CN112913775A - 一种药物(调往诱导剂mnu)诱导自发性白内障的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，诱导步骤如下：a.首先选用280只老鼠被用作研究；b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查。本发明通过在诱导剂MNU内添加褪黑素，能够直接清除自由基，还能够提高内源性抗氧化酶的产生，而且褪黑素治疗有助于Cu‑Zn‑SOD和MnSOD的产生，减少了脂质和DNA过氧化标志物MDA和8‑OHdG的水平。
Description
技术领域
本发明涉及白内障技术领域，具体为一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法。
背景技术
视网膜是光敏组织，它位于眼球的后极部。它源于复杂的微电路的层状结构，这些微电路协同工作来处理视觉信号。对视网膜损害将造成不可逆地视觉损伤。视网膜色素变性是一类遗传性视网膜病其特是退行性光感受器死亡。RP的病理过程受分子、细胞和组织水平因子的影响。鉴于巨大的异质极影响病因，RP病人总是有极大地易变发病点，进行性动态及其预后结果。这些易变性给精确治疗带来地极大地挑战。在临床阶断，没有药物能使RP病人光感受器死亡和视觉损害的中断。越来越多地证据表明氧化应激有助于RP光感受器的凋亡。过多的氧化自由基将干扰氧化还原的新陈代谢，改变线粒体膜的通透性及诱发光感受器的细胞色素c泄漏。过剩的氧化应激可被还原剂清除，光感受器可能存活时间更长其功能在合适的环境下发挥良好的作用。这个观点进一步被证明通过分子的抗氧化效能可以提升RP患者的视觉功能。
光感受器非常容易遭受氧化的损伤。它们的体内稳态需要大量的抗氧化剂直接对抗活性自由基。褪黑素是一种吲哚胺，主要通过松果体以昼夜节律性的方式合成的。视网膜是主要的生物节律信号的接受者，它被称作“光敏眼钟”。特别是，褪黑激素也是由光感受器合成的，以提高视觉灵敏度。褪黑素的受体集中在光感受器的突触末端部位，褪黑素有极大地可能介导光感受器的有益效应。一些证据表明了外源性褪黑素对视网膜提供细胞保护效应。褪黑素可以协同维生素E共同缓解视网膜内一氧化氮诱导的脂质过氧化。对比分析显示褪黑素保护抑制光诱导的氧化损伤大约是维生素E的100倍。褪黑素也可缓解氧化损伤和糖尿病视网膜病中的血管堵塞。另一个体外研究表明外源性褪黑素提升视杆光感受器和视网膜色素上皮层细胞的存活，这两个都涉及RP的发病机理。而且，外源性褪黑素也保护眼部疾病的物模型，如神经性青光眼，视网膜缺血-再灌注性损伤，早产儿视网膜病。褪黑素可以通过清除氧自由基，刺激细胞内的抗氧化酶的激活，稳定线粒体传递电子链及其调控凋亡基因的表达。
N-甲基N-亚硝基脲(MNU)是通过系统注射诱导光感受器细胞快速死亡的烷基化毒性物质。MNU给药小鼠典型地被用作化学诱导的RP动物模型。MNU与DNA相互作用，MNU给药6小时后光感受器核内选择性地产生7-甲基呱DNA结合物。光感受器内的凋亡级联在MNU给药12小时后被激活，最终使Bcl-2水平下调。在这个时间点，核小体内的碎片可以在光感受器内看到。在MNU给药24小时后，第一个组织的改变可以被检测到。光感受器表现为核固缩以及内外节的缩短。在MNU给药48小时后，光感受器核的破坏最明显。最终在七天的时候，由于光感受器丧失，光感受器退化的活动迹象变得模糊不清。目的是探索褪黑素对退行性光感受的保护效应。褪黑素被递送到MNU给药小鼠的玻璃体内。目的是寻找褪黑素对MNU给药小鼠的光感受的存活，视觉功能和视觉信号的传输是否有额外的保护效应。特别的是，倾向于通过位置分析褪黑素的定性的治疗效应。这些发现将丰富对褪黑素的了解，对RP的治疗提供一个新的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，解决了背景技术中所提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，诱导步骤如下：
a.首先选用280只老鼠被用作研究；
b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；
c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；
d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查；
e.待步骤d完成后，再将小鼠被麻醉后转移到超高分辩率仪器的记录平台上，接着将甲基纤维系润滑剂涂抹在小鼠的角膜上，然后将探头放置在角膜的附近，直到视网膜的图像出现在屏幕上，最后用相关盒子对视神经头(ONH)进行定位，分别在距离ONH边缘相同距离的两侧进行8次测量；
f.待步骤e完成后，将视网膜标本置于电极陈列的记录室内，视网膜神经元模拟细胞外反应被Med-64系统记录，电场电位波形用带通滤波器(100-300Hz)处理并求得脉冲值，用环刺激时间直方图(PSTHs)和栅格图将视网膜神经节细胞(RGEs)进行分类，根据PSTHs分析进行ON和OFF反应；
g.待步骤f完成后，再用花生凝集素偶联Alexa Fluor 488，s-视椎视蛋白和m-视椎视蛋白分别用抗体与视网膜切片染色，之后用PBS冲洗，视网膜标本被Cyt3联合抗兔免疫球蛋白G(IgG)和4,6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)共同孵育，再使用Axio Vision软件对ONL周围的四个420*420箱内的锥细胞进行定量；
h.待步骤g完成后，再对老鼠进行末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测，在其过程中外核层(ONL)的凋亡指数(AI)是通过TUNEL阳性核数/光感受器细胞核总数*100计算得到；
i.待步骤h完成后，再将老鼠吓死后将它们的眼睛取出，使用商业试剂提取视网膜切片中的总RNA然后使MACSTMDNA合成盒合成互补DNA，达到定量逆转录聚合酶链反应；
j.待步骤i完成后，再将视网膜组织加入到含有0.5％Triton X100(pH 7.4)的PBS中，然后用研磨机在冰冷的水中匀浆，组织在4℃下以500g离心5分钟，然后测定悬浮液中蛋白质含量，以使酶活性和氧化应激标记物的含量正常化，再根据之前的描述测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的浓度，在其过程中铜锌超氧化物歧化酶活性被超氧化物歧化酶检测试剂盒分析，一个单位的铜锌超氧化物歧化酶活性被定义为在硝基蓝四唑还原率中引起半抑制酶的量，接着使用带有超微量比色皿的分光光度计来测量吸光度值，在550纳米的分光光度计上测量每个样品在超微量试管中的吸光度值，该值表示为U/mg蛋白质；
k.待步骤j完成后，再使用方差分析(ANOVE)对数据进行处理，随后使用Bonferroni的事后分析，所有的数值均以均数+-标准差(SD)表示，P值<0.05被认为具有统计学意义。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤a中老鼠均为C57/BL，8-9周大的雌雄鼠，体重范围在18-23g。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤b中设备的温度为18-23℃，40-65％的湿度，12小时循环暗/灯照射。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤c中普通对照组，老鼠没有任何的药物注射，MNU组：老鼠接受静脉注射MNU(60mg/kg)，MNU+褪黑素组：老鼠接受玻璃体递送褪黑素，MNU+空白组：MNU递送2小时后玻璃体递送2的空白液。
作为本发明的一种优选实施方式，所述MNU被保存在4℃的暗环境中，使用前将MNU溶解于0.05％乙酸的生理盐水中，MNU诱导的视网膜退化在注射60mg/kg7天内完成，将老鼠分离两小时，然后观察他们是否有不正常的现象，如果MNU给药小鼠没有不良的影响，褪黑素溶液按照描述的方法进行注射，褪黑素首先溶解在5％的二甲基然后在不同浓度进一步稀释磷酸缓冲液，控制组动物接受的空白注射与褪黑素治疗组保持相同剂量的PBS和DMSO。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤d中对老鼠进行视网膜电图检查，先将所有老鼠暗适应至少12小时，随后，小鼠的ERG按照以前地描述被记录在RETI port系统上。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤h中末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测(TUNEL)采用原位细胞死亡检测POD试剂盒。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤i中定量实时PCR(qRT)的引物为：
Bax:5'-AGCTCTGAACAGATCATGAAGACA-3'(正向)；
5'-CTCCATGTTGTTGTCCAGTTCATC3'(反向)；
Bcl-2:5'-GGACA ACATCGC TCTGTG GATGA-3'(正向)；
5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3'(反向)；
caspase-3:5'-TGTCGATGCAGCTAACC-3'(正向)；
5'-GGCCTCCACT GGTATCTTCTG-30(反向)；
Calpain-2:5'-CCCCAGTTCATTATTGGA GG-3'(正向)；
5'-GCCAGGATTTCCTCATTCAA-3'(反向)。
作为本发明的一种优选实施方式，所述引物都在遗传ABI分析仪上进行测序来进行质量控制，结果用管家基因β-肌动蛋白进行标准化，反应在一个实时CFX96Touch PCR上用SYBRR绿色主混合物进行，扩增程序包括聚合酶95℃活化5分钟和50个循环的95℃变性1分钟，在95℃退火和延伸30秒，对每个基因进行重复的逆转录-定量聚合酶链反应，以最小化单个试管的可变性，并对每个时间点取平均值，计算阈值循环效率校正，并使用每个单基因聚合酶链反应分析的cDNA获得解链曲线进行统计分析，相对表达水平被标准化和量化以获得△△CT值。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤j中硫代巴比妥酸比色MDA)以nmol/mg蛋白质表示，锰依赖性SOD(Mn-SOD)活性是在制造商的指导下使用市售试剂盒测量的，Mn-SOD的活性用单位毫克蛋白质表示，8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度通过竞争性酶联免疫吸附测定试剂盒在制造商方案的指导下进行定量。8-OHdG浓度以g/mg DNA表示。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过在诱导剂MNU内添加褪黑素，能够直接清除自由基，还能够提高内源性抗氧化酶的产生，而且褪黑素治疗有助于Cu-Zn-SOD和MnSOD的产生，减少了脂质和DNA过氧化标志物MDA和8-OHdG的水平。
2、本发明向玻璃体腔注射褪黑素能够抑制MNU诱导的光感受器凋亡，另外，褪黑素显著减少凋亡因子mRNA的水平，这些结构表明调节凋亡阈值可能对光感受器的生存有益，相应的，褪黑素能够提供突变非依赖的药物，适用于不同病因背景下普遍的RP病人。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明提供一种技术方案：一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，诱导步骤如下：
a.首先选用280只老鼠被用作研究；
b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；
c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；
d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查；
e.待步骤d完成后，再将小鼠被麻醉后转移到超高分辩率仪器的记录平台上，接着将甲基纤维系润滑剂涂抹在小鼠的角膜上，然后将探头放置在角膜的附近，直到视网膜的图像出现在屏幕上，最后用相关盒子对视神经头(ONH)进行定位，分别在距离ONH边缘相同距离的两侧进行8次测量；
f.待步骤e完成后，将视网膜标本置于电极陈列的记录室内，视网膜神经元模拟细胞外反应被Med-64系统记录，电场电位波形用带通滤波器(100-300Hz)处理并求得脉冲值，用环刺激时间直方图(PSTHs)和栅格图将视网膜神经节细胞(RGEs)进行分类，根据PSTHs分析进行ON和OFF反应；
g.待步骤f完成后，再用花生凝集素偶联Alexa Fluor 488，s-视椎视蛋白和m-视椎视蛋白分别用抗体与视网膜切片染色，之后用PBS冲洗，视网膜标本被Cyt3联合抗兔免疫球蛋白G(IgG)和4,6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)共同孵育，再使用Axio Vision软件对ONL周围的四个420*420箱内的锥细胞进行定量；
h.待步骤g完成后，再对老鼠进行末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测，在其过程中外核层(ONL)的凋亡指数(AI)是通过TUNEL阳性核数/光感受器细胞核总数*100计算得到；
i.待步骤h完成后，再将老鼠吓死后将它们的眼睛取出，使用商业试剂提取视网膜切片中的总RNA然后使MACSTMDNA合成盒合成互补DNA，达到定量逆转录聚合酶链反应；
j.待步骤i完成后，再将视网膜组织加入到含有0.5％Triton X100(pH 7.4)的PBS中，然后用研磨机在冰冷的水中匀浆，组织在4℃下以500g离心5分钟，然后测定悬浮液中蛋白质含量，以使酶活性和氧化应激标记物的含量正常化，再根据之前的描述测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的浓度，在其过程中铜锌超氧化物歧化酶活性被超氧化物歧化酶检测试剂盒分析，一个单位的铜锌超氧化物歧化酶活性被定义为在硝基蓝四唑还原率中引起半抑制酶的量，接着使用带有超微量比色皿的分光光度计来测量吸光度值，在550纳米的分光光度计上测量每个样品在超微量试管中的吸光度值，该值表示为U/mg蛋白质；
k.待步骤j完成后，再使用方差分析(ANOVE)对数据进行处理，随后使用Bonferroni的事后分析，所有的数值均以均数+-标准差(SD)表示，P值<0.05被认为具有统计学意义。
进一步，所述步骤a中老鼠均为C57/BL，8-9周大的雌雄鼠，体重范围在18-23g。
进一步，所述步骤b中设备的温度为18-23℃，40-65％的湿度，12小时循环暗/灯照射。
进一步，所述步骤c中普通对照组，老鼠没有任何的药物注射，MNU组：老鼠接受静脉注射MNU(60mg/kg)，MNU+褪黑素组：老鼠接受玻璃体递送褪黑素，MNU+空白组：MNU递送2小时后玻璃体递送2的空白液。
进一步，所述MNU被保存在4℃的暗环境中，使用前将MNU溶解于0.05％乙酸的生理盐水中，MNU诱导的视网膜退化在注射60mg/kg7天内完成，将老鼠分离两小时，然后观察他们是否有不正常的现象，如果MNU给药小鼠没有不良的影响，褪黑素溶液按照描述的方法进行注射，褪黑素首先溶解在5％的二甲基然后在不同浓度进一步稀释磷酸缓冲液，控制组动物接受的空白注射与褪黑素治疗组保持相同剂量的PBS和DMSO。
进一步，所述步骤d中对老鼠进行视网膜电图检查，先将所有老鼠暗适应至少12小时，随后，小鼠的ERG按照以前地描述被记录在RETI port系统上。
进一步，所述步骤h中末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测(TUNEL)采用原位细胞死亡检测POD试剂盒。
进一步，所述步骤i中定量实时PCR(qRT)的引物为：
Bax:5'-AGCTCTGAACAGATCATGAAGACA-3'(正向)；
5'-CTCCATGTTGTTGTCCAGTTCATC3'(反向)；
Bcl-2:5'-GGACA ACATCGC TCTGTG GATGA-3'(正向)；
5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3'(反向)；
caspase-3:5'-TGTCGATGCAGCTAACC-3'(正向)；
5'-GGCCTCCACT GGTATCTTCTG-30(反向)；
Calpain-2:5'-CCCCAGTTCATTATTGGA GG-3'(正向)；
5'-GCCAGGATTTCCTCATTCAA-3'(反向)。
进一步，所述引物都在遗传ABI分析仪上进行测序来进行质量控制，结果用管家基因β-肌动蛋白进行标准化，反应在一个实时CFX96Touch PCR上用SYBRR绿色主混合物进行，扩增程序包括聚合酶95℃活化5分钟和50个循环的95℃变性1分钟，在95℃退火和延伸30秒，对每个基因进行重复的逆转录-定量聚合酶链反应，以最小化单个试管的可变性，并对每个时间点取平均值，计算阈值循环效率校正，并使用每个单基因聚合酶链反应分析的cDNA获得解链曲线进行统计分析，相对表达水平被标准化和量化以获得△△CT值。
进一步，所述步骤j中硫代巴比妥酸比色MDA)以nmol/mg蛋白质表示，锰依赖性SOD(Mn-SOD)活性是在制造商的指导下使用市售试剂盒测量的，Mn-SOD的活性用单位毫克蛋白质表示，8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度通过竞争性酶联免疫吸附测定试剂盒在制造商方案的指导下进行定量。8-OHdG浓度以g/mg DNA表示。
实施例一
褪黑素对光感受器生存的影响
OCT检测表明MNU组视网膜结构受到严重的损伤。在MNU+vehicle组视网膜厚度于MNU组相比显著不同，这说明玻璃体腔注射的外科手术不能影响MNU诱导的视网膜退行性变的结果。与MUN组相比MNU+褪黑素组视网膜结构相对完整。且MNU+褪黑素组视网膜厚度显著比MNU组厚。在MNU组组织切片中没有检测到外核层(ONL)，然而在MNU+褪黑素组外核层中细胞核的几个层都保留下来。MNU+褪黑素组外核层的平均厚度比MNU组厚。大量的TUNEL阳性细胞在MNU组的外核层发现。相反，很少的TUNEL阳性细胞在MNU+褪黑素组发现。在MNU+褪黑素组凋亡指数显著比MNU组小。而且，剂量-效应分析显示，150μg/kg剂量的小鼠中视网膜厚度和外核层厚度比50μg/kg和100μg/kg剂量的小鼠都要厚。在另一方面，150μg/kg剂量凋亡指数比50μg/kg和100μg/kg剂量的凋亡指数显著小很多。这些形态学的指标在150μg/kg剂量与200μg/kg剂量和250μg/kg剂量的实验组中没有明显的不同。
实施例二
褪黑素对视功能的保护作用
典型的视网膜电图反应在正常的对照组中产生。根据先前的研究视网膜点图在MNU组中无法检测到。在MNU+褪黑素组b波的振幅显著的比MNU组大。暗视力和明视力的b波振幅分别是正常对照组振幅的56.1％和62.7％。这些数据表明褪黑素对MNU给药的小鼠的视功能有显著的保护作用。剂量-效应分析显示在150μg/kg剂量下b波的振幅比50μg/kg和100μg/kg剂量时大。b波的振幅在150μg/kg剂量时与200μg/kg剂量和250μg/kg剂量没有显著的不同。在视动测试中MNU组小鼠对光栅的刺激不敏感。在MNU+vehicle组视觉敏感度与MNU组完全相同。在MNU组的视觉敏感度比MNU+褪黑素组显著要小。然而MNU+褪黑素组对比敏感度比MNU组显著要大。剂量-效应分析显示在150μg/kg剂量下小鼠的视觉敏感度和对比敏感度比50μg/kg剂量和100μg/kg剂量组都要大。然而，在150μg/kg剂量的小鼠的功能指标与200μg/kg剂量和250μg/kg剂量显著不同。
实施例三
褪黑素对锥体光感受器生存的保护效应
强烈的花生凝集素荧光在正常对照组的内节发现。花生凝集素荧光在MNU组视网膜切片的十分不清晰。相反，花生凝集素荧光在MNU+褪黑素组内节发现。MNU+褪黑素组视网膜全切片显示花生凝集素荧光很好的被保存。MNU+褪黑素组花生凝集素阳性细胞的数量平均723±58，MNU组为15±10。这些结果表明褪黑素治疗能够显著改善视锥细胞光感受器的生存。在MNU+褪黑素组的视网膜全切片中，DT象限中花生凝集素阳性细胞的数量最多，表明视锥细胞光感受器在这个区域被褪黑素挽救。然而，M-opsin或S-opsin染色在MNU组视网膜切片中不能检测到。相反，视锥细胞着色在MNU+褪黑素组视网膜中显著的保存。M-opsin和S-opsin阳性细胞的平均数量在MNU+褪黑素组中比MNU组显著多。M-opsin和S-opsin阳性细胞的平均数量在MNU+褪黑素组中分别时正常细胞数量的48.6％和44.8％。
实施例四
褪黑素在视觉信号转导中的保护效应
多电极阵列分为3类，中央区、中间外围区、外围区电极通道。在MNU组检测不到场电位波幅。相反，在MNU+褪黑素组褪黑素治疗保存了场电位波幅。在MNU+褪黑素组平均场电位波幅大于MNU组。在MNU+褪黑素组外围区域场电位振幅比在中间外围区和中央区都要大。剂量－效应分析显示在150μg/kg剂量的小鼠组中场电位振幅比在50μg/kg和100μg/kg组中场电位振幅要大。而且，在150μg/kg剂量的小鼠组中场电位振幅与在200μg/kg和250μg/kg组中场电位振幅没有显著区别。在MNU组中自发放电率显著大于正常对照组。在变性的视网膜中用褪黑素治疗显著减少了自发放电率。另外，根据对光诱导的反应对RGGs进行分类。在MNU+褪黑素组光诱导的总放电率大于MNU组。MNU+褪黑素组ON和OFF反应强度比MNU组大。尤其是OFF反应比ON反应更有效的保存。ON反应的强度是正常对照组的38.1％，而OFF反应强度是正常对照组的69.9％。剂量－效应分析显示与50μg/kg和100μg/kg剂量组相比150μg/kg剂量组中小鼠的自发放电率小，光诱导的放电率大。在150μg/kg组ON和OFF反应的放电率比50μg/kg和100μg/kg组大。这些指标在150μg/kg与200μg/kg和250μg/kg组没有显著区别。
实施例五
褪黑素诱导的保护效应的作用机制
在MNU+褪黑素组中caspase-3、calpain-2、Bax的mRNA水平比MNU组低。另一方面，MNU+褪黑素组中Bcl-2的mRNA水平比MNU组大。这些结果表明至少有一部分抗凋亡机制是由褪黑素介导的保护作用。在MNU+褪黑素组视网膜中MDA(脂质过氧化物的稳定代谢物)是1.89±0.303nmol/mg，在MNU组是4.88±0.521nmol/mg。MNU+褪黑素组视网膜8-OHdG(DNA氧化损伤的指示物)是89.71±8.40μg/mg，在MNU组是140.60±11.37μg/mg。这些结果表明褪黑素能够缓解视网膜退变的氧化应激。线粒体损伤能够导致内部膜空间蛋白的释放和线粒体依赖的凋亡途径的激活。视网膜中一种具有氧自由基清除潜能的线粒体蛋白－MnSOD的水平，在MNU+褪黑素组中是33.84±5.37U/mg，在MNU组中是18.55±4.29U/mg，这表明褪黑素治疗对线粒体中光感受器具有保护作用。MNU+褪黑素组中视网膜SOD水平是160.455±21.802U/mg，在MNU组是71.831±15.270U/mg。这些结果证明MNU给药的小鼠中在褪黑素治疗能够提高内源性抗氧化酶的活性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：诱导步骤如下：
a.首先选用280只老鼠被用作研究；
b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；
c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；
d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查；
e.待步骤d完成后，再将小鼠被麻醉后转移到超高分辩率仪器的记录平台上，接着将甲基纤维系润滑剂涂抹在小鼠的角膜上，然后将探头放置在角膜的附近，直到视网膜的图像出现在屏幕上，最后用相关盒子对视神经头(ONH)进行定位，分别在距离ONH边缘相同距离的两侧进行8次测量；
f.待步骤e完成后，将视网膜标本置于电极陈列的记录室内，视网膜神经元模拟细胞外反应被Med-64系统记录，电场电位波形用带通滤波器(100-300Hz)处理并求得脉冲值，用环刺激时间直方图(PSTHs)和栅格图将视网膜神经节细胞(RGEs)进行分类，根据PSTHs分析进行ON和OFF反应；
g.待步骤f完成后，再用花生凝集素偶联Alexa Fluor 488，s-视椎视蛋白和m-视椎视蛋白分别用抗体与视网膜切片染色，之后用PBS冲洗，视网膜标本被Cyt3联合抗兔免疫球蛋白G(IgG)和4,6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)共同孵育，再使用Axio Vision软件对ONL周围的四个420*420箱内的锥细胞进行定量；
h.待步骤g完成后，再对老鼠进行末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测，在其过程中外核层(ONL)的凋亡指数(AI)是通过TUNEL阳性核数/光感受器细胞核总数*100计算得到；
i.待步骤h完成后，再将老鼠吓死后将它们的眼睛取出，使用商业试剂提取视网膜切片中的总RNA然后使MACSTMDNA合成盒合成互补DNA，达到定量逆转录聚合酶链反应；
j.待步骤i完成后，再将视网膜组织加入到含有0.5％Triton X100(pH 7.4)的PBS中，然后用研磨机在冰冷的水中匀浆，组织在4℃下以500g离心5分钟，然后测定悬浮液中蛋白质含量，以使酶活性和氧化应激标记物的含量正常化，再根据之前的描述测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的浓度，在其过程中铜锌超氧化物歧化酶活性被超氧化物歧化酶检测试剂盒分析，一个单位的铜锌超氧化物歧化酶活性被定义为在硝基蓝四唑还原率中引起半抑制酶的量，接着使用带有超微量比色皿的分光光度计来测量吸光度值，在550纳米的分光光度计上测量每个样品在超微量试管中的吸光度值，该值表示为U/mg蛋白质；
k.待步骤j完成后，再使用方差分析(ANOVE)对数据进行处理，随后使用Bonferroni的事后分析，所有的数值均以均数+-标准差(SD)表示，P值<0.05被认为具有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤a中老鼠均为C57/BL，8-9周大的雌雄鼠，体重范围在18-23g。
3.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤b中设备的温度为18-23℃，40-65％的湿度，12小时循环暗/灯照射。
4.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤c中普通对照组，老鼠没有任何的药物注射，MNU组：老鼠接受静脉注射MNU(60mg/kg)，MNU+褪黑素组：老鼠接受玻璃体递送褪黑素，MNU+空白组：MNU递送2小时后玻璃体递送2的空白液。
5.根据权利要求4所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述MNU被保存在4℃的暗环境中，使用前将MNU溶解于0.05％乙酸的生理盐水中，MNU诱导的视网膜退化在注射60mg/kg7天内完成，将老鼠分离两小时，然后观察他们是否有不正常的现象，如果MNU给药小鼠没有不良的影响，褪黑素溶液按照描述的方法进行注射，褪黑素首先溶解在5％的二甲基然后在不同浓度进一步稀释磷酸缓冲液，控制组动物接受的空白注射与褪黑素治疗组保持相同剂量的PBS和DMSO。
6.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤d中对老鼠进行视网膜电图检查，先将所有老鼠暗适应至少12小时，随后，小鼠的ERG按照以前地描述被记录在RETI port系统上。
7.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤h中末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测(TUNEL)采用原位细胞死亡检测POD试剂盒。
8.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤i中定量实时PCR(qRT)的引物为：
Bax:5'-AGCTCTGAACAGATCATGAAGACA-3'(正向)；
5'-CTCCATGTTGTTGTCCAGTTCATC3'(反向)；
Bcl-2:5'-GGACA ACATCGC TCTGTG GATGA-3'(正向)；
5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3'(反向)；
caspase-3:5'-TGTCGATGCAGCTAACC-3'(正向)；
5'-GGCCTCCACT GGTATCTTCTG-30(反向)；
Calpain-2:5'-CCCCAGTTCATTATTGGA GG-3'(正向)；
5'-GCCAGGATTTCCTCATTCAA-3'(反向)。
9.根据权利要求8所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述引物都在遗传ABI分析仪上进行测序来进行质量控制，结果用管家基因β-肌动蛋白进行标准化，反应在一个实时CFX96Touch PCR上用SYBRR绿色主混合物进行，扩增程序包括聚合酶95℃活化5分钟和50个循环的95℃变性1分钟，在95℃退火和延伸30秒，对每个基因进行重复的逆转录-定量聚合酶链反应，以最小化单个试管的可变性，并对每个时间点取平均值，计算阈值循环效率校正，并使用每个单基因聚合酶链反应分析的cDNA获得解链曲线进行统计分析，相对表达水平被标准化和量化以获得△△CT值。
10.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤j中硫代巴比妥酸比色MDA)以nmol/mg蛋白质表示，锰依赖性SOD(Mn-SOD)活性是在制造商的指导下使用市售试剂盒测量的，Mn-SOD的活性用单位毫克蛋白质表示，8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度通过竞争性酶联免疫吸附测定试剂盒在制造商方案的指导下进行定量。8-OHdG浓度以g/mg DNA表示。
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