TW202404650A - 抗血管新生之自組裝奈米粒子及其用途 - Google Patents

抗血管新生之自組裝奈米粒子及其用途 Download PDF

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曾靖孋
鄭幼文
吳昱儀
謝薾萱
梁家樺
林凡立
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臺北醫學大學
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Abstract

本揭露提供一種用於治療或緩解眼部血管新生或血管生成的奈米粒子或包含該奈米粒子的醫藥組成物，該奈米粒子包括透明質酸和治療性胜肽。本揭露另提供一種藉由將本揭露的奈米粒子或醫藥組成物投予有其需要的個體以抑制血管形成或增長的方法。

Description

抗血管生成之自組裝奈米粒子及其用途
本揭露有關自組裝奈米粒子及其用於治療血管生成相關疾病或病症，尤其是眼部血管生成相關疾病或病症的用途。
眼部疾病，例如退化性黃斑部病變(age-related macular degeneration，AMD)在全世界越來越常見，這是因為人口老化和過度使用螢幕裝置例如手機與筆記型電腦，從而使眼睛疲勞並導致眼部疾病的風險增加。根據2021年世界衛生組織(WHO)報告，全球至少有2.2億人患視力障礙，其中，約2億人有中度或重度視力障礙或失明。
Feizi,S.等人(Eye and Vision,4(1)：p.28,2017)已闡明，角膜血管生成在視力障礙與失明中有重要角色。據統計，每年約有140萬人出現角膜血管新生(Corneal neovascularization,CoNV)，其中有12%的人繼而失去視力。角膜血管生成也是角膜感染的常見併發症，感染性角膜炎的盛行反映了全球角膜血管生成的總體情況，全世界約有15%(600萬人)的失明係由衣原體感染所引起；盤尾絲蟲病感染是由於角膜血管生成而導致失明的另一個主要原因。此類感染已導致約27萬例失明，全球約有1.2億人處於感染風險之中。在美國，預估 約有50萬例皰疹性角膜炎。除此之外，長期配戴隱形眼鏡，尤其是軟性水膠隱形眼鏡也是造成角膜血管生成的因子；據估計，在900萬隱形眼鏡佩戴者中，有1.3%的人有角膜血管新生。此外，當角膜受到化學傷害(如除漆劑、染料、酸和鹼)時的修復過程也會導致角膜血管生成。在美國，由各種化學物質引起的角膜血管生成的盛行率約為3.7萬人。
除了角膜血管生成，眼後段(Posterior segment)新血管的形成與增長(例如脈絡膜血管新生，ChNV)也是嚴重眼部疾病與視力喪失的主因。此情形可能發生於多種狀況中，包括患有退化性黃斑部病變(AMD)、糖尿病視網膜病變(DR)與嚴重視力障礙等個體中。
目前，用於治療眼部疾病的主要治療方法包括口服類固醇與玻璃體內注射。然而，長期使用類固醇可導致體重增加、高血壓、血糖升高、青光眼、白內障和胃腸道症狀等副作用。類固醇還會抑制免疫系統的保護作用，從而增加感染風險如單純皰疹的復發。玻璃體內注射通常使用抗血管內皮生長因子(anti-VEGF)藥物，然而，頻繁注射此類藥物可能導致如眼內炎、出血、高眼壓、發炎、白內障與視網膜剝離等併發症。
因此，能有效抑制新血管形成，同時在原位(in situ)投藥的治療為當前所亟需。
本揭露提供一種用於抑制血管生成或新血管形成的自組裝奈米粒子。此類奈米粒子能用於例如眼部疾病及/或病症之治療。
本揭露之另一態樣為提供上述奈米粒子的製備方法。
本揭露之又一態樣為提供包含本揭露之奈米粒子的組成物，例如醫藥組成物。
本揭露之再一態樣為提供一種用於治療或緩解眼部血管生成的包含本揭露之奈米粒子的組合物，例如用於緩解眼部血管生成之醫藥組成物。
本揭露之另一態樣為提供一種用於治療或改善眼部血管生成相關疾病或病症(例如退化性黃斑部病變(AMD))之方法，其包括將本揭露之奈米粒子或其組成物投予有其需要之個體。
本揭露之又一態樣為提供本揭露之奈米粒子於製備藥物的用途。
為實現上述態樣，本揭露提供一種包含透明質酸(HA)與治療性胜肽的自組裝奈米級粒子。在一些具體實施例中，本揭露之自組裝奈米粒子載藥至少70% w/w的給定量之治療性胜肽，例如70% w/w、71% w/w、72% w/w、73% w/w、74% w/w、75% w/w、76% w/w、77% w/w、78% w/w、79% w/w、80% w/w、81% w/w、82% w/w、83% w/w、84% w/w、85% w/w、86% w/w、87% w/w、88% w/w、89% w/w、90% w/w、91% w/w、92% w/w、93% w/w、94% w/w、95% w/w、96% w/w、97% w/w、98% w/w、99% w/w或更高的給定量之治療性胜肽。在一些具體實施例中，本揭露之自組裝奈米粒子載藥率約70%至99% w/w的治療性胜肽，例如約70%至75%、約75%至80%、約80%至85%、約85%至90%或約95%至99%的給定量之治療性胜肽。
在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子的尺寸為約100至400nm，例如約100至150、150至200、200至250、250至300、300至350，或350至400nm。在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子的尺寸為約150至350nm。在一些實施例中，本揭露之奈米粒子的多分散性指數(polydispersity index)為約0.001至0.7，例如約0.001至0.01、約0.01至0.05、約0.05至0.1、約0.1 至0.15、約0.15至0.2、約0.2至0.25、約0.25至0.3、約0.3至0.35、約0.35至0.4、約0.4至0.45、約0.45至0.5、約0.5至0.55、約0.55至0.6、約0.6至0.65，或約0.65至0.7。在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子的zeta電位範圍為-40mV至40mV，例如-40mV至-35mV、-35mV至-30mV、-30mV至-25mV、-25mV至-20mV、-20mV至-15mV、-15mV至-10mV、-10mV至-5mV、-5mV至0mV、0mV至5mV、5mV至10mV、10mV至15mV、15mV至20mV、20mV至25mV、25mV至30mV、30mV至35mV、或35mV至40mV。在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子的zeta電位為約-35mV至35mV。
在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子包含治療性胜肽，其在血管內皮細胞中表現出抗氧化、抗發炎與抗血管生成之特性，尤其是抑制活性含氧物(ROS)產生之特性，從而抑制血管內皮生長因子(VEGF)的表現。在一些具體實施例中，本揭露之奈米粒子包含靶向Nox2的抑制胜肽，例如gp91 ds-tat胜肽。
在一些具體實施例中，本揭露提供一種用於抑制血管形成及/或增長的方法，包括將本揭露之奈米粒子投予有其需要的個體。在一些具體實施例中，該血管為眼部血管，其中，將奈米粒子施用於個體的眼部。在一些具體實施例中，該眼部包括眼前段(Anterior segment)和眼後段，其中，眼前段包含角膜、結膜、虹膜與晶狀體；眼後段包含前玻璃體膜、玻璃體液、視網膜、視神經、脈絡膜與鞏膜。在某些具體實施例中，眼前段指角膜，眼後段指視網膜與脈絡膜。
在一些具體實施例中，奈米粒子實質上帶正電(zeta電位>0mV)，且藉由眼藥水劑型投予至有其需要之個體的眼前段。在一些具體實施例中，奈米粒子實質上帶負電(zeta電位<0mV)，且藉由玻璃體內注射投予至有其需要之 個體的眼後段。在一些具體實施例中，投予至該眼後段的奈米粒子穿過視網膜並到達脈絡膜。
在一些具體實施例中，該個體患有血管生成或血管新生相關病症，例如實體腫瘤(例如癌症與惡性肉瘤)、血管纖維瘤、動靜脈畸形(arteriovenous malformations)、動脈粥樣硬化、血管瘤症(hemangiomatosis)、血管黏連(vascular adhesions)、伴有血管錯構瘤的軟骨發育不全(Maffucci症候群)、遺傳性出血性毛細血管擴張症(Osler-Weber-Rendu症)、發炎或傷口癒合異常。
在一些具體實施例中，個體患有眼部血管生成相關病症，例如退化性黃斑部病變(AMD)、視網膜動脈或靜脈阻塞、視網膜分支靜脈阻塞、早產兒視網膜病變(ROP)、新生血管性青光眼、角膜血管新生(CoNV)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、急性特發性黃斑病變、息肉狀脈絡膜血管病變、缺血性糖尿病視網膜病變、色素性視網膜炎(RP)、視錐細胞營養不良、貝塞特氏病(Behcet’s disease)、增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜炎、葡萄膜炎、萊伯氏症遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy)、視網膜剝離、視網膜色素上皮剝離、視網膜血管生成和脈絡膜血管新生(Choroidal neavasculzarzation,ChNV)、眼後段創傷、放射性視網膜病變、黃斑前膜(epiretinal membrane)或前段缺血性視神經病變。
在一些具體實施例中，本揭露提供一種組成物，其包含本揭露之奈米粒子。
定義
本文中使用的所有用語，包括描述性或技術性用語，均應被解釋為具有對所屬領域中具通常知識者顯而易見的涵義。然而，根據所屬領域中具有 通常知識者的意圖、先前案例或新技術的出現，該等用語可具有不同涵義。此外，申請人可任意選擇部分用語，此情況下，將於本揭露之描述中詳細闡述所選用語的涵義。因此，本文中之用語是基於用語的涵義及說明書中之整體描述加以定義。
在本文中，除非明確且清楚地限於一個指稱對象，否則用語「一(a)」、「一個(an)」或「該(the)」包括多個指稱對象。除非上下文另有明確說明，否則用語「或」可與用語「及/或」互換使用。用語「約」指根據如何測量或決定數值的可接受範圍或偏差。在本文中，用語「約」理解為表示高達特定數值的正負20%，例如正1%、正5%、正10%、正15%、正20%、負1%、負5%、負10%、負15%或負20%的特定數值。此外，當一個部件「包含(includes)」或「包括(comprises)」一個元件或步驟時，除非有與之相反的特定描述，否則該部件還可以包括其他部件或其他步驟，而非排除其他部件或步驟。
在本文中，以參數列舉的數值或範圍旨在包括介於所列舉的數值或範圍間的數值與範圍。還應理解，本揭露中的範圍包括下限和上限。例如，若胜肽具有12到50個胺基酸，所有個別數值如12、13、49、50與其子範圍如12到20、20到30及30到50皆已明確列舉。下限和上限之間所有可能的值之組合視為已在本揭露中明確表示。
用語「自組裝的(self-assembled)」與「自組裝(self-assembly)」指如下現象：物體(例如本文所揭奈米粒子)的組分由於其本身之間的相互作用而組織成具有功能之結構，而無須外部指引。用語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用，指患有、懷疑患有、有風險、將有血管生成或血管新生相關病症、或接受該相關病症之篩檢的溫血動物，包括實際罹患或疑似罹患疾 病者。此等用語包括但不限於家畜、運動用動物、靈長類與人類。例如哺乳動物，較佳為人類。
在本文中，用語「治療(treat)」或「處置(treating)」係指為了處置及照護個體中之疾病、病症或病況而採取的行動。該用語旨在包括延緩該疾病、病症或病況之進展、減輕或緩解症狀與併發症、及/或治癒或消除該疾病、病症或病況。待治療的個體可為哺乳動物，例如人類。
用語「減少」、「緩解」或「抑制」係指透過習知標準手段檢測到之參數(例如血管形成)的減少，其中，相較未治療的個體，該參數減少或至少減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或更高。
用語「有效」是指疾病、病症或病況的症狀相對於未治療個體得到改善。本揭露所使用之有效治療血管生成或血管新生相關疾病的活性化合物之量，取決於年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、藥物相互作用與個體的病情嚴重程度。主治醫師或獸醫將決定適當的量與劑量方案。該劑量稱為「有效」劑量。如果必要或需要，治療可涉及向患者多次施用有效量的本揭露之奈米粒子或其組成物。
在本文中，用語「血管新生(neovascularization)」是指新血管的形成。此類產生新血管的過程可由環境刺激觸發並由血管生成及/或病理組織反應介導。舉例來說，受傷的組織可能會引發促血管新生因子的集合，這些因子會刺激蛋白酶釋放，並最終導致新血管的形成和重塑。用語「血管生成(angiogenesis)」是指源自現有血管的新血管的增殖或生長。血管生成可以透過測量每單位面積的血管段的總長度、功能性血管密度(每單位面積的灌注血管的總長度)或血管體積密度(每單位體積組織的血管總體積)加以測定。
用語「治療」或其任何語言變體是指治療有效量的本揭露組成物之投予，其可有效改善與疾病相關的不欲之症狀，以防止此類疾病在症狀出現前的表現、減緩疾病進展、減緩症狀惡化、增強緩解期的開始、減緩疾病進行性慢性階段造成的不可逆損害、延緩該進展階段的發作，減輕疾病嚴重程度或治癒疾病、帶來快速恢復、或防止疾病發生或上述兩者或多者的組合。
在本文中，用語「胜肽」表示一系列胺基酸殘基，通常透過相鄰胺基酸的α-胺基和羰基之間的胜肽鍵彼此連接。在一些具體態樣中，本揭露使用的胜肽長度為5至200個胺基酸。在一些具體態樣中，本揭露使用的胜肽長度為10至100個胺基酸。在一些具體態樣中，本揭露使用的胜肽長度為12至50個胺基酸，例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸之長度。
此外，用語「胜肽」應包括一系列胺基酸殘基的鹽，通常透過相鄰胺基酸的α-胺基和羰基之間的胜肽鍵彼此連接。例如，由鈣、鉀、鈉、鎂及其類似物製備的無機離子鹽；由鹽酸、硝酸、磷酸、溴酸、碘酸、高氯酸、酒石酸、硫酸及其類似物製備的無機酸鹽；三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、富馬酸、扁桃酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖酸、半乳醣醛酸；由酸、麩胺酸、戊二酸、葡萄醣醛酸、天冬胺酸、抗壞血酸、碳酸、香草酸、氫碘酸等製備的有機酸鹽；由甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘磺酸及其類似物製備的磺酸鹽；由甘胺酸、精胺酸、離胺酸等製備的胺基酸鹽；由三甲胺、三乙胺、氨、吡啶、甲基吡啶等及其類似物製備的胺鹽。較佳地，該鹽是胜肽的醫藥上可接受之鹽。
本文使用的用語「醫藥上可接受的賦形劑」是指促進活性劑投予個體及/或為個體所吸收的物質。在本揭露的一些具體態樣中，醫藥賦形劑包括但不限於填充劑、黏合劑、防腐劑、聚合物、溶劑、抗氧化劑、崩解劑、懸浮劑、潤濕劑、潤滑劑、包衣、金屬、甜味劑、調味劑、穩定劑或著色劑。本領域具通常知識者將理解其他醫藥賦形劑可用於本揭露。
術語「生物相容性」物質是指當施用於個體時通常不會引起不良反應的物質。不良反應包括但不限於個體的免疫系統對該物質的顯著發炎及/或急性排斥，例如透過T細胞介導的反應。在一些具體態樣中，生物相容性物質為可生物降解者。生物相容性物質的非限制性示例是生物相容性聚合物(包括生物相容性共聚物)。
申請文件包含至少一彩色圖式。專利局將根據請求與必要的費用提供帶有彩色圖式的本專利申請公開之副本。
透過結合附圖並參考以下描述，將更容易理解本揭露內容。
圖1A顯示繪示自組裝HA-胜肽複合奈米粒子(HA-NPs)形成的示意圖
圖1B顯示繪示帶正電的HA-NPs(HA-NPs+)和帶負電的HA-NPs(HA-NPs-)的投藥途徑示意圖。
圖2說明HA-NPs+和HA-NPs-在穿透式電子顯微鏡(TEM)下的形態。
圖3顯示在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)的中性(pH 7)環境中HA-NPs+、HA-NPs-及純gp91 ds-tat(gp)的累積藥物釋放率。
圖4顯示用不同濃度的透明質酸(HA)、純gp91 ds-tat(gp)及HA-NPs處理1天，對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的細胞存活率測試結果。
圖5A至5B說明HUVECs中游離gp91 ds-tat(gp)及HA-NPs+的細胞攝取量。圖5A顯示透過流式細胞儀與FITC螢光標記的細胞計數。圖5B繪示根據圖4的FITC強度的直方圖。
圖6A至6B描繪了以透明質酸(HA)、純gp91 ds-tat(gp)或HA-NPs+處理HUVECs的管柱形成測定，在投藥後4小時、16小時與24小時的結果。圖6B繪示根據圖5的分支數量的直方圖。
圖7A至7B說明純gp91 ds-tat(gp)或HA-NPs+在小鼠前眼中隨時間的藥物保留率。圖7A展示了小鼠眼睛中的螢光程度，其中最小色標為9.69×108，最大色標為1.10×1010。圖7B示出了根據圖7A的螢光強度的量化結果。
圖8A至8B說明用PBS、透明質酸(HA)、gp91 ds-tat(gp)或HA-NPs+處理的化學灼傷小鼠的角膜血管新生(CoNV)的治療結果。圖8A顯示了各治療組中CoNV小鼠眼睛的恢復進展。圖8B顯示了根據圖7的各治療組中的血管比率的直方圖。
圖9A至9B顯示了用純gp91 ds-tat(gp)和HA-NPs-處理的小鼠的螢光冷凍切片結果。圖9A展示了脈絡膜和視網膜區域中的眼睛圖像，其中 TAMRA標記的gp91 ds-tat以紅色顯示。圖9B顯示根據圖9A的螢光強度直方圖。
圖10A至10B說明HA-NPs對治療脈絡膜血管新生(ChNV)的作用。圖10A顯示雷射誘導治療前7天(-7天)、雷射誘導當日(0天)、雷射誘導治療後7天(+7天)和雷射誘導治療後14天(+14天)的小鼠眼底影像。圖10B顯示了PBS和HA-NPs-處理後血管新生面積變化的直方圖。呈現基於第0天的標準化數據以描述倍數變化。
本發明的總體特徵為一種自組裝奈米粒子，該奈米粒子包含特定比例的透明質酸(HA)與治療性胜肽試劑及其組成物，可用於抑制血管新生。本發明還涉及一種治療血管生成或血管新生相關疾病的方法，包括將上述奈米粒子或其組成物投予有其需要的個體。如下文更詳細描述可知，Nox2靶向抑制肽gp91 ds-tat與HA組合被識別為具有抑制眼部血管新生或血管生成的能力，相較於使用常規的純gp91或PBS治療之組別，藥物在眼部的保留時間也更長。
角膜血管新生(CoNV)
眼球的前1/6部分是角膜，覆蓋瞳孔、前房和虹膜，是透明的無血管結構。為保持透明，角膜沒有血管。它主要透過角膜邊緣的血管網獲得營養，其次是淚液和房水。它直接透過空氣獲得約80%的氧氣。由於角膜與空氣直接接觸，容易發生各種感染和刺激。一旦角膜受到刺激，角膜邊緣血管網的血管就會向前增殖，如果不採取行動，可能會導致角膜疾病、退化，甚至失明。引起CoNV的原因多種多樣，包括但不限於角膜免疫反應、微生物感染、角膜水疱樣病變、化學損傷(鹼損傷和硝酸銀)、先天性角膜病變(彼得畸形)、維生素A或其他 維生素和胺基酸缺乏與代謝干擾、佩戴軟/硬隱形眼鏡、放射狀角膜切開術後……等。
缺氧也可能在CoNV的發病機制中起作用，因為在使用透氣鏡片的個體的眼睛中很少觀察到血管新生。先前的研究表明，引起CoNV的主要因素是感染、全身性疾病、化學燒傷和無虹膜。綜上所述，角膜血管新生是當前最嚴重的眼部疾病之一。
血管生成途徑
Kim等人(Blood.123(5)：p.625-631,2014)解釋了血管生成途徑。當NADPH氧化酶被活化時，血管內皮生長因子(VEGF)會刺激活性含氧物(ROS)的產生。然後增加的ROS參與驅動血管增殖(血管生成)的VEGFR2磷酸化。NOX2，也稱為gp91phox或CYBB，是NADPH氧化酶的原型。文昌魚NOX2可能是所有哺乳動物NOX1/2/3的起源。Gp91phox可嚴重抑制活性含氧物以引起缺氧。NADPH氧化酶是缺氧期間產生過氧化物的主要來源，並且已表明它可作用於所有細胞類型中由缺氧所活化的氧傳感器。在活化過程中，NADPH氧化酶的細胞質亞基(p47phox、p67phox、p40phox、Rac1和Rac2)遷移到膜上並與膜結合的亞基(gp91phox、p22phox)對接。
用於角膜新生血管(CoNV)的藥物
CoNV治療目的是實現抗血管生成或血管退化。眼藥水和口服藥物等非侵入性治療的治療效果較差。現今的CoNV藥物如貝伐單抗、托珠單抗和雷珠單抗主要針對VEGF，因為VEGF的抑制作用已顯示對治療CoNV的顯著效果。如今，藥物治療如類固醇、非類固醇消炎藥(NSAID)、抗VEGF劑和環孢菌素已經出現。CoNV的一線治療是類固醇和非類固醇消炎藥。然而，使用類固醇的風險為可能會增加感染、青光眼、白內障、單純皰疹復發的機會，而消炎藥可能會導致角膜潰瘍和融化。近年來的新療法是抗VEGF藥物(雷珠單抗或 貝伐單抗)，其已被證明可降低CoNV。血管內皮生長因子(VEGF)家族及其受體系統已被證明是血管生成之細胞訊息傳遞的基本調節劑。此外，許多研究表明，VEGF在與眼部疾病相關的血管生成和病理性血管新生中起重要作用，CoNV的潛在治療方法是透過競爭VEGF與特異性中和抗VEGF抗體的結合來抑制VEGF活性。然而，抗VEGF藥物在治療CoNV方面有侷限性，它並非完全治癒的治療方法，需要反復治療才能隨著時間維持正面效果。雖然貝伐單抗或雷珠單抗是抗癌藥物，但它們已被證明具有短期安全性和有效性，惟尚未記錄長期影響，並可能導致角膜變薄、上皮癒合減少和上皮糜爛。抗VEGF治療目前仍是一種實驗性治療。如果角膜因角膜血管新生而發炎，酶的抑制可以透過損害角膜結構完整性來阻斷CoNV。CoNV亦可經口服多西環素片和局部皮質類固醇的組合來抑制。
新的抗血管新生劑gp91 ds-tat
Gp91 ds-tat是NADPH氧化酶抑制肽。它是一種能夠阻斷p47phox與NOX2(gp91phox)結合從而抑制NAD(P)H活化的胜肽。gp91 ds-tat阻止p47phox與Nox的結合。Gp91 ds-tat包含帶正電荷的精胺酸殘基，使胜肽帶正電荷。
F.E.Rey等人(Circulation research 89(5)：p.408-414,2001)闡明gp91可抑制ROS形成並下調VEGF的性能。體外試驗顯示，當將gp91 ds-tat施用用於血管緊張素II誘導(Ang II)小鼠時，O2 -值降低。顯示該抑制劑降低血管O2 -和血壓的能力，gp91 ds-tat組得到顯著抑制。
T.Usui等人(Acta Physiologica 211(2)：p.385-394,2014)也闡明gp91 ds-tat可抑制ROS。他們首先研究了腦源性神經營養因子(BDNF)可能在人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)中誘導ROS。之後，在BDNF刺激之前用gp91 ds-tat預處理HUVECs。結果表明，gp91 ds-tat可顯著抑制BDNF誘導的ROS生成，其ROS信號強度低於其他組。
Hiroki Hachisuka等人(Journal of organization engineering and regenerative Medicine 2(7)：p.430-435,2008)使用大鼠室模型檢查了gp91 ds-tat對工程組織塊生長的影響。他們將Matrigel與gp91 ds-tat(100iza混合，並與對照組比較，觀察血管的形成。儘管每單位細胞化面積的血管總數在兩組之間沒有差異，但與對照組相比，gp91 ds-tat處理的組織中的大多數血管具有較小的管柱(對照組為10.3中的大多數血，而gp91 ds-tat組為1.7；p<0.001)。在體外，gp91 ds-tat治療減少了培養的微血管內皮細胞的增殖和遷移。
因此，據信gp91 ds-tat可能有助於抑制角膜新生血管(CoNV)。
眼部疾病的奈米藥物
眼中複雜的藥物遞送屏障降低了許多藥物在眼中的生物利用度，並呈現較差的治療效果。奈米載體介導的藥物可與眼黏膜相互作用，延長滯留時間，增加藥物在角膜上的通透性。此外，減少藥物的毒性和劑量是必要的。因此，奈米粒子藥物已成為生產奈米藥物並應用於眼科治療的潛在技術。通常，奈米粒子的類型分為奈米球、奈米膠囊、聚合物膠束、脂質體、第四代樹枝狀大分子、配體偶合與鐵磁流體偶合配體。奈米粒子在眼睛中的分佈主要取決於它們的大小和表面性質。直徑200至2000nm範圍內的奈米粒子可以在眼組織中停留至少2個月，並且可以在角膜前組織中停留很長時間而不被快速去除。在聚合物奈米粒子中，藥物可以被封裝、結合或吸附。
實施例
本揭露的示例性實施例進一步描述於以下實例中，其不應被解釋為對限本揭露範圍的限制。
如圖1A和1B所示，本發明提供的奈米粒子是由透明質酸(HA)和治療性胜肽自組裝複合而成的。HA-胜肽複合奈米粒子(HA-NPs)為膠體，其中粒子的電荷可為正電荷或負電荷，具體取決於HA與胜肽之間的比率。根據 它們的電荷，HA-NPs可以有不同的用途。如圖1B所示，帶正電的HA-NPs(HA-NPs+)可用於製備眼藥水，此眼藥水可施用於眼前段(例如角膜或結膜)。由於角膜和結膜具有負表面電荷，陽離子膠體HA-NPs可延長保留期並持續滯留在帶負電荷的眼組織上。另一方面，帶負電荷的HA-NPs(HA-NPs-)可透過玻璃體內注射投予至眼後段(例如視網膜、脈絡膜和鞏膜)而不會引起排斥事件。由於玻璃體是由透明質酸組成，位於眼後段的HA-NPs也可以避免非吸收性清除機制。
實施例1. 自組裝HA-NPs的合成和特性。
在本揭露中，選擇gp91 ds-tat(gp)作為用於製備HA-NPs的示例性治療胜肽。分別製備透明質酸(HA)和gp溶液，其特定濃度為1至5mg/mL。為了合成奈米粒子，首先將2mL去離子(DI)水加入樣品瓶中，並以990rpm的轉速攪拌。HA和gp溶液以不同的添加量比(HA：gp=1：0.5至2.5)快速加入樣品瓶中，形成帶正電荷(HA-NPs+)或帶負電荷(HA-NPs-)的奈米粒子。將這些奈米粒子連續攪拌10分鐘，然後在4℃保存以備進一步使用。
使用奈米粒徑分析儀(DLS)(Zetasizer Nano ZS90；Malvern Instruments,Malvern,UK)在25℃測定HA-NPs+和HA-NPs-的粒徑、zeta電位和多分散性指數(polydispersity index，PdI)，每組進行三次測量。為了確定奈米粒子的胜肽載藥率(EE)，將HA-NPs+和HA-NPs-在離心過濾管中以4000rcf離心20分鐘。收集未載藥的gp91 ds-tat並透過蛋白質測定試劑(Bio-Rad,USA)進行定量。胜肽載藥率透過下列公式計算：
Figure 111127398-A0304-12-0015-1
結果總結在下表1和2中。表1表明HA-NPs的電荷可以根據奈米粒子內HA和gp之間的比率量來確定。比率中gp的增加將導致HA-NPs帶更多正電荷，而HA增加則使HA-NPs帶更多負電荷。
Figure 111127398-A0304-12-0016-2
表2顯示HA-NPs+和HA-NPs-特性的平均值。透過DLS測量的HA-NPs+和HA-NPs-的平均粒徑分別為268.4±7.1nm和166.7±1.0nm。HA-NPs+和HA-NPs-的zeta電位分別為17.9±0.7mV(正)和-31.6±0.6mV(負)。所有測試組的PdI值均低於0.15，表明這些樣品是分散良好的膠體溶液。HA-NPs+和HA-NPs-的胜肽載藥率(EE)分別在98%和76%左右，表明胜肽載藥良好。
Figure 111127398-A0304-12-0016-3
實施例2. 藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)對HA-NPs的形態觀察
藉由穿透式電子顯微鏡(TEM；HT-7700；日立，東京，日本)檢查HA-NPs+和HA-NPs-的形態。將稀釋的HA-NPs滴在鎳網上，再用2%醋酸鈾(UA)溶液染色1分鐘。乾燥後透過TEM查測樣品。
從TEM圖像觀察到HA-NPs+和HA-NPs-組中的圓形和球形奈米粒子，HA-NPs沒有團聚。粒徑約為248nm(HA-NPs+)和143nm(HA-NPs-)(圖2)，這與從DLS測量獲得的粒徑結果大致相符。
實施例3. 胜肽/藥物釋放率評估
gp91 ds-tat(gp)偶合至螢光異硫氰酸鹽(FITC)，用於藥物螢光標記。然後將FITC標記的胜肽用於製備自組裝的HA-NPs+和HA-NPs-用於胜肽/藥物釋放評估。將1mL FITC標記的HA-NPs+、HA-NPs-和純gp溶液分別加載進透析膜。然後將每個透析膜浸泡在總體積為15mL的PBS(pH 7)中，並在37℃磁力攪拌的水浴中溫育。在特定時間(10分鐘、30分鐘、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時)，每組收集1mL溶液，再供給1mL PBS。在完成所有收集後，使用全波長多功能微盤分析儀(Varioskan Flash；賽默飛世爾科技，美國)測試收集的樣品以獲得FITC濃度，其激發波長為494nm，放射波長為518nm。計算FITC標記胜肽的累積藥物釋放率並顯示於圖3。
如圖3所示，純gp組的胜肽在前24小時內快速釋放(佔總量的57.19%)，並在評估開始後48小時內達到100%的釋放率。然而，與純gp相比，HA-NPs的釋放率明顯較慢，因為在評估開始後24小時內，兩者的累積釋放率分別為8.9%(HA-NPs+)和7.2%(HA-NPs-)。評估72小時後，HA-NPs+和HA-NPs-分別達到31.0%和17.3%的釋放率。結果證明，這揭示胜肽/藥物載藥於奈米粒子中時的緩釋狀態。
實施例4. 細胞存活率測試
人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)用於細胞存活率測試。將細胞種在96孔盤中(5×103個細胞/孔)並過夜培養。隨後分別與各種濃度的透明質酸(HA)、純gp91 ds-tat(gp)、HA-NPs+和HA-NPs-培養一天。使用細胞存活率試劑(CCK-8)測定每個治療組的細胞存活率。在各組培養1天後移去培養基，然後在各組加入含CCK-8的培養基110μL。培養3小時後，使用全光譜分析儀(EPOCH2；BioTek，美國)在450nm波長下測試反應溶液。結果顯示為基於對照組(C)(圖4)的標準化數據。
如圖4所示，所有治療組的細胞存活率均高於70%，表明未觀察到生物毒性。低濃度(25和75μg/mL)的HA-NPs不影響細胞存活率。此外，HA-NPs的電荷也不影響細胞存活率。值得注意的是，HA-NPs濃度高於100μg/mL的治療組表現出比gp組更低的細胞存活率。這些結果表明HA-NPs對細胞無毒性。
實施例5. HA-NPs的細胞攝取
FITC-標記的gp91 ds-tat用於製備HA-NPs+，以於流式細胞儀檢驗中追蹤其螢光信號。將HUVECs細胞種在24孔盤(2x105細胞/孔)中過夜。將胜肽濃度為300μg/mL的純gp91 ds-tat(gp)和HA-NPs+藥物溶液添加到細胞中。在培養0.5小時和2小時後，採集細胞並將其重懸(resuspended)於PBS中成為單一細胞懸液。隨後以流式細胞儀(Invitrogen AttuneTM NxT Acoustic Focusing Cytometer；AFC2，Thermo，新加坡)進行檢驗，藉由AttuneNxT軟體(Invitrogen AttuneTM NxT Acoustic Focusing Cytometer；AFC2，Thermo，新加坡)對1x104個細胞進行計數及分析。
如圖5A和5B所示，HA-NPs+組在培養0.5小時表現出明顯高於gp組的FITC強度。在2小時的培養中也觀察到類似的結果，與gp組相比，HA-NP+組 獲得了更高的螢光強度。此結果顯示本揭露提供的HA-NPs容易被細胞攝取，並且能將治療性胜肽遞送至細胞中。
實施例6. 管柱形成測試
為了解HA-NPs和其中的治療性胜肽所帶來的抗血管生成作用，進行管柱形成測試以觀察血管網形成情況。使用MatrigelTM水凝膠為HUVECs提供形成管柱的環境。將Matrigel平鋪在48孔盤上的孔(150μL)中，接著將這些48孔盤與Matrigel在37℃下培養30分鐘凝固。以1.5 x 105個細胞/孔的密度製備HUVECs且分別給予HA、gp、HA-NPs+組(100μg/mL gp91 ds-tat胜肽濃度)，再種在48孔盤中。每組進行三重複測試，並透過倒立式螢光顯微鏡(Leica DMi8，德國)在4、16和24小時拍攝細胞影像。其分支數量由ImageJ軟體量化，HUVECs的分支增長代表體外血管的增長情形。
如圖6A和6B所示，HA-NPs+組在三個時間點皆表現出所有測試組中最低的分支數。然而，在治療24小時後，HA-NPs+與其他組相比呈現明顯較低的分支數。這些結果證實，嵌入HA的gp91 ds-tat奈米製劑(HA-NPs+)能有效抑制HUVECs的管柱形成，且相較於純胜肽和HA組更為有效。管柱形成的抑制也意味著HA-NPs+能夠阻止HUVECs中的血管形成。
實施例7. HA-NPs在眼前段的藥物滯留情形
使用不同的投藥途徑對小鼠的眼前段和眼後段進行動物試驗，如圖1B所示。對於眼前段試驗，根據上述方法將FITC標記的gp91 ds-tat與HLA一起配製以製備HA-NPs+眼藥水。將10μL空格具有相同胜肽濃度的純gp91 ds-tat(gp)和HA-NPs+眼藥水施用於C57BL/6小鼠的眼睛，再藉由IVIS® Lumina XRMS小動物非侵入式活體影像系統(PerkinElmer；Waltham,MA)在麻醉下分別檢測眼表的螢光訊號。於多個時間點(30秒、5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘)檢查眼部螢光滯留量。
用不同眼藥水治療的小鼠眼睛的影像顯示在圖7A中，螢光訊號(FITC)的量化數據總結在圖7B中。投藥3分鐘後，gp組小鼠眼睛的螢光強度為61.8%±1.8%，HA-NPs+組為73.7%±6.1%，表明HA-NPs+在小鼠眼睛上的滯留時間更長且在更長的治療時間後也觀察到類似的結果。與純胜肽眼藥水相比，HA-NPs+在眼前段表現出明顯的長期保留率。結果顯示，HA-NPs可以在作用部位長時間滯留，因此可以提供持續的藥物釋放並減少藥物的重複投藥頻率。
實施例8. HA-NPs對角膜血管新生(CoNV)的治療效果
首先將Zoletil 50®和Rompun®的混合物對雄性C57BL/6小鼠(6至8週齡)之腹腔皮下注射以進行麻醉，再使用0.5% Alcaine®(Alcon；Geneva,Switzerland)對其眼睛進行局部麻醉。使用75%硝酸銀/25%硝酸鉀棒(1590；Grafco,Australia)灼傷小鼠角膜8秒以誘導角膜血管新生(CoNV)，每兩天經眼藥水投予10μL之PBS、透明質酸(HA)、純gp91 ds-tat(gp)和HA-NPs+，每個測試組(PBS、HA、gp和HA-NP+)重複6到8次。在投藥後第0、4和7天，利用裂隙燈(Kowa，日本)觀察血管向角膜中央增長的情況並拍照。為了評估HA-NPs+對CoNV的治療效果，透過ImageJ軟體對不同治療劑的角膜血管面積進行了量化，並總結在圖8B進行比較。
角膜中的血管形成情形顯示於圖8A，其中PBS治療的眼睛在投藥後第4天和7天後表現出嚴重的血管生成狀況。在HA、gp和HA-NPs+組中，特別是在HA-NPs+組中，觀察到角膜血管量化數較少。圖8B另顯示HA-NPs+對傷口帶來最快和最強的抗血管生成作用，並且表現出以眼藥水形式治療CoNV的最佳效果。結合前述實施例7的結果，HA-NPs+眼藥水不僅能在眼表保留更長的藥物暴露時間，且能對CoNV提供有效抑制血管形成的治療效果。
實施例9. HA-NPs在眼後段的藥物滯留
為了評估HA-NPs在眼後段的藥物滯留，將((5-(6)-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯(TAMRA)淬滅體(quencher)標記的HA-NPs-玻璃體注射到小鼠眼中。在4小時和24小時後犧牲小鼠，取下眼球進行冷凍切片，用冷凍切片機(CM3505S，Leica，Germany)在-20℃下將切片切成10μm的厚度，然後貼附在帶正電的載玻片(Superfrost®加，Thermo)上。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，300nM)進行細胞核染色，然後蓋上蓋玻片。透過Tissue FAXS(TissueGnostics,Vienna,Austria)掃描整個眼球冷凍切片如圖9A所示，紅點代表TAMRA標記的純gp91 ds-tat(gp)或HA-NPs-的粒子位置。
在gp組中，投藥後4小時在視網膜和脈絡膜區域觀察到強訊號(圖9B)，顯示純gp91 ds-tat胜肽迅速從玻璃體移動到視網膜和脈絡膜。然後在投藥24小時後觀察到螢光強度顯著下降，顯示純胜肽不能保留在組織上。相比之下，HA-NPs-在前4小時內沒有表現出強烈的螢光強度，但在投藥24小時後強度顯著增加。結果顯示，與純胜肽相比，經玻璃體注射給予的HA-NPs不會導致藥物突然釋放，且能於後眼中高度保留更長時間。
實施例10. HA-NPs對脈絡膜血管新生(ChNV)的治療效果
C57BL/6小鼠如上所述進行全身麻醉，並在實驗前進行局部瞳孔散大(Mydrin®；Shiga，日本)。透過Imagine Guide Laser系統(Phoenix Research Laboratories,Tempe,AZ，美國)施打雷射光，然後使用眼底血管造影分析(FFA)檢查脈絡膜血管新生(ChNV)形成。使用2%乾眼凝膠(OmniVision，SA，Neuhausen，瑞士)覆蓋小鼠眼睛，並使用Phoenix MICRONh Lab(Phoenix Research Laboratories，Tempe，AZ，美國)拍攝眼底影像和螢光素血管造影影像。眼後段的圖像一開始是用白光拍攝的，再將10%的螢光素鈉皮下注射到小鼠體內進行螢光素血管造影。接著藉由ImageJ軟體分析從FFA拍攝用於評估血管新生區 域之變化的影像。在雷射誘導治療ChNV之前記錄小鼠的健康眼底輪廓。在第0天雷射誘導ChNV模型，然後在第1天經玻璃體注射(IV)遞送PBS/HA-NPs-，並每週進行FFA以檢查血管生成情況驗證其療效，持續2週的結果總結在圖10A。
如圖10A所示，-7天組(雷射誘導治療前)顯示了健康和正常的眼底。第0天雷射誘導後(0天組)可清晰觀察到四個雷射點。在玻璃體注射HA-NPs-後，眼底雷射誘導面積明顯小於PBS組。圖10B顯示了與第0天相比新生血管面積的標準倍數變化。PBS組在治療後7天和14天表現出新生血管面積擴大，而HA-NPs組明顯降低了新生血管水平。結果表明，HA-NPs-透過減少新生血管面積有效抑制脈絡膜血管形成，表明HA-NPs-作為抗血管生成劑在ChNV治療中的應用潛力巨大。
本揭露已搭配其具體實施例進行描述，且應理解，在不悖離本揭露範圍的情況下，各種修改都是根據本揭露的具體實施例。因此，本文所描述的具體實施例旨在涵蓋本揭露範圍內的修改，而非限制本揭露。是以，應給予申請專利範圍最廣泛的解釋，以涵蓋所有此類修改。

Claims (20)

  1. 一種自組裝奈米粒子，其包括透明質酸及治療性胜肽。
  2. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該奈米粒子載藥至少70% w/w的給定量之治療性胜肽。
  3. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該奈米粒子之粒徑為約100至400nm。
  4. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該奈米粒子之多分散性指數為約0.001至0.7。
  5. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該奈米粒子之Zeta電位為約-40mV至40mV。
  6. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該治療性胜肽抑制活性含氧物(ROS)之產生，從而抑制血管內皮生長因子(VEGF)之表現。
  7. 如請求項1所述的自組裝奈米粒子，其中，該治療性胜肽為Nox2靶向抑制胜肽。
  8. 如請求項7所述的自組裝奈米粒子，其中，該Nox2靶向抑制胜肽為gp91 ds-tat胜肽。
  9. 一種抑制血管形成或增長之方法，包括將請求項1所述之奈米粒子投予有其需要之個體。
  10. 如請求項9所述的方法，其中，該血管為眼部血管。
  11. 如請求項10所述的方法，其中，將該奈米粒子投予至有其需要之個體的眼段。
  12. 如請求項11所述的方法，其中，該眼部包括眼前段及眼後段。
  13. 如請求項12所述的方法，其中，該眼前段為角膜或結膜。
  14. 如請求項12所述的方法，其中，該眼後段為視網膜、脈絡膜或鞏膜。
  15. 如請求項12所述的方法，其中，該奈米粒子實質上帶正電，且經眼藥水投予至有其需要的個體之眼前段。
  16. 如請求項12所述的方法，其中，該奈米粒子實質上帶負電，且經玻璃體注射投予至有其需要的個體之眼後段。
  17. 如請求項9所述的方法，其中，該個體患有選自，由癌症、惡性肉瘤、血管纖維瘤、動靜脈畸形、動脈粥樣硬化、血管瘤症、血管黏連、伴有血管錯構瘤的軟骨發育不全(Maffucci症候群)、遺傳性出血性毛細血管擴張症(Osler-Weber-Rendu症)、發炎及傷口癒合異常所組成之群組中至少一者之病症。
  18. 如請求項9所述的方法，其中，該個體患有眼部血管生成或血管新生相關病症。
  19. 如請求項18所述的方法，其中，該眼部血管生成相關病症選自由退化性黃斑部病變(AMD)、視網膜動脈或靜脈阻塞、視網膜分支靜脈阻塞、早產兒視網膜病變(ROP)、新生血管性青光眼、角膜血管新生、糖尿病性黃斑水腫(DME)、急性特發性黃斑病變、息肉狀脈絡膜血管病變、缺血性增殖性視網膜病變、色素性視網膜炎(RP)、視錐細胞營養不良、貝塞特氏病(Behcet’s disease)、增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜炎、葡萄膜炎、萊伯氏遺傳視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy)、視網膜剝離、視網膜色素上皮剝離、視網膜血管生成和脈絡膜血管新生(ChNV)、眼後段創傷、放射性 視網膜病變、黃斑前膜(epiretinal membrane)及前段缺血性視神經病變所組成之群組中至少一者。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1所述之奈米粒子及醫藥上可接受之賦形劑。
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