＦ
２６８）からの骨格を、操作されるジンクフィンガータンパク質についての足場
として使用する（例えば、Ｊａｃｏｂｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４５０７（１９
９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２
２６０（１９９３）を参照のこと）。次いで、多数の方法を使用して、その標的
について高親和性を有するジンクフィンガータンパク質（例えば、好ましくは、
約２５ｎＭ未満のＫdを有する）を設計しそして選択し得る。上記のように、ジ
ンクフィンガータンパク質は、高親和性を伴って、標的の候補遺伝子における任
意の適切な標的部位に結合するように設計または選択され得る。同時係属中の特
許出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）（本明細書
中で参考として援用される）は、選択された標的部位についてのジンクフィンガ
ータンパク質の設計、構築および発現のための方法を包括的に記載する。
【００８４】 当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、ジンクフィンガータンパク質
をコードする核酸を設計および構築し得る（例えば、ファージディスプレイ、ラ
ンダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ／合理的設計、
親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーからのクローニング
、合成構築など）（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号；Ｗｕら、ＰＮＡ
Ｓ ９２：３４４−３４８（１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂ
ｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫ
ｌｕｇ、ＰＮＡＳ ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）；Ｃｈｏｏおよ
びＫｌｕｇ、ＰＮＡＳ ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）；Ｄｅｓｊ
ａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３
）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ ８９：７３４５−７３４
９（１９９２）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３−９６
（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、ＰＮＡＳ ９２：９７５２−９７５６（
１９９５）；ならびにＬｉｕら、ＰＮＡＳ ９４：５５２５−５５３０（１９９
７）；ＧｒｉｅｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：２７５：６
５７−６６１（１９９７）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ
９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を参照のこと）。
【００８５】 好ましい実施態様において、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７
（１９９９年１月１２日出願）は、標的遺伝子を選択し、そして１〜６（または
それを超える）Ｄ可能な（Ｄ−ａｂｌｅ）部位（定義については以下を参照のこ
と）を含む遺伝子内の標的部位を同定する方法を提供する。次いで、これらの方
法を使用して、ジンクフィンガータンパク質を、予め選択した部位に結合するよ
うに合成し得る。標的部位選択のこれらの方法は、標的セグメントにおける１以
上のＤ可能な部位の存在が、Ｄ可能な部位を欠く標的セグメントに結合するジン
クフィンガータンパク質と比較して、その部位に結合するように選択または設計
したジンクフィンガータンパク質において、より高い結合親和性についての可能
性を付与するという認識を一部前提とする。この洞察を支持する実験的な証拠は
、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願
）における実施例２〜９に提供される。
【００８６】 Ｄ可能な部位またはサブ部位は、単一のジンクフィンガーが、標的部位のうち
３塩基ではなく、４塩基に結合するように適切に設計されることを可能にする標
的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントの
うちの一方の鎖（標的鎖）における塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第四
の塩基に結合する（同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９
年１月１２日出願）の図２を参照のこと）。４塩基標的セグメントへの単一のジ
ンクフィンガーの結合は、標的鎖の配列上およびジンクフィンガーのアミノ酸配
列上の両方の束縛を課す。標的鎖内の標的部位は、「Ｄ可能な」部位のモチーフ
５’ＮＮＧＫ３’を含むべきである。ここで、ＮおよびＫは、慣用されるＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢの多義性（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）コードである。そのような部位へ
の結合のためのジンクフィンガーは、−１位にアルギニン残基、および＋２位に
アスパラギン酸（または、好ましさは低いが、グルタミン酸）を含むべきである
。−１位のアルギニン残基は、Ｄ可能な部位におけるＧ残基と相互作用する。ジ
ンクフィンガーの＋２位でのアスパラギン酸（またはグルタミン酸）残基は、Ｄ
可能な部位のＫ塩基と相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。Ｄ可能な部位と
の名称を付与するのは、アスパラギン酸（シンボルＤ）と反対の鎖の塩基（第四
の塩基）との間の相互作用である。Ｄ可能な部位の式から明らかなように、２つ
のサブタイプのＤ可能な部位が存在する：５’ＮＮＧＧ３’および５’ＮＮＧＴ
３’。前者の部位について、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸または
グルタミン酸は、Ｄ可能な部位の反対の鎖におけるＣと相互作用する。後者の部
位において、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は
、Ｄ可能な部位の反対の鎖におけるＡと相互作用する。一般的に、ＮＮＧＧが、
ＮＮＧＴよりも好ましい。
【００８７】 ３つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質の設計において、標的
部位は、そのタンパク質の少なくとも１つのフィンガーおよび必要に応じて２ま
たは３つすべてのフィンガーがＤ可能な部位に結合する可能性を有するように選
択されるべきである。そのようなものは、式５’−ＮＮｘ ａＮｙ ｂＮｚｃ−
３’を有するより大きな標的遺伝子内から標的部位を選択することによって達成
され得る。ここで、 （ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）のセットの各々は、（Ｎ，Ｎ）また
は（Ｇ，Ｋ）のいずれかであり； （ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の少なくとも１つは、（Ｇ，Ｋ）で
あり、そして ＮおよびＫは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの多義性コードである。
【００８８】 換言すれば、（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の３つのセットの少な
くとも１つが、セット（Ｇ，Ｋ）であるとは、そのセットの一位がＧであり、そ
して二位がＧまたはＴであるという意味である。（Ｇ，Ｋ）ではない３つのセッ
トのもの（ある場合）が、（Ｎ，Ｎ）であるとは、そのセットの一位が任意のヌ
クレオチドによって占有され得、そしてそのセットの二位が任意のヌクレオチド
によって占有され得ることを意味する。例として、セット（ｘ、ａ）は、（Ｇ，
Ｋ）であり得、そしてセット（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）は、両方とも（Ｎ，Ｎ
）であり得る。
【００８９】 式５’−ＮＮｘ ａＮｙ ｂＮｚｃ−３’において、ＮＮｘ ａＮｙおよびｂ
Ｎｚｃのトリプレットは、ジンクフィンガータンパク質における３つのフィンガ
ーによって結合される標的鎖上の塩基のトリプレットを表す。ｘ、ｙおよびｚの
１つのみがＧであり，そしてこのＧにＫが続く場合、その標的部位は単一のＤ可
能なサブ部位を含む。例えば、ｘのみがＧであり、そしてａがＫである場合、そ
の部位は、
【００９０】
【化１】 であり、ここで、Ｄ可能なサブ部位を強調表示する。ｘおよびｙの両方がＧであ
るがｚはＧでなく、そしてａおよびｂがＫである場合、その標的部位は、以下の
ように２つの重複するＤ可能なサブ部位を有する：
【００９１】
【化２】 であり、このような部位の一方を、ボールドで表し、そして他方を斜体字で表す
。ｘ、ｙおよびｚの３つすべてがＧであり、そしてａ、ｂおよびｃがＫである場
合、その標的セグメントは、以下のような３つのＤ可能なサブ部位を含む：
【００９２】
【化３】 ここで、Ｄ可能なサブ部位は、ボールド、斜体字、および下線によって表される
。
【００９３】 従って、これらの方法は、上記のように、標的遺伝子を選択し、そして式５’
−ＮＮｘ ａＮｙ ｂＮｚｃ−３’に適合する標的部位についてその遺伝子の可
能なサブ配列内を系統的に検索することによって作用する。いくつかのそのよう
な方法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の１０の連続する塩基の
全ての可能なサブ配列を評価して、その配列が上記の式に適合するか否か、およ
びそうであれば、どれだけのＤ可能な部位が存在するかを決定する。代表的には
そのような比較は、コンピュータによって実行され、そしてその式に適合する標
的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、どれだけ
多くのＤ可能な部位が存在するかに従って、異なるサブセットにおいて出力され
得る。
【００９４】 変形において、本発明の方法は、第一および第二の標的セグメントを同定する
。これら各々は、上記の式に独立して適合する。そのような方法における２つの
標的セグメントは、その標的遺伝子において互いの近接または近位（すなわち、
約０〜５塩基以内）に存在するように束縛される。近位の標的セグメントの選択
の基礎をなす戦略は、それぞれ第一および第二の標的セグメントについて特異的
な２成分ジンクフィンガータンパク質の結合によって形成されるジンクフィンガ
ータンパク質の設計を可能にすることである。これらの原理は、任意の数の成分
フィンガーを有するジンクフィンガータンパク質によって結合されるべき標的部
位を選択するように拡張され得る。例えば、９フィンガータンパク質についての
適切な標的部位は、３成分セグメントを有し、ここで、各セグメントは、上記の
式に適合する。
【００９５】 上記の方法によって同定された標的部位は、他の基準による評価にさらに供さ
れ得るか、またはこれを、設計または選択（必要な場合）およびそのような部位
について特異的なジンクフィンガータンパク質の産生について直接使用し得る。
潜在的な標的部位を評価するためのさらなる基準は、遺伝子内の特定の領域に近
位であることである。ジンクフィンガータンパク質がそれ自体における細胞遺伝
子を抑制するように使用されるべき場合（すなわち、抑制性部分へのそのジンク
フィンガータンパク質の結合を伴わない）、その最適な位置は、転写開始部位、
またはその５０ｂｐ上流もしくは下流に存在するようであるか、転写複合体の形
成を阻害するようであるか（ＫｉｍおよびＰａｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２：２９７９５−２９６８０（１９９７））、または必須のエンハンサー結
合タンパク質と競合するようである。しかし、ジンクフィンガータンパク質が、
ＫＲＡＢリプレッサードメインまたはＶＰ１６アクチベータードメインのような
機能的ドメインと融合される場合、その結合部位の位置は、相当に、より可撓性
であり、そして公知の調節領域の外側に存在し得る。例えば、ＫＲＡＢドメイン
は、ＫＲＡＢが結合する場所から少なくとも３ｋｂｐまでにあるプロモーターで
の転写を抑制し得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ ９１：４５０９−４５１
３（１９９４））。従って、調節配列のような標的遺伝子を有する実証可能な生
物学的意義のセグメントを、必ずしも含まないかまたは重複しない標的部位が選
択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、そのようなセ
グメントまたは関連するセグメントへのジンクフィンガータンパク質の結合の先
行する利用可能性、および／または所定の標的セグメントを結合するような新た
なジンクフィンガータンパク質を設計する容易さを含む。
【００９６】 標的セグメントが選択された後、そのセグメントに結合するジンクフィンガー
タンパク質は、種々のアプローチによって提供され得る。アプローチの最も単純
なものは、その標的部位へ結合することがすでに公知である既存の収集物からの
予め特徴付けられたジンクフィンガータンパク質を提供することである。しかし
、多くの場合、そのようなジンクフィンガータンパク質は存在しない。既存のジ
ンクフィンガータンパク質のデータベースにおける情報およびそれらのそれぞれ
の結合親和性を使用する別のアプローチもまた、新たなジンクフィンガータンパ
ク質を設計するために使用され得る。さらなるアプローチは、上記のような置換
規則に基づいてジンクフィンガータンパク質を設計することである。なおさらな
る別のものは、ファージディスプレーのような経験的なプロセスによって所定の
標的に対する特異性を有するジンクフィンガータンパク質を選択することである
。いくつかのそのような方法において、ジンクフィンガータンパク質の各々の成
分フィンガーは、他の成分フィンガーとは独立して設計または選択される。例え
ば、各フィンガーは、異なる既存のジンクフィンガータンパク質から得られ得る
か、または各フィンガーは、別個のランダム化および選択に供され得る。
【００９７】 一旦ジンクフィンガータンパク質が所定の標的セグメントに対して選択され、
設計され、または他の方法で提供されると、そのジンクフィンガータンパク質ま
たはそれをコードするＤＮＡが合成される。ジンクフィンガータンパク質をコー
ドするＤＮＡを合成および発現するための例示的な方法は、以下に記載される。
次いで、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガータンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドは、発現の調節、またはジンクフィンガータンパク質が
結合する標的部位を含む標的遺伝子の分析のために使用され得る。
【００９８】 （ジンクフィンガータンパク質の発現および精製） ジンクフィンガータンパク質ポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝学の分野
において慣用的な技術を用いて作製され得る。本発明における一般的使用法を開
示する基本書は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９），Ｋｒｉｅｇｌ
ｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら
、編、１９９４）を含む。さらに、本質的に任意の核酸を、任意の種々の商業的
供給元に特注することが可能である。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種
々の商業的供給元に特注することが可能である。
【００９９】 代表的に、２つの代替的方法を用いて、新規に設計したＤＮＡ結合ペプチドを
発現するために必要とされるコード配列を作製する。１つ目のプロトコルは、６
つが重複するオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲに基づく構築手順である（図
１の同時係属中のＵＳＳＮ０９／２２９、０３７）。３つのオリゴヌクレオチド
は、認識へリックス間のＤＮＡ結合ドメインの部分をコードする「汎用（ｕｎｉ
ｖｅｒｓａｌ）」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジン
クフィンガー構築物について一定に保たれる。その他の３つの「特異的」オリゴ
ヌクレオチドは、認識へリックスをコードするように設計される。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、認識へリックス上の主に−１位、２位、３位および６位での
置換を含み、このことはオリゴヌクレオチドを異なるＤＮＡ結合ドメインの各々
に対して特異的にさせる。
【０１００】 ＰＣＲ合成は、２つの工程で実行される。第一に、二重鎖ＤＮＡの鋳型が、低
温度アニーリング工程での４サイクルＰＣＲ反応において、６つのオリゴヌクレ
オチド（３つは汎用、３つは特異的）を組み合わせることによって作製され、そ
れによってオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＤＮＡ「骨格」を形成する。
この骨格におけるギャップは、高忠実度熱安定ポリメラーゼ（ＴａｑおよびＰｆ
ｕポリメラーゼの組み合わせもまた十分である）によって埋められる。構築の第
二段階において、ジンクフィンガーの鋳型は、クローニングするためにいずれか
一方の末端の制限部位をシャトルベクターか、または直接発現ベクターに組み込
むために設計された外部プライマーによって増幅される。
【０１０１】 新規に設計したＤＮＡ結合タンパク質をクローニングする代替的方法は、所望
のジンクフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補的なオリゴヌクレ
オチドをアニーリングすることに依存する。この特定用途は、オリゴヌクレオチ
ドが最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。これは、通常、アニ
ーリング反応を準備する前に行われるが、キナーゼ処理はまた、アニーリング後
に起こり得る。簡単に言えば、タンパク質の定常領域をコードする「汎用」オリ
ゴヌクレオチドは、それらの相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる
。さらに、フィンガー認識へリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチ
ドは、それらのそれぞれに相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる。
これらの相補的オリゴは、上記のプロトコルにおいてポリメラーゼによって以前
に埋められた領域を埋めるために設計される。通常のオリゴ１およびフィンガー
３に相補的なオリゴは、選択したベクターへのクローニングに用いられる制限部
位に特異的な配列をオーバーハングしたままにするように操作される。第２の構
築プロトコルは、以下の局面で最初のプロトコルとは異なる：新規に設計したジ
ンクフィンガータンパク質をコードする「骨格」は、全体的に合成ＤＮＡから成
り立っており、それによってポリメラーゼの埋める（ｆｉｌｌ−ｉｎ）工程を排
除する。さらに、ベクターへクローニングされるフラグメントは、増幅を必要と
しない。最後に、配列特異的にオーバーハングしたままにする設計は、挿入フラ
グメントの制限酵素消化の必要を排除する。
【０１０２】 得られた、新規に設計したジンクフィンガータンパク質をコードするフラグメ
ントは、発現ベクターに連結される。一般的に利用される発現ベクターは、改変
化ｐＭＡＬ−ｃ２細菌発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ
，「ＮＥＢ」）または真核生物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を
含むがこれらに限定されない。
【０１０３】 当業者に公知の任意の適切なタンパク質精製の方法は、本発明のジンクフィン
ガータンパク質を精製するのに用いられ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、前出を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主が、用いられ得る（
例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など）。
【０１０４】 １つの実施態様において、細菌株ＪＭ１０９におけるマルトース結合タンパク
質（ＭＢＰ−ＺＦＰ）と融合されたジンクフィンガータンパク質の発現は、アミ
ロースカラム（ＮＥＢ）を通じた簡単な精製を可能にする。ジンクフィンガーキ
メラタンパク質の高い発現レベルは、ＩＰＴＧを用いる誘発によって得られ得る
。なぜならば、ｐＭａｌ−ｃ２発現プラスミドにおけるＭＢＰ−ＺＦＰ融合物は
、ＩＰＴＧ誘発性ｔａｃプロモーター（ＮＥＢ）の制御下にあるからである。Ｍ
ＢＰ−ＺＦＰ融合プラスミドを含む細菌は、１０μＭ ＺｎＣｌ2、０．０２％
グルコース、および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地に接種され
、そして３７℃で振盪される。指数増殖の中期にＩＰＴＧが０．３ｍＭ添加され
、そして培養物を振盪する。３時間後、細菌は、遠心分離によって収集され、超
音波処理によって破壊され、次いで不溶物質が遠心分離によって取り除かれる。
ＭＢＰ−ＺＦＰタンパク質は、アミロース結合樹脂に捕捉され、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴおよび５
０μＭ ＺｎＣｌ2を含む緩衝液で徹底的に洗浄され、次いで本質的に同じ緩衝
液中のマルトースで溶出される（精製は、ＮＥＢからの標準的プロトコルに基づ
く）。精製したタンパク質は、定量され、そして生化学的分析のために保存され
る。
【０１０５】 精製したタンパク質の生化学的特性（例えば、Ｋd）は、任意の適切なアッセ
イによって特徴づけされ得る。１つの実施態様において、Ｋdは、電気泳動移動
度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を介して特徴づけされる（Ｂｕｒａｔｏｗｓ
ｋｉおよびＣｈｏｄｏｓｈ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２．２．１−１２．２．７頁（Ａｕ
ｓｕｂｅｌ編、１９９６）；本明細書中で参考として援用される米国特許第５，
７８９，５３８号、１９９９年１月１２日に出願された米国特許出願第０９／２
２９，００７もまた参照のこと）。アフィニティーは、低固定量の標識化二重鎖
オリゴヌクレオチド標的に対して、精製したタンパク質を滴定することによって
測定される。この標的は、天然の配列に見出される３ｂｐに隣接する天然の結合
部位配列（９または１８ｂｐ）を含む。結合部位および隣接配列に対する外側は
、定常配列である。アニーリングしたオリゴヌクレオチド標的は、Ｔ４ファージ
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標的の効率的な標識化を可能にする１ｂｐの
５’オーバーハングを保有する。アッセイのために、標的は、４０ｎＭまたは４
０ｎＭ未満の濃度（実際の濃度は、最も低いタンパク質希釈度より、少なくとも
１０倍より低く保たれる）で添加され、そして反応は少なくとも４５分間平衡化
させておく。さらに、反応混合物はまた、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2、５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１０％グリセロール、０．０２％ＢＳＡ（ポリ（ｄＩｄＣ）または（ｄＡ
ｄＴ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）はまた、１０〜１００μｇ／μｌで添加され得る
）を含む。
【０１０６】 平衡化した反応物は、１０％ポリアクリルアミドゲル上にロードされる。１０
％ポリアクリルアミドゲルは、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液において４５分間、前
泳動（ｐｒｅ−ｒｕｎ）されている。結合および非結合標識標的は、１５０Ｖで
の電気泳動によって分離される（あるいは、４％ポリアクリルアミドスタッカを
含む１０〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルが用いられ得る）。乾燥したゲルは
、オートラジオグラフィーかまたはホスホロイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏ
ｉｍａｇｉｎｇ）によって可視化され、見かけ上のＫdが、最大の半分の結合を
与えるタンパク質濃度を算出することによって決定される。
【０１０７】 同様のアッセイはまた、タンパク質調製物における活性な画分を決定すること
を含み得る。活性な画分は、タンパク質が高濃度の標的ＤＮＡに対して滴定され
る化学量論的ゲルシフトによって決定される。滴定は、１００、５０、および２
５％の標的（通常、μＭレベル）で行われる。
【０１０８】 別の実施態様において、ファージ提示ライブラリーを用いて、選択された標的
部位に対して高いアフィニティーを有するジンクフィンガータンパク質を選択し
得る。この方法は、それが、変異誘発されたジンクフィンガータンパク質の多様
なライブラリーの作製、続いて、アフィニティー選択法を用いて所望のＤＮＡ結
合特性を有するタンパク質の単離を含むという点において直接の設計とは本質的
に異なる。この方法を用いるために、この実験は、代表的には以下のように進行
する。
【０１０９】 始めに、ジンクフィンガータンパク質についての遺伝子が変異誘発され、結合
特異性および／またはアフィニティーについて重要な領域へ多様性を導入する。
代表的な適用において、これは、−１位、＋２位、＋３位、および＋６位で、な
らびに＋１位、＋５位、＋８位、または＋１０位のようなおそらくアクセサリー
位置での単一のフィンガーの無作為化を介して達成される。
【０１１０】 次いで、変異誘発された遺伝子は、例えば、コートタンパク質ｐＩＩＩをコー
ドする糸状ファージの遺伝子ＩＩＩを有する融合物としてファージベクターまた
はファージミドベクターへクローニングされる。ジンクフィンガー遺伝子は、膜
輸出シグナルペプチドをコードする遺伝子ＩＩＩのセグメントとｐＩＩＩの残余
物との間に挿入され、その結果ジンクフィンガータンパク質は、成熟プロセス化
タンパク質におけるｐＩＩＩとのアミノ末端融合物として発現される。ファージ
ミドベクターが用いられる場合、変異誘発されたジンクフィンガー遺伝子はまた
、ファージ粒子へのｐＩＩＩの構築に必要とされるＣ末端領域を最小にコードす
る、短縮型バージョンの遺伝子ＩＩＩへ融合され得る。
【０１１１】 生じたベクターライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換され、そして糸状フ
ァージを産生するために用いられる。糸状ファージは、コートタンパク質ｐＩＩ
Ｉを有する融合物としてそれらの表面上に改変体ジンクフィンガータンパク質を
発現する（ファージミドベクターが用いられる場合、この工程はヘルパーファー
ジとの重感染を必要とする）。次いで、ファージライブラリーは、標的ＤＮＡ部
位とインキュベートされ、そしてアフィニティー選択法を用いて、高いアフィニ
ティーで標的に結合するファージを、大量のファージから単離する。代表的には
、ＤＮＡ標的は、固体支持体に固定化される。次いで、これは最も固く結合する
ファージ以外全てを取り除くのに十分な条件下で洗浄される。洗浄後、支持体上
に残存する任意のファージが、ジンクフィンガー−ＤＮＡ結合を完全に破壊する
条件下での溶出を介して回収される。
【０１１２】 回収したファージを用いて、新鮮なＥ．ｃｏｌｉを感染させる。次いでこれを
、増幅し、そして新しいファージ粒子のバッチを生成するために用いる。次いで
、結合工程および回収工程は、固い結合剤のためのファージプールを十分に富化
するのに必要な回数だけ繰り返され、その結果、固い結合剤が、配列決定法およ
び／またはスクリーニング法を用いて同定され得る。
【０１１３】 （調節ドメイン） 本発明のジンクフィンガータンパク質は、必要に応じて、遺伝子発現の調節の
ための調節ドメインと結合され得る。ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上
の調節ドメイン、あるいは、同じドメインかまたは２つの異なるドメインの２つ
のコピーである２つ以上のドメインを有する、２つ以上の調節ドメインと共有的
にかまたは非共有的に結合され得る。この調節ドメインは、ジンクフィンガータ
ンパク質へ共有的に連結され得る（例えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タ
ンパク質の一部として）。ジンクフィンガータンパク質はまた、非共有的二量体
化ドメインを介して調節ドメインと結合され得る（例えば、ロイシンジッパー、
ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質（例えば
、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５３９（１９９１），Ｂａｒａｈｍ
ａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８２：８２２−８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）を参照のこと））。調節ドメインは、
ジンクフィンガータンパク質のＣ末端またはＮ末端を含む、任意の適切な位置で
ジンクフィンガータンパク質と結合され得る。
【０１１４】 ジンクフィンガータンパク質へ付加するための一般的な調節ドメインは、例え
ば、以下を含む：転写因子由来のエフェクタードメイン（活性化因子、リプレッ
サー、活性化補助因子、コリプレッサー）、サイレンサー、核ホルモンレセプタ
ー、癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍ
ａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；Ｄ
ＮＡ修復酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再配列（
ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾
因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、
アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチル
トランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホ
スファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらに関連する
因子および修飾因子。
【０１１５】 調節ドメインを獲得し得る転写因子ポリペプチドは、調節された転写および基
礎的な転写に関与するポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、転写因
子、それらのエフェクタードメイン、活性化補助因子、サイレンサー、核ホルモ
ンレセプターを含む（例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメント
の総説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ ８４：８２５−３０（１９
９６）を参照のこと；一般の転写因子は、ＢａｒｎｅｓおよびＡｄｃｏｃｋ，Ｃ
ｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２５ 増補．２：４６−９（１９９５）なら
びにＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（
１９９６）に総説される）。転写因子専用のデータベースは公知である（例えば
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：６３０（１９９５）を参照のこと）。核ホルモンレ
セプター転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４
８５５−７４（１９９５）に記載される。Ｃ／ＥＢＰファミリーの転写因子は、
Ｗｅｄｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９３：１７１−８５（１９９５
）に総説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介する活性化補助
因子およびコリプレッサーは、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら、Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；およびＵｔｌ
ｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４９８−５０２（１９９８））に総説される。
ＧＡＴＡ転写因子（これは、造血の調節に関与する）は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｅｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパ
ク質（ＴＢＰ）およびその関連したＴＡＦポリペプチド（これはＴＡＦ３０、Ｔ
ＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０、およびＴＡＦ２５０を含
む）はＧｏｏｄｒｉｃｈおよびＴｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）ならびにＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載される。Ｓ
ＴＡＴファミリーの転写因子は、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃ
ｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（
１９９６）に総説される。疾患に関与する転写因子は、Ａｓｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）に総説される。
【０１１６】 １つの実施態様において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢリプレッ
ションドメインは、転写リプレッサーとして用いられる（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎ
ｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４５０９−
４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２
：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４５１４−４５１８（１９９４））。
別の実施態様において、ＫＡＰ−１（ＫＲＡＢコリプレッサー）は、ＫＲＡＢと
共に用いられる（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：２０６７−
２０７８（１９９６））。あるいは、ＫＡＰ−１は、ジンクフィンガータンパク
質と共に単独で用いられ得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転
写因子および転写因子ドメインは、ＭＡＤを含む（例えば、Ｓｏｍｍｅｒら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６３２−６６４２（１９９８）；Ｇｕｐｔａ
ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：１１４９−１１５９（１９９８）；Ｑｕｅｖａら
、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：９６７−９７７（１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎら、
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：７３７−７４８（１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙら、Ｃ
ｅｌｌ ８９：３４９−３５６（１９９７）；およびＣｕｌｔｒａｒｏら、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３５３−２３５９（１９９７）；ＦＫＨＲ（
横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｉｎ ｒｈａｐ
ｄｏｓａｒｃｏｍａ ｇｅｎｅ）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．１５：３５４２−３５４６（１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４１１８−４１３０（１９９８））；ＥＧＲ−１（即時型
遺伝子産物−１；Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））；ｅｔｓ２リプレッサー因子
リプレッサードメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４７
８１−４７９３（１９９５））；およびＭＡＤ ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン
（ＳＩＤ；Ａｙｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５７７２−５７８
１（１９９６）を参照のこと）。
【０１１７】 １つの実施態様において、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメインは、転写活性化因
子として用いられる（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９
５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）。活性化ドメインを供給し得る他の
好ましい転写因子は、ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ
．１１：４９６１−４９６８（１９９６））；核ホルモンレセプター（例えば、
Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−
３８３（１９９８）を参照のこと）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔ
ｋｏおよびＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８
）ならびにＤｏｙｌｅおよびＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７
−２９４２（１９９７））；ならびにＥＧＲ−１（即時型遺伝子産物−１；Ｙａ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８２９８−
８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
５：３−２８（１９９８））を含む。
【０１１８】 キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関与するポリペプチドを修飾
する他のタンパク質はまた、ジンクフィンガータンパク質についての調節ドメイ
ンとして有用である。このような修飾因子は、しばしば、例えば、ホルモンによ
り媒介される転写のスイッチを入れることか、または切ることに関与する。転写
調節に関与するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２
：４５９−６７（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅ
ｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２８：２７９−８６
（１９９３）、およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ
．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）において総説される。一方ホ
スファターゼは、例えば、ＳｃｈｏｎｔｈａｌおよびＳｅｍｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ
Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）において総説される。核チロシンキ
ナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−
６（１９９４）において記載される。
【０１１９】 記載されるように、有用なドメインはまた、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕ
ｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏ
ｓファミリーメンバー）の遺伝子産物、ならびにそれらに関連する因子および修
飾因子から得られ得る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
ｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９５）において記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗ
ａｓｌｙｌｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）
およびＣｒｅｐｉｅｕｘら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８
（１９９４）において総説される。ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）において総説される。ｊ
ｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｔｈｅ Ｆｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎ Ｆａ
ｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｌ
ｅおよびＨｅｒｒｌｉｃｈ，編（１９９４）において記載される。ｍａｘ癌遺伝
子は、Ｈｕｒｌｉｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａ
ｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６において総説される。ｍｙｂ遺伝子ファミ
リーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）において総説される。ｍｏｓ
ファミリーは、Ｙｅｗら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９
−２５（１９９３）において総説される。
【０１２０】 ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ修復酵素から得られた調節ドメイン、
ならびにそれらに関連する因子および修飾因子を含み得る。ＤＮＡ修復系は、例
えば、Ｖｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：３８５−９５（
１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９−１０５
（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ；Ｅｎｇ．１７：１−１９（１９９
５）；およびＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７
（１９９６）において総説される。ＤＮＡ再配列酵素、ならびにそれらに関連す
る因子および修飾因子はまた、調節ドメインとして用いられ得る（例えば、Ｇａ
ｎｇｌｏｆｆら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０：２６１−９（１９９４）；Ｓ
ａｄｏｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：７６０−７（１９９３）を参照のこと）
。
【０１２１】 同様に、調節ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフ
ェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファター
ゼ、ポリメラーゼ）、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子由来であり
得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２
（１９９４）において総説され、そしてメチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎ
ｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４−１０（１９９５）
において記載される。ヒストンデアセチラーゼ（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７２：３７１−２（１９９６））のような、クロマチンに関連したタンパク
質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラ
ーゼ）はまた、選択したジンクフィンガータンパク質へ付加するためのドメイン
として有用である。１つの好ましい実施態様において、調節ドメインは、転写リ
プレッサーとして作用するＤＮＡメチルトランスフェラーゼである（例えば、Ｖ
ａｎ ｄｅｎ Ｗｙｎｇａｅｒｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２
８９（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：１０１−１
１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６
：２５３６−２５４０（１９９８）；およびＺａｒｄｏおよびＣａｉａｆａ，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−１６５２０（１９９８）を参照の
こと）。別の好ましい実施態様において、Ｆｏｋ１のようなエンドヌクレアーゼ
は、転写リプレッサーとして用いられる。これは、遺伝子切断を介して作用する
（例えば、ＷＯ９５／０９２３３；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２０１を参照
のこと）。
【０１２２】 クロマチンおよびＤＮＡの構造、移動および局在を制御する因子、ならびにそ
れらに関連する因子および修飾因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物およ
びウイルス）由来の因子およびそれらに関連するかまたはそれらを修飾する因子
はまた、キメラタンパク質を得るために用いられ得る。１つの実施態様において
、組換え酵素およびインテグラーゼは、調節ドメインとして用いられる。１つの
実施態様において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写活性化因子と
して用いられる（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７２：４０８−４１１（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５１９−３５２４（１９９８）
を参照のこと）。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、調節リプ
レッサーとして用いられ得る（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａ
ｋｉおよびＴｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２
４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２
８３１−２８４１（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）を参照のこと）。
【０１２３】 ポリペプチドドメインの間（例えば、２つのジンクフィンガータンパク質間ま
たはジンクフィンガータンパク質と調節ドメインとの間）のリンカードメインが
、含まれ得る。このようなリンカーは、代表的には、約５アミノ酸と２００アミ
ノ酸との間のｇｌｙ配列のようなポリペプチド配列である。好ましいリンカーは
、代表的には、可撓性アミノ酸部分配列である。これは、組換え融合タンパク質
の一部として合成される。例えば、１つの実施態様において、リンカーＤＧＧＧ
Ｓを用いて２つのジンクフィンガータンパク質を連結する。別の実施態様におい
て、２つのジンクフィンガータンパク質を連結する可撓性リンカーは、配列ＴＧ
ＥＫＰを含むアミノ酸部分配列である（例えば、Ｌｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこ
と）。別の実施態様において、リンカーＬＲＱＫＤＧＥＲＰを用いて２つのジン
クフィンガータンパク質を連結する。別の実施態様において、以下のリンカーを
用いて２つのジンクフィンガータンパク質を連結する：ＧＧＲＲ（Ｐｏｍｅｒａ
ｎｔｚら、１９９５、前出）、（Ｇ4Ｓ）n（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１１５６−１１６０（１９９６）；および
ＧＧＲＲＧＧＧＳ；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ；ＬＲＱＫ
Ｄ（Ｇ3Ｓ）2ＥＲＰ。あるいは、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプ
チド自身の両方をモデリングすることが可能なコンピュータープログラムを用い
て（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：
１１０９９−１１１０３（１９９４））か、またはファージ提示方法によって合
理的に設計され得る。
【０１２４】 他の実施態様において、化学的リンカーを用いて合成的にか組換え的に生成さ
れるドメイン配列を接続する。このような可撓性リンカーは、当業者に公知であ
る。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可
能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結
合、またはヘテロ官能基結合を有する。調節ドメインへのジンクフィンガータン
パク質の共有結合に加えて、非共有法を用いて、調節ドメインと結合するジンク
フィンガータンパク質を有する分子を生成する。
【０１２５】 調節ドメインに加えて、しばしば、ジンクフィンガータンパク質は、精製を容
易にするため、発現をモニタリングするため、または細胞および亜細胞の局在を
モニタリングするための、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、および
ＦＬＡＧエピトープのような融合タンパク質として発現される。
【０１２６】 （ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸のサブクローニングおよび発
現） 選択のＺＦＰをコードする核酸は、代表的に、複製、発現のための（例えば、
Ｋdを決定するための）原核生物細胞または真核生物細胞中に形質転換するため
のベクター中にクローニングされる。このようなベクターは、代表的に、ジンク
フィンガータンパク質をコードする核酸またはタンパク質の産生の保存または操
作のための原核生物ベクター（例えば、プラスミド）またはシャトルベクター、
または昆虫ベクターのような真核生物ベクターであり、あるいは、ジンクフィン
ガータンパク質の発現および必要に応じて遺伝子発現の制御のためのウイルスベ
クターのような原核生物ベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウ
イルスベクターなど）である。次いで、ジンクフィンガータンパク質をコードす
る核酸はまた、植物細胞、動物細胞（好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞
）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞へ投与され得る。
【０１２７】 クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、ジンクフィンガー
タンパク質は、代表的には、直接転写するためのプロモーターを含む発現ベクタ
ー中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモ
ーターは、当該分野で周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（
第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０
）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４）に記載される。ジンクフィ
ンガータンパク質発現のための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２
：２２９−２３５（１９８３））において利用可能である。このような発現系の
ためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための
真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。
【０１２８】 ジンクフィンガータンパク質核酸の発現を指向するために用いられるプロモー
ターは、特定の適用に依存している。例えば、強力な構成性プロモーターは、代
表的には、ジンクフィンガータンパク質の発現および精製のために使用される。
対照的に、ジンクフィンガータンパク質が、遺伝子調節のためにインビボで投与
される場合、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかがジンク
フィンガータンパク質の特定の使用に依存して、使用される。プローモーターは
また、代表的には、トランス活性化に応答性の（例えば、低酸素症応答エレメン
ト、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびにｔ
ｅｔ−調節系およびＲＵ−４８６系のような低分子制御系）エレメントを含み得
る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８
８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）を参照のこと）。
【０１２９】 プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、原核生物または真核生物
のいずれかの宿主細胞において核酸の発現に要求される全てのさらなるエレメン
トを含む、転写単位または発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセット
は例えば、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結
されたプロモーター、および例えば、転写、転写終結、リボソーム結合部位、ま
たは翻訳終結を効率的にポリアデニル化するために要求されるシグナルを含む。
このカセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサーおよび異種のスプ
ライシングしたイントロンのシグナルを含み得る。
【０１３０】 遺伝的情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ジンク
フィンガータンパク質の意図された使用（例えば、植物、動物、細菌、真菌、原
生動物などにおける発現）に関して選択される（以下および実施例の節に記載の
発現ベクターを参照のこと）。標準的な細菌発現ベクターは、ｐＢＲ３２２に基
づいたプラスミドである、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、ならび
に市販されているＧＳＴおよびＬａｃＺのような融合発現系を含む。好ましい融
合タンパク質は、マルトース結合タンパク質である「ＭＢＰ」である。このよう
な融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質の精製に使用される。エピト
ープタグもまた、組換えタンパク質に添加され、発現をモニタリングするため、
ならびに細胞および細胞下の局在化をモニタリングするための単離の簡便な方法
を提供し得る（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）。
【０１３１】 真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば真核
生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、
およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の
例示的な真核生物ベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／
Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期
プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプ
ロモーター、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、または真核
生物細胞において効率的な発現を示す他のプロモーターの指示下でタンパク質の
発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
【０１３２】 いくつかの発現系は、安定なトランスフェクト細胞株の選択のためのマーカー
を有する（例えば、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホス
ホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ）。高収率発現系はま
た、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーター
の指示下でジンクフィンガータンパク質コード配列を用いて、例えば、昆虫細胞
でのバキュロウイルスベクターの使用に適切である。
【０１３３】 代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機
能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質
耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミ
ドの非必須領域での独特の制限部位を含む。
【０１３４】 標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する
細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を産生し、次いでこ
のタンパク質は、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇ
ｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、１９９０
））。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換を、標準的な技術に従って行
なう（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１
９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３
））。
【０１３５】 外来のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の方法のいずれかを
使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン
、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジ
ェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソーム
および組みこみの両方、および宿主細胞への、クローニングされたゲノムＤＮＡ
、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または外来の他の遺伝物質の導入のための他の周知の
方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照
のこと）。特定の遺伝子操作手順が、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞
に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得るように使用されることのみが必
要である。
【０１３６】 （遺伝子発現の調節のためのジンクフィンガータンパク質をコードするベクタ
ー） 従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、哺乳動物細胞ま
たは標的組織に、操作されたジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を導
入するために使用され得る。このような方法は、ジンクフィンガータンパク質を
コードする核酸をインビトロまたはインビボで細胞に投与するために使用され得
る。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達ビ
ヒクル（例えば、リポソーム）と複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達
系は、細胞への送達後にエピソームであるかまたはゲノムに組み込まれるかのい
ずれかである、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療の手順
の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８〜８１
３（１９９２）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２
１１〜２１７（１９９３）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ
１１：１６２〜１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：
１６７〜１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜
４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（
１０）；１１４９〜１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖ
ｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５〜３６
（１９９５）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１〜４４（１９９５）；Ｈ
ａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ（編）
（１９９５）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３〜２６（
１９９４）を参照のこと。
【０１３７】 操作されたジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の非ウイルス送達方
法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃｓ）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム、イムノリポソーム
、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬
剤で増強されたＤＮＡの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特
許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許
第４，８９７，３５５号）に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販さ
れている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍTMおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM）
。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションについて適切で
あるカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４
、ＷＯ９１／１６０２４のカチオン性脂質および中性脂質を含む。送達は、細胞
に対してか（エキソビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対してであり
得る。
【０１３８】 免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は
、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４
０４〜４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．２：２９１〜２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．５：３８２〜３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７〜６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０〜７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７〜４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，
１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２
６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第
４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７
８７号を参照のこと）。
【０１３９】 操作されたジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の送達のためのＲＮ
ＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、身体中の特定の細胞に対してウイ
ルスを標的化して、そして核に搭載されるウイルスの輸送のための高度に発達し
たプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に（インビボで）直接投与
され得るか、またはウイルスベクターは、インビトロで細胞を処置するために使
用され得、そしてこの改変された細胞を患者に（エキソビボで）投与する。ジン
クフィンガータンパク質の送達のための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子移
入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクター
を含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および標的組織において、遺
伝子移入の最も効果的かつ用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、
レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法
を用いて可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期間の発現を生じる
。さらに、高い遺伝子導入効率が、多数の異なる細胞型および標的組織で観察さ
れている。
【０１４０】 レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによっ
て変化され得、標的細胞の潜在的な標的集団を広げる。レンチウイルスベクター
は、非分裂細胞に形質導入または感染し得、そして代表的には高いウイルス力価
を生じ得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入
系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂま
での外来配列についてパッケージング能力を有するシス作用性の長末端反復から
構成される。最少のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージング
に十分であり、次いでこれは、標的細胞中に治療用遺伝子を組み込み、永続的な
導入遺伝子発現を提供するために使用される。広範に使用されるレトロウイルス
ベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（
ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくレトロウイルスベクターを含む（例えば
、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１〜２７３９（１９９
２）Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５〜１６４０（１９９２）
；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８〜５９（１９９０）；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４〜２３７８（１９８９）；Ｍｉ
ｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０〜２２２４（１９９１）；ＰＣＴ
／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０１４１】 ジンクフィンガータンパク質の一過性の発現が好ましい場合の適用において、
アデノウイルスに基づく系が、代表的に使用される。アデノウイルスに基づくベ
クターは、多数の細胞型において非常に高い形質導入効率であり得、そして細胞
分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発
現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。ア
デノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、細胞に標的核酸を形質導入す
るために（例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生のために、および
インビボおよびエキソビボでの遺伝子治療手順のために）使用される（例えば、
Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８〜４７（１９８７）；米国特許第
４，７９７，３６８号；ＷＯ ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。
組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓ
ｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０（１９８５
）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０
８１（１９８４）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６４６６〜６４７０（１９８４）
；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２〜３８２８
（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載される。
【０１４２】 パッケージング細胞は、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために
使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２
９３細胞およびレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７
細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイル
ス粒子中に核酸ベクターをパッケージングする産生細胞株により生成される。こ
のベクターは、代表的に、パッケージングおよび宿主中への引き続く組込みに必
要とされる最少ウイルス配列、発現されるべきタンパク質についての発現カセッ
トにより置換されている他のウイルス配列を含む。この欠けているウイルス機能
は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に
使用されるＡＡＶベクターは、代表的に、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列を有す
るのみであり、このＩＴＲ配列は、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組込
みに必要とされる。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよ
びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いている、ヘルパープラスミドを含む
、細胞株中でパッケージングされる。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノ
ウイルスを用いて感染される。このヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製
およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラ
スミドは、ＩＴＲ配列の欠損に起因して、有意な量でパッケージングされない。
アデノウイルスの汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である
熱処理により減少され得る。
【０１４３】 多くの状況において、ベクターが特定の組織型に高い程度の特異性で送達され
ることが所望される。ウイルスベクターは、代表的には、ウイルスコートタンパ
ク質との融合タンパク質としてリガンドをウイルス外表面上に発現することによ
って所定の細胞型に対して特異性を有するように改変される。このリガンドは、
目的の細胞型上に提示されることが公知であるレセプターに対して親和性を有す
るように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９７４７〜９７５１（１９９５）は、Ｍｏｌｏｎｅｙマ
ウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌ
ｉｎ）を発現するように改変され得、そしてこの組換えウイルスが、ヒト上皮増
殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。こ
の原則は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現
する標的細胞の他の対にまで及び得る。例えば、糸状ファージは、実質的に任意
の選択された細胞レセプターに対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメ
ント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の記載
は、主にウイルスベクターに適用するが、同じ原則が非ウイルスベクターに適用
され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞により好ましく取り込まれる
と考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０１４４】 発現ベクターは、インビボで、個々の被験体に投与することによって、代表的
には、以下に記載されるような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、
皮下、または頭蓋内の注射）または局所適用によって送達され得る。あるいは、
裸のＤＮＡが投与され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで、個々の被験
体から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または一般
のドナー造血幹細胞のような細胞に送達され得、次いで、通常はベクターを組み
込んだ細胞について選択した後に、患者に細胞を再移植する。
【０１４５】 投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触中に分子を導入するために通
常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する適切な方法は、
利用可能でありかつ当業者に周知であり、そして特定の組成物を投与するために
、１より多くの経路が使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路より
も迅速かつ効果的な反応を提供し得る。
【０１４６】 薬学的に受容可能なキャリアは、投与されている特定の組成物によって、なら
びにこの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定
される。従って、以下に記載されるように、本発明の薬学的組成物の広範な種々
の適切な処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９を参照のこと）。
【０１４７】 （ジンクフィンガータンパク質についての送達ビヒクル） ポリペプチド化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の投与における
重要な因子は、このポリペプチドが細胞の形質膜、または核のような細胞内区画
の膜を横切る能力を有することを確実にすることである。細胞膜は、非イオン性
の親油性化合物に対して自由に透過性であり、かつ極性化合物、巨大分子、およ
び治療剤または診断剤に対して固有に不透過性である、脂質タンパク質の二重層
から構成される。しかし、細胞膜を横切るジンクフィンガータンパク質のような
ポリペプチドを輸送する能力を有する、タンパク質およびリポソームのような他
の化合物が記載されている。
【０１４８】 例えば、「膜輸送ポリペプチド」は、膜輸送キャリアとして作用する能力を有
する両親媒性または疎水性のアミノ酸部分配列を有する。１つの実施形態におい
て、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って輸送する能力を有する。ホ
メオドメインタンパク質の最も短い内部移行可能なペプチドであるアンテナペデ
ィア（Ａｎｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）は、タンパク質の第３のヘリックスである
ことが見出された（アミノ酸４３位〜５８位）（例えば、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：６
２９〜６３４（１９９６）を参照のこと）。別の部分配列である、シグナルペプ
チドのｈ（疎水性）ドメインは、類似の細胞膜輸送の特徴を有することが見出さ
れた（例えば、Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１ ４２５５〜１
４２５８（１９９５）を参照のこと）。
【０１４９】 細胞中へのジンクフィンガータンパク質の取り込みを促進するための、本発明
のジンクフィンガータンパク質に連結され得るペプチド配列の例は、以下を含む
がこれらに限定されない：ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸のペプチド
；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４〜１０３に対応する２０残基のペプチド配列
（Ｆａｈｒａｅｕｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：８４（１９９６
）を参照のこと）；アンテナペディアの６０アミノ酸長のホメオドメインの第３
のヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４
４（１９９４））；カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域のようなシ
グナルペプチドのｈ領域（Ｌｉｎら、前出）；またはＨＳＶ由来のＶＰ２２輸送
ドメイン（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ ８８：２２３〜２３３
（１９９７））。細胞取り込みの増強を提供する他の適切な化学部分もまた、ジ
ンクフィンガータンパク質に化学的に連結され得る。
【０１５０】 毒素分子もまた、細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。し
ばしば、このような分子は、少なくとも２つの部分（「２要素毒素」と呼ばれる
）：輸送または結合のドメインまたはポリペプチドおよび別々の毒素ドメインま
たはポリペプチドから構成される。代表的には、輸送ドメインまたは輸送ポリペ
プチドは、細胞レセプターに結合して、次いで毒素が細胞中に輸送される。いく
つかの細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓイオータ毒
素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）、百日
咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｃｉｓ毒素、および百日咳ア
デニレートシクラーゼ（ＣＹＡ）を含む）は、内部融合物またはアミノ末端融合
物として細胞のサイトゾルにペプチドを送達する試みにおいて使用されている（
Ａｒｏｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４〜３３４１（１９９
３）；Ｐｅｒｅｌｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６１：５１４７〜５１
５６（１９９３）；Ｓｔｅｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１
０２５〜１０３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３０〜３５３４（１９９３）；Ｃａｒ
ｂｏｎｅｔｔｉら、Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．９５：２９５（１９９５）；Ｓｅｂｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．６３：３８５１〜３８５７（１９９５）；Ｋｌｉｍｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０２７７〜１０２８１（１９
９２）；およびＮｏｖａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６〜
１７１９３ １９９２））。
【０１５１】 このような部分配列は、細胞膜を横切ってジンクフィンガータンパク質を輸送
するために使用され得る。ジンクフィンガータンパク質は、このような配列と都
合よく融合され得るか、またはこれを用いて誘導体化され得る。代表的には、こ
の輸送配列は、融合タンパク質の一部として提供される。必要に応じて、リンカ
ーは、ジンクフィンガータンパク質および輸送配列に連結するために使用され得
る。任意の適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）が使用され得る。
【０１５２】 ジンクフィンガータンパク質はまた、リポソームおよびイムノリポソームのよ
うなリポソーム誘導体を介して、動物細胞に、好ましくは哺乳動物細胞中に導入
され得る。用語「リポソーム」とは、水相を包み込む、１以上の同心性の状態の
脂質二重層から構成される小胞をいう。水相は、代表的に、細胞に送達されるべ
き化合物（すなわち、ジンクフィンガータンパク質）を含む。
【０１５３】 リポソームは、形質膜と融合して、それによってサイトゾル中に薬物を放出す
る。あるいは、リポソームは、食細胞化されるかまたは輸送小胞の状態で細胞に
よって取り込まれる。リポソームは、一旦エンドソームまたは食胞において、輸
送小胞の膜を分解するか、またはこれと融合するかのいずれかであり、そしてそ
の内容物を放出する。
【０１５４】 リポソームを介する薬物送達の現在の方法において、リポソームは、最終的に
は透過性になり、そして包み込まれた化合物（この場合は、ジンクフィンガータ
ンパク質）を、標的組織または標的細胞で放出する。全身送達または組織特異的
送達のために、これは、例えば、受動的な様式（ここでこのリポソーム二重層は
、身体中の種々の因子の作用を介して経時的に分解する）において達成され得る
。あるいは、能動的な薬物放出は、リポソーム小胞において透過性の変化を誘導
する因子を使用する工程を含む。リポソーム膜は、リポソーム膜の近くの環境が
酸性になる場合、不安定になるように、構築され得る（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９０８（１９８９）を参照のこと）。リポソームが、
標的細胞によってエンドサイトーシスされる場合、例えば、リポソームは、不安
定になり、そしてそれらの内容物を放出する。この不安定化は、フゾジェネシス
（ｆｕｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＯＰＥ）は、多数のフゾジェネシス系の基礎である。
【０１５５】 このようなリポソームは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質および脂
質成分（例えば、中性脂質および／またはカチオン性脂質、必要に応じて、所定
の細胞表面レセプターまたはリガンドに結合する抗体のような、レセプター認識
分子（例えば、抗原）を含む）を包含する。以下に記載されるようなリポソーム
を調製するための種々の方法が利用可能である：例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許
第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１
号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，
７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，２
３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第
４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号
、同第４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７４２４、Ｄｅａｍ
ｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４
３：６２９〜６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：３３４８〜３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８１２：５５〜６５（１９８
５）；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１
６１〜１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４２〜２４６（１９８８）；Ｌｉｐｏｓｏｍ
ｅｓ（Ｏｓｔｒｏ（編）、１９８３、第１章）；Ｈｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙ
ｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ、Ｌｉｐｏｓｅｍｅ
ｓ：ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３）
）。適切な方法は、例えば、超音波破砕、排出、高圧／ホモジネーション、微量
流動化、洗剤透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘導性融合およびエーテ
ル融合方法（これらの全ては、当該分野において周知である）を含む。
【０１５６】 本発明の特定の実施形態において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的部
分を使用して、本発明のリポソームを標的化することが所望される。種々の標的
部分（例えば、リガンド、レセプター、およびモノクローナル抗体）を使用する
リポソームの標的化は、以前に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７
，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【０１５７】 標的部分の例は、新生物に関連した抗原（例えば、前立腺癌特異的抗原および
ＭＡＧＥ）に特異的なモノクローナル抗体を含む。腫瘍はまた、癌遺伝子（例え
ば、ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２）の活性化または過剰発現から生じる遺伝子産
物を検出することによって診断され得る。さらに、多数の腫瘍は、胎児組織によ
り通常発現される抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性
抗原（ＣＥＡ））を発現する。ウイルス感染の部位は、種々のウイルス抗原（例
えば、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原
、エプスタイン−バーウイルス抗原、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）お
よびパピローマウイルス抗原を使用して診断され得る。炎症は、インテグリン（
例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチンレセプター（例えば、ＥＬＡＭ−１）など
のような、炎症の部位で発現される表面分子により特異的に認識される分子を使
用して検出され得る。
【０１５８】 リポソームに標的剤を共役させるための標準的な方法が使用され得る。これら
の方法は、一般に、標的因子、または誘導体化された親油性化合物（例えば、脂
質誘導体化ブレオマイシン）の付着に対して活性化され得る、リポソーム脂質成
分（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）中への組込みを含む。抗体標的
化リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用して構築さ
れ得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３３７
〜１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２４４８〜２４５１（１９９０）を参照の
こと）。
【０１５９】 （ジンクフィンガータンパク質による遺伝子発現の調節を決定するためのアッ
セイ） 種々のアッセイを使用して、選択された表現型と候補遺伝子の関連を決定し得
る。ジンクフィンガータンパク質により調節される特定の遺伝子の活性は、種々
のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパク質
レベルまたはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖；レポーター遺
伝子の転写活性化または転写抑制；セカンドメッセンジャーレベル（例えば、ｃ
ＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ2+）；サイトカインおよびホルモンの
産生レベル；ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イムノア
ッセイ（例えば、抗体を用いるＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学アッセイ）、ハイ
ブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン、インサイチ
ュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究）、比色定量アッセ
イ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイ、ｃ
ＤＮＡアレイ研究などを使用して、評価され得る。
【０１６０】 ジンクフィンガータンパク質は、しばしば初めに、例えば、２９３細胞、ＣＨ
Ｏ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などの培養細胞
を使用して、活性についてインビトロで試験され得る。好ましくは、ヒト細胞ま
たはマウス細胞が使用される。ジンクフィンガータンパク質は、しばしば、初め
に、レポーター遺伝子を用いる一過性の発現系を使用して試験され、次いで標的
候補遺伝子の調節は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞および動物にお
いて試験される。ジンクフィンガータンパク質は、細胞中で組換え発現され得る
か、動物中に移植された細胞中で組換え発現され得るか、またはトランスジェニ
ック動物中で組換え発現され得、そして以下に記載される送達ビヒクルを使用し
て動物または細胞にタンパク質として投与され得る。この細胞は、固定化され得
るか、溶液中であり得るか、動物に注射され得るか、またはトランスジェニック
動物または非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。
【０１６１】 遺伝子発現の調節および選択された表現型と候補遺伝子の関連は、本明細書中
に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイの１つを使用して試験
される。候補遺伝子を含む細胞または被験体動物は、ジンクフィンガータンパク
質と接触され、そしてコントロール遺伝子または第２の候補遺伝子と比較されて
表現型調節の範囲を調べる。遺伝子発現の調節について、ジンクフィンガータン
パク質は、必要に応じて２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、より
好ましくは５０ｎＭ、最も好ましくは２５ｎＭ以下のＫｄを有する。
【０１６２】 ジンクフィンガータンパク質の効果は、上記の任意のパラメータのいずれかを
試験することによって測定され得る。任意の適切な遺伝子発現変化、表現型変化
、または生理学的変化を使用して、ジンクフィンガータンパク質の影響を評価し
得る。インタクトな細胞または動物を使用して機能的な結果を決定する場合、種
々の効果（例えば、腫瘍増殖、新生血管形成、ホルモン放出、公知および特徴付
けされていない遺伝マーカーの両方の転写変化（例えば、ノーザンブロットまた
はオリゴヌクレオチドアレイ研究）、細胞の代謝における変化（例えば、細胞増
殖またはｐＨ変化）、ならびに細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＧＭ
Ｐ）の変化もまた測定し得る。
【０１６３】 選択された表現型についてのアッセイの例としては、例えば、形質転換アッセ
イ（例えば、増殖の変化、足場依存性、増殖因子依存性、病巣形成、軟寒天にお
ける増殖、ヌードマウスにおける腫瘍増殖、およびヌードマウスにおける腫瘍新
生血管形成）；アポトーシスアッセイ（例えば、ＤＮＡラダリング（ｌａｄｄｅ
ｒｉｎｇ）および細胞死、アポトーシスに関与する遺伝子の発現）；シグナル伝
達アッセイ（例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３の変化、
ホルモンの変化および神経伝達物質放出）；レセプターアッセイ（例えば、エス
トロゲンレセプターおよび細胞増殖）；増殖因子アッセイ（例えば、ＥＰＯ、低
酸素および赤血球コロニー形成単位アッセイ）；酵素産物アッセイ（例えば、Ｆ
ＡＤ−２誘導油脱飽和）；転写アッセイ（例えば、レポーター遺伝子アッセイ）
；ならびにタンパク質産生アッセイ（例えば、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ）が挙げら
れる。
【０１６４】 標的部分の例は、新生物に関連した抗原（例えば、前立腺癌特異的抗原および
ＭＡＧＥ）に特異的なモノクローナル抗体を含む。腫瘍はまた、癌遺伝子（例え
ば、ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２）の活性化または過剰発現から生じる遺伝子産
物を検出することによって診断され得る。さらに、多数の腫瘍は、胎児組織によ
り通常発現される抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性
抗原（ＣＥＡ））を発現する。ウイルス感染の部位は、種々のウイルス抗原（例
えば、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原
、エプスタイン−バーウイルス抗原、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）お
よびパピローマウイルス抗原を使用して診断され得る。炎症は、インテグリン（
例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチンレセプター（例えば、ＥＬＡＭ−１）など
のような、炎症の部位で発現される表面分子により特異的に認識される分子を使
用して検出され得る。
【０１６５】 リポソームを標的剤とカップリングさせるための標準的な方法が使用され得る
。これらの方法は、一般に、標的因子、または誘導体化された脂溶性化合物（例
えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）の付着に対して活性化され得る、リポソー
ム脂質成分（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）中への組込みを含む。
抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用し
て構築され得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１
６３３７〜１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２４４８〜２４５１（１９９０
）を参照のこと）。
【０１６６】 （ジンクフィンガータンパク質による遺伝子発現の調節を決定するためのアッ
セイ） 種々のアッセイを使用して、選択された表現型と候補遺伝子との関連性を決定
し得る。ジンクフィンガータンパク質により調節される特定の遺伝子の活性は、
種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパ
ク質レベルまたはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖；レポータ
ー遺伝子の転写活性化または転写抑制；セカンドメッセンジャーレベル（例えば
、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ2+）；サイトカインおよびホルモ
ンの産生レベル；ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イム
ノアッセイ（例えば、抗体を用いるＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学アッセイ）、
ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン、インサ
イチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究）、比色定量ア
ッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイ
、ｃＤＮＡアレイ研究などを使用して、評価され得る。
【０１６７】 ジンクフィンガータンパク質は、初めに、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、
ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などの培養細胞を使用し
て、活性についてインビトロで試験され得る。好ましくは、ヒト細胞またはマウ
ス細胞が使用される。ジンクフィンガータンパク質は、しばしば、初めに、レポ
ーター遺伝子を用いる一過性の発現系を使用して試験され、次いで標的候補遺伝
子の調節は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞および動物において試験
される。ジンクフィンガータンパク質は、細胞中で組換え発現され得るか、動物
中に移植された細胞中で組換え発現され得るか、またはトランスジェニック動物
中で組換え発現され得、そして以下に記載される送達ビヒクルを使用して動物ま
たは細胞にタンパク質として投与され得る。この細胞は、固定化され得るか、溶
液中であり得るか、動物に注射され得るか、またはトランスジェニック動物また
は非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。
【０１６８】 遺伝子発現の調節および選択した表現型と候補遺伝子との関連性は、本明細書
中に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイの１つを使用して試
験される。候補遺伝子を含む細胞または被験動物は、ジンクフィンガータンパク
質と接触され、そしてコントロール遺伝子または第２の候補遺伝子と比較されて
、表現型調節の範囲を調べる。遺伝子発現の調節について、ジンクフィンガータ
ンパク質は、必要に応じて、２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、
より好ましくは５０ｎＭ、最も好ましくは２５ｎＭ以下のＫｄを有する。
【０１６９】 ジンクフィンガータンパク質の効果は、上記の任意のパラメータのいずれかを
試験することによって測定され得る。任意の適切な遺伝子発現変化、表現型変化
、または生理学的変化を使用して、ジンクフィンガータンパク質の影響を評価し
得る。インタクトな細胞または動物を使用して機能的な結果を決定する場合、種
々の効果（例えば、腫瘍増殖、新生血管形成、ホルモン放出、公知および特徴付
けされていない遺伝マーカーの両方の転写変化（例えば、ノーザンブロットまた
はオリゴヌクレオチドアレイ研究）、細胞の代謝における変化（例えば、細胞増
殖またはｐＨ変化）、ならびに細胞内セカンドメッセンジャーの変化（例えば、
ｃＧＭＰ）もまた測定し得る。
【０１７０】 選択した表現型についてのアッセイの例としては、例えば、形質転換アッセイ
（例えば、増殖、足場依存性、増殖因子依存性、病巣形成、軟寒天における増殖
、ヌードマウスにおける腫瘍増殖、およびヌードマウスにおける新血管形成にお
ける変化）；アポトーシスアッセイ（例えば、ＤＮＡ標識および細胞死、アポト
ーシスに関与する遺伝子の発現）；シグナル伝達アッセイ（例えば、細胞内カル
シウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３の変化、ホルモン放出および神経伝達物質
放出における変化）；レセプターアッセイ（例えば、エストロゲンレセプターお
よび細胞増殖）；成長因子アッセイ（例えば、ＥＰＯ、低酸素症および赤血球コ
ロニー形成単位アッセイ）；酵素生成物アッセイ（例えば、ＦＡＤ−２誘
導油不飽和化）；転写アッセイ（例えば、リポーター遺伝子アッセイ）；ならび
にタンパク質産生アッセイ（例えば、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【０１７１】 １つの実施形態では、選択した表現型についてのアッセイは、インビトロで実
行され得る。１つの好ましいインビトロアッセイの形式において、培養された細
胞における遺伝子発現のジンクフィンガータンパク質調節は、ＥＬＩＳＡアッセ
イを使用して、タンパク質産生を調べることによって測定される。
【０１７２】 別の実施態様において、候補遺伝子発現のジンクフィンガータンパク質調節は
、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定することによってインビトロで決定
される。遺伝子発現のレベルは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはハイブリダイ
ゼーションアッセイ（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、ドットブロッティング）を使用する増幅を使用して測定される。ＲＮａｓｅ
保護は、１つの実施態様において使用される。タンパク質またはｍＲＮＡのレベ
ルは、本明細書中に記載されるような、標識された検出試薬（例えば、蛍光標識
核酸または放射性標識核酸、放射性標識抗体または酵素標識抗体など）を直接的
または間接的に使用して検出される。
【０１７３】 あるいは、レポーター遺伝子系は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラー
ゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、またはβ−ｇａｌ）に作動可能に連結された
標的遺伝子プロモーターを使用して考案され得る。レポーター構築物は、代表的
には、培養された細胞中に同時にトランスフェクトされる。選り抜きのジンクフ
ィンガータンパク質での処置の後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性
の量は、当業者に公知の標準的技術に従って測定される。
【０１７４】 候補遺伝子発現のジンクフィンガータンパク質調節をモニターするために有用
な好ましいアッセイ形式の別の例は、インビボで実行される。このアッセイは、
腫瘍促進遺伝子、新生血管形成のような腫瘍支持に関与する遺伝子（例えば、Ｖ
ＥＧＦ）、または腫瘍サプレッサー遺伝子を活性化する遺伝子（例えば、ｐ５３
）の発現を阻害するジンクフィンガータンパク質を調べるために特に有用である
。このアッセイにおいて、選り抜きのジンクフィンガータンパク質を発現する培
養された腫瘍細胞は、免疫が損なわれたマウス（例えば、無胸腺マウス、放射線
照射されたマウス、またはＳＣＩＤマウス）に皮下注射される。適切な長さの時
間、好ましくは４〜８週間後に、腫瘍増殖は、例えば、容積によってかまたはそ
の２つの最も大きい寸法によって、そしてコントロールと比較されて測定される
。実質的に有意な減少（例えば、スチューデントｔ検定を使用）を有する腫瘍は
、阻害された増殖を有するといわれる。あるいは、腫瘍の新生血管形成の程度も
また測定し得る。内皮細胞特異的抗体を使用するイムノアッセイは、腫瘍におい
て、腫瘍の血管新生および管の数について染色するするために使用される。管の
数において、実質的に有意な減少を有する腫瘍（例えば、スチューデントＴ検定
を使用）は、新生血管形成の阻害を有するといわれる。
【０１７５】 トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物はまた、インビボで
候補遺伝子発現の調節を調べるための実施態様として使用される。トランスジェ
ニック動物は、代表的に選り抜きのジンクフィンガータンパク質を発現する。あ
るいは、選り抜きのジンクフィンガータンパク質を一過性で発現する動物、また
はジンクフィンガータンパク質が送達ビヒクルにおいて投与されている動物が使
用され得る。候補遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるアッセイのいず
れか１つを使用して試験される。動物は、機能的変化について観察およびアッセ
イされ得る（薬物、分裂促進因子、ウイルス、病原体、毒素などを用いてチャレ
ンジされ得る）。
【０１７６】 （トランスジェニックマウスおよび薬物発見のためのインビトロでの高処理能
アッセイ） ジンクフィンガータンパク質技術のさらなる適用は、細胞株およびトランスジ
ェニック動物における遺伝子発現を操作することである。一旦、選択した候補遺
伝子がある表現型と関連し、そしてこの候補遺伝子が薬物治療標的として確認さ
れると、細胞およびトランスジェニック動物ベースのアッセイが、高処理能薬物
スクリーニングの目的のために開発される。候補遺伝子を発現する細胞株または
動物は、候補遺伝子の発現を調節するジンクフィンガータンパク質を供給される
。このジンクフィンガータンパク質は、代表的には、ジンクフィンガータンパク
質をコードする核酸として提供されるが、タンパク質としてもまた投与され得る
。次いで、この細胞株または動物は、候補遺伝子および選択した表現型に対する
この化合物の効果を決定するために、試験化合物と接触される。ジンクフィンガ
ータンパク質技術は、高処理能細胞ベースアッセイおよび高処理能動物アッセイ
についての改良である。例えば、ジンクフィンガータンパク質の発現は、低分子
系を用いる条件でなされ得るからである。
【０１７７】 治療についての１つの高処理能アッセイにおいて、ジンクフィンガータンパク
質は、本明細書中に記載された低分子により調節される系を用いて、細胞株およ
び動物において候補遺伝子を調節するために用いられ得る。ジンクフィンガーベ
ースのリプレッサーの発現／機能は、発生の間にスイッチを切り得、そして細胞
または動物において随意にスイッチを入れ得る。このアプローチは、ジンクフィ
ンガータンパク質発現モジュールの付加のみに依存し；相同組換えは必要とされ
ない。ジンクフィンガータンパク質リプレッサーはトランスドミナントであるの
で、生殖系列伝達またはホモ接合性について関係がない。これらの問題は、マウ
スモデルに対する特徴付けが乏しい遺伝子の候補（ｃＤＮＡまたはＥＳＴクロー
ン）から出発するために必要とされる時間および労力に劇的に影響する。この能
力は、治療的介入のための遺伝子標的を迅速に同定および／または確認し、新規
なモデル系を生成し、そして複雑な生理的現象（発生、造血、形質転換、神経機
能など）を分析するために使用され得る。キメラ標的化マウスは、Ｈｏｇａｎら
、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｒｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）；Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍ
ａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、編、（１９８７）；およびＣ
ａｐｅｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１９８９）に従って得
られ得る。
【０１７８】 （ジンクフィンガータンパク質の用量） 本発明の状況において被験体または細胞に投与される用量は、所望の表現型を
もたらすのに充分であるべきである。特定の投与レジメが、実験設定（例えば、
機能的ゲノム研究における設定、および細胞または動物モデルにおける設定）に
おける表現型の変化を決定するために有用であり得る。用量は、用いられる特定
のジンクフィンガータンパク質の効力およびＫd、標的細胞の核の容量、および
細胞または患者の状態、ならびに処置される細胞または患者の体重または表面積
によって決定される。用量のサイズはまた、特定の細胞または患者における特定
の化合物もしくはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、およ
び程度によって決定される。
【０１７９】 標的部位に対する約９９％の結合のための、ジンクフィンガータンパク質の最
大の投与量は、細胞１個あたり特異的なジンクフィンガータンパク質分子の約１
．５×１０5〜１．５×１０6コピーより少ない範囲にあると計算される。この結
合のレベルのための細胞１個あたりのジンクフィンガータンパク質の数は、以下
のように、ＨｅＬａ細胞核の容量（約１０００μｍ3または１０-12Ｌ；Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、（ＡｌｔｍａｎおよびＫａｔｚ、編（１９７６）））を用い
て計算される。ＨｅＬａ核は比較的大きいので、この投与量の数は、必要な場合
、標的細胞の核の容量を使用して再計算される。この計算はまた、他の部位によ
るジンクフィンガータンパク質結合との競合を考慮しない。この計算はまた、基
本的にすべてのジンクフィンガータンパク質が核に局在化されると仮定している
。１００×Ｋdの値が、標的部位に対する約９９％の結合を計算するために使用
され、そして１０×Ｋdの値が、標的部位に対する約９０％の結合を計算するた
めに使用される。例えば、Ｋd＝２５ｎＭでは、
【０１８０】
【数１】 ジンクフィンガータンパク質をコードする発現ベクターの適切な用量はまた、
プロモーターからのジンクフィンガータンパク質発現の平均速度および細胞内の
ジンクフィンガータンパク質分解の平均速度を考慮することによって計算され得
る。好ましくは、野生型または変異体ＨＳＶ ＴＫのような弱いプロモーターが
、上記のように使用される。マイクログラムのジンクフィンガータンパク質の用
量は、利用される特定のジンクフィンガータンパク質の分子量を考慮に入れるこ
とによって計算される。
【０１８１】 投与されるジンクフィンガータンパク質の有効量を決定する際に、ジンクフィ
ンガータンパク質またはジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の循環血
漿レベル、潜在的なジンクフィンガータンパク質毒性、表現型の進行、および抗
ジンクフィンガータンパク質抗体の産生を評価する。投与は、単回用量、または
分割した用量で達成され得る。
【０１８２】 （薬学的組成物および投与） ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガータンパク質をコードする
発現ベクターは、遺伝子発現の調節のために、被験体または細胞に直接的に投与
され得る。有効な量の投与は、ジンクフィンガータンパク質を導入して、組織ま
たは細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。ジ
ンクフィンガータンパク質は、任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に受容可
能なキャリアとともに投与される。このような調節物の適切な投与方法は、当業
者に利用可能でありかつ周知であり、そして１を超える経路が特定の組成物を投
与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりもより直接的かつよ
り効果的な反応をしばしば提供し得る。
【０１８３】 薬学的に受容可能なキャリアは、部分的には、投与される特定の組成物、およ
び、その組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従
って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する（例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第
１７版、１９８５を参照のこと）。
【０１８４】 ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸
は、単独でまたは他の適切な組成物と組み合わせて、吸入を介して投与されるた
めのエアロゾル処方物（すなわち、それらは「霧状に」され得る）に作られ得る
。エアロゾル処方物は、加圧した受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオ
ロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。
【０１８５】 非経口的投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路によるような）
のための適切な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されたレシピ
エントの血液と等張性である処方物を与える溶質を含み得る、水溶性および非水
溶性の等張性滅菌注入溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、濃縮剤、安定剤、および
保存剤を含み得る水溶性および非水溶性滅菌懸濁液を含む。本発明の実施におい
て、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、または
鞘内によって投与され得る。化合物の処方は、単位用量または多用量を封入した
容器（例えば、アンプルまたはバイアル）中に提供され得る。注入溶液および懸
濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る
。
【０１８６】 本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行
物または特許出願が具体的にかつ個別に参考として援用されることが示されるよ
うに、本明細書中に参考として援用される。
【０１８７】 前述の発明は、理解の明確さの目的のために例証および実例によっていくぶん
詳細に記載してきたけれども、本発明の教示を考慮して、添付の請求の範囲の精
神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変が本発明に対してな
され得ることは、当業者にとって容易に明らかである。
【０１８８】 （実施例） 以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、限定する目的ではない。
当業者は、変更または改変されて基本的に類似した結果を生じ得る種々の決定的
ではないパラメーターを容易に認識する。
【０１８９】 （実施例Ｉ：標的確認のための、ジンクフィンガータンパク質を用いるヒトＶ
ＥＧＦ遺伝子の標的化） 標的確認における重要な考慮は、標的遺伝子と得られる表現型との間の相関関
係を十分に決定しかつ実際に評価することである。本実施例は、ジンクフィンガ
ータンパク質技術の使用を実証して、例えば、遺伝子の発現または遺伝子産物の
機能を調節し得る、治療用化合物の開発のための標的として遺伝子を確認するこ
とを実証する。このプロセスは、以下の単純な仮説に基づく（図１）。
【０１９０】 遺伝子ＸがＺＦＰ−Ａ１（これはＸ１部位を特異的に標的にする）により上方
制御される場合、表現型Ｑが観察される。
【０１９１】 遺伝子ＸがＺＦＰ−Ａ２（これは異なるＸ２部位を特異的に標的にする）によ
り上方制御される場合、同じ表現型Ｑが観察される。
【０１９２】 遺伝子ＸがＺＦＰ−Ｂ１（これはＸ３部位（Ｘ３はＸ１またはＸ２であり得る
）を標的にする）により下方制御される場合、異なる表現型Ｚが観察される。
【０１９３】 ＺＦＰ−Ａ１、ＺＦＰ−Ａ２、またはＺＦＰ−Ｂ１を用いて、表現型Ｑに関与
しない遺伝子を標的にする場合、この遺伝子に関する表現型の変化は観察されな
い。ヒトおよびマウスの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子を、本実施例にお
ける標的確認のために選択した。ＶＥＧＦは、低酸素により誘導される内皮細胞
特異的分裂促進因子である、約４６ｋＤａの糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、
チロシンキナーゼレセプターＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）およびＦｌｋ−１／
ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との相互作用を介して内皮細胞に結合する。ＶＥＧＦ
は、新脈管形成において非常に重要な役割を果たすので、治療薬の開発のための
この遺伝子の標的化は、多大な興味を引いている。ＶＥＧＦ遺伝子の阻害（下方
制御）は、癌および糖尿病性網膜炎の処置に用いられ得るが、遺伝子の活性化（
上方制御）は、虚血心臓および組織疾患のために用いられ得る。これらの２つの
所望の表現型変化は、ＶＥＧＦ遺伝子をジンクフィンガータンパク質技術を用い
る標的確認に理想的にする。
【０１９４】 （インビトロでの生化学的アフィニティーおよび特異性についてのジンクフィ
ンガータンパク質の試験） ジンクフィンガータンパク質についてのＤＮＡ標的部位を、標的遺伝子の転写
部位の周囲の領域において選択した。主な標的を、転写開始部位の約１ｋｂ上流
の領域内で選択した。ここで、エンハンサーエレメントの大部分が配置される。
各３−フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、９ｂｐのＤＮＡ配列を認識
する。ＤＮＡ結合特異性を増加させるために、近接する２つの３−フィンガーの
ジンクフィンガータンパク質を９ｂｐ配列（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５５２５〜５５３０（１９９７））を標的
にするように共に融合した。
【０１９５】 ヒトＳＰ−１またはマウスＺｉｆ２６８転写因子を設計したジンクフィンガー
タンパク質の構築のための前駆体分子として用いた。アミノ酸配列（フィンガー
）（これは標的ＤＮＡ配列を認識する）を、本明細書中に記載される「認識規則
」に基づいて設計した。設計したジンクフィンガータンパク質遺伝子を６つの重
複するオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲベースの手順を用いて構築した。Ｖ
ＥＧＦを標的にするジンクフィンガータンパク質遺伝子を設計およびアセンブル
する方法は、ＵＳＳＮ ０９／２２９，０３７に詳述される。
【０１９６】 設計したジンクフィンガータンパク質遺伝子を、始めに、ＫｐｎＩおよびＢａ
ｍＨＩを用いて消化した後、ｐＭＡＬ−ＫＮＢベクターにクローン化した（図２
）。このｐＭＡＬ−ＫＮＢベクターを、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクター（ＮＥＷ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）から改変する。ジンクフィンガータンパク
質を細菌から精製し、そして生化学的アフィニティーアッセイおよび特異性アッ
セイに供した。これらのインビトロアッセイについての方法を、本明細書中およ
び同時係属出願であるＵＳＳＮ ０９／２２９，０３７に記載する。
【０１９７】 （一過性トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼプロモーターの活性化
または抑制） 高い生化学的アフィニティーおよび特異性を有するジンクフィンガータンパク
質を、ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦまたはｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ中のＫｐｎＩ部位およびＢ
ａｍＨＩ部位にサブクローニングした（図２）。ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ構築物は、
核局在シグナル、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、およびＦｌａ
ｇペプチドをコードするＣＭＶプロモーター制御配列を含む。この構築物を、哺
乳動物細胞に導入した場合に、標的化遺伝子を上方制御するように設計した。ｐ
ｃＤＮＡ−ＮＫＦ構築物は、ＶＰ１６ドメインに代わってＫｒｕｐｐｅｌ関連ボ
ックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメインを含み、そしてこれを標的化遺伝子の下方制御
に用いた。これらの構築物を、同時係属出願であるＵＳＳＮ ０９／２２９，０
３７に詳細に記載する。
【０１９８】 レポータープラスミド系は、ｐＧＬ３−プロモーターおよびｐＧＬ３−コント
ロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）に基づく。ジンクフィンガータンパク
質標的部位の３つの直列型反復配列を、ＳＶ４０プロモーターの上流に挿入した
（図３）。ｐＧＬＰレポーターを用いて、遺伝子発現の上方制御について、操作
したジンクフィンガータンパク質の活性を評価した。ｐＧＬＣレポーターを用い
て、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ活性（遺伝子発現の阻害）の効果を測定した。これらの構
築物を、同時係属出願であるＵＳＳＮ ０９／２２９，０３７に詳細に記載する
。
【０１９９】 本実施例に用いられるコントロールプラスミドを、図２に示す。ｐｃＤＮＡ−
ＮＶＦ（またはｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ）は、ＺＦＰを欠くエフェクターである。ｐ
ｃＶ−ＲＡＮ（またはｐｃＫ−ＲＡＮ）は、操作したジンクフィンガータンパク
質が公知でないＤＮＡ結合能力を有すること以外、全ての成分を発現する（図２
）。ｐｃＶ−ＲＡＮ（またはｐｃＫ−ＲＡＮ）構築物におけるジンクフィンガー
タンパク質配列は、以下：
【０２００】
【化４】 であり、ここで、フィンガーに下線を付す。これらのコントロール構築物を用い
て、ＤＮＡ結合ドメインの非存在下での調節ドメイン（ＶＰ１６またはＫＲＡＢ
）の効果を確認した。ｐｃ−ＺＦＰ−ｃａｔプラスミドは、特定の設計したジン
クフィンガータンパク質を発現するが、機能的ドメイン（ＶＰ１６またはＫＲＡ
Ｂ）を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＡＴベクター（ｎｔ１４４２〜１６７７）（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）遺伝子から単離される２３４ｂｐフラグメントと交換した（図２）
。このコントロールプラスミドを用いて、ＤＮＡ結合ドメインが単独で遺伝子発
現に対する任意の効果を有するか否かを試験する。他のコントロールは、異なる
ＤＮＡ配列および非特異的ジンクフィンガータンパク質標的配列を含むレポータ
ーを認識するジンクフィンガータンパク質を発現するエフェクターを含む。
【０２０１】 以下の実施例は、設計したジンクフィンガータンパク質の効果を実証する。こ
れは２９３細胞中のルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する。標的化配列
（ＧＧＧＧＴＴＧＡＧ）をＭ６−１８９２Ｓと名付け、そしてこれはヒトＶＥＧ
Ｆ遺伝子のプロモーター領域中に存在する。この９−ｂｐ ＤＮＡ配列を認識す
るジンクフィンガータンパク質を、本明細書中およびＵＳＳＮ ０９／２２９，
０３７に記載されるように設計およびアセンブルした。ジンクフィンガータンパ
ク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す：
【０２０２】
【化５】 アセンブルされたジンクフィンガータンパク質のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮ
Ａフラグメントを、ｐＭＡＬ−ＫＮＢベクターのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位にク
ローン化した。設計されたジンクフィンガータンパク質が、その標的部位に結合
する能力を、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質を発現および精製すること、な
らびに電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施することによって、確
認した。上記に示したタンパク質の結合親和性（Ｋd）は、ＥＭＳＡによって決
定された場合、２０ｎＭであった。次いで、このＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ ＺＦＰ
フラグメントを、ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦベクターのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位にサ
ブクローン化し、そしてｐｃＶ−ＶＦ４７１Ａと命名した。Ｍ６−１８９２Ｓ部
位の３つの縦列反復配列を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、
そしてｐＧＬＰ−ＶＦ４７１ｘ３と命名した。
【０２０３】 すべてのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キットを使用して
調製した。ヒト胚性腎２９３細胞を、翌日に約７０％コンフルエンスに到達する
密度で、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ＭＤ）またはＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）トランスフェクション試薬
を用いて、５０ｎｇエフェクターＤＮＡ（ＺＦＰ発現プラスミド）、９００ｎｇ
レポーターＤＮＡ、および１００ｎｇ ｐＣＭＶ−ＬａｃＺ ＤＮＡと共に、同
時トランスフェクトした。同時発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性をコントロ
ールに使用して、ルシフェラーゼ活性を正規化した。細胞溶解産物を、トランス
フェクションの４０〜４８時間後に収集した。ルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕ
ａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｎｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄ
ａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｏｐｉｘ、ＭＡ）
を使用して実施した。代表的なルシフェラーゼアッセイの結果を、図４に示す。
【０２０４】 この実施例は、この設計されたＺＦＰ発現プラスミド（ｐｃＶ−ＶＦ４７１Ａ
）が、コントロールプラスミドｐｃＶ−ＲＡＮ（これは、既知のＤＮＡ結合能力
を有さない）と比較した場合に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を８倍刺激し得るこ
とを示した。ＶＰ１６ドメインをペプチド（これは、転写調節活性を有さない）
と置換した場合に、このジンクフィンガータンパク質（ｐｃＶ−ＶＦ４７１Ａ−
ｃａｔ）は、ルシフェラーゼ遺伝子をトランス活性化するその能力を欠損した。
設計されたジンクフィンガータンパク質（ｐｃＶ−ＶＦ４７１Ａ）は、異なるジ
ンクフィンガータンパク質結合部位を含むレポーターからのルシフェラーゼ発現
を活性化できず、このことは、このトランス活性化効果が配列特異的であること
を示す。従って、この実施例において調節ドメイン（ＶＰ１６）と組み合わせら
れたＤＮＡ結合ドメイン（ＶＦ４７１Ａ ＺＦＰ）は、適切な標的部位で遺伝子
をオンにし得た。
【０２０５】 （一過的にトランスフェクトされた細胞における標的遺伝子のネイティブなプ
ロモーターを含むリポーターの試験） 単純レポーター系とネイティブなレポーター系との間の差異は、ネイティブな
レポータープラスミド構築物が、標的遺伝子のプロモーターを含むということで
ある。ネイティブなレポーター系に固有の利点は、単一のネイティブなレポータ
ープラスミド構築物を使用して、そのプロモーターの状況下で、複数のジンクフ
ィンガータンパク質の効果を分析し得るということである。
【０２０６】 ｐＧＬＰ−ネイティブレポーターを、プロモーターを含むＤＮＡフラグメント
とｐＧＬ３−プロモーター中のＳＶ４０プロモーターとを置換すること、そして
標的遺伝子の配列を隣接させることによって構築した（図３）。この実施例では
、ヒトＶＥＧＦ遺伝子のネイティブなレポーター構築物は、ヒトゲノムＤＮＡか
ら３３１９ｂｐのフラグメントをＰＣＲ増幅することによって生成された。この
フラグメントは、ＶＥＧＦプロモーターおよびその隣接領域を含む。ＶＥＧＦ
ＡＴＧコドンを、ルシフェラーゼコード領域に融合した。ネスト（Ｎｅｓｔ）−
ＰＣＲを、増幅のために実施した。外部プライマーは、ｈＶＥＧＦＵ１（５’−
ＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＧ；ｎｔ １〜２５は、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ配列Ｍ６３９７１に基づいた）およびＶＥＧＦＤ２（５’−ＡＣＣ
ＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧ；ｎｔ ３４７５〜３４５１）
であった。内部プライマー対は、ｈＶＥＨＦＵ２（５’−ＡＣＡＣＡＣＣＴＴＧ
ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧ；ｎｔ ７１〜９５、ＫｐｎＩ部位に下線を付
した）およびＶＥＧＦＤ１（５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＴｃＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧ
ＧＡＧＧＣＣ；ｎｔ ３４１３〜３３８８、下線を付したＮｃｏＩ部位を生成す
るために、ＴからＣへの置換を作製する）である。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ
）ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩで消化し、そしてｐＧＬ３プロモータ
ープラスミドのＫｐｎＩ−ＮｃｏＩベクターフラグメントと連結した（図３）。
ヒトＶＥＧＦネイティブレポータープラスミドを、ｐＧＬＰＶＦＨと命名した。
【０２０７】 類似のストラテジーを使用して、マウスゲノムＤＮＡから２０７０ｂｐフラグ
メントを増幅した。外部プライマーは、ｍＶＥＧＦＵ２（５’−ＴＧＴＴＴＴＡ
ＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＧＴＡＡＧＣＣＴ；ｎｔ １〜２５は、ＧｅｎＢａｎｋ
配列Ｕ４１３８３に基づいた）およびＶＥＧＦＤ２（５’−ＡＣＣＧＣＴＴＡＣ
ＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧ；ｎｔ ３４７５〜３４５１は、Ｍ６３９７
１に基づいた）であった。内部プライマーは、ｍＶＥＧＦ（５’−ＧＣＣＣＣＣ
ＡＴＴＧＧｔＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＣＡ；ｎｔ
１５５〜１９２；下線を付したＫｐｎＩ部位を生成するために、ＣからＴへの置
換を作製する）およびＶＥＧＦＤ（５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＴｃＣＡＴＧＧＴＴ
ＴＣＧＧＡＧＧＣＣ；ｎｔ ３４１３〜３３８８はＭ６３９７１に基づいた、下
線を付したＮｃｏＩ部位を生成するために、ＴからＣへの置換を作製する）であ
った。ＶＥＧＦＤ２およびＶＥＧＦＤ１プライマーを使用して、ヒトおよびマウ
スのゲノムＤＮＡの両方を増幅した。なぜなら、これらの配列は、この領域で非
常に相同であるからである（Ｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
３８７７（１９９６））。マウスＶＥＧＦのネイティブなレポータープラスミド
を、ｐＧＬＰｍＶＦと命名した。
【０２０８】 以下の実施例は、２つの設計されたジンクフィンガータンパク質が、２９３細
胞中でヒトＶＥＧＦネイティブプロモーター遺伝子を上方制御し得たことを示す
。１つのジンクフィンガータンパク質（ｐｃＶ−Ｍ６−２００９Ａ）を、転写開
始部位の３６２ｂｐ上流に位置付けられた近位部位ＧＡＡＧＧＧＧＧＣを標的化
するように設計し、そして他の１つ（ｐｃＶ−Ｍ６−１１１Ｓ）を、転写開始部
位の２２４０ｎｔ上流に位置付けられた遠位部位ＡＴＧＧＧＧＧＴＧを標的化す
るように設計した。上記のルシフェラーゼレポーターアッセイと同様に、５０〜
１００ｎｇのエフェクターＤＮＡを、９００ｎｇのネイティブなレポーターＤＮ
Ａおよび１００ｎｇのｐＣＭＶｌａｃＺ ＤＮＡと共に同時トランスフェクトし
た。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの約４０時間後に測定し、そ
して図５に活性化倍数として示した。
【０２０９】 （細胞培養物において内因性のヒトおよびマウスのＶＥＧＦ遺伝子を活性化ま
たは抑制するための第１ジンクフィンガータンパク質） これらの操作されたジンクフィンガータンパク質が、細胞培養物において内因
性のヒトおよびマウスのＶＥＧＦ遺伝子を活性化または抑制し得るか否かを試験
するために、一過的なトランスフェクション実験を実施した。ヒト２９３細胞お
よびマウス乳房上皮細胞Ｃ１２７Ｉ（Ｓｈｉｍａら、ＪＢＣ ２７１：３８７７
（１９９６））は、低レベルの内因性ＶＥＧＦタンパク質を発現し、これを使用
して、ＶＥＧＦ活性化に対するジンクフィンガータンパク質の効果を評価した。
ヒト膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞、マウス神経芽腫ＮＢ４１細胞（Ｌｅｖｙら、Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２：９（１９８９））およびラット神経膠腫ＧＳ−９
Ｌ細胞（Ｃｏｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
７：１３２３（１９９０））は、高レベルの内因性ＶＥＧＦタンパク質を発現し
、これを、ジンクフィンガータンパク質の抑制効果を試験するために使用する。
これらの細胞を、翌日に約７０％コンフルエンスに到達する密度で、６ウェルプ
レートの各ウェルに播種する。０．１〜１ｇのエフェクターＤＮＡを、通常、細
胞型に依存してＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅまたはＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトラン
スフェクション試薬のいずれかを用いて、細胞をトランスフェクトするために使
用する。トランスフェクションの約１４時間後、細胞に、新鮮培地を給餌し、そ
してさらに２４時間培養する。次いで、この培地を収集し、そして内因性ＶＥＧ
Ｆレベルを、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
ＭＮ）を使用して測定する。
【０２１０】 ＶＥＧＦ Ｍ６−１１１ＳおよびＭ６−２００９Ｓ ＺＦＰを、第１ジンクフ
ィンガータンパク質として設計して、ヒトＶＥＧＦ遺伝子調節におけるそれらの
活性を試験した。表１における結果は、両方の第１ジンクフィンガータンパク質
が、２９３細胞中において内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現を有意に活性化することを
示した。
【０２１１】
【表１】 標的遺伝子を発現させるために、設計されたジンクフィンガータンパク質ドメ
インを、ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦベクター中にクローン化した。適切な細胞中へのＤ
ＮＡのトランスフェクション後、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ融合タンパク質は、同時トラ
ンスフェクトされたルシフェラーゼレポーター遺伝子と同様に、内因性遺伝子を
阻害し得る。本明細書中で使用された実施例は、ｐｃＫ−Ｍ６−１１Ｓである。
表１に示されるように、Ｍ６−１１１Ｓ ＺＦＰは、標的配列ＡＴＧＧＧＧＧＴ
Ｇを認識する。Ｍ６−１１１Ｓ ＺＦＰが、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合される
場合、同時トランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター遺伝子発現におけ
る約８０％の抑制および内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現における約４０％の抑制が達
成された。
【０２１２】 （細胞培養物における内因性のヒトおよびマウスのＶＥＧＦ遺伝子を活性化ま
たは抑制するための第２ジンクフィンガータンパク質） 第１ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が、ＶＥＧＦ
遺伝子に対する効果に起因し、そして他の副作用（例えば、代替的な遺伝子標的
の調節）に起因しないことを確認するために、第１ジンクフィンガータンパク質
の部位とは異なる部位でＶＥＧＦ遺伝子を標的化する第２ジンクフィンガータン
パク質を操作した。表１に示されるように、２つの第２ジンクフィンガータンパ
ク質はまた、培養細胞中で内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する。これらの結
果は、ジンクフィンガータンパク質技術を使用して、遺伝子発現を調節し得、そ
して治療のための標的として遺伝子を確認し得ることを示す。
【０２１３】 （ＶＥＧＦ生理に関与しない遺伝子を標的化するための第３ジンクフィンガー
タンパク質） 第１および第２ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が
、ＶＥＧＦ遺伝子に対する特異的効果に起因し、そしていかなる非特異的ＤＮＡ
結合または鎮圧（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）効果にも起因しないことを確認するた
めに、ＶＥＧＦ生理に関与しない遺伝子を標的化する第３ジンクフィンガータン
パク質を、ネガティブコントロールとして使用する。例えば、ヒトＥＰＯ遺伝子
発現を調節するために設計されたジンクフィンガータンパク質を、特異性コント
ロール（実施例ＩＩを参照のこと）として使用する。ＥＰＯはまた、低酸素によ
って影響を及ぼされ、従って、低酸素アッセイを使用するＶＥＧＦ標的確証のた
めのコントロールとして有用である。ＶＥＧＦ阻害は、特異的に、糖尿病性網膜
症を覆す。この結果は、薬物の発見および開発のための分子標的としてのＶＥＧ
Ｆを確証する。
【０２１４】 （げっ歯類における糖尿病性網膜症モデルに対するＶＥＧＦ阻害効果の試験） 糖尿病性網膜症は、労働者年齢の個体間における失明の最も一般的な原因であ
る。ＶＥＧＦ発現の増加は、糖尿病性網膜症の病理の主要な誘因である。この疾
患を処置するためのストラテジーの１つは、治療的化合物を使用して、内因性Ｖ
ＥＧＦ遺伝子発現を阻害することである。上記のように、ジンクフィンガータン
パク質は、治療剤としてＶＥＧＦを確証するための手段を提供する。アデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）および／またはレトロウイルスに基づいたウイルスベクター
を、上記のように構築する。これらのウイルスベクターは、上記のようなＫＲＡ
Ｂ抑制ドメインと融合されたジンクフィンガータンパク質を発現する。これらの
ウイルスを産生し、精製し、そして動物中に注射する。操作されたジンクフィン
ガータンパク質の効力を、以前に記載された（Ａｄｍａｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６（１９９６）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９０５（１９９５）；Ａｉｅｌ
ｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１０４５
７（１９９５）；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ
．Ｓｃｉ．３５：１０１、１９９４）ような網膜新生血管形成の抑制によって、
評価する。すべての必要なコントロール（第２および第３のジンクフィンガータ
ンパク質を発現するウイルスベクターを含む）もまた、使用される。
【０２１５】 （げっ歯類における末梢動脈疾患モデルに対するＶＥＧＦ活性化効果の試験） 側副動脈の発達を増強するための、ＶＥＧＦによる末梢新脈管形成の刺激は、
虚血性脈管疾患を有する患者のための潜在的に新規な治療形態である。上記と同
じストラテジーを使用し、マウス末梢動脈疾患モデルを用いて、標的としてのＶ
ＥＧＦを確証する。ＶＰ１６活性化ドメインに融合されたジンクフィンガータン
パク質を発現するＡＡＶまたはレトロウイルスベクターを、上記のように構築す
る。ジンクフィンガータンパク質の効力を、以前に記載された手順（Ｃｏｕｆｆ
ｉｎｈａｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：１６６７（１９９８）；Ｔａ
ｋａｓｈｉｔａら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｓｔ．７５：４８７（１９９６）；Ｉｓｎｅ
ｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：９５９（１９９６））と同
様に評価する。すべての必要なコントロール（第２および第３のジンクフィンガ
ータンパク質を発現するウイルスベクターを含む）もまた、使用される。ＶＥＧ
Ｆの過剰発現は、側副動脈成長を誘発する。この結果は、薬物の発見および開発
のための標的としてのＶＥＧＦを確証する。
【０２１６】 （実施例ＩＩ：赤血球生成の標的の発見） 哺乳動物の赤血球生成を、増殖および分化シグナルを与える特定の因子による
赤血球前駆体の刺激を介して調節する。低酸素は、多くの生理学的に関連したプ
ロセスを制御する遺伝子の発現を誘導する強力なシグナルである（Ｒａｔｃｌｉ
ｆｆｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０１：１１５３（１９９８））。このプロ
セスの１つは、特定の組織が、さらなる赤血球の生成のための因子を放出するこ
とを「要求」することである。この現象は、低酸素条件を用いて異なる細胞株お
よび／または組織を刺激すること、培養物上清をサンプリングすること、そして
マウス骨髄培養物由来の赤血球コロニー形成単位の刺激について試験することに
よって検出され得る。この様式において、低酸素に応答することが見出された細
胞株または組織は、低酸素誘導可能様式で、赤血球生成増殖因子を発現する可能
性がある。低酸素処理に際してこのような細胞または組織において示差的に発現
される遺伝子の分析は、赤血球生成増殖因子発現遺伝子の同定へと導く。ジンク
フィンガータンパク質技術は、このような示差的な遺伝子発現実験のための分析
ツールとして、そして仮定上の赤血球生成増殖因子遺伝子を確証するために使用
され得る。
【０２１７】 細胞型（ヒトヘパトーム細胞株Ｈｅｐ３Ｂを含む）の収集物を、適切な培地に
おいて培養し、そして加湿５％ＣＯ2−９５％空気のインキュベーター内で３７
℃にて維持する。低酸素条件を、１８時間にわたって１％Ｏ2−５％ＣＯ2−９４
％Ｎ2を流すことによって達成する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ ７７：
２７１（１９９１））。培養物上清を収集し、そしてコロニー形成アッセイにお
いて試験する（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：１３５３（１
９９３）；Ｅａｖｅｓ＆Ｅａｖｅｓ、Ｂｌｏｏｄ ５２：１１９６（１９７８）
）。ヒトヘパトームＨｅｐ３Ｂ細胞株は、低酸素誘導に際して赤血球生成増殖因
子を生成することが見出され（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７９７２（１９８７））、そしてこの細胞株
を、さらなる特徴付けのために用いる。
【０２１８】 １つの作業仮説は、赤血球生成の刺激を担う１つの（または、それより多い）
細胞性遺伝子が、低酸素に際して活性化されるということである。この遺伝子は
、示差的遺伝子発現実験（例えば、ディファレンシャルディスプレイ（Ｇｅｎｅ
Ｈｕｎｔｅｒ、ＴＮ）、ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクション（ＰＣＲ−Ｓｅｌ
ｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）、ま
たはマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ））を実施することによって
同定され得る。正常な条件および低酸素条件の下で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞増殖物から
抽出されたＲＮＡの遺伝子発現パターンを比較する。
【０２１９】 複数の遺伝子が、低酸素症を呈した細胞において上方制御される可能性が非常
に高い。約１８個の遺伝子が、低酸素によって上方制御されるとして同定された
（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０１：１１５３（１９９８
））。広範に研究されている、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子および血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子を、この実施例において使用して、赤血球生成増
殖因子をコードする遺伝子の機能的ゲノム学（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）および同定へ
のジンクフィンガータンパク質技術の適用を実証する。
【０２２０】 上記の実験から同定された候補遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、第１ジンクフ
ィンガータンパク質は、プロモーターに近接して位置付けられたＤＮＡ配列を標
的化するように設計される。ジンクフィンガータンパク質の構築および特徴付け
のプロセスは、実施例Ｉに記載されたプロセスと同一である。高いＤＮＡ結合親
和性および特異性を有するジンクフィンガータンパク質（３フィンガーのもの、
または６フィンガーのタンパク質）を、ＨＳＶ ＶＰ−１６活性化ドメインまた
はＫＲＡＢ抑制ドメインのいずれかと融合して、リスト上の個々の遺伝子の発現
を活性化またはブロックする。
【０２２１】 これらの設計されたＺＦＰ−ＶＰ１６構築物は、非低酸素条件下でＧｅｎｅＰ
ＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を使用して、個々に一過的にＨｅｐ３Ｂ細胞中にトランス
フェクトされる。トランスフェクションの４８時間後、上清を収集し、そしてコ
ロニー形成アッセイを実施する。ジンクフィンガータンパク質のアップレギュレ
ーションに際して赤血球生成を誘導する遺伝子は、赤血球生成増殖因子をコード
する遺伝子であるとみなされる。この結果は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝
子が、赤血球生成の調節を担うが、他のすべての試験された遺伝子（ＶＥＧＦを
含む）は、赤血球生成の調節を担わないことを示す。実施例Ｉに記載された、す
べての必要なジンクフィンガータンパク質コントロール構築物をまた、この実施
例において使用する。
【０２２２】 遺伝子を同定および確証する別の方法は、これらのジンクフィンガータンパク
質をＫＲＡＢドメインと融合すること、そしてＨｅｐ３Ｂ細胞を、トランスフェ
クションの１４時間後に低酸素によって刺激することを除いて、上記と同様の実
験を実施することである。ＥＰＯ遺伝子発現を抑制するように設計されたジンク
フィンガータンパク質を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中にトランスフェクトする場合、コロ
ニー形成アッセイに基づいて、全く活性は観察されないか、または活性の減少が
観察される。ＥＰＯ遺伝子以外の遺伝子を標的化するすべてのジンクフィンガー
タンパク質は、低酸素誘導下で、赤血球生成に影響を及ぼさない。
【０２２３】 遺伝子の機能をさらに確証するために、ＥＰＯ遺伝子の異なる部位で標的化す
る第２ジンクフィンガータンパク質を構築する。これらの第２ジンクフィンガー
タンパク質は、ＶＰ１６活性化ドメインと融合された場合に、ＥＰＯ遺伝子発現
を活性化し、そして赤血球生成を刺激する。逆に、ＫＲＡＢ抑制ドメインと融合
された場合、これらのジンクフィンガータンパク質は、低酸素条件下でＥＰＯ遺
伝子発現を阻害し、そして赤血球生成を刺激できない。
【０２２４】 （実施例ＩＩＩ：乳癌標的遺伝子の発見） いくつかの乳房腫瘍の増殖は、ホルモンエストロゲンの持続的存在に依存する
。エストロゲンは、トランスフォームされた表現型の維持に必要とされる遺伝子
のアップレギュレーションに関与する可能性がある。これらの組織由来の細胞株
（例えば、ＭＣＦ−７、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ）は、培養における増殖につ
いての、このエストロゲン依存性を保持する。従って、エストロゲンは、依存的
細胞株において必須の遺伝子の発現を刺激するようである。これらのエストロゲ
ン誘導性遺伝子の発見は、乳癌を処置するための新たな薬物の開発のために有用
な分子標的である。エストロゲン依存性細胞増殖に必要とされるエストロゲン誘
導性遺伝子を同定するためのジンクフィンガータンパク質の使用が、本明細書中
に記載される。さらに、新たに発見された標的を、ジンクフィンガータンパク質
および適切なコントロールを使用して確証する。
【０２２５】 （ＥＲ応答性遺伝子の同定） ＭＣＦ−７細胞を、エストロゲン（エストラジオール）の非存在下で、短期間
（１週間）および長期間（２８週間）増殖させ、基底レベルに達するまでエスト
ラジオール誘導性遺伝子の転写を可能にする。フェノールレッドを欠きかつ１０
％チャコール除去（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎ
ｅ）、１０μｇ／ｍｌのインスリンおよび０．５ｎＭのエストラジオールを補充
したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む１６２ｍｌフラスコ中で、
細胞を増殖させる。８０％コンフルエンシーを達成したらすぐ、細胞をトリプシ
ン処理し、そしてエストラジオールを欠く新鮮培地に移す。このフラスコを５％
のＣＯ2の加湿雰囲気下で３７℃にてインキュベートする。
【０２２６】 エストロゲン応答性遺伝子発現を、この細胞にエストラジオールを添加するこ
とにより刺激する。エストラジオールの非存在下で増殖した細胞を、エストラジ
オールを欠く新鮮培地へ分配する。１つのフラスコに１０ｎＭのエストラジオー
ル（エタノールに溶解させた）を添加し、一方、他方のフラスコにエストラジオ
ールを含まない等量のエタノールを添加する。刺激した細胞および刺激してない
細胞の両方を、６時間後に収集する。
【０２２７】 ＲＮＡを、標準的なＲＮＡ単離キットを使用して、示差的に発現された遺伝子
を同定するために細胞から単離する。エストロゲン応答性遺伝子を以下の方法の
１つまたはそれらの組み合わせを使用して同定する：差引きハイブリダイゼーシ
ョン（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ）、ディファレンシ
ャルディスプレイ法（例えば、Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃにより提供されるＲＥＡＤＳ
技術もしくＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＧｅｎＳｃｏｐｅ）、ｃＤＮＡアレイ（
例えば、Ｉｎｃｙｔｅ製のＧＥＭ技術）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから提供さ
れる高密度オリゴヌクレオチドマトリックス技術。
【０２２８】 多くの示差的に発現された（エストラジオール活性化）遺伝子が同定される。
これらの遺伝子に関するｃＤＮＡが配列決定され、そして候補遺伝子のリストに
まとめられる。多くの遺伝子が同定され、これらが、エストロゲンレセプターを
含むことが予想される。
【０２２９】 （エストロゲン応答性遺伝子の最初の確認） 上記のように、そして同時係属中の出願（ＵＳＳＮ０９／２２９，０３７）に
記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリス
トの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に
標的化可能な９ｂｐの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配
列を得るためおよび上記で生成されたｃＤＮＡ配列の精度を確実にするために、
以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索すること
を含む。
【０２３０】 これらの設計されたジンクフィンガータンパク質は、上記のように機能ドメイ
ンに融合され、候補遺伝子の発現の上方制御およびノックダウンの両方を可能に
する。使用される機能的ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）
抑制ドメインおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＶＰ１６活性化ドメイ
ンである。
【０２３１】 （候補遺伝子の抑制） リプレッサー研究のために、個々のジンクフィンガータンパク質を保有する細
胞を、エストロゲン依存性機能をブロックすることに起因する増殖の欠損につい
てアッセイする。エストロゲンレセプターが、ＭＣＦ−７における増殖に必須で
あることが証明され、従って、これらの細胞は、ＥＲ遺伝子または他のエストロ
ゲン依存性機能が下方制御について標的化される場合、増殖に失敗する。
【０２３２】 細胞を、エストラジオールを有するかまたは有さない、上記の培地中で培養す
る。ジンクフィンガータンパク質をＳＶ４０ ＮＬＳおよびＫＲＡＢに融合して
構築された真核生物発現ベクターは、上に記載される。トランスフェクションは
、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製の市販されるリポソーム
調製物）を使用して行われる。全てのプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉ
ｄｉ ＤＮＡ精製システムを使用して調製される。１０ｇのエフェクタープラス
ミドを全量１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の１００ｎｇのＬｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ（５０μｌ）と混合する。ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）をまた、トランスフェクション効率のための内部コントロールとしてＤ
ＮＡ混合物中に含ませた。３０分間のインキュベーション後、６．４ｍｌのＤＭ
ＥＭを添加し、そしてこの混合物を細胞上で層状に重ねた。５時間後、ＤＮＡ−
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を除去し、そして１０％のチャコール除去Ｆ
ＣＳ、１０μｇ／ｍｌのインスリンおよび１０ｎＭのエストラジオールを含む新
鮮培養培地をその細胞上で層状に重ねた。
【０２３３】 生存能力を、トリパンブルー排除および増殖のモニタリングによりアッセイす
る。細胞を、トリプシン処理し、遠心分離により濃縮し、そして約１０6細胞／
ｍｌで再懸濁する。トリパンブルーの０．４％溶液を、血球計スライド上の等量
の細胞に添加する。全細胞および染色した細胞を顕微鏡下で計数する。増殖を、
ＤＮＡ合成を測定することによりモニターする。放射活性［3Ｈ］チミジン（３
０Ｃｉ／ｍｍｏｌで０．５μＣｉ；Ａｍｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そして細胞
をさらに１７時間増殖させる。培地を除去し、そして細胞を１％ＳＤＳを用いて
インサイチュで溶解する。細胞溶解産物を、１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で
沈殿させ、そしてＷｈａｔｍａｎ ３Ｍフィルターディスクを用いて濾過するこ
とにより収集し、そして５％ＴＣＡ、次いでエタノールで洗浄する。濾紙を乾燥
させ、そしてチミジンの取り込みを液体シンチレーション計数により定量する。
【０２３４】 （候補遺伝子の活性化） リストの各メンバーの活性化をまた行い、ＭＣＦ−７細胞のエストロゲン依存
性増殖についてアッセイする。真核生物発現ベクターを上記のように構築する。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製の市販されるリポソーム調
製物）を用いてトランスフェクションを行う。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉ
ａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製システムを使用して調製する。上記のようにト
ランスフェクションを行う。
【０２３５】 生存能力を、トリパンブルー排除および増殖のモニタリングによりアッセイす
る。細胞を、トリプシン処理し、遠心分離により濃縮し、そして約１０6細胞／
ｍｌで再懸濁する。トリパンブルーの０．４％溶液を、血球計スライド上の等量
の細胞に添加する。全細胞および染色した細胞を顕微鏡下で計数する。増殖を、
ＤＮＡ合成を測定することによりモニターする。放射活性［3Ｈ］チミジン（３
０Ｃｉ／ｍｍｏｌで０．５μＣｉ；Ａｍｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そして細胞
をさらに１７時間増殖させる。培地を除去し、そして細胞を１％ＳＤＳを用いて
インサイチュで溶解する。細胞溶解産物を、１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で
沈殿させ、そしてＷｈａｔｍａｎ ３Ｍフィルターディスクを用いて濾過するこ
とにより収集し、そして５％ＴＣＡ、次いでエタノールで洗浄する。濾紙を乾燥
させ、そしてチミジンの取り込みを液体シンチレーション計数により定量する。
【０２３６】 （二次的な確認） さらなる試験によって、この１回目のリプレッサーおよびアクチベーター研究
の間に同定された候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク質
を、候補遺伝子における異なりかつ別々の２つの標的部位を標的化するように設
計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、１８ｂ
ｐを認識する６フィンガー分子を形成するために、２つの３フィンガージンクフ
ィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。
【０２３７】 ３フィンガージンクフィンガータンパク質を上記のように設計し、生成しそし
てＥＭＳＡによりアッセイする。適切な配列（これらについて、ジンクフィンガ
ータンパク質が容易にかつ信頼して設計され得る）を位置付けるために、候補遺
伝子のさらなる配列決定が必要とされ得る。さらに、さらなる配列を、ヌクレオ
チド配列データベースに見出し得る。２つの９ｂｐの配列が互いの５ｂｐ以内に
存在し；従ってジンクフィンガータンパク質対の連結を可能にするように、標的
配列を選択する。受容可能な親和性および特異性で結合する３フィンガージンク
フィンガータンパク質の対を同定した後、このドメインをＰＣＲによって連結し
、６フィンガー分子のフィンガー４〜６を構成するドメインを増幅する。非組織
的かつ可撓性であると推定されるペプチド配列をコードする短いＤＮＡ配列を、
増幅の間に、このドメインのＮ末端に付加する。
【０２３８】 各構築物を、培養物中の増殖しているＭＣＦ−７細胞へ一過的にトランスフェ
クトし、そして各構築物を、上記のように、増殖の失敗（抑制）またはエストロ
ゲン非依存性増殖（活性化）についてスコア付けする。
【０２３９】 （異種移植片を使用する標的確認） 腫瘍増殖に対する変更された標的遺伝子発現の効果を、ヌードマウスにおける
異種移植片により評価する。ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を
、上記のようにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレトロウイルスベースのウ
イルスベクターにクローン化する。このジンクフィンガータンパク質をＫＲＡＢ
またはＶＰ１６ドメインのいずれかに融合する。得られた組換えウイスルを生成
し、精製しそしてＭＣＦ−７細胞を感染するために使用する。これらのトランス
ジェニック細胞を、皮下的にヌードマウスへ導入する（Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｓｅ
ｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：３〜１６（１９９５））。腫瘍を、腫瘍重量を見積
もるために１週間に２度測定する（Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ
．２２：３〜１６（１９９５）；Ｋｕｂｏｔａら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．
６４：１５５〜１２１（１９９７））。この実験を、腫瘍が１００〜３００ｍｇ
の重量を得るかまたは動物が死亡するまで進められる。
【０２４０】 終点アッセイは、あり得る死亡原因を決定するための胸腔および腹腔の肉眼的
実験を含む。さらなるアッセイは、組織サンプルの組織学的分析および秤量のた
めの腫瘍の切り出しを含む。
【０２４１】 （実施例ＩＶ：植物における脂肪酸飽和標的の発見） 植物油の質を、成分の脂肪酸側鎖の飽和程度により部分的に決定する。過剰な
不飽和（１または２個の二重結合より多い）は、酸化および酸敗する傾向がより
高い粗悪な油を生じる。油生産種子における生合成機構の構成要素は、不飽和の
程度を決定する。産物が脂肪酸不飽和に関与する遺伝子の発現を阻害することに
よって、高品質の油を生じ得る。ジンクフィンガータンパク質を、脂肪酸飽和の
レベルを設定する際に役割を果たす遺伝子を同定するための、示差的遺伝子発現
実験のためのプローブとして使用する。第１、第２および第３のジンクフィンガ
ータンパク質を使用して、新たに発見された遺伝子機能を確認する。最終的に、
高品質の油を生成するトランスジェニック植物を作製する。
【０２４２】 （ランダム変異誘発を介する候補遺伝子の作製） 出発材料は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）種子または植物のいずれかで
ある。変異誘発を、化学的処理またはランダムＤＮＡ挿入のいずれかにより行う
（Ｋａｔａｖｉｃら，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：３９９〜４０９（
１９９５）；Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：２０２１〜２０２６（１９９８）；Ｈｏｈｎ＆Ｐｕｃｈｔ
ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：８３２１〜８
３２３（１９９９）；Ｆａｃｃｉｏｔｔｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．
１７：５９３〜５９７（１９９９））。
【０２４３】 種子の化学的変異誘発を、０．３％（ｖ／ｖ）のエチルメタンスルホネート（
ＥＭＳ）中に１６時間浸漬することにより行う（Ｈａｕｇｈｎ＆Ｓｏｍｅｒｖｉ
ｌｌｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：４３０〜４３４（１９８６））
。Ｍ1種子を繁殖し、そして自家受粉させ、次いでＭ2種子を無作為に収集し、そ
して繁殖させて、引き続きもう１回の自家受粉してＭ3種子を形成する。これら
の種子の脂肪酸組成および得られた植物を以下に記載のように分析する。
【０２４４】 あるいは、ランダムＤＮＡ挿入を、植物において開発された多くの系を使用す
る転位により行い得る（Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：２０２１〜２０２６（１９９８））。
【０２４５】 （脂肪酸および脂質分析による潜在的な候補遺伝子の同定） 脂肪酸および脂質組成物を、Ｋａｔａｖｉｃ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
１０８：３９９〜４０９（１９９５））の方法に従って、約２０〜３０個のＭ3
種子について決定する。成熟植物組織もまた、同様に分析する。種子を、脂肪酸
飽和の程度に従ってカテゴリーに分類する。
【０２４６】 発現プロフィールを、実施例ＩＩＩに記載される方法の１つを使用することに
より、不飽和の上昇した程度または減少した程度のいずれかを発現する種子につ
いて作成する（注記：ω−６−デサチュラーゼをコードするＦＡＤ２−１は、種
子における低レベルのポリ不飽和長鎖脂肪酸である、過少発現遺伝子であること
が予想される）。一旦、特定の遺伝子を、変更された表現型に関与すると同定す
ると、このｃＤＮＡを配列決定のために選択する。
【０２４７】 （第１ジンクフィンガータンパク質を用いる最初の標的確認） 上記のように、そして同時係属中の出願（ＵＳＳＮ０９／２２９，０３７）に
記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリス
トの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に
標的化可能な９ｂｐの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配
列を得るためおよび上記で生成されたｃＤＮＡ配列の精度を確実にするために、
以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索すること
を含む。
【０２４８】 これらの設計されたジンクフィンガータンパク質は、上記のように機能的ドメ
インに融合され、候補遺伝子の発現の上方制御およびノックダウンの両方を可能
にする。使用される機能的ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ
）抑制ドメインおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＶＰ１６活性化ドメ
インである。
【０２４９】 ＺＦＰ−機能ドメイン融合物をコードする遺伝子を植物発現ベクター（例えば
、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１）へクローン化する。このベクターは、以下の特性を
有する：１）選択可能マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性をコードする遺
伝子）；２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のための左側または右側
のＴ−ＤＮＡ境界（ｂｏｒｄｅｒ）；３）所望のプロモーター（例えば、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓ、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーターまたはファゼオリンプロモーター
）の下流のジンクフィンガータンパク質遺伝子の挿入を可能にする都合のよい制
限部位；４）Ｎｏｓのような植物ポリアデニル化シグナル；５）ＧＵＳレポータ
ー遺伝子。
【０２５０】 設計されたジンクフィンガータンパク質を、レポーター遺伝子の活性化または
抑制をアッセイすることにより、所望の標的に対する活性について試験する。ジ
ンクフィンガータンパク質およびレポーターを独立して発現する単一のプラスミ
ドを使用する。標的配列を、ＧＵＳ遺伝子の転写の開始部位付近のＤＮＡ中に挿
入する。タバコカルスへのレポーター構築物の形質転換を、標準の同時培養手順
により行う（Ｇｒａｙｂｕｒｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：６７５〜６７
８（１９９２））。ＧＵＳアッセイを、蛍光アッセイを使用して行う（Ｊｅｆｆ
ｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７〜４０５（１
９８７））。
【０２５１】 ＥＭＳＡにより評価する場合には受容可能な親和性を示し、そしてレポーター
アッセイにより評価する場合にはインビボ機能を示すジンクフィンガータンパク
質を、未成熟種子の子葉に由来する増殖性の胚形成培養物の粒子ボンバードメン
トを用いてダイズ体細胞胚へ形質転換する（Ｌｉｕら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．４６：３３〜４２（１９９６））。
【０２５２】 各ＺＦＰ保有プラスミドについての１０〜２０の別々の形質転換事象由来の組
織および種子を単離し、脂肪酸および脂質プロフィールを評価する。上記のジン
クフィンガータンパク質で形質転換した場合に変更された脂肪酸または脂質プロ
フィールを生じる候補遺伝子を、より特異的なジンクフィンガータンパク質を生
成する第２の設計または第３の設計のために選択する。
【０２５３】 （不飽和経路における標的をさらに確認するための第２または第３のジンクフ
ィンガータンパク質） さらなる試験を使用して、１回目のこのリプレッサーおよびアクチベーター研
究の間に同定される候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク
質を、候補遺伝子における異なりかつ別々の２つの標的部位を標的化するように
設計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、１８
ｂｐを認識する６フィンガー分子を形成するために、２つの３フィンガージンク
フィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。
【０２５４】 ３フィンガージンクフィンガータンパク質を本明細書中に記載のように、設計
し、生成しそしてＥＭＳＡによりアッセイする。適切な配列（これらについて、
ジンクフィンガータンパク質が容易にかつ信頼して設計され得る）を位置付ける
ために、候補遺伝子のさらなる配列決定が必要とされ得る。さらに、さらなる配
列を、ヌクレオチド配列データベースに見出し得る。２つの９ｂｐの配列が互い
の５ｂｐ以内に存在し；従ってジンクフィンガータンパク質対の連結を可能にす
るように、標的配列を選択する。受容可能な親和性および特異性で結合する３ジ
ンクフィンガータンパク質の対を同定した後、ドメインをＰＣＲによって連結し
、６フィンガー分子のフィンガー４〜６を構成するドメインを増幅する。非組織
的かつ可撓性であると推定されるペプチド配列をコードする短いＤＮＡ配列を、
増幅の間に、このドメインのＮ末端に付加する。
【０２５５】 ６フィンガージンクフィンガータンパク質を本明細書中に記載のように抑制ド
メインまたは活性化ドメインのいずれかに融合し、そして初めにタバコカルスレ
ポーター研究において、次いでダイズ植物においてアッセイする。
【０２５６】 上記の第２のジンクフィンガータンパク質により標的化する場合、変更された
脂肪酸または脂質プロフィールを生じる候補遺伝子を、第３のジンクフィンガー
タンパク質の設計のために選択する。第２のジンクフィンガータンパク質で標的
化される遺伝子とは異なる遺伝子の第２の領域を選択する。再度、本明細書中に
記載のように、１８ｂｐを結合するように設計されたジンクフィンガータンパク
を設計し、そして試験する。これらのジンクフィンガータンパク質をダイズに導
入し、そして生じた脂肪酸および脂質プロフィールにおける変更を、再度試験す
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、遺伝子発現を調節するジンクフィンガータンパク質を使用する標的確
認の略図を示す。
【図２】 図２は、ジンクフィンガータンパク質発現構築物を示す。
【図３】 図３は、遺伝子発現のジンクフィンガータンパク質の調節のためのルシフェラ
ーゼレポーター構築物を示す。
【図４】 図４は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性化に対する、ジンクフィンガー
タンパク質の効果を示す。
【図５】 図５は、ジンクフィンガータンパク質による、ヒトＶＥＧＦネイティブレポー
ターの活性化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チャン， レイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94132， サン フランシスコ， フォント ブー ルバード 520 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 DA02 DA03 DA06 EA04 FA02 GA11 HA11 4B063 QA01 QA08 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QS34

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方法
    は、以下： （ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程； （ｉｉ）該第１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィン
    ガータンパク質、および第２の遺伝子の標的部位に結合する第２のジンクフィン
    ガータンパク質を提供する工程； （ｉｉｉ）該第１のジンクフィンガータンパク質が該第１の候補遺伝子と接触
    する条件下で第１の細胞を培養し、そして該第２のジンクフィンガータンパク質
    が該第２の候補遺伝子と接触する条件下で第２の細胞を培養する工程であって、
    ここで、該第１および第２のジンクフィンガータンパク質が、該第１および該第
    ２の候補遺伝子の発現を調節する、工程；ならびに （ｖｉ）選択された表現型についてアッセイする工程であって、これにより該
    第１の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する、工程、を
    包含する、 方法。
  2. 【請求項２】 前記第１の候補遺伝子の第２の標的部位に結合する第３のジ
    ンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 複数の候補遺伝子を選択する工程、および各候補遺伝子の標
    的部位に結合する複数のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包
    含する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第２の遺伝子が、制御遺伝子である、請求項１に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 前記第１の候補遺伝子が、少なくとも約２００ヌクレオチド
    長のＥＳＴによって部分的にコードされる、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記第１の候補遺伝子および前記第２の遺伝子の両方が、前
    記選択された表現型と関連する、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第１および第２の細胞が同一の細胞であり、ここで該細
    胞が、前記第１および第２の候補遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１および第２の候補遺伝子が、内因性遺伝子である、
    請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約５０％だけ抑制され
    る、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約１５０％だけ活性
    化される、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む
    融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ジンクフィンガータンパク質の発現が、外因性薬剤の
    投与によって誘導される、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調
    節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細
    胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現
    の活性化である、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑
    制である、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトラン
    スフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およ
    びヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法
    。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２のジ
    ンクフィンガータンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィ
    ンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発
    現ベクターを前記細胞に投与する第１の工程をさらに包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記ジンクフィンタータンパク質の発現が、低分子の制御
    下にある、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、前記第１のジンクフィ
    ンガータンパク質の発現、および前記第２のジンクフィンガータンパク質の発現
    が、異なる低分子の制御下にあり、該第１および第２のジンクフィンガータンパ
    ク質の両方は、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、そして該第１および
    第２のジンクフィンガータンパク質が、同じ細胞において発現される、方法。
  23. 【請求項２３】 前記第１および第２のジンクフィンガータンパク質の両方
    が、遺伝子発現を抑制する調節ドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２
    ０に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデ
    ノウイルス発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、請求項２４に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーター
    に作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項２０に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記細胞が、約１．５×１０6個未満の各ジンクフィンガ
    ータンパク質のコピーを含む、請求項１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の上流に
    ある、請求項１に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位に隣接し
    ている、請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の下流の
    ＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項１に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方
    法は、以下： （ｉ）複数の候補遺伝子を同定する工程； （ｉｉ）第１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィンガ
    ータンパク質を提供する工程； （ｉｉｉ）該第１のジンクフィンガータンパク質が該第１の候補遺伝子と接触
    する条件下で第１の細胞を培養する工程であって、ここで、該第１のジンクフィ
    ンガータンパク質が、該第１の候補遺伝子の発現を調節する、工程； （ｉｖ）該候補遺伝子の発現パターンを決定し、そして該第１の候補遺伝子が
    選択された表現型と関連するか否かを決定する、工程；ならびに （ｖ）各候補遺伝子について、工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程、を包
    含する、 方法。
  32. 【請求項３２】 前記第１の候補遺伝子の第２の標的部位に結合する第２の
    ジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項３１に記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記候補遺伝子の少なくとも１つが、少なくとも約２００
    ヌクレオチド長のＥＳＴである、請求項３１に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 少なくとも２つの候補遺伝子が、選択された表現型を引き
    起こすために必要とされる、請求項３１に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記候補遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項３１に記
    載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約５０％だけ抑制さ
    れる、請求項３１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約１５０％まで活性
    化される、請求項３１に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む
    融合タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記調節ドメインが、低分子の制御下にある、請求項３８
    に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調
    節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細
    胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４１に記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現
    の活性化である、請求項３１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑
    制である、請求項３１に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトラン
    スフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およ
    びヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法
    。
  47. 【請求項４７】 請求項３１に記載の方法であって、前記ジンクフィンガー
    タンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク
    質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発現ベクターを前
    記細胞に投与する第１の工程をさらに包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 前記ジンクフィンタータンパク質の発現が、低分子の制御
    下にある、請求項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４
    ７に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデ
    ノウイルス発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、請求項４９に記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーター
    に作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項４７に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記細胞が、約１．５×１０6個未満の前記ジンクフィン
    ガータンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の上流に
    ある、請求項３１に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位に隣接し
    ている、請求項３１に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の下流の
    ＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項３１に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方
    法は、以下： （ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程； （ｉｉ）該第１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィン
    ガー、および該第１の候補遺伝子の第２の標的部位に結合する第２のジンクフィ
    ンガーを提供する工程； （ｉｉｉ）該第１のジンクフィンガータンパク質が該第１の候補遺伝子と接触
    する条件下で第１の細胞を培養し、該第２のジンクフィンガータンパク質が該第
    １の候補遺伝子と接触する条件下で第２の細胞を培養する工程であって、ここで
    、該第１および第２のジンクフィンガータンパク質が、該第１の候補遺伝子の発
    現を調節する、工程；ならびに （ｉｖ）選択された表現型についてアッセイする工程であって、これにより該
    第１の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する工程、を包
    含する、 方法。
  57. 【請求項５７】 前記第２の候補遺伝子の標的部位に結合する第３のジンク
    フィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項５６に記載の方
    法。
  58. 【請求項５８】 複数の候補遺伝子を選択する工程、および各候補遺伝子の
    標的部位に結合する複数のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに
    包含する、請求項５６に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記第２の候補遺伝子が、制御遺伝子である、請求項５７
    に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記第１の候補遺伝子が、少なくとも２００ヌクレオチド
    長のＥＳＴである、請求項５６に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記第１の候補遺伝子および前記第２の候補遺伝子の両方
    が、前記選択された表現型を引き起こすために必要とされる、請求項５７に記載
    の方法。
  62. 【請求項６２】 前記第１および第２の細胞が同一の細胞である、請求項５
    ６に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記第１の候補遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項５
    ６に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記第１の候補遺伝子の発現が、少なくとも約５０％だけ
    抑制される、請求項５６に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記第１の候補遺伝子の発現が、少なくとも約１５０％ま
    で活性化される、請求項５６に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記第１のジンクフィンガータンパク質が、調節ドメイン
    を含む融合タンパク質である、請求項５６に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記調節ドメインが、低分子の制御下にある、請求項６６
    に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調
    節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項６６に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細
    胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６９に記載の方
    法。
  71. 【請求項７１】 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項７１に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現
    の活性化である、請求項５６に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑
    制である、請求項５６に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトラン
    スフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およ
    びヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法
    。
  75. 【請求項７５】 請求項５６に記載の方法であって、前記第１および第２の
    ジンクフィンガータンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフ
    ィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該
    発現ベクターを前記細胞に投与する第１の工程をさらに包含する、方法。
  76. 【請求項７６】 前記ジンクフィンガータンパク質の発現が、低分子の制御
    下にある、請求項７５に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 請求項７６に記載の方法であって、前記第１のジンクフィ
    ンガータンパク質の発現、および前記第２のジンクフィンガータンパク質の発現
    が、異なる低分子の制御下にあり、ここで、該第１および第２のジンクフィンガ
    ータンパク質の両方が、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、そしてここ
    で、該第１および第２のジンクフィンガータンパク質が、同一の細胞において発
    現される、方法。
  78. 【請求項７８】 請求項７７に記載の方法であって、前記第１のジンクフィ
    ンガータンパク質が、遺伝子発現を抑制する調節ドメインを含み、そして前記第
    ２のジンクフィンガータンパク質が、遺伝子発現を活性化する調節ドメインを含
    む、方法。
  79. 【請求項７９】 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７
    ５に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデ
    ノウイルス発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、請求項７９に記載
    の方法。
  81. 【請求項８１】 前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーター
    に作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項７５に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記細胞が、約１．５×１０6個未満の各ジンクフィンガ
    ータンパク質のコピーを含む、請求項５６に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記第１または第２の標的部位が、前記第１の候補遺伝子
    の転写開始部位の上流にある、請求項５６に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記第１または第２の標的部位が、前記第１の候補遺伝子
    の転写開始部位に隣接している、請求項５６に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 前記第１または第２の標的部位が、前記第１の候補遺伝子
    の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項５
    ６に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方
    法は、以下： （ｉ）第１の候補遺伝子を選択する工程； （ｉｉ）該第１の候補遺伝子の第１の標的部位に結合する第１のジンクフィン
    ガータンパク質を提供する工程； （ｉｉｉ）該第１の候補ジンクフィンガータンパク質が該第１の候補遺伝子と
    接触する条件下で第１の細胞を培養する工程であって、ここで、該第１のジンク
    フィンガータンパク質は、該第１の候補遺伝子の発現を調節する、工程；ならび
    に （ｉｖ）選択された表現型についてアッセイする工程であって、それにより該
    第１の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する、工程、を
    包含する、 方法。
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