CN116322664A

CN116322664A - 神经保护的方法及其用途

Info

Publication number: CN116322664A
Application number: CN202180068223.XA
Authority: CN
Inventors: M·M·雅布隆斯基
Original assignee: Ocuro Therapy Co ltd
Current assignee: University of Tennessee Research Foundation
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2023-06-23
Also published as: US20240156765A1; IL300724A; AU2021329413A1; EP4199905A1; US20240041808A1; JP2023541372A; WO2022040622A1; CA3189273A1

Abstract

本发明涉及一种在有需要的受试者中预防眼部神经变性的方法。

Description

神经保护的方法及其用途

本申请要求于2020年8月21日提交的美国临时申请号63/068,917的优先权，其全部内容以引用方式并入本文。

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均特此通过引用以其全文并入本文。这些出版物的公开内容特此以全文引用的方式并入本申请中，以便更全面地描述自本文所描述和要求保护的发明的日期起本领域技术人员已知的现有技术的状态。

政府利益

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号R43EY029909和R24EY029950在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

背景技术

青光眼是导致世界上不可逆失明的主要原因。这种疾病现在在美国影响了超过300万人，并且随着预计寿命的增加，到2050年该数字可增加至约630万人。成人发病型青光眼有四种主要类型，所有这些类型最终都会引起视网膜神经节细胞(RGC)功能障碍和/或凋亡，进而导致视力受损。有趣的是，每种形式的青光眼都可与多种且有时不同的危险因素相关，表明存在导致RGC凋亡的多种触发机制。就四种成人发病型青光眼亚型中的三种类型而言，升高的眼内压(IOP)是RGC凋亡后视野缺损的最显著预测危险因素。第四亚型(即正常眼压性青光眼)与高IOP无关，并且引发RGC凋亡的因素在很大程度上是未知的。

成人发病型青光眼的现行标准治疗包括，使用降IOP药物作为局部递送的滴眼剂来进行治疗。所有目前经FDA批准的青光眼药物的主要缺陷是功效有限。具体地，在许多青光眼患者中，IOP降低不能完全预防RGC凋亡及其导致的视野缺损。

发明内容

本发明的一个方面涉及受试者中治疗青光眼的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)。在实施方案中，该眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。在实施方案中，神经保护作用影响了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。在实施方案中，将该组合物局部施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物施用于受试者的一只眼睛或两只眼睛。在另一个实施方案中，该局部施用的组合物通过滴眼剂施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物每天施用一次。在一个实施方案中，该组合物包含微乳液(ME)制剂。在另一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。在另一个实施方案中，该微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。在另一个实施方案中，该多重微乳液包含：a.内部相，该内部相包含水性溶液(W₁)，该内部相被包覆在内部乳化剂内；b.中间油相(O)，该中间油相包覆内部相，该中间油相被包覆在外部乳化剂内；和c.外部水相(W₂)，该外部水相包围外部乳化剂。在另一个实施方案中，中间油相(O)包含内部乳化剂。在另一个实施方案中，内部乳化剂包含caproyl 90、卵磷脂或它们的组合。在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。在一个实施方案中，外部水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，ME被配制为局部制剂。在另一个实施方案中，多重微乳液还包含油相(O)中的不溶性或微溶性药物。在一个实施方案中，多重微乳液还包含水性溶液(W₂)中的水溶性药物。在实施方案中，眼用组合物或微乳液制剂以单剂量施用。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂连续给药。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。

本发明的一个方面涉及预防(诸如防止)青光眼诱导的神经变性的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)。在实施方案中，该眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。在实施方案中，神经保护作用影响了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。在实施方案中，将该组合物局部施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物施用于受试者的一只眼睛或两只眼睛。在另一个实施方案中，该局部施用的组合物通过滴眼剂施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物每天施用一次。在一个实施方案中，该组合物包含微乳液(ME)制剂。在另一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。在另一个实施方案中，该微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。在另一个实施方案中，该多重微乳液包含：a.内部相，该内部相包含水性溶液(W₁)，该内部相被包覆在内部乳化剂内；b.中间油相(O)，该中间油相包覆内部相，该中间油相被包覆在外部乳化剂内；和c.外部水相(W₂)，该外部水相包围外部乳化剂。在另一个实施方案中，中间油相(O)包含内部乳化剂。在另一个实施方案中，内部乳化剂包含caproyl 90、卵磷脂或它们的组合。在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。在一个实施方案中，外部水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，ME被配制为局部制剂。在另一个实施方案中，多重微乳液还包含油相(O)中的不溶性或微溶性药物。在一个实施方案中，多重微乳液还包含水性溶液(W₂)中的水溶性药物。在实施方案中，眼用组合物或微乳液制剂以单剂量施用。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂连续给药。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。

本发明的一个方面涉及在受试者中减少视野缺损的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)。在实施方案中，该眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。在实施方案中，神经保护作用影响了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。在实施方案中，将该组合物局部施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物施用于受试者的一只眼睛或两只眼睛。在另一个实施方案中，该局部施用的组合物通过滴眼剂施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物每天施用一次。在一个实施方案中，该组合物包含微乳液(ME)制剂。在另一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。在另一个实施方案中，该微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。在另一个实施方案中，该多重微乳液包含：a.内部相，该内部相包含水性溶液(W₁)，该内部相被包覆在内部乳化剂内；b.中间油相(O)，该中间油相包覆内部相，该中间油相被包覆在外部乳化剂内；和c.外部水相(W₂)，该外部水相包围外部乳化剂。在另一个实施方案中，中间油相(O)包含内部乳化剂。在另一个实施方案中，内部乳化剂包含caproyl 90、卵磷脂或它们的组合。在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。在一个实施方案中，外部水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，ME被配制为局部制剂。在另一个实施方案中，多重微乳液还包含油相(O)中的不溶性或微溶性药物。在一个实施方案中，多重微乳液还包含水性溶液(W₂)中的水溶性药物。在实施方案中，眼用组合物或微乳液制剂以单剂量施用。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂连续给药。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。

本发明的一个方面涉及降低眼内压以及预防眼部神经变性的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)。在实施方案中，该眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。在实施方案中，神经保护作用影响了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。在实施方案中，将该组合物局部施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物施用于受试者的一只眼睛或两只眼睛。在另一个实施方案中，该局部施用的组合物通过滴眼剂施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物每天施用一次。在一个实施方案中，该组合物包含微乳液(ME)制剂。在另一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。在另一个实施方案中，该微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。在另一个实施方案中，该多重微乳液包含：a.内部相，该内部相包含水性溶液(W₁)，该内部相被包覆在内部乳化剂内；b.中间油相(O)，该中间油相包覆内部相，该中间油相被包覆在外部乳化剂内；和c.外部水相(W₂)，该外部水相包围外部乳化剂。在另一个实施方案中，中间油相(O)包含内部乳化剂。在另一个实施方案中，内部乳化剂包含caproyl90、卵磷脂或它们的组合。在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。在一个实施方案中，外部水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，ME被配制为局部制剂。在另一个实施方案中，多重微乳液还包含油相(O)中的不溶性或微溶性药物。在一个实施方案中，多重微乳液还包含水性溶液(W₂)中的水溶性药物。在实施方案中，眼用组合物或微乳液制剂以单剂量施用。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂连续给药。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。

本发明的一个方面涉及向有需要的受试者的眼睛提供神经保护作用的方法，这些方法包括向受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)。在实施方案中，该眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。在实施方案中，神经保护作用影响了视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。在实施方案中，将该组合物局部施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物施用于受试者的一只眼睛或两只眼睛。在另一个实施方案中，该局部施用的组合物通过滴眼剂施用。在另一个实施方案中，将该局部施用的组合物每天施用一次。在一个实施方案中，该组合物包含微乳液(ME)制剂。在另一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。在另一个实施方案中，该微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。在另一个实施方案中，该多重微乳液包含：a.内部相，该内部相包含水性溶液(W₁)，该内部相被包覆在内部乳化剂内；b.中间油相(O)，该中间油相包覆内部相，该中间油相被包覆在外部乳化剂内；和c.外部水相(W₂)，该外部水相包围外部乳化剂。在另一个实施方案中，中间油相(O)包含内部乳化剂。在另一个实施方案中，内部乳化剂包含caproyl90、卵磷脂或它们的组合。在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。在一个实施方案中，外部水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，ME被配制为局部制剂。在另一个实施方案中，多重微乳液还包含油相(O)中的不溶性或微溶性药物。在一个实施方案中，多重微乳液还包含水性溶液(W₂)中的水溶性药物。在实施方案中，眼用组合物或微乳液制剂以单剂量施用。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂连续给药。在实施方案中，将眼用组合物或微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。

本发明的一个方面涉及降低眼内压(IOP)以及提供直接神经保护的方法，这些方法包括施用靶向由Cacna2dq基因编码的电压依赖性钙通道α2δ1亚基(CACNA2D1)蛋白的治疗剂。

本发明的其他目的和优点将从随后的描述中变得显而易见。

附图说明

图1示出了近端Chr 5上的IOP调节QTL。Cacna2d1被鉴定为IOP调节基因(Chintalapudi等人，Nature Communications 8,1755(2017))。

图2表明CACNA2D1定位于睫状体、施累姆氏管(Schlemm’s canal)和小梁网(Chintalapudi等人，Nature Communications 8,1755(2017))。

图3表明CACNA2D1定位于视网膜神经节细胞(RGC)(红色箭头)及其在神经纤维层(NFL)中的轴突(白色箭头)(小图A和小图B)。它还存在于视神经(ON)(黑色箭头)和包围该神经的髓鞘(白色箭头)的RGC轴突束中(小图C)。

图4表明在BXD29小鼠中，IOP(圆圈)在该小鼠的整个生命中相对恒定，而ON中的轴突过早坏死(2个月-5个月)。

图5表明B6小鼠的基线IOP(15.83mmHg+0.73mmHg)和BXD29小鼠的基线IOP(16.25mmHg+0.25mmHg)在5周龄时没有显著差异。与B6不同，BXD29小鼠的IOP对局部PRG-ME无反应(n＝5只小鼠/条件)。

图6表明在根据(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))改性的粘性介质中，与PRG相比，PRG-ME(正方形)极大地改善了药物功效。

图7表明与空白ME相比，用PRG-ME(实心方块)每天一次给药持续21天可将IOP保持在较低的生理范围内。未检测到耐药性(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图8表明在用ME局部给药(每天给药，持续21天)后，PRG到达视网膜(最右侧)(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图9表明用PRG ME局部每天给药保护了ON中的RGC轴突免于变性。在5周龄(小图A)时，BXD29小鼠的ON是健康的。在用我们的PRG ME每天局部给药持续6周后(小图B)，ON的结构得到良好保持并且类似于预治疗对照。明显相反，用空白ME给药持续6周的小鼠(小图C)的ON轴突已发生变性。

图10的示意图表明，不希望受理论束缚，PRG(普瑞巴林)与CACNA2D1(红色)的结合导致钙通道的α1孔限制Ca²⁺流入RGC及其轴突中。

图11示出了用我们的普瑞巴林微乳液治疗60天的荷兰黑带兔的健康视神经。

图12表明PRG ME具有不同多层结构，如通过透射电子显微镜(TEM)所示(Ibrahim，M.等人。ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图13表明PRG ME(正方形)使PRG释放延长>24小时(与滴眼剂(圆圈)或水(星号)相比)。

图14示出了说明ME合成的流程图。

图15示出了ME的模拟图，其中水相用蓝色表示，油相用褐色表示。

图16表明在第一次给药PRG ME后，IOP在荷兰黑带兔中的剂量保持在降低的水平持续21天。接受空白ME的眼睛保持在升高的基线IOP(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图17表明在给药21天后，荷兰黑带兔的眼睛看起来健康(Ibrahim，M.等人，ACSNano 13,13728-13744(2019))。

图18示出了用我们的普瑞巴林微乳液治疗60天的兔的视神经乳头的最小杯状。

图19示出了在用普瑞巴林微乳液治疗60天的荷兰黑带兔的眼睛中杯盘比<0.4的眼底图像。

图20示出了正常荷兰黑带兔眼神经横截面的图像，其中受损区域被圈出。

图21示出了在正常荷兰黑带兔的眼中杯盘比>0.7的图像。

图22示出了来自荷兰黑带兔(其用我们的普瑞巴林微乳液治疗)的眼睛隔室中的普瑞巴林浓度。

图23示出了荷兰黑带兔的经治疗的眼睛与正常眼睛之间的杯盘比的图。

图24表明局部施用的普瑞巴林水溶液使眼内压(IOP)降低20％，但IOP在给药后7小时恢复至基线。

图25表明在荷兰黑带兔中用ME局部给药(每天给药，持续21天)后，PRG到达视网膜(绿色)(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图26表明在用ME局部给药(每天给药，持续21天)后，最小限度的PRG到达荷兰黑带兔的对侧眼睛(Ibrahim，M.等人，ACS Nano 13,13728-13744(2019))。

图27表明在对荷兰黑带兔的眼睛第一次给药PRG ME后，IOP保持在降低的水平持续60天。接受空白ME的对侧眼睛保持在升高的基线IOP。

图28表明在给药60天后，荷兰黑带兔的眼睛看起来是健康的。

图29示出了在仅接受空白ME持续60天的荷兰黑带兔的对侧眼睛中杯盘比<0.4的眼底图像。

图30示出了荷兰黑带兔的经治疗的眼睛和正常眼睛之间的杯盘比的图。

图31示出了用空白微乳液治疗60天的荷兰黑带兔的对侧眼睛中的健康视神经。

图32示出了用空白微乳液治疗60天的荷兰黑带兔的对侧眼睛的视神经乳头的最小杯状。

图33示出了正常荷兰黑带兔的视神经乳头的大且深的杯状。

图34表明了来自荷兰黑带兔的外周器官中的普瑞巴林浓度，其中该兔的一只眼睛和对侧眼睛均用空白微乳液治疗60天。

图35表明BXD29小鼠的IOP未响应于局部普瑞巴林微乳液长达6周的每天给药。给药和未给药的眼睛的IOP在所有时间点都是统计学上相同的。

图36示出了在图35所述条件下的坏死的轴突数目的图(n＝6只小鼠/条件)。

图37示出了共聚焦显微图像。钙通道亚基CACNA2D1和CACNA2D2在睫状体(CB)、小梁网视网膜和视神经乳头(ONH)中表达。将1月龄的完整C57B1/6J小鼠的切片针对普瑞巴林钙电压门控通道辅助亚基α2δ1(CACNA2D1，红色)和钙电压门控通道辅助亚基α2δ2(CACNA2D2，绿色)的两个靶点进行免疫标记。核用DAPI(蓝色)标记。小图A至小图C)通过睫状体的切片。小图D至小图F)通过视神经乳头的视网膜切片。比例尺＝20mm。

图38示出了其中免疫组织化学用于表明CACNA2D1在视网膜中的定位的图像。CACNA2D1蛋白存在于内部丛状层(IPL)和光感受器中。

图39示出了普瑞巴林浓度的图。在用我们的ME局部给药后，普瑞巴林到达视网膜和ON。

图40示出了用于对DB兔的眼睛产生爆炸损伤的OBI装置。

图41示出了IOP测量的图。IOP从基线直到损伤后7周都没有发生变化。数据来自50psi爆炸压力。

图42示出了图形视网膜电图(PERG)的图。PERG振幅瞬时增加，随后在损伤后2周后迅速降低。数据来自50psi爆炸压力。

图43示出了杯/盘比的图。到损伤后2周时，杯盘比稳定地增加，这可以指示RGC轴突受损。数据来自50psi爆炸压力。

图44示出了组织学图像。具有升高的IOP的9月龄的正常DB兔出现ON损伤和ONH杯状。

图45示出了组织学图像。用普瑞巴林ME治疗2个月的9月龄的兔未出现ONH杯状的ON损伤。

图46示出了显微镜图像。将Ca²⁺指示剂装载到RGC中(小图A)。RGC轴突(小图B以及小图C中的正方形)和胞体(小图B以及小图E中的圆圈)的更高放大倍数。轴突束(小图D)和单个RGC(小图F)中的K⁺诱导。Ca²⁺瞬变显示为紫色。

具体实施方式

本发明的各个方面涉及对有需要的受试者预防眼部神经变性的方法。

本文提供了一个或多个实施方案的具体实施方式。然而，本发明可以各种形式来体现。因此，本文所公开的具体细节不应被解释为限制性的，而是作为权利要求书的基础并且作为教导本领域技术人员以任何适当的方式来采用本发明的代表性基础。

除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(one or more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。

无论本文何处使用了“例如”、“诸如”、“包含”等短语，除非另有明确说明，否则短语“和但不限于”可紧随其后。类似地，“示例”、“示例性”等为非限制性的。

术语“基本上”允许与对预期目的不产生负面影响的描述符的偏离。即使“基本上”一词没有明确地列举出来，描述性术语也可由术语“基本上”修饰。

术语“包括(comprising)”和“包含(including)”和“具有(having)”和“涉及(involving)”(和类似地“包括(comprises)”、“包含(includes)”、“具有(has)”和“涉及(involves)”)等可互换使用且具有相同含义。具体地，这些术语中的每个术语被定义成与“包括”的通用美国专利法定义一致，并且因此应被解释为意指“至少以下”的开放术语，并且还应被解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“涉及步骤a、b和c的过程”意指包含至少步骤a、b和c的过程。无论什么情况下使用术语“一个”或“一种”，除非这种解释在上下文中是没有意义的，否则应理解为“一个或多个/一种或多种”。

如本文所用，本文中使用术语“约”意指大约、大致、左右或在其区域中。当结合数值范围使用术语“约”时，该术语通过扩展所阐述的数值以上和以下的界限来修改所述范围。通常，本文中使用术语“约”按向上或向下(更高或更低)例如20％的变化来修饰所述值以上和以下的数值。

本发明的各个方面涉及预防(诸如防止)眼部神经变性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含普瑞巴林(PRG)的组合物。如本文所用，“神经变性”可以指视网膜神经节细胞(RGC)和/或视神经的凋亡/功能障碍。例如，神经变性可由本领域技术人员使用视野测试来测量。例如，神经变性可由本领域技术人员使用图形视网膜电图(pERG)测量RGC的功能来定量。

本发明的各个方面涉及提供神经增强和/或神经保护的方法。例如，实施方案可包括将包含普瑞巴林(PRG)的组合物施用于有需要的受试者。如本文所用，“神经增强”可以指神经组成部分的健康程度或性能的改善。“神经组成部分”的非限制性示例可以是视网膜神经节细胞或它们相应的轴突和光感受器。如本文所用，术语“神经保护”可以指预防神经元细胞凋亡。例如，施用本文所述的含普瑞巴林的ME可向有需要的受试者提供神经增强和/或神经保护作用。

本发明的各个方面涉及在受试者中治疗青光眼或提供神经保护作用的方法，该方法包括施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。本发明的各个方面涉及在受试者中减少视野缺损的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含PRG的眼用组合物。本发明的各个方面涉及降低眼内压以及防止神经变性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含PRG的眼用组合物。如本文所用，术语“眼用组合物”可以指配制用于眼部施用的任何组合物或化合物或者可用于治疗眼部疾病或障碍的任何组合物或化合物。

如本文所用，“有效量”可以指产生生物学应答的药物的剂量或浓度。

本发明的各个方面涉及向有需要的受试者的眼睛提供神经保护作用的方法。例如，实施方案可包括向受试者施用包含(PRG)的组合物。如本文所用，短语“神经保护作用”可以指预防和/或减少视网膜神经节细胞(RGC)和/或视神经的凋亡/功能障碍。例如，神经保护作用可由本领域技术人员使用视野测试来测量。例如，神经保护作用可通过本领域技术人员使用图形视网膜电图(pERG)测量RGC的功能来定量。在实施方案中，该组合物降低眼睛的眼内压(IOP)，同时提供神经保护作用。在实施方案中，该组合物提供神经保护作用，同时对IOP无影响。在实施方案中，神经保护作用与IOP的任何变化无关。

如本文所用，术语“施用”可以指将一种物质引入受试者中。可以使用任何施用途径，包括例如鼻内、局部、口服、肠胃外、玻璃体内、眼内、眼部、视网膜下、鞘内、静脉内、皮下、经皮、皮内、颅内等施用。在实施方案中，“施用”还可以指向受试者提供治疗有效量的制剂或药物组合物。本发明的制剂或药物化合物可单独施用，但也可与基于所选施用途径和标准制药实践选择的其他化合物、赋形剂、填充剂、粘合剂、载体或其他媒介物一起施用。施用可通过载体或媒介物的方式进行，诸如可注射溶液，包括无菌水性溶液或非水性溶液，或盐水溶液；霜剂；洗剂；胶囊剂；片剂；颗粒剂；球剂；散剂；悬浮液、乳液或微乳液；贴剂；胶束；脂质体；囊泡；植入物，包括微植入物；滴眼剂；其他蛋白质和肽；合成聚合物；微球；纳米粒子；等等。

可校准该制剂的不同形式以适应不同个体和单个个体的不同需要。然而，该制剂不需要针对每个个体的每种原因。相反，通过针对必要的原因，该制剂将使身体和大脑恢复其正常功能。然后身体和大脑自己会纠正剩余的不足。

术语“治疗有效量”可以指所施用的组合物或药物组合物的实施方案的量，该量可在一定程度上缓解正在治疗的疾病或病症的一种或多种症状，并且/或者可在一定程度上预防正在治疗的受试者患有或有风险患上的病症或疾病的一种或多种症状。

如本文可互换使用的，“受试者”、“个体”或“患者”可以指脊椎动物，例如哺乳动物，诸如人。哺乳动物可包括但不限于鼠类、猴类、人类、农场动物、竞技动物和宠物。术语“宠物”可包括狗、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、兔、雪貂等。术语农场动物可包括马、绵羊、山羊、鸡、猪、牛、驴、美洲驼、羊驼、火鸡等。

“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的佐剂”可以指可用于制备药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，该药物组合物是安全无毒的并且在生物学上或其他方面均无不良影响，并且可包含用于兽医使用和/或人类药物使用的可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂”可包括一种和多种此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。

短语“药物组合物”或“药物制剂”可以指适于施用于受试者(诸如哺乳动物，尤其是人)的组合物或药物组合物，并且可以指活性剂或成分与药学上可接受的载体或赋形剂的组合，使得该组合物适用于体外、体内或离体的诊断、治疗或预防用途。在“药物组合物”中，可以指该组合物是无菌的，并且不含可在受试者体内引起不期望反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药物级的)。药物组合物可以被设计用于通过多种不同的施用途径向有需要的受试者或患者施用，这些施用途径包括口服、鼻内、局部、静脉内、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、管内、肌肉内、皮下、通过支架洗脱装置、导管洗脱装置、血管内球囊、吸入装置等。

在实施方案中，该方法包括局部施用该组合物。例如，该组合物通过滴眼剂施用。

本发明的一个方面涉及每天多于3次、每天约3次、每天约两次、每天约一次、每两天约一次、每三天约一次、每4天约一次、每5天约一次、每6天约一次、每周约一次、每2周约一次、每3周约一次、每个月约一次、每2个月约一次、每3个月约一次、每4个月约一次、每五个月约一次、每6个月约一次、每7个月约一次、每8个月约一次、每9个月约一次、每10个月约一次、每11个月约一次、每年约一次或每年少于一次施用该组合物。

在一个实施方案中，该组合物包含微乳液。参见例如US2020/0383915。如本文所用，“微乳液”可以指由表面活性剂的界面膜稳定的一种液相进入另一种液相中的热力学稳定分散体。如本文所用，“表面活性剂”可以指具有疏水性部分和亲水性部分的合成和/或天然存在的两亲分子。例如，表面活性剂可以指乳化剂。如本文所用，“乳化剂”是指稳定乳液和/或微乳液的物质。例如，乳化剂可以指包含用于乳化或稳定油包水微乳液(W/O)或水包油(O/W)微乳液的一种或多种分子、化合物或成分的化合物。

在一个实施方案中，微乳液是多层微乳液。如本文所用，短语“多重微乳液”可以指称为不连续相(或中间相)的一种液体进入称为连续相(或外部相)的另一种液体的热力学稳定分散体，其中不连续相的液滴含有与称为内部相的连续相性质相同的较小液滴。例如，该多重微乳液是一种水包油包水型(W₁/O/W₂)微乳液，该微乳液包含：不连续相，该不连续相包含水性溶液(W₁)，该不连续相被包覆在内部乳化剂内；连续相油相(O)，该连续相油相包覆内部相，该连续相油被包覆在外部乳化剂内；和连续水相，该连续水相(W₂)包围外部乳化剂。如本文所用，“不连续相”可以指分散在连续相内并且与连续相不混溶，并且可与“中间相或油相”互换使用的成分。如本文所用，“连续相”可以指具有分散的不混溶相并且可与“外部相”互换使用的相。如本文所用，“内部相”可以指与外部相性质相同并且作为较小液滴分散在不连续相内的相。如本文所用，“内部乳化剂”可以指在位于内部相与中间相之间的界面处具有HLB值为3-7的疏水性表面活性剂。如本文所用，“外部乳化剂”可以指在位于中间相与外部相之间的界面处具有HLB值高于10的亲水性表面活性剂。亲水亲油平衡(HLB)可以指表面活性剂对水或油的亲和力程度。

在一个实施方案中，不连续的油相(O)包含内部乳化剂。例如，内部乳化剂包含caproyl 90、卵磷脂或它们的组合。

在一个实施方案中，不连续油相(O)包含不溶性或微溶性药物。

在一个实施方案中，水性溶液(W₂)包含水溶性药物。

在一个实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。

在一个实施方案中，连续水相(W₂)包含外部乳化剂和生物粘附聚合物。在一个实施方案中，生物粘附聚合物可以指黏膜粘附聚合物。

在一个实施方案中，该微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。如本文所用，术语“作用持续时间”可以指物质起效的时间长度。例如，将PRG置于微乳液中延长了PRG的降IOP和神经保护作用。例如，在没有微乳液的情况下，IOP降低约20％并且在约8至10小时后恢复至基线，而在有微乳液的情况下，IOP降低约40％并且直到给药后约>30小时才恢复至基线。

可将任何合适的疏水性内部乳化剂用于微乳液中。在各种非限制性实施方案中，内部乳化剂选自单辛酸丙二醇酯或亲水亲脂平衡(HLB)值为3-7的任何其他表面活性剂和/或任何脂肪酸的丙二醇酯，该任何脂肪酸诸如：单己酸丙二醇酯、单辛酸丙二醇酯、单癸酸丙二醇酯、单月桂酸丙二醇酯、单硬脂酸丙二醇酯、单棕榈酸丙二醇酯、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇十六烷基醚、单棕榈酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、单油酸脱水山梨糖醇酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、乙二醇单乙基醚P、月桂酸聚乙二醇甘油酯50/13(硬脂酸的PEG(MW 1500)单酯、二酯、三酯的混合物)、月桂酸聚乙二醇甘油酯44/14(月桂酸的PEG(MW 1500)单酯、二酯、三酯的混合物)、月桂酸聚乙二醇甘油酯43/01(脂肪酸Cs-Cis的PEG(MW 1500)单酯、二酯、三酯的混合物)和任何脂肪酸的任何PEG单酯、二酯、三酯，卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、生育酚或任何其他磷脂，以及它们的组合。

Capryol 90是具有HLB＝5的表面活性剂。其化学名为单辛酸丙二醇酯(辛酸的丙二醇单酯)。单辛酸丙二醇酯的替代物可以是HLB值为3-7的任何其他表面活性剂和/或任何脂肪酸的丙二醇酯，该任何脂肪酸诸如单己酸丙二醇酯、单辛酸丙二醇酯、单癸酸丙二醇酯、单月桂酸丙二醇酯、单硬脂酸丙二醇酯、单棕榈酸丙二醇酯、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇十六烷基醚、单棕榈酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、单油酸脱水山梨糖醇酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯等。

Labrasol是具有HLB值＝12的亲水性表面活性剂。其由小部分的甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯以及主要的辛酸和癸酸的聚乙二醇-8(MW 400)单酯和二酯组成。其化学名为辛酰己酰聚氧乙烯-8甘油酯、辛酰己酰聚乙二醇-8甘油酯或PEG-8辛酸/癸酸甘油酯。其替代物可以是具有HLB值(10-14)的任何其他亲水性表面活性剂和/或任何脂肪酸的聚乙二醇单酯和/或二酯。

Cremophor EL是具有HLB值＝14的亲水性表面活性剂。其化学名为聚乙二醇甘油蓖麻油酸酯、PEG-35蓖麻油、聚氧乙烯35氢化蓖麻油或聚氧乙烯-35蓖麻油。其替代物可以是具有HLB值(12-16)的任何其他亲水性表面活性剂和/或任何脂肪酸或脂肪酸混合物的聚乙二醇单酯和/或二酯。

卵磷脂是具有HLB值＝4-7的疏水性表面活性剂。其化学名为2-壬酰氧基-3-十八碳-9,12-二烯氧基丙氧基)-[2-(三甲基铵)乙基]次膦酸盐。它是天然磷脂的混合物，因此它的替代物可以是以下项中的一者：蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、生育酚或任何其他磷脂。

在一个实施方案中，内部乳化剂选自单辛酸丙二醇酯、卵磷脂以及它们的组合。

可将任何合适的水性溶液用于微乳液中。在各种非限制性实施方案中，水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。

可将任何合适的油相用于微乳液中。在各种非限制性实施方案中，油相选自由以下项组成的油：辛酸(Cs)和癸酸(Cio)的中链甘油三酯；任何纯脂肪酸酯，包括但不限于脂肪酸乙酯、脂肪酸丙酯、脂肪酸异丙酯和脂肪酸丁酯；脂肪酸的酯，包括但不限于己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸或硬脂酸、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、己酸异丙酯、辛酸异丙酯、硬脂酸乙酯、月桂酸丁酯；和任何天然油，包括但不限于椰子油、棕榈仁油、大豆油、蓖麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油；以及它们的组合。在一个具体的实施方案中，油相包含labrafac亲脂体WL1349(即，辛酸和癸酸的甘油三酯)。

可将任何合适的外部乳化剂用于ME中。在各种其他实施方案中，外部乳化剂选自：辛酰己酰聚氧乙烯-8甘油酯、聚乙二醇甘油蓖麻油酸酯、亲水亲油平衡(HLB)值在10-16之间的任何其他亲水性表面活性剂、任何脂肪酸或脂肪酸混合物的聚乙二醇单酯和/或二酯；丙二醇或任何其他醇，包括但不限于甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇和异丙醇；以及它们的组合。在各种另外的实施方案中，外部乳化剂包含辛酰己酰聚氧乙烯-8甘油酯、聚乙二醇甘油蓖麻油酸酯、丙二醇或它们的组合。

可使用本公开的ME的各种组分的任何合适的组合。在一个实施方案中，ME含有0.5％-35％w/w水性溶液、0.5％-95％w/w油相和5％-99％w/w乳化剂(即：内部乳化剂+外部乳化剂)。在另一个实施方案中，ME含有10％-30％w/w水性溶液、20％-40％w/w油相和40％-60％w/w乳化剂。在另一个实施方案中，ME含有约20％w/w水性溶液、约30％w/w油相和约50％w/w乳化剂。在各种另外的实施方案中，ME含有至少0.5％w/w水性溶液、含有至少1％w/w水性溶液、含有至少2％w/w水性溶液、含有至少3％w/w水性溶液、含有至少4％w/w水性溶液、含有至少5％w/w水性溶液、含有至少6％w/w水性溶液、含有至少7％w/w水性溶液、含有至少8％w/w水性溶液、含有至少9％w/w水性溶液、含有至少10％w/w水性溶液、含有至少11％w/w水性溶液、含有至少12％w/w水性溶液、含有至少13％w/w水性溶液、含有至少14％w/w水性溶液、含有至少15％w/w水性溶液、含有至少16％w/w水性溶液、含有至少17％w/w水性溶液、含有至少18％w/w水性溶液、含有至少19％w/w水性溶液、含有至少20％w/w水性溶液、含有至少25％w/w水性溶液、含有至少30％w/w水性溶液、含有至少35％w/w水性溶液、含有至少40％w/w水性溶液、含有至少45％w/w水性溶液、含有至少50％w/w水性溶液、含有至少55％w/w水性溶液、含有至少60％w/w水性溶液、含有至少65％w/w水性溶液、含有至少70％w/w水性溶液、含有至少75％w/w水性溶液、含有至少80％w/w水性溶液、含有至少85％w/w水性溶液、含有至少90％w/w水性溶液，或含有至少95％w/w水性溶液。

在各种实施方案中，外部乳化剂相对于内部乳化剂以约10:1至约2:1的比例存在。在各种另外的实施方案中，外部乳化剂相对于内部乳化剂以约9:1至约2:1、约8:1至约2:1、约7:1至约2:1、约6:1至约2:1、约5:1至约2:1、约4:1至约2:1、约3:1至约2:1、约10:1至约2.5:1、约9:1至约2.5:1、约8:1至约2.5:1、约7:1至约2.5:1、约6:1至约2.5:1、约5:1至约2.5:1、约4:1至约2.5:1、约3:1至约2.5:1、约10:1至约3:1的比例存在；相对于内部乳化剂以约9:1至约3:1、约8:1至约3:1、约7:1至约3:1、约6:1至约3:1、约5:1至约3:1、约4:1至约3:1、约10:1至约4:1存在；相对于内部乳化剂以约9:1至约4:1、约8:1至约4:1、约7:1至约4:1、约6:1至约4:1、约5:1至约4:1、约10:1至约5:1的比例存在；相对于内部乳化剂以约9:1至约5:1、约8:1至约5:1、约7:1至约5:1、约6:1至约5:1的比例存在。

在一个实施方案中，水性溶液包含水溶性治疗剂/药物。可将任何合适的水溶性治疗剂/药物掺入水性溶液中，这些合适的水溶性治疗剂/药物包括但不限于β-阻滞剂，诸如倍他洛尔和噻吗洛尔；前列腺素类似物，诸如比马前列素、拉坦前列素和曲伏前列素；α-肾上腺素能药剂，诸如酒石酸溴莫尼定；碳酸酐酶抑制剂，诸如布林佐胺、多佐胺、乙酰唑胺；钙通道阻滞剂，诸如尼莫地平和普瑞巴林；asialo，半乳糖基化，三触角(NA3)(也称为asialo-，三触角复合类型N-聚糖)、OT-551盐酸盐(1-羟基-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基环丙烷羧酸酯盐酸盐)、酒石酸溴莫尼定、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、吉米沙星、氧氟沙星、曲安西龙、伐昔洛韦、乙胺嘧啶、缬更昔洛韦、更昔洛韦、阿昔洛韦、膦甲酸、乙酸泼尼松龙、diflupednate、曲安西龙、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、环孢素、他克莫司、环磷酰胺、利巴韦林、溴芬酸、酮咯酸、奈帕芬胺、立他司特、氟比洛芬、双氯芬酸、酮替芬、奈多罗米、去氧肾上腺素、氮卓斯汀、依匹斯汀、萘甲唑林/非尼拉敏、oloptadine、贝他斯汀、alacaftadine、吡嘧司特、有或没有硫酸锌的四氢唑啉、Iodoxamide、萘甲唑林、去氧肾上腺素、色甘酸、依美斯汀、羟甲唑啉、赛洛唑啉、氯雷他定、地氯雷他定、苯基甘氨酸、加巴喷丁或它们的组合。在具体的实施方案中，水溶性药物选自苯基甘氨酸、加巴喷丁、普瑞巴林和利巴韦林，或它们的药学上可接受的盐。

药学上可接受的盐可包括但不限于胺盐，诸如但不限于N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、l-对-氯苄基-2-吡咯烷-l'-基甲基苯并咪唑、二乙胺和其他烷基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱金属盐，诸如但不限于锂、钾和钠；碱土金属盐，诸如但不限于钡、钙和镁；过渡金属盐，诸如但不限于锌；以及其他金属盐，诸如但不限于磷酸氢钠和磷酸氢二钠；并且还包括但不限于无机酸的盐，诸如但不限于盐酸盐和硫酸盐；有机酸的盐，诸如但不限于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。

在另一个实施方案中，水相包含水凝胶(即：凝胶或溶胀的网络结构聚合物基体，其中液体组分是水或水性溶液、乳液或悬浮液)。在一个实施方案中，水凝胶包含生物粘附聚合物。在一个实施方案中，生物粘附聚合物包含黏膜粘附聚合物。在一个实施方案中，水凝胶包含黏膜粘附聚合物。可使用任何合适的黏膜粘附聚合物，包括但不限于聚丙烯酸衍生物(包括但不限于

诸如/>

981)、海藻酸及其盐或衍生物(包括但不限于海藻酸钠)、壳聚糖及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、果胶及其衍生物、明胶及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、透明质酸盐及其衍生物、结冷胶及其衍生物、黄原胶及其衍生物、琼脂及其衍生物、甘氨胆酸及其盐或衍生物，或它们的组合。在具体实施方案中，黏膜粘附聚合物选自聚丙烯酸衍生物(包括但不限于

诸如/>

981)、海藻酸及其盐或衍生物(包括但不限于海藻酸钠)、壳聚糖及其衍生物，或它们的组合。

微乳液可被配制为用于任何合适的施用途径(即：口服、局部、鼻内、肠胃外等)，水溶性治疗剂以剂量单位制剂形式负载在微乳液中。该制剂可包含适于施用途径的任何其他组分，包括但不限于常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物。在一个实施方案中，微乳液被配制为局部制剂，诸如用于递送至眼。例如，该局部制剂包括滴眼剂。在一个实施方案中，微乳液被配制用于可注射施用。

“制剂”可以指被选择以提供用于特定最终用途的最佳特性(包括产品规格和/或使用条件)的化合物、混合物或溶液的任何组分的集合。术语制剂可包含液体、半液体、胶体溶液、分散体、乳液、微乳液和纳米乳液，包含水包油乳液和油包水乳液、糊剂、散剂和悬浮液。这些制剂还可包含或包装有其他无毒化合物，诸如化妆品载体、赋形剂、粘合剂和填充剂等。例如，可接受的化妆品载体、赋形剂、粘合剂和填充剂可包括使化合物易于口服递送和/或提供稳定性从而使得本发明的制剂表现出商业上可接受的储存保质期的那些化妆品载体、赋形剂、粘合剂和填充剂。

本文所公开的微乳液可作为微乳液小球(即，滴剂)提供，微乳液小球可具有任何合适的尺寸。在一个实施方案中，微乳液小球的直径为约1nm至约200nm。在各种另外的实施方案中，ME小球的直径为约1nm至约150nm、约1nm至约100nm、约1nm至约50nm、约1nm至约20nm、约1nm至约18nm、约1nm至约17nm、约5nm至约200nm、约5nm至约150nm、约5nm至约100nm、约5nm至约50nm、约5nm至约20nm、约5nm至约18nm、约5nm至约17nm。在各种另外的实施方案中，ME小球的直径为约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约90nm、约95nm、约100nm、约110nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、约160nm、约170nm、约180nm、约190或约200nm。在其他实施方案中，ME小球的直径为至少约1nm、至少2nm、至少3nm、至少4nm、至少5nm、至少6nm、至少7nm、至少8nm、至少9nm、至少10nm、至少15nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少55nm、至少60nm、至少65nm、至少70nm、至少75nm、至少80nm、至少90nm、至少95nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm、至少150nm、至少160nm、至少170nm、至少180nm、至少190或至少200nm。

在另一个方面提供了用于治疗眼睛疾病或提供神经保护作用的方法。例如，实施方案可包括向有需要的受试者施用有效治疗眼睛疾病或提供神经保护作用的量的本文所述的任何实施方案或实施方案的组合的ME，其中水性溶液包含能够治疗眼睛疾病或提供神经保护作用的水溶性治疗剂。在各种实施方案中，这些方法用于降低眼内压(IOP)、治疗青光眼、预防青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、预防神经变性以及提供神经保护作用，包括向具有本文所述的任何实施方案或实施方案的组合的升高的眼内压、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损和/或ME的神经变性的受试者施用，其中水性溶液包含能够降低IOP、治疗青光眼、预防青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、预防神经变性以及提供神经保护作用的水溶性治疗剂。在各种实施方案中，能够降低IOP、治疗年龄相关性黄斑变性、治疗青光眼、预防青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、预防神经变性以及提供神经保护作用的水溶性治疗剂选自：β-阻滞剂，诸如倍他洛尔和噻吗洛尔；前列腺素类似物，诸如比马前列素、拉坦前列素和曲伏前列素；α-肾上腺素能药剂，诸如酒石酸溴莫尼定；碳酸酐酶抑制剂，诸如布林佐胺、多佐胺、乙酰唑胺；钙通道阻滞剂，诸如尼莫地平和普瑞巴林；asialo，半乳糖基化，三触角(NA3)(也称为asialo-，三触角复合类型N-聚糖)、OT-551盐酸盐(1-羟基-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基环丙烷羧酸酯盐酸盐)、酒石酸溴莫尼定、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、吉米沙星、氧氟沙星、曲安西龙、伐昔洛韦、乙胺嘧啶、缬更昔洛韦、更昔洛韦、阿昔洛韦、膦甲酸、乙酸泼尼松龙、diflupednate、曲安西龙、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、环孢素、他克莫司、环磷酰胺、利巴韦林、溴芬酸、酮咯酸、奈帕芬胺、立他司特、氟比洛芬、双氯芬酸、酮替芬、奈多罗米、去氧肾上腺素、氮卓斯汀、依匹斯汀、萘甲唑林/非尼拉敏、oloptadine、贝他斯汀、alacaftadine、吡嘧司特、有或没有硫酸锌的四氢唑啉、Iodoxamide、萘甲唑林、去氧肾上腺素、色甘酸、依美斯汀、羟甲唑啉、赛洛唑啉、氯雷他定、地氯雷他定、苯基甘氨酸、加巴喷丁或它们的组合。在具体的实施方案中，能够降低IOP、治疗青光眼、预防青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、预防神经变性以及提供神经保护作用的水溶性药物选自苯基甘氨酸、加巴喷丁、普瑞巴林和利巴韦林，或它们的药学上可接受的盐。在一个具体的实施方案中，能够降低IOP、治疗青光眼、预防青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、预防神经变性以及提供神经保护作用的水溶性药物为普瑞巴林，并且普瑞巴林以ME％w/w的约0.2％至约2％存在于微乳液中；在各种另外的实施方案中，普瑞巴林以ME％w/w的约0.2％至约1.5％、约0.2％至约1％、约2％至约0.75％、约0.3％至约2％、约0.3％至约1.5％、约0.3％至约1％、约0.3％至约0.75％、约0.4％至约2％、约0.4％至约1.5％、约0.4％至约1％、约0.4％至约0.75％、约0.5％至约2％、约0.5％至约1.5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约0.75％、约0.2％至约0.6％、约0.3％至约0.6％、约0.4％至约0.6％、约0.5％至约0.6％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％或约0.6％存在于ME中。本文所述的ME是用于任何水溶性治疗剂候选物的优异药物递送系统。

如本文所使用的，“治疗(treatment和treating)”可以指以改善或以其他方式有益地改变疾病或障碍的一种或多种症状的任何方式，以对抗病症、疾病或障碍为目的对受试者进行管理和护理。该术语可包括针对患者所患的特定病症的全方位治疗，诸如出于以下目的来施用活性化合物：减轻或缓解症状或并发症；延迟病症、疾病或障碍的进展；治愈或消除病症、疾病或障碍；以及/或者预防病症、疾病或障碍，其中“预防(preventing/prevention)”可以指出于阻止病症、疾病或障碍的发展的目的而对患者进行管理和护理，并且可包括施用活性化合物以预防或降低症状或并发症发作的风险。熟练的技术人员将理解，可以使用多种方法和测定来评估病理学的发展，并且类似地，可以使用多种方法和测定来减少病理学、车道或退化。例如，本文所述的方法可提供针对神经变性或损伤的治疗。

如本文所用，术语“预防”可以指预防疾病、障碍或病症发生在可能处于疾病风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中。预防(和有效预防剂量)可以在群体研究中得到证明。例如，有效预防给定疾病或病症的量是与未经治疗的对照群体相比，有效降低治疗群体中的发病率的量。

在该实施方案的其他方面，本文所公开的水溶性药物用于降低IOP和/或治疗青光眼(包括POAG)、防止青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、防止神经变性，并且在患有这些综合征中的一者或多者的患者中提供神经保护作用，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方案的其他方面，本文所公开的水溶性药物降低IOP和/或治疗青光眼、防止青光眼诱导的神经变性、防止青光眼诱导的神经变性、减少视野缺损、防止神经变性，并且在患有这些综合征中的一者的患者中提供神经保护作用，例如约5％至约100％、约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％，或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％，或约50％至约70％。

本文所公开的微乳液可包含足以允许向个体常规施用的量的水溶性药物。在该实施方案的各个方面，本文所公开的ME可包含例如至少0.001％w/w、至少0.002％w/w、至少0.003％w/w、至少0.004％w/w、至少0.005％w/w、至少0.006％w/w、至少0.007％w/w、至少0.008％w/w、至少0.009％w/w、至少0.01％w/w、至少0.02％w/w、至少0.03％w/w、至少0.04％w/w、至少0.05％w/w、至少0.06％w/w、至少0.07％w/w、至少0.08％w/w、至少0.09％w/w、至少0.1％w/w、至少0.2％w/w、至少0.3％w/w、至少0.4％w/w,0.5％w/w、至少0.6％w/w、至少0.7％w/w、至少0.8％w/w、至少0.9％w/w、至少1.0％w/w、至少1.1％w/w、至少1.2％w/w的水溶性药物。在该实施方案的其他方面，本文所公开的ME可包含例如约0.001％w/w至约1.2％w/w、约0.001％w/w至约1.1％w/w、约0.001％w/w至约1.0％w/w、约0.001％至约0.9％w/w、约0.001％w/w至约0.8％w/w、约0.3％w/w至约1.2％w/w、约0.3％w/w至约1.1％w/w、约0.3％w/w至约1.0％w/w、约0.3％w/w至约0.9％w/w、约0.3％w/w至约0.8％w/w、约0.4％w/w至约1％w/w、约0.4％w/w至约0.9％w/w、约0.4％w/w至约0.8％w/w、约0.4％w/w至约0.7％w/w、约0.5％w/w至约1.0％w/w、约0.5％w/w至约0.9％w/w、约0.5％w/w至约0.8％w/w、约0.5％w/w至约0.7％w/w、约0.55％w/w至约0.8％w/w，或约0.55％w/w至约0.7％w/w的水溶性药物。本文所公开的水溶性药物在本文所公开的ME中的最终浓度可以是任何期望的浓度。在该实施方案的一个方面，水溶性药物在微乳液中的最终浓度可以是治疗有效量。在该实施方案的其他方面，水溶性药物在ME中的最终浓度可以是例如至少0.001％w/w、至少0.002％w/w、至少0.003％w/w、至少0.004％w/w、至少0.005％w/w、至少0.006％w/w、至少0.007％w/w、至少0.008％w/w、至少0.009％w/w、至少0.01％w/w、至少0.02％w/w、至少0.03％w/w、至少0.04％w/w、至少0.05％w/w、至少0.06％w/w、至少0.07％w/w、至少0.08％w/w、至少0.09％w/w、至少0.1％w/w、至少0.2％w/w、至少0.3％w/w、至少0.4％w/w,0.5％w/w、至少0.6％w/w、至少0.7％w/w、至少0.8％w/w、至少0.9％w/w、至少1.0％w/w、至少1.1％w/w、至少1.2％w/w。在该实施方案的其他方面，本文所公开的水溶性药物在ME中的浓度可以是例如至多0.3％w/w、至多0.4％w/w、至多0.5％w/w、至多0.6％w/w、至多0.7％w/w、至多0.8％w/w、至多0.9％w/w、至多1.0％w/w、至多1.1％w/w或至多1.2％w/w。在该实施方案的其他方面，水溶性药物在ME中的最终浓度可以在以下范围内：例如约0.001％w/w至约1.2％w/w、约0.001％w/w至约1.1％w/w、约0.001％w/w至约1.0％w/w、约0.001％至约0.9％w/w、约0.001％w/w至约0.8％w/w、约0.3％w/w至约1.2％w/w、约0.3％w/w至约1.1％w/w、约0.3％w/w至约1.0％w/w、约0.3％w/w至约0.9％w/w、约0.3％w/w至约0.8％w/w、约0.4％w/w至约1％w/w、约0.4％w/w至约0.9％w/w、约0.4％w/w至约0.8％w/w、约0.4％w/w至约0.7％w/w、约0.5％w/w至约1.0％w/w、约0.5％w/w至约0.9％w/w、约0.5％w/w至约0.8％w/w、约0.5％w/w至约0.7％w/w、约0.55％w/w至约0.8％w/w，或约0.55％w/w至约0.7％w/w。

如本文所用，“治疗(treat/treating)”可以指实现以下项中的一者或多者：(a)降低障碍的严重程度；(b)限制或预防所治疗的障碍的特征性症状的发展；(c)抑制所治疗的障碍的特征性症状的恶化；(d)限制或预防该障碍在先前患有该障碍的患者中的复发；以及(e)限制或预防先前对该障碍有症状的患者的症状复发。某些实施方案部分地公开了治疗患有IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性的个体。在这些实施方案中，治疗可以指减少或消除个体的IOP临床症状、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性；或者延迟或预防个体的IOP临床症状、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性的发作。例如，术语“治疗”可以指将以IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性为特征的病症的症状减少例如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。与IOP、青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎和/或结膜炎相关的实际症状是众所周知的，并且可由本领域普通技术人员通过考虑与这些综合征中的每一种综合征相关的各种因素来确定。本领域技术人员将知道与IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性相关的适当症状或指标，并且将知道如何确定个体是否是如本文所公开的治疗的候选者。

在各种实施方案中，本文所公开的治疗有效量的水溶性药物使与IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性相关的症状减少例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在其他实施方案中，本文所公开的治疗有效量的水溶性药物使与IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性相关的症状减少例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在其他实施方案中，本文所公开的治疗有效量的水溶性药物使与IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性相关的症状减少例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％，或约30％至约50％。在本文所公开的方法中使用的治疗剂(诸如微乳液)可由主治医务人员在认为适当时施用，例如通过本文所述的施用途径。在一个实施方案中，将在本文所公开的方法中使用的治疗剂(诸如微乳液)施用于受试者的一只眼或两只眼睛。在另一个实施方案中，每天施用一次。剂量可以是单次剂量或累积剂量(连续剂量)，并且可由本领域技术人员容易地确定。例如，IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性的治疗以及提供神经保护作用可包括单次施用有效剂量的含有本文公开的水溶性药物的ME。在另一个实施方案中，IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性的治疗以及提供神经保护作用可包括在一个时间段范围内进行有效剂量的含有水溶性药物的微乳液的多次施用，诸如每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次。施用的时间可因个体而异，这取决于个体症状的严重程度等因素。例如，有效剂量的含有本文所公开的水溶性药物的ME可在不确定的时间段内每天一次施用于个体，或者直至该个体不再需要治疗。本领域普通技术人员将认识到，可在整个治疗过程中监测该个体的病症，并且可相应地调节所施用的含有本文所公开的水溶性药物的ME的有效量。

在另一个实施方案中，本发明的水溶性药物及其衍生物具有为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、一个月、两个月、三个月、四个月或更长的半衰期。

在一个实施方案中，用于治疗IOP、青光眼、青光眼诱导的神经变性、视野缺损减少和/或神经变性以及提供神经保护作用的治疗剂的施用时间段为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在另一个实施方案中，在施用时间段之间停止施用期间的时间段为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。

在各种实施方案中，治疗有效量的含有本文所公开的水溶性药物的ME使个体的眼睛内的眼内压(IOP)降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方案的其他方面，治疗有效量的含有本文所公开的水溶性药物的ME使个体的眼睛内的内部压力降低例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方案的其他方面，治疗有效量的含有本文所公开的水溶性药物的ME使个体的眼睛内的内部压力降低例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％，或约30％至约50％。在实施方案中，以低剂量、中等剂量或高剂量施用治疗有效量的含有本文所公开的水溶性药物的微乳液。如本文所用，“剂量”可以指有效产生生物学应答的化合物或组合物的量，诸如有效产生生物学应答的普瑞巴林的量或包含普瑞巴林的微乳液的量。例如，该剂量可以指包含约0.1％的化合物、约0.2％的化合物、约0.3％的化合物、约0.4％的化合物、约0.5％的化合物、约0.6％的化合物、约0.7％的化合物、约0.8％的化合物、约0.9％的化合物、约1％的化合物、约2％的化合物、约3％的化合物、约4％的化合物、约5％的化合物、约10％的化合物或大于10％的化合物的组合物。在实施方案中，剂量可以是约0.6％普瑞巴林。例如，该剂量可以是包含约0.6％普瑞巴林的微乳液。“中等剂量”可以指例如约3倍低剂量。高剂量可以指例如约10倍低剂量，或多于约10倍低剂量。

如本文所用，可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”可以指任何动物，包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、鸟、猪、马、家畜(例如猪、绵羊、山羊、牛)、灵长类动物或人。在具体的实施方案中，受试者、个体或患者是人。将包含微乳液和水溶性药物的药物组合物施用于受试者。例如，作为治疗的候选者的任何受试者是具有某些形式的IOP、青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎、眼睛损伤、遗传性视网膜变性和/或结膜炎的候选者。术前评估包括常规病史和体检，以及公开手术所有相关风险和益处的全面知情同意书。

用于在本文所公开的方法中使用的含治疗剂的微乳液可被配制用于并通过任何合适的途径施用，包括但不限于口服、静脉内、眼部、阴道内、肛门内、皮下、颅内、局部、肌肉内、肠内或肠胃外施用途径。在实施方案中，含治疗剂的ME可被配制通过局部施用进行眼部或光学应用(包括但不限于配制为滴眼剂)、鼻内施用、通过口服用于不同系统性疾病、通过经皮应用用于系统性疾病以及通过局部用于不同皮肤障碍。本文所述的ME还可用作药物递送系统以在单个ME中掺入一种或多种任何类型的水溶性化合物，包括但不限于小分子和肽。

微乳液的制备可在适合用于预期用途的任何合适条件下进行。在一个非限制性实施方案中，微乳液的制备可室温下进行，以便使水溶性药物完全溶解于药学上可接受的溶剂中。然而，在该方法的其他实施方案中，微乳液的制备可在高于室温的温度下进行。在该实施方案的各个方面，ME的制备可在例如大于21℃、大于25℃、大于30℃、大于35℃或大于37℃、大于40℃、大于42℃、大于45℃、大于50℃、大于55℃或大于60℃的温度下进行。在该实施方案的各个方面，ME的制备可在例如约20℃至约30℃、约25℃至约35℃、约30℃至约40℃、约35℃至约45℃、约40℃至约50℃、约45℃至约55℃，或约50℃至约60℃之间的温度下进行。在某些情况下，ME的制备可在低于室温的温度下进行，以便使治疗剂完全溶解于溶剂中。然而，在该方法的其他实施方案中，微乳液的制备可在低于室温的温度下进行，例如低于10℃、高于5℃、高于0℃、高于-10℃或高于-20℃。

在一个实施方案中，与微乳液一起使用的水溶性药物是普瑞巴林。如本文所用，“普瑞巴林”可以指以下化学结构：

另一个方面提供了用于治疗青光眼、降低IOP、提供神经保护、治疗眼睛损伤和预防遗传性视网膜变性的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效治疗青光眼、降低IOP、提供神经保护、治疗眼睛损伤以及/或者防止遗传性视网膜变性的量的钙电压门控通道辅助亚基α2δl(CACNA2D1)蛋白的抑制剂。在一个实施方案中，这些方法用于治疗青光眼；在一个此类实施方案中，该青光眼是原发性开角型青光眼(POAG)。在一个实施方案中，方法用于提供神经保护；在此类实施方案中，神经保护来自眼睛损伤和/或视网膜变性。例如，眼睛损伤可以是爆炸损伤。例如，视网膜变性可以是遗传性视网膜变性。在一个实施方案中，所述抑制剂包括gabapentanoid、苯基甘氨酸或其药学上可接受的盐类。在另一个实施方案中，gabapentanoid包含普瑞巴林或其药学上可接受的盐类。在实施方案中，抑制剂可以是普瑞巴林或其类似物。例如，类似物可包括加巴喷丁、加巴喷丁恩那卡比、苯丙氨酸、氨氯地平、4-甲基普瑞巴林、阿西维辛、唑来膦酸、5-乙基庚-2-烯酸乙酯、5-乙基-3-硝基甲基庚酸乙酯、4-(2-乙基丁基)吡咯烷-2-酮、3-氨甲基-5-乙基庚酸盐酸盐、3-乙基戊腈、3-氰基-4-乙基己酸乙酯、3R-氨甲基-4R,5-二甲基己酸、4-(1-乙基丙基)吡咯烷-2-酮、3-氨甲基-4-乙基己酸盐酸盐、5S-甲基-3-(4R-甲基-2-氧代-5S-苯基噁唑烷-3-羰基)己腈、(S)-2-(2-氨乙基)-4-甲基戊酸、(4S)-异丁基二氢呋喃-2-酮、(4S)-异丁基-(3S)-甲基二氢呋喃-2-酮、(3S)-叠氮甲基-(2S,5)-二甲基己酸乙酯、(4S)-异丁基-(3S)-甲基吡咯烷-2-酮、(3S)-氨乙基-(2S,5)-二甲基己酸盐酸盐、2,4-二甲基戊腈、2-乙基-4-甲基戊腈、3-氰基-3,5-二甲基己酸乙酯、3-氰基-3-乙基-5-甲基己酸乙酯、4-甲基-4-异丁基吡咯烷-2-酮、4-乙基-4-异丁基吡咯烷-2-酮、3-氨甲基-3,5-二甲基己酸、3-氨甲基-3-乙基-5-甲基己酸盐酸盐、3-异丁基-2-甲基-5-氧代吡咯烷-1-羧酸、叔丁酯、2-甲基-5-氧代-3-丙基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯、3-丁基-2-甲基-5-氧代吡咯烷-l-羧酸叔丁酯、3-(l-氨基-乙基)-5-甲基己酸、3-(l-氨基-乙基)己酸、3-(l-氨基-乙基)庚酸、5-甲基己-2-烯酸乙酯、5-甲基-3-(l-硝基乙基)己酸乙酯、4-异丁基-5-甲基吡咯烷-2-酮、3-异丁基-2-甲基-5-氧代吡咯烷-l-羧酸苄酯、3-(l-苄氧羰基氨乙基)-5-甲基己酸、3-(l-氨乙基)-5-甲基己酸4-甲基戊-2-烯酸、3-(4-甲基戊-2-烯酰)-4R-苯基噁唑烷-2-酮、3-(3R,4-二甲基戊酰基)-4R-苯基噁唑烷-2-酮、(3R)-(2-乙酰氧基-lR-苯乙基氨基甲酰)-4S,5-二甲基己酸叔丁酯、2R-(1S,2-二甲基丙基)琥珀酸4-叔丁酯、4R-(1S,2-二甲基丙基)二氢呋喃-2-酮、3R-溴甲基-4S,5-二甲基己酸乙酯、3R-叠氮甲基-4S,5-二甲基己酸乙酯、4R-(1S,2-二甲基丙基)吡咯烷-2-酮、3R,4S-3-氨甲基-4,5-二甲基己酸、3R-苄基-4R-异丙基二氢呋喃-2-酮、2R-苄基-3R-溴甲基-4-甲基戊酸乙酯、2R-苄基-3R,4-二甲基戊酸乙酯、醋酸2R-苄基-3R,4-二甲基戊酯、3R-溴甲基-4R,5-二甲基己酸乙酯、3R-氨甲基-4R,5-二甲基己酸。

如本文所用，短语“药学上可接受的盐”可以指药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐两者以及溶剂化物。此类药学上可接受的盐可以是适于预期用途的任何盐，包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、亚磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、氢碘酸、链烷酸(诸如乙酸、HOOC-(CH₂)_n-COOH(其中n为0-4)等)。无毒的药用碱加成盐包括碱(诸如钠、钾、钙、铵等)的盐。本领域技术人员将认识到多种无毒的药学上可接受的加成盐。

如本文所用，“有需要的”受试者可以指患有待治疗的障碍或疾病或者易患该障碍或病症，或者以其他方式处于发展该疾病或障碍的风险中的受试者。

在一个非限制性示例中，微乳液可包含以下组分或由以下组分组成：

(a)初级油包水(w/o)相，其占制剂约0.1％至约40％，其中该w/o相包含：

(i)水，其浓度为制剂的0％w/w至约7％w/w；

(ii)油，其浓度为制剂的约6％w/w至约13％w/w；

(iii)capryol 90，其浓度为制剂的约1％w/w至约13％w/w；和

(iv)卵磷脂，其浓度为制剂的约1％w/w至约13％w/w；和

(b)外部水相，其占制剂的50％-99.9％，其中该外部水相包含：

(i)labrasol，其浓度为制剂的约0.1％w/w至约25％w/w；

(ii)Cremophor EL，其浓度为制剂的约0.1％w/w至约25％w/w；

(iii)丙二醇，其浓度为制剂的0％w/w至约45％w/w；和

(iv)水，其浓度为制剂的约10％w/w至约99.7％w/w。

在另一个非限制性示例中，微乳液可包含以下组分或由以下组分组成：

(i)水，其浓度为制剂的2％w/w至约7％w/w；

(ii)油，其浓度为制剂的约6％w/w至约9％w/w；

(iii)Capryol 90，其浓度为制剂的约3％w/w至约9％w/w；和

(iv)卵磷脂，其浓度为制剂的约3％w/w至约9％w/w；和

(b)外部水相，其占制剂的50％-99.9％，其中该外部水相包含：

(i)labrasol，其浓度为制剂的约5％w/w至约9.5％w/w；

(ii)Cremophor EL，其浓度为制剂的约5％w/w至约9.5％w/w；

(iii)丙二醇，其浓度为制剂的5％w/w至约25％w/w；和

(iv)水，其浓度为制剂的约30％w/w至约56％w/w。

在另一个方面提供了被设计为用于水不溶性药物分子和弱水溶性药物分子的药物递送系统的微乳液。在这些实施方案中，微乳液与上述相同，但缺少内部水相和内部乳化剂。因此，在该实施方案中，ME包含：

(a)不连续的(分散的)油相；和

(b)乳化剂，该乳化剂包覆油相。

在一个实施方案中，微乳液还包含(c)包围乳化剂的连续水相。在该实施方案中，使油性药物溶液在含有亲水性乳化剂(诸如具有高HLB值的乳化剂)的生物粘附水相(诸如本文所述的水凝胶)中乳化。

在另一个实施方案中，微乳液包含不连续油相中的不溶性或微溶性药物。

除非上下文另外清楚地指明，否则上文针对ME公开的所有实施方案也可用于该方面。

在实施方案中，微乳液可含有抗氧化剂。例如，抗氧化剂可包括谷胱甘肽、生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、焦亚硫酸钠、α生育酚、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)或它们的组合。

实施例

下面提供了实施例，以促进更全面地理解本发明。以下实施例展示了制备和实践本发明的示例性模式。然而，本发明的范围并不限于仅出于说明目的在这些实施例中所公开的具体实施方案，因为可以使用替代性方法获得类似的结果。

实施例1

青光眼是导致世界上不可逆失明的主要原因。这种疾病现在在美国影响了超过300万人，并且随着预计寿命的增加，到2050年该数字可增加至约630万人。成人发病型青光眼有四种主要类型，所有这些类型最终都会引起视网膜神经节细胞(RGC)功能障碍和/或凋亡，进而导致视力受损。每种形式的青光眼都可与多种且有时不同的危险因素相关，表明存在导致RGC凋亡的多种触发机制。就四种成人发病型青光眼亚型中的三种类型而言，升高的眼内压(IOP)是RGC凋亡后视野缺损的预测危险因素。第四亚型(即正常眼压性青光眼)与高IOP无关，并且引发RGC凋亡的因素是未知的。

成人发病型青光眼的现行标准治疗包括，使用降IOP药物作为局部递送的滴眼剂来进行治疗。所有目前经FDA批准的青光眼药物的缺陷是功效有限。具体地，在许多青光眼患者中，IOP降低不能预防RGC凋亡及其导致的视野缺损。在我们的研究中，我们使用系统遗传学方法发现了新的降IOP药物靶点，即电压依赖性钙通道α2δ1亚基(又名CACNA2D1)。此外，我们已经鉴定了表现出降IOP活性的选择性CACNA2D1阻滞剂，即普瑞巴林(PRG)。我们开发了局部缓释型PRG微乳液(ME)，其增加了药物进入眼睛，从而使功效更好且作用持续时间更长。我们的研究揭示了与青光眼的PRG治疗相关的未预料到的附加有益效果。我们有数据证明，CACNA2D1除了定位于调节IOP的前段结构之外，还位于RGC中。我们还有证据表明，它在两种青光眼动物模型中直接防止视神经(ON)损伤。我们的发现表明我们的PRG ME可以是既降低IOP又对RGC具有直接神经保护作用的青光眼疗法。

不希望受理论束缚，我们的PRG ME将以更好的功效来降低IOP，以及维持RGC的健康，该使用领域目前尚无经FDA批准的药物。我们的数据支持了这一点，该数据表明CACNA2D1位于RGC及其包含NFL(神经纤维层)和ON的轴突中，并且我们的缓释型生物粘附ME增强了局部递送后的PRG进入眼睛的运动。

下文列出了以下试验：

1：我们使用每天一次给药测试了PRG是否是RGC和ON的神经保护剂。

2：我们测试了PRG是否通过调节细胞内钙(Ca²⁺)的浓度而在RGC健康中发挥直接作用。

结果：基于数据集并且不希望受理论束缚，该研究将验证PRG ME作为一种神经保护疗法，其可最大限度地减少青光眼患者的视野缺损。

实施例2

青光眼是一种复杂的、多因素的、多遗传的疾病，它是全世界不可逆失明的主要原因¹。趋势表明，到2040年，全世界将有多达1.118亿人患有青光眼²，并且其中许多人将因视神经(ON)损伤而导致法定失明^3,4。成人发病型青光眼的各种亚型(即，原发性开角型青光眼(POAG)、原发性闭角型青光眼(PACG)和正常眼压性青光眼)具有视网膜神经节细胞(RGC)和ON轴突损伤以及随后的视野缺损的临床病理学⁵。已知该疾病的几个危险因素^6-8，其中升高的眼内压(IOP)是与青光眼的发生和进展相关的可改变的危险因素^4,6,9-11。所有形式的成人发病型青光眼的标准治疗是使用降IOP药物作为局部递送的滴眼剂来进行治疗。这种治疗策略不能预防许多青光眼患者的RGC/ON损伤及其导致的视野缺损。因此，人们感兴趣的是鉴定对RGC提供直接神经保护或神经增强的分子。来自眼科医师的引文包括：“neuroprotection is a big void”；“there are no therapeutic options forneuroprotection”；以及“owering IOP is not enough；we need to addneuroprotection to increase the efficacy of glaucoma meds”。

鉴定具有直接神经保护作用的新型降IOP药物：尽管IOP降低是所有形式的成人发病型青光眼的治疗选项，但遗憾的是，目前的降IOP药物不能解决潜在的病理或遗传变异。通过将正向鼠遗传学方法与细胞生物学、药理学和人类GWAS数据分析相结合，我们鉴定出了调节IOP的新基因，例如电压依赖性钙通道α2δ1亚基(又名Cacna2d1)¹²(图1)。我们的方法将五个年龄组中的65个重组近交BXD小鼠系的IOP测量与遗传多态性评估和全眼微阵列分析相结合。作为我们研究的双向组成部分，我们证实了CACNA2D1在人类POAG群体内的推测的SNP。对人、兔和小鼠的免疫组织化学研究^12,13表明，CACNA2D1位于睫状体(CB)和流出结构中，其可影响IOP(图2)。药理学研究证明，用普瑞巴林(PRG)(一种对CACNA2D1具有特异性的拮抗剂)局部给药以剂量依赖性方式降低IOP¹³。这些发现支持PRG作为一类新型青光眼治疗剂的代表的发展，其作用机制不同于目前的降IOP药物。

我们研究的另一个意想不到的发现表明，CACNA2D1还在RGC中表达。基于这些数据，并且不希望受理论束缚，CACNA2D1代表了RGC和ON上的可成药靶点，除了其降IOP的作用之外，还防止青光眼诱导的神经变性。

我们制备、优化并表征了用于将PRG递送至眼睛的基于缓释型微乳液(ME)的制剂。我们的ME被设计为克服与水性滴眼剂相关的缺点，这些缺点包括排液快速、角膜接触时间短和角膜渗透最小；所有这些缺点都会导致功效降低和患者依从性差。我们通过使用具有原位胶凝特性的生物相容性组分设计多层ME来完善这一点，这些原位胶凝特性改善生物粘附、增强角膜渗透并且提供长达30小时的药物持续释放。因为我们的ME具有小的粒径(<20nm)，所以它是透明的并且不会模糊视线。对于PRG ME的剂量增加，IOP存在剂量反应性降低，0.6％PRG是提供最大作用的最小剂量，其中IOP降低近40％，直到给药后34小时才恢复至基线(测试1；¹³。我们还确定，用PRG ME每天给药持续21天没有导致制剂的功效降低(又名快速耐受性)(试验2；¹³)。在整个研究中，经治疗的眼睛的IOP保持在降低的水平，而对照眼睛保持在升高的基线IOP。在快速耐受性研究结束后，我们测定了PRG在眼睛和身体中的分布(试验2；¹³)。在用我们的PRG ME连续21天局部给药后，我们确定该药物以足以抑制CACNA2D1的浓度到达眼后部组织，包括视网膜。接受空白ME的对照眼睛含有微量水平的PRG，血浆和所有外周器官也是如此。裂隙灯和组织病理学检查确定载药的ME是安全的并且是眼睛能耐受的¹³。这些是重要的发现，因为它们证明了我们的ME可将亲水性分子递送至视网膜。这将该药物递送系统的用途扩大到包括后极疾病，包括将神经保护分子递送至RGC。我们直接测试，除了作为有效的降IOP的治疗剂之外，当通过我们的ME递送时，PRG是否还是RGC的直接神经保护剂。

概念和方法：

·我们已经鉴定出了一种新型降IOP药物——PRG，其是基于我们发现Cacna2d1作为IOP调节基因而选择的¹²。PRG对CACNA2D1具有高亲和力和特异性。目前所有的疗法都具有局限性，包括缺乏持续作用、眼部刺激以及其他副作用和药物相互作用。为经历这些副作用的患者改变疗法是具有挑战性的，因为目前所有的疗法都与一组受限制的作用机制相关。因此，可用的治疗选项是有限的。PRG代表一类新型青光眼药物，其通过新的、先前未知的靶点和作用机制发挥作用，因此为许多患者提供了一种选项。PRG已被FDA批准并且目前是非专利的，这使得我们能够通过505(b)(2)监管途径将它再定向并且提供一类新型青光眼疗法。

·我们已经制备并表征了用于将亲水性药物递送至眼睛的基于缓释型、多层、生物粘附的局部ME的制剂。我们的ME被设计为克服传统滴眼剂的缺点，这些缺点包括排液快速、角膜接触时间短和角膜渗透最小，所有这些缺点都会导致功效降低和患者依从性差。功效的改善得益于黏膜粘附特性增强、角膜渗透性增加、粒径变小、渗透能力增强和缓释。**当通过我们的ME递送时，PRG进入眼睛的运动被增强并且PRG可在视网膜中被检测到，从而允许用于靶向视网膜的疗法的局部递送。

·我们有数据证明CACNA2D1还定位于RGC细胞体及其包含ON的轴突(图3)。附加的数据表明，即使在不存在IOP降低的情况下，PRG也预防ON中的轴突的变性(图4至图6)。

总之，这些数据表明PRG是RGC的直接神经保护剂，并且将限制视野缺损，而不仅仅是降IOP。目前尚无经FDA批准的用于青光眼的神经保护疗法。我们的PRG ME将是既降低IOP又保护RGC和视神经的第一种青光眼疗法。

不希望受理论束缚，PRG是使用每天一次局部给药来用于RGC和ON的神经保护剂。

目标：这项研究中的阻碍是对PRG的与IOP降低无关的任何直接神经保护作用的体内评估。为了应对这一挑战，我们利用我们的数据进证明具有Cacna2d1的D单倍型的小鼠对PRG的降IOP特性无响应¹²。此外，我们挖掘了我们从5个年龄组中的BXD小鼠收集的IOP和ON损伤的数据库^12,13，并将BXD29鉴定为携带Cacna2d1的D单倍型的品系；具有不随年龄改变的IOP(图4，橙色圆圈)，但在早期具有显著的ON损伤(图4，蓝色条状)；并且其IOP对PRG治疗无反应(图5，红色符号)。这些特征使得BXD29理想地用于评估PRG对RGC的直接神经保护特性，因为该BXD29消除了通过IOP降低介导的间接效应。

非限制性的示例性数据：我们发现可以使PRG有效治疗青光眼的视力受损。CACNA2D1除了存在于前段(图2)之外，还定位于RGC(图3A和图3B)以及ON(图3C)。PRG可改善对脑中多种神经元细胞类型的损伤^16-21，我们的数据表明CACNA2D1可以是既降低IOP又对RGC/ON具有直接神经保护的靶点。

我们已经开发了具有缓释特性的多层微乳液(ME)，该多层微乳液支持PRG的每天一次给药以降低IOP，单滴的多层微乳液诱导了IOP的显著降低(42％)，并在33小时处恢复到基线(AUC＝170mmHg-hr；红色正方形荷兰黑带兔；图6)¹³。在给药后24小时，IOP仍然降低>20％。在不存在我们的ME的情况下，PRG仅产生30％的IOP降低，其在10小时后恢复到基线(AUC＝38mmHg-hr)，这证明我们的制剂增强了PRG的降IOP功效并延长了作用持续时间。此外，它对眼睛是安全和可耐受的¹³。每天一次给药，持续21天，证明没有药物耐受性，并且IOP永远不会恢复到其升高的给药前基线(红色；荷兰黑带兔；图7)¹³。出于我们评估PRG作为RGC和ON的直接神经保护剂的目的，通过我们的ME局部递送，PRG还增强了药物渗透到眼睛中，从而使药物水平到达视网膜，即RGC部位及其轴突(荷兰黑带兔；图8)¹³。

我们已有证据表明，不希望受理论束缚，用我们的PRG ME局部给药对ON中的RGC轴突具有神经保护作用。在对ON变性进行标记之前，从5周龄开始(图9A)，我们用PRG ME对BXD29小鼠每天给药。在来自每天给药持续6周的BXD29小鼠的ON中，ON轴突被保持在接近正常水平(图9B)。相反，来自用未含药ME进行给药的小鼠的ON具有缺损的轴突轮廓和增加的碎片面积(图9C)。这些研究将评估PRG作为RGC神经保护剂的作用，并且确定其发挥作用的细胞机制。

研究设计和方法：出于上述原因，我们的测试对象可以是BXD29(JAX#010981)，我们的测试对象还可以是C57B1/6J(B6；JAX#000664；无眼部病变的对照)。使用John等人(其中他们评估了烟酰胺在D2青光眼模型中的神经保护作用²²)的效能计算，并且不希望受理论束缚，将有80只小鼠被纳入这项研究中，其中雄性和雌性各一半。在这项研究的预防组中，BXD29小鼠将在ON损伤开始前被饲养至1个月(图9)。将用5μL的PRG ME^23-25对每只小鼠的两只眼睛每天局部给药，持续3个月，直到小鼠达4月龄，并且在不存在PRG(n＝20)的情况下ON变性将变得显著。第二组小鼠的两只眼睛将接受空白ME(n＝20；相同的给药模式)。第三组将不接受干预，并且将用作正常对照(每个BXD29组中n＝20；其中10只将用于获得基线数据，并且另外10只将用于获得终期数据)。第四组将包括B6小鼠(n＝20)作为无眼部病变的对照。它们将与作为正常对照的第三组进行平行检查。我们已经确定，我们的制剂在5℃下最少稳定3个月，因此将制备单个批次的PRG ME¹³，将其等分到单独的4mL不透明点滴瓶中，并且针对每只小鼠进行编码。在该研究期间，瓶子将在5℃下储存。实验人员将对制剂瓶中的内容物不知情。为了表征PRG的神经保护作用，我们将使用以下临床检查和实验室检查：

·临床检查(基线和每月)：IOP测量；包括暗视阈值反应的暗视视网膜电图(ERG)和作为RGC功能的指标的图形ERG(PERG)；视敏度(VA)和对比敏感度(CS)；以及通过视神经乳头(ONH)进行OCT成像，这些检查均使用我们公开的方法^13,23,25-27进行。

·实验室检查(基线和终期)：视网膜的形态学和免疫/组织化学评估(包括γ-突触核蛋白(SNCG)、脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A(BRN3A)和TUNEL染色)；和ON损伤的组织学评估，这些检查均使用我们公开的方法^12,28-31进行。

·统计分析：将使用GraphPad Prism-8统计软件，通过单向ANOVA分析统计差异，然后进行Tukey-Kramer多重比较检验(在显著F检验的情况下)。

本文所述的结果将会确定PRG在预防性应用时的神经保护性质。在用PRG ME治疗的BXD29小鼠中，与未经治疗的小鼠相比，我们将在ON中测量到：接近基线的ERG和PERG振幅；接近基线的VA和CS水平；较少的TUNEL阳性RGC；较多的SNCG和BRN3A免疫阳性RGC；较少的坏死的轴突和瘢痕区域。目前尚无经FDA批准的直接作用于RGC以阻断或减轻青光眼患者的视野缺损的治疗。不希望受理论束缚，PRG具有神经保护作用，我们的PRG ME将是首个具有多种作用机制(即，降IOP和神经保护)的青光眼疗法。

性能将包括以下证明：在对IOP没有影响的情况下，用我们的PRG ME每天给药持续3个月后，视网膜和RGC结构、功能和蛋白质表达模式维持在接近基线的水平。

不希望受理论束缚，PRG通过调节细胞内(Ca²⁺)水平的浓度而在RGC健康中发挥直接作用。

非限制性的示例性目的：PRG可用作针对RGC的神经保护剂的作用机制是未知的。然而，鉴于PRG是选择性CACNA2D1阻滞剂¹²，并且CACNA2D1定位于RGC及其轴突(图3)，PRG具有神经保护作用的作用机制的第一步是通过减弱离子Ca²⁺穿过细胞膜的流入(图10)。

非限制性的示例性研究设计：我们将使用已确立的方法测量在加载Ca²⁺指示剂染料后，来自BXD29和C57B1/6J(B6)小鼠的RGC细胞体和轴突中由电压门控Ca²⁺通道(VGCC)介导的Ca²⁺信号。具有早发型ON损伤的BXD29(图4)是我们在测试1中使用的相同品系的小鼠(连同相同的三个实验条件)，而B6小鼠将充当无ON损伤的对照小鼠。将获得每个实验条件下的小鼠眼杯(具有约1mm长的ON残端)。将使用Hamilton注射器将Ca²⁺敏感染料(Fluo-5F，五钾盐；40mM的H2O溶液)和Ca²⁺不敏感染料(Alexa 568，20mM的H2O溶液)的混合物注射到ON残端中。该策略将允许我们使用比率测量法来计算RGC及其轴突中游离Ca²⁺信号的振幅。因为Fluo-5F和Alexa 568的分子量相似，所以它们将以大致相同的速率扩散到细胞中³²。眼杯将在黑暗中被放置在用95％O2/5％CO₂鼓泡的哺乳动物林格溶液中达1小时，以使得染料加载到RGC及其轴突中。视网膜将被分离出来，分成四个象限，使用harp切片网格将RGC侧朝下安装在载玻片上进行稳定，并且使用奥林巴斯FV3000-RS共聚焦显微镜进行成像。将使用六通道重力灌流系统(Warner Instruments)以在生理温度下递送用95％O₂/5％CO₂鼓泡的溶液。通过将细胞外钾浓度([K⁺])从3mM升高到60mM达33秒，使RGC和RGC轴突去极化，从而激活VGCC^33,34。将使用晶体管-晶体管逻辑(TTL)数字信号使升高的[K⁺]的灌流与成像自动化和同步化^35,36。通过减少钠(Na⁺)，高K⁺溶液中的同渗容摩将维持恒定。我们将采用Na+通道阻滞剂河豚毒素(TTX；200nM)，以确定在高K⁺刺激期间Na⁺通道对RGC胞体中[Ca²⁺]瞬变的产生的贡献程度。来自ROI的荧光强度值将在实验条件内取平均值，每个值都被认为是使用Student's未配对t检验进行统计检验的独立观察结果。将在测试1中的临床和实验室结果与测试2中获得的Ca²⁺瞬变振幅之间进行关联。

非限制性的示例性结果：结果将是在正常眼压性青光眼模型(BXD29)中存在/不存在PRG的情况下Ca²⁺瞬变的测量结果。这些结果将允许我们确定PRG作为RGC及其轴突的神经保护治疗剂的作用机制。来自用PRG预防性治疗的BXD29小鼠的归一化Ca²⁺瞬变的振幅将与处于基线(1月龄)的B6小鼠或正常BXD29小鼠类似。此外，由于未经治疗的BXD29小鼠的RGC和轴突在早期就已受损(图5)，所以从4月龄的正常BXD29或未经治疗的小鼠获得的诱发的Ca²⁺瞬变将比用PRG治疗的B6小鼠和BXD29小鼠都大。不希望受理论束缚，RGC健康的阳性指标将与在每种条件下测量的Ca²⁺瞬变的振幅负相关。

另选的方法：本项目的方法论和方法是技术人员所确立和理解的。如果我们在整装制备中未发现来自未经治疗的BXD29小鼠的RGC和轴突的Ca²⁺流入的变化，我们将分离RGC以比较通过VGCC诱发的Ca²⁺信号。为此，我们将对分离的RGC进行全细胞电压钳，并在通过膜片移液管加载Ca²⁺指示剂后进行钙成像。³⁴此外，我们将测试CACNA2D1表达是否在用PRG预防性治疗的BXD29小鼠中有所减少。为了测试这一点，我们将进行半定量免疫组织化学法，并进行较高分辨率成像以比较VGCC亚基的表达。

一个里程碑将是证明：a)PRG对RGC和轴突中的CACNA2D1具有作用，并且b)PRG减少了RGC和轴突中的Ca²⁺信号，与B6小鼠类似。

实施例中引用的参考文献

1Standefer,J.E.，In focus:Glaucoma is second leading cause ofblindness globally.Bull World Health Organ 82,887-888(2004)。

2Tham,Y.-C.等人，Global Prevalence of Glaucoma and Projections ofGlaucoma Burden through 2040.Opthalmology 121,2081-2090(2014)。

3Bourne,R.R.A.，Worldwide glaucoma through the looking glass.Br JOphthalmol 90,253-254(2006)。

4Quigley,H.A.和Broman,A.T.，The number of people with glaucomaworldwide in 2010and 2020.Br J Ophthalmol 90,262-267(2006)。

5Allingham,R.R.、Liu,Y.和Rhee,D.J.，The genetics of primary open-angleglaucoma:A review.Experimental Eye Research 88,837-844,doi:10.1016/j.exer.2008.11.003(2009)。

6Gordon,M.等人，The Ocular Hypertension Treatment Study:baselinefactors that predict the onset of primary open-angle glaucoma.Arch Ophthalmol120,714-720(2002)。

7Libby,R.、Gould,D.、Anderson,M.和John,S.W.，Complex genetics ofglaucoma susceptibility.Ann Rev Genomics Hum Genet 6,15-44(2005)。

8Quigley,H.A.，Glaucoma:macrocosm to microcosm:The FriedenwaldLecture.Invest Ophthalmol Vis Sci 46,2662-2670(2005)。

9Armaly,M.等人，Biostatistical analysis of the collaborative glaucomastudy.I.Summary report of the risk factors for glaucomatous visual-fielddefects.Arch Ophthalmol 98,2163-2171(1980)。

10Leske,M.、Connell,A.、Wu,S.、Hyman,L.和Schachat,A.，Risk factors foropen-angle glaucoma.The Barbados Eye Study.Arch Ophthalmol 113,918-924(1995)。

11Sommer,A.等人，Relationship between intraocular pressure and primaryopen angle glaucoma among white and black Americans.Arch Ophthalmol 109,1090-1095(1991)。

12Chintalapudi,S.R.等人，Systems genetics identifies a role forCacna2d1regulation in elevated intraocular pressure and glaucomasusceptibility.Nat Commun 8,1755(2017)。

13Ibrahim,M.等人，Once Daily Pregabalin Eye Drops for Management ofGlaucoma.ACS Nano 13,13728-13744(2019)。

14Wittenborn,J.和Rein,D.in Prevent Blindness America(2013)。

15National_Eye_Institute.Glaucoma:NEI Looks Ahead,<http://nei.nih.gov/health>(

16A§ci,S.、Demirci,S.、A§ci,H.、Dogug,D.和Onaran,I.，NeuroprotectiveEffects of Pregabalin on Cerebral Ischemia and Reperfusion.Balkin Med J 33,221-227(2016)。

17Kazanci,B.等人，Neuroprotective Effects of Pregabalin Against SpinalCord Ischemia-Reperfusion Injury in Rats.Turk Neurosurg 27,952-961(2017)。

18Moriya,S.等人，Neuroprotective effects of pregabalin in a rat modelof intraci sternal facial nerve avulsion.J Neurosurg Sci 61,495-503(2017)。

19Abraham,M.、Faisal,K.、Biju,C.和Babu,G.，Neuroprotective effect oflacosamide and pregabalin on strychnine induced seizure models in rat.World JPharm Pharmaceut Sci 3,1324-1329(2014)。

20Song,Y.等人，Effect of pregabalin administration upon reperfusion ina rat model of hyperglycemic stroke:Mechanistic insights associated withhigh-mobility group box 1.PLOS One 12,e0171147(2017)。

21Jorige,A.和Annapurna,A.，Neuroprotective Effect of Lacosamide andPregabalin on Pentylenetetrazole Induced Seizure Models in Rat.Br Biomed Bull(2014)。

22Williams,P.等人，Vitamin B3modulates mitochondrial vulnerability andprevents glaucoma in aged mice.Science 355,756-760(2017)。

23Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Novel topicalophthalmic formulations for management of glaucoma.Pharm Res 30,2818-2831(2013)。

24Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Nanoparticle-based topical ophthalmic formulations for sustained celecoxib release.J PharmSci 102,1036-1053(2013)。

25Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Naturalbioadhesive biodegradable nanoparticles-based topical ophthalmic formulationsfor sustained celecoxib release:In vitro Study.Pharm Technol&Drug Res 2,7http://dx.doi.org/10.7243/2050-712QX-7242-7247(2013)。

26Swaminathan,S.等人，Novel Endogenous Glycan Therapy For RetinalDiseases:Safety,In Vitro Stability,Ocular Pharmacokinetic Modeling and Bio-distribution.AAPS Journal 16,311-312(2014)。

27Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，NaturalBioadhesive Biodegradable Nanoparticle-Based Topical Ophthalmic Formulationsfor Management of Glaucoma.Transl Vis Sci Technol 4,12(2015)。

28Jablonski,M.等人，The Tennessee Mouse Genome Consortium:identification of ocular mutants.Vis Neurosci 22,595-604(2005)。

29Chintalapudi,S.等人，Isolation and Molecular Profiling of PrimaryMouse Retinal Ganglion Cells:Comparison of Phenotypes from Healthy andGlaucomatous Retinas.Front Aging Neurosci 8,93(2016)。

30Chintalapudi,S.、Morales-Tirado,V.、Williams,R.和Jablonski,M.，Multipronged Approach to Identify and Validate a Novel Upstream Regulator ofSncg in Mouse Retinal Ganglion Cells.FEBS J283,678-693(2015)。

31Stiemke,A.等人，Systems Genetics of Optic Nerve Axon Necrosis DuringGlaucoma Front Genet 11,31(2020)。

32Van Hook,M.J.和Thoreson,W.B.，Weak endogenous Ca²⁺buffering supportssustained synaptic transmission by distinct mechanisms in rod and conephotoreceptors in salamander retina.Physiol Rep 3,doi:10.14814/phy2.12567(2015)。

33Vaithianathan,T.、Akmentin,W.、Henry,D.和Matthews,G.，The ribbon-associated protein C-terminal-binding protein 1is not essential for thestructure and function of retinal ribbon synapses.Mol Vis 19,917-926(2013)。

34Vaithianathan,T.和Matthews,G.，Visualizing synaptic vesicle turnoverand pool refilling driven by calcium nanodomains at presynaptic active zonesof ribbon synapses.Proc Natl Acad Sci USA 111,8655-8660,doi:10.1073/pnas.1323962111(2014)。

35Vaithianathan,T.、Henry,D.、Akmentin,W.和Matthews,G.，Nanoscaledynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic activezone.Elife 5,doi:10.7554/eLife.13245(2016)。

36Vaithianathan,T.、Wollmuth,L.P.、Henry,D.、Zenisek,D.和Matthews,G.，Tracking Newly Released Synaptic Vesicle Proteins at Ribbon ActiveZones.iScience 17,10-23,doi:10.1016/j.isci.2019.06.015(2019)。

实施例3

青光眼是世界上导致不可逆失明的主要原因，仅在美国就有超过300万人受到影响，预计发病率每年增长4.1％。青光眼有四种主要类型，所有这些类型最终都会引起视网膜神经节细胞(RGC)功能障碍和/或凋亡，进而导致视力受损。对于青光眼的一种形式(原发性开角型青光眼，POAG)，最显著的危险因素是升高的眼内压(IOP)。目前，所有成人发病型青光眼的标准治疗都包括使用四类降IOP药物(例如，β-阻滞剂、碳酸酐酶抑制剂、拟交感神经药、缩瞳剂或前列腺素衍生物)中的一种或多种药物作为局部递送的滴眼剂来进行治疗。这些药物通过抑制睫状体产生房水或增强房水通过流出结构的排液来减少房水体积，从而降低IOP。目前没有疗法能同时影响产生和排液。可用药物的其他限制是它们的半衰期短并且在角膜上的停留时间有限，导致每天需要多达3次给药。每天多次施用滴眼剂的需求以及相关的眼部刺激、眼眶副作用(诸如结膜充血)和全身副作用共同导致了许多眼科医师所记录的低水平的患者顺从性/依从性。

我们使用系统遗传学方法鉴定出了新的降IOP药物靶点，即电压依赖性钙通道α2δ1亚基(又名CACNA2D1)。此外，我们还鉴定出了选择性CACNA2D1阻滞剂，即普瑞巴林(PRG)，其表现出与IOP产生和排液两者相关的双重降IOP活性。我们开发了局部缓释型PRG制剂，其增加了药物进入眼睛，从而使功效更好且作用持续时间更长，同时具有最小的眼部刺激或眼部副作用。我们这项研究的总体目标是进一步开发PRG作为一类新型青光眼治疗剂的代表，其作用机制不同于目前的降IOP药物。我们将重点关注CACNA2D1作为前段中的可成药靶点，目的是优化有效的降IOP治疗，该治疗使IOP降低-40％并在单次局部给药后将其维持在降低的水平达34小时。PRG是经FDA批准再定向为用作青光眼治疗剂的药物，不希望受理论束缚，当PRG配制在具有持续释放、生物粘附和角膜渗透增强特征的局部微乳液中时，将引起与目前市场上的其他青光眼药物相比振幅相等或更大且持续时间更长的降IOP反应。

不希望受理论束缚，我们将完成我们的制剂研究，扩大药物产品的GLP生产，并且完成对具有新作用机制和持续降IOP特性的新型青光眼药物的毒理学研究。这种治疗策略将减少青光眼患者的负担并带来更好的视力结果。为了实现我们的目标，我们将执行以下步骤：

1：在保持功效的同时，提高新型局部施用微乳液制剂的稳定性。

2：在药物非临床研究质量管理规范(Good Laboratory Practice，GLP)条件下制造药物产品以用于毒理学研究。

3：在美国食品和药物管理局(FDA)的指导下进行毒理学研究。

不希望受理论束缚，PRG还提供对RGC的神经保护。在该项研究中，我们将确立神经保护的作用机制及其通过我们的微乳液滴眼制剂所实现的可持续性。该项研究的完成将允许我们扩展我们针对具有包括附加神经保护益处的作用机制的降IOP药物的总体药物开发计划。

实施例4

尽管有可用的治疗选项，但青光眼仍然是世界上不可逆失明的主要原因¹。趋势表明，到2040年，全世界将有多达1.118亿人患有青光眼¹，并且其中许多人将因视神经(ON)损伤而导致法定失明¹。成人发病型青光眼的各种亚型(即，原发性开角型青光眼(POAG)、原发性闭角型青光眼(PACG)和正常眼压性青光眼)与视网膜神经节细胞(RGC)和ON轴突损伤以及随后的视野缺损具有共同的临床病理学²。已知该疾病的几个危险因素^3-5，其中升高的眼内压(IOP)是与青光眼的发展和进展相关的唯一可改变的危险因素^3,6-9。因此，成人发病型青光眼的所有形式的标准治疗都是使用降IOP药物作为局部递送的滴眼剂来进行治疗。我们进行的市场验证研究已经鉴定出了当前青光眼药物的多个问题，其中一些问题是：1)缺乏持续作用；2)需要每天多次给药；3)直接的眼部刺激；4)个体患者的全身和眼部副作用；和5)具有不同作用机制(MOA)的药物的选项有限。我们已经鉴定出了用于治疗青光眼的新的可成药靶点，以及解决这些痛点中的许多痛点的药物和制剂。

使用再定向的治疗剂通过新的MOA降IOP：通过将鼠类遗传学方法与细胞生物学、药理学和人类全基因组关联数据库(GWAS)数据分析相结合，我们鉴定出了显著调节IOP的遗传基因座，即电压依赖性钙通道α2δ1亚基(又名Cacna2d1)¹⁰(图1)。作为我们研究的双向组成部分，我们证实了CACNA2D1在人类POAG群体内的推测的单核苷酸多态性(SNP)。对人、兔子和小鼠的免疫组织化学研究表明，CACNA2D1位于睫状体(CB)和流出结构中(图2)，这两者都会影响IOP。为了验证所鉴定出的靶点，我们证明了用普瑞巴林(PRG)(一种对CACNA2D1具有高度特异性并且阻断电压依赖性钙(Ca²⁺)通过L型Ca²⁺通道的腔静脉孔的通量的拮抗剂¹¹)局部给药以剂量依赖性方式降低了荷兰黑带兔的IOP¹²。这些发现与早期发现一致，这些早期发现表明Ca²⁺通量通过CB和流出结构中的作用作为IOP的调节剂^13,14。这是非常重要的，因为很少有经批准的降IOP药物同时作用于流入和流出结构，并且我们能够阐明Ca²⁺通量对流入和流出控制的潜在但尚未证实的作用。在治疗方面，由于在我们的研究中PRG介导的IOP降低的振幅和持续时间是有限的(IOP降低17％，在6小时处恢复到基线)¹⁵，因此我们设计了新的局部缓释型微乳液(ME)制剂，以增强PRG功效并延长作用持续时间¹²。我们的数据表明，将单滴的我们的最新PRG ME制剂施用于角膜来靶向CACNA2D1实现了多达至少24小时的IOP持续降低，具有比初始制剂显著更好的功效；因此，它支持每天给药一次PRG用于IOP降低(图3；IOP最大降低42％，在33小时处恢复到基线)，使得我们的PRG ME与噻吗洛尔和舒而坦相当或优于它们。这些发现表明了PRG作为一类新型青光眼治疗剂的发展，其MOA不同于目前经批准的降IOP药物。

我们所发现的PRG的降IOP作用及其对调节IOP的结构(睫状体(CB)和流出结构)的特异性定位，以及提供局部施用PRG的延长的作用持续时间的新递送系统，代表了用于降低青光眼的IOP的新治疗方法和新递送系统两者的开发策略。PRG是加巴喷丁药物，但它不与γ-氨基丁酸(GABA)受体结合，也不影响GABA释放或摄取¹⁶。相反，它以高亲和力与CACNA2D1结合，并且通过不涉及抗炎途径的机制来提供镇痛。PRG已广泛用于治疗癫痫发作或神经性疼痛病症(诸如纤维肌痛¹⁷)，且具有安全性¹⁸。已经报道了在一些易感人群中的潜在累加行为以及罕见的超敏反应(诸如血管性水肿)^18,19。因为在我们的ME滴剂(50μL)中PRG的剂量比在片剂或悬浮液中少2000倍以上，并且来自该局部剂量的全身性暴露甚至可以少得多，所以口服剂量副作用在我们的局部给药中将不受关注。

作为青光眼疗法的钙通道阻滞剂(CCB)：它们为何会失败以及对未来研究的影响：电压门控钙通道调节钙(Ca²⁺)流入，并分布于全身。包括CACNA2D1在内的多个亚基组成了通道，并用于调节腔静脉孔的活性(图10)。

因为先前的研究已证明了Ca²⁺与青光眼之间存在联系^20,21，所以靶向腔静脉孔的全身性CCB(例如，维拉帕米)已被评估为用于POAG的疗法。然而，这些研究的结果并不一致，一些研究表明CCB在降IOP和改善视力功能方面是有效的，而其他研究则未能复制那些结果^22-28。全身性CCB也具有显著的副作用，诸如头晕或头痛^22-28。先前没有研究评估过Ca²⁺通道的青光眼相关辅助调节剂，诸如我们的系统遗传学所鉴定出的靶点CACNA2D1(图10)。除了遗传原理以及将经批准且广泛使用的药物再定向于使用PRG而非传统CCB来降低IOP的优点之外，还存在多种物理化学特征，诸如高水溶性、低分配系数和高膜渗透性，这使得PRG成为比CCB更有用的局部治疗选项。这些特征使得PRG能够穿过角膜的上皮层，但仍能够溶于角膜基质和AH的水性环境中，因此它可以通过局部给药到达眼睛中的靶组织。另外，其光敏性的缺乏将使得含PRG的局部制剂的稳定性得到提高。

先前发现的总结以及扩展：我们制备并表征了用于将PRG递送至眼睛的基于延长作用微乳液(ME)的制剂¹²。我们的ME被设计为克服传统滴眼剂的缺点，这些缺点包括排液快速、角膜接触时间短和角膜渗透最小；所有这些缺点都会导致功效降低和患者依从性差。我们通过使用具有原位胶凝特性的高度生物相容性组分设计多层ME来完善这一点，这些原位胶凝特性改善生物粘附、增强角膜渗透并且提供30小时以上的持续药理作用。因为我们的ME具有小的粒径(<20nm)，所以它是透明的并且不会模糊视线。我们确定，对于PRG ME的剂量增加，IOP存在剂量反应性降低，0.6％PRG是提供最大作用的最小剂量，其中IOP降低近40％，直到给药后34小时才恢复到基线(测试1¹²)。我们还确定，用PRG ME重复每天给药持续21天没有导致制剂的功效降低(又名快速耐受性)(测试2¹²)。在整个研究中，经治疗的眼睛的IOP保持在降低的水平，而对照眼睛保持在升高的基线IOP。在快速耐受性研究结束后，我们还测定了PRG在眼睛和身体中的分布(测试2¹²)。在用我们的PRG ME连续21天局部给药后，我们确定药物到达了眼睛中的靶组织。接受空白ME的对照眼睛含有微量水平的PRG，血浆和所有外周器官也是如此。裂隙灯和组织病理学检查确定载药的ME是安全的并且是眼睛能良好耐受的¹²。

健康益处：鉴于青光眼患病率的上升和人类寿命的预计增加，青光眼的发病率将相应增加。在2013年，美国青光眼的经济负担估计为约58亿美元29。我们产品的开发将提供用于控制青光眼的治疗方法，其将在青光眼治疗中占有市场份额。这一立场得到了PRG的新MOA的支持，每天一次的给药方案与市场领先者相比具有优异的功效(IOP降低了-40％，在>30小时内不会恢复到基线)，并且具有高生物相容性。由于PRG具有独特的MOA、高功效和长持续时间，不希望受理论束缚，因此它不仅可用于单药治疗，而且可与其他青光眼治疗剂组合使用。不希望受理论束缚，基于300万受影响的美国人的患病率估计、200美元/5mL每瓶的成本、10％的市场份额，以及患者的两只眼睛将每天接受单滴，我们的局部制剂将维持4.38亿美元的美国年市场峰值。根据预测，到2050年，美国人的患病率将增加630万30，遵循相同的假设，我们的美国市场份额可增加到9.2亿美元。尽管我们正在将我们的制剂设计成与PRG一起使用，但这种ME可被改性成适于水不溶性药物的掺入。因此，我们的微乳液的效用超出了我们目前的药物(PRG)和我们目前所针对的疾病(青光眼)。微乳液与其他纳米药物递送系统(例如，纳米颗粒)的比较表明，微乳液是稳定的，易于制备，在制备期间无能量需求，具有100％的包封效率(因为在其制备期间不存在API损失)，并且含有改善所掺入药物的角膜渗透性的渗透增强剂。这些特性使得微乳易于以批量规模扩大，以供药物制造公司生产用于商业用途。

我们已发现了几个额外的、意想不到的发现。我们的数据表明，CACNA2D1也在视网膜神经节细胞(RGC)体中以及视神经(ON)中的RGC轴突中表达。在用我们的ME连续21天局部给药后，PRG以足以抑制CACNA2D1的浓度到达眼后部组织，包括视网膜。此外，我们的PRG ME的局部给药减轻了BXD29小鼠(正常眼压性青光眼的临床前模型)中的ON损伤。基于这一证据，我们正在寻求这一重要线索并且确定CACNA2D1是否可作为RGC上的可成药靶点以防止青光眼诱导的RGC神经变性，另外，确定其通过CB和流出结构的降IOP作用。不希望受理论束缚，PRG制剂可将治疗剂量递送至视网膜并且对RGC具有神经保护作用，不希望受理论束缚，我们的市场份额可以增加，因为该制剂将是唯一既能降低IOP又能对RGC提供直接神经保护的青光眼疗法。

方法：

我们已经鉴定出了IOP调节基因Cacna2d1，以及以高亲和力和特异性结合CACNA2D1蛋白以降低IOP的药物PRG^15,11。目前所有的疗法都具有局限性，包括缺乏持续作用、眼部刺激以及其他副作用和药物相互作用。为经历这些副作用的患者改变疗法是具有挑战性的，因为目前所有的疗法都与一组受限制的MOA相关。许多患者需要多于一种药物来达到目标IOP水平。MOA不同的治疗选项的有限可用性加剧了这两个挑战。PRG代表一类新型青光眼药物，其通过新的、先前未知的靶点和MOA发挥作用，因此为许多患者提供了急需的选项。因为CACNA2D1定位于眼睛中的流入和流出结构两者(图2)^12,15，所以PRG可提供双重的协调作用来降低IOP。PRG已被FDA批准并且目前是非专利的，这将使得我们能够通过505(b)(2)监管途径将它再定向并且提供一类急需的新型青光眼疗法。

我们已经制备并表征了用于将亲水性药物递送至眼睛的基于缓释型、多层、生物粘附、耐受性良好的局部ME的制剂。我们的ME被设计为克服传统滴眼剂的缺点，这些缺点包括排液快速、角膜接触时间短和角膜渗透最小，所有这些缺点都会因为需要每天多次给药而导致功效降低和患者顺从性差。功效的改善得益于黏膜粘附特性增强、角膜渗透性增加、粒径变小、渗透能力增强和缓释。我们将提高该制剂目前3个月的稳定性以延长保质期，从而便于临床应用。

除了ME的有利物理特性之外，还存在使ME生产优于其他缓释型替代物的益处。ME可容易地制造成无菌的。此外，在ME生产期间，包封效率大致为100％，因此允许扩大工艺规模以进行大批量生产。从经济学的观点来看，ME制造是高效的，因为除了简单的混合之外，它不需要任何能量输入。

非限制性的示例性方法

这将推动我们的产品获得监管部门批准，以将我们的缓释型PRG ME用于降低青光眼和/或高眼压患者的IOP。我们确定了在兔子中提供最大降IOP反应的最小每天一次剂量，并且证明了持续21天每天一次的单一给药不会降低我们的PRG ME的功效，但保持了其对眼睛的安全性和生物相容性以及最小的全身性暴露。我们还发现，用我们的PRG ME局部给药增加了进入眼睛的药物的量。另外，我们确定PRG可到达视网膜，因此允许用于眼后部靶点的这种给药模式，同时限制药物到达未给药的对侧眼睛或非靶向器官¹²。这项研究的工作重点是通过延长制剂目前3个月的稳定性，同时维持充分的功效，使其成为具有至少12个月保质期的可行药物产品，从而增强我们的药物产品的价值主张。我们将把我们的制造规模扩大到大批量生产和GLP制造，以用于毒理学研究。我们将进行毒理学研究。PRG目前是经FDA批准用于其他目的的药物。自2005年以来，PRG一直是经批准用于疼痛管理的产品，并且已经有超过1600万人开具了处方并服用(Lyrica网站FAQ)。另外，我们已经证明，在眼部施用PRG后没有全身性暴露的证据¹²。

研究设计和方法

1：在保持功效的同时，提高我们的新型局部施用微乳液制剂的稳定性。

目的：我们将验证具有持续降IOP特性的新型青光眼药物的制剂，并证明其在物理上和化学上均稳定最少1年，并且在长时间段储存后仍对我们的青光眼兔子模型有效，以确保改善的制剂的效力。

提高我们的ME制剂的化学稳定性。

结果：普瑞巴林(PRG；BCS I类)以高亲和力和特异性靶向CACNA2D1 11。我们确定，当局部施用时，单滴的PRG水性溶液以剂量依赖性方式降低了IOP。然而，反应的振幅和持续时间是有限的并且对于临床应用是行不通的。为了提高PRG作为降IOP药物的功效，我们设计了新的微乳液局部制剂¹²。我们的制剂被设计为水包油包水微乳液，其中最里面和最外面的水相中分别含有40％和60％的PRG。PRG在两个水相中的区室化支持了降IOP作用的快速起效和长持续时间。药物从最外面的水相的释放是快速的，从而允许快速降低IOP。然而，为了从最里面的水相释放，PRG必须通过两个界面，即内部的水/油界面和外部的油/水界面，在此之后它必须扩散通过构成我们的多层ME的最外面的水相的粘性聚合物溶液(图12)。总的来说，跨越两个界面的移动减缓了PRG从我们的制剂中的移动，并且支持了延长的降IOP作用。在从最外面的聚合物扩散后，PRG能够通过角膜吸收。为了确保制剂将在角膜表面上保留足够的时间以允许药物的持续释放，最外面的水凝胶层由具有优异的生物粘附特性的Carbopol 981制备。

表1：PRG ME液滴为<20nm，具有高ζ电位 ¹²。

我们的ME具有小的液滴大小，其不受载药量的影响(表1)。它的低PDI表明尺寸的变化最小，这通过透射电子显微镜(TEM；小球，图12)得到证实。X射线衍射数据表明，PRG可溶于我们的ME中，并且不存在PRG晶体¹²。另外的表征显示，与PRG滴眼剂相比，我们的PRG ME具有更低的粘度(这有利于其从点滴器中分配)和更高的生物粘附性(这将使其在给药后保持定位在眼睛内)¹²。一个特点将PRG掺入到我们的ME中将其释放时间延长到了超过24小时，而作为水性滴眼剂时释放时间只有3小时(图13)。鉴于其高ζ电位(表1)，ME可以是稳定的。遵循国际医药法规协和会(International Conference on Harmonization，ICH)提出的指南³¹，我们评估了我们的制剂在5℃、25℃、30℃和40℃下的化学稳定性和物理稳定性。通过测定pH、大小、PDI、ζ电位、药物释放和药物含量来评估化学稳定性³¹。使用重复冻融循环并通过超速离心来测定物理稳定性32,33。我们的结果证明我们的ME的药物含量(我们的制剂的化学稳定性的指标)在5℃和25℃下保持在可接受的药典限度内达3个月，并且在30℃和40℃下保持在可接受的药典限度内达2个月(表2)。尽管在储存一年期间，我们的制剂的物理特性没有变化并且化学稳定性的其他指标(pH、液滴大小和电荷)保持不变，但是必须优化药物含量的保留以确保成功开发出具有合理/行得通的保质期的可行商业药物产品，以供临床试验和后期使用。

表2：储存长达4个月后PRG的药物含量(％)。我们目前的PRG ME在5℃和25℃下化学稳定3个月，并且在30℃和40℃下化学稳定2个月。其他参数稳定至少12个月。

非限制性研究设计和方法：我们将优化我们的制剂以提高PRG在我们的ME中的化学稳定性。这将分两个步骤进行：1)短期稳定性和抗氧化剂筛选研究，然后是2)遵循ICH指南的稳定性研究。不希望受理论束缚，我们将得到具有约12个月的最短保质期的制剂。

微乳液的制备：我们的多层水包油包水(w/o/w)ME生物粘附滴眼剂的制备分几个步骤完成。制备初级w/o ME，并将其进一步乳化到先前浸有生物粘附聚合物的外部水性溶液中。为了确定初级微乳液组分的适当比率，使用不同的疏水性表面活性剂通过水滴定法构建几个三相图¹²。我们选择的初级w/o ME由20％的水(其中溶解有40％的药物；图14，步骤1)+[30％的油(labrafac亲脂性WL1349)+50％的表面活性剂混合物(capryol 90和大豆卵磷脂，1:1；图14，步骤2)]组成。外部水相由50％的水(其中溶解有60％的药物(图14，步骤3))+(10％labrasol+10％cremophor EL+30％的丙二醇)的混合物(图14，步骤4)组成。将生物粘附聚合物(Carbopol 981，0.15％)将浸泡在先前制备的外部水相中，并使其溶胀过夜以产生粘性聚合物/表面活性剂溶液。将所制备的含有40％的聚合物/表面活性剂溶液的w/o微乳液充分混合，直至形成澄清的多层w/o/w微乳液生物粘附滴眼剂。

**抗氧化剂的添加：在储存期间，制剂中活性药物成分(API)的降解通过几种途径发生，这些途径包括酸性和/或碱性降解、氧化降解、水性水解、光分解和热降解。PRG对于水性水解、光分解和热降解是稳定的，并且对于酸性水解是相对稳定的³⁴。相比之下，它在碱性和氧化条件下是不稳定的³⁴。基于这些数据，当在水性介质中储存时，PRG很容易在碱性pH下或通过氧化降解被降解。我们的ME具有弱酸性pH(5.4±0.05)，因此对我们的ME中PRG的化学稳定性产生负面影响的因素是氧化降解。

表3：测试水性和脂溶性抗氧化剂以提高ME稳定性的策略。注意：由于其乳化特性，在含TPGS的制剂中，制剂组分的比率需要使用我们公开的方法12来确定。

为了对抗氧化降解，并由此提高我们的PRG ME的化学稳定性，我们将会把一种或多种水溶性抗氧化剂掺入到内部水相和外部水相中(图15，蓝色)，并且/或者把油溶性抗氧化剂掺入到我们的ME的中间油相中(图15，棕褐色)，以保护PRG在储存期间免受氧化降解。使药物制剂中包含抗氧化剂，以增强易被氧化化学降解的API的稳定性。在我们的ME中测试的水溶性抗氧化剂包括：谷胱甘肽(CAS#70-18-8)；生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS；CAS#9002-96-4)；或焦亚硫酸钠(CAS#7681-57-4)。待测试的油溶性抗氧化剂包括：α生育酚(维生素E；CAS#10191-41-0)；丁基羟基甲苯(BHT；CAS#128-37-0)；或丁基羟基茴香醚(BHA；CAS#25013-16-5)。为了确定最有效的抗氧化剂或抗氧化剂组合，将首先进行预稳定性和抗氧化剂筛选研究，然后遵循ICH指南进行完全稳定性研究。这些成分中的许多成分已用于延长许多API的稳定性并且可达到12个月的稳定性。

抗氧化剂筛选期间短期制剂稳定性的评估：通过将一种或多种抗氧化剂单独或组合添加到我们的ME中来实现抗氧化剂的筛选，如表3所示。通过将含有抗氧化剂的制剂在25℃、30℃、40℃这三个不同温度下储存三个月来对其进行加速稳定性研究。每15天评估一次储存的制剂的物理外观、药物含量和pH。如果所有制剂都保持稳定达三个月，则该短期研究将延长到六个月。根据这些加速稳定性结果，将选择最有效的抗氧化剂用于最终优化的制剂。

根据ICH指南进行优化制剂的完全稳定性研究：根据短期稳定性和抗氧化剂筛选研究的结果，将根据ICH指南对含有最有效抗氧化剂的最终优化的制剂以及不含抗氧化剂的原始制剂进行稳定性研究，如下所示：将遵循ICH指南评估制剂的物理稳定性(冻融循环和离心测试)和化学稳定性。因为我们不知道我们打算将我们的制剂在其保质期期间储存在什么储存条件下最好，所以我们将测试不同的条件，包括室温、冷藏或冷冻条件。对于长期稳定性研究，制剂将在-20℃、5℃和25℃下储存1年。中间稳定性研究将在30℃下进行6个月。加速稳定性研究也将使用我们的标准方法在40℃下进行6个月。在储存期间，将每月评估制剂的药物含量、pH、液滴大小、PDI和ζ电位。最初还将测试释放模式，然后每6个月测试一次，以评估ME维持其持续释放行为的能力。

将使用以下方法来评估物理稳定性和化学稳定性(一式三份的样品)：

物理稳定性：将使用重复冻融循环并通过超速离心来测定物理稳定性^32,33。

PRG含量：将使用我们的HPLC-UV方法¹²来测定制剂和放行样品中的药物含量。

pH测定：将使用pH计(Corning pH计440)来测定pH¹²。

平均液滴大小、多分散指数(PDI)和ζ电位测量：我们的ME制剂的平均液滴大小、PDI和ζ电位将在适当稀释后使用Zetasizer(Nanoseries，nano-ZS)进行测定35。所有测定将在25℃下进行。

测试1.2：在IOP升高的兔模型中确认来自测试1.1的优化制剂的功效。

表4：图6所示制剂的药效学参数

数据表示为±SEM平均值；n＝3Tmax：达到最大反应的时间(以小时为单位)

T_end(h)：到反应结束的时间(以小时为单位)

AUC(％，H)：％IOP降低对时间曲线下的总面积

数据：我们评估了我们的PRG ME在荷兰黑带兔中的功效12，并证明了单滴的我们的ME制剂维持了降低的IOP(降低42.3％；表4)，其在单次施用后34小时处恢复到基线(AUC＝788.6％·小时)。在不存在我们的ME的情况下，在Carbopol 981凝胶中的相同药物仅产生了29.4％的IOP降低，其在10小时处恢复到基线(AUC＝172.3％·小时)，证明将药物掺入到我们的ME中增强了药物的功效。此外，我们的W/O/W ME的所有三层的组合效应对于增强PRG的功效至关重要。我们还表征了ME，并且确定其增加了PRG穿过角膜的渗透并且在眼睛中是安全且耐受性良好的12。使用该相同模型，我们将评估来自测试1.1的我们的优化制剂。

为了评估我们的PRG ME的长期使用，我们使用连续21天每天给药的方式进行了快速耐受性、生物相容性和生物分布研究¹²。我们的数据表明，在第一次给药PRG ME之后，IOP维持在13mmHg至14mmHg的正常生理范围；与19.3mmHg的基线相比，p<0.001)。重要的是，在给药21天后，兔子的角膜和结膜看起来很健康，同时前房中没有细胞或闪辉，这提供了证据表明我们的ME在眼睛中的耐受性良好。组织病理学也证实了这一发现¹²。

研究设计和方法：荷兰黑带兔(Envigo兔群；前Covance)将用于该单剂量设计研究。来自该兔群的兔子可具有比从其他兔群购买的那些兔子更高的基线IOP值。在开始研究前，将使兔子(雄性和雌性各一半)适应处理和IOP测量至少七天。在研究前后将进行裂隙灯生物显微镜和眼底镜检查。将在该模型中使用我们的方法¹²对来自测试1.1的我们的前三种制剂进行测试。在施用制剂之前立即(基线，上午8点)并且在施用后每隔一小时，使用回弹式眼压计(Tono-Pen AVIA Vet，Reichert)测量两只眼睛的IOP，直到IOP恢复到基线。将使用无菌微量移液管尖端，将三十微升的含有PRG ME的制剂或空白对照局部滴入每只兔子的一只眼睛中，同时对侧眼睛将接受制剂媒介物并因此用作对照。在每天上午8点对兔子给药，持续21天，并且使用我们的方法¹²在上午8点(给药前立即)和测量到最大IOP降低的时间(Tmax)收集IOP。将产生类似于图16的曲线。如图17所示，将使用裂隙灯生物显微镜评估含抗氧化剂的制剂的生物相容性。进行研究的人将对每只兔子的哪只眼睛接受含药制剂和哪只眼睛接受空白对照不知情。假设效能为80％，IOP结果的边际差异为30％，我们估计这项研究将需要10只兔子。我们还将在C57B1/6J(B6)小鼠和食蟹猴中评估这些制剂，这将允许进行物种确认和比较。

不希望受理论束缚，向我们的ME的水相和/或油相中添加一种或多种抗氧化剂将提高PRG的化学稳定性并防止其在储存期间降解。ME是稳定的制剂，并且只要其水/油比保持恒定，就可保持其物理稳定性。因为抗氧化剂将作为ME的油和/或水含量的一部分被添加，所以相体积比将保持恒定，这可维持我们的ME的物理稳定性和完整性。添加有抗氧化剂的优化的ME将继续保持高效，在降IOP能力或作用持续时间方面几乎没有变化。PRG在口服溶液中的化学稳定性具有1年以上的稳定性(NDA 22-488)。

另选的方法：虽然短期稳定性和抗氧化剂筛选研究将确定抗氧化剂是否能提高我们的ME的化学稳定性，但是单靠抗氧化剂可能不足以将我们的产品的保质期延长至两年。包括较冷储存温度(5℃和-20℃)的评估将告知我们是否有必要低温储存以改善制剂稳定性。如果将抗氧化剂掺入到我们的ME中或改变储存温度未能提高ME的稳定性，我们将探究将抗氧化剂(例如，BHT、BHA或比率为1:1的它们的组合)掺入到瓶材料(HDPE)中以及在氮气气氛下包装。因为大多数氧化反应发生在瓶壁和制剂之间的界面处，而不是在制剂的本体内，所以将抗氧化剂掺入到瓶材料中并且在氮气下包装将有助于阻止因氧化而导致的PRG降解。

不希望受理论束缚，测试1可证明我们的ME制剂在添加抗氧化剂以维持功效后稳定性提高至一年。来自加速稳定性的结果将用于计算每种制剂的趋势分析图。我们将使用这些图来告知使我们的制剂转移到我们的GMP制造商(测试2)。

2：在药物非临床研究质量管理规范(GLP)条件下制造药物产品以用于毒理学研究。

目的：我们将优化测试方法并使其合格，以分析评估我们的API原料和制造的药物产品。我们将制造GLP药物产品，并开始根据ICH指南分析杂质。这可以使得：1)药物产品制备方法转移到制造现场；2)生产适于毒理学研究的工程规模扩大的GLP批次；3)鉴定和表征显著的杂质和降解物(≥0.10％)。我们的目标是成功制造出稳定最少1年的用于毒理学研究的GLP药物产品。

2.1：优化、量化和转移分析测试方法以支持制造、质量放行和稳定性研究期间的药物测试。

HPLC-UV：成功开发了使用反相HPLC和紫外(UV)检测的LC-UV分析测定法，以用于估计PRG效力和纯度¹²。该方法用于评估普瑞巴林API以及最终药物产品。

平均液滴大小、多分散指数(PDI)和ζ电位测量：我们的ME制剂的平均液滴大小、PDI和ζ电位将在适当稀释后使用Zetasizer(Nanoseries，nano-ZS)进行测定³⁵。将在25℃下以一式三份进行测定。

透射电子显微镜：将使用透射电子显微镜(TEM)(JEOL JEM1200EX II电子显微镜)对我们的PRG ME的形态以及液滴大小进行确认。简而言之，用MilliQ水以1:100稀释ME制剂。将两微升稀释的ME放置在用Formvar膜(Electron Microscopy Sciences EMS)覆盖的400目铜网格上。将使网格在干燥器中干燥2小时，随后用无铀EM染液(ElectronMicroscopy Sciences EMS)进行负染色，然后通过TEM进行检查。

粘度测定：根据我们的方案^36,37，使用锥形(1.5°)和平板旋转粘度计(BrookfieldDV-II+可编程粘度计；Brookfield Engineering Laboratories)测定我们的制剂的粘度。在每次测定之前，将每种制剂(500μL)放置在粘度计的固定板上5分钟，以达到运行温度。将在35℃±0.5℃下以一式三份测定粘度。

生物粘附力的测定：我们的ME滴眼剂的生物粘附力将通过简单的方法进行测定，该方法取决于对将生物粘附聚合物与粘蛋白分散体混合时发生的流变协同作用的评估^38,39。将把II型胃粘蛋白(15％，w/v)分散在模拟泪液(pH 7.4)中并使其在4℃下溶解过夜。在测定之前，将粘蛋白分散体加热至35℃，然后将其与预先加热至相同温度的制剂混合。将使用Brookfield粘度计以一式三份测定粘蛋白分散体、制剂和它们的混合物的粘度。将使用我们的方法¹²计算由于生物粘附以及生物粘附力引起的粘度变化。

研究设计和方法：

2.2：用于毒理学研究的GLP药物产品制造和稳定性。由IRISYS进行

数据：我们已经使用图16所示的方法在内部制造了小批量的PRG ME，每批最多500g。我们的PRG ME在5℃和25℃下化学稳定3个月，并且在30℃和40℃下化学稳定2个月(表2)，我们将对其进行进一步优化，以在测试1.1中将化学稳定性提高至1年。最终优化的制剂将被转移到IRISYS以用于GLP制造和评估，为未来毒理学研究做准备。

将针对来自测试1.1的具有最长化学稳定性的前三种制剂，生成GLP示范批次(每批次5,000瓶)的批次记录。将生产这些示范批次以确立分析测试方法的流程和灵敏度。基于所遵循的几乎相同的流程，这些示范批次和未来的GMP批次中的杂质概况可以是类似的。示范批次将用于GLP毒理学研究。另外，这些工程批次将根据ICH指南在-20℃、2℃至8℃、25℃和40℃下进入长达最少12个月的稳定性测试。因为我们计划将该批次用于所有我们的毒理学研究，所以我们将填充足够的样品以产生24、30和36个月的结果，从而使我们能够在我们的整个毒理学项目中跟踪稳定性。然而，将仅对经过12个月老化的样品进行分析。

2.3：对在PRG ME药物产品中发现的杂质的探索性鉴定和表征。

可鉴定和表征杂质和降解物(≥0.10％)。PRG ME药物产品内的杂质可以是：1)普瑞巴林药物物质中存在的已知杂质；和2)我们的PRG ME制剂中的未知杂质。在普瑞巴林中发现的六种已知杂质和降解产物34以及潜在来源如下：

烯烃杂质、4-烯杂质或4,5脱氢普瑞巴林(CAS#216576-74-8；Toronto ResearchChemicals)

二酸杂质、3-羧基-5-甲基己酸(CAS#5702-99-8；Toronto Research Chemicals或Simon Pharma Limited)

3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基己酸(CAS#181289-33-8；Toronto ResearchChemicals)

(5)-4-异丁基吡咯烷-2-酮、内酰胺杂质或PD 0147804(CAS#61312-87-6；TorontoResearch Chemicals)

二酮杂质或4-异丁基哌啶-2-6-二酮(CAS#916982-10-0；Toronto ResearchChemicals或Sigma Aldridge)

R-对映体杂质或PD 0144550(CAS#148553-51-9；Toronto Research Chemicals或Sigma Aldridge)

非限制性的示例性研究设计和方法：将使用药物产品的HPLC分析对我们优化的含有抗氧化剂的PRG ME的初始GLP批次进行探索性杂质谱分析。峰面积>0.10％的杂质的初始结构表征将通过MS/MS分析进行。为了确认这些结构，将购买鉴定出的杂质并使用LC/MS、MS/MS和NMR光谱数据进行表征。其中许多杂质将与目前市售的PRG药品(NDA 22-488)中所见到的杂质相同，因为这些杂质将从药物物质携带出来。

在整个研究中，可以进行以下步骤：1)转移用于药物产品放行和稳定性的必要测试方法并使其合格；2)制造适于毒理学研究的高质量药物产品的前3种制剂中的每一种的GLP批次；3)制造安慰剂/ME媒介物的GLP批次；4)确定该药物产品在2℃至8℃和室温下稳定最少两年；5)按照ICH指南的要求，鉴定和表征已通过分析鉴定出的PRG杂质。

测试2的度量可包括：1)用于毒理学研究的GLP药物产品的制造；2)6个月加速稳定性数据；以及3)根据ICH指南的12个月长期稳定性数据。

3：毒理学评估。

3可测定我们的PRG ME在兔子中的未观察到不良事件水平(no-observed-adverse-event-level，NOAEL)(测试3.1)，其将指导对兔子进行的未来GLP长期重复剂量研究的适当剂量的选择。

3.1：为期四周的非GLP、重复剂量、剂量范围发现毒性研究。

4的数据：自2005年以来，PRG一直是经批准用于疼痛管理的产品，并且已经有超过1600万人开具了处方并服用，因此现有临床数据库很大(Lyrica网站FAQ)。在眼部施用PRG后，没有发现可检测水平的全身性暴露的证据¹²，这可对安全性概况产生有利影响。将在这项研究中进行高剂量后的毒代动力学分析，以获得关于全身性暴露的水平的确切数据。我们已经遵循Pauly等人40的方法验证了用超高效液相色谱-串联质谱12评估PRG浓度的生物分析方法，并进行了修改，包括使用保护柱。使用该HPLC方法的定量水平(LOQ)为越2.5pg/mL。

已在室内进行了重复剂量安全性研究，并且未观察到任何不良事件。确定未观察到不良事件水平(NOAEL)是非临床风险评估的重要部分，并且将有助于确定我们的初始临床试验中的最大推荐起始剂量。(通过增加浓度和增加每天的施用次数)增加剂量是确定NOAEL和鉴定应当在临床试验中监测的潜在不良事件所必需的。这项研究将预示并告知长期GLP重复剂量毒性研究中使用的剂量。

表5：用于毒性研究的动物分布。

非限制性的示例性研究设计和方法：将在雄性和雌性荷兰黑带兔中进行标准的眼部毒性研究设计。将研究低剂量(有效剂量)、中等剂量(3倍有效剂量)和高剂量(10倍有效剂量)，以评估我们的PRG ME的治疗窗。在收集数据之前，将使动物适应IOP测量。

适应将包括每周5天上午和下午对两只眼睛进行测量IOP，持续2周。将每天检查动物两次以进行死亡率核查，并且每天检查动物以进行笼边观察。每周进行包括体重在内的详细临床观察。将动物分成4组，并根据表5给药，持续4周。将收集以下终点：

大体的眼部观察：大体的眼部观察将使用调整后的draize评分系统进行，并且将在研究前进行一次，并且每周在最后一天施用后约0.5小时进行一次。

眼部检查(OE)：OE将由委员会认证的兽医眼科医师使用裂隙灯生物显微镜和间接检眼镜进行。将使用调整后的Hackett-McDonald评分系统来评估两只眼睛。检查将在研究前进行一次，并且在第1天、第8天、第15天、第22天各进行一次，并在验尸前(在最后一天施用后约0.5小时)进行一次。

眼内压(IOP)：将使用回弹式眼压计获得IOP，以评估两只眼睛中的药理作用。将在研究前、第1周期间、第2周期间和验尸前分别测量一次IOP。

角膜厚度测量：角膜厚度测量读数将从中央角膜对两只眼睛进行，并在研究前和验尸前进行。

角膜内皮细胞显微镜检查：角膜内皮细胞显微镜检查将在麻醉动物的两只眼睛中进行评估，并且将包括角膜内皮细胞的标准数值评估。将在研究前和验尸前进行评估。

视网膜电图(ERG)：将在麻醉动物的两只眼睛中进行全视野暗适应视网膜电图测试。将在研究前和验尸前进行评估。

临床病理学：将在研究前和验尸前对采集的血液进行临床病理学评估。将在验尸时收集尿液。评估的参数将是标准血液学、凝血、血清化学和铀分析组。

毒代动力学(TK)：将从第1天和第29天(第二次每天施用后10分钟、30分钟和90分钟)采集的血液评估血浆中的测试制品浓度。

大体的验尸：将进行包括标准非眼部组织列表在内的大体的验尸。将收集器官重量。将收集的眼部组织包括：具有球结膜的右眼、眼睑、泪腺、下颌淋巴结、瞬膜、哈德氏腺、视神经、鼻甲、鼻咽、具有房水收集的摘除的右眼。

组织浓度：将收集以下眼部组织中的测试制品浓度：眼房水、角膜、虹膜/睫状体、玻璃体液、视网膜、脉络膜/RPE。

组织病理学：将对所有动物的眼部组织和附件组织进行显微镜评估，并且对每只眼的三张载玻片进行评估(石蜡包埋和苏木精-伊红染色(H&Estain))。非眼部组织将储存在固定剂中，以用于未来评估。

这些研究旨在1)深入了解我们完成研究的计划并就此获得FDA的同意，以及2)确定我们的PRG ME在兔子中的NOAEL，并自信地选择用于在我们的后续实验中对兔子进行的GLP长期重复剂量研究的适当剂量。

性能终点：测试3的主要终点/成功度量将包括：1)同意完成研究的计划，2)为期4周的研究的最终研究报告(包括确定的NOAEL)，以及3)用于我们未来长期GLP重复剂量毒性研究的推荐剂量水平。

该实施例中引用的参考文献

1Tham,Y.-C.等人，Global Prevalence of Glaucoma and Projections ofGlaucoma Burden through 2040.Opthalmology 121,2081-2090(2014)。

2Allingham,R.R.、Liu,Y.和Rhee,D.J.，The genetics of primary open-angleglaucoma:A review.Experimental Eye Research 88,837-844,doi:10.1016/j.exer.2008.11.003(2009)。

3Gordon,M.等人，The Ocular Hypertension Treatment Study:baselinefactors that predict the onset of primary open-angle glaucoma.Arch Ophthalmol120,714-720(2002)。

4Libby,R.、Gould,D.、Anderson,M.和John,S.W.，Complex genetics ofglaucoma susceptibility.Ann Rev Genomics Hum Genet 6,15-44(2005)。

5Quigley,H.A.，Glaucoma:macrocosm to microcosm:The FriedenwaldLecture.Invest Ophthalmol Vis Sci 46,2662-2670(2005)。

6Quigley,H.A.和Broman,A.T.，The number of people with glaucomaworldwide in 2010and 2020.Br J Ophthalmol 90,262-267(2006)。

7Armaly,M.等人，Biostatistical analysis of the collaborative glaucomastudy.I.Summary report of the risk factors for glaucomatous visual-fielddefects.Arch Ophthalmol 98,2163-2171(1980)。

8Leske,M.、Connell,A.、Wu,S.、Hyman,L.和Schachat,A.，Risk factors foropen-angle glaucoma.The Barbados Eye Study.Arch Ophthalmol 113,918-924(1995)。

9Sommer,A.等人，Relationship between intraocular pressure and primaryopen angle glaucoma among white and black Americans.Arch Ophthalmol 109,1090-1095(1991)。

10Chintalapudi,S.等人，Systems Genetics Identifies a Role forCacna2d1Regulation in Elevated Intraocular Pressure and GlaucomaSusceptibility.Nature Communications 8,1755(2017)。

11Klugbauer,N.、Marais,E.和Hofmann,F.，Calcium channel alpha2deltasubunits:differential expression,function,and drug binding.Journal ofBioenergetics and Biomembranes 35,639-647(2003)。

12Ibrahim,M.等人，Once Daily Pregabalin Eye Drops for Management ofGlaucoma.ACS Nano 13,13728-13744(2019)。

13Brubaker,R.in Glaucoma.Applied Pharmacology in Medical Treatment(eds SM Drance&AHNeufeld)35-70(Grune and Strat-ton,Inc.,1984)。

14Ryskamp,D.等人，TRPV4regulates calcium homeostasis,cytoskeletalremodeling,conventional outflow and intraocular pressure in the mammalianeye.Sci Rep 6,30583(2016)。

15Chintalapudi,S.R.等人，Systems genetics identifies a role forCacna2d1regulation in elevated intraocular pressure and glaucomasusceptibility.Nat Commun 8,1755(2017)。

16Belliotti,T.等人，Structure-Activity Relationships of Pregabalin andAnalogues That Target the a2-8Protein.J.Med.Chem 48,2294-2307(2005)。

17Field,M.等人，Identification of the alpha2-delta-l subunit ofvoltage-dependent calcium channels as a molecular target for pain mediatingthe analgesic actions of pregabalin.Proc Natl Acad Sci USA 103,17537-17542(2006)。

18Bonnet,U.和Scherbaum,N.，How addictive are gabapentin andpregabalin？A systematic review.Eur Neuropsychopharmacol 27,1185-1215(2017)。

19Pfizer.labehng.pfizer.com/ShowLabeling.aspx？id＝561#S6.1.

20McElnea,E.等人，Oxidative stress,mitochondrial dysfunction andcalcium overload in human lamina cribrosa cells from glaucoma donors.Mol Vis17,1182-1191(2011)。

21Crish,S.和Calkins,D.，Neurodegeneration in glaucoma:progression andcalcium-dependent intracellular mechanisms Neuroscience 176,1-11(2011)。

22Payne,L.、Slagle,T.、Cheeks,L.和Green,K.，Effect of Calcium ChannelBlockers on Intraocular Pressure in Rabbits.OphthalRes 22,337-341(1990)。

23Wiederholt,M.、Thieme,H.和Stumpff,F.，The regulation of trabecularmeshwork and ciliary muscle contractility.Prog Retin Eye Res 19,271-295(2000)。

24Siegner,S.、Netland,P.、Schroeder,A.和Erickson,K.，Effect of calciumchannel blockers alone and in combination with antiglaucoma medications onintraocular pressure in the primate eye.J Glaucoma 9,334-339(2000)。

25Luksch,A.等人，Effect of nimodipine on ocular blood flow and colourcontrast sensitivity in patients with normal tension glaucoma.Br J Ophthalmol89,21-25,doi:10.1136/bjo.2003.037671(2005)。

26Jani,A.、Goyal,R.、Shah,G.和Mehta,A.，Effect of calcium channelblockers on intraocular pressure in rabbits.Iranian JPharm&Therap 4,95-99(2005)。

27Araie,M.和Mayama,C.，Use of calcium channel blockers forglaucoma.Prog Retin Eye Res 30,54-71(2011)。

28Ganekal,S.、Dorairaj,S.、Jhanji,V.和Kudlu,K.，Effect of TopicalCalcium Channel Blockers on Intraocular Pressure in Steroid-inducedGlaucoma.J.Curr Glaucoma Pract 8,15-19(2014)。

29Wittenborn,J.和Rein,D.in Prevent Blindness America(2013)。

30NationalEyelnstitute.Glaucoma:NEI Looks Ahead,nei.nih.gov/health

31美国卫生与公众服务部(HHS)、美国食品药品监督管理局(FDA)、美国FDA药品评估与研究中心(CDER)和生物制品审评与研究中心(CBER).in The Federal RegisterVol.68(2003)。

32Chen,H.等人，Hydrogel-thickened microemulsion for topicaladministration of drug molecule at an extremely low concentration.Int JPharm341,78-84(2007)。

33Dehghani,F.等人，Preparation,characterization and in-vivo evaluationof microemulsions containing tamoxifen citrate anti-cancer drug.Eur J PharmSci 96,479-489(2017)。

34Vukkum,P.、Babu,J.和Muralikrishna,R.，Stress degradation behavior ofpregabalin,identification of degradation impurities and development ofstability indicating UPLC method.Int J Pharm Sci Res 6,2241-2257(2015)。

35Kalam,M.A.、Alshamsan,A.、Aljuffali,I.A.、Mishra,A.K.和Sultana,Y.，Delivery of gatifloxacin using microemulsion as vehicle:formulation,evaluation,transcorneal permeation and aqueous humor drug determination.DrugDeliv 23,896-907(2016)。

36Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，NaturalBioadhesive Biodegradable Nanoparticle-Based Topical Ophthalmic Formulationsfor Management of Glaucoma.Transl Vis Sci Technol 4,12(2015)。

37Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Stability andOcular Pharmacokinetics of C el ecoxib-Loaded Nanoparticles TopicalOphthalmic Formulations.J Pharm Sci 105,3691-3701(2016)。

38Mayol,L.、Quaglia,F.、Borzacchiello,A.、Ambrosio,L.和La Rotonda,M.I.，Anovel poloxamers/hyaluronic acid in situ forming hydrogel for drug delivery:rheological,mucoadhesive and in vitro release properties.Eur J Pharm Biopharm70,199-206,doi:10.1016/j.ejpb.2008.04.025(2008)。

39Tayel,S.A.、El-Nabarawi,M.A.、Tadros,M.I.和Abd-Elsalam,W.H.，Promisingion-sensitive in situ ocular nanoemulsion gels of terbinafine hydrochloride:design,in vitro characterization and in vivo estimation of the ocularirritation and drug pharmacokinetics in the aqueous humor of rabbits.Int JPharm 443,293-305,doi:10.1016/j.ijpharm.2012.12.049(2013)。

40Pauly,C.、Yegles,M.和Schneider,S.，Pregabalin Determination in Hairby Eiltra-High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.JAnal Toxic 37,676-679(2013)。

实施例5

用局部普瑞巴林微乳液给药荷兰黑带兔，持续60天。其他兔子是正常的并且不接受治疗。接受普瑞巴林微乳液治疗的兔子具有对其视神经的保护作用。

实施例6

验证药物普瑞巴林对其同源受体CACNA2D1和CACNA2D2的作用的分子机制

经FDA批准的药物普瑞巴林可降低IOP[1,2]。为了确定普瑞巴林降低IOP的作用机制，我们需要鉴定普瑞巴林所结合的底物，并且确定该底物是否存在于负责IOP产生和调节的眼部区域中。普瑞巴林的靶点可以是电压依赖性钙通道亚基α2δ1(又名CACNA2D1)。为了验证CACNA2D1可存在于眼睛中并定位于影响IOP的区域，我们进行了荧光免疫组织化学法(flHC)，其证明了CACNA2D1定位于可调节IOP的区域，例如小梁网和睫状体(图37，小图A至小图C)。此外，当普瑞巴林以水性溶液和缓释型微乳[1,2]局部递送时，其以剂量依赖性方式降低IOP。通过对给药后21天普瑞巴林在眼睛中的生物分布的进一步研究[2]，我们惊奇地在视神经中测量到高水平的普瑞巴林；然而，CACNA2D1以最小限度存在于视神经中(如果存在的话)。因为普瑞巴林以类似的亲和力结合CACNA2D2(第二δ亚基)，所以不希望受理论束缚，普瑞巴林可通过与CACNA2D2的相互作用而在视神经中具有不同的功能。使用免疫组织化学法和共聚焦显微镜，我们发现CACNA2D2定位于视神经(图37，小图D至小图F)，为局部给药普瑞巴林后视神经中升高的水平提供了解释[2]。

该实施例中引用的参考文献

1.Chintalapudi,S.、Maria,D.、Wang,X、Cooke Bailey,J.，NEIGHBORHOODConsortium,International Glaucoma Genetics Consortium，Hysi,P.、Wiggs,J.、Williams,R.和Jablonski,M.(2017)Systems genetics identifies a role forCacna2d1regulation in elevated intraocular pressure and glaucomasusceptibility Nat Commun.8,1755。

2.Ibrahim,M.、Maria,D.、Wang,X.、Mishra,S.、Guragain,D.和Jablonski,M.(2019)Once Daily Pregabalin Eye Drops for Management of Glaucoma,ACS Nano.13,13728-13744。

实施例7

遗传性视网膜变性(IRD)可影响视网膜中的光感受器并且可导致它们坏死，并且受试者可能因此而丧失他们的视力。与青光眼(其可影响老年人)不同，IRD可影响年轻人(例如<30岁)。IRD的一些形式可影响青少年至年轻的成年人。这些形式可称为“视网膜色素变性”。其他形式可影响幼儿。这些形式可被称为“莱伯氏先天性黑蒙症”。有许多基因可引起这些疾病。这些疾病的其他形式可被称为“锥杆或杆锥营养不良”。

我们使用免疫组织化学法确定了CACNA2D1(普瑞巴林的靶标之一)可定位于视网膜中的光感受器。如图38所示：

·RPE＝视网膜色素上皮；ONL＝外核层；OPL＝外丛状层；INL＝内核层；IPL＝内部丛状层；RGC＝视网膜神经节细胞层

·红色显示CACNA2D1定位的位置

○CACNA2D1定位于光感受器和整个内视网膜

·绿色显示CACNA2D2定位的位置

○CACNA2D2定位于整个内视网膜

·CACNA2D1和CACNA2D2两者都结合普瑞巴林

○鉴于CACNA2D1由光感受器表达，它可以在那里作为神经保护剂发挥作用

实施例8

本文所述的研究可为以下状况提供疗法：与军事相关创伤事件有关的眼睛损伤或视觉功能障碍；以及在恶劣环境和长期野外护理环境中的稳定和眼睛损伤治疗。

不希望受理论束缚，我们将验证眼部爆炸损伤(OBI)的兔子模型，该模型拥有与人眼大小相近的眼睛，从而促进我们的结果在临床上的适用性，并且我们将确定普瑞巴林(我们在青光眼视网膜神经节细胞(RGC)和视神经(ON)损伤的鼠和兔子模型中鉴定为神经保护剂的分子)的局部制剂在我们的兔子OBI模型中的功效和作用机制。

30岁以下的士兵在爆炸损伤后可能会经历多年的视力受损¹。可以保持视力的疗法是令人感兴趣的。不希望受理论束缚，普瑞巴林微乳液(ME)被验证为爆炸OBI的治疗剂。不希望受理论束缚，本文验证了眼部创伤的新模型。

背景

对于用于冲击损伤后视力受损的疗法和药物递送系统的需求尚未得到满足。防弹衣的改善已经降低了对战士的致命创伤的发生率；然而，眼部损伤仍然是发病的原因。并发症可包括RGC(视网膜神经节细胞)和ON(眼部神经)损伤和视野缺损。一直都很缺乏治疗这些损伤的疗法。需要将神经保护剂无创地递送至眼睛的后段。本文描述了解决这两个未满足的需求的实施方案；我们已经确定了普瑞巴林提供对青光眼中的RGC和ON的神经保护，并且具有促进药物进入眼睛的经设计的局部制剂。我们已经将普瑞巴林鉴定为眼内压(IOP)的调节剂。令人惊奇的是，我们还发现它在青光眼RGC和ON损伤的鼠和兔子模型中是神经保护剂。我们的制剂是基于生物粘附多层微乳液(ME)的局部滴眼剂，通过单剂量可持续释放普瑞巴林达24小时以上²。我们的ME的优点包括易于制备、100％的包封效率、由于其生物粘附性而增加的药物角膜接触时间、由于其多层结构而得到控制的药物释放，以及持续的高角膜渗透性²。这些特征的最终结果是普瑞巴林可以进入眼睛并扩散到视网膜和ON(图39)。我们的ME在眼睛中也是安全且耐受性良好的^2,3。

对于促进向人类研究过渡的具有大眼睛的临床前OBI模型的需求尚未得到满足。近10年来，我们使用小鼠作为OBI和外伤性脑损伤(TBI)的临床前模型取得了巨大成功，并表征了中枢和外周视觉系统损伤和缺陷^4-9。虽然小鼠对于确定损伤机制和对似乎合理的神经保护分子的早期评估来说是有价值的，但具有与人眼大小相近的眼睛的临床前模型是将治疗剂推向人类临床试验中的必要条件。为了满足这一需求，我们将验证我们的OBI兔子模型，并将其用作平台，以用于评估我们的普瑞巴林ME作为OBI的神经保护疗法。

目标和方法：

不希望受理论束缚，本文描述了用于保持受眼部爆炸损伤影响的受伤士兵的视力的神经保护疗法。我们可评估我们的局部普瑞巴林ME制剂作为OBI治疗剂的功效。不希望受理论束缚，普瑞巴林将通过减弱细胞内游离钙水平[Ca²⁺]_i的增加来减轻RGC轴突的功能障碍和受损。

目标1：我们将验证我们的OBI的临床前兔子模型。

目标2：我们将验证配制的普瑞巴林将通过调节RGC及其轴突中的细胞内游离钙[Ca²⁺]i水平的浓度，为兔子中的OBI后的RGC和ON提供神经保护。

目标1：我们将验证我们的OBI的临床前兔子模型。这将允许我们将兔子推进作为经验证的OBI临床前模型，该模型将促进普瑞巴林和其他药物进展到人类临床试验。

数据：我们评估了对荷兰黑带(DB)兔的眼睛进行40psi、45psi或50psi的单次爆炸后的损伤(图40)。50psi是可以对RGC和ON产生始终如一且可记录的功能损伤的压力。IOP在OBI后的时间段期间是恒定的(图41)。反映RGC功能的图形ERG(PERG)振幅在损伤后的前两周期间瞬时增加(图42)，并且不希望受理论束缚，这可能是或不可能是由于保护性细胞因素的释放，如在轻度损伤的情况下所证明的那样^10,11，但这些振幅随后在7周内下降。尽管RGC功能暂时增加，但我们记录到了杯盘比的稳定增加(图43)，这反映了RGC轴突在视神经乳头(ONH)处离开眼睛时受损。可在损伤后10周处死后进行损伤标志物的组织病理学和评估。

非限制性的示例性方法：模型选择和损伤范例。基于效能计算，我们可纳入36只兔子(约3月龄；每组6M和6F；2个OBI组和1个对照；3个时间点；Covance)。为了产生OBI，将麻醉的兔子固定在立体定位框架中，并且我们的爆炸炮的端部定位在距角膜5mm处(图40)。我们将产生并表征两个OBI模型：在一组中由于50psi的单次爆炸而导致的轻度损伤(图41至图43)；以及由于在50psi下的连续五次重复的爆炸压力(两次爆炸之间有60秒延迟)而导致的中度损伤，如我们已在我们的小鼠研究中所做的那样^4-7。每只兔子的两只眼睛都将一前一后受到相同的损伤，前后不超过几分钟。对照组将被放置在爆炸装置中，但不会受到损伤。在研究开始前，对正常兔子进行基线测量。将在爆炸后使用以下评估来评价OBI的破坏作用：

损伤前基线处和OBI后2周、6周和10周的临床检查：IOP测量；暗视全视野视网膜电图(ERG)和图形ERG(PERG)测试(它们可分别作为光感受器/生物极性细胞和RGC功能的指标)；具有杯盘比计算的眼底成像；以及评估视网膜厚度的变化的OCT成像，这些检查均使用我们公开的方法^2,12-15进行。

损伤前基线处和OBI后2周、6周和10周的实验室检查。在每个时间点对两只兔子(1M，IF)实施安乐死，并进行以下研究：视网膜、ON和视束的形态；小胶质细胞状态的免疫组织化学评估；确定视束中受损轴突球的存在，以及对ON损伤的组织学评估，这些研究均使用我们的方法^4,5进行。

统计分析：将使用Prism统计软件，通过单向ANOVA分析统计差异，然后进行Tukey-Kramer多重比较检验(在显著F检验的情况下)。将确定雄性和雌性的反应差异。如果没有鉴定出差异，则将合并数据。

不希望受理论束缚，我们可以包括兔子中OBI的两个模型的表征。

目标2：验证配制的普瑞巴林将通过调节RGC及其轴突中的细胞内钙(Ca²⁺)水平的浓度，为兔子中的OBI后的RGC和ON提供神经保护。我们可以验证我们配制的普瑞巴林作为神经保护剂在遭受OBI的兔子中的功效和作用机制。不希望受理论束缚，通过局部给药递送神经保护治疗剂可改善治疗选项。由于每天单次滴眼剂给药的性质，我们的制剂可用于野外医院、恶劣环境和长期野外护理环境等。

数据：DB兔可发展自发性年龄相关性青光眼，表现为ON损伤和ON乳头杯状(图44)。然而，在青光眼部损伤的早期阶段，用我们的普瑞巴林ME每天给药减轻了这些结构缺陷(图45)。我们可验证评估我们的普瑞巴林ME作为OBI的似乎合理的神经保护剂。例如，我们可使用年轻的兔子(3月龄，尚未发展出与年龄相关的IOP增加和ON损伤)，因为这个年龄可模拟遭受OBI的士兵的年龄。

普瑞巴林对RGC具有神经保护作用的作用机制是未知的。不希望受理论束缚，并且鉴于它是选择性CACNA2D1阻滞剂¹⁶，普瑞巴林可减弱离子Ca²⁺穿过RGC及其轴突的细胞膜的流入(图10)。

非限制性的示例性方法：普瑞巴林作为神经保护剂的评估。基于效能计算，我们将纳入36只兔子(约3月龄；每组6M和6F；2个OBI组和1个对照；3个时间点；Covance)。为了验证我们的普瑞巴林ME在我们的轻度和中度OBI模型(见本文)中的神经保护作用，将在损伤后2小时开始对兔子给药(以模拟士兵在损伤和开始治疗之间可经历的时间长度)。受损的眼睛将接受30μL剂量的普瑞巴林ME(0.6％²)。每天继续给药，连续10周。将使用本文概述的相同的临床和实验室检查来评估普瑞巴林ME的神经保护潜力。

普瑞巴林对[Ca²⁺]_i的作用的评估。我们将纳入36只兔子(约3月龄；每组2M和2F；2个OBI组和1个对照；3个时间点；Covance)。为了验证普瑞巴林在我们的轻度和中度OBI模型中减轻Ca²⁺流入，我们将在损伤后的以下时间测量RGC胞体及其轴突中由电压门控Ca²⁺通道(VGCC)介导的Ca²⁺信号：2小时、4小时和2周，这将允许我们既获得急性变化，又获得慢性变化。为此，用Ca²⁺敏感和不敏感染料的混合物对每种条件下的眼杯进行逆向加载，从而允许我们使用比率测量法来计算[Ca²⁺]_i的振幅和持续时间¹⁷。经由与成像计算机同步的自动化灌流^20,21，通过提高细胞外钾浓度来激活VGCC^18,19，从而使细胞去极化。将通过在特定RGC轴突束和胞体上放置感兴趣区域(ROI)来获得[Ca²⁺]_i的变化(图46，小图C和小图E)。将使用Na⁺通道阻滞剂河豚毒素来确定Na⁺通道对Ca²⁺瞬变的产生的贡献程度。来自ROI的荧光强度值将在实验条件内取平均值，每个值都被认为是统计检验的独立观察结果。

不希望受理论束缚，与未经治疗的受损眼睛相比，用我们的局部普瑞巴林ME给药的受损眼睛具有更少的功能和组织病理学异常。不希望受理论束缚，OBI导致离子Ca²⁺的不受调节且升高的流入，普瑞巴林可减轻这种流入。不希望受理论束缚，稳定且低的[Ca²⁺]_i将与临床和组织病理学神经保护相关。

该实施例中引用的参考文献

1Stallard,H.B.，Retinal Detachment Due to War Trauma.Br.J Ophthalmol7,419-429(1946)。

2Ibrahim,M.等人，Once Daily Pregabalin Eye Drops for Management ofGlaucoma.ACS Nano 13,13728-13744(2019)。

3Ibrahim,M.等人，Enhanced Corneal Penetration of a Poorly PermeableDrug Using Bioadhesive Multiple Microemulsion Technology Pharmaceutics 12,704,doi:doi:10.3390/pharmaceuticsl2080704(2020)。

4Guley,N.等人，A Novel Closed-Head Model of Mild Traumatic BrainInjury Using Focal Primary Overpressure Blast to the Cranium inMice.J.Neurotrauma 33,403-422(2016)。

5Reiner,A.等人，Motor,Visual and Emotional Deficits in Mice afterClosed-Head Mild Traumatic Brain Injury Are Alleviated by the Novel CB2Inverse Agonist SMM-189.Int JMol Sci 16,758-787(2015)。

6Honig,M.等人，Amelioration of visual deficits and visual systempathology after mild TBI via the cannabinoid Type-2receptor inverse agonismof raloxifene.Exp Neurol 322,113063(2019)。

7Bu,W.等人，Mild traumatic brain injury produces neuron loss that canbe rescued by modulating microglial activation using a CB2receptor inverseagonist.Front Neurosci 10,449(2016)。

8Guley,N.等人，Amelioration of visual deficits and visual systempathology after mild TBI with the cannabinoid type-2receptor inverse agonistSMM-189.Exp Eye Res 182,109-124(2019)。

9Liu,Y.等人，Abnormalities in dynamic brain activity caused by mildtraumatic brain injury are partially rescued by the cannabinoid type-2receptor inverse agonist SMM-189.eNeuro 18,4(2017)。

10Roth,S.，Endogenous neuroprotection in the retina.Brain Res Bull 62,461-466(2004)。

11Simon,G.、Hovda,D.、Harris,N.、Gomerz-Pinilla,F.和Goldberg,R.，Traumatic brain injury induced neuroprotection of retinal ganglion cells tooptic nerve crush J Neurotrauma 23,1072-1082(2006)。

12Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Novel topicalophthalmic formulations for management of glaucoma.Pharm Res 30,2818-2831(2013)。

13Swaminathan,S.等人，Novel Endogenous Glycan Therapy For RetinalDiseases:Safety,In Vitro Stability,Ocular Pharmacokinetic Modeling and Bio-distribution.AAPS Journal 16,311-312(2014)。

14Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，NaturalBioadhesive Biodegradable Nanoparticle-Based Topical Ophthalmic Formulationsfor Management of Glaucoma.Transl Vis Sci Technol 4,12(2015)。

15Ibrahim,M.、Abd-Elgawad,A.、Soliman,O.和Jablonski,M.，Naturalbioadhesive biodegradable nanoparticles-based topical ophthalmic formulationsfor sustained celecoxib release:In vitro Study.Pharm Technol&Drug Res 2,7(2013)。

16Chintalapudi,S.R.等人，Systems genetics identifies a role forCacna2d1regulation in elevated intraocular pressure and glaucomasusceptibility.Nat Commun 8,1755(2017)。

17Van Hook,M.J.和Thoreson,W.B.，Weak endogenous Ca²⁺buffering supportssustained synaptic transmission by distinct mechanisms in rod and conephotoreceptors in salamander retina.Physiol Rep 3,doi:10.14814/phy2.12567(2015)。

18Vaithianathan,T.、Akmentin,W.、Henry,D.和Matthews,G.，The ribbon-associated protein C-terminal-binding protein 1is not essential for thestructure and function of retinal ribbon synapses.Mol Vis 19,917-926(2013)。

19Vaithianathan,T.和Matthews,G.，Visualizing synaptic vesicle turnoverand pool refilling driven by calcium nanodomains at presynaptic active zonesof ribbon synapses.ProcNatl Acad Sci U S A 111,8655-8660,doi:10.1073/pnas.1323962111(2014)。

20Vaithianathan,T.、Henry,D.、Akmentin,W.和Matthews,G.，Nanoscaledynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic activezone.Elife 5,doi:10.7554/eLife.13245(2016)。

21Vaithianathan,T.、Wollmuth,L.P.、Henry,D.、Zenisek,D.和Matthews,G.，Tracking Newly Released Synaptic Vesicle Proteins at Ribbon ActiveZones.iScience 17,10-23,doi:10.1016/j.isci.2019.06.015(2019)。

等效物

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的特定物质和程序的许多等效物。这样的等效物被认为是在本发明的范围内并且被所附权利要求所覆盖。

Claims

1.一种在受试者中治疗青光眼的方法，所述方法包括向有需要的所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

2.一种预防青光眼诱导的神经变性的方法，所述方法包括向有需要的所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

3.一种在受试者中减少视野缺损的方法，所述方法包括向有需要的所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

4.一种降低眼内压以及预防眼部神经变性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

5.一种用于向有需要的受试者的眼睛提供神经保护作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物，所述眼用组合物能够提供神经保护作用。

6.一种用于在受试者中治疗眼睛损伤的方法，所述方法包括向有需要的所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

7.一种用于预防遗传性视网膜变性的方法，所述方法包括向有需要的所述受试者施用有效量的包含普瑞巴林(PRG)的眼用组合物。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物降低所述眼睛的眼内压(IOP)。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述眼用组合物含有约0.001％至约1.2％的普瑞巴林(PRG)。

10.根据权利要求5所述的方法，其中所述神经保护作用影响视网膜神经节细胞(RGC)和视神经。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述组合物局部施用。

12.根据权利要求8所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的一只眼睛或两只眼睛。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物通过滴眼剂施用。

14.根据权利要求9所述的方法，其中将所述组合物每天施用一次。

15.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含微乳液(ME)制剂。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述微乳液制剂的作用持续时间延长，并且功效增强。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述微乳液包括水包油包水(W₁/O/W₂)多重微乳液。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多重微乳液(W₁/O/W₂)包含：

内部相，所述内部相包含水性溶液(W₁)，所述内部相被包覆在内部乳化剂内；

中间油相(O)，所述中间油相包覆所述内部相，所述中间油相被包覆在外部乳化剂内；和

外部水相(W₂)，所述外部水相包围所述外部乳化剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述中间油相(O)包含内部乳化剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述内部乳化剂包含表面活性剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述表面活性剂包含caproyl90、卵磷脂或它们的组合。

22.根据权利要求18中任一项所述的方法，其中所述水性溶液选自去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、人工泪液和平衡盐溶液。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述外部水相(W₂)包含所述外部乳化剂和生物粘附聚合物。

24.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述ME被配制为局部制剂。

25.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括所述油相(O)中的不溶性或微溶性药物。

26.根据权利要求18所述的方法，其中所述水性溶液(W₂)包含水溶性药物。

27.一种降低眼内压(IOP)以及提供直接神经保护的方法，所述方法包括施用靶向由Cacna2d1基因编码的电压依赖性钙通道α2δ1亚基(CACNA2D1)蛋白的治疗剂。

28.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述眼用组合物或所述微乳液制剂作为单剂量施用。

29.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述眼用组合物或所述微乳液制剂连续给药。

30.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述眼用组合物或所述微乳液制剂每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次施用于受试者。