TWI691508B

TWI691508B - 用於提供眼部神經保護或用於預防、治療與視網膜神經節細胞死亡相關的眼部疾病或減輕其影響的方法

Info

Publication number: TWI691508B
Application number: TW107122548A
Authority: TW
Inventors: 黃舜平; 蔡榮坤
Original assignee: 慈濟學校財團法人慈濟大學
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-04-21
Also published as: TW202000698A

Abstract

本發明係關於一種在有需要的對象中用於提供眼部神經保護或用於預防、治療與視網膜神經節細胞死亡相關的眼部疾病或減輕其影響的方法，包含向該對象投予有效量的重組P-選擇素免疫球蛋白G(P-sel-IgG)嵌合融合蛋白、或包含該蛋白及藥學上可接受的佐劑、媒液、或載體的組合物。

Description

用於提供眼部神經保護或用於預防、治療與視網膜神經節細胞死亡相關的眼部疾病或減輕其影響的方法

導致嚴重視力喪失的視網膜缺血是許多眼部疾病中的常見病理，包括缺血性視神經病變、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、視網膜動脈阻塞、脈絡膜血管新生(choroidal neovascularization,CNV)及青光眼。視網膜缺血會使得氧氣減少，以及代謝物和廢物的清除減少。視網膜(中樞神經系統(CNS)的延伸)的損傷是不可逆的，並且依據疾病類型及狀態可導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell,RGC)、無軸突細胞、及雙極細胞的死亡。視網膜缺血誘導的視神經盤隱結(optic disc drusen)(擁擠的視神經)、視網膜脈管系統(retinal vasculature)受損、出血(hemorhage)、血管新生(neovascularization)、及視網膜剝離會導致視力喪失。視網膜缺血性疾病的病理生理學方面在此前已被研究並假設了各種機制。可能導致細胞死亡的疾病機制為視網膜中的氧化壓力、視神經中促炎因子(pro-inflammatory factor)的表現、鈣離子穩態的破壞、及巨噬細胞極化。考量這些機制，一些使用抗發炎化合物、神經營養因子(neurotropic factor)、氧化壓力調節劑、鈣離子通道阻斷劑及微膠質細胞活化抑制劑或血源性(blood-borne)巨噬細胞浸潤阻斷劑的策略可減少組織的損傷。由於大鼠前部缺血性視神經病變(rAION)與人類和靈長類動物的AION具有相似的特徵及病理，因此rAION模型是研究RGC病理及缺血性損傷的極好模型。

由光動力療法完成的rAION模型將產生在視神經(ON)微血管內循環的超氧自由基，其會導致視神經梗塞及局部缺血。rAION中活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)產生的發炎及氧化壓力會導致RGC死亡。因此，減少這種發炎反應及氧化壓力可防止RGC凋亡。

P-選擇素(CD62)是選擇素家族的成員，僅存在於血小板的α-顆粒及內皮細胞的Weibel-Palade小體中。在內皮細胞或血小板活化後，P-選擇素會易位至表面以募集白血球。P-選擇素與PSGL-1(P-選擇素糖蛋白配體-1)的交互作用會支持白血球滾動並使黏附牢固，導致周圍組織中的穿移(transmigration)，從而引發發炎反應級聯(cascade)。可溶的外源性P-選擇素重組形式可在血友病小鼠模型中恢復止血、挽救蛇毒引起的的死亡、從缺血性再灌注損傷中挽救肝臟內皮細胞並改善發炎。所有這些發現都基於一個共同的原則，即可溶的外源性P-選擇素重組形式與內源性膜結合的P-選擇素分子會競爭與PSGL-1(一種眾所周知的P-選擇素配體)的結合。儘管在rAION中存在類似的病理生理學，包括缺血、光血栓(photothrombosis)、及發炎，可溶的P-選擇素在缺血性損傷中的治療潛力仍有待進一步研究。此外，停止該發炎過程係潛在的治療標的，但世人對rAION中的抗氧化路徑仍知之甚少。由ROS的產生所引起的氧化壓力會透過核因子類紅血球2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)-抗氧化反應元素(antioxidant response element,ARE)信號軸觸發壓力反應，其會清除ROS並維持氧化還原狀態。據認為Nrf2僅限於氧化還原的控制，而該抗發炎效果係Nrf2消除ROS的結果。然而，Nrf2藉由以ARE依賴性方式與這些基因緊密結合來抑制促炎細胞介素的轉錄。因此，rAION中作為發炎對應物(inflammatory counterpart)的抗氧化劑路徑仍有待進一步研究。

本發明證實了重組P-選擇素免疫球蛋白G(P-sel-IgG)嵌合融合蛋白在大鼠前部缺血性視神經病變(rAION)模型中的神經保護作用。在P-sel-IgG會與PSGL-1結合的假設下，本研究亦檢測在缺血性損傷後P-sel-IgG影響視覺功能、RGC存活、血-視神經屏障(blood-optic nerve barrier,BONB)及白血球募集的機制。藉由光動力療法誘導rAION。在rAION的急性期，P-sel-IgG治療會減少視神經水腫並穩定血-視神經屏障(BONB)。此外，P-sel-IgG在慢性期(第28天)增加了視網膜神經節細胞(RGC)存活率、減少RGC凋亡、保持視覺功能、維持視網膜神經纖維層厚度、並減少視神經組織中的巨噬細胞浸潤。NAD(P)H醌去氫酶1(NQO1)和血紅素加氧酶1(HO-1)表現水平增加，同時轉錄因子Nrf2也增加，表示P-sel-IgG透過Nrf2信號傳導路徑發揮抗氧化作用。總而言之，本研究首次證明了在rAION模型中P-sel-IgG治療藉由穩定BONB並活化Nrf2信號傳導路徑來促進RGC存活。P-sel-IgG將是治療缺血性ON及視網膜血管疾病的潛在治療應用。由於ON是CNS的一部分，且AION病理學類似於CNS中的其他類型中風，因此P-sel-IgG治療對於治療其他類型的CNS中風或白質缺血也可能是有效的。

因此，本發明提供一種在有需要的對象中用於提供眼部神經保護或用於預防、治療與視網膜神經節細胞死亡相關的眼部疾病或減輕其影響的方法，包含向該對象投予有效量的重組P-選擇素免疫球蛋白G(P-sel-IgG)嵌合融合蛋白、或包含該蛋白及藥學上可接受的佐劑、媒液、或載體的組合物。在一實施例中，該眼部疾病包含視野缺損(visual field loss)。在一實施例中，該眼部疾病包含神經退化(neurodegeneration)、眼內壓升高、缺血事件或視神經損傷。在一實施例中，該眼部疾病包含視網膜損傷或視神經損傷，其中該視網膜損傷或視神經損傷包含缺血或缺氧損傷。在一實施例中，該眼部疾病係選自由青光眼、糖尿病視網膜病變(DR)、糖尿病黃斑部水腫(diabetic macular edema,DME)、老年性黃斑部病變(age related macular degeneration,AMD)、雷伯氏遺傳性視神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy,LHON)、雷伯氏視神經萎縮(Leber optic atrophy)、視神經炎、視網膜動脈阻塞、中心性視網膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、分枝性視網膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、缺血性視神經病變、視神經損傷、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)或色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa,RP)、視網膜神經節退化、黃斑部退化、遺傳性視神經病變、代謝性視神經病變、由毒性劑引起的視神經病變、由不良藥物反應或維生素缺乏所引起的神經病變、及與腫瘤有關的視力喪失所組成之群組。在一實施例中，該眼部疾病係缺血性視神經病變。在一實施例中，該缺血性視神經病變係前部缺血性視神經病變(AION)。在一實施例中，該眼部神經保護包含視神經的神經保護。

在上述方法中，該蛋白或包含該蛋白的組合物係以乳膏劑、泡沫劑、糊劑、軟膏劑、乳劑、液體溶液劑、點眼劑、凝膠劑、噴霧劑、懸液劑、微乳劑、微球體(microsphere)、微膠囊、奈米球體、奈米粒子、脂質囊泡(lipid vesicle)、微脂體、聚合物囊泡、貼劑、或隱形眼鏡的形式投予。在一實施例中，該蛋白或包含該蛋白的組合物係以液體溶液劑的形式投予，該液體溶液劑係藉由玻璃體內注射(intravitreal injection)來投予。

在上述方法中，該蛋白包含P-選擇素的C-型凝集素結構域及類EGF結構域，其以二硫鍵連接的同型二聚體形式與人類IgG₁的Fc區融合。

圖1：閃光視覺誘發電位(FVEP)。(a)每組中rAION後的代表性FVEP圖(方框表示P1-N2振幅)。(b)顯示P1-N2幅度的振幅圖。4μg P-sel及2μg P-sel處理組的振幅顯著高於PBS處理組的振幅(分別為25.16571±7.931084μV及16.296±5.484773μV)。數據係以平均值±S.D.表示；*P

0.05，**P

0.01；n=6。

圖2：視網膜平片(flat mount)製備及RGC形態測定。(a，b)每組中rAION後RGC密度的代表性圖像。4μg P-sel處理組顯示出比PBS處理組顯著更高的RGC密度，在(c)中央視網膜分別為1009±177/mm²對612±31/mm²，以及在(d)中周邊(mid-peripheral)視網膜分別為614±99/mm²對323±92/mm²。2μg P-sel處理組也顯示出比PBS處理組顯著更高的RGC密度，在中周邊視網膜(d)分別為544±66/mm²對323±92/mm²。**P

0.01，***P

0.001；n=6。

圖3：視網膜的TUNEL測定。(a)每組中rAION後TUNEL染色的視網膜橫切面的代表性圖像。(b)在中央視網膜中4μg P-sel處理組顯示出比PBS處理組顯著更少的TUNEL+細胞(分別為13.30±6.290717706對24.5±8.06)。GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；*P

0.05，***P

0.001；n=6。

圖4：視神經(ON)的ED1免疫染色。(a)各組中rAION後ON橫切面中ED1免疫染色的代表性圖像。(b)4μg P-sel處理組及2μg P-sel處理組顯示出比PBS處理組顯著更少的ED1+細胞(分別為16.53±10.26及20.2±10.29對36.5±11.3)。**P

0.01，***P

0.001；n=6。

圖5：視網膜神經纖維層(RNFL)及視神經寬度(ONW)的光學同調斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)圖。(a)穿過視神經頭的線性掃描。(b-d)在第3天假手術(sham)組、rAION組及4μg P-sel處理組的代表性ONW圖。(e)隨時間變化的ONW厚度曲線圖。與PBS處理組相比，4μg P-sel處理組顯示出顯著的水腫減少(分別為385.25±48μm對325.5±37.3μm)。(f)在視神經頭周圍循環掃描。(g-i)在第28天假手術(sham)組、rAION組及4μg P-sel處理組的代表性RNFL厚度測量值(黑線表示RNFL)。(j-1)在第28天假手術(sham)組、rAION組及4μg P-sel處理組的代表性ONW曲線圖。(m)隨時間變化的RNFL厚度曲線圖(曲線下面積)。與PBS處理組相比，4μg P-sel處理組在第28天表現出顯著的RNFL保護(分別為0.5±0.15mm²對0.68±0.17mm²)。RNFL：視網膜神經纖維層；GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；*P

0.05；n=6。

圖6：視神經橫切面的穿透式電子顯微術(TEM)影像。(a)神經血管單位及其主要組成物的圖示(紅血球：RBC；基底層：BL；神經元：N；星狀細胞終足(astrocyte end feet)：AE；內皮細胞：EC；外被細胞(pericyte)：P)。(b)假手術(sham)組微血管的橫切面影像。神經血管單位的完整超微結構，其中的組分係可區分的；(n=1)。(c)顯示顯著的緊密連接(tight junction)(黑色箭頭)的插圖。(d，h)在PBS處理組的第1天及第7天，血-視神經屏障(BONB)崩潰，所有組分缺失並且(e，i)BONB中有嚴重的空泡形成；(n=2)。(f，j)在4μg P-sel處理組的第1天及第3天經保護的BONB，其中可見到緊密連接(插圖(g，k)，黑色箭頭)；(n=2)。(l)在PBS處理組的第7天BONB復原。(m)顯示緊密連接的插圖；(n=1)。(n)在4μg P-sel處理組第7天的BONB。(o)顯示緊密連接的插圖。

圖7：視網膜的免疫印跡(immunoblot)。(a)Nrf2、NQO1、及GAPDH的代表性經裁剪的印跡影像(內部裝載對照)。(b，c，d)顯示Nrf2、HO-1及Nqol相對密度的長條圖，其以假手術組視網膜作為參考值。*P

0.05，**P

0.01，***P

0.001；n=3。

圖8：本研究的總結(d)及P-選擇素-IgG在rAION模型中的神經保護作用的可能模型。rAION誘導後以P-sel-IgG處理(a)可使Psgl-1飽和(b，插圖c)並停止視神經組織中的巨噬細胞浸潤。

下面的實例係非限制性的，並且僅作為本發明之各種態樣及特徵的代表。

實例1： 材料及方法

表1列出了本研究中使用的資源清單。

動物：將重量為150至180克(7至8週)的61隻遠交系成年Wistar大鼠保持在過濾器位於頂部的固定籠子中。在溫度為23℃和55%濕度的環境控制室中，大鼠可以自由獲取食物和水，其中的明暗週期為12小時(光照時間為上午7點至下午7點)。動物護理及實驗程序係根據用於在眼科和視力研究中使用動物的ARVO聲明進行，且慈濟大學實驗動物中心的實驗動物照護及使用委員會(IACUC)批准了所有的動物實驗。肌內注射氯胺酮(100mg/kg)及甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合物以進行全身麻醉。愛爾卡因(Alcaine)用於局部麻醉，並且在所有實驗中使用Mvdrin-P進行瞳孔擴張。研究設計細節見表2。

AION誘導：將愛爾卡因(Alcaine)及Mydrin-P點眼劑分別用於局部麻醉及瞳孔擴張。全身麻醉後，靜脈內投予於PBS中的2.5mM孟加拉玫紅(rose bengal)(1ml/kg動物體重)。在注射孟加拉玫紅後，立即將視神經盤暴露於綠氬氣雷射(argon green laser)(532nm波長，500mm大小及80mW功率)下進行12次1秒脈衝。使用眼底鏡片(fundus lens)將該雷射聚焦於該視神經盤上。在該程序後施用Tobradex眼藥膏，並監測大鼠直至觀察到完全恢復。

P-sel-IgG給藥及配方：我們使用重組小鼠P-選擇素-Fc嵌合蛋白(P-sel-IgG)，其包含P-選擇素的C-型凝集素結構域及類EGF結構域，其以二硫鍵連接的同型二聚體形式與人類IgG₁的Fc區融合。簡而言之，在200μl PBS：甘油(8：2)溶液中重構200μg P-sel-IgG以達到1μg/μl濃度。藉由玻璃體內注射(IVI)以4μl總體積的PBS、4μg P-sel-IgG(4μg P-sel)、或2μg P-sel-IgG(2μg P-sel)處理動物。

閃光視覺誘發電位記錄：全身麻醉後，打開顱骨的矢狀區域。使用立體定位坐標將螺釘植入物固定在兩個半球的初級視覺皮質區域(AP：前-後；ML：內側-外側；DV：背-腹；AP：-8mm；及ML：-3.0mm)；將一個電極固定在額葉皮質(AP：3mm)。使用視覺電診斷系統測量FVEP。該系統內建有測量FVEP的程式。位於初級視覺皮質的電極被認為是活性(正)電極，位於額葉皮質的電極被認為是參考(負)電極，並將接地電極放在老鼠的尾巴上。使用的設定如下：無背景照明，閃光強度為30cd.s/m²，及閃光速率為1.02Hz的單次閃光。平均收集64次掃描(sweep)並保存原始數據以用於進一步分析。測量P1-N2振幅以檢查視覺功能。

藉由氟金逆行標記RGC並測量RGC密度：如先前報導中所述，以逆行方式標記RGC(Huang TL,Huang SP,Chang CH,Lin KH,Sheu MM,Tsai RK.Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.Ophthal res 2014；51：173-178)。簡言之，在犧牲大鼠前1週進行逆行標記。打開顱骨的矢狀區域，並將2μl氟金注射進上丘(AP：-6mm；ML：-1.5mm；及DV 4mm)。在另一個半球上進行相同的程序。標記一周後，殺死該些大鼠，收集眼球並用10%福馬林固定。將視網膜小心地平放封片。在具有×100功率、內建的濾光片組(激發濾光片：350-400nm；屏障濾光片：515nm)、及連接的數位成像系統的螢光顯微鏡下檢查該視網膜。檢查距離中心1mm至3mm的視網膜以計算中心和外周的RGC密度。在中心及中周邊區域分別掃描至少10個隨機區域；保存這些細胞的圖像以用於密度計算。藉由ImageMaster 2D Platinum軟體計算RGC密度。藉由計算處理組(treatment group)與假手術組(sham-operated group)的比率並將該比率乘以100來測定RGC存活率。

視網膜及視神經的樣本製備：殺死該些大鼠，將其眼睛摘出並用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。將該些眼球與視神經分離並各自轉移至30%蔗糖中；將樣本儲存在4℃直至它們沉澱至管子底部。使用低溫恆溫器(cryostat)獲得20μm的視網膜及視神經橫切面。

視神經組織的ED-1免疫組織化學(IHC)：抗ED-1對外源性巨噬細胞具有特異性。在室溫下用5% FBS阻斷視神經橫切面1小時。用稀釋於抗體稀釋緩衝液(2% BSA、1×PBS(pH 7.2)、及0.3% Triton X-100；1：200)的ED1一級抗體在4℃下標記該組織整夜。將山羊抗小鼠Alexa 488(0.3% Triton X-100及1×PBS(pH 7.2)；1：500)加至該組織，將其在室溫下培養1小時並用DAPI(0.3% Triton X-100及1×PBS(pH 7.2)；1：500)複染。使用適當的濾光片組在螢光顯微鏡中以×100放大率進行圖像採集。手動執行ED-1⁺細胞計數或由ImageMaster 2 Platinum軟體進行。

TUNEL分析：使用TUNEL來檢測神經節細胞層(GCL)中的凋亡細胞。根據製造商的方案(DeadEnd Fluorometric TUNEL System；Promega Corporation,Madison,WI,USA)進行TUNEL分析。手動計算GCL中的TUNEL⁺細胞。

圖像引導的OCT成像：使用具有圖像引導OCT的Phoenix Micron IV視網膜顯微鏡進行成像。此系統使用譜域OCT，其提供了1.8μm的縱向解析度及3μm的橫向解析度，在視網膜上具有3.2mm的視野及1.2mm的成像深度。在全身麻醉後，將大鼠放置在成像平台上，並將頭部定位成一角度以允許光從顳側垂直穿透角膜。在視盤周圍循環掃描以得到視網膜神經纖維層(RNFL)，並藉由穿過該視盤中心的線性掃描來掃描布魯赫膜開口(ONW)。每隻眼睛至少獲得三次清晰的擷取。藉由內建的「Insight」軟體進行布魯赫膜開口及RNFL厚度的定量測量。此軟體生成一不同層的分段及所欲分段層的厚度圖像。藉由使用GraphPad Prism計算RNFL厚度圖像的曲線下面積來測量平均RNFL厚度。上述程序係在rAION之前(第0天)以及rAION之後第1天、第3天、第7天、第14天、及第28天進行。

視神經的穿透電子顯微術：在不同時間點(第1天、第3天、及第7天)殺死大鼠並從距離視神經頭部1mm處切出視神經組織(1至2mm³)。將該組織在2.5%戊二醛/0.1M二甲胂酸鹽緩衝液+1%單寧酸中預先固定。然後將該組織用1%四氧化鋨/0.1M二甲胂酸鹽緩衝液後固定。後固定之後，用2%乙酸鈾醯對該組織進行全體染色。然後將該組織包埋在Spurr氏樹脂中，用超薄切片機獲得80nm厚的橫切面並藉由TEM觀察。在所欲放大率下，每個樣本平均拍攝4至5個微血管的顯微照片。

西方印漬術(western blotting)：殺死大鼠並摘除牠們的眼睛。將視網膜均質化並儲存在-80℃以用於進一步分析。使用BCA蛋白質分析套組進行蛋白質分析。關於免疫印漬術(immunoblotting)，在10%雙丙烯醯胺凝膠上分離30μg蛋白質。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上。轉移後，將該膜用5%脫脂奶粉阻斷1小時，然後與Nrf2(1：250；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、Nqo1(1：500；Santa Cruz)、Ho1(1：1000；Abcam,Cambridge,MA,USA)、或GAPDH(1：2000；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)一級抗體在4℃一起培養整夜。洗滌該膜，然後與針對適當宿主物種的結合有HRP的二級抗體在室溫下培養1小時。然後使用增強的化學發光受質顯影該膜，並在西方印漬分析儀中拍攝圖像。使用ImageJ軟體計算相對密度。

統計分析：使用GraphPad Prism進行所有的統計分析。數據表示為平均值±S.D.。Mann-Whitney U檢定係用於組間比較。小於0.05的P值被認為是統計上顯著的，*代表P

0.05、**P

0.01、及***P

0.001。

結果

P-sel-IgG處理保留了視覺功能：在梗塞後第28天測量閃光視覺誘發電位(FVEP)。假手術組、PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組的P1-N2振幅分別為47.00±10.15、16.29±5.5、25.16±7.9、及27.02±3.4μV。在該兩個P-sel處理組中的P1-N2振幅顯著保留(圖1；2μg P-sel，P=0.05；4μg P-sel，P=0.008)。這些數據表明P-sel-IgG可以在rAION模型中保留視覺功能。

P-sel-IgG處理提高了RGC存活率：為了驗證FVEP結果，進行RGC的逆行追踪以計算梗塞後第28天的RGC密度。假手術組、PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組在中央視網膜中的RGC密度分別為1841±139、612±31、825±365、及1009±177個細胞/mm²。假手術組、PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組在中周邊視網膜中的RGC密度分別為1063±92、323±93、544±66、及614±99個細胞/mm²。中央視網膜中RGC的存活率在PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組中分別為33.2%、44.8%、及54.8%。中周邊視網膜中RGC的存活率在PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組中分別為30.5%、51.1%、及57.7%。在中央視網膜(圖2(a和d)：P=0.002)及中周邊視網膜(圖2(b和c)：P=0.006)中，4μg P-sel處理組比起PBS處理組的RGC密度均顯著增加。然而，2μg P-sel處理組的RGC密度僅在中周邊視網膜中有比較顯著的增加(圖2(d)；P=0.009)，這表明了劑量依賴性效應。總之，這些結果驗證了FVEP數據並顯示P-sel-IgG處理以劑量依賴性方式增加RGC的存活率。

P-sel處理拯救RGC免於細胞凋亡：為了確認P-sel-IgG是否可拯救RGC免於細胞凋亡，在視網膜橫切面上進行原位(in situ)TUNEL分析。假手術組、PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組中的TUNEL⁺細胞數分別為3±2、24±8、16±4、及13±6。將4μg P-sel處理組與PBS處理組中的數量進行比較有顯著差異，但PBS處理組與2μg P-sel處理組之間就沒有那麼顯著的差異(圖3(a和b)；P=0.01)，其進一步表明了劑量依賴性效應。此結果顯示P-sel-IgG處理可拯救RGC免於經歷細胞凋亡。

P-sel可防止視神經組織中的血源性(blood-borne)巨噬細胞浸潤：血源性巨噬細胞浸潤到視神經組織被認為是AION後對組織發炎的初級反應。因此，對視神經組織中的ED1進行免疫染色以測定P-sel處理是否可以減少血源性巨噬細胞浸潤。在梗塞後第28天進行ED1免疫染色。假手術組、PBS處理組、2μg P-sel處理組、及4μg P-sel處理組中的ED1陽性細胞數量分別為5±4、36±11、20±10、及16±10。在2μg P-sel處理組及4μg P-sel處理組中ED1陽性細胞顯著減少(圖4(a和b)；2μg P-sel，P=0.008；4μg P-sel，P=0.002)。這些結果顯示出P-sel-IgG處理可減少rAION視神經組織中血源性巨噬細胞的浸潤。

OCT顯示P-sel處理可減輕視神經水腫並保留視網膜神經纖維層(RNFL)厚度：在先前的報告中，顯示rAION的急性期包含視神經組織的發炎，其可能由大量的巨噬細胞浸潤所引起(Wen YT,Huang TL,Huang SP,Chang CH,Tsai RK.Early applications of granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)can stabilize the blood-optic-nerve barrier and ameliorate inflammation in a rat model of anterior ischemic optic neuropathy(rAION).Dis Model Mech 2016；9：1193-1202)，其可能會導致急性期的視神經水腫。在先前的實驗中，4μg P-sel處理組顯示出更好的結果，因此被選擇用於進一步的實驗。在AION誘導後立即出現視神經水腫；在第1天觀察到嚴重水腫並在第7天完全恢復(圖5(e)，表3)。

我們認為P-sel-IgG可以在rAION過程中更早地減少視神經水腫。譜域OCT係用於監測視神經寬度(ONW)隨時間的變化。與PBS處理組中的水腫相比，在4μg P-sel處理組中第3天的視神經水腫顯著減少(圖5(b至e)；P=0.041)。此外，隨著時間的推移監測RNFL厚度。可觀察到RNFL厚度由於視神經水腫的關係而增加直至第3天(圖5(m)，表4)。

表4 RNFL厚度的時間進程數據。數據表示為平均值±SD；單位mm ² ；n=6(參見圖5)

慢性期(第14天及第28天)的RNFL厚度表明，在所有具有rAION的組中，由於視神經水腫引起的厚度變化在第7天減少非常多。因此，視神經水腫完全恢復後RNFL厚度的任何變化完全是由於4μg P-sel或PBS處理的結果。在4μg P-sel處理組中，視神經水腫沒有顯著減少。然而，在第28天，與PBS處理組中的RNFL厚度相比，在4μg P-sel處理組中的RNFL厚度顯著被保留(圖5(i，l，m)；P=0.017)。總之，這些數據表明P-sel-IgG可以減輕急性期的水腫並保持慢性期的RNFL厚度。

P-sel-IgG處理穩定了在rAION急性期的血-視神經屏障(BONB)：rAION引起內皮細胞損傷並增加血管通透性。因此，我們決定進行穿透式電子顯微術(TEM)來研究視神經組織的變化。根據OCT結果(圖5(e))，我們將研究限於急性期(直至第7天)的超微結構變化。使用假手術組的視神經來比較視神經超微結構。在假手術組的視神經中，所有微血管的超微結構都清晰可見(圖6(b和c))。視神經中這些微血管的作用為BONB。TEM顯示在第1天PBS處理組的視神經中存在嚴重的超微結構缺陷。基底層完全破裂，且BONB的關鍵組分缺失(圖6(d))。大多數微血管單位完全受損，但有些表現出緊密的基底層，伴有嚴重的空泡形成、內皮細胞損傷(圖6(e))、及緊密連接(tight junction)缺失。在第3天觀察到類似的發現(圖6(h和i))，但是完全損壞的微血管數量減少，並且更常觀察到具有緊密基底層的微血管，表示BONB重建中的過渡狀態。當檢查4μg P-sel處理組時，觀察到對rAION損傷的顯著保護。P-sel處理穩定了BONB，並且在第1天保持BONB的超微結構(圖6(f))，其具有可觀察到的緊密連接(圖6(g))。儘管在第1天存在一些內皮細胞損傷，但該緊密連接及基底層仍然完整，且內皮細胞損傷在第3天便恢復。此外，在4μg P-sel處理組中第7天的內皮細胞(圖6(n和o))與假手術組中的內皮細胞非常相似，而PBS處理組中在第7天則存在內皮細胞損傷(圖6(i和m))。這些發現解釋了之前的OCT結果(圖5)，其中4μg P-sel處理組在急性期的視神經水腫減少。此結果表明，P-sel-IgG藉由在rAION的急性期穩定BONB而達到保護作用。

P-sel-IgG在視網膜中表現出Nrf2介導的保護作用：在缺血再灌注損傷後，PSGL-1介導的肝臟保護需要NRF2。PSGL-1係眾所周知的P-選擇素配體；因此，Nrf2和其他抗氧化反應元素(ARE)成為目標。在4μg P-sel處理組中，Nrf2的表現與在PBS處理組中的表現相比顯著增加(圖7(b))。在4μg P-sel處理組中，兩種ARE(Nqol及Hol)的表現水平也顯著增加(圖7(c)、圖7(d))。此結果顯示P-sel-IgG透過Nrf2信號傳導路徑發揮神經保護作用。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之方法及用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本發明的範圍及精神的情況下，可以對本文公開的發明進行各種替換及修改。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。

在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

Claims

一種組合物用於製備提供眼部神經保護或預防、治療與視網膜神經節細胞死亡相關的眼部疾病或減輕其影響的藥物之用途，其中該組合物包含一有效量的：a)重組P-選擇素-Fc嵌合蛋白(P-sel-IgG)，其中該重組P-選擇素-Fc嵌合蛋白(P-sel-IgG)包含P-選擇素的C-型凝集素結構域及類EGF結構域，且該重組P-選擇素-Fc嵌合蛋白(P-sel-IgG)係以二硫鍵連接的同型二聚體形式與人類IgG₁的Fc區融合；或b)該重組P-選擇素-Fc嵌合蛋白(P-sel-IgG)及藥學上可接受的佐劑、媒液、或載體的組合物。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該眼部疾病包含視野缺損(visual field loss)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該眼部疾病包含神經退化(neurodegeneration)、眼內壓升高、缺血事件或視神經損傷。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該眼部疾病包含視網膜損傷或視神經損傷。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該視網膜損傷或視神經損傷包含缺血或缺氧損傷。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該眼部疾病係選自由青光眼、糖尿病視網膜病變(DR)、糖尿病黃斑部水腫(diabetic macular edema,DME)、老年性黃斑部病變(age related macular degeneration,AMD)、雷伯氏遺傳性視神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy,LHON)、雷伯氏視神經萎縮(Leber optic atrophy)、視神經炎、視網膜動脈阻塞、中心性視網膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、分枝性視網膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、缺血性視神經病變、視神經損傷、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)或色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa,RP)、視網膜神經節退化、黃斑部退化、遺傳性視神經病變、代謝性視神經病變、由毒性劑引起的視神經病變、由不良藥物反應或維生素缺乏所引起的神經病變、及與腫瘤有關的視力喪失所組成之群組。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該眼部疾病係缺血性視神經病變。
如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該缺血性視神經病變係前部缺血性視神經病變(AION)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該眼部神經保護包含視神經的神經保護。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該蛋白或包含該蛋白的組合物係以乳膏劑、泡沫劑、糊劑、軟膏劑、乳劑、液體溶液劑、點眼劑、凝膠劑、噴霧劑、懸液劑、微乳劑、微球體(microsphere)、微膠囊、奈米球體、奈米粒子、脂質囊泡(lipid vesicle)、微脂體、聚合物囊泡、貼劑、或隱形眼鏡的形式投予。
如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該蛋白或包含該蛋白的組合物係以液體溶液劑的形式投予。
如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該液體溶液劑係藉由玻璃體內注射(intravitreal injection)來投予。