TWI726172B - 一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含治療有效劑量的木蝴蝶素或其醫藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或對映異構體作為活性成分。

Description

一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途

本發明提供一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含治療有效劑量的木蝴蝶素或其醫藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或對映異構體作為活性成分。

創傷性視神經病變(Traumatic optic neuropathy，TON)是造成視力和失明之功能障礙的破壞性原因。視神經損傷引發了受損軸突的變性過程，可能由膠質細胞功能障礙所介導，隨著細胞凋亡訊號，退行性變化(retrograde axonal degenaration)和瓦勒氏變性(Wallerian degeneration)而導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGC)凋亡。許多研究已經建立了創傷性視神經病變的實驗動物模型，如視神經橫斷、牽張和擠壓損傷模型。視神經擠壓損傷模型可以模擬視神經損傷，通常用於研究視神經和視網膜中的神經變性過程，並篩選潛在的神經保護試劑用於急性視神經病變。

木蝴蝶素(5,7-二羥基-6-甲氧基黃酮，Oroxylin A)是從藥 用植物黃芩所分離出的植物來源的黃酮類化合物。先前研究表明，木蝴蝶素透過抑制RAW264.7巨噬細胞中NFκB-p65的活化來抑制LPS誘導的iNOS和環加氧酶-2的表達。據報導，木蝴蝶素及其類似物對微膠質細胞中LPS誘導的NO產生具有強烈的抑製作用。此外，體內研究的結果表明木蝴蝶素刺激海馬齒狀回區域的成年神經發生(adult neurogenesis)，防止腦灌注不足引起的神經元損傷，改善澱粉樣蛋白(amyloid)(Aβ)誘導的記憶障礙。因此，木蝴蝶素已經顯示出其能行使抗炎和神經保護作用。

本發明揭示了木蝴蝶素在患有視網膜擠壓損傷的大鼠模型中具有神經保護作用。使用螢光金逆行標記來檢測視網膜神經節細胞的存活率所提供的形態學證據表明，木蝴蝶素在視網膜擠壓損傷後促進視網膜神經節細胞存活，並進一步藉由Brn3a免疫染色確認，儘管視網膜神經節細胞密度在兩個實驗中是不同的，這可能是染色效率不同的結果。此外，如FVEP所演示的木蝴蝶素也對在擠壓損傷後的視覺功能保存上發揮了有益的作用。

在本研究中，在視網膜擠壓損傷後，檢查木蝴蝶素在預防視網膜神經節細胞損失和保留視網膜神經節細胞功能方面的能力。進一步研究了木蝴蝶素介導保護中所涉及的潛在分子標的，並研究其在視網膜擠壓損傷模型中的微膠質細胞活化作用的腳色。

本發明係關於一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含 治療有效劑量的木蝴蝶素或其醫藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或對映異構體作為活性成分。

於一實施例中，其中該視神經病變係與細胞之凋亡有關。

於另一實施例中，其中所述細胞為視網膜神經節細胞。

於一實施例中，其中該視神經病變係與炎症有關。

於另一實施例中，其中所述炎症係與巨噬細胞或微膠質細胞啟動相關。

於另一實施例中，其中所述炎症係與神經膠質增生相關。

於另一實施例中，其中所述炎症係與一種或多種促炎因數表達相關。

於另一實施例中，其中該促炎因數係為iNOS表達。

於另一實施例中，其中該促炎因數係為COX-2表達。

圖1、視網膜神經節細胞密度在視網膜擠壓損傷後施以木蝴蝶素兩週下的改進。(A，D)假手術組的視網膜神經節細胞密度分別為2577±383/平方毫米和1550±325/平方毫米。(B)PBS處理組和(C)木蝴蝶素處理組中央視網膜視網膜神經節細胞密度分別為510±158/平方毫米和1352±476/平方毫米，(E，F)在中周視網膜中分別為439±139/平方毫米和960±465/平方毫米，(G，H)分別為中央視網膜及中周視網膜之視網膜神經節細胞密度之長條圖，顯示木蝴蝶素具有顯著的保存作用。(每組n=6；p<0.05)* p<0.05。比例尺：50微米(50μm)。

圖2、具有Brn3a的視網膜舖片證實了木蝴蝶素處理組中的視網膜神經節細胞存活。在每組中的中央視網膜(A-C)和中周視網膜(D-F)中的Brn3a+細胞的代表性圖像。與本發明中的PBS處理的組別相比，木蝴蝶素處理的組別呈現明顯更高的Brn3a+細胞：中央視網膜(G)木蝴蝶素處理對比於PBS處理為894±367/平方毫米vs 475±203/平方毫米，中周視網膜(H)木蝴蝶素處理對比於PBS處理為800±199/平方毫米vs 474±254/平方毫米。n=6；*** P<0.001。比例尺：100微米(100μm)。

圖3、木蝴蝶素治療後FVEPs中P1波潛伏期的改善。(A)在視網膜擠壓損傷後2周的閃光VEP追蹤代表圖。(B)在假手術，PBS處理和木蝴蝶素處理的大鼠的P1波潛伏期分別為85±15毫秒，154±31毫秒和100±12毫秒。相較於PBS處理組，木蝴蝶素處理組具有較短的P1潛伏期(每組n=6，p<0.05)。* P<0.05。

圖4、TUNEL分析顯示了在木蝴蝶素處理後顯示凋亡細胞的數目減少。上列係為三組間視網膜TUNEL的重建。下列描述了假手術大鼠視網膜視網膜神經節細胞層中有1.2±0.9個陽性細胞/HPF，PBS處理組為11.0±3.5個陽性細胞/HPF，以及4.0±2.4個陽性細胞/HPG於木蝴蝶素處理大鼠中(每組n=6)。* p<0.05，*** p<0.001。比例尺：50微米。GCL，神經節細胞層；INL，內核層；IPL，內叢狀層；ONL，外核層；OPL，外叢狀層。

圖5、視神經擠壓後2周以木蝴蝶素處理的視神經中ED1的滲透較少。上列代表在視神經縱切段中的ED1染色。下列表示在假手術組、PBS處理組和木蝴蝶素處理組中的ED1陽性細胞/HPF分別為4.1±2.2，72.0±23.3， 33.5±16.3。每組中的n=6。*p<0.05，***p<0.001。比例尺：上列：200微米(200μm)；下列：50微米(50μm)

圖6、木蝴蝶素在視神經擠壓後2週減弱視網膜神經膠質增生。(A)視網膜切片中的GFAP(星形膠質細胞和Muller細胞)免疫反應性。木蝴蝶素對ON粉碎後2週抑制視網膜GFAP水平的影響。(B)西方墨點顯示視網膜中GFAP的表達水平。在條形圖中，GFAP的表達水平以GAPDH表達的比例表示。假手術視網膜的值設置為1。結果表示三次獨立實驗的平均值±SD。* P<0.05。** P<0.01。比例尺：50微米(50μm)。

圖7、視神經擠壓後以木蝴蝶素處理降低視網膜中iNOS和COX-2的表達水平。(A)木蝴蝶素在視神經擠壓後2週在視網膜中抑制iNOS和COX-2的影響。(BC)圖(A)的定量分析。在條形圖中，iNOS和COX-2的表達水平以GAPDH表達的比例表示。假手術視網膜的值設置為1。結果表示三次獨立實驗的平均值±SD。* P<0.05。

本發明涉及預一種醫藥組合物用於製備治療、減少、預防或改善視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含治療有效劑量的木蝴蝶素或其醫藥學上可接受的鹽、互變異構體、立體異構體或對映異構體作為活性成分。

以下之實施例非為限定用途，僅用以呈現此發明之多種面向。

材料及方法

動物和倫理聲明

在本研究中使用了五十四隻體重為150±180克(7±8週齡)的成年雄性Wistar大鼠(表1)。大鼠從台灣BioLASCO有限公司的種群中獲得。在進行外科手術之前，將動物在該環境中維持至少1週。將其保存在環境受控的房間中，保持在23±1℃，濕度為55±5%的溫度，並且具有12小時光±暗循環(光照時間：上午7點至晚上7點)。大鼠可以自由獲得食物和水。根據視力與眼科研究協會(ARVO)在眼科和視力研究中使用動物聲明進行動物護理和實驗程序。慈濟大學機構動物護理與使用委員會(IACUC)批准了所有動物實驗(No.104096)。使用總共54隻大鼠，並且所有大鼠存活直到完成預定方案。

麻醉和安樂死

所有操作均在肌內註射氯胺酮(100毫克/公斤體重(BW))和賽拉嗪(10毫克/公斤BW；Sigma，St Louis，Mo.，USA)的混合物和動物誘導的全身麻醉下進行在手術期間和手術後保持溫暖。此外，使用局部0.5%的可卡因滴眼劑(Alcon，Puurs，Belgium)。在外科手術後立即應用局部Tobradex眼膏(Alcon，Puurs，Belgium)。動物保健人員和獸醫人員每天監測動物健康。大鼠係藉由暴露於每分鐘置換20%室內空氣(5公升/分鐘)速率的二氧化碳中，於具有木削鋪墊的籠中安樂死。所有努力都是為了盡量減少痛苦。

視神經擠壓和損傷實驗

如先前報告所述誘發視神經擠壓損傷。Chien JY,Sheu JH,Wen ZH,Tsai RK,Huang SP.Neuroprotective effect of 4-(Phenylsulfanyl)butan-2-one on optic nerve crush model in rats.Experimental eye research.2016；143：148-57.Epub 2015/10/17。簡言之，將大鼠全身麻醉，用局部用0.5%的可卡因滴眼液進一步麻醉眼睛。用Vannas剪刀切開結膜以暴露視神經。注意避免損壞視神經周圍的小血管。透過用血管夾(60g微血管夾，World Precision Instruments，FL，USA)將視神經於眼球2毫米後部擠壓30秒而引入損傷。手術後，給予Tobradex眼軟膏(Alcon，Puurs，Belgium)。將大鼠保持在監測下，並在37℃的電加熱板上進行恢復。透過以相同的方式暴露視神經而不經擠壓來進行假手術。Oroxyiln A(15毫克/公斤在0.2毫升磷酸緩衝鹽)或磷酸緩衝鹽(PBS對照組)通過皮下注射直接施用 於視神經擠壓損傷後。

閃光視覺誘發電位(Flash visual-evoked potentials，FVEP)

關於視神經功能的評估，在18隻實驗大鼠的視神經破碎後2周記錄FVEPs。對評估FVEP中的組別進行掩蔽。以立體定向座標(bregma-8毫米，lateral 3毫米)在視覺皮層上透過2毫米直徑的顱切開術將一隔離的銀板電極進行外部放置和ohlsson等人所述的改進方法，通過視覺皮層通過2毫米直徑的開顱手術將隔離的銀板電極放置在硬膜外方面。Ohlsson M,Mattsson P,Svensson M.A temporal study of axonal degeneration and glial scar formation following a standardized crush injury of the optic nerve in the adult rat.Restorative neurology and neuroscience.2004；22(1)：1-10.Epub 2004/04/21。使用視覺電診斷系統(UTAS-E3000，LKC Technologies，Gaithersburg，MD，USA)來測量FVEPs。Chien JY,Sheu JH,Wen ZH,Tsai RK,Huang SP.Neuroprotective effect of 4-(Phenylsulfanyl)butan-2-one on optic nerve crush model in rats.Experimental eye research.2016；143：148-57.Epub 2015/10/17；Tsai RK,Chang CH,Wang HZ.Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.Experimental eye research.2008；87(3)：242-50.Epub 2008/07/08。在光照適應10分鍾後，進行了明視FVEP，根據報告顯示在Wistar大鼠中明視和暗視VEP之間的潛伏期無明顯差異。Heiduschka P,Schraermeyer U.Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials.Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology=Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie.2008；246(11)：1559-73.Epub 2008/07/26。所述設置是背景照明，Ganzfeld 0db的閃光強度，快閃率為1.9hz的單次閃光，測試平均值為80°，在50mv下剔除偽像的閾值以及2000hz的採樣率。對組間的FVEP的第一個正波(P1)的延遲時間進行比較(各組之n=6)。

使用螢光金(Fluorogold，FG)進行視網膜神經節細胞的逆行標記及視網膜神經節細胞密度。詳細程式已經在先前的報告中有所描述。Chien JY,Sheu JH,Wen ZH,Tsai RK,Huang SP.Neuroprotective effect of 4-(Phenylsulfanyl)butan-2-one on optic nerve crush model in rats.Experimental eye research.2016；143：148-57.Epub 2015/10/17；Tsai RK,Chang CH,Wang HZ.Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.Experimental eye research.2008；87(3)：242-50.Epub 2008/07/08。簡言之，在犧牲之前一周以FG逆行標記視網膜神經節細胞，以避免將標記的視網膜神經節細胞與染料產生的巨噬細胞和微膠質細胞混合而過度計數視網膜神經節細胞。Huang TL,Huang SP,Chang CH,Lin KH,Sheu MM,Tsai RK.Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.Ophthalmic research.2014；51(4)：173-8.Epub 2014/03/26。使用氯胺酮(ketamine，100毫克/公斤)和賽拉嗪(xylazine，10毫克/公斤)混合物將大鼠麻醉，然後置於立體定向裝置(Stoelting，Wood Dale，IL，USA)中。將1.5毫升的5%FG(螢光鉻，Fluorochrome，Denver，CO，USA)量注入每一側的上層中。標記一周後， 在動物安樂死後收穫眼球。將眼球置於10%福爾馬林中，然後仔細切開整個視網膜並壓平。使用設置有一濾波器組(激發濾光片：350±400nm；屏障濾波器：515nm)的400表面螢光顯微鏡(Axioskop；Carl Zeiss Meditec.Inc。，Jena，Germany)檢查視網膜，以及數位相機(Axiocam MRm)和軟件(Axiovision 4.0)。以1或3毫米的距離對視網膜神經節細胞進行檢查(Fihe視網膜檢查視網膜神經節細胞距離中心1或3毫米的距離，以分別提供中央和中周視網膜神經節細胞密度，計數8個在每個視網膜的中央(約40%的中央區域)和中周(約30%的中周)區域(每組n=6)隨機選擇的區域(38250平方微米；225x17微米)，這些區域的平均值被視為每個視網膜視網膜神經節細胞的平均密度，視網膜神經節細胞存活百分比定義為每個治療組中的視網膜神經節細胞數除以假手術視網膜中視網膜神經節細胞的數目乘以100。

Brn3a標記的視網膜舖片

將動物安樂死，將眼睛摘除並在10%福爾馬林中固定1小時。如前所述，對視網膜平台進行Brn3a的免疫熒光染色。Tual-Chalot S,Allinson KR,Fruttiger M,Arthur HM.Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo.2013；(77)：e50546。簡言之，用PBS洗滌舖片，並用封閉緩衝液(含有0.3% Triton-X和5%胎牛血清的PBS)封閉1小時。然後將舖片與第一單株抗體Brn3a(1：200；Santa Cruz，CA，USA)培養24小時，用PBS洗滌並用第二抗體Alexa flour 488(1：400；Life Technologies，OR，USA)並培育過夜。對於涵蓋中央和中周區域的每個視網膜舖片，都拍攝了8到10個顯微照片。

視神經和視網膜樣品製備

視神經準備。視交叉和眼球之間的視神經(5±7毫米長)片段在實驗後兩週處死後獲得。該神經立即於-70℃冷凍以進行後續免疫組織化學研究。視網膜準備。於犧牲後，取下角膜，晶狀體和玻璃體。將含有鞏膜和視網膜的剩餘角膜在室溫下固定在4%多聚甲醛中2小時。每個視網膜皮質被切成兩片。然後將組織在30%蔗糖中脫水過夜並保持在-20℃，直到進行進一步處理以進行切片。

末端脫氧核苷酸轉移酶切口末端標記(Terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL)測定

為了確保使用對等的視野進行比較，所有的視網膜冷凍切片都採用與ONH 1±2毫米距離的視網膜製備。進行TUNEL反應(DeadEndTM fluorometric TUNEL System,Promega Corporation,Madison,WI,USA)以檢測凋亡細胞。在10個高倍數視野(HPF,x400 magnification)中對每個樣品的視網膜神經節細胞層中的TUNEL陽性細胞進行計數，並且對每個眼睛的3個切片進行平均。(Tsai RK,Chang CH,Wang HZ.Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.Experimental eye research.2008；87(3)：242-50.Epub 2008/07/08)。

在視神經和視網膜中的免疫組織化學

使用單株抗體(ED1,1：50；AbD Serotec,Oxford,UK)或多株抗體(GFAP,1：200；Cambridge,MA,USA)於視神經進行ED1(CD68，一巨噬 細胞(macrophage)/小神經膠質細胞(microglia)的標記)的免疫組織化學，於視網膜進行GFAP的免疫組織化學。簡言之，將視神經和視網膜的冷凍縱截面以丙酮在-20℃下固定30分鐘，並用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的5%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)封閉15分鐘。施以抗ED1抗體(1：50 AbD Serotec，Oxford，UK)，並在4℃下反應過夜。於室溫施以與異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate(FITC)，1：100，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，USA)綴合的二抗1小時。使用DAPI(1：1000，Sigma，St.Louis，MO，USA)進行複染。為了比較，在視神經的病變部位(每組n=6)的6個HPF中計數ED1陽性細胞。

免疫印跡分析

以經修飾的放射免疫沉澱(radioimmunoprecipitation，RIPA)緩衝液製備來自大鼠視網膜的總視網膜蛋白質提取物。使用二喹啉酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質測定試劑盒(Pierce)測定蛋白質濃度。每個視網膜視作一獨立樣本(每組n=3)。將含有50微克蛋白質的蛋白質樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠上分離，並轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)上。在加入含5%乾脫脂乳的TBST緩衝液(0.02M Tris-base,pH 7.6,0.8% NaCl,0.1% Tween 20)反應30分鐘後，將膜於抗GFAP抗體(1：1000；Abcam，Cambridge MA，USA)，抗iNOS抗體(1：100；Cell signaling Inc.Beverly，MA，USA)和抗COX-2初級抗體(1：100；Santa Cruz，CA，USA)於4℃反應過夜。經洗滌後，將印跡在適當的抗辣根過氧化物酶綴合 的二抗(1：10000；Bio-Rad)中在室溫下反應1小時。以增強的化學發光(ECL)系統(Amersham Biosciences)檢測膜上的蛋白質。並以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1：3000；Sigma-Aldrich)的抗體作為內部負載對照來探側印跡。使用ImageJ軟件進行光密度分析。每個實驗以來自不同動物的獨立視網膜樣品重複三次。為了比較，假手術組視網膜上的GFAP，iNOS或COX-2信號/GAPDH信號的比例視做為1.0倍。

統計分析

所有測量均以掩蔽方式(masked fashion)進行。數據表示為平均值±標準偏差(SD)。使用商業軟件(IBM SPSS Statistics 19，International Business Machine Corp.，Armonk，NY)進行統計分析。Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney U檢驗用於各組之間的比較。在所有情況下，p<0.05的值被認為具有統計學意義。

實施例1：木蝴蝶素投藥增強了視神經擠壓損傷後視網膜神經節細胞存活率

為了評估木蝴蝶素對視神經損傷後視網膜神經節細胞存活的影響，進行對假手術組、擠壓損傷以PBS處理組、以及擠壓損傷以木蝴蝶素處理組中的大鼠視網膜的逆行標記視網膜神經節細胞進行形態學分析。假手術組於中央及中周視網膜的視網膜神經節細胞密度分別為2577±383/平方毫米和1550±325/平方毫米。視神經擠壓損傷兩週後，木蝴蝶素處理組和PBS處理組中央視網膜之視網膜神經節細胞密度分別為1352±476/平方毫米(存活率52.5%)和510±158/平方毫米(存活率19.8%)，於中周視網膜 分別為960±465/平方毫米(存活率61.9%)和439±139/平方毫米(存活率28.3%)(圖1)。木蝴蝶素治療組中央和中周視網膜中視網膜神經節細胞密度相較於PBS處理組皆具顯著差異(n=6，P<0.05)。結果表明，與PBS處理組相比，於木蝴蝶素處理組視網膜神經節細胞存活率在中央視網膜增加約32.7%，中周視網膜增加33.6%。這些結果清楚地表明了木蝴蝶素在視神經粉碎後顯著促進視網膜神經節細胞的神經保護作用。

此外，為了驗證視網膜神經節細胞存活率，使用Brn3a於整個視網膜鋪片上進行了免疫染色(圖2)。假手術組眼睛的中央和中周視網膜Brn3a+細胞的密度分別為1378±253/平方毫米和1095±142/平方毫米。木蝴蝶素處理組和PBS處理組中央視網膜Brn3a的密度分別為847±367/平方毫米(存活率64.9%)和475±203/平方毫米(存活率34.5%)，而於外周視網膜分別為801±199/平方毫米(存活率73%)和474±254/平方毫米(存活率43.2%)(圖2)。木蝴蝶素治療組中央和中周視網膜中視網膜神經節細胞密度相較於PBS處理組皆具顯著差異(n=6，P<0.001)。此結果表明，與PBS治療組相比，木蝴蝶素治療組視網膜神經節細胞存活率在中央視網膜中增加約30.4%，中周視網膜增生29.7%。這些結果清楚地表明，木蝴蝶素在視神經擠壓損傷後顯著促進視網膜神經節細胞的神經保護作用。

實施例2：在木蝴蝶素處理組中P1振幅的改善

為了評估視覺功能，評估了在視神經擠壓損傷後兩週內FVEP中P1潛伏期的變化。在假手術組中，P1波的潛伏期為85±15毫秒。在PBS處理組中，P1的潛伏期延遲到154±31毫秒。在木蝴蝶素處理組中P1波 的潛伏期為100±12毫秒(圖3)。在PBS處理組中P1波的潛伏期比在木蝴蝶素處理組中更顯著延遲(每組n=6，p<0.05)。FVEP結果表明，在視神經擠壓後2週時木蝴蝶素處理組相較於PBS處理組顯著保持視覺功能。

實施例3：在木蝴蝶素處理的視網膜中的視網膜神經節細胞層中的TUNEL陽性細胞的數目減少

TUNEL檢測顯示，假手術組大鼠TUNEL陽性細胞/HPF(高倍視野)為1.2±0.9個細胞，PBS處理組為11.0±3.5陽性細胞/HPF(p<0.001 vs假手術組)，以及木蝴蝶素處理組大鼠視網膜神經節細胞層中的4.0±2.4(p<0.05對PBS處理組)陽性細胞/HPG(圖4)。如圖3所示，PBS處理組的視網膜神經節細胞層中TUNEL陽性細胞數明顯增加，而木蝴蝶素減少了TUNEL陽性細胞數，表明施用木蝴蝶素在視神經擠壓損傷後對視網膜神經節細胞具有顯著的抗凋亡作用。

實施例4：木蝴蝶素在視神經擠壓損傷後降低了視神經中的ED-1陽性細胞

在視神經擠壓損傷後兩週，ED1陽性細胞在PBS處理組(72.0±23.3細胞/HPF)的視神經損傷部位突出，並且在木蝴蝶素處理後視神經中ED1陽性細胞/HPF浸潤明顯較少(ON 33.5±16.3個細胞/HPF)(圖5)。這些結果表明，木蝴蝶素的施用於視神經在損傷後具有抗炎作用，如較少的ED-1標記的巨噬細胞/微膠質細胞積聚在視神經所證明的。

實施例5：木蝴蝶素減少了擠壓損傷後視網膜中GFAP的上調

GFAP是視網膜神經元變性響應的視網膜膠質增生的敏感標 誌物。通常僅在正常視網膜神經節細胞層的星形膠質細胞中觀察到GFAP免疫反應性(圖6)。視神經擠壓損傷導致內視網膜中GFAP免疫反應性染色顯著增加。在擠壓損傷的木蝴蝶素治療組中，增強的GFAP水平顯著降低。(與ON-粉碎，PBS處理組相比，p<0.05)。

實施例6：促炎細胞因子、iNOS和COX-2表達的抑制

在視神經擠壓後兩週，PBS處理的視網膜中iNOS和COX-2(圖7)的表達水平顯著升高。木蝴蝶素處理抑制由視神經損傷引起的iNOS和COX-2表達的增加。這些結果表明，木蝴蝶素減輕了視神經壓傷後視網膜中升高的促炎細胞因子、iNOS和COX-2的表達。

為使此發明所屬技術領域中具有通常知識者得以了解製作以及使用這項技藝的方法，此發明已描述並已充分詳細舉例說明，然而，各式各樣的變體，修改或改進應被視為無異於此項發明之精神與範圍。

本發明所屬技術領域中具有通常知識者易於理解並實現本發明之目的，並獲得先前所提到之結果及優點。本發明所使用之細胞，動物以及生產它們的過程和方法乃代表最佳實施例，乃示例性質，而不作為限制本發明的範圍用途。本領域的技術人員與製作或使用此項技藝時所將產生之修改或其他用途皆涵蓋於本發明的精神內，並且由權利範圍所限定。

Claims (9)

1. 一種醫藥組合物用於製備治療、減少或改善創傷性視神經病變後的視覺功能退化之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含治療有效劑量的木蝴蝶素或其醫藥學上可接受的鹽作為活性成分。
2. 如申請專利範圍1所述的用途，其中該創傷性視神經病變後的視覺功能退化係與細胞之凋亡有關。
3. 如申請專利範圍2所述的用途，其中所述細胞為視網膜神經節細胞。
4. 如申請專利範圍1所述的用途，其中該創傷性視神經病變進一步引起炎症。
5. 如申請專利範圍4所述的用途，其中所述炎症係與巨噬細胞或微膠質細胞啟動相關。
6. 如申請專利範圍4所述的用途，其中所述炎症係與神經膠質增生相關。
7. 如申請專利範圍4所述的用途，其中所述炎症係與一種或多種促炎因數表達相關。
8. 如申請專利範圍7所述的用途，其中該促炎因數係為iNOS表達。
9. 如申請專利範圍7所述的用途，其中該促炎因數係為COX-2表達。

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