JP5827519B2 - ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤 - Google Patents

Description

本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤、及びこれを含む飲食品、医療品、化粧品、飼料、ペットフード等の各種製品に関する。

ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（以下、ＰＰＡＲと略す。）は、ほとんどの脊椎動物に発現している核内受容体であり、種々の遺伝子の発現や制御を通じて様々な生体反応をコントロールしている。ＰＰＡＲにはα、β／δ、γのサブタイプが存在し、それぞれに発現している組織や制御している遺伝子系が異なっている。例えばＰＰＡＲ−αは筋肉や肝臓で高発現し、エネルギー代謝に関与している。これに対しＰＰＡＲ−γの発現は脂肪細胞に特異的であり、その他の組織ではほとんど発現せず、脂肪細胞の分化・成熟や各種のサイトカイン産生に関与している（例えば、非特許文献１参照。）

ＰＰＡＲの重要性は、ＰＰＡＲの活性化等により、インスリン抵抗性の改善や血清脂質低下作用といったメタボリックシンドロームＰ関連症状が緩和されることが見いだされたことにある。例えばピオグリタゾンに代表されるチアゾリジン誘導体は、インスリン抵抗性を高める作用を有することから糖尿病の治療薬として用いられているが、この作用はＰＰＡＲ−γの活性化、すなわちＰＰＡＲ−γのアゴニスト作用によるものであることが明らかとなっている（例えば、非特許文献２参照）。またＰＰＡＲ−αアゴニストであるフェノフィブラートは強いコレステロール及び中性脂肪低下作用を有することから、高脂血症薬として臨床応用されている（例えば、非特許文献３参照）。

これまでにＰＰＡＲには複数のサブタイプ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγが同定されている。これらはいずれもレチノイド受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、特徴的な１ｂｐのスペーサーを含むダイレクトリピート（ＤＰ１）を有する標的遺伝子のエンハンサー領域であるＰＰＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＰＲＥ）に結合することによって当該遺伝子の転写を制御することが知られている。ＰＰＡＲの活性化には自身のアゴニストがリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することが必要であることも報告（非特許文献４）がなされている。

従来、ＰＰＡＲについては、精力的な研究が進められており、種々の生体内機能が解明されている。例えば、ＰＰＡＲαについては、中性脂肪の分解促進、脂肪代謝の活性化、角化細胞への分化誘導（非特許文献５−６等）、メラノサイトへの分化抑制（非特許文献５−６等）、抗炎症（非特許文献７−８等）、生体リズムの調節遺伝子Ｂｍａｌ１の発現促進（非特許文献９等）等の機能が知られている。また、ＰＰＡＲβについては、耐糖能の維持やインスリン抵抗性の改善（非特許文献１０−１１等）、抗炎症（非特許文献１２等）、動脈硬化の改善（非特許文献１３等）、創傷治癒促進（非特許文献１５等）、抗肥満や中性脂肪の低減（非特許文献１６等）等の機能が知られている。更に、ＰＰＡＲγについては、インスリン抵抗性の改善（非特許文献１７等）、脂肪細胞の肥大化抑制（非特許文献２０等）、中性脂肪及び遊離脂肪酸の低減、抗炎症（非特許文献２１−２２等）、アミロイドβの脳内蓄積の抑制（非特許文献２３等）、脳梗塞部位の縮小（非特許文献２４等）等の機能が知られている。このように、ＰＰＡＲは、肥満、糖尿病、動脈硬化、脳梗塞等の種々の疾患に関与する重要なレセプターの一つであるばかりでなく、それ以外にも角化細胞への分化促進作用等が知られている。よってこのＰＰＡＲを活性化することにより各種疾患の改善効果だけではなく、皮膚の状態の改善効果を奏するものと期待されている。

これまでに、脂肪酸、エイコサノイド、カルバプロスタサイクリン、非ステロイド抗炎症剤等を含む数多くの物質が、ＰＰＡＲを活性化に関与することが知られている。またＰＰＡＲｓは合成セラミドによって活性化されることが報告されている（非特許文献２５）。

一方、８位に二重結合を有するスフィンゴイドは、脂肪酸と結合することで、植物に見られるセラミドとなるセラミド前駆体である。植物セラミドはその保湿効果から多くの飲食品、化粧品、入浴剤等に使用されているが、８位に二重結合を持つスフィンゴイド、なかでも４，８−スフィンガジエニンや４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンの機能については十分に解明されていない。

また、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミドにＰＰＡＲ作用を有すること報告されている（特許文献１）が、４，８−スフィンガジエニンと４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン等の８位に二重結合を持つスフィンゴイドのＰＰＡＲ活性化作用は報告されていなかった。セラミドは、スフィンゴイドに長鎖脂肪酸がアミド結合している物質であり、スフィンゴイドとは物性や分子量、生体内での主な分布や機能が全く異なる分子である。

特開２０１０−１３２６２２

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．，１３７，３５４（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，ｐ１２９５３−１２９５６（１９９５） Ｎｅｗ Ｃｕｒｒｅｎｔ，７（６），９−１９（１９９６） 生活習慣病とＰＰＡＲｓ ライフサイエンス出版 Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９８；１１０：３６８−３７５ Ｌｉｐｉｄｓ ２００４；３９：１０９３−１０９９ Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９９：７９０−７９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２０００；２７５：３６７０３−３６７０７ Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２００６；２０：１７１５−１７２７ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２００５；５４：２４６０−２４７０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ． ２００３；１００：１５９２４−１５９２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２：４５３−４５７ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ２００５；１８１：２９−３７ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００４；１２２：９７１−９８３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２００７；２７：７１６１−７１７５ Ｃｅｌｌ ２００３；１１３：１５９−１７０ ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００４；４：２３ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００４；１２３：３０５−３１２ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００４；１２２：１３０−１３９ Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｊｐｎ． ２００３；１２２：２９４−３００ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． ２００３；１９８：４１１−４２１ Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９９；１０４：３８３−３８９ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００４；２４：１０９０８−１０９１７ ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２００６；２０：１１６２−１１７５ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２００１；１５：３２６３−３２７７

本発明は、ＰＰＡＲに対して優れた活性化作用を有するＰＰＡＲ活性化剤を提供することを目的とする。更に、本発明は、該ＰＰＡＲ活性化剤を含有する飲食品、化粧品、医薬品、ペットフード等の各種製品を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検討した結果、意外にも、８位に二重結合を有するスフィンゴイドが、ＰＰＡＲに対して優れた活性化作用を示すことを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成するに至った。

すなわち本発明は下記の通りである。
（１） ８位に二重結合を有するスフィンゴイドを有効成分とする、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
（２） 前記スフィンゴイドが３位及び４位の少なくも一方に水酸基が置換されている、（１）に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
（３） 前記スフィンゴイドの炭素数が１６〜２２である、（１）又は（２）に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
（４） 前記スフィンゴイドが、植物及び／又は菌類由来のスフィンゴ脂質を加水分解して得られるものである、（１）〜（３）いずれかに記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
（５） 前記スフィンゴイドが、４，８−スフィンガジエニン及び／又は４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンである、（１）〜（４）のいずれかに記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
（６） メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、又は動脈硬化の予防又は治療に使用される、（１）〜（５）のいずれかに記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。

本発明によれば、安価かつ効果的にＰＰＡＲを活性化させることができ、ＰＰＡＲが関与する疾患を予防又は改善することが可能になる。また、本発明によれば、ＰＰＡＲを活性化することにより、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、又は動脈硬化などを効果的に予防又は治療を行なうこともできる。

また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、飲食品、化粧品、医薬品、ペットフード等の各種製品に配合して使用できるので、ＰＰＡＲ活性化作用を含有する各種製品を提供できる。

以下本発明について説明する。本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、８位に二重結合を有するスフィンゴイドを有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明のＰＰＡＲ活性化剤について詳述する。

８位に二重結合を有するスフィンゴイド
８位に二重結合を有するスフィンゴイドについて、以下に述べる。
本発明に用いられる８位に二重結合を有するスフィンゴイドとは、炭化水素鎖の１位に水酸基及び２位にアミノ基が結合している長鎖アミノアルコールであって、８位に二重結合（即ち、８位の炭素原子と９位の炭素原子の二重結合）を有する化合物である。該スフィンゴイドは、直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。

８位に二重結合を有するスフィンゴイドの炭素数として、好ましくは１６〜２２、更に好ましくは１８〜２０が挙げられる。更に、該スフィンゴイドは、８位以外の位置にも、１又は２以上の二重結合を有してもよい。該スフィンゴイドにおいて、８位以外にも二重結合を有する場合、該二重結合の位置の好適な例としては４位（即ち、４位の炭素原子と５位の炭素原子の二重結合）が挙げられる。本発明に用いられるスフィンゴイドの好適な一例として、８位のみに二重結合を有するスフィンゴイド、４位と８位に二重結合を有するスフィンゴイドが挙げられる。

また、８位に二重結合を有するスフィンゴイドは、１位の水酸基及び２位のアミノ基以外に、水酸基、アミノ基、メチル基等の置換基が結合していてもよい。ＰＰＡＲ活性化作用を一層向上させるという観点から、好ましくは、３位及び４位の少なくも一方に水酸基が置換されているスフィンゴイド；更に好ましくは、３位に水酸基が置換されているスフィンゴイド、並びに３位及び４位の双方に水酸基が置換されているスフィンゴイドが挙げられる。

８位に二重結合を有するスフィンゴイドとして、具体的には、４，８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン、８−スフィンゲニン等が挙げられる。４，８−スフィンガジエニンとしては、ｄ１８：２（４ｔ，８ｔ）、ｄ１８：２（４ｃ，８ｔ）、ｄ１８：２（４ｔ，８ｃ）、及びｄ１８：２（４ｃ，８ｃ）の中から、１種を単独で使用してもよく、またこれらの中の２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンとしては、ｔ１８：１（８ｔ）及びｔ１８：１（８ｃ）の中から、１種を単独で使用してもよく、またこれら組み合わせて使用してもよい。また、８−スフィンゲニンとしては、ｄ１８：１（８ｔ）及びｄ１８：１（８ｃ）の中から、１種を単独で使用してもよく、またこれら組み合わせて使用してもよい。ここで、表記「ｄ１８：２」は４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンを示し、その後ろに示す括弧内の「４ｔ」は４位がトランス体、「４ｃ」は４位がシス体、「８ｔ」は８位がトランス体、及び「８ｃ」は８位がシス体であることを示す。また、表記「ｔ１８：１」は４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンを示し、その後ろに示す括弧内の「８ｔ」は８位がトランス体、「８ｃ」は８位がシス体を示す。また、表記「ｄ１８：１」は８−スフィンゲニンを示し、その後ろに示す括弧内の「８ｔ」は８位がトランス体、「８ｃ」は８位がシス体を示す。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤において、８位に二重結合を有するスフィンゴイドは、１種単独で使用しても、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

８位に二重結合を有するスフィンゴイドは、スフィンゴ脂質の加水分解、化学合成、酵素合成等の公知の製法により得ることができる。本発明のＰＰＡＲ活性化剤において、８位に二重結合を有するスフィンゴイドとして、スフィンゴ脂質の加水分解により得られるものが好適に使用される。

スフィンゴ脂質を加水分解して８位に二重結合を有するスフィンゴイドを得る方法については、特に制限されないが、例えば、スフィンゴ脂質を酸又はアルカリで加水分解する方法が挙げられる。

スフィンゴ脂質を酸で加水分解する方法としては、具体的には、酸を用いてｐＨ１〜３程度に調整した酸性溶液にスフィンゴ脂質を入れて、６０〜８０℃程度で２〜２４時間インキュベートする方法が挙げられる。スフィンゴ脂質の加水分解に使用される酸の種類については、特に制限されるものではなく、有機酸、無機酸のいずれであってもよい。また、スフィンゴ脂質の加水分解に使用される酸性溶液の組成についても、特に制限されないが、一例として、含水アルコールに塩酸を添加した溶液が挙げられる。

また、スフィンゴ脂質をアルカリで加水分解する方法としては、具体的には、アルカリを用いてｐＨ１２〜１４程度に調整したアルカリ性溶液にスフィンゴ脂質を入れて、３０〜１５０℃程度で２〜２４時間インキュベートする方法が挙げられる。スフィンゴ脂質の加水分解に使用されるアルカリの種類やアルカリ性溶液の組成については、特に制限されない。

斯してスフィンゴ脂質を加水分解することにより生成したスフィンゴイドを、カラムクロマトグラフィーや分取型ＨＰＬＣ等の精製処理に供することにより、８位に二重結合を有するスフィンゴイドが回収される。本発明のＰＰＡＲ活性化剤に使用される８位に二重結合を有するスフィンゴイドは、高度に精製されたものでなく粗精製物であってもよいが、ＰＰＡＲ活性化作用の観点から、スフィンゴイドの総量に対する８位に二重結合を有するスフィンゴイド（特に、４，８−スフィンガジエニン及び／又は４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン）の割合が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上がより好ましく、９０質量％以上が特に好ましい。

また、スフィンゴイドの製造原料として使用されるスフィンゴ脂質は、例えば、８位に二重結合を有するスフィンゴイド塩基が結合したスフィンゴ脂質を含む天然素材から抽出することにより得られる。スフィンゴ脂質を含む天然素材としては、例えば、植物、動物、菌類等が挙げられ、好ましくは植物及び菌類が使用される。

スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される植物については、８位に二重結合を有するスフィンゴイド塩基が結合したスフィンゴ脂質を含む限り、特に制限されない。このような植物としては、例えば、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマチャ、アマチャヅル、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カリン、ガルシニア、カルダモン、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク芋（コンニャクトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、ゼニアオイ、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンジン、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ヘチマ、ベニバナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マタタビ、マリーゴールド、マンゴー、ミツバ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの植物の中でも、含有量と経済性の観点から、コンニャク芋（コンニャクトビ粉を含む）、及び温州ミカンが好ましい。スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される植物の部位については、植物の種類に応じて適宜設定される。

スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される菌類については、８位に二重結合を有するスフィンゴイド塩基が結合したスフィンゴ脂質を含む限り、特に制限されない。このような菌類としては、例えば、酵母、糸状菌（カビ）、担子菌（キノコ）類等の真菌類が挙げられる。スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される菌類の部位については、菌類の種類に応じて適宜設定される。

スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される酵母としては、例えば、サッカロマイセス・クルイヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等のサッカロマイセス属；クルイヴェロマイセス・ラクティス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ ｌａｃｔｉｓ）、クルイヴェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイヴェロマイセス・ワルティ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ）、クルイヴェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイヴェロマイセス・ウィッケルハミ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）等のクルイヴェロマイセス；チゴサッカロマイセス・シドリ（Ｚｙｇｏｘａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｄｒｉ）、チゴサッカロマイセス・フェルメンタティ（Ｚｙｇｏｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）等のチゴサッカロマイセス属等が挙げられる。

スフィンゴ脂質の抽出原料として使用されるカビとしては、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属；リゾープス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等のリゾープス属；ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）等のペニシリウム属；モナスクス・アンカ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ａｎｋａ）等のモナスクス属等が挙げられる。

スフィンゴ脂質の抽出原料として使用される担子菌類としては、子実体、菌糸体のいずれも使用することができ、食用できるものが望ましい。例えば、グリフォラ属、レンチナス属、プルーロタス属、フラムリナ属、フォリオタ属、アガリスク属、ハナビラタケ属に属する担子菌が広範に使用でき、具体的には、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、タモギタケ（Ｐｌｕｅｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｎａｍｅｋｏ）、ツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ハナビラタケ（Ｓｐａｒａｓｓｉｓ ｃｒｉｓｐａ）等が挙げられる。

スフィンゴ脂質の抽出に使用される抽出溶媒については、スフィンゴ脂質を抽出可能であることを限度として、水、有機溶媒、これらの混合物のいずれを使用してもよい。有機溶媒としては、特に制限されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ピリジン類等が挙げられる。これらの有機溶媒は１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

これらの有機溶媒の中でも、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を食品分野で使用する場合には、安全性の観点から、水、エタノール、及び／又はヘキサンを使用することが望ましい。

また、スフィンゴ脂質の抽出効率を高めるために、必要に応じて、酵素、界面活性剤等の添加剤を抽出溶媒に加えてもよい。

上記天然素材からスフィンゴ脂質を抽出するには、公知の抽出処理を用いればよく、超臨界抽出法を使用することも可能である。また、必要に応じて、複数回の抽出処理を行ってもよく、これにより天然素材から抽出されるスフィンゴ脂質量を高めることもできる。

斯して得られた抽出液は、そのままスフィンゴイドの加水分解に使用してもよいが、濃縮処理に供してスフィンゴ脂質を濃縮しておくことが望ましい。濃縮処理としては、例えば、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いる方法、加熱する方法等が挙げられる。また、斯して得られた濃縮物は、必要に応じて更に精製処理に供してもよい。精製処理としては、例えば、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等が挙げられる。これらの精製処理は、同一処理を複数回繰り返して実施してもよく、２以上の異なる処理を組み合わせて実施してもよい。

ＰＰＡＲ活性化剤の用途・用法
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、生体内でＰＰＡＲα、β、及び／又はγを活性化することにより、ＰＰＡＲが関与する生体機能を正常化又は向上させることができる。従って、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、ＰＰＡＲが関与する生体機能の正常化又は向上によってもたらされる用途、例えば、中性脂肪分解促進、脂肪代謝活性化、抗炎症、耐糖能の維持、インスリン抵抗性の改善、動脈硬化の改善、創傷治癒促進、脂肪細胞の肥大化抑制、アミロイドβの脳内蓄積の抑制、アミロイドβの脳内蓄積の抑制、メラノサイトへの分化抑制、角化細胞への分化誘導等に使用することができる。本発明のＰＰＡＲ活性化剤の好適な用途として、湿疹・皮膚炎、蕁麻疹、紅斑・紅皮症、水疱症、そばかす等の皮膚症状・疾患の予防又は治療；メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病の予防又は治療が例示される。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、経口、経腸、経粘膜、注射等の任意の投与形態で使用できるので、飲食品、化粧品、医薬品、ペットフード、飼料等の製品に配合して使用される。

また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤の剤型は、固形状、半固形状、液状等のいずれであってもよく、配合される製品の形態に応じて適宜設定される。本発明のＰＰＡＲ活性化剤が配合される製品には、その形態等に応じて、本発明の効果を損なわない範囲内で、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の添加剤を含有してもよい。また、本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤が配合される製品には、その形態や用途等に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、機能性成分を含有してもよい。機能性成分としては、例えば、ビタミンＣ、コラーゲン、スクワラン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ヒアルロン酸、プラセンタエキス、ソルビトール、キチン、キトサン、各種植物抽出物等が挙げられる。これらの配合量については、本発明の効果を損なわない限り限定されない。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を飲食品に使用する場合、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を単独で又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製して、ＰＰＡＲ活性化用の飲食品として提供される。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的には、パン類、麺類等の主菜；チーズ、ハム、ウィンナー、魚介加工品等の副菜；果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料；クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品；錠剤、顆粒、粉剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク等のサプリメント等が例示される。なお、病者用食品については、ＰＰＡＲ活性低下に起因する疾病患者やＰＰＡＲの活性化により症状の改善が見込まれる疾患の患者用の食事として使用することができる。

更に、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を飲食品に使用する場合、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を単独で又は他の成分と組み合わせて、ＰＰＡＲ活性化用の食品添加剤として提供することもできる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を飲食品に使用する場合、飲食品に対する該剤の配合割合（８位に二重結合を有するスフィンゴイドの配合割合）については、飲食品の形態等に応じて異なるが、例えば、０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜５質量％、更に好ましくは０．０１〜１質量％が挙げられる。

また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を化粧品に使用する場合、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製して、ＰＰＡＲ活性化用の化粧品として提供される。このような化粧品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、乳液、クリーム、化粧水（ローション）、パック、美容液、洗浄剤、メーキャップ化粧料等が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を化粧料に使用する場合、化粧料に対する該剤の配合割合（８位に二重結合を有するスフィンゴイドの配合割合）については、化粧料の形態等に応じて異なるが、例えば、０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜５質量％、更に好ましくは０．０１〜１質量％が挙げられる。

また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を医薬品に使用する場合、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基材や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製して、ＰＰＡＲ活性化用の医薬品として提供される。このような医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤等の経口投与製剤；外用剤、吸入剤、坐剤等の経皮又は経粘膜投与製剤；注射剤等が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を医薬品として使用する場合、医薬品に対する該剤の配合割合（８位に二重結合を有するスフィンゴイドの配合割合）については、医薬品の形態等に応じて異なるが、例えば、０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜５質量％、更に好ましくは０．０１〜１質量％が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を飼料又はペットフードに使用する場合、本発明のＰＰＡＲ活性化剤を単独で又は他の飼料成分と組み合わせて所望の形態に調製して、ＰＰＡＲ活性化用の飼料又はペットフードとして提供される。該飼料又はペットフードに使用される飼料成分としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、米ぬか等のぬか類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム類；ビタミン類；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤を飼料又はペットフードに使用する場合、飼料又はペットフードに対する該剤の配合割合（８位に二重結合を有するスフィンゴイドの配合割合）については、飼料又はペットフードの形態等に応じて異なるが、例えば、０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜５質量％、更に好ましくは０．０１〜１質量％が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ活性化剤の投与又は摂取量については、該剤の投与形態、投与対象者の年齢、期待される効果等に応じて、ＰＰＡＲ活性化に有効な量を適宜設定すればよい。例えば、経口投与又は摂取される場合であれば、８位に二重結合を有するスフィンゴイドとして成人１日あたりの投与又は摂取量を、通常０．０１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは０．１〜１００ｍｇ程度、更に好ましくは０．１〜３０ｍｇ程度に設定すればよい。このような投与又は摂取量を充足することにより、生体内でＰＰＡＲ活性化効果を有効に奏させることができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

調製例１（コンニャクからの８位に二重結合を有するスフィンゴイドの調製）
コンニャクとび粉１ｋｇを撹拌糟に仕込み、そこにエタノール２Ｌを加え、常温で２時間撹拌して混合物を得た。得られた混合物をろ過し、抽出物（抽出溶液）と残渣とに分離した。抽出溶液をエバポレーターにより濃縮し、茶褐色の蝋状濃縮物を約１０ｇ得た。

得られた濃縮物１０ｇを、０．４ＮのＫＯＨ水溶液５００ｍｌにより２５℃にて２時間弱アルカリ分解した後、混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水＝８／４／３、体積比）で再抽出を行った。クロロホルム相を減圧下濃縮乾固して、脂質８．６ｇを得た。

続いて、この脂質を４倍量のアセトンで２回洗浄した後、２０倍量のエタノール、０．２倍量の活性炭を加え脱色処理し、黄白色固体１．４ｇを得た。この黄白色固体うち、１ｇをシリカゲルカラムに供給し、混合溶媒（酢酸エチル：エタノール＝９５：５（容量比）で共雑物を除き、９０：１０（容量比）で溶出）を用いてグルコシルセラミドを精製し、白色のグルコシルセラミド粉末０．６ｇを得た。得られたグルコシルセラミド粉末を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製、「ＣＬＡＳＳ−ＶＰ／ＬＣ−１０」）と薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ｍｅｒｃｋ社製 「Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０」）を用いて検出を行ったところ、他のピークやスポット等がほとんど見られなかった。共離ピークから純度を求めた結果、９８％以上であった。

続いて、このグルコシルセラミド粉末を、１Ｎ含水メタノール性塩酸（メタノール濃度８３質量％）中で、７０℃で１８時間加熱した。次いで、ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを抽出除去後、４ＮのＮａＯＨで中和し、さらにクロロホルム、メタノールを添加して、混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水＝１／１／１、体積比）として抽出することによってスフィンゴイド類を調製した。得られたスフィンゴイド類を、トリメチルシリル化剤（東京化成工業社製、「Ｃ０３０６」）を用いてトリメチルシリル化した。次いで、分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、「６８９０Ｎ、５９７５Ｃ」）を用いてＧＣ−ＭＳ分析を行ったところ、得られたスフィンゴイド類は、４，８‐スフィンガジエニン（５４質量％）、４−ヒドロキシ‐８‐スフィンゲニン（４０質量％）、及び８−スフィンゲニン等その他の微量スフィンゴイド（６質量％）の混合物であることが確認された。このスフィンゴイド類をさらにＴＬＣにて分取することで、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンと４、８−スフィンガジエニンを得た（純度９５％以上）

調製例２（酵母からの８位に二重結合を有するスフィンゴイドの調製）
サッカロマイセス クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、ＮＢＲＣ １６８５）を培養終了後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。分離した菌体をＰＢＳにて洗浄した後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心分離後の湿菌体を凍結乾燥機（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＭＩ−ＳＳ社製ＦＴＳ Ｄｕｒａ−Ｓｔｏｐ ＭＰ ａｎｄ Ｄｕｒａ Ｄｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）にて乾燥させた。約１００ｇの乾燥菌体を共栓付遠沈管に採取し、秤量後、１２００ｍｌのメタノールを添加した。氷冷しながら１０分の超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ製ＳＯＮＩＦＩＥＲ）処理を行い、次いで２４００ｍｌのクロロホルムを添加し氷冷しながら１０分の超音波ホモジナイザー処理を行った。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、上清を別の試験管に移した（Ａ）。残さにクロロホルム：メタノールが２：１（容量比）混合液を１２００ｍｌ添加し、氷冷しながら１０分の超音波ホモジナイザー処理を行ない、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、上清をＡと同じ試験管に移した。残さに、クロロホルム：メタノールが１：２（容量比）混合液を１２００ｍｌ添加し、氷冷しながら１０分の超音波ホモジナイザー処理を行い、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、上清をＡと同じ試験管に移した。これをエバポレーターで乾燥させたところ３ｇの脂質画分を得た。

この脂質を用いて調製例１と同様に精製を行ったところ、８位に二重結合を有する９−メチル−４，８−スフィンガジエニンを得た。（純度９５％以上）

実施例１（正常ヒト表皮角化細胞を用いたＰＰＡＲ産生促進作用の効果の評価）
正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社製、「ＮＨＥＫ」）を、２．５×１０^３細胞／ウェルとなるように、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、インキュベーター（ＥＳＰＥＣ社製）を用いて培養を行った。３日に一度培地（商品名：Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２、クラボウ社製）交換を行いながら、８０％コンフレントな状態になるまで培養を継続した。

調製例１で得た４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン又は４，８−スフィンガジエニンを１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにエタノール（ナカライテスク社製）に溶解した溶液を、培地（商品名：Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）（増殖添加剤不含有）で１０００倍に希釈することにより試験培地を調製した。この試験培地（５００μｌ／ウエル）を８０％コンフレントな状態の細胞に培地交換して作用させた。

対照群として３種類の試験培地を用いた。即ち、溶媒であるエタノール、および動物由来のスフィンゴイドであって８位に二重結合を有さない４−スフィンゲニン（ＡＶＡＮＴＩ ＰＯＬＡＲ ＬＩＰＩＤ社製）、すでにＰＰＡＲ活性が報告されているフィトセラミド（Ｄｏｏｓａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のセラミド３をＴＬＣにて精製後、純度９５％以上にして利用）を用いて、上記と同条件で試験を行った。

培地を交換した直後から、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で２４時間培養を行なった。２４時間経過後、該培地をプレートから除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄した後、核酸抽出試薬であるＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を各ウェル５００μｌずつ添加し懸濁することで細胞中のＲＮＡを溶解させ、ＲＮＡを抽出した。次いで、逆転写酵素（タカラバイオ社製、ＲＲ０３７Ａ）をＲＮＡ１０００ｎｇあたり１μｌ添加し、ｃＤＮＡを得た。

得られたｃＤＮＡを用い、リアルタイムＰＣＲ（アプライドシステムズジャパン社製）を使用して、各ＰＰＡＲ遺伝子量の半定量を行った。その定量結果を表１に示す。なお、表１は、エタノールを単独で含む試験培地（スフィンゴイド及びフィトセラミド不含有）を用いた場合の各ＰＰＡＲ遺伝子の発現量を基準値（１００）として、各ＰＰＡＲ遺伝子の発現量の相対値を算出した結果である。

表１から明らかなように、４−スフィンゲニンではＰＰＡＲの産生促進が殆ど認められなかったのに対して、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン及び４，８−スフィンガジエニンでは、陽性コントロールであるフィトセラミドを遥かに凌ぐＰＰＡＲ産生促進が認められた。この結果から、８位に二重結合を有するスフィンゴイドには、強いＰＰＡＲの産生促進作用があることが明らかとなった。

実施例２（マウス繊維芽細胞を用いたＰＰＡＲ活性化作用の評価）
小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６又は肝細胞株ＨｅｐＧ２を１２ｗｅｌｌプレートに播種しＤＭＥＭ（和光純薬製、５％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））中で一日培養した。これらの細胞に対して、ＰＰＡＲ応答配列であるＡＧＧＴＣＡ−Ｎ−ＡＧＧＴＣＡ（Ｎは任意の塩基）（配列番号１）を含むＤＮＡ鎖、ＳＶ４０プロモーター遺伝子、及び蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むＰＰＡＲレポータープラスミド（ＰＰＡＲ−Ｌｕｃ）を０．５μｇ／ｗｅｌｌとなるようにリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）を用いて形質転換を行った。別途、調製例１で得た４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン又は４，８−スフィンガジエニンを１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにエタノール（ナカライテスク社製）に溶解した溶液を、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ不含有、２５０μＭのＢＳＡ添加）で１０００倍に希釈することにより試験培地を調製した。この試験培地（１ｍｌ／ウエル）を、上記で得られた形質転換体に培地交換して作用させた。培地交換から２４時間培養後に、形質転換体をＰＢＳ（和光純薬製）で洗浄を行いルシフェラーゼ定量システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のプロトコールに基づいて細胞の回収と発光を測定して、ＰＰＡＲ活性化作用を数値化した。

対照群として３種類の試験培地を用いた。即ち、溶媒であるエタノール、８位に二重結合を有さない４−スフィンゲニン（ＡＶＡＮＴＩ ＰＯＬＡＲ ＬＩＰＩＤ社製）、すでにＰＰＡＲ活性が報告されているフィトセラミド（Ｄｏｏｓａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のセラミド３をＴＬＣにて精製後、純度９５％以上にして利用）を用いて、上記と同条件で試験を行った。

得られた結果を表２に示す。表２は、エタノールを単独で含む試験培地（スフィンゴイド及びフィトセラミド不含有）を用いた場合の細胞の蛍光強度を基準値（１００）として、各細胞の蛍光強度の相対値を算出した結果である。

表２から明らかなように、４−スフィンゲニンではＰＰＡＲの活性化作用が殆ど認められなかったのに対して、４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン及び４，８−スフィンガジエニンでは、陽性コントロールであるフィトセラミドを遥かに凌ぐＰＰＡＲ活性化が認められた。この結果から、８位に二重結合を有するスフィンゴイドには、ＰＰＡＲの産生量を増やすだけでなく、その活性の上昇させることが明らかとなった。

Claims (4)

1. 炭素数が１６〜２２であり、３位及び４位の少なくも一方に水酸基が置換されており、８位に二重結合を有するスフィンゴイドを有効成分とする、経口用ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤（ただし、コラーゲン産生促進用途を除く。）。
2. 前記スフィンゴイドが、植物及び／又は菌類由来のスフィンゴ脂質を加水分解して得られるものである、請求項１に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
3. 前記スフィンゴイドが、４，８−スフィンガジエニン及び／又は４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニンである、請求項１又は２に記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
4. メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、又は動脈硬化の予防又は治療に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載のペルオキシソーム増殖剤応答性受容体活性化剤。