ES2874562T3 - Suministro intraocular de moléculas bioactivas mediante el uso de iontoforesis - Google Patents

Abstract

Una formulación de liposomas que contiene una molécula bioactiva para su uso en un método para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular mediante la administración de la formulación al ojo de un sujeto mediante iontoforesis, en donde la molécula bioactiva se selecciona del grupo que consiste en luteína y/o zeaxantina y el liposoma tiene un potencial zeta positivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Suministro intraocular de moléculas bioactivas mediante el uso de iontoforesis

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere generalmente al uso de moléculas bioactivas en tejidos oculares y, más específicamente, al suministro de luteína a la mácula mediante el uso de iontoforesis.

La luteína (y la zeaxantina) se asocian con la reducción del riesgo de desarrollar AMD (degeneración macular relacionada con la edad) y extracción de cataratas debido a sus efectos antioxidantes y fotoprotectores, y su distribución exclusiva en la mácula del ojo1. La edad es uno de los factores de riesgo más importantes para la AMD, que afecta típicamente a individuos mayores de 50 años2-4. Hay dos tipos de AMD, "AMD seca" y "AMD húmeda". La AMD seca se desarrolla cuando las células maculares se dañan como resultado de la acumulación de productos de desecho llamados "drusas". Es el tipo de AMD más común y menos grave. Se estima que un alto número de personas que presentan síntomas de AMD seca desarrollarán AMD húmeda, que se desarrolla cuando los vasos sanguíneos anormales debajo de la mácula crecen y provocan un daño celular irreversible2-4.

La luteína se ha usado ampliamente a través de la suplementación oral con el fundamento de que la circulación sistémica puede llevar la luteína a la circulación coroidea para su absorción en la mácula, a través de la proteína de unión a xantofila5. Sin embargo, varios informes demuestran que solo un pequeño porcentaje de luteína llega a la mácula6-8. Además, debido a los límites de la barrera ocular, los tratamientos terapéuticos en el segmento posterior del ojo son difíciles. Dado que el ojo está protegido por la película lagrimal, las barreras corneal, vítrea, hematorretiniana y hematoacuosa, es muy difícil suministrar medicamentos al ojo, particularmente a la retina, en concentraciones suficientes y con efectos secundarios mínimos910. Se han usado aplicaciones in-situ para superar este problema; sin embargo, los sistemas de suministro lenta, tales como los implantes, son muy invasivos y costosos. En los últimos años, los resultados de muchos estudios han destacado los riesgos de estos tratamientos1112.

Recientemente, se han usado inyecciones intravítreas de luteína para teñir membranas prerretinianas específicas y otras estructuras oculares durante la cirugía13-16. Estos han sido los primeros datos sobre el suministro in-situ de luteína hacia la mácula, al aprovechar el efecto de tinción intrínseco de la luteína. El potencial de la luteína de retrasar la progresión de la AMD y la supuesta acción neuroprotectora mostrada en diferentes ensayos aún no se ha demostrado mediante aplicación in-situ después del suministro intraocular. La inyección intravítrea de luteína con fines preventivos puede ser demasiado invasiva como estrategia para suministrar luteína a la mácula, con la desventaja de una mala aceptación por parte del paciente.

La iontoforesis ocular es un método mínimamente invasivo que se usa para impulsar por fuerza eléctrica altas concentraciones de moléculas objetivo transescleralmente o transcornealmente (ver por ejemplo el documento US2005/245856 A1) Usa una pequeña corriente eléctrica aplicada a una cámara iontoforética que contiene la molécula de interés y el vehículo17. Varios informes revelaron que la luteína, que se encuentra en altas concentraciones en la mácula del ojo humano, tiene el potencial de retrasar la progresión de la AMD, además de una potencial acción neuroprotectora18-20.

Aquí informamos de una nueva forma de suministrar luteína a la retina, por lo que su presencia en la región macular parafóvea se puede mejorar significativamente y de esta manera retrasar la progresión de la AMD y proteger las células endoteliales de la retina. Se han creado diferentes sistemas de suministro de iontoforesis para uso oftálmico y se han usado para suministrar medicamentos de manera segura y efectiva a los segmentos anterior y posterior del ojo humano21. Con esta tecnología, es posible suministrar cantidades significativas de moléculas bioactivas, incluidas macromoléculas, a través de la córnea y la esclerótica. En el trabajo que se informa aquí, una emulsión de luteína se ha administrado de forma difusa a la mácula mediante iontoforesis22-23. La idea era desarrollar un método mínimamente invasivo para impulsar altas concentraciones de luteína cargada, transescleralmente o transcornealmente mediante iontoforesis. Hemos evaluado la distribución y concentración de luteína en los diferentes tejidos oculares mediante el uso de microscopía de dos fotones, espectroscopía Raman y HPLC después de la aplicación iontoforética escleral y corneal. La principal ventaja de este enfoque es el uso de un dispositivo médico que es más seguro y más fácil de lograr el cumplimiento del paciente, al evitar las complicaciones de las inyecciones o implantes quirúrgicos frecuentes y de alta dosis. Este procedimiento se puede realizar rápidamente en el consultorio del médico durante una cita de atención oftalmológica normal sin necesidad de un entorno quirúrgico.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una formulación de liposomas que contiene una molécula bioactiva para su uso en un método para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular mediante la administración de la formulación al ojo de un sujeto mediante iontoforesis, en donde la molécula bioactiva se selecciona del grupo que consiste en de luteína y/o zeaxantina y el liposoma tiene un potencial zeta positivo.

Se descubrió que la iontoforesis, una metodología mínimamente invasiva que usa una corriente eléctrica baja para mejorar la penetración de compuestos ionizados en los tejidos, es efectiva para el suministro intraocular de luteína. Se trataron catorce conejos pigmentados mediante la aplicación sobre la córnea y la esclerótica de un depósito iontoforético rellenado con emulsión de luteína con o sin corriente (20,0 y 0,0 mA, respectivamente). Después de la iontoforesis, se recogieron los tejidos oculares de ambos ojos (ensayo y control) y se evaluó el suministro de luteína mediante comparación visual entre el ojo tratado y el ojo contralateral no tratado. La aplicación de iontoforesis transcorneal y transescleral dio como resultado el suministro de luteína a la córnea del conejo en todos los ojos tratados (tiempo 0 h). La aplicación de luteína también creó una traza naranja en la esclerótica limbo y una ligera coloración naranja en la conjuntiva del ojo, lo que demuestra el transporte de la emulsión también a estos tejidos. En este trabajo hemos demostrado por primera vez que la iontoforesis es una técnica efectiva para el suministro intraocular de luteína.

En la presente invención, se evaluó la distribución de luteína en el ojo después del procedimiento de iontoforesis para confirmar que se suministraron grandes cantidades de luteína a la retina posterior mediante esta técnica. Los resultados indican que la iontoforesis es un método efectivo para suministrar una emulsión liposomal de luteína cargada positivamente en los ojos de los conejos. Además, se realizaron experimentos mediante el uso de formulaciones optimizadas de emulsión de luteína y un prototipo iontoforético alternativo para evaluar la distribución de la luteína en diferentes tejidos oculares.

También se realizaron ensayos con ojos de cadáveres humanos a los que se les aplicó una corriente eléctrica baja para evaluar el suministro de luteína a través de la córnea y la esclerótica. La córnea, la esclerótica, la coroides, la retina periférica y central de los ojos tratados y no tratados se recogieron y analizaron mediante microscopía de dos fotones para visualizar la distribución de los liposomas que contienen luteína.

La aplicación iontoforética transescleral dio como resultado el suministro de luteína principalmente a la región de la retina posterior, lo que revela la trayectoria de la luteína después de que la iontoforesis ocurre a través del cuerpo ciliar/pars plana seguido de difusión pasiva hasta llegar a la retina posterior. La ausencia de luteína en la coroides puede explicarse por el tamaño estrecho de las uniones estrechas del epitelio pigmentado de la retina, que dificulta el paso de las vesículas liposomales más grandes, de esta manera se atrapa la luteína en las capas internas de la retina.

Con este trabajo demostramos por primera vez el suministro in-situ de luteína al segmento posterior del ojo a través de un método novedoso y mínimamente invasivo. Los resultados demuestran que la iontoforesis escleral de la luteína es una estrategia efectiva para llevar luteína a la mácula, lo que representa una alternativa a los métodos actuales usados para retrasar enfermedades en el segmento posterior del ojo, tales como la AMD.

La iontoforesis tiene la ventaja de ser un método mínimamente invasivo y, por lo tanto, es más seguro que los métodos alternativos de suministro intraocular de compuestos, específicamente implantes e inyecciones intraoculares. Consecuentemente, la iontoforesis tendrá una mayor conformidad del paciente ya que evita las complicaciones de un implante quirúrgico o inyecciones intravítreas frecuentes y de alta dosis. Otra ventaja es que esta técnica es menos costosa que esos procedimientos y se puede realizar rápidamente en el consultorio del médico durante una cita de atención oftalmológica normal sin necesidad de un entorno quirúrgico.

Breve descripción de las figuras

El archivo de la patente o de la solicitud contiene al menos un dibujo hecho a color. Las copias de esta publicación de patente o de la solicitud de patente con la (las) figura(s) a color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tarifa necesaria.

La Figura 1 es un gráfico de los espectros de absorción de Lipo+ (300 a 750 nm), dilución 1:50 en NaCl al 0,9 % (azul) o agua destilada (rojo); se representa el espectro de control (solución de liposomas sin luteína).

La Figura 2 es un gráfico de espectros de fluorescencia Lipo+ (480 a 650 nm), dilución 1:50 en NaCl al 0,9 % (azul) o agua destilada (rojo); se representa el espectro de control (solución de liposomas sin luteína).

La Figura 3 es un gráfico de la dispersión dinámica de la luz y la movilidad electroforética para estimar la distribución del tamaño de partícula y la carga de la solución Lipo+: se ensayó una dilución 1:50 en agua destilada (roja) y también una dilución 1:50 de liposomas en agua (sin luteína) como control.

La Figura 4 es una representación esquemática de la trayectoria de la luteína después de la aplicación de la iontoforesis; la aplicación escleral deposita luteína en la parte posterior del ojo, mientras que la aplicación corneal deja la luteína sobre las células epiteliales corneales (manchas naranjas); las flechas indican la entrada de luteína después de la aplicación de iontoforesis.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

Los términos "administración de" o "suministrar un" compuesto deben entenderse como proporcionar un compuesto de la invención al individuo que necesita tratamiento en una forma que pueda introducirse en el cuerpo de ese individuo en una forma terapéuticamente útil y en una cantidad terapéuticamente efectiva, que incluyen, pero no se limitan a: formas de dosificación oral, tales como comprimidos, cápsulas, jarabes, suspensiones y similares; formas de dosificación inyectables, tales como IV, IM o IP y similares; formas de dosificación transdérmica, que incluyen cremas, gelatinas, polvos o parches; formas de dosificación bucal; polvos, aerosoles, suspensiones y similares para inhalación; y supositorios rectales.

El término "cantidad efectiva", como se usa en la presente, se refiere a la cantidad necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. Como apreciarán los expertos en esta técnica, la cantidad efectiva de un compuesto o agente bioactivo puede variar en dependencia de factores tales como el punto final biológico deseado, el agente bioactivo que se suministrará, la composición de la matriz encapsulante, el tejido objetivo, etc.

Como se usa en la presente, el término "extracto" se refiere a un producto preparado por extracción. El extracto puede estar en forma de una solución en un solvente, o el extracto puede ser un concentrado o esencia que está libre o sustancialmente libre de solvente. El término extracto puede ser un solo extracto obtenido de una etapa de extracción particular o una serie de etapas de extracción o el extracto también puede ser una combinación de extractos obtenidos de etapas de extracción separadas. Por ejemplo, el extracto "a" puede obtenerse al extraer arándano con alcohol en agua, mientras que el extracto "b" puede obtenerse mediante extracción supercrítica de arándano con dióxido de carbono. Los extractos a y b pueden luego combinarse para formar el extracto "c". Por tanto, dichos extractos combinados también están englobados por el término "extracto".

Como se usa en la presente, el término "fracción" significa el extracto que comprende un grupo específico de compuestos químicos caracterizados por ciertas propiedades físicas, químicas o propiedades físicas o químicas.

El término "prevenir", cuando se usa en relación con una afección, como el cáncer, una enfermedad infecciosa u otra enfermedad o afección médica, se comprende bien en la técnica e incluye la administración de una composición que reduce la frecuencia o retrasa la aparición de síntomas de una afección médica en un sujeto con relación a un sujeto que no recibe la composición. Por tanto, la prevención del cáncer incluye, por ejemplo, reducir el número de crecimientos cancerosos detectables en una población de pacientes que reciben un tratamiento profiláctico con relación a una población de control no tratada y/o retrasar la aparición de crecimientos cancerosos detectables en una población tratada frente a una población no tratada de control, por ejemplo, en una cantidad estadística y/o clínicamente significativa. La prevención de una infección incluye, por ejemplo, reducir el número de diagnósticos de la infección en una población tratada frente a una población de control no tratada y/o retrasar la aparición de los síntomas de la infección en una población tratada frente a una población de control no tratada.

Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el portador, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor del mismo.

El término "sinérgico" se entiende bien en la técnica y se refiere a dos o más componentes que trabajan juntos de modo que el efecto total es mayor que la suma de los componentes.

El término "tratar" se entiende bien en la técnica y se refiere a curar así como también mejorar al menos un síntoma de cualquier condición o trastorno.

El término tratamiento "profiláctico o terapéutico" es bien conocido en la técnica e incluye la administración al anfitrión de una o más de las composiciones objeto. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal huésped), entonces el tratamiento es profiláctico, es decir, protege al huésped contra el desarrollo de la afección no deseada, mientras que si se administra después de la manifestación de la afección no deseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, está destinado a disminuir, mejorar o estabilizar la afección no deseada existente o los efectos secundarios de la misma).

Los compuestos de esta invención se pueden administrar a sujetos (seres humanos y animales, incluidos animales de compañía, tales como perros, gatos y caballos) que necesiten dicho tratamiento en dosis que proporcionarán una eficacia farmacéutica óptima. Se apreciará que la dosis requerida para uso en cualquier aplicación particular puede variar de paciente a paciente, no sólo con el compuesto particular o la composición seleccionada, sino que además con la vía de administración, la naturaleza de la afección a tratar, la edad y la condición del paciente, la medicación concurrente o las dietas especiales que después sigue el paciente, y otros factores que reconocerán aquellos con experiencia en la materia, con la dosificación adecuada que será en última instancia a criterio del médico asistente.

Ejemplo 1 - Suministro intraocular de luteína en ojos de conejo

Materiales y métodos

Trabajo de formulación. Entre los diferentes sistemas de suministro que se usan actualmente para mejorar la estabilidad de los compuestos, los liposomas tienen ventajas debido a su biocompatibilidad, potencial de liberación sostenida y la capacidad de transportar compuestos tanto hidrófobos como hidrófilos16. En este trabajo, se encapsuló luteína cristalina (Kemin Foods, FloraGLO® Crystalline Lutein lote 1401103302) en liposomas mediante el uso de fosfolípidos 90H (Lipoid GmbH, lote 529400-2120046-12-112, CAS 308068-11-3) y octadecilamina (Sigma- Aldrich lote BCBK6340V, CAS 124­ 30-1). La película lipídica se preparó mediante el uso de fosfolípidos 90H, octadecilamina y luteína disuelta en CHCla/MeOH (2:1) (Sigma-Aldrich, lote SHBC4982V, CAS 67-66-3/Sigma-Aldrich, lote SZBC237BV, CAS 67-56-1). Los disolventes se eliminaron al vacío mediante evaporación rotatoria; la solución se secó al vacío a 40 °C mediante un rotavapor Heidolph, la velocidad del rotavapor se moduló para reducir la formación de burbujas y salpicaduras que podrían causar pérdida de producto y se obtuvo una película fina seca después de 1-2 horas. Para eliminar cualquier traza de disolventes, la película fina se dejó al vacío durante al menos 16 horas a temperatura ambiente. La hidratación de la película lipídica se realizó al agregar agua destilada (Water Ultrapure - MilliQ-by AquaMax - conductividad 0,054 uS/cm) a 40-45 °C a la película de lípidos para hidratar los lípidos y formar vesículas de liposomas grandes. La homogeneización de las vesículas de liposomas grandes se logró mediante el uso del homogeneizador digital Ika Works ULTRA-TURRAX T 25 (Staufen, Alemania), y la reducción de las vesículas de liposomas a un intervalo de tamaño nanométrico se realizó por extrusión mediante el uso de un procesador de alto fluido Microfluidizer® M-110EH a 50 - 60 °C y 1200 bar. Este proceso se repitió 5 veces. La esterilización de la emulsión se realizó a 121 °C durante 20 minutos a 1 atm. La Tabla 1 muestra la composición de la emulsión de liposomas. La distribución de tamaño, el potencial zeta, la osmolalidad y el pH del producto final se analizaron después de la esterilización y se resumen en la Tabla 2.

Tabla 1. Composición de emulsión de liposomas de luteína.

Tabla 2. Características de los liposomas después de la esterilización.

Dispositivo de iontoforesis ocular. El dispositivo de iontoforesis constaba de dos componentes desechables: un aplicador ocular y un electrodo de retorno. Estos dos componentes se conectaron a un generador reusable. El aplicador ocular estaba compuesto por un reservorio de policarbonato (diámetro 9 mm, altura 4,5 mm, volumen 0,5 ml) y un electrodo de acero inoxidable (AISI 304) conectado con un cable al generador (ánodo - electrodo positivo). El electrodo de retorno fue una aguja intradérmica de 25G, insertada en el cuello (lado frontal) y conectada con una pinza de cocodrilo y cable al generador (cátodo). El generador (EYEGATE CCI Generator 6121-EYe , Eyegate Pharma, París Francia) era un tipo de corriente constante, intervalo de ajuste 0,25 mA - 2,5 mA (10 incrementos de 0,25 mA) para la corriente y 0,5 min - 5 min para el tiempo (10 incrementos de 0,5 min). La tensión resultante aplicada se midió durante el estudio con un multímetro.

Animales. En este estudio se usaron catorce conejos pigmentados de la cepa HY79b (Criador: "HYPHARM" - FR-49450 ROUSSAY). Todos los animales se identificaron individualmente mediante el uso de una etiqueta de oreja y mediante el uso de un marcador en las orejas después del examen de inclusión. Los animales se mantuvieron en observación durante 3 días después de su llegada y se les observó diariamente para detectar signos de enfermedad con especial atención a los ojos. Los animales se alojaron individualmente en jaulas estándar, en condiciones ambientales idénticas. La temperatura se mantuvo a 15 - 21 °C y la humedad relativa a 55 ± 10 %. Las habitaciones fueron ventiladas continuamente (> 15 volúmenes de aire por hora). La temperatura y la humedad relativa se controlaron y registraron continuamente. Los animales se expusieron de forma rutinaria (en la jaula) a una luz de 10-200 lx en una luz de 12 horas (de 7:00 am a 7:00 pm) y un ciclo controlado de oscuridad de 12 horas. Durante todo el estudio, los animales tuvieron acceso libre a alimentos y agua. Se les alimentó con una dieta estándar en gránulos secos (150 g/día), LASQCdiet® Rab-14H (LASVENDI GMBH, Soest Alemania). Se disponía de agua del grifo, analizada periódicamente ad libitum de botellas de plástico. Todos los procedimientos y protocolos operativos estándar descritos en este plan de estudio han sido revisados por un Comité de Ética certificado. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE Convención Europea para la Protección de Animales Vertebrados usados para Experimentos17 y otros fines científicos y a la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión18.

Procedimiento experimental. Se dividieron aleatoriamente catorce conejos pigmentados de la cepa HY79b en dos grupos: control (aplicación pasiva: sin corriente eléctrica; animales # 9-14) y grupo de ensayo (aplicación iontoforética: con corriente eléctrica; animales # 1-8). Estos dos grupos se subdividieron en dos puntos de tiempo (0 y 2 horas). La Tabla 3 resume el diseño del estudio.

Tabla 3. Diseño del estudio.

La emulsión de luteína se administró por iontoforesis a animales anestesiados (inyección intramuscular de una mezcla de xilazina/ketamina), con la ayuda de un blefarostato y bajo anestesia local (una gota de Cebesine®: oxibuprocaína al 0,4 %, Thea, lote F6757) unos 10 minutos antes de la aplicación). Los animales se trataron mediante la aplicación sobre la córnea y la esclerótica de un aplicador iontoforético de 9 mm relleno con luteína durante 10 minutos en el ojo derecho. Se aplicó una carga de 0,0 mA o 20,0 mA en cada ojo, en dependencia del grupo (ver Tabla 3). El aplicador iontoforético se impregnó con 0,5 ml de emulsión de liposoma de luteína justo antes de la dosificación; el electrodo del dispositivo se cubrió con emulsión de luteína. Todas las administraciones fueron seguidas por lavado con solución salina balanceada (BSS).

Inmediatamente después de la aplicación iontoforética en el ojo derecho o 2 horas después de la aplicación (ver Tabla 3), los animales fueron sacrificados mediante la administración intravenosa de pentobarbital en sobredosis, que se encuentra entre los métodos recomendados por las autoridades europeas17. Se tomaron muestras de córnea (C), humor acuoso (AH), cuerpo ciliar (CB), retina (R), vítreo (V) y esclerótica (SC) de ambos ojos y se pesaron. Se realizó una evaluación visual de la coloración de las muestras antes de almacenarlas a -80 °C para futuros análisis de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución).

Resultados

Suministro iontoforético ocular de emulsión de luteína en conejos pigmentados. Con el fin de evaluar la capacidad de la luteína para ser liberada por iontoforesis, producimos liposomas que llevaban luteína (cargada positivamente) y aplicamos esta emulsión durante 10 min con 2,0 mA en la córnea/esclerótica de conejos pigmentados. La eficacia del suministro por iontoforesis se evaluó mediante una evaluación visual de los tejidos recogidos. La Tabla 4 resume los resultados tras la aplicación de la emulsión de luteína, con y sin corriente.

Tabla 4. Coloración después de la aplicación iontoforética.

Subsecuentemente a la aplicación de la iontoforesis, todos los ojos tratados con 20,0 mA de corriente (tiempo 0 h) revelaron un color naranja circular en la córnea lo que revela la presencia de emulsión de luteína en los tejidos. La aplicación de luteína también se originó en dos ojos (#2 y #3) una traza naranja en la esclerótica limbo y una ligera coloración naranja en la conjuntiva del ojo. Después de 2 h de tratamiento, solo la mitad de los ojos tratados mostraron esta coloración en la córnea (#5 y #8), este evento puede indicar que subsecuentemente a la aplicación, la emulsión se difunde al ojo. No se observó suministro a los diferentes tejidos oculares sin corriente.

Discusión

Aproximadamente el 10 % de las personas mayores de 65 años en todo el mundo padecen la enfermedad de AMD19. Diferentes ensayos han indicado que la luteína es un potencial retardador de la progresión de la AMD y también una posible molécula neuroprotectora1320-22. Además, la luteína es un componente natural del ojo, con tropismo macular intrínseco, que se deposita específicamente en la zona parafoveal donde es congénita1. Estas características pueden ser una ventaja frente a los productos actuales que se usan para controlar AMD. Los tratamientos disponibles para esta patología involucran inyecciones intraoculares que tienen efectos secundarios, son molestos para el paciente y costosos, por lo que el desarrollo de un tratamiento más seguro y efectivo es crucial. En los últimos años, los resultados de muchos estudios han destacado los riesgos de las inyecciones intravítreas. La necesidad de una administración frecuente de fármacos mediante inyecciones intravítreas puede provocar desprendimiento de retina, endoftalmitis y aumento de la presión intraocular. Se ha informado de la inflamación tanto infecciosa como no infecciosa como complicaciones de las inyecciones intravítreas. Con las tasas crecientes de inyecciones intravítreas desde su aprobación para su uso, la incidencia de endoftalmitis infecciosa se ha estudiado ampliamente2324. En este trabajo probamos, por primera vez, una tecnología mínimamente invasiva para suministrar luteína in-situ. La iontoforesis tiene la ventaja de ser un método mínimamente invasivo y por lo tanto es más seguro y fácil de mejorar el cumplimiento del paciente, ya que evita las complicaciones de una implantación quirúrgica o frecuentes y altas dosis de inyecciones intravítreas12. De hecho, diferentes estudios preclínicos y clínicos informaron sobre la seguridad de las aplicaciones repetidas de iontoforesis ocular142126. Otra ventaja es que este método es menos costoso y se puede realizar rápidamente en el consultorio del médico durante una cita de atención oftalmológica normal sin necesidad de un entorno quirúrgico. Diferentes estudios establecieron el uso de la iontoforesis para el tratamiento de enfermedades oculares humanas, por ejemplo, en el manejo del rechazo activo de injertos de córnea27, tratamiento de la enfermedad del ojo seco1428, uveítis anterior no infecciosa15 y enfermedad del queratocono29.

En esta investigación hemos usado la iontoforesis que implica la aplicación de una corriente continua débil durante 10 minutos que impulsa moléculas cargadas a través de los tejidos del ojo. La aplicación iontoforética resultó en la penetración de la emulsión de liposomas portadores de luteína (fármaco ionizado) a través del segmento corneal del ojo.

Este estudio es una prueba de concepto efectiva que muestra claramente un suministro intraocular de emulsión de luteína a través de la técnica de iontoforesis.

Ejemplo 2: Suministro intraocular de luteína en ojos de cadáveres

Materiales y métodos

Trabajo de formulación. Se ha demostrado que las partículas positivas son mejores candidatas para la aplicación iontoforética como portador de fármacos que las partículas cargadas negativamente debido a una mayor penetración en los tejidos oculares38. Además, el campo eléctrico fuerza a las moléculas con carga positiva a moverse hacia las membranas oculares (cargadas negativamente)39. En este trabajo aprovechamos el hecho de que las membranas presentes en el ojo humano, a pH fisiológico, están cargadas negativamente y para desarrollar una emulsión cargada positivamente portadora de luteína para ser suministrada mediante aplicación de iontoforesis. Debido a que la luteína es una molécula de gran peso molecular, lipofílica e insoluble en agua, el suministro de este carotenoide a través de la iontoforesis sin modificaciones es casi imposible1. Para superarlo se preparó una formulación con vesículas de liposomas cargadas positivamente que se comportan como portadores de moléculas de luteína (Lipo+). La película lipídica se preparó mediante el uso de fosfolipón 90H (Lipoid GmbH, lote 529400-2120046-12-112, CAS 308068-11-3), octadecilamina (Sigma-Aldrich lote Bc Bk6340V, Ca S 124-30-1) luteína cristalina (Kemin Health, FloraGLO® Crystalline Lutein lote 1401103302). Para la preparación de 4-5 L, los compuestos se disolvieron en 500-800 mL de CHCl3/MeOH (1:1 v/v) (Sigma-Aldrich, lote SHBC4982V, CAS 67-66-3/Sigma-Aldrich, lote SZBC237BV, CAS 67-56-1) al calentar a 30­ 35 °C. Consulte la composición de la formulación en la Tabla 5. Los disolventes se eliminaron al vacío mediante evaporación rotatoria; la solución se secó al vacío a 40 °C mediante un rotavapor Heidolph y se obtuvo una película fina seca después de 1-2 horas. La película delgada se dejó al vacío durante al menos 16 horas a temperatura ambiente para asegurar la eliminación completa de cualquier traza de disolventes. El contenido de disolventes orgánicos se analizó mediante cromatografía de gases (GC) y se aseguró que era inferior a 25 ppm. La hidratación de la película lipídica se realizó al agregar agua destilada (Water Ultrapure - MilliQ-by AquaMax - conductividad 0,054 uS/cm) a 65 °C a la película lipídica para formar vesículas de liposomas grandes. La homogeneización de estas vesículas de liposomas grandes se logró mediante el uso del homogeneizador digital Ika Works ULTRA-TURRAX T 25 (Staufen, Alemania) a 2000-4000 rpm y la reducción de las vesículas de liposomas a un intervalo de tamaño nanométrico se realizó mediante extrusión mediante el uso de un procesador de alto fluido a gran escala Microfluidizer® M-110EH a 50 - 60 °C y 1200 bar. Este proceso se repitió 5 veces. La esterilización de la emulsión se realizó a 121 °C durante 20 minutos a 1 atm. Después del proceso de esterilización, se registraron las características de la formulación liposomal: pH (mediante el uso de un instrumento Mettler Toledo S20), osmolalidad (mediante el uso de un Osmomat 3000), tamaño de partícula y potencial zeta (mediante el uso de dispersión dinámica de luz (DLS), también conocida como correlación de fotones técnica de espectroscopía - Nicomp 380 DLS.

Tabla 5. Composición de emulsión de liposomas de luteína.

Evaluación espectrofotométrica de la formulación. Se usó espectrofotometría para medir las propiedades de absorbancia y fluorescencia de la solución Lipo+ (dilución 1:50 en agua o NaCl al 0,9 %). Se usó como control una solución que incluía solo liposomas (sin luteína). Los espectros de absorbancia se trazaron entre 300 y 750 nm para cada muestra y los espectros de fluorescencia entre 480 y 650 nm, con excitación a 370 nm (elegida a partir de los resultados de los espectros de absorbancia).

Tamaño de partícula y potencial zeta. Se usó la dispersión de luz dinámica para evaluar la distribución de tamaños de los componentes en la solución Lipo+. Se realizó electroforesis para evaluar el potencial zeta de la solución.

Dispositivo de iontoforesis ocular. El principio de la iontoforesis ocular consiste en aplicar un campo eléctrico a una sustancia electrolítica que contiene al menos un producto, con el fin de transportar el producto al cuerpo o al órgano a tratar, a través de las membranas biológicas del ojo12.

Un ajuste iontoforético típico se compone de dos componentes: un aplicador ocular y un electrodo de retorno, ambos conectados a un generador. En este experimento, el aplicador ocular constaba de 2 electrodos para tratar independientemente los tejidos de la córnea y la esclerótica. El aplicador ocular (OPIA Technologies SAS, París, Francia) está fabricado en resina de poliuretano y comprende 2 depósitos: depósito circular central (diámetro 8 mm, altura 4,5 mm, volumen 1 ml) y un electrodo de acero inoxidable, aplicado sobre la córnea rodeada de un depósito anular (diámetro interior 12,5 mm, diámetro exterior 18 mm altura 4,5 mm, volumen 1 ml) y un electrodo de acero inoxidable, aplicado en la esclerótica (región pars plana alrededor del limbo). Cada electrodo de acero inoxidable conectado con un cable a un generador de corriente constante diferente (ánodo - electrodo positivo). Los electrodos de retorno se asignaron a cada generador y se unieron respectivamente al nervio óptico (para el electrodo corneal) y la región ecuatorial de la esclerótica (para el electrodo escleral), al cerrar cada circuito eléctrico independientemente. Los generadores (IONO-25, Iacer Srl, Italia) eran del tipo de corriente constante, intervalo de ajuste 0,25 mA - 2,5 mA (5 incrementos de 0,5 mA) para la corriente y el tiempo ajustados automáticamente para suministrar una dosis total de 20 mA.min. La tensión resultante aplicada se midió durante el estudio para cada circuito con 2 multímetros.

Ojos de cadáveres. Se obtuvieron seis globos oculares de cadáveres humanos, de diferentes donantes sanos, de la Veneto Eye Bank Foundation (Venezia Zelarino, Italia). Los ojos humanos se usaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki para investigaciones que implican el uso de tejido humano y se explantaron entre 3 y 16 horas después de la muerte y se conservaron inmediatamente a 4 °C en medio de almacenamiento corneal enriquecido con dextrano al 6 %. La edad media del donante fue de 63,6 ± 5,9 años. La densidad media de células endoteliales fue de 2125 ± 389 células/mm2. Cada globo ocular, sumergido en una solución enriquecida con dextrano, se envió al laboratorio dentro de 5 días. Cuatro globos oculares se sometieron a iontoforesis corneoescleral para suministrar una solución oftálmica de luteína al 0,1 % en el tejido retiniano. Se usaron dos globos oculares como control: se realizó la iontoforesis sin presencia de la formulación.

Preparación de los ojos. Cada globo ocular se montó suavemente en un soporte especialmente diseñado, con la mirada hacia arriba. Los electrodos pasivos escleral y corneal se aplicaron en el nervio óptico y la esclerótica, respectivamente. El ojo se conectó a un manómetro de columna mediante un tubo, relleno con solución de cloruro de sodio al 0,9 %, para mantener la presión dentro del ojo a 15 mmHg durante el experimento. El globo ocular se sometió primero a tres ciclos de preacondicionamiento entre 15 y 42 mmHg para estabilizar los tejidos y la mecánica oculares durante el experimento. Este preacondicionamiento aseguró alcanzar un estado de referencia único al comienzo de cada experimento y restaurar el grosor corneal y escleral a niveles fisiológicos. Después del preacondicionamiento, se midió el grosor corneal central (CCT), mediante el uso de un paquímetro corneal ecográfico (Pachmate, DGH, Exton, Estados Unidos). En estas muestras, el CCT medio fue de 558 ± 19 pm.

Impregnación con la solución. El electrodo activo (cátodo), en un baño de plástico, se aplicó a la superficie corneal y escleral. El tubo de plástico se rellenó de espuma, que se empapó con Lipo+ durante 2o minutos. Después de este tratamiento de remojo previo, el tubo se aplicó suavemente a la superficie anterior del globo ocular y se volvió a rellenar con 2 ml de solución Lipo+. La densidad de corriente se fijó en 2,5 mA y se suministró durante 5 minutos para ambos generadores conectados a la córnea y la esclerótica. Después de la iontoforesis corneoescleral, el globo ocular se mantuvo, con la mirada hacia arriba, en el soporte del ojo con la presión dentro del ojo a 15 mmHg durante 80 minutos. Este período permitió que la luteína, que llegaba a la retina por iontoforesis transescleral, se difundiera pasivamente, a través del tejido retiniano, hacia la mácula, especialmente la región parafoveal. Dos de los 6 ojos usados en este estudio se usaron como control, por lo que no se realizó impregnación con la formulación.

Evaluación de tejidos. Después de 80 minutos, se aisló el tejido de la retina sin inducir un daño grave que pudiera comprometer su uso para la obtención de imágenes de dos fotones de alta resolución. La disección de tejidos retinianos, coroideos, corneales y esclerales se realizó mediante el uso de un protocolo estandarizado47. Se usó microscopía de dos fotones para evaluar la penetración de luteína en la región macular de la retina. Antes de comenzar la adquisición de imágenes en los tejidos oculares, se adquirieron varias pilas de solución Lipo+ (diluciones al 0,005 %, 0,002 % y 0,001 % en cloruro de sodio al 0,9 %) para comprender cuál es el mejor filtro para aplicar y mejorar la fluorescencia de dos fotones (TPF) señal emitida por la luteína. El filtro 550/80 nm (Semrock) fue el más apropiado para el estudio de la luteína (en base a estudios espectrofotométricos) sin embargo, se encontró que el filtro 525/20 nm (Semrock) dio buenos resultados en términos de relación señal a ruido (SNR). Por lo tanto, la excitación usada para la evaluación de los tejidos oculares fue de 835 nm y la luz TPF emitida por los componentes del tejido ocular se recogió en dirección hacia atrás mediante un detector no escaneado (NDD1) para la reflexión de la luz reflejada.

Espectroscopía Raman de resonancia: Se usó la dispersión resonante Raman para evaluar la eficacia de la liberación de luteína por iontoforesis a la retina humana en ojos de cadáveres. Se usó una fuente láser de modo único (50 mW de potencia), centrada en una longitud de onda de 473,5 nm, como fuente de excitación para realizar la medición de espectroscopía Raman de resonancia. El rayo láser se enfocó en los tejidos oculares mediante una combinación de lentes y un objetivo de microscopio (NA = 0,25), de modo que el área de la retina irradiada tenía 1 mm de diámetro; la potencia del láser se redujo a 1 mW en el plano retiniano mediante el uso de un filtro de densidad neutra. La luz dispersa Raman se recogió mediante un tubo fotomultiplicador (PMT), con resolución espectral de 10 cm-1 y con una tasa promedio de 80 recuentos oscuros. La intensidad de la señal Raman se registró como recuentos de fotones por segundo (cps). Las mediciones se realizaron en tres regiones retinianas: la esclerótica interna en el sitio de liberación iontoforética (es decir, la esclerótica perilimbal que mira hacia el cuerpo ciliar); la periferia media de la retina, que incluía la región de la retina que rodeaba las arcadas vasculares y la cabeza del nervio óptico; y la mácula. Las mediciones se realizaron en cuatro áreas en cada región con el fin de recopilar datos suficientes para estimar correctamente los datos en el estudio y los ojos de control. Antes del experimento, para encontrar una correlación entre las lecturas Raman y el contenido real de luteína de los tejidos oculares, se realizaron experimentos de calibración mediante el uso de cubetas de cuarzo delgadas rellenadas con diferentes concentraciones de luteína.

Resultados

Características espectrales de Lipo+. Los espectros de absorbancia y fluorescencia de la solución Lipo+ se abordaron inicialmente en este estudio para determinar la longitud de onda de excitación de dos fotones. Los espectros de absorción se trazaron entre 300 y 750 nm y se representan en la Figura 1. La solución de Lipo+ mostró un pico de absorción a 370 nm y esto se usó como longitud de onda de excitación para trazar los espectros de fluorescencia de Lipo+ entre 480 y 650 nm (Figura 2). Lipo+ mostró dos picos de bandas fluorescentes: 500-530 nm y 540-570 nm. En base a estos resultados, el filtro elegido para los experimentos de dos fotones fue el 550/88.

Características físicas de Lipo+. El tamaño de partícula y el potencial zeta también se determinaron antes de la prueba de iontoforesis, con el fin de confirmar la carga positiva y el tamaño de Lipo+. Estas determinaciones se realizaron mediante dispersión dinámica de luz y electroforesis, respectivamente, para una dilución de Lipo+ 1:50 en agua destilada, y también se compararon con la solución de liposomas sin luteína (como control). De acuerdo con la Figura 3, los agregados de Lipo+ alcanzan un pico a 3,5 pm (en promedio) y también se observa un pico más pequeño a 300 nm (en promedio), indicativo de los liposomas individuales. Además, la determinación del potencial zeta mostró una carga de 5 mV para la solución Lipo+.

Distribución de la luteína en ojos de cadáveres después de la aplicación iontoforética. Aunque el filtro elegido para los experimentos de dos fotones fue el 550/88 (en base a experimentos de fluorescencia previos), el análisis inicial de la formulación liposomal de luteína reveló que el filtro 525/20 dio mejores resultados en términos de SNR. En esta calibración inicial (con diluciones de Lipo+ al 0,005, 0,002 y 0,001 % en NaCl al 0,9 %), los liposomas se observaron como vesículas esféricas y el microscopio se calibró correctamente (datos no mostrados). Este es un control muy importante porque las células pigmentarias de la retina están llenas de melanina, un pigmento que se excita en la misma longitud de onda que la luteína. Además, con este control podemos distinguir entre los liposomas de luteína y el pigmento.

Para evaluar la distribución de los liposomas portadores de luteína en el ojo humano después de la aplicación iontoforética, cinco ojos de cadáveres se expusieron a una corriente de 2,5 mA durante 5 minutos en la córnea/esclerótica, se dejaron reposar durante 80 minutos (presión intraocular controlada a 15 mmHg) y se recogieron las diferentes estructuras del ojo: córnea, esclerótica, coroides, retina periférica y central. La distribución de los liposomas se evaluó mediante microscopía de dos fotones (excitación a 835 nm). Se usó un sexto ojo de cadáver como control: el ojo nunca estuvo en contacto con la formulación liposomal. En este, no se detectaron liposomas cuando el láser de 835 nm estaba encendido, lo que indica que la señal es específica de la luteína exógena (datos no mostrados).

El análisis de los diferentes tejidos oculares recogidos mostró que después de la iontoforesis corneoescleral combinada, la luteína era abundante en la retina, mientras que no se encontraron liposomas enriquecidos con luteína en los tejidos coroideos de todos los ojos ensayados con la formulación.

Además, a partir de la investigación de la retina, la solución Lipo+ no pudo atravesar la pared de los vasos retinianos, ya que los liposomas solo se encontraron en el tejido que rodea los vasos.

Para las determinaciones del segmento anterior (esclerótica y córnea) no se encontraron liposomas enriquecidos con luteína, ni en el estroma corneal ni en el tejido de la esclerótica, pero sí en células epiteliales corneales.

En la retina también fue posible observar más luteína en la parte externa cercana a los fotorreceptores que en las células ganglionares, la parte interna de la retina.

Dado que el análisis de coroides reveló que no había liposomas presentes en esta región después de la aplicación actual, estos resultados indican que después de la aplicación transescleral de luteína por iontoforesis a través del cuerpo ciliar/pars plana, los liposomas de luteína se difunden pasivamente a través de las membranas del ojo hasta alcanzar la retina posterior cerca de la fóvea. La Figura 4 muestra una representación esquemática de la trayectoria de la luteína dentro del ojo. El análisis del tejido corneal después de la aplicación de iontoforesis corneal reveló que los liposomas estaban asentados sobre las células epiteliales de este tejido.

También se realizó un análisis de espectroscopía Raman de resonancia de diferentes tejidos oculares. Las señales Raman se superpusieron sobre un fondo de fluorescencia que probablemente se originó a partir de la fluoresceína de carotenoide intrínseca y la fluorescencia de lipofuscina. Para obtener una lectura precisa de las alturas de los picos Raman, sin señales de fondo, restamos la influencia de los picos de ruido potencialmente superpuestos en el espectro mediante el ajuste polinomial (hasta el 5to orden) de las formas de línea Raman medidas para cada espectro medido. La altura del pico final de la señal de doble enlace C=C a 1530 cm-1 se eligió como una firma de la presencia de luteína.

En la esclerótica interna, el pico Raman a 1530 cm-1 medido en un ojo tratado fue 7 veces mayor que en el ojo de control, lo que proporciona la evidencia de la eficacia de la iontoforesis para suministrar luteína al ojo a través de la esclerótica intacta. En la periferia media de la retina, el pico Raman a 1530 cm-1 medido en un ojo tratado fue 1,7 veces mayor que en el ojo de control, lo que indicó que una gran cantidad de luteína alcanzó el polo posterior de la retina al final del tratamiento de iontoforesis. En la mácula, el pico Raman a 1530 cm-1 medido en un ojo tratado fue 1,3 veces mayor que en los controles, lo que demuestra que la iontoforesis fue efectiva para suministrar luteína en la mácula.

Discusión

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la principal causa de ceguera irreversible en personas mayores de 50 años en el mundo desarrollado4041. Más de 8 millones de estadounidenses tienen AMD y se prevé que la prevalencia general de la enfermedad aumente en más del 50 % para el año 202037. Varios estudios epidemiológicos destacaron que la suplementación con luteína conduce a un aumento en los niveles de densidad óptica del pigmento macular (MPOD) en pacientes con AMD en etapa temprana, lo que se asocia con la protección contra la enfermedad macular4221. De hecho, la luteína se concentra naturalmente en la retina, donde junto con la zeaxantina forma el pigmento macular. Al actuar como un filtro de luz azul, la luteína puede proteger los fotorreceptores subyacentes en el centro de la mácula del daño fotoquímico43. Las propiedades antioxidantes de la luteína también pueden proteger la mácula del estrés oxidativo44.

Las soluciones disponibles para retardar la progresión de la AMD se basan en inyecciones o cirugías intraoculares, que abarcan efectos secundarios evidentes y posibles complicaciones tales como desprendimiento de retina, aumento de la presión intraocular y también inflamación no infecciosa e infecciosa2333. En este trabajo, usamos un método mínimamente invasivo de suministro in-situ de luteína al segmento posterior del ojo humano. La iontoforesis tiene la ventaja de ser un método más seguro y sencillo para tener la conformidad del paciente y propulsar altas concentraciones de un producto de interés a través de las diferentes capas del ojo hasta llegara la retina. Diferentes informes han establecido la seguridad de los tratamientos repetidos mediante iontoforesis ocular para el tratamiento de diferentes enfermedades tales como el ojo seco, la uveítis no infecciosa y el queratocono1415,25262829.

En la presente descripción, mediante el uso de ojos de cadáveres como modelo preclínico, aplicamos una corriente eléctrica débil para impulsar la luteína hacia el ojo, sin efectos secundarios. Observamos que los liposomas de luteína se depositan principalmente en la retina periférica y central cerca de la fóvea, pero estaban ausentes en las regiones coroideas. Con esta observación es posible extrapolar la trayectoria de la luteína después de una aplicación transescleral a través del cuerpo ciliar/pars plana, seguido de difusión pasiva a través de las membranas oculares hasta llegar a la región posterior de la retina (Figura 4). Demostramos por primera vez que la iontoforesis transescleral es una forma efectiva de llevar la luteína a la retina del ojo humano que proporciona una nueva forma de fortalecer el pigmento macular. Tras el depósito en la región posterior, se postula que la luteína puede alcanzar la parte externa de la retina donde están presentes los fotorreceptores, mediante difusión pasiva/gradiente de proteínas. Se puede argumentar que la razón por la que no se observó luteína en la coroides se debe a la barrera neural retiniana cuyo tamaño de malla es de 80-90 nm45 (Los liposomas tienen un tamaño de 341 nm y en ocasiones pueden formar grupos de 2-3 pm, lo que sugiere que los liposomas de luteína permanecen atrapados en la retina (Figura 4). Es importante destacar que el análisis de espectroscopía Raman de resonancia reveló que la concentración de luteína aumenta en la mácula después de la iontoforesis. Esta observación demuestra claramente que la iontoforesis transescleral es un método eficaz de suministro de luteína a la mácula y es una alternativa válida a los métodos actuales para prevenir la aparición de AMD, prevenir su progresión y/o tratar la enfermedad establecida.

Después de la aplicación de la iontoforesis corneal, no se encontraron liposomas en el estroma corneal. Este hecho se puede explicar ya que la luteína es hidrófoba y el estroma está compuesto en un 70 % por agua, por lo que es muy hidrófilo46, lo que imposibilita que la luteína penetre en este tejido.

La descripción y los dibujos anteriores comprenden modalidades ilustrativas de la presente invención. Las modalidades anteriores y los métodos descritos en la presente descripción pueden variar en función de la capacidad, experiencia y preferencia de los expertos en la técnica. El solo hecho de enumerar las etapas del método en un cierto orden no constituye ninguna limitación en el orden de las etapas del método. La descripción y los dibujos anteriores simplemente explican e ilustran la invención, y la invención no se limita a la misma, excepto en la medida en que las reivindicaciones son muy limitadas. Los expertos en la técnica que tengan ante sí la descripción podrán realizar modificaciones y variaciones en la misma sin apartarse del alcance de la invención.

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47. www.jove.com/video/3765

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de liposomas que contiene una molécula bioactiva para su uso en un método para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular mediante la administración de la formulación al ojo de un sujeto mediante iontoforesis, en donde la molécula bioactiva se selecciona del grupo que consiste en luteína y/o zeaxantina y el liposoma tiene un potencial zeta positivo.

2. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular retrasa la aparición de la degeneración macular relacionada con la edad.

3. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular es prevenir o retrasar la progresión de la degeneración macular relacionada con la edad.

4. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad o disfunción ocular es la degeneración macular relacionada con la edad.

5. Una formulación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde mejorar o prevenir una enfermedad o disfunción ocular comprende llevar a cabo el método en sujetos sanos.