JP5766750B2 - シュピーゲルマーの新規な使用 - Google Patents
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Description
発現が関与するイントラマーの場合に適合された経路は、シュピーゲルマー、すなわちL−核酸からなるアプタマーを合成することができる生物学的系が存在しないので、原理的にシュピーゲルマーには閉ざされている。
−少なくとも1つの細胞内受容体を含有する細胞を準備し、
−L−核酸を準備し、そして
−細胞をL−核酸とインキュベーションする、
ことを含んでなる。
散星状細胞腫;骨巨細胞腫;皮膚ガン;バーキットリンパ腫;ルイス肺癌;白血病;非−小細胞肺癌腫;ならびに各々の場合でその転移および/または転移している形態を含んでなる群から選択される。
ル(vehicle)を含んでなる組成物により達成される。
。
と区分ヘリックスB2の5’末端の間に1〜7個のヌクレオチドが整列される。
N1=U、C、AまたはG;
N2=GまたはU;
N3=UまたはC;
N4=UまたはA;
N5=GまたはA;そして
N8=Uまたは存在しない
である。
N1=U、C、AまたはG;
N2=GまたはU;
N3=UまたはC;
N4=UまたはA;
N5=GまたはA;
N6=G、AまたはU;
N7=GまたはU;
N8=Uまたはヌクレオチド無し;
Nx=0〜5個のヌクレオチド;
Ny=0または6個のヌクレオチド;そして
Nz=0〜6個のヌクレオチド;
区分ボックスA1および区分ボックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立してGGGCG、GGGUGおよびGGGAGを含んでなるヌクレオチド配列の群から選択され;
区分ヘリックスA1および区分ヘリックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスA1およびヘリックスA2は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスB1およびヘリックスB2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスB1およびヘ
リックスB2は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そしてハイブリダイズする領域が4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、そしてここで区分ヘリックスA1と区分ヘリックスA2との、および区分ヘリックスB1と区分ヘリックスB2とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和が10〜12ヌクレオチド対である、
を含んでなる。
N1=U、C、AまたはG;
N2=GまたはU;
N3=UまたはC;
N4=UまたはA;
N5=GまたはA;
N6=G、AまたはU;
N7=GまたはU;
N8=Uまたはヌクレオチド無し;
Nx=0〜5個のヌクレオチド;
Ny=0または5個のヌクレオチド;そして
Nz=0〜6個のヌクレオチド;
区分ボックスA1および区分ボックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立してGGGCG、GGGUGおよびGGGAGを含んでなるヌクレオチド配列の群から選択され;
区分ヘリックスA1および区分ヘリックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスA1およびヘリックスA2は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスB1およびヘリックスB2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスB1およびヘリックスB2は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そしてハイブリダイズする領域が4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、そしてここで区分ヘリックスA1とヘリックスA2との、および区分ヘリックスB1と区分ヘリックスB2とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和が10〜12ヌクレオチド対である、を含んでなる。
HMGA結合核酸が12〜25個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Z2を含んでなる。
一態様でもある)、HMGA結合核酸の中央区分Ncが3〜5個のヌクレオチドを含んでなる。
Na=1〜5個のヌクレオチド;
Nb=3個のヌクレオチド;
Nc=3〜5個のヌクレオチド;
Nd=2〜5個のヌクレオチド;そして
Nc=1〜2個のヌクレオチド、好ましくはAまたはUU;
区分ボックスA1および区分ボックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立してGGGCG、GGGUGおよびGGGAGを含んでなる群から選択され;
区分ヘリックスA1およびヘリックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して5もしくは6個のヌクレオチドを含んでなり、そして
区分ヘリックスC1およびヘリックスC2は各々の場合で5もしくは6個のヌクレオチドを含んでなり、これらは好ましくは互いに完全に、または部分的にハイブリダイズする、
を有する。
Ni=2個のヌクレオチド、好ましくはCA;
Nj=2個のヌクレオチド、好ましくはAG;
Nc=4個のヌクレオチド、好ましくはGAUG;
区分ボックスA1およびボックスA2が各々の場合で個別に、そして互いに独立して配列GGGCG、GGGUGおよびGGGAGを含んでなる群から選択され;
区分ヘリックスA1およびヘリックスA2が各々の場合で個別に、そして独立して6個のヌクレオチドを含んでなり、これは好ましくは互いにハイブリダイズし;
区分ヘリックスB1およびヘリックスB2が各々の場合で個別に、そして独立して5個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスB1および区分ヘリックスB2は互いにハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスC1およびヘリックスC2が各々の場合で個別に、そして独立して3個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスC1およびヘリックスC2が互いハイブリダイズする、
を有する。
−候補HMGAアンタゴニストおよび/または候補HMGAアゴニストを準備し、
−第7観点に従う核酸を準備し、
−HMGAアンタゴニストおよび/またはHMGAアゴニストの存在下でシグナルを送達する試験系を準備し、そして
−候補HMGAアンタゴニストがHMGAアンタゴニストであるかどうか、および/または候補HMGAアゴニストがHMGAアゴニストであるかどうかを決定する、
工程を含んでなる、HMGAアンタゴニストまたはHMGAアゴニストのスクリーニング法により第9観点で達成される。
−相、好ましくは固相に固定化されたHMGAを準備し、
−第7観点に従う核酸、好ましくは標識された第7観点に従う核酸を準備し、
−候補HMGAアゴニストおよび/または候補HMGAアンタゴニストを加え、そして
−候補HMGAアゴニストがHMGAアゴニストであるかどうか、および/または候補HMGAアンタゴニストがHMGAアンタゴニストであるかどうかを決定する、
工程を含んでなる、HMGAアゴニストおよび/またはHMGAアンタゴニストのスクリーニング法により第10観点で達成される。
およびヒトの身体で使用される場合の高い安定性、および毒性または免疫学的に活性な分解産物が不存在であるというようなL−ヌクレオチドの構造による機能的L−核酸に固有の特性は、プラスミドまたは通常にはベクターにコードされるL−核酸がインタラマーの場合のように細胞性のメカニズムを正しく利用できるようにせず、すなわち細胞内で起こる転写のプロセスにより実際に機能的な核酸を提供する。
al.,Nat.Biotech,14,1116−1119、1996;およびKlussmann et al.,Nat.Biotechnol,14,1112−1115、1996に記載されている。
またはアプタマーまたはシュピーゲルマーにより最終的に結合される分子を表す。
子への結合に影響を及ぼす因子についてはそうである。
に疾患が軽減され、防止され、または治癒され、および/または診断薬の場合は疾患またはそれらに対する素因が確立されるか、または診断され得ることを意味する。本明細書で使用するように、診断の概念には、早期診断ならびにその後の診断、特に例えば疾患の進行または疾患の段階を追跡または測定するための診断または調査を含む。標的分子は本明細書に記載するような細胞内受容体、特に転写因子、細胞内標的分子またはHMGタンパク質であることが本発明の範囲内である。本発明の範囲内で、標的分子が細胞内に存在し(すなわち細胞内)、そして疾患および/または診断に影響を有する相互作用がL−核酸、そして特にシュピーゲルマーと標的分子、すなわち受容体との間で細胞内で起こることが最も特別に好適である。また標的分子が細胞の外側に存在し、そしてL−核酸、そして特にシュピーゲルマーと標的分子、すなわち受容体との間の相互細胞が細胞外で起こることも本発明の範囲内である。
詳細に記載する。
Drug Disc,4:145−160,2005)。
06,1999;Bioconjug Chem,6:101−108,1995)。さらにいわゆるシグナル輸送ペプチド(IP)もあり、これらは核酸の細胞性の取り込みを促進することができ、そして例えばカポジの繊維芽細胞増殖因子(K−FGF)から誘導することができた(Adv Drug Deliv Rev,44:35−49,2000)。
Materials,3(4):244−8,2004)。
00;J Drug Target,5:291−302,1998)。
5、そして最も特に好ましくは約2〜3に調整される。
本発明を形成する知識の特定の例である。HMGAタンパク質およびそれに向けられたL−核酸の立体配置に関して、L−核酸の細胞内使用について本明細書で言及するコメントは、本発明のこの観点と関連しても応用し(そしてその逆にも応用する)、そして不必要な反復を回避するためにここもこの点に原因があるとみなす。
al.,1994)。塩基性HMGタンパク質は、3つの異なるファミリー−HMGB(正式にはHMG−1/−2)、HMGN(正式にはHMG−14/−17)およびHMGAファミリーは、(正式にはHMG−I/Y/C)に細分類される。各HMGファミリーは、その特徴的な機能的配列モチーフを有する:「HMGボックス」(HMGBファミリー)、「ヌクレオソーム結合ドメイン」(HMGNファミリー)、および「ATフック」(HMGAファミリー)。
に局在するHMGA2遺伝子の発現に関する調査では、これらが主に細胞分化のプロセスで活性であることが示された。したがってこれら遺伝子の強い発現は、胚の発生中および未分化細胞(Chiappetta et al 1996)ならびに増殖因子が刺激する細胞(Friedman et al 1993;Johnson et al 1990;Ogram et al 1995;Holth et al 1997)に見いだすことができる。成体の分化した組織では、HMGA1は網膜でのみ強力に発現し、一方、HMGA2はすべての他の組織中で見いだされず、そしてHMGA1は大変低濃度で見いだされるだけである(Bussemakers et al 1991;Chiappetta et al 1996;Rogalla et al 1996;Zhou
et al 1995;Chau et al 2000)。分化した正常組織中のHMGAタンパク質の再活性化発現は、脂肪細胞の成長および分化を伴う時期(Zhou et al 1995;Anand & Chada 2000;Melillo et
al 2001)、脈管損傷後の血管の平滑筋細胞の増殖(Chin et al 1999)、炎症反応における免疫応答(Pellacani et al 1999)、ならびにアポトーシスプロセス(Diana et al 2001;Sgarra et al 2003)と同時である。これと関連してHMGA1の量は、細胞の増殖速度に依存して変動する(Johnson et al 1990)。
・ 細胞サイクルおよびcdc25Aのような増殖レギュレーター
・ サイトケラチン1型のような中期フィラメントマーカー
・ TRAR15のようなアポトーシスレギュレーター
・ 発癌遺伝子およびMETのような腫瘍抑制遺伝子
・ DNA修復およびDNase Xのような組換えに関する遺伝子
・ frizzled−5のような細胞運命および発生レギュレーター
・ FGFR1のような受容体
・ コラーゲン1型のような細胞接着、運動性および浸襲遺伝子
・ FGFR2のような新脈管形成レギュレーター
・ MMP−16のような浸襲レギュレーター
・ Rhoファミリーの小GTPaseおよびRhoCのようなそれらのレギュレーター・ カドヘリン12のような細胞−細胞相互作用遺伝子
・ 増殖因子およびIL−11のようなサイトカイン
に影響する(Reeves et al 2001)。
繁に間葉腫瘍に転換することはめったにない)、すでに早期に過形成中でHMGAを発現する。これは異なる胚起源の組織中でHMGAタンパク質が異なる機能を満たすという事実を指摘し、これからまた、今後さらに詳細に具体的に説明されるように、対応する疾患の診断および/または処置における本発明によるL−核酸の対応する用途が直接的に追随する。
・ 前立腺(Bussemaker et al 1991;Tamimi et al
1996,Leman et al 2003;Nestl et al 2001)・ 膵臓(Nestl et al 2001;Abe et al 2000,2002;Tarbe et al 2001)
・ 甲状腺(Chiappetta et al 1998,1995)
・ 頸部(Bandiera et al 1998)
・ 胃(Xiang et al 1997)
・ 胸部(Holth et al 1997;Baldassarre et al 2003;Reeves et al 2001;Nestl et al 2001;Ram et al 1993;Dolde et al 2002)
・ 結腸/直腸(Fedele et al 1996;Abe et al 1999;Kim et al 1999;Chiapetta et al 2001)
・ 卵巣(Masciullo et al 2003)
・
およびさらに
・ 神経芽腫(Giannini et al 2000;1999)ならびに
・ リンパ腫(Wood et al 2000a;b)。
1987)。
・ 子宮平滑筋腫(Mark et al 1988;Ozisik et al 1993)
・ 脂肪腫(Sreekantaiah et al 1990)
・ 子宮内膜ポリープ(Fletcher et al 1992;Dal Cin et al 1995)ならびに
・ 肺の軟骨様過誤腫(Fletcher et al 1991;Johansson
et al 1992,1993).
と強力に関連する(Giancotti et al.1987,1989,1993)。このように有意なHMGA2発現が化学的またはウイルスで引き起こされた腫瘍ならびに自発的に生じる腫瘍で見いだされたが、このタンパク質は非形質転換細胞または健康な組織中では検出できなかった。(Giancotti et al.1989)。これと調和して、HMGA2発現の合成が特異的に遮断された発癌性レトロウイルスに感染した細胞の場合、形質転換に関する種々の表現型マーカーは存在しなかった(Berlingieri et al.1995)。
・ 子宮平滑筋腫、女性に最も多い腹部の腫瘍であり、そして米国で年間200,000例以上の子宮摘出の理由である(Heim et al 1988;Turc−Carel et al 1986;Vanni et al 1988)
・ 脂肪腫(Heim et al 1988;Turc−Carel et al 1986;Mandahl et al 1987;Sreekantaiah et al 1991;Belge et al 1992)
・ 子宮内膜ポリープ(Walter et al 1989;Vanni et al
1993;Dal Cin et al 1995)
・ 肺の軟骨様過誤腫(Fletcher et al 1991,1995;Dal Cin et al 1993)
・ 唾液腺の多形性腺腫(Mark et al 1980,1986;Bullerdiek et al 1987)
・ 血管周囲細胞腫(Mandahl et al 1993)
・ 軟骨性腫瘍(Mandahl et al 1989;Bridge et al 1992)
・ 胸部の良性腫瘍(Birdsal et al 1992;Rohen et al
1995;Staats et al 1996)
・ 浸潤性血管粘液腫(Kazmierczak et al 1995)
・ 拡散星状細胞腫
・ 骨巨細胞腫(Nuguera et al 1989)
の様々な段階に関与している。
2004;Sgarra 2004)。すなわち例えばHMGA転写産物に向けられたアンチセンスRNAを使用することにより、癌細胞中の細胞増殖はインビトロで減少するか、または細胞はアポトーシスをも受けた(Masciullo 2003;Scala
2000;Chau 2003)。動物モデルでは、種々の膵臓癌外移植片の成長が遺伝子治療により劇的に減少されることが示された(HMGA転写産物に向けられたアンチセンスRNAのアデノウイルス発現)(Trapasso et al 2004)。
・ ヒト パポバウイルス JC(Leger et al 1995)
・ エプスタイン−バーウイルス(Schaefer et al 1997)
・ 単純ヘルペスウイルス(Panagiotidis 1999;French et
al 1996)
・ HIV−1 ウイルス(Henderson et al 2000).
により使用される。
して決定的な役割を果たすようであり、したがって抗ウイルス処置において興味深い治療的取り組みになると思われる(Van Maele et al.2006,Li et
al 1998,Hindmarsh et al.1999)。
が関与でき、そして当該技術分野では周知である。そのような修飾の例はとりわけVenkatesan N.et al.(2003)Curr Med Chem.Oct;10(19):1973−91;Kusser,W.(2000)J Biotechnol,74:27−38;Aurup,H.et al.(1994)Nucleic Acids Res,22,20−4;Cummins,L.L.et al,(1995)Nucleic Acids Res,23,2019−24;Eaton,B.E.et al.(1995)Chem Biol,2,633−8;Green,L.S.et al.,(1995)Chem Biol,2,683−95;Kawasaki,A.M.et al.,(1993)J Med Chem,36,831−41;Lesnik,E.A.et al.,(1993)Biochemistry,32,7832−8;Miller,L.E.et al.,(1993)J Physiol,469,213−43に記載されている。そのような修飾は、例えば核酸に含まれる個々のヌクレオチドの2’位のH原子、F原子またはO−CH3基またはNH2基でよい。さらに本発明の核酸は、少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含むことができる。1つの態様では、本発明の核酸は、LNAヌクレオチド、そして好ましくは完全にLNAヌクレオチドからなる。
さについて好適な範囲は、約20から100ヌクレオチド、約20から80ヌクレオチド、約20から60ヌクレオチド、約20から50ヌクレオチド、そして約30から50ヌクレオチドの長さである。
造から出発して、コンピュータープログラムを使用して多数の異なる化学化合物の構造を含有するデータバンクを通して調査する。選択はコンピューターにより行われる。選択された化合物は、さらに研究室で試験される。
できるが、必ずしも互いにハイブリダイズする必要はなく、または使用の条件下でハイブリダイズした状態で存在する必要がないことを意味すると理解されることがわかる。
技術的教示に従い自由に選択することができ、すなわちそれらが個々の標的分子に対して必要な結合挙動を現し、かつ/または構造、特に本明細書に記載する2次構造を形成できるように選択できることは、本発明の範囲内である。
図1Aは、21AS−HMGA1a/bドメインに結合するD−21AS−HMGA1a/bに対してインビトロ選択により生成されたアプタマーを示す。
assay)”におけるミセル中へのペグ化シュピーゲルマーのパッキングの調査である。
1.1 HMGA1a/b結合配列
HMGA1a/b結合RNAシュピーゲルマーは、D−21AS−HMGA1a/bに対するインビトロ選択、そして引き続いて短縮化工程により生成した。21AS−HMGA1a/bドメインに結合する生じたアプタマーは図1Aに表す。
種々のクローン(図1Aを参照)は、標準的なホスホロアミダイト合成によりアプタマー(D−RNA)として調製し、そしてキナージング(kinasing)により5’末端で放射性標識した(以下参照)。次いでクローンはそれらの親和性およひ活性に関して、2種類の濃度のD−バイオ−21aa HMGA1a/bで平衡結合アッセイにより分析した。
物質 [最終]
RNA 5μM
T4フォワード反応バッファー(インビトロジェン) 1x
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(インビトロジェン) 10U/10μl反応バッチ
[γ−32P]−ATP 1μl/10μl反応バッチ
オリゴヌクレオチドの調製用精製には、変性PAGE用の1/2から2容量の濃縮化サンプルバッファーを反応バッチに加えた。加えて、大規模標準を必要に応じて調製し(各250pmol)、そしてサンプルバッファーに溶解した。バッチを5分間、95℃で変
性させ、そして氷上で冷却した。調製用の変性7%または10%PAAゲル(200x200x1.5mm)は、600Vを40〜50Wの最大電圧でかけることにより前加熱した(約1時間)。1xTBEでカップをすすいだ後、サンプルをプロットした。分離が完了した後(50Wで50分)、ゲルは透明フィルムで保護された蛍光化薄層クロマトグラフィープレートに配置した(色素60F254)。バンドはUV光(254nm)により影として(“UVシャドーイング”)視覚化し、そして小刀で切り出した。次いで酢酸アンモニウムによる「クラッシュ−アンド−ソーク」ゲル溶出を行った。
PAAゲルからオリゴヌクレオチドを溶出するために、PAAゲル片を細分した後、500μlの酢酸アンモニウム(2M)をピペットチップまたはスパチュラを使用して加えた。「クラッシュ−アンド−ソーク」溶出は、サーモシェーカー(1000rpm)中で68℃で2×1.5時間行った。上清は、「ウルトラフリー(Ultrafree)−MC」小カラム(ミリポア/アミコン(Millipore/Amicon)、シュバルバッハ、ドイツ)により卓上遠心機(16,100×g)でゲル残渣を除いた。次いでRNAはこのようにして溶出し、次いでエタノール沈殿により脱塩した。
エタノール沈殿には、1〜2μlのグリコーゲンを沈殿助剤として使用した。2.5容量の無水エタノールを加え、そしてボルテックスで混合した後、オリゴヌクレオチドを30分間、−80℃で沈殿させ、そして16,000g、4℃で30分間遠心した。ペレットを70%エタノールで1回洗浄し、そして4℃で16,100gにて5分間遠心した。
2pmolの各5’放射標識化アプタマーは、ビーケム(Bachem、ヴァイル アム ライン、ドイツ)により生産されたビオチン化−D−HMGA1a/b−21mer(EPSEVPTPKRPRGRPKGSKNK [配列番号17]; 図2参照)中で複合化させた。濃度範囲1〜3000nMの溶液(または2点測定には、300nMおよび30nMまたは100nMおよび10nMペプチド)を、選択バッファー(10mM Tris HCl pH7.4、5mM KCl、0.8mM MgCl2、0.1%Tween)中で37℃で1時間インキュベーションした。ビオチン化D−HMGA1a/b−21merを含まない溶液をバックグラウンド対照とした。次いでペプチドおよび複合体を30分以内、37℃で10μlのストレプトアビジンUltraLinkゲルで固定化した。 懸濁液の放射性を測定した。上清を除去した。次いでマトリックスは1回、100μlの選択バッファーで洗浄し、次いで選択バッファーを用いて沈殿させた。放射性を測定することにより、複合体中、ビオチン化−D−HMGA1a/b−21merと一緒に存在するアプタマー画分を、各ペプチド濃度について測定した。活性種の解離定数および活性分子の比率は、グラフのプロットおよび適合により決定した(GraFit、4.0.10バージョン、Erithacusソフトウェア)。
アプタマー(D−RNA)として合成したすべてのクローンに関して、8〜22nMのHMGA1a/b(ビオチン化−D−HMGA1a/b−21mer)の21アミノ酸長Dフラグメントに対する結合の解離定数を、平衡結合アッセイで決定した(図1A)。
1.1.2 実施例132−B3における短縮化
すべての選択候補は、繰り返し存在する配列モチーフGGGCG または GGGUG
または GGGAGを現し、これはヘリックス/幹(stem)モチーフにより5’末端および3’末端で安定化される(図3)。
(13):3406−15)に従い、RNAアプタマーの有望な構造および沈殿の分析は、予め定めた幹/ヘリックス構造が幾つかの場合で延ばされていることが示された(132−C3、132−B3、132−C4、132−E2、132−A2、132−H1、132−F1、122−G2、122−E2、図1A参照)。この幹−ヘリックス構造は、これら候補のさらなる短縮化の基礎を形成した。この候補のさらなる短縮化は、HMGA1a/bフラグメントへの結合に関して、合成D−RNA沈殿分析、続いて削除分析により、最小結合モチーフを同定し、そして安定化することにより行った。これらの結合特性は、平衡結合アッセイにより決定された。示す図3は候補NOX−f(132−B3)での例により、幹構造の安定化に基づくアプタマーの短縮化を表し、これは候補132−C3、132−B3、132−C4、132−E2、132−A2、132−H1、132−F1、122−G2、122−E2 (図1Aを参照)における延長化形態に見い出すことができる。6個のヌクレオチド長の幹を有するNOX−fの32ヌクレオチド長アプタマーバリアント(NOX−f 32nt)の短縮化は、21aa HMGA1a/bフラグメントに対する結合特性に損失を導かなかった(図3および4)。5’−位の幹の第3位にアデノシンの人工的挿入は、ループアウト領域無しに7ヌクレオチド長の幹の理論的形成を導き、そして3’領域における幹の完成に役立った(NOX−f 33nt、図3および4)。HMGA1a/bの21アミノ酸長ドメインに関する平衡結合アッセイによる結合特性(親和性および活性)の測定は、これらの変化に影響されなかった。
ればアプタマーと原理的に同じ結合特性を現す。
1.2.1 反復配列要素:ボックスA1およびボックスA2
配列GGGCGまたはGGGUGまたはGGGAGの反復配列要素は、HMGA1a/bに結合するすべてのシュピーゲルマーの特徴である。この配列要素は、HMGA1a/b結合シュピーゲルマーに2回現れる(図1Aおよび1B)。シュピーゲルマーの5’末端付近にある配列要素を本明細書ではボックスA1と呼ぶ。一方、シュピーゲルマーの3’末端付近にある配列要素を本明細書ではボックスA2と呼ぶ。ボックスA1およびボックスA2およびそれらの共通アライメントは、恐らくHMGA1a/b結合シュピーゲルマーの決定的特徴を表している。
ボックスA1とボックスA2との間に、6〜7個の核酸または12〜22個のヌクレオチドの長さを有するいずれかの配列区分がある (図1Aおよび1B)。これらの配列区分はそれらの長さが異なるだけではないので、それらを個別に検討する。
ボックスA1とボックスA2との間にある配列区分が6個のヌクレオチド長を有する場合、配列区分は配列UGGUUG、UGGCUG、CGGUUG、AGGUUGまたはGUGUAAを現す。1個のヌクレオチド(ウラシル)の配列CGGUUGへの挿入(これは配列CGGUUUGを導く)は、負または正のどちらの影響もシュピーゲルマーの結合特性に及ぼさない。
ボックスA1とボックスA2との間にある配列区分が12〜22個のヌクレオチド長を有する場合、この配列区分は等しい長さの2つの配列領域を含んでなり、これは恐らく互いにハイブリダイズすることができる(ヘリックスC)。この場合、ハイブリダイゼーションは各々の場合で3〜6個のヌクレオチドにより起こる。3〜5個の非対合ヌクレオチドは、ヘリックスCを形成するヌクレオチド間に位置する。1〜3個のヌクレオチドが、ボックスA1の3’末端とヘリックスCの5’末端との間に非対合で存在する。1〜5個のヌクレオチドが、ヘリックスCの3’末端とボックスA2の5’末端との間に非対合で存在することができる。
すべてのHMGA1a/b結合シュピーゲルマーは、互いにハイブリダイズすることができる配列区分によりそれらの5’および3’末端に特徴がある(ヘリックスA1およびヘリックスA2、(図1Aおよび1B)。各々の場合で互いにハイブリダイズするヌクレオチドの数は、4〜8個に変動することができる。これと関連して、この恐らくは二重鎖領域が、ボックスA1の5’末端およびボックスA2の3’末端に延長することができる。そうはならないならば、ボックスA1およびボックスA2はさらに互いにハイブリダイズするヌクレオチドにより平滑化され得る(ヘリックスB1およびヘリックスB2)。これには各々の場合で4〜8個のヌクレオチドの領域が関与し得る(図1Aおよび1B)。
N2 = G,U;
N3 = U,C;
N4 = U,A;
N5 = G,A;
N6 = G,A,U;
N7 = G,U;
N8 = Uまたはヌクレオチド無し;
Nx = 0〜5個のヌクレオチド;
Ny = 0〜6個のヌクレオチド;
Nz = 0〜6個のヌクレオチド;
ヘリックスA1およびヘリックスA2=各々の場合で4〜8個のヌクレオチド、これは互いに完全に、または一部ハイブリダイズし、ここで各場合で、ヘリックスA1およびヘリックスA2、ならびにヘリックスB1およびヘリックスB2の相互にハイブリダイズするヌクレオチドの和は、10〜12ヌクレオチドである;
ヘリックスB1およびヘリックスB2=各々の場合で4〜8個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、ここで各場合で、ヘリックスA1およびヘリックスA2、ならびにヘリックスB1およびヘリックスB2の相互にハイブリダイズするヌクレオチドの和は、10〜12ヌクレオチドである。
Nb =3個のヌクレオチド
Nc =3〜5個のヌクレオチド
Nd =2〜5個のヌクレオチド
Ne =1〜2個のヌクレオチド、好ましくはAまたはUU
ヘリックスA1およびヘリックスA2=各々の場合で5〜6個のヌクレオチド、これは互いに完全に、または一部ハイブリダイズし、
事例2B:122−E2
Nj =2個のヌクレオチド、好ましくはAG
Nc =4個のヌクレオチド、好ましくはGAUG
ヘリックスA1およびヘリックスA2 = 各々の場合で6個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、
ヘリックスB1およびヘリックスB2 = 各々の場合で5個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、
2.1 競合アッセイにおけるHMGA1a/bシュピーゲルマーと組換えHMGA1bとの相互作用の測定
実施/方法
His6−標識化HMGA1bのクローニング
HMGA1bをコードする配列を有するBD−FreedomTM ORFクローンGH00552L1.0(高移動性群ATフック1)をバイオカット(BioCat)ハイデルベルグから購入した。配列はC−末端の融合を可能にするために、終止コドンがロイシンをコードするコドンに変換されるようにその中ですでに変更されていた。クローンの配列は一般に、RefSeqデータバンクにNo.NM002131で保存されている配列に対応する。HMGA1bをコードする配列を、標準的PCRにより、プライマーHMG_fwd1(TCGACACCATGGGTGAGTC、配列番号34)およびHMG_rev1(GTCTAGAAAGCTTCCCAACTG、配列番号35)を用いて増幅した。これと関連して、これによりNcoI境界を導入するためにATG後の塩基をAからGに変えた。PCR産物は製造元の使用説明に従い制限酵素NcoIおよびHindIII(両方ともNEB、フランクフルト アム メイン、ドイツ)で開裂し、そしてアガロースゲルを介して精製した。ベクターpHO2d(Fasshauer et al.(1997) J.Biol.Chem.272:28036−28041))を同様にNcoIおよびHindIIIで開裂し、そしてアガロースゲルを介して精製した。ベクターpHO2dは、T7−プロモーターの制御下で6個のヒスチジン残基(His6−タグ)の配列を用いてC−末端に融合したタンパク質の発現を可能とする(Fasshauer et al.,1997,JBC 272:28036)。
融合タンパク質の発現には、バクテリアBL21株をプラスミドpHO2d/HMGA1bで形質転換した。融合タンパク質の発現は、イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)で誘導した。4時間後、バクテリアを15分間、10,000×gで遠心し、そしてペレットをさらに使用するまで−20℃で保存した。
(fluted)フィルターを通して濾過し、次いで洗浄バッファー(50mM NaxPO4バッファー、pH8.0、250mM NaCl、10mM イミダゾール、すべてメルク、ダルムシュタット、ドイツから)で平衡化したHIS−セレクトカラム(HIS−セレクトカートリッジ、シグマ(Sigma)、ダイゼンホーヘン、ドイツ)に加えた。カラムを10−15mlの洗浄バッファーで洗浄した後、融合タンパク質を溶出バッファー(洗浄バッファー中に250mMイミダゾール)で0,5−1mlサイズの画分で溶出した。タンパク質を含有する画分は、純度をゲル電気泳動(Scheager & Jagow,1987,Anal.Biochem.166:368−379に従い16%ポリアクリルアミドゲル)により精製を検査した。融合タンパク質を含む画分を精製し、必要ならば適切なバッファーを使用して透析し、そしてタンパク質測定後に再度、純度について試験した。精製された融合タンパク質はアリコートで−20℃に保存した。
HMGA1bに対するHMGA1a/bシュピーゲルマーの親和性のさらに詳細な分析のために、96−ウェル形式に基づく試験を使用した。この試験では、HMGA1a/bシュピーゲルマーのHMGA1b−His6への結合が、HMGA1a/bへの結合部位を有するDNAオリゴヌクレオチドとの相互作用を防ぐ。このDNAオリゴヌクレオチド(dsDNA ATフック)(Fashena et al.,1992)は、ビオチン分子で1つの鎖を標識され、これを介してストレプトアビジンで被覆したプレートに結合することができる。DNAに結合したHMGA1b−His6の検出は、ニッケルで修飾した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Nickel−HRP)を用いて行い、これは蛍光基質を変換する。このアッセイでは、シュピーゲルマーが組換えHMGA1bをその自然な結合パートナーと置き換わる。シュピーゲルマー/rHMGA1b/dsDNA ATフックの1:1:1の化学量論により、HMGA1bに関するシュピーゲルマーの親和性に関する直接的な予測を行うことができる。アッセイの原理は図5で具体的に説明する。
r ニッケル−HRP、(メダック(Medac)、ハンブルグ、ドイツ)(TBSTCM中、10mg/mlのBSA(ロッシュ、マンハイム、ドイツ)中の1:1000)を各ウェルに加え、そして穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベーションする。次いでウェルを再度3回、各回200μlのTBSTCMで洗浄する。次いで100μlの蛍光性HRP基質(QuantaBlue、ピアス、ボン、ドイツ)を各ウェルに加え、そして蛍光を15分後に測定する(ex:340/em:405nm)。
シュピーゲルマーNOX−A(50nt)、NOX−f(33nt)およびNOX−f(48nt)は、濃度依存的様式でHMGA1b−His6のビオチン化DNA−オリゴヌクレオチドへの結合と競合することが示された(図6)。約15nMのIC50がシュピーゲルマーNOX−Aについて見いだされる。
実施/方法
組換えで発現したHMGA1bは、16%PAA−トリシンゲルでのゲル電気泳動により分離し、そしてエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜へ移した。次いで膜を5%スキムミルクおよび1xTBST(20mM Tris/HCl pH 7.6、137mM NaCl、0.1% Tween)中、100nMの非特異的シュピーゲルマーで1時間ブロックし、そして3回、10分間、1xTBSTで洗浄した。組換えHMGA1bの検出は、5’末端でビオチン化されたシュピーゲルマーNOX−A(5’bioNOX−A).を用いて行った。5’bioNOX−Aは、1mMの各カルシウムおよびマグネシウム(TBST+Ca/Mg)および100nMの非特異的シュピーゲルマーを含む1xTBSTで希釈し、そして1.5時間インキュベーションした。次いでブロットを3回、10分間、1xTBST+Ca/Mgで洗浄し、そして結合したビオチン化シュピーゲルマーを抗−ビオチン抗体とTBST+Ca/Mg中で45分間インキュベーションした。次いでブロットを5回、10分間、1xTBST+Ca/Mgで洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にカップリングした2次抗体を、LumiGLO検出試薬(セルシグナリングテクノロジー(Cell Signaling Technology))により検出した。
5’−末端ビオチン化シュピーゲルマーの組換えで発現したHMGA1bへの結合は、前記方法により証明された。抗体に基づく検出と同様に、5μgのHMGA1bを3nMのbio−NOX−Aを用いてブロット膜に移した後に検出した。NOX−AのインバースシュピーゲルマーはHMGA1bを認識できなかったが、これはNOX−Aの特異的結合を確認する(図8)。
3.1 シュピーゲルマーのポリエチレンイミン−媒介性トランスフェクションの原理
標的分子HMGA1a/bは細胞質ゾルで発現され、そして転写因子としてその自然な結合パートナーである二本鎖DNAを細胞核中に見いだす。HMGA1a/b−媒介性の細胞応答は、シュピーゲルマーの細胞質ゾル中のHMGA1a/bへの結合により、そして細胞核中のDNAに対するATフックにより結合されたHMGA1a/bとの競合によ
りアンタゴナイズされるはずである。形質膜の負電荷により、DNAおよびRNA分子は細胞からの受動輸送により容易に取り込まれない。核酸による細胞内輸送に対する取り組みの1つは、全複合体の荷電を生じる荷電した粒子または試薬の縮合またはパッキングである。この複合体はエンドサイトーシスを通して容易に取り込まれ、すなわち細胞の細胞質ゾルを通過する。この方法の欠点は、DNA/RNAの安定性であり、そしてエンドソーム区画から核酸の放出である。細胞の細胞質ゾル中でリソソームは、プロテアーゼまたはヌクレアーゼの導入により収縮したエンドソームから、そして区画のプロトン化により迅速に形成される。ヌクレアーゼはそこで核酸を消化し、そしてさらに核酸は酸性媒質中で安定ではない。全複合体はエキソサイトーシスにより細胞から再度、迅速に輸出され、そしてゴルジ装置中で分解され、したがってわずかな核酸が細胞に入るだけである。適切なトランスフェクション系のための前調整の1つは、このように安定化ならびにエンドソームから細胞質ゾルへの核酸の放出である。安定性に関して、RNAシュピーゲルマーは非天然のエナンチオマーであり、それらは酵素により分解されないので、真核細胞のトランスフェクションに理想的な特性を有する。
リード候補NOX−AおよびNOX−fは、3’末端のアミノ基を有するアプタマーおよびシュピーゲルマーとして人工的に生産され、次いでアミノ基を介してペグ化された。平衡結合アッセイによりペグ化はアプタマーのHMGA1a/bフラグメントへの結合特性に影響を及ぼさないことが示された。さらに組換え完全長HMGA1a/bとの競合アッセイによりシュピーゲルマーの完全長HMGA1a/bへの結合も3’末端のペグ化に非依存的であることが示された(図9)。
滅菌されたペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、PBS中で25kDaの架橋分岐化ポリエチレンイミン(PEI)(アルドリッチ、Cat:40,872−7)を、2.5:1(N/P 2.5)の骨格のリボ核酸の絶対ホスフェートに対するPEIの絶対窒素画分の比率で加えることにより行った。滅菌されたオートクレーブ処理済PEI溶液は、200mMの遊離窒素基濃度を有し、そして1M塩酸でpH7.4に調整された。滅菌濾過したシュピーゲルマーを最高700μMの濃度にCa/Mgを含む1xPBS中に取り、そして滅菌濾過したPEIの添加後、室温で30〜60分間インキュベーションした。理想的には複合体の形成は、高濃度のシュピーゲルマーが無作為に大きな凝集物を導くので、加えるシュピーゲルマー濃度を出来る限り小さく調整して形成する。シュピーゲルマーミセルの形成は、色素排除アッセイにより測定した。このために、どのくらいのシュピーゲルマーがミセルにパッキングされる前後の色素により検出できるかを測定した。リボグリーン(RiboGreen)(M.プローブズ(Probes))を色素として使用し、そして蛍光をELISAリーダーで測定した。各場合で1μMのシュピーゲルマーを100μlの1xPBSに加え、そしてPEIの量を上げながら加え。100μlの0.2μg/μlリボグリーンを、蛍光に適した96ウェルのマイクロタイタープレートに配置し、そしてミセルバッチを室温で30分間インキュベーションした後、10μlをマイクロタイタープレートにピペットで入れた。2のN/P比から出発して、90%より多くのシュピーゲルマーがミセルとして存在した(図10)。これと関連して、PEI単独では色素の蛍光に影響を及ぼさなかった。
1μMのシュピーゲルマーミセルを、図11に特定した条件下で保存した。シュピーゲルマーミセルの安定性は、3.3章に記載した色素排除アッセイにより測定した。ミセルの安定性実験は、異なる媒質中ならびに異なる温度でのミセルの保存がシュピーゲルマーミセルに影響を及ぼさないことを示した。リボザイムの特性を喪失しないリボザイム/PEI複合体の凍結乾燥も文献に記載されている(Brus−C et al.,J.Control Release,2004,Feb,20,95(1),199−31)。
シュピーゲルマーミセルの細胞内取り込みは、HS578T細胞の細胞培養系で樹立された。1x104のHS578T細胞は、滅菌された20mmサイズのカバークラス上で30〜40%の集密度まで成長させた。5’−標識シュピーゲルマーNOX−A−3’−PEGは2.5:1のN/P比でミセルにパックされ、1μMの濃度で細胞に加え、そして37℃で16時間インキュベーションした。シュピーゲルマーの受動的取り込みの対照として、1μMの純粋な蛍光標識シュピーゲルマーを各々の場合で細胞とインキュベーションした。次いで細胞を3回、1mlのPBSで洗浄し、そして3%パラホルムアルデヒドで30分間固定した。調製物を再度3回、1mlのPBSで洗浄し、さらに10〜20秒間、DAPI溶液(10mlの1xPBSに対する1μlストック)とインキュベーションして、細胞核中のクロマチン(chomatin)を染色し、もう一度洗浄し、そして溶液を乗せて覆った。このように調製した調製物を蛍光顕微鏡で分析した(発光488nm/吸光 514−522nm)。
および放出されたシュピーゲルマーの拡散パターン点を示す。わずかなシュピーゲルマーのシグナルが細胞核で検出できただけであった。
H578T細胞の細胞質ゾルおよび核周辺空間におけるシュピーゲルマーの点様の分布は、細胞の区画、例えばエンドソームにおける蓄積を指摘する。これらの区画からシュピーゲルマーの放出を検査するために、個々の大きく拡大した細胞の分布パターンを分析した(図13)。シュピーゲルマーの点様の局在化に加えて、細胞質ゾルおよび形質膜上の拡散分布パターンが検出され、これはシュピーゲルマーのエンドソーム放出を指摘する。このパターンは「裸」のシュピーゲルマーの場合には見いだされなかった。
4.1PEI無しでの増殖アッセイ
MCF−7細胞の増殖に及ぼす効果
細胞分割におけるHMGA1a/bの有力な役割は、増殖アッセイにより調査した。最初に、シュピーゲルマーを高用量で「裸」の核酸として細胞培養基に加え、そして細胞の成長を経時的に追跡した。乳癌細胞株MCF−7は、HMGA1a/bの小さい(アンタゴナイジング)発現が見いだされ、そしてこれら細胞の増殖におけるHMGA1a/bの役割が既に文献に記載されたので、モデルとしてこれらの細胞を使用した。Reeves
et al(Reeves−R et al.,Molecular and Cellular Biology,Jan 2001,p575−594)は、MCF−7細胞でのHMGA1a/bの過剰発現が上昇した増殖を導き、そして発現したアンチセンス構築物によるHMGA1a/bの阻害がMCF−7細胞の増殖を阻害することを示した。
0.5x104のMCF−7細胞(ATCC)を平らな透明基材の96−ウェルプレート(コースター:Costar)に播種し、そして10%のウシ胎児血清(FCS)を含む100μlのRPMI1640培地中で16〜24時間培養した。次いで細胞をPBSで洗浄し、そしてさらに48時間、標準細胞培養基で培養し、滅菌濾過したシュピーゲルマーを直接添加した。これに続いて10μlのレザズリン溶液(PBS中の0.44mM)を各バッチに加え、そしてさらに37℃で2時間インキュベーションした。細胞の代謝によるレザズリンの変換は、細胞数と直接的に相関する。色の変化をFluostar Optima多検出プレートリーディングデバイス(BMG)で測定した(発光544nm、吸光590nm)。各値は、実験毎に3回測定し、そして未処理対照細胞の値を参照とした。
NOX−Aは2日後、用量依存的様式でMCF−7細胞の増殖を阻害した(n=12)(図14)。40μMで未処理細胞の約30%の値まで増殖の最大阻害が見いだされた。
H−1299細胞の増殖に及ぼすシュピーゲルマーミセルの効果
実施/方法
1x104個のNCI−H−1299細胞(肺癌腫細胞;ATCC)を平らな透明基材の24−ウェルプレート(コースター)に播種し、そして10%のFCSを含む1mlのRPMI1640培地中で16〜24時間培養した。次いで細胞をPBSで2回洗浄し、そしてさらに3日間、1%FCSおよびシュピーゲルマーミセルを含有する細胞培養基で
培養した。滅菌したペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、25kDaの架橋分岐化ポリエチレンイミン(PEI)(シグマ)を、2.5:1(N/P 2.5)のリボ核酸骨格の絶対ホスフェートに対するPEIの絶対窒素画分の比率で予めPBS中で加えることにより行った。滅菌されたシュピーゲルマーを30μMの濃度で使用し、そしてPEIの添加後、室温で30〜60分間インキュベーションした。次いでシュピーゲルマーミセルは1μMに1%FCSを含有する細胞培地で希釈し、洗浄した細胞に直接加え、そして37℃で3日間インキュベーションした。
1μMのシュピーゲルマーとのPEI(N/P 2.5)の使用は、細胞増殖に最初は何の効果もなかった。細胞培養基中のFKSの量を1%未満に減少させることにより、シュピーゲルマーミセルによるトランスフェクションはH−1299細胞の増殖に影響を及ぼし、これは以前に10%FKSでは目で見ることはできなかった(図15)。恐らくFKSはわずかな効果が観察できなくなる程度まで増殖を刺激したのであろう。MCF−7細胞中のFKS濃度の減少は、3日間にわたり細胞死を導く。
有力な発癌遺伝子cdc25aの例において、細胞周期因子のHMGA1a/b−媒介性の調節に及ぼす効果。
1x104個のH−1299細胞を、平らな透明基材の床面の24−ウェルプレート(コースター)に播種し、そして10%のFCSを含むRPMI1640培地中で16〜24時間培養した(1ml容量)。次いで細胞をPBSで2回洗浄し、そしてさらに3日間、10%FCSを含有するシュピーゲルマーミセルを含む細胞培養基で培養した。滅菌したペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、25kDaの架橋分枝化ポリエチレンイミン(PEI)(シグマ)を、2.5:1(N/P 2.5)のリボ核酸骨格の絶対ホスフェートに対するPEIの絶対窒素画分の比率で加えることにより予めPBS中で行った。滅菌されたシュピーゲルマーを30μMの濃度で使用し、そしてPEIの添加後、室温で30〜60分間インキュベーションした。次いでシュピーゲルマーミセルは1%FCSを含有する細胞培養基で個々の濃度に希釈し、洗浄した細胞に直接加え、そして37℃で3日
間インキュベーションした。細胞を2回、PBSで洗浄し、そして細胞スクレーパーにより回収した。次いで細胞のmRNAは細胞からRoti−Quick−キット(ロス(Roth)、Cat.No.979.1)により単離し、そして0.2−1μgの全RNAをcdc25aおよびGAPDHのPCR用の鋳型として使用した。
ddCP=dCP(処理シュピーゲルマーNOX−A)−dCP(対照:PBSまたはNOX−Aインバース)
比=2−ddCP
cdc25aおよびHMGA1a/bは、RT−PCRによりMCF−7およびH−1299細胞で検出された。HMGA1a/bの低い発現を示したMCF−7細胞は、cdc25aの発現も低く、一方、HMGA1a/bおよびcdc25aはH−1299細胞で強く発現した。HMGA1a/b結合シュピーゲルマーで2日間トランスフェクトしたH−1299細胞は、cdc25a mRNAの発現の有意な用量依存的減少を導いた(図16および図17)。
インビボでの腫瘍成長に及ぼすシュピーゲルマーの効果
HMGA1a/b結合シュピーゲルマーがインビボでの腫瘍の成長を阻害するという仮説を試験するために、強力にHMGA1a/bを発現する膵臓癌腫細胞PSN−1について異種移植モデルを開発した。このモデルに基づき、治療実験は2.5のN/Pで2mg/kgのNOX−Aシュピーゲルマーミセルを用いて行った(実施例3、3.3項を参照されたい)。
オスの裸マウス(NMRI:nu/nu)(群のサイズ n=8)には、各々の場合で脇に107のPSN−1細胞(ECACC)が皮下注射され、そして腫瘍の成長が22日にわたり観察された。動物は25〜27gの平均体重を有し、そして6〜8週齢であった。INV−3’PEG中の活性シュピーゲルマーNOX−A−3’PEGおよびインバース対照シュピーゲルマーは、2.5のN/P比でPEIを加えることにより上記のようにミセルにパックされた。100μlのシュピーゲルマーミセル懸濁液(3.46nmol/動物または2mg/kgに相当する)は、各々の場合で毎日、腫瘍の付近に皮下注射された。腫瘍容積および体重を1週間に3回測定した。動物は22日に屠殺され、そして血漿、肝臓、腎臓および腫瘍中のNOX−A分布が定量された。
lのCSPD ”レディ−−トゥ−ユース−基質(Ready−To−Use Substrate)”(アプライドバイオシステム(Applied Biosystems))を加え、室温で30分間インキュベーションし、そして化学発光をFluostar Optima多検出プレートリーディングデバイス(BMG)で測定した。
予備実験では、移植後にH−1299細胞は腫瘍がPSN−1よりもなかりゆっくりと成長し、そして個々の動物を比べると不均一な腫瘍の成長を現したので、処置実験の異種移植モデルには適当でないようであることが示された。PSN−1細胞は、22日までに活発な腫瘍の成長を現した。NOX−Aミセルは、PBS対照と比べて2mg/kgの用量でPSN−1腫瘍の成長を有意に減少させることが示された(図18)。動物の体重は、シュピーゲルマーミセルでの処置による影響を受けなかった。対照シュピーゲルマーは腫瘍成長の非特異的阻害を現さず、そして同様に動物の体重に効果を及ぼさなかった。腫瘍サイズの差異は、NOX−A3’PEGミセルでの処置の10日目から、未処理動物と比べて有意、または高度に有意であった(PBS対照(スチューデントのt−検定)。22日後の終点分析では、腫瘍の成長に高度に有意な特異的減少が示された(PBSに比べてp=0.0098、そしてインバース対照シュピーゲルマーに比べてp=0.022)(図19)。PBSで処置したマウスは、2.5cm3の平均腫瘍成長を示し、対照シュピーゲルマーで処置した動物は、2.6cm3の平均腫瘍容積を有し、そしてNOX−Aで処置した動物は、22日後に1.2cm3の平均腫瘍容積を有した(箱ヒゲ分析)。これは50%より高い腫瘍成長の減少に相当する。
シュピーゲルマーミセルの効率的取り込みを検査するために、非機能的シュピーゲルマー(プルーフ オブ コンセプト:Proof of Concept=POC)を3’末端でPEG2kDaによりペグ化し、そして2.5の窒素/ホスフェート比(N/P)でミセルにパックした。(実施例3、3.3項を参照)。実施例5に記載するプロトコールに準じて、この取り組みはミセルにパックされたシュピーゲルマー、ならびに遊離のミセルにパックされていないシュピーゲルマーに採用した。
オスの裸マウス(NMRI:nu/nu)(群のサイズn=8)を各々の場合で脇に107個のPSN−1細胞(ECACC)を皮下注射し、そして腫瘍の成長を25日にわたり観察した。動物は25〜27gの平均体重を有し、そして6〜8週齢であった。非機能的シュピーゲルマーPOC−3’PEGは、上記のようにPEIを2.5のN/P比で加えることによりミセルにパックした。ミセルにパックしなかったシュピーゲルマーPOC−3’PEGは、PEIにより媒介されない取り込みの対照として役立てた。100μlのシュピーゲルマー−ミセル懸濁液またはシュピーゲルマー溶液(1500nmole/kgおよび2000nmole/kgに相当)は毎日、腫瘍の付近に皮下注射した。腫瘍容積および体重を1週間に3回測定した。最後の注射から24および96時間後、各群から2匹の動物を屠殺し、そして血漿、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、胆嚢、膵臓および腫瘍中のPOC−3’PEG(パックした/非パック)の分布を定量した。
ミセルにパックされた非機能的シュピーゲルマーPOC−3’PEGの重量分布の分析は、24時間後に、非パックシュピーゲルマー(0.840 +/− 0.255pmole/mg)に比べて腫瘍組織(24.925+/−13.301pmole/mg)中で有意に高い濃度を示した(図21A)。一方、パックされたシュピーゲルマーの濃度はさらに3日後に(96時間)半分となり(11.325 +/−7.050pmole/mg)、大変少量の非パックシュピーゲルマーを検出することができただけであった(0.120 +/− 0.057pmole/mg)。
0 +/− 2.729pmole/ml)。96時間後、明確な差異が見いだされ、ここで非パックシュピーゲルマーに比べて約4倍量のパック化シュピーゲルマーが検出された。
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Claims (7)
- 核酸が区分ボックス A1および区分ボックス A2を含んでなり、区分ボックス A1および区分ボックス A2は中間区分により互いに連結され、そしてボックス A1およびボックス A2は互いに個別に、そして独立してGGGCG、GGGUGおよびGGGAGを含んでなる群から選択され、
中間区分が、6もしくは7個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Z1、または12〜25個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Z2のいずれかからなり、
核酸が区分ボックス A1の5’末端で第1区分を含んでなり、そして区分ボックス A2の3’末端が第2区分を含んでなり、ここで好ましくは両区分が互いに独立して各々の場合で4〜8個のヌクレオチドを含んでなり、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号22および配列番号24を含んでなる群から選択される配列を含んでなることを特徴とするHMGA結合核酸。 - HMGAタンパク質がHMGA1、HMGA1a、HMGA1bおよびHMGA2からなる群から選択される請求項1記載のHMGA結合核酸。
- 請求項1ないし2の1項に記載のHMGA結合核酸を含んでなるHMGAの検出用キット。
- HMGAタンパク質および請求項1ないし2の1項に記載のHMGA結合核酸を含んでなる複合体。
- 請求項1ないし2の1項に記載のHMGA結合核酸および製薬学的に許容される担体を含んでなる製薬学的組成物。
- 薬剤を製造するための請求項1ないし2の1項に記載のHMGA結合核酸の使用方法。
- 薬剤が癌の治療および/または防止のための薬剤である、請求項6に記載の方法。
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