BRPI0610367A2 - uso de um ácido nucleico, método para ligação de um receptor intracelular, composição, composição farmacêutica, ácido nucleico de ligação a hmga, método para seleção de um antagonista ou agonista de hmga, kit para detecção de hmga, antagonista e agonista de hmga e complexo - Google Patents
uso de um ácido nucleico, método para ligação de um receptor intracelular, composição, composição farmacêutica, ácido nucleico de ligação a hmga, método para seleção de um antagonista ou agonista de hmga, kit para detecção de hmga, antagonista e agonista de hmga e complexo Download PDFInfo
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Abstract
A presente invenção se refere ao uso de um ácido L-nucleico como agente intracelularmente ativo.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE SPI-ELGELMERS".
Um aspecto da presente invenção se refere a um novo uso despiegelmers. Outro aspecto da presente invenção se refere a spiegelmersque se ligam à proteínas HMG.
Com os avanços em medicina molecular, se tornou possível i-dentificar moléculas alvo envolvidas em uma doença ou um estado doentio eatuar sobre essas especificamente de maneira a, desse modo, tratar ou pre-venir a doença ou o estado doentio ou pelo menos aliviar os sintomas asso-ciados aos mesmos. As moléculas alvo podem, em princípio, ser divididasem dois grupos. Um primeiro grupo inclui moléculas alvo que estão presen-tes extracelularmente e podem, assim, em princípio, ser mantidas em conta-to com uma substância ativa através de administração da última em um flui-do corporal ou uma cavidade corporal que contém a molécula alvo. O se-gundo grupo de moléculas alvo inclui moléculas alvo que estão presentesem células, essas células estando envolvidas na doença a ser tratada ou napredisposição à doença. Não é necessário, a esse respeito, que a moléculaalvo seja diretamente responsável pelo estado doentio ou diretamente rela-cionada à predisposição à doença. Na verdade, é suficiente se a respectivamolécula alvo está envolvida em uma cascata de reação, o curso da qual éinfluenciado pela substância ativa, com o resultado de que a substância ativaé adequada para o tratamento ou prevenção da doença. O segundo grupode moléculas alvo é aqui também referido como moléculas alvo intracelulares.
A natureza da molécula alvo, isto é, molécula alvo extracelularou intracelular, determina, em princípio, a classe de ligação, com a qual umatentativa pode ser feita para obter a interação necessária para ação terapêu-tica ou preventiva entre a substância ativa, tipicamente a substância ativafarmacêutica, e a molécula alvo. Em virtualmente todos os casos, as assimdenominadas moléculas pequenas podem ser usadas, isto é, compostosquímicos com um peso molecular de, tipicamente, 1000 daltons ou menos.Essas moléculas podem interagir da maneira desejada diretamente com mo-léculas alvo extracelulares, bem como com moléculas alvo intracelulares.
Contra esse antecedente, novas classes de substâncias ativasforam desenvolvidas pela indústria de biotecnologia tais como, por exemplo,anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, moléculas anti-senso, mo-léculas de siRNA, aptâmeros e spiegelmers. Embora algumas dessas clas-ses de moléculas ainda estejam no estágio preliminar de investigações clíni-cas existem pelo menos alguns casos de anticorpos e produtos de molécu-las anti-senso que já estão em uso clínico. Contudo, com essas novas clas-ses de substâncias, existem também problemas significativos com relação àmoléculas alvo intracelulares. Assim, por exemplo, o uso intracelular de anti-corpos atualmente ainda nem sempre está disponível, pelo menos não atéum ponto ou de uma forma e maneira que permita um uso de rotina, em pa-cientes, de anticorpos dirigidos contra moléculas alvo intracelulares para finsde tratamento e/ou profilaxia. Também, a outra nova classe de substânciasativas, em particular moléculas anti-senso e moléculas de siRNA, deve levarem contra seu mecanismo de ação a ser introduzido na respectiva célulacontendo a molécula alvo ou no gene que codifica a molécula alvo. A libera-ção objetivada da substância ativa, também denominada distribuição, é tam-bém, para essas classes de substâncias, um fator limitativo para uma aplica-ção clínica.
O mesmo é também verdadeiro para aptâmeros e spiegelmers,isto é, ácidos nucleicos funcionais com uma estrutura tridimensional definidaque permite a interação específica com as respectivas moléculas alvo. O usode aptâmeros de forma a se dirigir à moléculas alvo intracelulares utiliza mé-todos de tecnologia genética, mais especificamente terapia genética. Os ap-tâmeros, também denominados intrâmeros, dirigidos contra uma moléculaalvo intracelular são incorporados na respectiva célula alvo por meio de mé-todos de tecnologia genética. Tal abordagem, contudo, também está sujeitaà limitações consideráveis, sem levar em conta a falta de aceitação das a-bordagens de tratamento baseadas em terapia genética. Em particular, a viaadotada no caso de intrâmeros, envolvendo expressão intracelular de umácido nucleico que codifica intracelularmente o respectivo aptâmero está, emprincípio, fechada para spiegelmers, uma vez que não existe sistema bioló-gico o qual seria capaz de sintetizar spiegelmers, isto é, aptâmeros consis-tindo de L-nucleotídeos.
O objetivo da presente invenção é, conseqüentemente, propor-cionar uma nova classe de substâncias que é capaz de interagir especifica-mente com moléculas alvo intracelulares, isto é, moléculas alvo que estãopresentes em uma célula.
De acordo com a invenção, esse objetivo é obtido pelo assuntoem questão das reivindicações em anexo independentes. Modalidades pre-feridas são divulgadas nas sub-reivindicações.
De acordo com a invenção, o objetivo básico é obtido pelo as-sunto em questão das reivindicações em anexo independentes. Modalidadespreferidas são divulgadas nas sub-reivindicaçoes.
De acordo com um primeiro aspecto da invenção, o objetivo éobtido através de uso de um ácido L-nucleico como agente ativo intracelular.
Em uma primeira modalidade do primeiro aspecto, o ácido L-nucleico é um spiegelmer.
Em uma segunda modalidade do primeiro aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade da primeira modalidade, o ácido L-nucleico interagecom um receptor intracelular.
Em uma terceira modalidade do primeiro aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade da segunda modalidade, o receptor intracelular éselecionado do grupo compreendendo receptores moleculares, enzimas,moléculas de chaperona, peptídeos sinalizadores, estruturas intracelulares eintermediários metabólicos.
Em uma quarta modalidade do primeiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade da segunda modalidade, o receptor intracelular é selecio-nado do grupo compreendendo polipeptídeos, carboidratos, ácidos nuclei-cos, lipídios e combinações dos mesmos.
Em uma quinta modalidade do primeiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade das segunda, terceira e quarta modalidades, o ácido L-nucleico interage com um receptor intracelular dentro de uma célula.Em uma sexta modalidade do primeiro aspecto, a qual também éuma modalidade das segunda, terceira, quarta e quinta modalidades, o re-ceptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo fatores de trans-crição e proteínas de ligação a DNA ligando um gancho AT.
Em uma sétima modalidade do primeiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade da sexta modalidade, o receptor intracelular é seleciona-do do grupo compreendendo proteínas HMG, de preferência do grupo com-preendendo HMGA1, HMGAIa, HMGAIb e HMGA2.
De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, esseobjetivo é obtido através de um método para ligação de um receptor intrace-lular compreendendo:
- fornecimento de uma célula contendo pelo menos um receptorintracelular;
- fornecimento de um ácido L-nucleico e
- incubação da célula com o ácido L-nucleico.
Em uma primeira modalidade do segundo aspecto, a incubaçãoocorre sob condições de modo que o ácido L-nucleico se liga ao receptorintracelular na célula.
Em uma segunda modalidade do segundo aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade da primeira modalidade, o ácido L-nucleico é umspiegelmer.
Em uma terceira modalidade do segundo aspecto, a qual tam-bém é ma modalidade das primeira e segunda modalidades, após a incuba-ção da célula com o ácido L-nucleico, é determinado se uma ligação, emparticular uma ligação intracelular, do ácido L-nucleico ao receptor intracelu-lar, ocorreu.
Em uma quarta modalidade do segundo aspecto, a qual tambémé uma modalidade das primeira, segunda e terceira modalidades, o receptorintracelular é selecionado do grupo compreendendo receptores moleculares,intermediários metabólicos e enzimas.
Em uma quinta modalidade do segundo aspecto, a qual tambémé uma modalidade das primeira, segunda, terceira e quarta modalidades, oreceptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo polipeptídeos,carboidratos, ácidos nucleicos, lipídios e combinações dos mesmos.
Em uma sexta modalidade do segundo aspecto, a qual tambémé uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta e quinta modali-dades, o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo fato-res de transcrição e proteínas de ligação a DNA ligando um gancho AT.
Em uma sétima modalidade do segundo aspecto, a qual tambémé uma modalidade da sexta modalidade, o receptor intracelular é seleciona-do do grupo compreendendo proteínas HMG, de preferência do grupo com-preendendo HMGA1, HMGAIa, HMGAIbe HMGA2.
De acordo com um terceiro aspecto da invenção, esse objetivo éobtido através de uso de um ácido L-nucleico para fabricar um medicamentopara o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, a molécula alvo do me-dicamento sendo uma molécula alvo intracelular.
Em uma primeira modalidade do terceiro aspecto, o receptor in-tracelular é selecionado do grupo compreendendo receptores moleculares,enzimas, moléculas de chaperona, peptídeos sinalizadores, estruturas intra-celulares e intermediários metabólicos.
Em uma segunda modalidade do terceiro aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade da primeira modalidade, o receptor intracelular éselecionado do grupo compreendendo polipeptídeos, carboidratos, ácidosnucleicos, lipídios e combinações dos mesmos.
Em uma terceira modalidade do terceiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade das primeira e segunda modalidades, a molécula alvo éselecionada do grupo compreendendo fatores de transcrição e Proteínas deligação a DNA ligando um gancho AT.
Em uma quarta modalidade do terceiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade da terceira modalidade, a molécula alvo é selecionada dogrupo compreendendo proteínas HMG e é, de preferência, selecionada dogrupo compreendendo HMGA1, HMGA1 a, HMGA1 b e HMGA2.
Em uma quinta modalidade do terceiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade das terceira e quarta modalidades, a doença é seleciona-da do grupo compreendendo doenças tumorígenas, infecções virais e arteri-osclerose.
Em uma sexta modalidade do terceiro aspecto, a qual também éuma modalidade da quinta modalidade, a doença tumorígena é selecionadado grupo compreendendo tumores mesenquimais, tumores epiteliais, tumo-res benignos, tumores malignos e tumores metastáticos.
Em uma sétima modalidade do terceiro aspecto, a qual tambémé uma modalidade das terceira, quarta, quinta e sexta modalidades, a molé-cula alvo é HMGA e as doenças são selecionadas do grupo compreendendocarcinomas da próstata, pâncreas, tiróide, cérvix, estômago, mama, có-lon/reto, ovários; pneuroblastomas; linfomas, leiomiomas uterinos; lipomas;pólipos endometriais; hamartomas condróides dos pulmões; adenomas ple-omórficos das glândulas salivares; hemangiopericitomas; tumores condro-matosos; angiomixomas agressivos; astrocitomas difusos; osteoclastomas;câncer de pele; linfoma de Burkitt; câncer de pulmão de Lewis; leucemia;câncer de pulmão de células não-pequenas; bem como, em cada caso, me-tástases e/ou formas metastáticas dos mesmos.
Em uma oitava modalidade do terceiro aspecto, a qual também éuma modalidade da quinta modalidade, a arteriosclerose é disparada oucausada pela formação de placas arterioscleróticas mediada por HMGA1,HMGAIa, HMG1b e/ou HMGA2.
Em uma nona modalidade do terceiro aspecto, a qual também éuma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, séti-ma e oitava modalidades, a molécula alvo intracelular está presente intrace-lularmente.
De acordo com um quarto aspecto da invenção, o objetivo é ob-tido através de uso de um ácido L-nucleico para a fabricação de um agentediagnóstico para fins diagnósticos, a molécula alvo do agente diagnósticosendo uma molécula alvo intracelular.
Em uma primeira modalidade do quarto aspecto, o receptor in-tracelular é selecionado do grupo compreendendo receptores moleculares,enzimas, moléculas de chaperona, peptídeos sinalizadores, estruturas intra-celulares e intermediários metabólicos.
Em uma segunda modalidade do quarto aspecto, a qual tambémé uma modalidade da primeira modalidade, o receptor intracelular é selecio-nado do grupo compreendendo polipeptídeos, carboidratos, ácidos nuclei-cos, lipídios e combinações dos mesmos.
Em uma terceira modalidade do quarto aspecto, a qual tambémé uma modalidade das primeira e segunda modalidades, a molécula alvo éselecionada do grupo compreendendo fatores de transcrição e proteínas deligação a DNA ligando um gancho AT.
Em uma quarta modalidade do quarto aspecto, a qual também é
uma modalidade da terceira modalidade, a molécula alvo é selecionado dogrupo compreendendo proteínas HMG e é, de preferência, selecionada dogrupo compreendendo HMGA, HMGA1 a, HMGA1 b e HMGA2.
Em uma quinta modalidade do quarto aspecto, a qual também éuma modalidade das terceira e quarta modalidades, a doença é selecionadodo grupo compreendendo doenças tumorígenas, infecções virais e arterios-clerose.
Em uma sexta modalidade do quarto aspecto, a qual também éuma modalidade da quinta modalidade, a doença tumorígena é selecionadodo grupo compreendendo tumores mesenquimais, tumores epiteliais, tumo-res benignos, tumores malignos e tumores metastáticos.
Em uma sétima modalidade do quarto aspecto, a qual também éuma modalidade das terceira, quarta, quinta e sexta modalidades, a molécu-la alvo é HMGA e a doença é selecionada do grupo compreendendo carci-nomas da próstata, pâncreas, tiróide, cérvix, estômago, mama, cólon/reto,ovários; neuroblastomas; linfomas, leiomiomas uterinos; lipomas; póliposendometriais; hamartomas condróides dos pulmões; adenomas pleomorficosdas glândulas salivares; hemangiopericitomas; tumores condromatosos; an-giomixomas agressivos; astrocitomas difusos; osteoclastomas; câncer depele; linfoma de Burkitt; câncer de pulmão de Lewis; leucemia; câncer depulmão de células não-pequenas; bem como, em cada caso, metástasese/ou formas metastáticas dos mesmos.Em uma oitava modalidade do quarto aspecto, a qual também éuma modalidade da quinta modalidade, a arteriosclerose é disparada atravésde formação de placas arterioscleróticas mediada por HMGA1, HMGMa,HMG1b e/ou HMGA2.
Em uma nona modalidade do quarto aspecto, a qual também éuma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta e sé-tima modalidades, a molécula alvo intracelular está presente intracelular-mente.
De acordo com um quinto aspecto da invenção, o objetivo é ob-tido por uma composição compreendendo ligação de um ácido L-nucleico auma molécula alvo intracelular e um veículo de distribuição.
Em uma primeira modalidade do quinto aspecto, o veículo dedistribuição é um veículo de distribuição adequado para a distribuição intra-celular do ácido L-nucleico.
Em uma segunda modalidade do quinto aspecto, a qual tambémé uma modalidade da primeira modalidade, o veículo de distribuição é sele-cionado do grupo compreendendo veículos, conjugados e meios físicos.
Em uma terceira modalidade do quinto aspecto, a qual tambémé uma modalidade da segunda modalidade, o veículo de distribuição é umveículo selecionado do grupo compreendendo lipossomas, nanopartículas,micropartículas, ciclodextrinas ou dendrímeros ou uma vesícula consistindode polipeptídeos, polietilenoimina e/ou moléculas anfifáticas.
Em uma quarta modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade da segunda modalidade, o veículo de distribuição é umconjugado, em que o conjugado é um conjugado para a endocitose receptor-mediada, um conjugado com um peptídeo fusogênico, um conjugado comum peptídeo sinalizador, um conjugado com um ácido nucleico, de preferên-cia um conjugado com um spiegelmer ou um conjugado lipofílico.
Em uma quinta modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade da segunda modalidade, o veículo de distribuição é ummeio físico, o meio físico sendo, de preferência, selecionado do grupo com-preendendo eletroporação, iontoforese, pressão, ultra-som e microondas.Em uma sexta modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade da terceira modalidade, o veículo de distribuição compre-ende polietilenoimina.
Em uma sétima modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade da sexta modalidade, a polietilenoimina é uma polietilenoi-mina ramificada com um peso molecular de cerca de 25 kDa.
Em uma oitava modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade das sexta e sétima modalidades, a polietilenoimina formauma micela ou uma estrutura semelhante à micela.
Em uma nona modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, séti-ma e oitava modalidades, o ácido L-nucleico é um spiegelmer.
Em uma décima modalidade do quinto aspecto, a qual também éuma modalidade da nona modalidade, o spiegelmer traz uma modificação, areferida modificação sendo selecionada do grupo compreendendo resíduosdePEG.
Em uma décima primeira modalidade do quinto aspecto, a qualtambém é uma modalidade da décima modalidade, o resíduo de PEG temum peso molecular de cerca de 1.000 a 10.000 Da, de preferência um pesomolecular de cerca de 1.500 a 2.500 Da e, ainda mais preferivelmente, umpeso molecular de cerca de 2.000 Da.
Em uma décima segunda modalidade do quinto aspecto, a qualtambém é uma modalidade das décima e décima primeira modalidades, amodificação é ligada ao 5' término ou ao 3' término do ácido L-nucleico.
Em uma décima terceira modalidade do quinto aspecto, a qualtambém é uma modalidade das nona, décima, décima primeira e décimasegunda modalidades, na composição, a proporção do número total de gru-pos nitrogênio da polietilenoimina para o número total de grupos fosfato doácido nucleico contido na composição é cerca de 1 a 20, de preferência cer-ca de 1,5 a 10, mais preferivelmente cerca de 2 a 5 e, ainda mais preferivel-mente, cerca de 2 a 3.
Em uma décima quarta modalidade do quinto aspecto, a qualtambém é uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta,sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda e dé-cima terceira modalidades, a composição proporciona o ácido L-nucleicointracelularmente.
De acordo com um sexto aspecto da invenção, o objetivo é obti-do pela composição farmacêutica compreendendo uma composição de a-cordo com o quinto aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em uma modalidade do uso de acordo com o primeiro aspecto,o ácido L-nucleico é uma composição de acordo com o quinto aspecto.
Em uma modalidade do método de acordo com o segundo as-pecto, o ácido L-nucleico é uma composição de acordo com o quinto aspecto.
Em uma modalidade do uso de acordo com o terceiro aspecto, oácido L-nucleico é uma composição de acordo com o quinto aspecto.
Em uma modalidade do uso de acordo com o quarto aspecto, oácido L-nucleico é uma composição de acordo com o quinto aspecto.
De acordo com um sétimo aspecto da invenção, o objetivo é ob-tido por um ácido nucleico de HMGA-ligação, caracterizado pelo fato de queo ácido nucleico compreende uma seção de Caixa A1 e uma seção de CaixaA2, em que a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são unidas uma àoutra por uma seção intermediária e em que a Caixa A1 e a Caixa A2 sãoselecionadas, individual e independentemente uma da outra, do grupo com-preendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG.
Em uma primeira modalidade do sétimo aspecto, a seção inter-mediaria consiste em uma seção intermediária Z1 compreendendo seis ousete nucleotídeos ou de uma seção intermediária Z2 compreendendo 12 a25 nucleotídeos.
Em uma segunda modalidade do sétimo aspecto, a qual tambémé uma modalidade da primeira modalidade, o ácido nucleico na extremidade5' da seção de Caixa A1 tem uma primeira seção e na extremidade 3' daseção de Caixa A2 tem uma segunda seção em que, de preferência, ambasas seções, independentemente uma da outra, compreendem quatro a oitonucleotídeos.
Em uma terceira modalidade do sétimo aspecto, a qual tambémé uma modalidade da segunda modalidade, as duas seções são, pelo me-nos parcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, a hibridizaçãose estendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
Em uma quarta modalidade do sétimo aspecto, a qual também éuma modalidade das segunda e terceira modalidades, o ácido nucleico tem,na extremidade 5' da seção de Caixa A1, uma seção de Hélice A1 e, na ex-tremidade 3' da seção de Caixa A2, uma seção de Hélice A2 em que, depreferência, a seção de Hélice A1 compreende quatro a oito nucleotídeos e,de preferência, a seção de Hélice A2 compreende quatro a oito nucleotídeose em que, de preferência, a seção de Hélice A1 forma a primeira seção naextremidade 5' da seção de Caixa A1 ou uma parte da mesma e em que, depreferência, a seção de Hélice A2 forma a segunda seção na extremidade 3'da seção de Caixa A2 ou uma parte da mesma, o comprimento da seção deHélice A1 sendo independente do comprimento da seção de Hélice A2.
Em uma quinta modalidade do sétimo aspecto, a qual também éuma modalidade da quarta modalidade, as seções de Hélice A1 e Hélice A2são, pelo menos parcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, ahibridização se estendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
Em uma sexta modalidade do sétimo aspecto, a qual também éuma modalidade das quarta e quinta modalidades, entre a extremidade 3' daseção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, uma seção deHélice B1 está disposta e entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e aextremidade 5' da seção de Hélice A2, uma seção de Hélice B2 está dispos-ta em que, de preferência, o comprimento da seção de Hélice B1 e Hélice B2compreende, em cada caso individual e independentemente, um comprimen-to de quatro a oito nucleotídeos.
Em uma sétima modalidade do sétimo aspecto, a qual também éuma modalidade da sexta modalidade, as seções de Hélice B1 e Hélice B2são, pelo menos parcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, ahibridização se estendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.Em uma oitava modalidade do sétimo aspecto, a qual também éuma modalidade das sexta e sétima modalidades, zero a cinco nucleotídeosestão dispostos entre a extremidade 3' da seção de Hélice A1 e a extremi-dade 5' da seção de Hélice B1.
Em uma nona modalidade do sétimo aspecto, a qual também é
uma modalidade da oitava modalidade, dois nucleotídeos estão dispostosentre a extremidade 3' da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seçãode Hélice B1.
Em uma décima modalidade do sétimo aspecto, a qual tambémé uma modalidade das sexta, sétima, oitava e nona modalidades, zero a seisnucleotídeos estão dispostos entre a extremidade 3' da seção de Hélice B2 ea extremidade 5' da seção de Hélice A2.
Em uma décima primeira modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da décima modalidade, de preferência na medi-da em que essa é uma modalidade da nona modalidade, um nucleotídeoestá disposto entre a extremidade 3' da seção de Hélice B2 e a extremidadeda seção de Hélice A2.
Em uma décima segunda modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das sexta, sétima, oitava, nona, décima e déci-ma primeira modalidades, a soma dos nucleotídeos de seção de Hélice A1 eda seção de Hélice B1 é dez a doze nucleotídeos e a soma dos nucleotídeosde seção de Hélice A2 e da seção de Hélice B2 é dez a doze nucleotídeos.
Em uma décima terceira modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da décima segunda modalidade, a soma dosnucleotídeos hibridizados da hibridização da seção de Hélice A1 com a se-ção de Hélice A2 e da seção de Hélice B1 com a seção Hélice B2 é dez adoze pares de nucleotídeo.
Em uma décima quarta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das sexta, sétima, oitava, nona, décima, décimaprimeira, décima segunda e décima terceira modalidades, de preferência dassexta ou sétima modalidades, o ácido nucleico não compreende uma seçãode Hélice A1 e Hélice A2, pelo que a seção de Hélice B1 está disposta naextremidade 5' do ácido nucleico e a Hélice B2 está disposta na extremidade3' em que, de preferência, o comprimento da seção de Hélice B1 e Hélice B2compreende, em cada caso individual e independentemente, um comprimen-to de quatro a oito nucleotídeos.
Em uma décima quinta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da décima quarta modalidade, as seções de Hé-lice B1 e Hélice B2 são, pelo menos parcial ou completamente, hibridizadasuma com a outra, a hibridização se estendendo sobre quatro a oito pares denucleotídeo.
Em uma décima sexta modalidade do sétimo aspecto, a qual éuma modalidade das quarta e quinta modalidades, um a cinco nucleotídeosestão dispostos entre a extremidade 3' da seção de Hélice A1 e a extremi-dade 5' da seção de Caixa A1 e um a três nucleotídeos estão dispostos en-tre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' da seção deHélice A2.
Em uma décima sétima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das sexta, sétima, oitava, nona, décima, décimaprimeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta e décima quintamodalidades, dois nucleotídeos estão dispostos entre a extremidade 3' daseção de Hélice B1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1 e um a setenucleotídeos estão dispostos entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 ea extremidade 5' da seção de Hélice B2.
Em uma décima oitava modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta,sexta, sétima, oitava e décima modalidades, na medida em que essa é umamodalidade das sexta, sétima e oitava modalidades, das décima segunda edécima terceira modalidades, na medida em que essas são modalidades dassexta, sétima, oitava e décima modalidades, das décima quarta e décimaquinta modalidades, na medida em que essas são modalidades das sexta,sétima, oitava, décima, décima segunda e décima terceira modalidades ouda décima sétima modalidade, na medida em que essas são modalidadesdas sexta, oitava, décima, décima segunda, décima terceira e décima quintamodalidades, em cada caso no escopo aqui restrito, a seção intermediáriaZ1 compreende seis ou sete nucleotídeos.
Em uma décima nona modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da décima oitava modalidade, a seção interme-diária Z1 compreende a seqüência N1N2GN8N3N4N5, em que:
Ni = U, C, A ou G;
N2 = G ou U;
N3 = U ou C;
N4 = U ou A;
N5 = GouA;e
N8 = U ou está ausente.
Em uma vigésima modalidade do sétimo aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade da décima nona modalidade, o ácido nucleico com-preende uma seção de Caixa A1 e uma seção de Caixa A2, em que a ex-tremidade 3' da seção de Caixa A1 é unida diretamente à extremidade 5' daseção intermediária Z1 e a extremidade 3' da seção intermediária Z1 é unidadiretamente à extremidade 5' da seção de Caixa A2.
Em uma vigésima primeira modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das décima oitava, décima nona e vigésimamodalidades, em particular da vigésima modalidade, o ácido nucleico com-preende uma seção de Hélice B1 e uma seção de Hélice B2.
Em uma vigésima segunda modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da vigésima primeira modalidade, as se-ções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada caso individual e in-dependentemente uma da outra, quatro a oito nucleotídeos os quais são, depreferência, completa ou parcialmente hibridizados uns com os outros.
Em uma vigésima terceira modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima primeira e vigésima segunda mo-dalidades, dois nucleotídeos N6, N7 estão dispostos entre a extremidade 3'da seção de Hélice B1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1 na direção5' 3', em que N6 é G, A ou U e N7 é G ou U.
Em uma vigésima quarta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima primeira, vigésima segunda e vigé-sima terceira modalidades, não existem nucleotídeos entre a extremidade 3'da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' da seção de Hélice B2 ou a se-qüência de nucleotídeo GNy está disposta na direção 5' 3', em que Ny com-preende zero a seis nucleotídeos, de preferência 0 ou 6 nucleotídeos.
Em uma vigésima quinta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das décima oitava, décima nona, vigésima, vigé-sima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira e vigésima quarta moda-lidades, o ácido nucleico compreende uma seção de Hélice A1 e Hélice A2.
Em uma vigésima sexta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da vigésima quinta modalidade, as seções deHélice A1 e Hélice A2 compreendem, em cada caso individual e independen-temente uma da outra, quatro a oito nucleotídeos em que, de preferência, asseções de Hélice A1 e Hélice A2 são completa ou parcialmente hibridizadasuma com a outra.
Em uma vigésima sétima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima quinta e vigésima sexta modalida-des, uma seqüência de nucleotídeo Nx está disposta entre a extremidade 3'da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice B1, em que Nxcompreende zero a cinco nucleotídeos.
Em uma vigésima oitava modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima quinta, vigésima sexta e vigésimasétima modalidades, um seqüência de nucleotídeo Nz está disposta entre aextremidade 3' da seção de Hélice B2 e a extremidade 5' da seção de HéliceA2, em que Nz compreende zero a seis nucleotídeos.
Em uma vigésima nona modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima primeira, vigésima segunda, vigé-sima terceira, vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésimasétima e vigésima oitava modalidades, a soma dos nucleotídeos hibridizadosda hibridização da seção de Hélice A1 com a seção de Hélice A2 e da seçãode Hélice B1 com a seção Hélice B2 é dez a doze pares de nucleotídeo.
Em uma trigésima modalidade do sétimo aspecto, a qual tam-bém é uma modalidade das vigésima quarta, vigésima quinta, vigésima sex-ta, vigésima sétima, vigésima oitava e vigésima nona modalidades, a se-qüência de nucleotídeo GNy está disposta entre a extremidade 3' da seçãode Caixa A2 e a extremidade 5" da seção de Hélice B2 na direção 5'- 3', emque Ny compreende zero a seis nucleotídeos, de preferência 0 ou 6 nucleotí-deos.
Em uma trigésima primeira modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da trigésima modalidade, o ácido nucleicode HMGA-ligação compreende a seguinte estrutura:
Hélice A1-Nx-Hélice B1-N6N7|cãÍxa AllN^GJvysUNjcÃTXA A2G-Ny-Hélice B2-N7-Hélice A2
em que:
Ni = U, C, A ou G;N2 = GouU;N3 = UouC;N4 = U ou A;
N5 = GouA;
N6 = G, A ou U;N7 = GouU;
N8 = U ou é nenhum nucleotídeo;Nx = zero a cinco nucleotídeos;
Ny = zero ou seis nucleotídeos; e
N2 = zero a seis nucleotídeos;
a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são selecionadas,em cada caso individual e independentemente uma da outra do grupo deseqüências de nucleotídeo compreendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG;
a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2 compreendem, emcada caso individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nu-cleotídeos em que, de preferência, as seções de Hélice A1 e Hélice A2 sãocompleta ou parcialmente hibridizadas uma com a outra; e
as seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nucleotídeosem que, de preferência, as seções de Hélice B1 e Hélice B2 são completaou parcialmente hibridizadas uma com a outra e a região de hibridizaçãocompreende quatro a oito nucleotídeos e em que a soma dos nucleotídeoshibridizados da hibridização da seção de Hélice A1 com a seção de HéliceA2 e da seção de Hélice B1 com a seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nu-cleotídeo.
Em uma trigésima segunda modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima e trigésima primeira modali-dades, o ácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seqüência sele-cionada do grupo compreendendo SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID.No. 3, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 e SEQ. ID. No. 13.
Em uma trigésima terceira modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das vigésima quarta, vigésima quinta, vigésimasexta, vigésima sétima, vigésima oitava e vigésima nona modalidades, a ex-tremidade 3' da seção de Caixa A2 é unida diretamente à extremidade 5' daseção de Hélice B2.
Em uma trigésima quarta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da trigésima terceira modalidade, o ácido nuclei-co de HMGA-ligação tem a seguinte estrutura:
Hélice A1-Nx-Hélice B1-N6N7|Caixa A1|N1N2GN8N3N4N5|CAIXA A2Hélice B2-N7-Hélice A2
em que:
N^U, C, AouG;N2 = G ou U;N3 = U ou C;N4 = U ou A;
N5 = G ou A;N6 = G, A ou U;N7 = G ou U;
N8 = U ou é nenhum nucleotídeo;Nx = zero a cinco nucleotídeos; eNz = zero a seis nucleotídeos;
a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são selecionadas,em cada caso individual e independentemente uma da outra, do grupo deseqüências de nucleotídeo compreendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG;
a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2 compreendem, emcada caso individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nu-cleotídeos em que, de preferência, as seções de Hélice A1 e Hélice A2 sãocompleta ou parcialmente hibridizadas uma com a outra; e
as seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nucleotídeosem que, de preferência, as seções de Hélice B1 e Hélice B2 são completaou parcialmente hibridizadas uma com a outra e a região de hibridizaçãocompreende quatro a oito nucleotídeos e em que a soma dos nucleotídeoshibridizados da hibridização da seção de Hélice A1 com a seção de HéliceA2 e da seção de Hélice B1 com a seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nu-cleotídeo.
Em uma trigésima quinta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das trigésima terceira e trigésima quarta modali-dades, o ácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seqüência inclu-indo SEQ. ID. No. 3.
Em uma trigésima sexta modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da trigésima primeira modalidade, o ácido nucle-ico de HMGA-ligação compreende a seguinte estrutura:
Hélice BI-NeNHCaixa AIIN^ÇNs^^NslCAIXA A2|G-NY-Hélice B2
Em uma trigésima sétima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da trigésima quarta modalidade, o ácido nucleicode HMGA-ligação compreende a seguinte estrutura:
Hélice BI-NeNHCaixa AllNiNgGNsNsWdCAIXA A2|Hélice B2
Em uma trigésima oitava modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da trigésima sexta modalidade, o ácido nucleicode HMGA-ligação compreende uma seqüência a qual é selecionada do gru-po incluindo SEQ. ID. No. 15 e SEQ. ID. No. 16.
Em uma trigésima nona modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das primeira, seggnda, terceira, quarta, quinta,sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, dé-cima terceira e décima sexta ou décima sétima modalidades do sétimo as-pecto, o ácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seção interme-diária Z2 a qual compreende 12 a 25 nucleotídeos.
Em uma quadragesima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade da trigésima nona modalidade, o ácido nucleicode HMGA-ligação compreende uma seção intermediária Z2, uma seção deHélice C1 e uma seção de Hélice C2.
Em uma quadragesima primeira modalidade do sétimo aspecto,a qual também é uma modalidade da quadragesima modalidade, uma seçãocentral Nc está disposta entre a seção de Hélice C1 e a seção de Hélice C2do ácido nucleico de HMGA-ligação.
Em uma quadragesima segunda modalidade do sétimo aspecto,a qual também é uma modalidade das quadragesima ou quadragesima pri-meira modalidades, o comprimento da seção de Hélice C1 e Hélice C2 doácido nucleico de HMGA-ligação são idênticos.
Em uma quadragesima terceira modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das quadragesima, quadragesima primeirae quadragesima segunda modalidades, o comprimento da seção de HéliceC1 e Hélice C2 do ácido nucleico de HMGA-ligação é, individual e indepen-dentemente, três a seis nucleotídeos.
Em uma quadragesima quarta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das quadragesima, quadragesima primeira,quadragesima segunda e quadragesima terceira modalidades, as seções deHélice C1 e Hélice C2 do ácido nucleico de HMGA-ligação são completa ouparcialmente hibridizadas uma com a outra.
Em uma quadragesima quinta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima nona, quadragesima, quadra-gesima primeira, quadragesima segunda, quadragesima terceira e quadra-gesima quarta modalidades, a seção central Nc do ácido nucleico de HMGA-ligação compreende três a cinco nucleotídeos.
Em uma quadragesima sexta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima nona, quadragesima, quadra-gesima primeira, quadragesima segunda, quadragesima terceira, quadrage-sima quarta e quadragesima quinta modalidades, o ácido nucleico de HM-GA-ligação compreende uma seção de Caixa A1 e uma seção de Caixa A2,em que uma seqüência de nucleotídeo Nb está disposta entre a extremidade3' da seção de Caixa A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice C1 e com-preende três nucleotídeos.
Em uma quadragesima sétima modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima nona, quadragesima, quadra-gésima primeira, quadragesima segunda, quadragesima terceira, quadrage-sima quarta, quadragesima quinta e quadragesima sexta modalidades, oácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seção de Caixa A1 euma seção de Caixa A2, em que uma seqüência de nucleotídeo Nd está dis-posta entre a extremidade 3' da seção de Hélice C2 e a extremidade 5' daseção de Caixa A2 e compreende dois a cinco nucleotídeos.
Em uma quadragesima oitava modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima nona, quadragesima, quadra-gesima primeira, quadragesima segunda, quadragesima terceira, quadrage-sima quarta, quadragesima quinta, quadragesima sexta e quadragesima sé-tima modalidades, o ácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma se-ção de Hélice A1 e uma seção de Hélice A2.
Em uma quadragesima nona modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da quadragesima oitava modalidade, asseções de Hélice A1 e Hélice A2 do ácido nucleico de HMGA-ligação com-preendem, em cada caso individual e independentemente uma da outra, cin-co a seis nucleotídeos em que, de preferência, a seção de Hélice A1 e a se-ção de Hélice A2 são completa ou parcialmente hibridizadas uma com a ou-tra.
Em uma qüinquagésima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das quadragésima oitava e quadragésima nonamodalidades, uma seqüência de nucleotídeo Na está disposta entre a extre-midade 3' da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1do ácido nucleico de HMGA-ligação, em que Na compreende um a cinco nu-cleotídeos.
Em uma qüinquagésima primeira modalidade do sétimo aspecto,a qual também é uma modalidade das quadragésima oitava, quadragésimanona e qüinquagésima modalidades, uma seqüência de nucleotídeo GNeestá disposta entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade5' da seção de Hélice A2 do ácido nucleico de HMGA-ligação na direção 5'-3', em que, Ne compreende um a dois nucleotídeos, de preferência A ou UU.
Em uma qüinquagésima segunda modalidade do sétimo aspec-to, a qual também é uma modalidade das quadragésima oitava, quadragé-sima nona, qüinquagésima e qüinquagésima primeira modalidades, a seçãode Hélice C1 e a seção de Hélice C2 do ácido nucleico de HMGA-ligaçãotêm, em cada caso individual e independentemente uma da outra, um com-primento de cinco ou seis nucleotídeos em que, de preferência, as seçõesde Hélice C1 e Hélice C2 são completa ou parcialmente hibridizadas umacom a outra.
Em uma qüinquagésima terceira modalidade do sétimo aspecto,a qual também é uma modalidade da qüinquagésima segunda modalidade, oácido nucleico de HMGA-ligação tem a seguinte estrutura:
Hélice A1-Na-|Caixa A1|-NbHHélice C1j-NcHHélice_ C2j-Nd-JCajxa_A2j-G-Ne-Hélice A2 (III)
em que :
Na = um a cinco nucleotídeos;Nb = três nucleotídeos;Nc = três a cinco nucleotídeos;Nd = dois a cinco nucleotídeos; eNe = um a dois nucleotídeos, de preferência A ou UU;
a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são selecionadas,em cada caso individual e independentemente uma da outra, do grupo com-preendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG,
as seções de Hélice A1 e Hélice A2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, cinco ou seis nucleotídeose
as seções de Hélice C1 e Hélice C2 compreendem, em cadacaso, cinco ou seis nucleotídeos os quais são, de preferência, completa ouparcialmente hibridizados uns aos outros.
Em uma qüinquagesima quarta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da qüinquagesima terceira modalidade, oácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seqüência a qual é sele-cionada do grupo compreendendo SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID.No. 10, SEQ. ID. No. 11, SEQ. ID. No. 14, SEQ. ID. No. 22 e SEQ. ID. No.24.
Em uma qüinquagesima quinta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das trigésima nona, quadragésima, quadra-gésima primeira, quadragésima segunda, quadragésima terceira e quadra-gésima quarta modalidades, o ácido nucleico compreende uma seção deCaixa 1 e uma seção de Hélice C1 do ácido nucleico de HMGA-ligação, emque um nucleotídeo A está disposto entre a extremidade 3' da seção de Cai-xa A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice C1.
Em uma qüinquagesima sexta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da qüinquagesima quinta modalidade, oácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seção de Hélice C2 euma seção de Caixa A2, em que um nucleotídeo G está disposto entre aextremidade 3' da seção de Hélice C2 e a extremidade 5' da seção de CaixaA2.
Em uma qüinquagesima sétima modalidade do sétimo aspecto,a qual também é uma modalidade das qüinquagesima quinta ou qüinquage-sima sexta modalidades, a seção central Nc do ácido nucleico de HMGA-ligação compreende quatro nucleotídeos, em que Nc é, de preferência,GAUG.
Em uma qüinquagésima oitava modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das qüinquagésima quinta, qüinquagésimasexta e qüinquagésima sétima modalidades, o ácido nucleico de HMGA-ligação compreende uma seção de Hélice B1 e uma seção de Hélice B2.
Em uma qüinquagésima nona modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da qüinquagésima oitava modalidade, asseções de Hélice B1 e Hélice B2 do ácido nucleico de HMGA-ligação com-preendem, individual e independentemente uma da outra em cada caso, cin-co nucleotídeos em que, de preferência, a seção de Hélice B1 é hibridizadacom a seção de Hélice B2.
Em uma sexagésima modalidade do sétimo aspecto, a qualtambém é uma modalidade das qüinquagésima oitava ou qüinquagésimanona modalidade, uma seqüência de nucleotídeo compreendendo dois nu-cleotídeos Nj está disposta entre a extremidade 3' da seção de Hélice B1 e aextremidade 5' da seção de Caixa A1 do ácido nucleico de HMGA-ligação,em que Nj é, de preferência, AG.
Em uma sexagésima primeira modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das qüinquagésima oitava, qüinquagésimanona e sexagésima modalidades, um nucleotídeo G está disposto entre aextremidade 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' de Hélice B2 doácido nucleico de HMGA-ligação.
Em uma sexagésima segunda modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das qüinquagésima quinta, qüinquagésimasexta, qüinquagésima sétima, qüinquagésima oitava, qüinquagésima nona,sexagésima e sexagésima primeira modalidades, o ácido nucleico de HM-GA-ligação compreende uma seção de Hélice A1 e uma seção de Hélice A2.
Em uma sexagésima terceiro modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da sexagésima segunda modalidade, asseções de Hélice A1 e Hélice A2 do ácido nucleico de HMGA-ligação com-preendem, individual e independentemente uma da outra em cada caso, seisnucleotídeos e, de preferência, a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2são hibridizadas uma com a outra.
Em uma sexagésima quarta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das sexagésima segunda e sexagésimaterceira modalidades, uma seqüência de nucleotídeo compreendendo doisnucleotídeos Ni está disposta entre a extremidade 3' da seção de Hélice Ale a extremidade 5' da seção de Hélice B1, em que Ni é, de preferência, CA.
Em uma sexagésima quinta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das sexagésima segunda, sexagésima ter-ceiro e sexagésima quarta modalidades, um nucleotídeo A está disposto en-tre a extremidade 3' da seção de Hélice B2 e a extremidade 5' da seção deHélice A2.
Em uma sexagésima sexta modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das qüinquagesima quinta a sexagésimaquinta modalidades, as seções de Hélice C1 e Hélice C2 compreendem, emcada caso, três nucleotídeos em que, de preferência, a seção de Hélice C1 eHélice C2 são hibridizadas uma com a outra.
Em uma sexagésima sétima modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da sexagésima sexta modalidade, o ácidonucleico de HMGA-ligação tem a seguinte estrutura:
Hélice A1-NrHélice B1 -Nj-{Caixa AH-A-JHéTicê ~Cjj-Nc-ÍHéTicê "C2J-G-|Caixã
A2|-G-Hélice B2-A -Hélice A2em que:
Ni = dois nucleotídeos, de preferência CA;
Nj = dois nucleotídeos, de preferência AG;
Nc = quatro nucleotídeos, de preferência GAUG;
as seções Caixa A1 e Caixa A2 são, em cada caso seleciona-das, individual e independentemente uma da outra, do grupo compreenden-do as seqüências GGGCG, GGGUG e GGGAG;
as seções de Hélice A1 e Hélice A2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente, seis nucleotídeos os quais são, de prefe-rência, hibridizados uns com os outros;
as seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente, cinco nucleotídeos em que, de preferên-cia, a seção de Hélice B1 e a seção de Hélice B2 são hibridizadas uma coma outra, e
a seção de Hélice C1 e Hélice C2 compreendem, em cada casoindividual e independentemente, três nucleotídeos em que, de preferência,as seções de Hélice C1 e Hélice C2 são hibridizadas uma com a outra.
Em uma sexagésima oitava modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade da sexagésima sétima modalidade, o ácidonucleico de HMGA-ligação compreende uma seqüência a qual é selecionadado grupo incluindo SEQ. ID. No. 12.
Em uma sexagésima nona modalidade do sétimo aspecto, aqual também é uma modalidade das sexagésima segunda a sétima modali-dades, o ácido nucleico é um que se liga a fatores de transcrição, em parti-cular fatores de transcrição compreendendo um gancho AT.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um oitavo as-pecto por um ácido nucleico o qual se liga a um fator de transcrição compre-endendo um gancho AT, em que o ácido nucleico tem uma estrutura de a-cordo com o sétimo aspecto.
Em uma modalidade da composição de acordo com o sexto as-pecto, o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com o sétimo as-pecto.
Em uma modalidade do uso de acordo com o primeiro aspecto,o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.
Em uma modalidade do método de acordo com o segundo as-pecto, o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com o sétimo as-pecto.
Em uma modalidade do uso de acordo com o terceiro aspecto, oácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.
Em uma modalidade do método de acordo com o quarto aspec-to, o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um nono as-pecto por um método para seleção de um antagonista de HMGA ou agonistade HMGA, compreendendo as seguintes etapas:
- fornecimento de um antagonista de HMGA candidato e/ou umagonista de HMGA candidato,
- fornecimento de um ácido nucleico de acordo com o sétimoaspecto,
- fornecimento de um sistema de teste o qual distribui um sinalna presença de um antagonista de HMGA e/ou um agonista de HMGA e
- determinação se o antagonista de HMGA candidato é um anta-gonista de HMGA e/ou se o agonista de HMGA candidato é um agonista deHMGA.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um décimoaspecto por um método para seleção de um agonista de HMGA e/ou um an-tagonista de HMGA, compreendendo as seguintes etapas:
- fornecimento de um HMGA imobilizado sobre uma fase, de pre-ferência uma fase sólida,
- fornecimento de um ácido nucleico de acordo com o sétimoaspecto, de preferência um ácido nucleico de acordo com o sétimo aspectoo qual é rotulado,
- adição de um agonista de HMGA candidato e/ou um antagonis-ta de HMGA candidato e
- determinação se o agonista de HMGA candidato é um agonistade HMGA e/ou se o antagonista de HMGA candidato é um antagonista deHMGA.
Em uma modalidade do décimo aspecto, considera-se que a de-terminação é realizada através de testagem se o ácido nucleico é substituídopelo agonista de HMGA candidato ou pelo antagonista de HMGA candidato.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um décimoprimeiro aspecto por um kit para a detecção de HMGA, compreendendo umácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um décimosegundo aspecto por um antagonista de HMGA o qual é obtenível por ummétodo de acordo com o décimo aspecto.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um décimoterceiro aspecto por um agonista de HMGA o qual é obtenível por um méto-do de acordo com o décimo aspecto.
De acordo com a invenção, o objetivo é obtido em um décimoquarto aspecto por um complexo compreendendo uma proteína de HMGA eum ácido nucleico de acordo com o sétimo aspecto.
A presente invenção é baseada sobre o resultado surpreendentede que, contrário à opinião recebida na técnica anterior, é possível usar áci-dos L-nucleicos e, em particular, spiegelmers, de forma a se dirigir à molécu-las alvo intracelulares. As moléculas alvo intracelulares são, de preferência,moléculas alvo as quais estão presentes em uma célula. As propriedadesinerentes nos ácidos L-nucleicos funcionais em virtude de sua estrutura deL-nucleotídeos, tal como alta especificidade da interação com suas molécu-las alvo, ao mesmo tempo com alta estabilidade e ausência de produtos dedecomposição imunologicamente ativos ou tóxicos quando ácidos L-nucleicos são usados em sistemas biológicos e, em particular, no corpo hu-mano e de um animal, contudo, não permitem que os mecanismos celularessejam utilizados de modo, conforme no caso de intrâmeros, que os ácidos L-nucleicos sejam codificados por um plasmídeo ou geralmente um vetor e,assim, proporcionam o ácido nucleico realmente funcional através do pro-cesso de transcrição que ocorre intracelularmente.
Esse dilema inescapável é resolvido pela presente invenção:ácidos L-nucleicos funcionais, em particular spiegelmers, podem ser trans-portados através de uma membrana citoplasmica ao mesmo tempo em queretêm sua especificidade com relação à sua ligação à sua molécula alvo esua atividade. Essa permeabilidade dos ácidos L-nucleicos funcionais é ine-rente em spiegelmers e pode ser ainda intensificada através de uso de veí-culos de distribuição ou técnicas de distribuição. Sem aqui depois desejarser específico a esse respeito, os presentes inventores partem do princípioque ácidos L-nucleicos funcionais podem, per se, superar a membrana cito-plásmica e, com a participação de mecanismos de transporte endossômicosao superar a membrana citoplásmica, são capazes de liberar os mesmosdas estruturas vesiculares que são, desse modo, formadas, adotando umaestrutura bidimensional ou tridimensional, a qual permite a interação especí-fica do ácido nucleico funcional com sua molécula alvo. Com o ensinamentotécnico divulgado aqui, o princípio desenvolvido para aptâmeros de utiliza-ção de mecanismos de transcrição intracelulares de forma a criar aptâmerosna célula é intencionalmente evitado e, pela primeira vez, meios são propor-cionados para uso de ácidos L-nucleicos funcionais e, em particular, spie-gelmers, em células.
Conforme empregado aqui em uma modalidade preferida, o ter-mo ácidos nucleicos funcionais denota aqueles ácidos nucleicos que sãodiferentes de ácidos nucleicos estruturais, em particular ácidos nucleicosestruturais que ocorrem naturalmente, tais como rRNAs, ou que são diferen-tes de ácidos nucleicos de codificação, tais como mRNAs. Em particular,ácidos nucleicos funcionais são ácidos nucleicos os quais, levando-se emconta sua estrutura bidimensional e/ou tridimensional, são capazes de seligar à moléculas alvo. Em uma modalidade particularmente preferida, a liga-ção à molécula alvo não ocorre através de hibridizaçao ou emparelhamentode base com base em emparelhamentos de base de Watson-Crick ou umemparelhamento de base de Hoogsteen. Ácidos nucleicos funcionais particu-larmente preferidos são aptâmeros e spiegelmers.
Um ácido L-nucleico é, em uma modalidade preferida, um ácidonucleico que é completa, substancial ou parcialmente sintetizado a partir deL-nucleotídeos. É particularmente preferido se o ácido L-nucleico consistecompletamente de L-nucleotídeos. O termo "substancialmente" denota, aesse respeito, uma modalidade na qual aquela parte do ácido L-nucleico aqual é responsável pela interação com a molécula alvo ou aquela parte aqual media a ligação à molécula alvo, consiste em L-nucleotídeos ou é sinte-tizada a partir desses.
Conforme usado aqui, um ácido L-nucleico funcional é um ácidonucleico funcional o qual é completa, substancial ou parcialmente sintetizadoa partir de L-nucleotídeos.
A síntese de ácidos L-nucleicos é conhecida por aqueles habili-tados na técnica nesse campo e é descrita, por exemplo, em Noite e colabo-radores, Nat. Biotech, 14, 1116-1119, 1996; e Klussmann e colaboradores,Nat. Biotechnol, 14, 1112-1115, 1996.
O processo básico para a produção de aptâmeros é descrito, porexemplo, em a Tuerck e colaboradores, Science, 248, 505-510, 1990; ouEllington e colaboradores, Nature, 346, 818-822, 1990, enquanto que pro-cesso básico para a produção de spiegelmers é descrito, por exemplo, emNoite e colaboradores, Nat. Biotech, 14, 1116-1119, 1996; ou Klussmann ecolaboradores, Nat. Biotechnol, 14, 1112-1115, 1996. Spiegelmers são, as-sim, aptâmeros os quais consistem de L-nucleotídeos ao invés de D-nucleotídeos. Com relação à produção de aptâmeros e spiegelmers, o termomolécula alvo denota aquela molécula a qual é usada no processo de sele-ção para produzir aptâmeros e spiegelmers ou denota aquela molécula aqual é, por fim, ligada pelo aptâmero ou spiegelmer.
Em uma modalidade preferida, um agente intracelularmente ati-vo é um composto químico o qual, quando presente em uma célula, é capazde se ligar a uma molécula. A esse respeito, é particularmente preferido se acélula é uma célula que existe isolada em um tecido ou um órgão mas, depreferência, não no corpo humano ou de um animal. Se o agente intracelu-larmente ativo é um spiegelmers, então, de preferência, ele é um agente in-tracelularmente ativo se ele é capaz de se ligar a uma molécula alvo intrace-lular. Alternativamente, o spiegelmer é um agente intracelularmente ativo seele é capaz de se ligar à sua molécula alvo sob condições tais como existeem uma célula. Testes de forma a determinar essas propriedades são co-nhecidos por aqueles habilitados na técnica nesse campo e incluem, por e-xemplo, ensaios de ligação em equilíbrio sob as condições tampões, tal co-mo existe intracelularmente (resistência iônica e composição de soluto, pH,temperatura), conforme divulgado no Exemplo 1.
Em uma modalidade preferida, a molécula alvo do ácido L-nucleico, em particular do ácido L-nucleico funcional, é um receptor intrace-lular. Um receptor intracelular, conforme usado aqui é, de preferência, umcomposto químico ou uma estrutura química ou, respectivamente, uma parteda mesma, com a qual o ácido L-nucleico funcional interage e é, de prefe-rência, um composto ou estrutura à qual o ácido L-nucleico funcional se liga,em que o receptor intracelular, isto é, o composto químico ou a estruturaquímica ou, respectivamente, uma parte da mesma, está presente intracelu-larmente, isto é, está presente em uma célula, conforme, de preferência, édescrito no parágrafo precedente. A esse respeito, é possível, dentro do es-copo da presente invenção, que o receptor intracelular seja a molécula alvona criação do ácido nucleico funcional, em particular o ácido L-nucleico fun-cional.
Em uma modalidade, o termo "receptor" denota qualquer parcei-ro de interação, de preferência um parceiro de interação de ligação específi-ca do ácido nucleico funcional, isto é, denota um parceiro de interação com oácido nucleico funcional, o qual tem uma estrutura espacial, distribuição decarga, distribuição de hidrofobicidade específicas, etc. Em uma modalidadeparticularmente preferida, o parceiro de interação corresponde à moléculaalvo do ácido nucleico funcional, conforme foi usado na criação do ácido nu-cleico funcional. A esse respeito, está dentro do escopo da presente inven-ção que um receptor também pode ser diferente da molécula alvo usada nacriação do ácido nucleico funcional, embora a interação específica seja emvirtude de uma reatividade cruzada do ácido nucleico funcional entre o par-ceiro de interação e a molécula alvo usada na criação do ácido nucleico fun-cional.
Em uma modalidade preferida, o termo "receptor intracelular"denota um receptor que está presente em uma célula ou um receptor quepode estar presente em uma célula, que ocorre sob circunstâncias naturaisem uma célula ou que, sob tais circunstâncias, existe em uma célula. A esserespeito, é particularmente preferido se a célula é uma célula que ocorre iso-lada em um tecido ou um órgão mas, de preferência, não no corpo humanoou de um animal. Conforme usado aqui, o termo "receptor intracelular", con-tudo, também denota um receptor que está presente sob condições tais co-mo existe em uma célula.
Em uma modalidade preferida, o termo "célula" denota uma cé-lula a qual é selecionada do grupo compreendendo células procariotas e eu-cariotas. De preferência, a célula eucariota é selecionado do grupo compre-endendo células fúngicas, células vegetais, células de animais e células hu-manas. Em uma modalidade alternativa, o termo célula denota, em geralaqui, um compartimento ligado por uma membrana dupla de fosfolipídio aqual, em uma modalidade, corresponde a uma membrana citoplásmica e aqual é separada pela membrana do ambiente. A separação do ambiente, aesse respeito, não é uma separação completa, mas permite uma transferên-cia de energia e uma transferência de massa (troca de substância) entre acélula e o ambiente. A transferência de massa é, de preferência, restrita. Nocaso onde a célula é separada do ambiente por uma membrana citoplásmicaou por uma membrana similar a uma membrana citoplásmica, a restrição datransferência de massa é definida pelas propriedades de transporte damembrana. Em uma modalidade, o termo célula aqui, assim, também incluivesículas e/ou compartimentos de uma célula procariota ou eucariota con-forme definido aqui a qual, por sua vez, estão presentes ou podem estarpresentes dentro de uma célula procariota ou eucariota, bem como fora detal célula eucariota ou procariota, por exemplo, como vesículas ou partes deuma célula procariota ou eucariota circundada por uma membrana citoplás-mica a qual, em uma modalidade, pode estar presente em um fluido corpo-ral. Em uma modalidade preferida, uma célula de acordo com a segundamodalidade alternativa leva em conta as condições dentro de tal célula, quecorrespondem substancialmente àquelas que ocorrem em uma célula proca-riota ou eucariota, em particular com relação a fatores que influenciam a li-gação do ácido nucleico funcional à sua molécula alvo.
Em uma modalidade preferida, o fluido corporal é selecionado dogrupo compreendendo sangue, urina, licor (fluido anatômico), fluido linfático,soro, plasma, secreções vaginais, saliva e esperma.
Em uma modalidade, o receptor é definido por sua função emuma célula. Conseqüentemente, o receptor pode ser selecionado do grupocompreendendo receptores moleculares, enzimas, intermediários metabóli-cos, peptídeos sinalizadores, moléculas de chaperona e estruturas intracelu-lares tais como, por exemplo, ribossomas, mitocôndrias, elementos do cito-esqueleto tais como, por exemplo, filamentos de tubulina e actina, partículasendossômicas, lisossomas, outras estruturas intracelulares, tais como vesí-culas, em particular vesículas intracelulares. Conforme usado aqui, o termoreceptor molecular denota, em uma modalidade preferida, uma molécula aqual aceita informação e transmite a mesma dentro de uma célula, um teci-do, um órgão ou um organismo. A informação é, tipicamente, mediada poruma molécula a qual interage com o receptor molecular. Como um resultadoda interação, o receptor molecular é capaz de gerar um sinal. Tal sinal podeser baseado na alteração na confirmação e/ou da atividade do receptor oupode ser manifestado no mesmo. O sinal em si é capaz de transmitir, emoutra forma, a informação recebida ou processada por ele. Como um resul-tado da alteração na confirmação ou atividade do receptor molecular, o sinalpode, de preferência, ser um sinal químico, bioquímico ou elétrico. De prefe-rência, o receptor molecular é parte de uma cascata de reação e, mais prefe-rivelmente, parte de uma cascata de sinal. A informação transmitida por umreceptor molecular pode ser informação quantitativa e/ou qualitativa, por e-xemplo, referente à presença de um composto e/ou sua concentração.
Em uma modalidade preferida, o termo "intermediários metabóli-cos" denota todos aqueles compostos os quais, em virtude de atividadesmetabólicas em uma célula, ocorrem como constituintes do catabolismo,bem como de anabolismo.
Em uma outra modalidade, o receptor é definido por sua nature-za química. De preferência, o receptor é selecionado do grupo compreen-dendo polipeptídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, lipidios e combinaçõesdos mesmos. Conforme usado aqui, o termo polipeptídeo denota, de prefe-rência, qualquer polímero consistindo de dois ou mais aminoácidos. De pre-ferência, os aminoácidos são L-aminoácidos, embora D-aminoácidos tam-bém possam ser usados dentro do escopo da modalidade. Conforme usadoaqui, o termo "ácidos nucleicos" denota, de preferência, um polímero de doisou mais nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo os quais são conhecidospor aqueles habilitados na técnica nesse campo, em que os nucleotídeospodem ser D-nucleotídeos ou L-nucleotídeos ou misturas dos mesmos.Combinações preferidas incluem polipeptídeos glicosilados e lipídios glicosi-lados.
Um grupo particular de receptores intracelulares são fatores detranscrição e proteínas de ligação a DNA os quais se ligam a um gancho AT.Exemplos de fatores de transcrição são fornecidos na tabela 1 a seguir:
Tabela 1: Fatores de transcrição
<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35/table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38/table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44/table><table>table see original document page 45</column></row><table>
Um outro grupo particularmente preferido de receptores intrace-lulares são as proteínas HMG, tal como é descrito, por exemplo, no Pedidode Patente Internacional PCT/EP96/00716 e, em particular, as proteínas deHMGA. Conforme usado aqui, o termo proteínas de HMGA denota, de prefe-rência, em geral, as seguintes proteínas: HMGA1, HMGAIa, HMGAIb eHMGA2.
As proteínas HMGA têm uma estrutura modular e compreen-dem, cada uma, três domínios de ligação a DNA, os quais são denominados"ganchos AT" e são mostrados como DBD1 a DBD3 na figura 2, bem comouma região C-terminal muito ácida. É óbvio para aqueles habilitados na téc-nica que antagonistas os quais se ligam a um dos "ganchos AT" reconhecemnão apenas proteínas HMGA1 e, assim, as duas variantes com união HM-GAIA e HMGA1B (veja figura 2), mas também exibem reatividade cruzadacom moléculas de ligação a DNA similares, tal como HMGA2. Além de HM-GA2, muitas outras proteínas também têm seqüências similares aos "gan-chos AT" e formam, em cada caso, outros receptores. Tais proteínas sãolistadas, inter alia, na Tabela 3:
Tabela 3:
Coluna 1: Banco de Dados de proteína - Códigos de acesso; Coluna 2: Designação deproteína
<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46/table>P17096-2 Isoforma com união HMG-Y de P17096 [HMGA1]
Q9Y6X0 Proteína de SET-ligação SETBP_HUMANA (SEB) [SETBP1]
Q8TEK3 N-metiltransferasedehistona-lisinaDOT1L_HUMANA
Q8TEK3-2 Isoforma 1 com união de Q8TEK3 [DOT1L]
Q03164 Proteína HRX do dedo de zinco HRXJHUMANA (ALL-1)
Q86YP1 Fator de transcrição humano MLL UPN96240
Q86YN9 Fator de transcrição humano MLL UPN95022
Q03164-2 Isoforma 4P-18B com união de Q03164 [MLL]
P04920 Proteína 2 de permutador de ânions B3A2_HUMANO
Q59GF1 Tipo variante-a de permutador-2 de ânions humano
Q8TAG3 Proteína SLC4A2 humana
Q6P391 Proteína PSIP1 humana
075475 Fator de crescimento p75 contendo epitélio de revestimentos humanos
Q9UEY6 Tipo a de permutador-2 de ânions humano [SLC4A2]
Q9UEY5 Tipo b2 de permutador-2 de ânions humano [SLC4A2]
Q9UEY4 Tipo b1 de permutador-2 de ânions humano [SLC4A2]
Q9UER6 Co-ativador de transcrição p75 humano
000256 DFS70 humana
P04920-2 Forma B1 com união de P04920 [SLC4A2]
Q9BTB1 Proteína hipotética humana MGC10561
Q9UKB0 Proteína HMG R humana
043167 Proteína contendo domínioBTBe dedo de zinco ZBT24JHUMANA
Q8N455 Proteína ZBTB24 humana [ZBTB24]
Q5TED5 Proteína 450 do dedo de zinco humana [ZNF450]
Q96CK0 Proteína 653 do dedo de zinco humana
Q96AS7 Proteína 653 do dedo de zinco humana
P51888 Precursor de pró-arginina PRELPJHUMANA
Q5JPC9 Proteína hipotética humana DKFZp667H216
Q6FHG6 Proteína PRELP humana
Q6ZR44 Proteína hipotética humana FLJ46672
Q8NEZ4 Homólogo de proteína 3 de leucemia mielóide/linfóide MLL3JHUMANA
Q96AC6 Proteína KIFC-2 semelhante à cinesina KIFC2 HUMANAQ9C0H5 Proteína K1688_HUMANA KIAA1688
P52926 Proteína HMG l-C HMGIC.HUMANA
Q9UKV3 Indutor ACINU_HUMANA de condensação de cromatina apoptótica
Q59F82 Variante de proteína C21orf2 humana
Q5VYT7 OTTHUMP00000021181 humana
Q96M56 Proteína hipotética humana FLJ32810
Q69YJ6 Proteína hipotética humana DKFZp667N107
Q8NEY3 Proteína 4 espermatogênese-associada SPAT4_HUMANA
Q12809 Sub-família do canal de íons de potássio com potencial controlado
KCNH2_HUMAN
Q8IYY4 Proteína humana similar à proteína 1 de DAZ-interação [DZIP1L]
Q6ZN04 Proteína hipotética FLJ16544 humana
Q5SXN7 Antígeno 3 de câncer de cólon sorologicamente definido humano
Q8IVG2 proteína KIAA2009 humana (Fragmento) [RKHD3]
Q75VX8 Proteína KIAA2038 humana (Fragmento) [KIAA2038]
Q12809-2 Isoforma 2 com união de von Q12809 [KCNH2]
Novamente, essa base da presente invenção também se referea ácidos L-nucleicos e, em particular, spiegelmers, os quais são dirigidoscontra qualquer uma das moléculas alvo mencionadas nas Tabelas 1 a 3.
Uma vez que o ácido L-nucleico é usado como um agente intra-celularmente ativo, em particular dentro de uma célula, de forma se a ligar areceptor intracelular intracelularmente, diferentes formas de interações entreo receptor intracelular e seus parceiros de interação podem ser influencia-das. Dependendo do tipo de parceiros de interação do receptor intracelular,o uso intracelular de ácidos L-nucleicos, assim, permite que interações deproteínas, ácidos nucleicos, lipídios, carboidratos ou combinações de proteí-nas, ácidos nucleicos, lipídios, carboidratos uns com os outros ou entre unsaos outros sejam influenciadas. Com relação ao uso de acordo com a inven-ção de um ácido L-nucleico, em particular um spiegelmers, como agente in-tracelular e o método para ligação de um receptor intracelular, deve ser ob-servado que isso, de preferência, se refere a uma aplicação in vitro e a ummétodo in vitro.Com relação ao uso de acordo com a invenção de um ácido L-nucleico, em particular um spiegelmer, para a produção de um medicamentopara o tratamento e/ou a prevenção de uma doença e/ou para a produção deum medicamento para fins diagnósticos, a molécula alvo é uma moléculaalvo intracelular. A esse respeito, a molécula alvo intracelular é uma que es-tá causai ou não causalmente envolvida na doença ou enfermidade a serprevenida, tratada ou diagnosticada mas, em qualquer caso, sua ligação aum ácido L-nucleico que se liga especificamente à mesma significa que, nocaso de um medicamento, a doença é aliviada, prevenida ou curada e/ou, nocaso de um agente diagnóstico, a doença ou uma predisposição à mesmapode ser estabelecida ou diagnosticada. Conforme usado aqui, o conceito dediagnóstico inclui um diagnóstico inicial, bem como subseqüentes diagnósti-cos, em particular diagnósticos ou investigações de forma, por exemplo, aacompanhar ou determinar a progressão da doença ou os estágios da doen-ça. Está dentro do escopo da invenção que a molécula alvo é um receptorintracelular, conforme descrito aqui, em particular um fator de transcrição,uma molécula alvo intracelular ou uma proteína-HMG. Dentro do escopo dapresente invenção, é mais particularmente preferido se a molécula alvo estápresente intracelularmente, isto é, dentro de uma célula e a interação tendouma influência sobre a doença e/ou diagnóstico ocorre intracelularmenteentre o ácidos L-nucleicos e, em particular, o spiegelmer e a molécula alvo,isto é, o receptor. Também está dentro do escopo da presente invenção se amolécula alvo está presente fora de uma célula e a interação entre o ácido L-nucleico e, em particular, o spiegelmer, e a molécula alvo, isto é, o receptor,ocorre extracelularmente.
As indicações para uso do medicamento produzido usando umácido L-nucleico, no qual o ácido nucleico é dirigido contra uma moléculaalvo intracelular, seguem para aqueles habilitados na técnica a partir do en-volvimento de uma molécula alvo intracelular no respectivo mecanismo depatogenicidade sobre o qual a indicação é baseada. Assim, sabe, por exem-plo, para proteínas HMGA, que essas estão associadas a carcinomas (interalia, da mama, pulmões, pele, tiróide), bem como leucemias e linfomas eoutros tumores malignos tais como, inter alia, sarcomas (rhabdomiosarcoma,osteosarcoma). Também, proteínas HMGA são expressas em muitos tiposde tumores mesenquimais incluindo, inter alia, hamartomas (mama e pul-mões), tumores de tecido gorduroso (lipomas), adenomas pleomórficos dasglândulas salivares, leiomiomas uterinos, angiqmixomas, fibroadenomas damama, pólipos do endométrio e placas áteroscleróticas. HMGA é um alvoterapêutico interessante. Bloqueio de HMGA poderia ser um ponto de partidaadequado para controle de câncer e prevenção de sua disseminação metas-tática. Conforme descrito em detalhes aqui, ácidos L-nucleicos dirigidos con-tra proteínas HMGA são também adequados para o diagnóstico e/ou trata-mento de doenças virais e arteriosclerose, levando-se em conta o envolvi-mento das proteínas HMGA na regulação da transcrição de um grande nú-mero de genes virais ou a expressão acentuada de HMGA e, em particular,HMGA1 nos tecidos afetados por arteriosclerose, o qual está associado aoneoíntimo, células de músculo liso vascular, macrófagos e novos vasos san-güíneos.
Embora - conforme foi, surpreendentemente, descoberto pelospresentes inventores - ácidos nucleicos, de preferência ácidos L-nucleicos e,particularmente, spiegelmers, sejam capazes, como tal, de penetrar umamembrana dupla de fosfolipídio, tal como uma membrana citoplásmica e,então, ser intracelularmente funcionais no sentido da interação específicacom o receptor intracelular, a eficácia da infiltração do ácido L-nucleico podeser influenciada e, em particular, intensificada através de uso de várias téc-nicas. Essas técnicas incluem o uso de compostos químicos ou moléculas,bem como o uso de medidas físicas. A despeito do tipo, essas técnicas sãoaqui geralmente referidas como veículos de distribuição. Está dentro do es-copo da presente invenção que os inventores, da mesma forma, estabelece-ram que aptâmeros também exibem essa propriedade e, da mesma formaque os spiegelmers podem, similarmente, ser usados envolvidos junto com acomposição de acordo com a invenção para basicamente as mesmas finali-dades, aplicações e usos.
No uso de compostos químicos e moléculas, uma outra distinçãoé se o ácido nucleico precisa ser modificado ou não para a distribuição. Umamodificação, para fins de uso de um veículo de distribuição, geralmente nãoé necessária se o veículo de distribuição é ou compreende uma vesícula talcomo, por exemplo, no caso de lipossomas, veículos polipeptídicos, ciclo-dextrinas, dendrímeros, nanopartículas e micropartículas e também polietile-noimina. Uma modificação, para fins de uso de um veículo de distribuição é,por outro lado, normalmente necessária se o veículo de distribuição usa en-docitose receptor-mediada, peptídeos fusogênicos, peptídeos sinalizadoresou conjugados lipofílicos. O grupo de técnicas físicas inclui, em particular,eletroporação e iontoforese. Será reconhecido que outras técnicas paratransporte de um composto através de uma membrana dupla de fosfolipídio,tal como a membrana citoplásmica, são conhecidas por aqueles habilitadosna técnica nesse campo as quais, em princípio, são também adequadas pa-ra a transferência de um ácido nucleico funcional tal como, por exemplo, umaptâmero e/ou um spiegelmer.
Os veículos de distribuição individuais os quais podem ser usa-dos dentro do escopo dos vários aspectos da presente invenção serão des-critos em maiores detalhes aqui depois.
Lipossomas consistem de lipídios catiônicos artificiais, tais comocloreto de N-[1 -(2,3-dioleoilóxi) propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) e sul-fato de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), nos quaisos grupos catiônicos interagem com os ácidos nucleicos negativamente car-regados e neutralizam sua carga aniônica. O transporte ocorre via endocito-se (PNAS, 93: 11493-11498, 1996). Contudo, lipossomas catiônicos são ci-totóxicos, especialmente em altas concentrações, o que restringe seu uso invitro e in vivo (Biochem Biophys Res Commun, 197: 818, 1993; BiochemBiophys Res Commun, 1372: 55-68, 1998). Por outro lado, o lipídio baseadoem piridínio anfifílico SAINT-2 é uma formulação não tóxica (Nucleic AcidsRes, 29: 2079-2087, 2001). Também, lipossomas sensíveis ao pH são umapossível alternativa, os quais consistem de moléculas anfifáticas, tais comohemi-succinato de colesterila (CHEMS) e dioleil fosfatidil etanolamina (DO-PE) (J Pharmacol Exp Ther, 297: 1129-1136, 2001). Formulações ampla-mente diferentes de lipossomas podem ser encontradas em artigos de revi-são por Dass e Torchili (Drug Delivery, 9: 169-180, 2002; Nat Rev Drug Disc,4:145-160,2005).
Com endocitose, mecanismos de transporte receptor-mediados((RME) os quais estão sempre presentes na membrana celular são utiliza-dos. Para essa finalidade, o ácido nucleico é acoplado, por exemplo, via umligante de poli-L-lisina (PPL) covalentemente a uma proteína transportadora(proteína "veículo"). A escolha da proteína transportadora depende, a esserespeito, da capacidade de se ligar a receptores específicos da membranacelular e se acumular na célula através de endocitose. Um transporte célula-específico pode, assim, ser realizado. Por exemplo, um fosforotioato anti-senso dirigido contra c-myc pôde ser introduzido em células de melanomahumano M-14 (Anticancer Res, 17: 29-35, 1997). Contudo, um transporteeficaz por meio de RME depende, nesse caso, não apenas da afinidade doreceptor pelo ligante, mas também da limitação do receptor selecionado comrelação à células - especialmente in vivo. Além disso, o ligante selecionadodeve ser inativo ou ter um efeito de intensificação com relação ao resultadoterapêutico, de forma a evitar uma possível toxicidade do veículo de trans-porte. Assim, a seleção e a propagação generalizada do receptor seleciona-do in vivo é decisiva para um transporte RME-baseado de sucesso. Alémdisso, a captura de ácidos nucleicos em compartimentos endossômicos foiobservada em transporte RME-baseado, o que parece tornar esse métodonão muito promissor para um transporte intracelular ou uma liberação oudistribuição intracelular. Mais importante de tudo, o acoplamento entre o re-ceptor e o ácido nucleico deve ser escolhido de modo que a função de umou outro não seja reduzida (J Pharmaceutical Science, 92 (8): 1559-1573,2003).
Peptídeos fusogênicos têm sido usados para permitir que conju-gados de peptídeo-oligonucleotídeo se fundam com a membrana celular e,assim, realizam o transporte na célula (Bioconjug Chem, 9: 466-475, 1998;Bioconjug Chem, 6: 43-53, 1995; Nucleic Acids Research, 25: 2730-2736,1997).A importação selecionada de proteínas nucleares do citosol parao núcleo é mediada por seqüências peptídicas curtas, as quais são denomi-nadas sinais de localização nuclear (NLS). Assim, vários derivados de peptí-deo de NLS podem ser usados de forma a transportar ácidos nucleicos parao núcleo (Bioconjug Chem, 10: 1005-1012, 1999; Bioconjug Chem, 10: 598-606, 1999; Bioconjug Chem, 6: 101-108, 1995). Além disso, existem tambémos assim denominados peptídeos de importação de sinal (IP), os quais po-dem promover a captação celular de ácidos nucleicos e poderiam ser deri-vados, por exemplo, de fator de crescimento de fibroblasto de Kaposi a (K-FGF) (Adv Drug Deliv Rev, 44: 35-49, 2000).
Vesículas similares aos capsídeos virais podem ser formadaspor blocos de polipeptídeos, as quais podem servir como possíveis veículosde transporte para um transporte intracelular (Nat Materials, 3(4): 244-8,2004).
O caráter hidrofílico dos oligonucleotídeos e a parte principal defosfodiéster aniônica reduzem a permeação celular. Conjugados lipofílicossão, portanto, uma possível forma de aumentar a capacidade dos oligonu-cleotídeos de se ligar à lipoproteínas e, desse modo, melhorar a distribuiçãointracelular. O conjugado que tem sido mais completamente investigado écolesterol (Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 12: 103-128,2002).
Ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos os quais têm umacavidade hidrofóbica central e múltiplos grupos hidroxila sobre a superfícieexterna. Ciclodextrinas, portanto, têm já tem sido usadas para o transportede oligonucleotídeos anti-senso em linhagens de células T humanas (Anti-sense Res Dev, 5: 185-192, 1995) e também têm sido usadas in vivo paratransporte intracelular e para liberação ou distribuição intracelular de se-qüências CpG imunogênicas (Biochem Pharmacol, 52: 1537-1544, 1996).Uma ampla variedade de formulações de ciclodextrinas são fornecidas noartigo de revisão por Davis e Brewster (Nature Reviews Drug Discovery 3:1023-1035, 2004).
Dendrímeros são macromoléculas altamente ramificadas asquais são compostas de unidades repetitivas, tipicamente, de poliamidas. Asmoléculas trazem grupos funcionais, tais como grupos amino primários, so-bre sua superfície, os quais interagem com outras moléculas através de inte-ração eletrostática. Uma formação de estrutura complexa, assim, ocorre ra-pidamente e de uma maneira altamente reproduzível, o que leva a comple-xos de baixa citotoxicidade (Nucíeic Acids Research, 28: 4225-4231, 2000;Clin câncer Res, 7: 3606-3612, 2001).
Nanopartículas de cianoacrilato têm sido testadas desde o co-meço da década de 1990 para a liberação ou distribuição de oligonucleotí-deos. A interação de oligonucleotídeos com nanopartículas ocorre atravésde pares de íons da carga aniônica dos oligonucleotídeos com vários cátionshidrofóbicos, principalmente com nanopartículas carregadas. Cianoacrilatode poliisohexila (PIHCA), cianoacrilato de poliisobutila (PIBCA) ou cianoacri-lato de polihexila (PHCA) são comumente usados para a formação de nano-partículas, embora um grande número de oligopares-cátions lipofílicos denucleotídeo também tenham sido testados (Pharm Res., 1: 1370-1378, 1994;PNAS, 91: 10460-10464, 1994; Pharm Res, 9: 441-449, 1992). Também,nanopartículas já foram empregadas para uso in vivo (Biochem Biophys ResCommun, 279: 401-406, 2000; Pharm Res, 13: 38-43, 1996).
Micropartículas ou as assim denominadas microesferas são, tipi-camente, formadas a partir de polímeros biodegradáveis, tais como (poli)d,l-lactídeo-co-glicolídeos [P(LA-GA)] e são usadas para a liberação retardadade oligonucleotídeos (J Pharm Sei, 91: 790-799; 2000; J Controlled Release,69: 197-207, 2000; J Drug Target, 5: 291-302, 1998).
Eletroporação é uma tecnologia de transporte a qual usa umcampo elétrico forte de forma a desestabilizar a membrana lipídica dupla e,desse modo, permeabilizar a membrana celular e, assim, realizar o transpor-te da substancia a ser administrada, a qual também pode estar presente naforma ionizada, na célula (iontoforese). Eletroporação já tem sido usada comsucesso de forma a realizar o transporte transdérmico de oligonucleotídeosex vivo, bem como in vivo (Int J Pharm, 184: 147-156, 1999; J Drug Target,5: 275-289, 1998; Pharm Res, 15: 1596-1602, 1998; Int J câncer, 85: 260-266, 2000; Biochem Biophys Res Commun, 212: 286-292, 1995; Blood, 88:731-741,1996).
A captação de oligonucleotídeos "nus" em células pode ser aper-feiçoada in vitro e ex vivo através de uso de alta pressão. A necessidade desistemas fechados de forma a usar essa tecnologia significativa que ela po-de ser usada apenas para aplicações ex vivo (PNAS, 96: 6411-6416, 1999;Hum Gene Ther, 10: 2355^2664, 1999).
Também, o uso de microondas, pulsos de alta pressão acústi-cos, realiza o transporte de oligonucleotídeos em células (J Mol Med, 79:306-313, 2001; câncer Res, 58: 219-221, 1998). Ultra-som é um tecnologiaacústica comparável a microondas, mas emprega freqüências maiores (MHzao invés de Hz) e tempos de aplicação mais curtos (de segundos a minutos)e já foi usado em um papel de suporte em técnicas de terapia genética (HumGene Ther, 7: 1339-1346, 1996; Invest Radiol, 32: 723-727, 1997; Ultra-sound Med Bio, 25: 1451-1457, 1999).
Em um outro aspecto da presente invenção, um novo veículo dedistribuição é proporcionado o qual é adequado, em particular, para o trans-porte de ácidos nucleicos funcionais, tais como aptâmeros, de preferênciaácidos L-nucleicos funcionais e, mais particularmente de preferência, spie-gelmers, O veículo de distribuição é, nesse caso, uma estrutura semelhanteà micela ou semelhante a lipossoma baseada em polietilenoimina. Sem de-sejar ter de ser muito específico na descrição a seguir, os presentes invento-res partem do princípio de que o ácido nucleico está presente incrustado oucontido na estrutura semelhante à micela ou semelhante a lipossoma. Polie-tilenoimina pode, em princípio, estar presente e também ser usada comopolietilenoimina linear ou ramificada, polietilenoimina na forma ramificadasendo particularmente preferida. Além disso, polietilenoimina pode existir epode também ser usada como polietilenoimina de elevado peso molecularou baixo peso molecular. De preferência, polietilenoimina de elevado pesomolecular tem um peso molecular de cerca de 800 kDa e polietilenoimina debaixo peso molecular tem um peso molecular de cerca de 3 kDa. Dentro doescopo da presente invenção, uma polietilenoimina com um peso molecularmédio de cerca de 25 kDa é preferida, uma polietilenoimina ramificada comum peso molecular de cerca de 25 kDa sendo particularmente preferida.
Embora não seja essencial para uma implementação eficaz, to-davia, é preferido se, no veículo de distribuição de acordo com a invenção, oácido nucleico em si a ser distribuído também traga uma modificação. A es-se respeito, é preferido se a modificação for selecionada do grupo compre-endendo resíduos de PEG. Além disso, é preferido se o resíduo de PEG temum peso molecular de cerca de 1000 a 10000 Da, de preferência cerca de1200 a 5000 Da, mais preferivelmente cerca de 1500 a 2500 Da e, mais par-ticularmente de.preferência, cerca de 2000 Da.
Quando de mistura do ácido nucleico com o veículo de distribui-ção para produzir uma composição de acordo com a invenção, a proporçãodo número total de grupos nitrogênio da polietilenoimina para o número totalde grupos fosfato do ácido nucleico a ser distribuído via ou acondicionadocom o veículo de distribuição é ajustada para cerca de 1 a 20, de preferênciacerca de 1,5 a 10, mais preferivelmente 2 a 5 e, mais particularmente de pre-ferência, cerca de 2 a 3.
O veículo de distribuição de acordo com a invenção, assim per-mite que o mecanismo de transporte intracelular de ácidos nucleicos viacondensação ou acondicionamento com partículas ou reagentes carregadose alteração associada na carga do complexo global seja usado também paraácidos nucleicos funcionais, tais como aptâmeros e, em particular, ácidos L-nucleicos, tais como spiegelmers. Esse complexo é prontamente captadoatravés de endocitose e, desse modo, passa para o citosol da célula. Umadesvantagem desse método é a estabilidade do DNA/RNA e a liberação doácido nucleico do compartimento endossômico. No citosol da célula, um li-sossoma é rapidamente formado a partir do endossoma hermeticamenteconstricto em virtude da introdução de proteases ou nucleases e através deprotonação do compartimento. Essas nucleases decompõem os ácidos nu-cleicos. Isso não se aplica, contudo, a spiegelmers, uma vez que, em virtudede sua configuração não natural, esses não estáveis à nuclease. Também,ácidos nucleicos não são estáveis no ambiente ácido do lisossoma. Contu-do, isso é mais verdadeiro para ácidos nucleicos sintetizados a partir deDNA e menos verdadeiro para ácido nucleico de RNA. O complexo todo érapidamente transportado da célula novamente através de exocitose e sedecompõe no aparelho de Golgi e, conseqüentemente, apenas uns poucosácidos nucleicos passam para a célula. Um dos desafios os quais um siste-ma de transfecção adequado tem de superar é, assim, a estabilização, bemcomo a liberação do ácido nucleico dos endossomas no citosol. Com relaçãoà estabilidade, spiegelmers de RNA têm propriedades ideais para uma trans-fecção de células eucariotas uma vez que, sendo enantiômeros, eles nãosão quebrados por enzimas.
O uso de acordo com a invenção de ácidos L-nucleicos e, emparticular, com relação à composição de acordo com a invenção, é importan-te especificamente para essa classe de substâncias ativas, uma vez que seumecanismo de ação é baseado em uma abordagem estequiométrica e nãoem uma abordagem catalítica, na qual a liberação intracelular de apenasuma poucas moléculas já é suficiente para obter o efeito desejado. Até esseponto, a presente invenção satisfaz uma necessidade que não tinha sidoreunida até agora pelos métodos da técnica anterior.
O sistema de transfecção de acordo com a invenção que é pro-porcionado e elaborado pelos veículos de distribuição de acordo com a in-venção é baseado na formação de micelas de ácidos nucleicos e polietileno-imina (PEI) ramificada. A parte principal de fosfodiéster dos ácidos nucleicosinterage com as posições de nitrogênio livre da PEI e forma pequenas mice-las através de reticulação, as quais têm uma carga positiva levando-se emconta a PEI. Essas micelas são prontamente captadas como endossomasde uma célula através de constricção da membrana plasmática. A PEI agoratampona o influxo de prótons, como um resultado do que muitos íons de clo-reto no interior do endossoma levam a um intumescimento do compartimen-to levando-se em conta a pressão osmótica. Esse efeito da PEI é descrito naliteratura como a efeito de esponja de prótons e, por fim, leva à ruptura doendossoma e libera os spiegelmers no citosol (Pharm Res, 22 (3): 373-80,2005; Eur J Cell Biol 83 (3): 97-111, 2004; Gene Ther 9(24): 1700-7, 2002).Está dentro do escopo da presente invenção aplicar a composi-ção de acordo com a invenção como um aerossol.
Além disso, spiegelmers podem ser derivatizados com peptídeossinalizadores para distribuição intracelular, bem como intranuclear, e tam-bém para distribuição órgão-específica. Um acoplamento de peptídeos sina-lizadores diretamente a uma polietilenoimina pode ser usado para uma loca-lização objetivada em órgãos ou dentro da célula.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a ácidos L-nucleicos, em particular spiegelmers e, mais preferivelmente, spiegelmers deRNA, os quais são dirigidos contra proteínas HMGA. Os spiegelmers divul-gados aqui dirigidos contra proteínas HMGA são, em particular, exemplos doconhecimento que forma a base da presente invenção de que ácidos L-nucleicos e, em particular, spiegelmers, são capazes de superar uma mem-brana dupla de fosfolipídio ou uma membrana citoplásmica de uma célula ese ligar intracelularmente com o receptor intracelular, para a ligação especí-fica ao qual eles foram selecionados. Com relação à configuração das prote-ínas HMGA e os ácidos L-nucleicos dirigidos contra as últimas, os comentá-rios feitos aqui com relação ao uso intracelular de ácidos L-nucleicos tam-bém se aplicam com relação ao presente aspecto da invenção (e vice-versa)e são referidos novamente nesse ponto de forma a evitar repetições desne-cessárias.
A família HMG (grupo com alta mobilidade) de fosfoproteínas deDNA-ligação está presente como componentes de não-histona de cromatinaatravés de células de mamíferos (Grosschedl e colaboradores, 1994). Asproteínas HMG básicas são subdivididas em três diferentes famílias HMGB(formalmente HMG-1/-2), HMGN (formalmente HMG-14/-17) e a famíliaHMGA (formalmente HMG-I/Y/C). Cada família HMG tem seu motivo de se-qüência funcional característico: a "caixa de HMG" (família HMGB), o "domí-nio de ligação nucleossômica" (família HMGN) e o "gancho AT" (família HMGA).
De acordo com o estado atual de conhecimento, a família HMGAcompreende dois genes, HMGA1 e HMGA2. Três diferentes proteínas po-dem ser expressas através de união alternativa pela HMGA1, (HMGAIa[formalmente: HMG-I], HMGAIb [formalmente: HMG-Y], HMGAIc [formal-mente: HMG-I/R]), enquanto que apenas uma proteína (HMGA2 [formalmen-te: HMGI-C]), pode ser expressa pela HMGA2. HMGAIa, HMGAIb e HM-GA2 são polipeptídeos de aproximadamente 100 aminoácidos de compri-mento e têm uma organização modular de seqüência: elas possuem trêsregiões fortemente básicas ("gancho AT") as quais se ligam a pequenos ca-nais estreitos de DNA rico em AT fita dupla (Reeves & Nissen 1990). O C-término, por outro lado, contém muitos aminoácidos ácidos. As proteínasnão têm uma estrutura secundária estável quando livres em solução e ado-tam uma conformação definida apenas quando elas estão presentes emcomplexo com DNA ou outras proteínas (Huth e colaboradores 1997). Prote-ínas HMGA pertencem às proteínas mais fortemente modificadas no núcleocelular de mamíferos e são fosforiladas, acetiladas e metiladas (Reeves &Beckerbauer2001).
As proteínas HMGA per se não têm qualquer atividade transcri-cional mas, sendo os assim denominados fatores de transcrição arquitetôni-cos, elas organizam, através de suas interações proteína-proteína e proteí-na-DNA, a formação do complexo de transcrição de nucleoproteína-DNA(Wolffe 1994). Assim, elas exercem uma influência inibitória ou de ativaçãoregulatória sobre a expressão de um grande número de genes. O exemplomais proeminente de uma regulação positiva é o envolvimento da HMGA1na regulação de IFN-J3 (Thanos & Maniatis, 1992). Assim, por exemplo, nocaso do promotor de IFN-p, a HMGAIb estimula a ligação de NF-kB e ATF-2à hélice dupla do DNA e, ao mesmo tempo, altera a estrutura do DNA deuma forma tal que NF-kB e ATF-2 podem interagir um com o outro e, pre-sumivelmente, também com o resto da maquinaria de transcrição (Thanos &Maniatis 1992, Du e colaboradores 1993). Um outro efeito transcrição-associado com relação à patogênese de arteriosclerose é a regulação dogene CD44 induzida pela HMGA1 (Foster e colaboradores 1998). CD44 éuma glicoproteína da superfície celular e está envolvida na migração e proli-feração de células do músculo liso após dano endotelial (Jain e colaborado-res 1996, Cuff e colaboradores 2001). A regulação transcricional de CD44 éinduzida pela ligação de c-Fos e c-Jun ao sítio de ligação AP-1 no promotorde CD44 e é fortalecida pela ligação de HMGA1. Investigações em ratosmostraram que, em virtude da super-expressão de CD44, há um recruta-mento intensificado de células do músculo liso, o que tem uma influênciadireta sobre a formação de lesões arterioscléroticas (Pellacani e colaborado-res 1999; Foster e colaboradores, 1998; 2000).
Investigações sobre a expressão do gene HMGA1 localizado nabanda cromossômica 6p21.3 e do gene de HMGA2 localizado na região12q14-15 mostraram que essas são principalmente ativas em processos dediferenciação celular. Conseqüentemente, uma forte expressão desses ge-nes pode ser encontrada durante desenvolvimento de embrião e em célulasnão diferenciadas (Chiappetta e colaboradores 1996), bem como em célulasde estimulação de fator de crescimento (Friedman e colaboradores 1993;Johnson e colaboradores 1990; Ogram e colaboradores 1995; Holth e cola-boradores 1997). Em tecido diferenciado de adultos, a HMGA1 é fortementeexpressa apenas na retina, enquanto que HMGA2 não é encontrada em to-dos os outros tecidos e HMGA1 é encontrada apenas em concentraçõesmuito baixas (Bussemakers e colaboradores 1991; Chiappetta e colaborado-res 1996; Rogada e colaboradores 1996; Zhou e colaboradores 1995; Chaue colaboradores 2000). Um expressão reativada de proteínas HMGA em te-cido normal diferenciado está, ao mesmo tempo, associada ao crescimentoe diferenciação de adipócitos (Zhou e colaboradores 1995; Anand & Chada2000; Melillo e colaboradores 2001), a proliferação de células do músculoliso nos vasos sangüíneos após dano vascular (Chin e colaboradores 1999),na resposta imune em reações inflamatórias (Pellacani e colaboradores1999), bem como em processos apoptóticos (Diana e colaboradores 2001;Sgarra e colaboradores 2003). A quantidade de HMGA1 varia, a esse respei-to, dependendo da taxa de proliferação das células (Johnson e colaborado-res 1990).
Durante o curso de desenvolvimento de embrião, a expressãode HMGA1 está concentrada sobre órgãos específicos de origem ectodérmi-ca, mesodérmica ou endodérmica, enquanto que HMGA2 está restrita aotecido mesenquimal. Até agora, não há informação referente ao fenotipo decamundongos knockout para HMGA1, possivelmente porque a falta dessefator prejudicou muito gravemente o desenvolvimento do embrião. Camun-dongos knockout para HMGA2, por outro lado, exibem ananismo e, particu-larmente, têm pouco tecido gorduroso (Zhou e colaboradores 1995) e, alémdisso, são resistentes à obesidade dieta-induzida (Anand & Chada 2000).
Finalmente, expressão de HMGA2 e HMGAIb não é detectávelno tecido gorduroso de camundongos normais, mas é dramaticamente au-mentada na gordura de camundongos gordos ou diabéticos (Chada e cola-boradores, 2004), o que aponta para uma conexão entre a adiposida-de/obesidade e expressão de HMGA.
A super-expressão de HMGA1 influência, em particular (Reevese colaboradores 2001):
• o ciclo e reguladores celulares, tal como cdc25A,
• marcadores de filamento intermediários, tal como citoquera-tina do tipo 1
• reguladores de apoptose, tal como TRAR15
• genes supressores de tumor e oncogenes, tal como MET
• genes para reparo e recombinação de DNA, tal como DNase
• reguladores de morte e desenvolvimento celular, tal comofrizzled-5
• receptores, tal como FGFR1
• genes de adesão, motilidade e invasão celular, tal como co-lágeno do tipo 1
• reguladores de angiogênese, tal como FGFR2
• reguladores de invasão, tal como MMP-16
• pequenas GTPases da família Rho e seus reguladores, talcomo RhoC
• genes de interação célula-célula, tal como caderina 12
• fatores de crescimento e citocinas, tal como IL-11Regulação anormal de HMGA1, portanto, poderia levar à altera-ções gerais de expressão do gene e, desse modo, contribuir significativa-mente para a formação de fenotipos transformados e/ou metastáticos.
Proteínas de HMGA parecem exercer diferentes papeis em tu-mores mesenquimais e epiteliais: em tumores epiteliais malignos, expressãode HMGA está associada, antes, com os últimos estágios de carcinogênese,enquanto que tumores benignos - com maior freqüência raramente se con-vertendo em tumores mesenquimais - já expressam HMGA em hiperplasiaprecoce. Isso aponta para o fato de que as proteínas HMGA em tecidos dediferentes origens embriônicas exercem diferentes funções, a partir do qualtambém segue diretamente os usos correspondentes dos ácidos L-nucleicosde acordo com a presente invenção no diagnóstico e/ou tratamento de do-enças correspondentes, conforme também é ilustrado em maiores detalhesaqui depois.
A expressão de HMGA1 em vários neoplasmas humanos e ani-mais foi investigada em modelos com animais. O papel da HMGA1 foi de-monstrado em modelos com animais de tumorigénese (Leman e colaborado-res 2003; Ram e colaboradores 1993), bem como progressão neoplasica(Bussemakers e colaboradores 1991; Nestl e colaboradores 2001; Ram ecolaboradores 1993).
Expressão elevada do gene HMGA1 foi demonstrada nos se-guintes carcinomas:
• Próstata (Bussemaker e colaboradores 1991; Tamimi e co-laboradores 1996, Leman e colaboradores 2003; Nestl e co-laboradores 2001)
• Pâncreas (Nestl e colaboradores 2001; Abe e colaboradores2000, 2002; Tarbe e colaboradores 2001)
• Tiróide (Chiappetta e colaboradores 1998, 1995)
• Cérvix (Bandiera e colaboradores 1998)
• Estômago (Xiang e colaboradores 1997)
• Mama (Holth e colaboradores 1997; Baldassarre e colabora-dores 2003; Reeves e colaboradores 2001; Nestl e colabo-e ainda em:
radores 2001; Ram e colaboradores 1993; Dolde e colabo-radores 2002)
Cólon/Reto (Fedele e colaboradores 1996; Abe e colabora-dores 1999; Kim e colaboradores 1999; Chiapètta e colabo-radores 2001)
Ovários (Masciullo e colaboradores 2003)
Neuroblastoma (Giannini e colaboradores 2000; 1999) bemcomo
• Linfoma (Wood e colaboradores 2000a; b).
A razão precisa para a expressão aumentada e o papel do genede HMGA1 na patogênese do tumor e no processo de metástase ainda nãofoi totalmente esclarecida. Vários estudos indicam, contudo, que a resistên-cia da expressão de HMGA1 pelo respectivo tumor como um marcadorprognóstico se correlaciona com seu potencial de metastatizar e, assim, re-presente um aspecto característico de uma célula transformada maligna (Gi-ancotti e colaboradores 1987).
Outros tumores mesenquimais HMGA1-associados - nesse casobenignos - são caracterizados por alterações cromossômicas na região6p21.3 da HMGA1 cromossômica. Tais aberrações foram, até agora, descri-tas, inter alia, em:
• Leiomioma uterino (Mark e colaboradores 1988; Ozisik ecolaboradores 1993)
• Lipoma (Sreekantaiah e colaboradores 1990)
• Pólipos endometriais (Fletcher e colaboradores 1992; DalCin e colaboradores 1995) bem como
• hamartoma condróide dos pulmões (Fletcher e colaborado-res 1991; Johansson e colaboradores 1992, 1993).
Aberrações nos mecanismos genéticos que controlam o cresci-mento de proliferação são a causa primária de carcinogenese. A expressade proteínas HMGA está fortemente associada com o desenvolvimento detumor, conforme foi mostrado em uma série de artigos e papers (Giancotti ecolaboradores, 1987, 1989, 1993). Assim, uma expressão significativa deHMGA2 foi encontrada em tumores química ou viralmente causados, bemcomo em tumores que ocorrem espontaneamente, enquanto que essa prote-ína não pôde ser detectada em células não transformadas ou tecido saudá-vel (Giancotti e colaboradores, 1989). De acordp com isso, no caso de célu-las infectadas com retrovírus oncogeneicos nos quais a síntese de expres-são de HMGA2 tenha sido especificamente bloqueada, vários marcadoresde fenotipo para transformação estavam ausentes (Berlingieri e colaborado-res, 1995).
O papel chave de proteínas HMGA no crescimento normal, bemcomo patológica, foi elucidado em modelos com camundongo: camundongosknockout para HMGA2 exibiram crescimento reduzido, isto é, os animais sãoaproximadamente 60% menores do que os camundongos do tipo silvestre.Esses camundongos anões, contudo, têm uma alta resistência à tumores depele quimicamente induzidos.
Nos últimos anos, aberrações estruturais da região cromossômi-ca 12q14-15 envolvendo o gene de HMGA2 têm sido encontradas com oauxílio de investigações citogenéticas para um número completo de tumoresbenignos de origem mesenquimal, esses sendo o último grupo de neoplasiainócua no homem. A despeito de um grande número de aberrações (Scho-enmakers e colaboradores 1995; Kottickal e colaboradores 1998; Klotzbü-chel e colaboradores 1999), a forma alterada, todavia, sempre exibe umacaracterística comum: elas retêm todos os três domínios de DNA-ligaçãomas, ao mesmo tempo, perdem o domínio ácido C-terminal bem como, anível de RNA, a informação na 3' UTR.
Tais alterações já foram encontradas para muitos (principalmen-te benignos) tumores mesenquimais HMGA-associados:
• Leiomiomas uterinos, os tumores abdominais mais comunsem mulheres e a razão para mais de 200.000 histerectomiaspor ano nos EUA (Heim e colaboradores 1988; Turc-Carel ecolaboradores 1986; Vanni e colaboradores 1988)
• Lipomas (Heim e colaboradores 1988; Turc-Carel e colabo-radores 1986; Mandahl e colaboradores 1987; Sreekantaiahe colaboradores 1991; Belge e colaboradores 1992)
• Pólipos endometriais (Walter e colaboradores 1989; Vanni ecolaboradores 1993; Dal Cin e colaboradores 1995)
• Hamartomas condróides dos pulmões (Fletcher e colabora-dores 1991, 1995; Dal Cin e colaboradores 1993)
• Adenomas pleomórficos das glândulas salivares (Mark e co-laboradores 1980, 1986; Bullerdiek e colaboradores 1987)
• Hemangiopericitomas (Mandahl e colaboradores 1993)
• Tumores condromatosos (Mandahl e colaboradores 1989;Bridge e colaboradores 1992)
• Tumores benignos dá mama (Birdsal e colaboradores 1992;Rohen e colaboradores 1995; Staats e colaboradores 1996)
• Angiomixomas agressivos (Kazmierczak e colaboradores1995)
• Astrocitomas difusos
• Osteoclastomas (Nuguera e colaboradores 1989)
■ A principal causa de mortalidade e morbidade em pacientes comcâncer é a disseminação metastática do neoplasma primário no corpo. Me-tástase não é processo simples, uma vez que uma colonização com sucessode órgãos distantes por células neoplásicas disseminadas tem de ultrapas-sar muitos estágios. Células neoplásicas têm de ser liberadas do neoplasmaprimário, entrar na corrente sangüínea, extravasar para locais distantes e,finalmente, proliferar novamente no parênquima do órgão correspondente.Muitos genes os quais expressam proteínas, tais como proteases, moléculasde adesão, fatores de motilidade e fatores angiogênicos, estão envolvidasnos vários estágios dessa cascata metastática altamente complexa.
Quais desses genes é, por fim, decisivo com relação à metásta-se não se sabe. O gene de HMGA1, sendo um dos fatores mais importantesque controla esse processo, contudo, é um provável candidato. Os produtosdo gene de HMGA1 influenciam a transcrição de muitos genes que são im-portantes para metástase com sucesso. Por exemplo, já foi mostrado queoutros genes metástase-associados são, em si, expressos em um nível re-duzido na supressão de expressão de HMGA1 (Battista 1998; Vallone 1997).
HMGA1, portanto, é uma molécula alvo terapêutica importante.O bloqueio de HMGA1 é, assim, em princípio, adequado para controle decâncer e prevenção de sua disseminação metastática (Evans 2004; Sgarra2004). Assim, por exemplo, através de uso de RNAs anti-senso dirigidoscontra transcritos de HMGA, a proliferação celular em células cancerígenasfoi reduzida in vitro ou as células sofreram mesmo apoptose (Masciullo 2003;Scála 2000; Chau 2003). Foi mostrado em modelos com animais que o cres-cimento de vários xenoenxertos de câncer pancreático é dramaticamentereduzido por terapia genética (expressão adenoviral de RNAs anti-sensodirigidos contra transcritos de HMGA) (Trapasso e colaboradores 2004).
HMGA1 poderia, além disso, ser usada como um marcadorprognóstico ou diagnóstico de forma a determinar quais pacientes se benefi-ciariam de um tratamento agressivo para o câncer. Existe uma correlaçãoíntima entre o grau da transformação maligna e a quantidade de HMGA1expressa. Isso, por sua vez, pode ser correlacionado a um pobre prognósticoem muitos tipos de câncer humano, tais como câncer de próstata (Tamimi1996; Bussemakers 1991) e carcinoma cólon-retal (Abe 1999) e neuroblas-toma (Giannini 2000).
Proteínas HMGA são usadas por muitos vírus, bem como porfatores de controle proporcionados pela célula hospedeira, para a expressãode genes virais ou como co-fatores, inter alia, pelo:
• Papovavírus JC humano (Leger e colaboradores 1995)
• Vírus de Epstein-Barr (Schaefer e colaboradores 1997)
• Vírus de Herpes simplex (Panagiotidis 1999; French e cola-boradores 1996)
• Vírus HIV-1 (Henderson e colaboradores 2000).
Em particular, proteínas HMGA estão envolvidas na regulaçãoda transcrição de um grande número de genes virais em uma célula hospe-deira. Exemplos disso são a regulação da expressão dos genes expressosprecoce e tardiamente do papovavírus JC humano (Leger e colaboradores,1995), regulação do gene EBNA1 (antígeno 1 nuclear do vírus de Epstein-Barr) do vírus de Epstein-Bar (EBV), o qual é conjuntamente responsávelpelo controle de latência viral (Schaeíer e colaboradores, 1997), regulaçãodo gene IE-3 (imediato-precoce) do Vírus-1 de Herpes simplex (HSV-1), oqual codifica a proteína ICP4 prematuramente expressa (Panagiotidis e co-laboradores, 1999), regulação do promotor 2, ativo durante a fase de latên-cia, do HSV-1 (French e colaboradores, 1996) e regulação do promotor deLTR (repetições longas terminais) do vírus de HIV-1 humano (Henderson ecolaboradores 2000).
O requisito de HMGA pela célula hospedeira no contexto de do-enças virais não está limitado apenas à regulação-de gene vital. HMGA1também parece exercer um papel decisivo como co-fator arquitetônico naintegração do DNA viral do vírus HIV-1, do vírus de leucemia de Moloney emmurinos (MoMuLv) e do vírus da gripe aviaria de sarcoma (ASV) no genomahumano e, portanto, parece ser uma abordagem terapêutica interessante emtratamento anti-viral (Van Maele e colaboradores, 2006, Li e colaboradores1998, Hindmarsh e colaboradores, 1999).
Inibidores de proteína HMGA são, portanto, também adequadospara o tratamento e diagnóstico de infecções virais (Reeves & Beckerbauer2002).
Como um resultado do envolvimento anteriormente mostrado deproteínas HMGA em várias doenças e sua adequabilidade como marcadoresdiagnósticos, ácidos L-nucleicos e, em particular, spiegelmers, dirigidos con-tra essas proteínas podem ser usados para a prevenção, tratamento e diag-nóstico das doenças acima. Spiegelmers particularmente preferidos são, aesse respeito, os spiegelmers descritos aqui. A esse respeito, é reconhecidopor aqueles habilitados na técnica que, embora spiegelmers individuais te-nham sido desenvolvidos para uma proteína HMGA específica, como umresultado da abordagem de domínio ilustrada no Exemplo 2, esses tambémpodem permitir uma reatividade cruzada com outras proteínas HMGA, o quepode ser observado a partir do alinhamento ilustrado na figura 2.
Além disso, é reconhecido por aqueles habilitados na técnicanesse campo que os ácidos nucleicos de acordo com, a invenção contêmuma série de motivos estruturais, os quais definem uma classe de spiegel-mers que se ligam, como receptores intracelulares, à proteínas HMGA. Osvários motivos estruturais são ilustrados em maiores detalhes no Exemplo 1.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção compreendem,em uma modalidade preferida, também aqueles ácidos nucleicos os quaissão substancialmente homólogos às seqüências especificamente divulgadasaqui. O termo "substancialmente homólogos" deverá, de preferência, sercompreendido, a esse respeito, como significando que a homologia é de pe-lo menos 75%, de preferência 85%, mais preferivelmente 90% e, ainda maispreferivelmente, mais de 95, 96, 97, 98 ou 99%.
O termo ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou ácidosnucleicos de acordo com a presente invenção, além disso, deverá ser com-preendido como incluindo também aqueles ácidos nucleicos os quais com-preendem seqüências de ácido nucleico tal como é descrito aqui ou partesdas mesmas, de preferência até o ponto em que os ácidos nucleicos ou asreferidas partes dos mesmos estão envolvidas na ligação à proteínas HM-GA. Tal ácido nucleico pode ser derivado daqueles divulgados aqui, por e-xemplo, através de encurtamento ou truncamento. Um encurtamento podeenvolver uma ou ambas as extremidades dos ácidos nucleicos, conforme édivulgado aqui. Um encurtamento também pode envolver as seqüências denucleotídeo internas, isto é, pode envolver nucleotídeo(s) entre os nucleotí-deos 5' e 3' terminais. Além disso, o termo encurtamento também pode sercompreendido como referindo-se à deleção de tão poucos quanto um nucle-otídeo individual das seqüências de ácido nucleico divulgadas aqui. Encur-tamento também pode envolver mais de uma região do(s) ácido(s) nuclei-co(s) de acordo com a invenção no qual, com relação a cada uma dessasregiões, pode ser tão pequena quanto um nucleotídeo de comprimento.
Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem,além disso, ser ácidos L-nucleicos ou ácidos D-nucleicos. De preferência, osácidos nucleicos de acordo com a invenção são ácidos L-nucleicos. Alémdisso, é possível que uma ou mais partes do ácido nucleico estejam presen-tes como ácidos D-nucleicos ou que pelo menos uma ou mais partes dosácidos nucleicos sejam, ácidos L-nucleicos. O termo "parte" dos ácidos nu-cleicos é compreendido como denotando tão pouco quanto um nucleotídeo.Tais ácidos nucleicos são, geralmente, referidos como ácidos D-nucleicos ouácidos L-nucleicos. Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, osácidos nucleicos de acordo com a presente invenção consistem de L-nu-cleotídeos e incluem pelo menos um D-nucleotídeo. Tal D-nucleotídeo é, depreferência, fixado a uma parte que é diferente da região ou regiões que de-finem os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e é, de prefe-rência, fixado àquelas partes dos mesmos as quais estão envolvidas emuma interação com outras partes dos ácidos nucleicos. De preferência, tal D-nucleotídeo é fixado à extremidade de cada região ou a cada ácido nucleicode acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, tais D-nucleotídeos podem atuar como um espaçador ou um ligante o qual, de pre-ferência, liga modificações, tais como PEG e HES, aos ácidos nucleicos deacordo com a presente invenção.
Dentro do escopo da presente invenção, em umá modalidade,os ácidos nucleicos de acordo com a invenção também incluem aqueles áci-dos os quais são parte de um ácido nucleico mais longo, em que esses áci-dos nucleicos mais longos podem incluir várias partes, pelo menos uma par-te sendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou uma par-te do mesmo. A outra parte ou as outras partes desses ácidos nucleicosmais longos pode ser um ácido D-nucleico ou um ácido L-nucleico. Qualquercombinação pode ser usada em conjunto com a presente invenção e para asfinalidades e usos tal como foi descrito aqui para os ácidos nucleicos de a-cordo com a invenção. Essa outra parte ou essas outras partes do ácido nu-cleico mais longo podem ter uma função que é diferente da função de liga-ção e, em particular, da ligação à proteína HMGA. Uma possível função épermitir uma interação com outras moléculas, por exemplo, para fins de imo-bilização, reticulação, detecção, amplificação, modificação ou aumento dopeso molecular.
Em particular, a esse respeito, ácidos L-nucleicos, conforme u-sado aqui, são ácidos nucleicos os quais consistem de L-nucleotídeos e, depreferência, consistem completamente de L-nucleotídeos.
Conseqüentemente, em particular, ácidos D-nucleicos, conformeusado aqui, são ácidos nucleicos os quais consistem de D-nucleotídeos e,de preferência, consistem completamente de D-.nucleotídeos.
A despeito se o ácido nucleico de acordo com a invenção con-siste em D-nucleotídeos, L-nucleotídeos ou uma combinação dos dois, acombinação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma se-qüência definida de regiões as quais consistem de pelo menos um L-nucleotídeo e pelo menos um ácidos D-nucleicos, o ácido nucleico podeconsistir de um ou mais deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combina-ções dos mesmos.
Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma com-posição farmacêutica a qual consiste em pelo menos um dos ácidos nuclei-cos de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais deoutros ácidos nucleicos, na qual o(s) outro(s) ácido(s) nucleico(s), de prefe-rência, se liga(m) à outras moléculas alvo que não proteína HMGA ou exer-ce(m) uma função diferente daquela dos ácidos nucleicos de acordo com ainvenção.
A construção dos ácidos nucleicos de acordo com a invençãocomo ácidos L-nucleicos é vantajosa por várias razões. Ácidos L-nucleicossão enantiômeros de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente. Ácidos L-nucleicos, contudo, não são muito estáveis em soluções aquosas e, em par-ticular, em sistemas biológicos e em amostras biológicas, levando-se emconta a presença extensiva de nucleases. Nucleases que ocorrem natural-mente, em particular nucleases de células animais, não são capazes dequebrar ácidos L-nucleicos. Como um resultado disso, a meia-vida biológicado ácido L-nucleico em tal sistema, incluído o corpo humano e de um animal,é significativamente aumentada. Levando-se em contra a falta de degradabi-lidade dos ácidos L-nucleicos, nenhum produto da decomposição de nuclea-se é produzido e, assim, nenhum efeito colateral resultante é observado.Esse aspecto, na verdade, demarca os ácidos L-nucleicos de todos os ou-tros compostos que são usados no tratamento de doenças e/ou distúrbios einclui a presença de HMGA ou sem envolvimento causai. Ácidos L-nucleicosque se ligam especificamente a uma molécula alvo através-de um mecanis-mo diferente do emparelhamento de base de Watson-Crick ou aptâmeros osquais consistem, parcial ou completamente, de ácidos L-nucleicos, em parti-cular aquelas partes do aptâmero que estão envolvidas na ligação do aptâ-mero à molécula alvo, são denominados spiegelmers.
Também está dentro do escopo da presente invenção que osácidos nucleicos de acordo com a presente invenção estejam na forma deácidos nucleicos fita simples ou fita dupla, a despeito de se eles estão pre-sentes como ácidos D-nucleicos, ácidos L-nucleicos ou ácidos D,L-nucleicose se eles são DNA ou RNA. Tipicamente, os ácidos nucleicos de acordo coma invenção são ácidos nucleicos fita simples os quais, levando-se em contaa seqüência primária, contêm estruturas secundárias definidas e podem,portanto, também formar estruturas terciárias. Os ácidos nucleicos de acordocom a invenção podem, contudo, também ser fita dupla, no sentido de queduas fitas as quais são complementares ou parcialmente complementaresuma à outra são hibridizadas uma com a outra. Isso tem um impacto sobre aestabilidade dos ácidos nucleicos, o que se torna particularmente importantese o ácido nucleico existe na forma D que ocorre naturalmente ao invés dena forma L.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser modi-ficados. Tais modificações podem envolver nucleotídeos individuais do ácidonucleico e são bem conhecidas na técnica. Exemplos de tal modificação sãodescritos, inter alia, em Venkatesan N. e colaboradores, (2003) Curr MedChem. Oct;10(19):1973-91; Kussen W.(2000) J Biotechnol, 74: 27-38; Aurup,H. e colaboradores, (1994) Nucleic Acid Res, 22, 20-4; Cummins, L.L. e co-laboradores, (1995) Nucleic Acid Res, 23, 2019-24; Eaton, B.E. e colabora-dores, (1995) Chem Biol, 2, 633-8; Green, L.S. e colaboradores,, (1995)Chem Biol, 2, 683-95; Kawasaki, A.M. e colaboradores,, (1993) J Med Chem,36, 831-41; Lesnik, E.A. e colaboradores,, (1993) Biochemistry, 32, 7832-8;Miller, L.E. e colaboradores,, (1993) J Physiol, 469, 213-43. Tal modificaçãopode, por exemplo, ser um átomo de H, um átomo de F ou um grupo O-CH3ou grupo NH2 na posição 2' de um nucleotídeo individual que está contido noácido nucleico. Além disso, o ácido nucleico de acordo com a presente in-venção pode incluir pelo menos um nucleotídeo de LNA. Em uma modalida-de, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em nucleo-tídeos de LNA e, de preferência, completamente de nucleotídeos de LNA.
Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de acordo com a pre-sente invenção podem ser um ácido nucleico com múltiplas partes. Um ácidonucleico com múltiplas partes, conforme usado aqui, é um ácido nucleicoque consiste em pelo menos duas fitas de ácido nucleico. Essas pelo menosduas fitas de ácido nucleico formam uma unidade funcional sendo um ligantepara uma molécula alvo. As pelo menos duas fitas de ácido nucleico podemser derivadas de um dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção atravésde clivagem do ácido nucleico de forma a produzir duas fitas ou através desíntese a partir de um ácido nucleico correspondendo a uma primeira partedo ácido nucleico total, isto é, ácido nucleico de acordo com a invenção e umoutro ácido nucleico correspondendo à segunda parte do ácido nucleico to-tal. É reconhecido que clivagem, bem como síntese, podem ser usadas deforma a produzir um ácido nucleico com múltiplas partes, onde mais das du-as fitas descritas acima, à guisa de exemplo, podem estar presentes. Emoutras palavras, as pelo menos duas fitas de ácido nucleico são, de prefe-rência, diferentes das duas fitas que são complementares uma à outra e sehibridizam uma com a outra, embora uma complementaridade possa existir,até determinado ponto, entre as várias partes de ácido nucleico.
Os presentes inventores estabeleceram que os ácidos nucleicosde acordo com a presente invenção têm uma faixa de valor de KD ou faixade valor de dissociação muito vantajosa e, portanto, uma constante de liga-ção muito vantajosa. Uma forma de determinação da constante de ligação éusar um ensaio de ligação em equilíbrio, conforme é descrito no Exemplo 1.
O valor de Kd dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção é,de preferência, menos de 1 uJvl. Um valor de Kd de cerca de 1 (iM seria ca-racterístico de uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo.Conforme será reconhecido por aqueles habilitados na técnica, o valor de Kode um grupo de compostos tal como, por exemplo, os ácidos nucleicos deacordo com a presente invenção, varia dentro de uma determinada faixa. AKd de cerca de 1 u,M mencionada acima é um valor de limite máximo preferi-do para o valor de Kd. O valor de limite mínimo preferido para a Kd dos áci-dos nucleicos que ligam à molécula alvo pode ser cerca de picomolar oumenos. Está dentro do escopo da presente invenção que os valores de KDdos ácidos nucleicos individuais os quais se ligam à HMGA, de preferência,repousem dentro dessa faixa. Faixas preferidas podem ser selecionadasatravés de escolha de um primeiro número dentro dessa faixa e um segundonúmero dentro dessa faixa. Valores máximos preferidos são 0,25 |iM, 0,1 |iMe valores mínimos preferidos são 100 nM, 10 nM, 1 nM e 0,05 nM.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção se ligam, de pre-ferência, à HMGAIb, a 379C em solução com uma constante de dissociaçãoKD<20 nM, conforme ilustrado no Exemplo 2.
Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podemser de comprimento arbitrário, contanto que eles ainda sejam capazes de seligar à molécula alvo. É reconhecido na técnica anterior que comprimentosespecíficos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção sãopreferidos. Tipicamente, o comprimento está entre 15 e 120 nucleotídeos. Étambém reconhecido por aqueles habilitados na técnica que qualquer núme-ro inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível preferido para os ácidosnucleicos de acordo com a presente invenção. Faixas preferidas para ocomprimentos dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção são compri-mentos de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos,cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 20 a 50 nucleotídeos e cerca de 30a 50 nucleotídeos.
Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de acordo com a in-venção estão presentes na forma modificada. Uma forma particularmentepreferida de modificação é PEGuilação. Nessa, a modificação dos ácidosnucleicos de acordo com a invenção envolve acoplamento com polietilenoglicol (PEG) ou outros grupos.Levando-se em conta a alta estabilidade dos ácidos nucleicos deacordo com a invenção, em particular na modalidade na qual esses existemcomo ácidos L-nucleicos, é possível administrar os ácidos nucleicos de a-cordo com a invenção diretamente a um paciente requerendo tal tratamento.De preferência, os ácidos nucleicos de acordo çom a invenção são prepara-dos como uma solução fisiológica para aplicação tópica ou sistêmica..
A despeito do uso direto dos ácido nucleicos de acordo com ainvenção para o tratamento, prevenção e diagnóstico das doenças descritasaqui, esses podem estar presentes ou ser usados individualmente ou emcombinação com outros em uma composição farmacêutica. A composiçãofarmacêutica de acordo com a presente invenção, conseqüentemente, com-preende pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente in-venção e, de preferência, um aglutinante farmaceuticamente aceitável. Tal'aglutinante pode ser qualquer aglutinante conhecido ou um conhecido nocampo. Em particular, tal aglutinante é qualquer aglutinante, conforme édescrito com relação à produção do medicamento, conforme divulgado aqui.Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica inclui um outro agen-te farmaceuticamente ativo. Está dentro do escopo da presente invençãoque o medicamento descrito aqui constitua a composição farmacêutica, con-forme é descrito aqui.
De preferência, a composição farmacêutica se destina à admi-nistração intravenosa. Contudo, também está dentro do escopo da presenteinvenção que tais composições farmacêuticas sejam administradas intra-muscular, intraperitoneal ou subcutaneamente. Outras vias de administraçãosão oral ou intranàsalmente, nas quais, com relação àquelas formas de ad-ministração, são preferidas por serem menos invasivas mas, ao mesmotempo, retêm a eficácia da composição farmacêutica e do agente farmaceu-ticamente ativo.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção estão, de prefe-rência, contidos como tal ou, com relação à composição farmacêutica deacordo com a invenção, dissolvidos em um solvente farmaceuticamente a-ceitável. Tais solventes são, em particular, aqueles que são selecionados dogrupo compreendendo água, solução salina fisiológica, PBS ou uma soluçãode glicose, em particular uma solução de glicose a 5%; Tal veículo pode ser,por exemplo, água, tampão, PBS, solução de glicose, de preferência umasolução de glicose a 5% (iso-osmótica), amido, açúcares, gelatina ou qual-quer outra substância veículo aceitável. Tais veículos são, em geral, conhe-cidos por aqueles habilitados na técnica nesse campo.
Está dentro do escopo da presente invenção que a composiçãofarmacêutica contenha pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo coma invenção em suas várias modalidades incluindo,/mas não restrito a, o áci-do nucleico como conjugado, conforme descrito aqui.
Em uma outra modalidade, o medicamento compreende um ou-tro agente farmaceuticamente ativo. Tais outros agentes farmaceuticamenteativos são, por exemplo, inibidores de protease, inibidores de proliferação einibidores de angiogênese e/ou agentes que têm um efeito citostático. Alter-nativa ou além disso, esse outro agente farmaceuticamente ativo é um outroácido nucleico de acordo com a presente invenção, alternativamente, o me-dicamento compreende pelo menos um ou mais ácidos nucleicos que seligam a uma molécula alvo que é diferente de HMGA ou têm uma função queé diferente daquela dos ácidos nucleicos de acordo com a presente inven-ção.
A composição farmacêutica de acordo com a presente invençãopode ser usada para o tratamento, diagnóstico e/ou a prevenção de cadauma das doenças ou distúrbios descritos aqui.
Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um méto-do para o tratamento de um organismo vivo requerendo tal tratamento, emque o método inclui a administração de uma quantidade farmaceuticamenteativa de pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente in-venção. Em uma modalidade, o organismo vivo sofre de uma doença ou es-tá em risco de sofrer tal doença, a doença sendo uma daquelas menciona-das aqui, em particular uma doença que é descrita com relação ao uso dosácidos nucleicos de acordo com a presente invenção para a produção de ummedicamento.Embora o uso dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção jádecorra do envolvimento ilustrado acima das proteínas HMGA em várias do-enças e estados, esse aspecto será discutido ainda aqui depois para finsilustrativos.
Proteínas HMGA e seus genes se tornaram, em particular, cres-centemente envolvidos no diagnóstico e prognóstico de doenças neoplásicase foram propostos como biomarcadores potenciais. Em tecido saudável, pnível de expressão de proteínas HMGA1a/b é muito baixo, se detectável emgeral. Expressão elevada de proteína HMGAIa/b é característica do fenotipode um grande número de tumores e metástases de muitos tipos de cânceres(Sarhadi e colaboradores, 2006, Balcercak e colaboradores, 2005, Briese ecolaboradores, 2006, Chang e colaboradores, 2005, Peters e colaboradores,2005, Sato e colaboradores, 2005, Chiappetta e colaboradores,2004, Li ecolaboradores, 2004, Chuma e colaboradores, 2004, Donato e colaborado-res, 2004, Czyz e colaboradores, 2004, Kettunen e colaboradores, 2004, Leee colaboradores, 2004, Chen e colaboradores, 2004, Abe e colaboradores,2003, Blacerczak e colaboradores, 2003, Flohr e colaboradores, 2003, Mas-ciullo e colaboradores, 2003, Nam e colaboradores, 2003, Pierantoni e cola-boradores, 2003). Alta expressão de proteína HMGA se correlaciona signifi-cativamente com um pobre prognóstico e a formação de metástases. A de-tecção do nível de expressão de HMGA1a/b em biópsias e sua caracteriza-ção histológica é uma abordagem diagnostica para a detecção precoce,prognóstico e identificação de doenças neoplásicas, em particular as doen-ças e condições discutidas aqui antes.
Além disso, uma associação entre proteínas HMGA1 e placasarterioscléroticas é descrita na literatura (Schlueter e colaboradores, 2005.).HMGA1 regula CD44, um dos principais genes alvo para a formação de pla-cas. A esse respeito descobriu-se, comparado com o tecido subjacente, queas regiões afetadas, tais como neo-íntima, células do músculo liso vascular,macrófagos e novos vasos sangüíneos, têm uma alta expressão de HMGA1.HMGA1 parece, portanto, ser um dos mediadores na formação de placa e,assim, é uma molécula alvo para fins diagnósticos.Os ácidos L-nucleicos descritos aqui e, em particular, os spie-gelmers os quais se ligam à HMGA1a/b podem, dentro do escopo de méto-dos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, ser usados de uma formasimilar a anticorpos. Até agora, apenas anticorpos muito pouco específicos(diferenciação) e afins contra HMGA1 foram identificados e são comercial-mente obteníveis. Isso parece ser em virtude da estrutura secundária não-existente da HMGA1, a qual não é um alvo adequado para o complexo deMHC na geração de anticorpos.
Contra essa base, contudo, descobriu-se, surpreendentemente,que o spiegelmers de HMGA1a/b-ligação biotinilado 5'-bio-NOX-A50 reco-nhece, no procedimento de Western blot, HMGA1a/b como bandas individu-ais em linhagens de células cancerígenas. Além disso, conforme descrito noExemplo 2, proteína HMGA1a/b recombinantemente expressa pôde ser de-tectada. A detecção do spiegelmer biotinilado é realizada, por exemplo, atra-vés de um anticorpo anti-biotina conjugado por meio de peroxidase de armo-rácia (HRP).
O diagnóstico in vivo de HMGA1a/b é uma outra abordagem naqual os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser usado. Tu-mores e metástases são, freqüentemente, incrustados em células tumoríge-nas necróticas as quais liberam HMGA1a/b no tecido subjacente. A detecçãoda HMGA1a/b extracelular é uma abordagem ao diagnóstico de tumores emetástases incrustados em tecido saudável.
Conforme usado aqui de preferência, uma ferramenta diagnosti-ca ou agente diagnóstico ou meio diagnóstico é capaz de detectar, direta ouindiretamente, uma proteína HMGA, de preferência HMGA1a/b conformedescrito aqui, com relação à vários distúrbios e doenças. A ferramenta diag-nostica é adequada para detecção e/ou pesquisa por qualquer uma das do-enças e condições descritas aqui. Tal detecção é possível através da ligaçãodos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção à HMGA1a/b. Talligação pode ser detectada direta ou indiretamente. Os métodos e meioscorrespondentes são conhecidos por aqueles habilitados na técnica nessecampo. Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem,inter alia, ser rotulados, o que permite a detecção dos ácidos nucleicos deacordo com a presente invenção, de preierência o ácido nucleico que estáligado ou pode se ligar à proteína HMGA e, de preferência, HMGA1a/b. Talrotulação é, de preferência, selecionada do grupo compreendendo rotulaçãoradioativa, enzimática e fluorescente. Em princípio, todos os testes conheci-dos que foram desenvolvidos para anticorpos podem ser adaptados aos áci-dos nucleicos de acordo com a presente invenção, o anticorpo de ligação àmolécula alvo sendo substituído por um ácido nucleico de ligação à moléculaalvo. Em testes com anticorpo os quais empregam anticorpos de ligação àmolécula alvo não rotulados, a detecção é, de preferência, realizada com umanticorpo secundário, o.qual foi modificado com rótulos radioativos, enzimá-ticos ou fluorescentes e se ligam ao anticorpo de ligação à molécula alvocomo seu fragmento Fc. No caso de um ácido nucleico, de preferência umácido nucleico de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico é modi-ficado com tal rótulo, o referido rótulo de preferência sendo selecionado dogrupo consistindo de biotina, CY-3 e CY-5 e tal rótulo é detectado por umanticorpo dirigido contra tal rótulo, por exemplo, um anticorpo anti-biotina,um anticorpo anti-CY-3 ou um anticorpo anti-CY-5 ou, no caso onde o rótuloé biotina, o rótulo é detectado através de estreptavidina ou avidina, as quaisse ligam naturalmente à biotina. Tal anticorpo, isto é, estreptavidina ou avidi-na é, por sua vez, de preferência, modificado com um rótulo correspondente,por exemplo, um rótulo radioativo, enzimático ou fluorescente, similarmentea um anticorpo secundário.
Em uma outra modalidade, os ácidos nucleicos de acordo com apresente invenção são detectados ou analisados por um segundo agente dedetecção, esse agente de detecção sendo um sinalizador molecular. A técni-ca de sinalizadores moleculares é conhecida por aqueles habilitados na téc-nica nesse campo. Em resumo, esses sinalizadores moleculares são sondasde ácido nucleico as quais são um complemento reverso da sonda de ácidonucleico a ser detectada e, conseqüentemente, se hibridizam com uma parteda sonda de ácido nucleicp a ser detectada. Após a ligação da sonda de á-cido nucleico, os grupos de fluoroforo do sinalizador molecular são separa-dos uns dos outros, o que leva a uma alteração no sinal de fluorescência, depreferência uma alteração na intensidade. Essa alteração se correlacionacom a quantidade da sonda de ácido nucleico que está presente.
Está dentro do escopo da presente invenção que os ácidos nu-cleicos de acordo com a invenção podem ser apropriadamente usados comoácidos L-nucleicos dentro do escopo dos vários aspectos divulgados aqui.
Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem, alémdisso, ser usados como material de iniciação para o design de substânciasfarmacêuticas ativas (design de fármaco). Em princípio, existem duas possí-veis abordagens para esse problema. Uma abordagem consiste em seleçãode bibliotecas de compostos, em que tais bibliotecas de compostos são, depreferência, bibliotecas de compostos de baixo peso molecular (baixas oupequenas moléculas). Tais bibliotecas são conhecidas por aqueles habilita-dos na técnica nesse campo. Em uma modalidade, a seleção é uma seleçãode alto rendimento. De preferência, seleção de alto rendimento é rápida, efi-caz e é realizada como uma avaliação por tentativa e erro de substânciasativas em um ensaio baseado em molécula alvo.
Alternativamente, de acordo com a presente invenção, os ácidosnucleicos podem ser usados para um design proporcional de substânciasativas. De preferência, um design proporcional de substâncias ativas é o de-sign de um candidato à substância farmacêutica ativa. Começando a partirda estrutura tridimensional da molécula alvo, a qual normalmente é determi-nada por meio de métodos tais como análise de estrutura por raio X ou es-pectroscopia por ressonância magnética (NMR), programas de computadorsão usados para pesquisar através de bancos de dados contendo estruturasde um grande número de diferentes compostos químicos. A seleção é reali-zada através de computador. Os compostos selecionados são, além disso,testados no laboratório.
Um design proporcional de substâncias ativas pode ocorrer co-mo seu ponto de partida de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordocom a presente invenção e compreende uma estrutura, em particular umaestrutura tridimensional, a qual é similar à estrutura do(s) ácido(s) nucleico(s)de acordo com a invenção ou é idêntica àquela parte da estrutura do(s) áci-do(s) nucleico(s) de acordo com a invenção que media a ligação à proteínasHMG. Em qualquer caso, tal estrutura também exibe o mesmo pu pelo me-nos um comportamento de ligação similar ao(s) ácido(s) nucleico(s) de acor-do com a invenção. Em uma outra etapa ou corpo uma etapa alternativa, emum design proporcional de substâncias ativas, a estrutura de preferênciatridimensional daquelas partes dos ácidos nucleicos que se ligam à proteínaHMG é imitada por grupos químicos os quais são, de preferência, diferentesde nucleotídeos e ácidos nucleicos. Por meio dessa imitação, também de-nominada mímica, um composto pode ser construído o qual é diferente doácido nucleico ou dos ácidos nucleicos os quais foram usados como materi-ais de iniciação para um design proporcional da substância ativa. Tal com-posto ou substância ativa é, de preferência, uma pequena molécula ou umpeptídeo.
No caso de bibliotecas de seleção de compostos usando testescompetitivos os quais são conhecidos por aqueles habilitados na técnicanesse campo, análogos de HMG, agonistas de HMG e antagonistas de HMGadequados podem ser encontrados. Tais ensaios competitivos podem serplanejados como segue. O ácido nucleico de acordo com a invenção, de pre-ferência um spiegelmer, isto é, ligação de um ácido L-nucleico à moléculaalvo, é acoplado, de preferência, a uma fase sólida. De forma a identificaranálogos de HMG, uma proteína HMG rotulada é adicionada ao sistema deteste. Alternativamente, a proteína HMG também poderia ser acoplada auma fase sólida e o ácido nucleico de acordo com a invenção poderia serrotulado. Um análogo potencial ou um agonista ou antagonista potencialcompetiria com as moléculas de HMG as quais se ligam ao spiegelmer, oque resultaria em uma diminuição no sinal recebido do rótulo corresponden-te. A seleção por agonistas ou antagonistas pode incluir o uso de um siste-ma de cultura de células o qual é conhecido por aqueles habilitados na téc-nica no campo.
Em um outro aspecto, os ácidos nucleicos de acordo com a in-venção podem, levando-se em conta seu comportamento de ligação caracte-rístico à proteína HMG, ser usados para validação de alvo (molécula alvo).Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser usados em ummodelo de órgão ex vivo de forma a estudar a função da proteína HMG. Emprincípio, existem modelos ex vivo nos quais ágonistas/antagonistas deHMG podem ser testados.
Um kit de acordo com a presente invenção pode compreenderpelo menos um ou mais dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção.Além disso, o kit pode incluir pelo menos um ou mais controles positivos ounegativos. Proteína HMG contra a qual o ácido nucleico de acordo com ainvenção foi selecionado ou ao qual esse se liga, dè preferência na formalíquida, pode ser usada como controle positivo. Como controle negativo, po-de ser usado, inter alia, um peptídeo que se comporta, com relação às suaspropriedades biofísicas, similarmente à proteína HMF, mas o qual não é re-conhecido pelos ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou um peptídeopode ser usado tendo a mesma composição de aminoácido, mas uma se-qüência diferente da proteína HMG.
Além disso, o kit pode incluir um ou mais tampões. Os váriosconstituintes podem estar presentes no kit na forma seca ou liofilizada oudissolvidos em um líquido. O kit pode incluir um ou mais recipientes osquais, por sua vez, podem conter um ou mais dos constituintes do kit. Depreferência, os vasos contêm lotes de reações, tal como é necessário parauma única execução de um experimento usando um ou mais constituintes do kit.
Será reconhecido que, a menos que estabelecido o contrário, asseqüências listadas aqui são fornecidas na direção 5'-3'. Além disso, seráobservado que o termo "as duas seções se hibridizam uma com a outra" écompreendido como significando que as seções podem se hibridizar in vitrocom base em normas gerais de emparelhamento ou que as seções se hibri-dizam ou podem se hibridizar sob as condições de uso, mas não são neces-sariamente hibridizadas- uma com a outra ou estão presentes na forma hibri-dizada sob as condições de uso.
As várias SEQ. ID, a estrutura química dos ácidos nucleicos con-forme divulgado aqui e a molécula alvo HMGA1a/1b conforme usado aqui,as seqüências reais e as referências internas são resumidas na tabela a se-guir.<table>table see original document page 83/table>Continuação
<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>Continuação
<table>table see original document page 86</column></row><table>Está dentro do escopo da presente invenção que, se nenhumaseqüência é explicitamente fornecida para as seções individuais dos ácidosnucleicos de acordo com a invenção, essas podem ser livremente escolhidasde acordo com o ensinamento técnico divulgado aqui, isto é, podem ser es-colhidas de modo que eles exibam o comportamento de ligação necessário àrespectiva molécula alvo e/ou sejam capazes de formas as estruturas, emparticular estruturas secundárias, descritas aqui.
Além disso, está dentro do escopo de modalidades preferidas dapresente invenção que, no caso onde, em seqüências que são identificadascomo seqüências de RNA, T é fornecido ao invés de U, então, T denotará U.
A presente invenção é descrita em maiores detalhes aqui depoiscom o auxílio das Figuras e Exemplos a seguir, os quais divulgam caracte-rísticas, modalidades e vantagens adicionais. A esse respeito: •
A figura 1A mostra aptâmeros gerados através de seleção in vi-tro contra AS-HMGA1a/b d-21, a qual se liga ao domínio da 21AS-HMGA1a/b;
A figura 1B é uma representação das regiões de seqüência queocorrem repetidamente identificadas dos aptâmeros gerados através de se-leção in vitro contra AS-HMGA1a/b d-21, a qual se liga ao domínio da 21AS-HMGA1a/b;
A figura 2 é uma comparação de seqüência de HMGA1a/b eHMGA2;
A figura 3 é um encurtamento do aptâmero de HMGA1a/b-ligação NOX-f;
A figura 4 mostra as propriedades de ligação do aptâmero deHMGA1a/b-ligação encurtado NOX-f;
A figura 5 mostra um ensaio de competição para medição daligação de HMGA ao DNA alvo fita dupla natural no ensaio em lâminas commulti-cavidades; a ligação do spiegelmer compete com a ligação da HM-GA1b recombinante ao dsDNA biotinilado (motivo em gancho AT). A detec-ção da HMGAIb ligada é realizada através de His-Tag via níquel-HRP, aqual converte um substrato em um sinal de fluorescência;A figura 6 mostra uma comparação do spiegelmer NOX-A e spi-egelmer NOX-f (48 nt; 33 nt) no ensaio em lâmina com multi-cavidades com-petitivo; no ensaio em lâmina, o spiegelmer NOX-A, bem como spiegelmerNOX-f e sua variante encurtada spiegelmer NOX-f33, impedem a ligação deHMGAIb recombinante a seu parceiro de ligação que ocorre naturalmentena baixa faixa nanomolar.
A figura 7 mostra a atividade do spiegelmer de 2kDa-PEG-acoplado NOX-A, bem como spiegelmer de controle não funcional no ensaioem lâmina com multi-cavidades competitivo; o spiegelmer PEGuilado NOX-Acompete com a ligação de HMGAIb recombinante ao motivo de gancho ATdo dsDNA com uma IC50 de 15 nM; o spiegelmer de controle inverso deNOX-A mostra, em altas concentrações de spiegelmer, uma interação nãoespecífica com HMGAIb;
A figura 8 mostra uma western blot; detecção de HMGAIb imobi-lizada pelo spiegelmer biotinilado; HMGAIb recombinante migra no campoeletroforético semelhante a uma grande proteína de 20kDa e pode ser reco-nhecida em baixa concentração (3 nM) pelo spiegelmers biotinilado (aquicom o exemplo de NOX-A); um spiegelmer de controle inverso não pôdereconhecer a HGMGAIb;
A figura 9 mostra a atividade do spiegelmer livre e PEGuiladoNOX-A no ensaio em lâmina com multi-cavidades competitivo;
A figura 10 é uma investigação do acondicionamento do spie-gelmer PEGuilado em micelas no "ensaio de exclusão RiboGreen";
A figura 11 mostra a estabilidade de micelas de spiegelmer emPEI no "ensaio de exclusão RiboGreen";
A figura 12 mostra a captação eficaz de spiegelmer acondicio-nado em micelas de PEI, em particular uma comparação da transfecção despiegelmer "nu" comparado com spiegelmers acondicionados em micelas,com o exemplo do spiegelmer NOX-A-3'PEG2kDa; as células as quais foramtransfectadas com micelas de spiegelmer exibiram, em um menor ajuste desensibilidade da câmera (ganho de câmera), uma fluorescência mais forte nocitosol comparado com células que tinham sido incubadas apenas com spie-gelmer puro; a eficácia com métodos de transfecção é > 95%;
A figura 13 mostra a liberação de spiegelmer do compartimentoendossômico; micelas de spiegelmer exibiram uma fluorescência significati-vamente maior comparado ao spiegelmer puro; micelas de spiegelmer exibi-ram um padrão de distribuição semelhante a pontos, perinuclear e tambémcitoplásmica; a distribuição semelhante a pontos indica uma localização emcompartimentos endossômicos; a distribuição difusa no citosol e sobre amembrana plasmática indica spiegelmer liberado de endossomas;
A figura 14 é um ensaio de proliferação com spiegelmer "nu";inibição dose-dependente da proliferação de células MCF-7 em altas con-centrações de spiegelmer após 2 dias no meio de cultura de células (quanti-ficação via resazurina);
A figura 15 mostra a proliferação de células H1299 ("câncer depulmão de células não-pequenas") após tratamento com NOX-A-PEG de2kDa acondicionado em PEI; inibição da proliferação de células H-1299 emspiegelmers a 1 uM, aplicados como micelas de PEI-spiegeímer (N/P de2,5); NOX-A mostrou uma ligeira inibição da proliferação comparado com ospiegelmer de controle;
A figura 16 mostra a inibição de expressão do gene cdc25aHMGA1a/b-induzida, detectada através de RT-PCR quantitativa; determina-ção da inibição específica de expressão de mRNA de cdc25a em células H-1299 por micelas de spiegelmer NOX-A a 1 |im (N/P de 2,5) por meio de RT-PCR;
A figura 17 mostra uma inibição dose-dependente de expressão'de mRNA de cdc25a pelo spiegelmer NOX-A; quantificação da inibição dosedependente de expressão de mRNA de cdc25a em células H1299 por meiode RT-PCR; micelas de spiegelmer NOX-A (N/Pde 2,5) mostraram começar,a 250 nM, uma inibição específica da expressão de mRNA de cdc25a; emuma concentração >4 uM, um efeito não específico do spiegelmer de contro-le foi encontrado, bem como efeitos tóxicos em virtude'de uma polietilenoi-mina (PEI) a > 10 uM (dados não mostrados);
A figura 18 mostra a inibição do crescimento de tumor no modelode xenoenxerto em camundongos nus pelo spiegelmer NOX-A; inibição docrescimento de tumor após injeção subcutânea de células PSN-1 por 2mg/kg de micelas de spiegelmer (N/P de 2,5). Spiegelmer NOX-A produziuuma redução significativa no crescimento de tumor;
A figura 19 mostra a análise estatística dos dados do experimen-to com xenoenxerto; inibição do crescimento de tumor após injeção subcutâ-nea de células PSN-1 por 2 mg/kg de micelas de spiegelmer (N/P de 2,5);análise de end point e representação como plotagem de caixa-e-whisker.NOX-A produziu uma redução altamente significativa do crescimento de tu-mor (p = 0,0098 comparado com PBS e p = 0,022 comparado com spiegel-mer de controle inverso);
A figura 20 mostra a distribuição tecidual do spiegelmer NOX-Ano experimento com xenoenxerto; análise quantitativa de distribuição do spi-egelmer NOX-A no plasma e tecidos; uma alta concentração de spiegelmerNOX-A pôde ser detectada no tecido tumorígeno, comparado com os outrostecidos e plasma;
A figura 21 mostra a distribuição tecidual de spiegelmer acondi-cionado em micelas e spiegelmers não acondicionado, 24 e 9.6 horas após aúltima injeção no experimento com xenoenxerto; análise quantitativa da dis-tribuição de spiegelmers não funcionais no plasma e tecidos; no tecido tumo-rígeno, uma concentração significativamente elevada de spiegelmer pôdeser detectada no caso de um spiegelmer acondicionado em micelas compa-rado com os outros tecidos e plasma, após 24 horas e 96 horas;
A figura 22 mostra a distribuição de spiegelmer acondicionadoem micelas e spiegelmer não acondicionado no plasma e no tumor 24 e 96horas após a última injeção no experimento com xenoenxerto; análise quan-titativa da distribuição de um spiegelmer não funcional no plasma e tumor;no tecido tumorígeno, uma concentração significativamente elevada de spie-gelmer pôde ser detectada no caso de um spiegelmer acondicionado emmicelas, comparado com spiegelmer não acondicionado, após 24 horas e 96horas.
Exemplo 1: Spiegelmers de HMGA1a/b-liqação1.1 Seqüências de HMGA1a/b-liqação
Os spiegelmers de RNA de HMGA1a/b-ligação foram geradosatravés de seleção in vitro contra d-21AS-HMGA1a/b e subseqüentes etapasde encurtamento. Os aptâmeros gerados, os quais se ligam ao domínio da21AS-HMGA1a/b, são mostrados na figura 1A.
1.1.1 Classificação e nível de aptâmero
Os diferentes clones (veja figura 1A) foram preparados comoaptâmeros (d-RNA) por meio de síntese padrão com fosforamidita e foramradioativamente rotulados na extremidade 5' através de utilização de quína-se (veja abaixo). Os clones foram, então, analisados com relação à sua afi-nidade e atividade por meio do ensaio de ligação em equilíbrio em duas con-centrações de HMGA1 a/b d-bio-21aa.Rotulação radioativa através de utilização de quínase:
Substância [final]
RNA 5uM
Tampão de reação dianteiro T4 (Invitrogen) 1x
Quínase de polinucleotídeo T4 (Invitrogen) 10 U/10 ulLote de reação
[y-32P]-ATP 1 Ml/10 UlLo,e de reação
A reação correu durante 1 hora a 379C e foi, então, cessada a-través de aquecimento (10 minutos a 65gC). A separação dos nucleotídeosradioativos de oligonucleotídeos rotulados foi realizada através de eletrofo-rese em gel de poliacrilamida analítica (PAGE) (veja aqui depois). Uma elui-ção de gel por "compressão-e-esmagamento" foi, então, realizada com ace-tato de amônio e precipitação com etanol (veja aqui depois). A quantidadede RNA purificado foi estimado a partir da radioatividade das pelotas (após aprecipitação) comparado com a radioatividade da tira cortada.
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
Para a purificação preparativa de oligonucleotídeos, Vz a 2 volu-mes de tampão de amostra concentrado para PAGE de desnaturação foramadicionados aos lotes de reação. Além disso, padrões em larga escala forampreparados conforme necessário (cada 250 pmoles) e captados em tampãode amostra. Os lotes foram desnaturados durante 5 minutos a 952C e esfria-dos sobre gelo. Um gel de PAA a 7% ou 10% preparativo de desnaturação(200 x 200 x 1,5 mm) foi pré-aquecido (aproximadamente 1 hora) através deaplicação de uma tensão máxima de 600 V a 40-50 W. Após enxágüe doscopos com 1x TBE, as amostras foram plotadas. Após término da separação(50 minutos a 50 W), o gel foi colocado sobre uma lâmina de cromatografiaem camada fina fluorescente protegida por um filme transparente (corante6OF254). As bandas foram visualizadas como sombras ("sombreamento porUV") por meio de luz UV (254 nm) e foram cortadas com um bisturi. Umaeluição de gel por "compressão-e-embebimento" com acetato de amônio foi,então, realizada.
Eluição em gel por "Compressão-e-embebimento"
Para eluir oligonucleotídeos de géis de PAA, após divisão dastiras de gel PAA cortadas, 500 pi de acetato de amônio (2 M) foram adicio-nados usando a ponta de uma pipeta ou uma espátula. A eluição por "com-pressão-e-embebimènto" foi realizada 2 x 1,5 horas a 682C em um termo-agitador (1000 rpm). Os sobrenadantes foram liberados dos resíduos de gelatravés de pequenas colunas "Ultrafree-MC" (Millipore/Amicon, Schwalbach,Alemanha) em uma centrífuga para bancada (16.100 x g). O RNA eluídodessa forma foi, então, dessalinizado através de precipitação com etanol.
Precipitação com Etanol
Para a precipitação com etanol, 1-2 ul de glicogênio foram usa-dos como auxiliar de precipitação. Após a adição de 2,5 volumes de etanolabsoluto e turbilhonamento, os oligonucleotídeos foram precipitados durante30 minutos a -809C e centrifugados durante 30 minutos a 16.100 g, 4eC. Apelota foi lavada uma vez com etanol a 70% e centrifugada durante 5 minu-tos a 16.100 g, 4SC.
Registro de isotermas de ligação no ensaio de ligação em equilíbrio2 pmoles de cada um dos aptâmeros 5' radioativamente rotula-dos foram transformados em complexo em biotinila-D-HMGA1a/b-21mer(EPSEVPTPKRPRGRPKGSKNK [Seq. ID. 17]; veja figura 2), produzida pelaBachem (Weil am Rhein, Alemanha). Soluções na faixa de concentração de1 - 3000 nM (ou, para a medição de dois pontos, com peptídeo a 300 nM e30 nM ou 100 nM e 10 nM) foram incubadas durante 1 hora a 379C em tam-pão de seleção (Tris/HCI a 10 mM, pH de 7,4, KCI a 5 mM, MgCI2 a 0,8 mM,Tween a 0,1%). Uma solução sem d-HMGA1a/b-21mer biotinilada serviucomo controle de base. O peptídeo e complexos foram, então, imobilizadosdentro de 30 minutos a 379C com 10 uí de gel de estreptavidina UltraLink. Aradioatividade da suspensão foi medida. O sobrenadante foi removido. Amatriz foi, então, lavada uma vez com 100 ul.de tampão de seleção e, então,precipitada com tampão de seleção. Através de medição da radioatividade, afração de aptâmero presente junto com biotinila-d-HMGA1a/b-21mer nocomplexo foi determinada para cada concentração de peptídeo. As constan-tes de dissociação das espécies ativas e a proporção de moléculas ativasforam determinadas através de plotagem gráfica e adaptação (GraFit, Ver-são 4.0.10, Software Erithacus).
Resultados
Para todos os clones sintetizados como aptâmeros (d-RNA),uma constante de dissociação para a ligação ao fragmento D de 21 aminoá-cidos de comprimento da HMGA1a/b (Biotinila-D-HMGA1a/b-21mer) de 8 -22 nM foi determinada no ensaio de ligação em equilíbrio (Fig. 1A).1.1.2 Encurtamento no Exemplo 132-B3
Todos os candidatos à seleção exibiam um motivo de seqüênciaque ocorre repetitivamente GGGCG ou GGGUG ou GGGAG, o qual é esta-bilizado na extremidade 5' e na extremidade 3' por uma Hplice/motivo detronco (Fig. 3).
Uma análise da provável estrutura e precipitação dos aptâmerosde RNA de acordo com Zuker (Nucleic Acids Res. 1 de Julho de 2003;,31(13): 3406-15) mostrou que a estrutura predeterminada de tronco/Hélicetinha aumentado em alguns casos (132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 122-E2, veja figura IA). Essa estrutura de tron-co-Hélice formou a base para o encurtamento adicional desses candidatos.Esse encurtamento adicional dos candidatos foi realizado através de identifi-cação e estabelecimento do motivo de ligação mínimo através de análise porprecipitação, seguido por análise por deleção de D-RNAs sintéticos com re-lação à ligação ao fragmento de HMGA1a/b. Essas propriedades de ligaçãoforam determinadas através do ensaio de ligação em equilíbrio. A figura 3mostra, à guisa de exemplo no candidato NOX-f (132-B3), o encurtamentodo aptâmero com base na estabilização da estrutura de tronco, a qual podeser encontrada na forma aumentada nos candidatos 132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-Ft, 122-G2..122-E2 (veja figura 1A). Umencurtamento para uma variante de NOX-f de aptâmero com 32 nucleotí-deos de comprimento com um tronco de 6 nucleotídeos de comprimento(NOX-f 32 nt) não leva a qualquer perda das propriedades de ligação aofragmento de HMGA1a/b de 21 aa (Figs. 3 e 4). A inserção artificial de umaadenosina na terceira posição do tronco na posição 5' levou a uma formaçãoteórica de um tronco de 7 nucleotídeos de comprimento sem uma região emloop e serviu para completar o tronco na região 3' (NOX-f 33 nt, figuras 3 e4). A medição das propriedades de ligação (afinidade e atividade) por meiodo ensaio de ligação em equilíbrio sobre o domínio de 21 aminoácidos decomprimento da HMGA1a/b não foi influenciada por essas alterações.
As seqüências 132-G2, 122-A1, 122-C1,' 122-B2 e 122-B4 têm,por outro lado, na extremidade 5' e na extremidade 3' do motivo de seqüên-cia que ocorre repetitivamente (GGGCG ou GGGUG ou GGGAG), uma es-trutura de tronco significativamente mais curta. Um encurtamento da estrutu-ra de tronco leva a uma perda de ligação. Um possível encurtamento da re-gião central, a qual é mais longa para essas seqüências, entre o motivo deseqüência repetitivo (GGGCG ou GGGUG ou GGGAG) não foi realizado.
As Seq. IDs das seqüências de aptâmero dos ácidos nucleicosde HMGA-ligação divulgadas aqui são como segue:
<table>table see original document page 94</column></row><table>Continuação
<table>table see original document page 95</column></row><table>
Conforme já foi discutido aqui, é sabido por aqueles habilitadosna técnica nesse campo que o enantiômero, consistindo de L-nucleotídeosde um aptâmero, isto é, de um ácido D-nucleico o qual foi gerado contra umD-peptídeo, se liga ao enantiômero de imagem de espelho do D-peptídeo,isto é, o L-peptídeo que ocorre naturalmente. Esse ácido L-nucleico é aquitambém referido como spiegelmers e, de outro modo, exibe, em princípio, asmesmas propriedades de ligação que o aptâmero.
1.2 Propriedades características de spiegelmers de HMGA/b-liqação
1.2.1 Elementos de seqüência repetitivos: Caixa A1 e Caixa A2
Um elemento de seqüência repetitivo da seqüência GGGCG ouGGGUG ou GGGAG é característica de todos os spiegelmers que se ligam àHMGA1a/b. Esse elemento de seqüência aparece duas vezes em spiegel-mers de HMGA1a/b-ligação (Figs. 1A e 1.B). O elemento de seqüência re-pousando mais próximo da extremidade 5' dos spiegelmers é aqui referidocomo Caixa A1. O elemento de seqüência repousando mais próximo da ex-tremidade 3' dos spiegelmers é, por outro lado, referido aqui como Caixa A2.A Caixa A1 e Caixa A2 e sua disposição mútua provavelmente representama característica decisiva de spiegelmers de HMGA1a/b-ligação.
1.2.2 Seção de seqüência entre a Caixa A1 e a Caixa A2
Entre a Caixa A1 e a Caixa A2, há uma seção de seqüência comum comprimento de seis a sete ácidos nucleicos ou 12 a 22 nucleotídeos(Figs. 1A e 1B). Uma vez que essas seções de seqüência diferem não ape-nas quanto a seu comprimento, eles são discutidas separadamente.
Caso 1:Seção de seqüência compreende seis a sete nucleotídeosSe a seção de seqüência repousando entre a Caixa A1 e a Cai-xa A2 tem um comprimento de seis nucleotídeos, então, a seção de seqüên-cia exibe a seqüência UGGUUG, UGGCUG, CGGUUG, AGGUUG ou GU-GUAA. Uma inserção de um nucleotídeo (uracila) na seqüência CGGUUG, aqual leva à seqüência CGGUUUG, não tem uma influência negativa nempositiva sobre as propriedades de ligação dos spiegelmers.
Caso 2:Seção de seqüência compreende 12 a 22 nucleotídeos
Se a seção de seqüência repousando entre a Caixa A1 e a Cai-xa A2 tem um comprimento de 12 a 22 nucleotídeos, então, essa seção deseqüência compreende duas regiões de seqüência de comprimento igual, asquais podem se hibridizar uma com a outra (Hélice C). A hibridização é, nes-se caso, realizada, em cada caso, em três a seis nucleotídeos. Três a cinconucleotídeos não emparelhados estão localizados entre os nucleotídeos queformam a Hélice C. Um a três nucleotídeos estão presentes não emparelha-dos entre a extremidade 3' da Caixa A1 e a extremidade 5' da Hélice C. Uma cinco nucleotídeos podem estar presentes não emparelhados entre a ex-tremidade 3' da Hélice C e a extremidade 5' da Caixa A2.1.2.3 Estrutura helicoidal nas extremidades 5' e 3' dos spiegelmers
Todos os spiegelmers de HMGA1a/b-ligação são caracterizados,em suas extremidades 5' e 3', por seções de seqüência as quais podem sehibridizar umas com as outras (Hélice A1 e Hélice A2, (Figs. 1A e 1B). Onúmero de nucleotídeos que se hibridizam uns com os outros pode, em cadacaso, variar de quatro a oito. A esse respeito, essa região presumivelmentefita dupla pode se estender para a extremidade 5' dá Caixa A1 e a extremi-dade 3' da Caixa A2. Se esse não for o caso, então, a Caixa A1 e Caixa A2podem ser flanqueadas por nucleotídeos que,.adicionalmente, se hibridizamuns aos outros (Hélice B1 e Hélice B2). Isso pode envolver regiões, em cadacaso, de quatro a oito nucleotídeos (Figs. 1A e 1B).
Dentro do escopo da invenção, formando a base do presentepedido, várias classes de ácidos nucleicos e, em particular, ácidos L-nucleicos os quais se ligam à molécula alvo foram identificadas. A ilustraçãoa seguir e descrição dessas classes, as quais são aqui denominados casosé, até esse ponto, uma parte integral da presente invenção. Para cada clas-se, sua estrutura principal e ácidos L-nucleicos exemplificativos para essaclasse são especificados aqui depois usando as respectivas abreviações dosácidos L-nucleicos.
Caso 1: 132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 132-B3 32nt, 132-B3 33nt
<formula>formula see original document page 97</formula>
ou
Hélice A1-Nx-Hélice B1-N6N7|Caixa AllN^GNeNsf^NslCAIXA A2|Hélice B2-N7-Hélice A2 (Case 1B)
Ni = U, C, A, G;
N2 = G, U;
N3 = U,C;
N4 = U, A;
N5 = G,A;
N6 = G,A, U;
N7 = G, U;
N8 = U ou nenhum nucleotídeo;Nx = zero a cinco nucleotídeos;Ny = zero ou seis nucleotídeos;Nz = zero a seis nucleotídeos;
Caixa A1 = Caixa A2 = GGGCG ou GGGUG ou GGGAG;
Hélice A1 e Hélice A2 = em cada caso, quatro a oito nucleotí-deos, os quais se hibridizam completa ou parcialmente uns com os outros,nos quais a soma, em cada caso, de nucleotídeos de hibridização mútua deHélice A1 e Hélice A2 e Hélice B1 e Hélice B2 é 10 a 12 nucleotídeos;
Hélice B1 e Hélice B2 = em cada caso, quatro a oito nucleotí-deos, os quais se hibridizam uns aos outros, nos quais a soma, em cadacaso, de nucleotídeos de hibridização mútua de Hélice A1 e Hélice A2 e Hé-lice B1 e Hélice B2 é 10 a 12 nucleotídeos.
As moléculas são ativas também após o encurtamento na ex-tremidade 5' e na extremidade 3'. Após a remoção das Hélices A1 e A2, bemcomo das regiões N6N7 e GNy, as moléculas encurtadas retêm suas propri-edades de ligação. Isso foi demonstrado para as variantes encurtadas 132-B3 32 nt (NOX-f 32nt) e 132-B3 33 nt (NOX-f 33nt) (veja figuras 3 e 4).Caso 2A: 132-G2, 122-A1, 122-C1,122-B.2,122-B4
Hélice A1-Na-}Caixa Al|-Nb-,rHélice", Cl]-Nc-[HélÍce~ C2"!-Nd-jCaixa A2|-G-Ne-Hélice A2
Na = um a cinco nucleotídeos
Nb = três nucleotídeos
Nc = três a cinco nucleotídeos
Nd = dois a cinco nucleotídeos
Ne = um a dois nucleotídeos, de preferência A ou UU
Caixa A1 = Caixa A2 = GGGCG ou GGGUG ou GGGAG
Hélice A1 e Hélice A2 = em cada caso, cinco a seis nucleotídeos, os quais
se hibridizam completa ou parcialmente uns com os outros,
Hélice C1_e_Héljce C2j = em cada caso, cinco a seis nucleotídeos, os quais
se hibridizam completa ou parcialmente uns com os outros.Caso 2B:122-E2
Hélice A1-NrHélice B1-NrCaixa A1-AJHélice C1'-NcJHélice C2'-G-Caixa
A2-G-Hélice B2-A-Hélice A2
N| = dois nucleotídeos, de preferência CA
Nj = dois nucleotídeos, de preferência AG
Nc = quatro nucleotídeos, de preferência GAUG
Caixa A1 = Caixa A2 = GGGCG ou GGGUG ou GGGAG
Hélice A1 e Hélice A2 = em cada caso seis nucleotídeos, os quais se hibri-dizam uns aos outros,
Hélice B1 e Hélice B2 = em cada caso cinco nucleotídeos, os quais se hibri-dizam uns aos outros,
Hélice C1_e H_élice C2 = em cada caso três nucleotídeos, os quais se hibri-dizam uns aos outros.
Exemplo 2: Abordagem de Domínio
2.1 Determinação da interação de spieqelmers de HMGA1a/b e HM-GA1b recombinante no ensaio de competição
Execução/Método
Clonagem de HMGAIb His6-rotulada
O clone de ORF GH00552L1.0 da BD-Freedom™ (gancho AT1do grupo com alta mobilidade) com a seqüência de codificação para HM-GAIb foi adquirido da BioCat Heidelberg. A seqüência já tinha sido alteradade modo que o códon terminal fosse convertido em um códon de codificaçãopara leucina, de modo a permitir fusões C-terminais. A seqüência do clonecorresponde, geralmente, à seqüência armazenada no banco de dados Ref-Seq sob No. NM002131. A seqüência de codificação para HMGAIb foi am-plificada por meio de uma PCR padrão com os primers HMG_fwd1 (TCGA-CACCATGGGTGAGTC, Seq. ID 34) e HMG_rev1 (GTCTAGAAAGCTTCC-CAACTG, Seq. ID 35). A esse respeito, a base após ATG foi alterada de Apara G, de modo a introduzir uma interface Ncol. O produto de PCR foi cli-vado de acordo com as instruções do fabricante com as enzimas de restri-ção Ncol e Hindlll (ambas da NEB, Frankfurt am Main, Alemanha) e purifica-do via um gel de agarose. O vetor pH02d (Fasshauer e colaboradores,(1997) J. Biol. Chem. 272: 28036 - 28041)) foi similarmente clivado com Ncole Hindlll e purificado via um gel de agarose. O vetor pH02d permite a ex-pressão de uma proteína fundida à extremidade C-terminal com uma se-qüência de seis resíduos de histidina (His6-tag), sob o controle de um pro-motor 17 (Fasshauer e colaboradores, 1997, JBC 272: 28036).
O produto de PCR purificado e clivado foi ligado no vetor prepa-rado durante a noite a 15 9C com o auxílio de uma ligase T4, corresponden-do às instruções do fabricante (MBI Fermentas, St. Leon-Roth, Alemanha).Bactérias da cepa DH5a foram transformadas com o produto da ligação. Aexatidão dos plasmídeos a partir das colônias obtidas foi verificada atravésde seqüenciamento. A proteína de fusão HMGA1b-His6 codificada pelopH02d/HMGA1b tem, comparado com a proteína HMGAIb natural, umaglicina (G) ao invés de serina (S) na posição 2 e, após a glutamina (Q) C-terminal, urna leucina (L) (veja acima), seguido por cinco outros aminoácidos(G á L N S) (codificados pelo vetor), aos quais as seis histidinas (H) são uni-das.
Expressão e Purificação de HMG1b-His6
Para a expressão da proteína de fusão, bactérias da cepa BL21foram transformadas com o plasmídeo pH02d/HMGA1b. A expressão daproteína de fusão foi induzida com isopropiltio:p-D-galactosídeo (IPTG). A-pós 4 horas, as bactérias foram centrifugadas durante 15 minutos a 10.000 xg e a pelota foi armazenada a -20°C até outro uso.
Para a extração da proteína de fusão, 25 ml de tampão de extra-ção (n-octil-p\D-tioglicopiranosídeo (OTG) a 1% em tampão de NaxP04 a 50mM, pH de 8,0, NaCI a 250 mM, imidazola a 10 mM e tabletes de inibidorMiniProtease (Roche, Mannheim, Alemanha) (5 horas/50 ml)) foram adicio-nados a uma pelota de bactérias congelada a partir de 500 ml de cultura,seguido por 5 ul de benzonase (grau 1; MERCK, Darmstadt, Alemanha),homogeneizada através de pipeteamento e incubados durante 5 min em RT.Isso foi seguido por centrifugação durante 15 min a 10.000 x g (RT). O so-brenadante foi filtrado através de um filtro estriado e, então, adicionado auma coluna HIS-SELECT (HIS-SELECT Cartridge, Sigma, Deisenhoíen, A-lemanha) equilibrada com tampão de lavagem (tampão de NaxP04 a 50 mM,pH de 8,0, NaCI a 250 mM, imidazola a 10 mM, todos da MERCK, Darms-tadt, Alemanha). Após lavagem da coluna com 10 - 15 ml do tampão de la-vagem, a proteína de fusão foi eluída com tampão de eluição (imidazola a250 mM em tampão de lavagem) em frações com tamanho de 0,5 - 1 ml.Frações contendo proteína foram verificadas com relação à pureza por meiode eletroforese em gel (gel de poliacrilamida a 16% de acordo com Schãger& Jagow, 1987, Anal. Biochem. 166: 368-379). Frações com proteína de fu-são foram purificadas, se necessário submetidas à diálise, usando um tam-pão adequado e, após determinação de proteína, foram testadas novamentecom relação à pureza. A proteína de fusão purificada foi armazenada emalíquotas a-20°C.
Determinação da interação de spiegelmers de HMGAla/b e HMGA1b-His6
Um teste baseado em um formato com 96 cavidades foi usadopara uma análise mais detalhada da afinidade de spiegelmers de HM-GA1a/b- por HMGA1 b. Nesse teste, a ligação de spiegelmers de HMGA1a/bà HMGA1b-His6 impede sua interação com um oligonucleotídeo de DNA quetem um sítio de ligação para HMGA1a/b. Esse oligonucleotídeo de DNA(gancho AT de dsDNA) (Fashena e colaboradores, 1992) é rotulado, sobreuma fita, com uma molécula de biotina, via a qual ele pode se ligar à lâminasrevestidas com estreptavidina. A detecção de HMGA1b-His6 ligado ao DNAé realizada com peroxidase de armorácia modificada com níquel (Nickel-HRP), a qual transforma um substrato fluorogênico. Nesse ensaio, o spie-gelmer desloca a HMGAIb recombinante de seu parceiro natural. Levando-se em conta a estequiometria de 1:1:1 de spiegelmer/ rHMGAIb/ gancho ATde dsDNA, uma previsão direta pode ser feita com relação à afinidade dosspiegelmers por HMGAIb. O princípio do ensaio é ilustrado na figura 5.
Para realizar esse teste, spiegelmers em várias concentrações eHMGA1b-His6 (0,36 ug/ml; aproximadamente 30 nM) em um volume total de100 ul são incubados durante 10 minutos em uma lâmina com piso afuniladoem temperatura ambiente enquanto se agita. A solução de incubação tam-bém contém: Tris/HCI a 25 mM, pH de 7,0 (Ambion, Austin, TX, EUA), KCI a140 mM (Ambion, Austin, TX, EUA), NaCI a 12 mM (Ambion, Austin, TX,EUA), MgCI2 a 0,8 mM (Ambion, Austin, TX, EUA), BSA a 0,25 mg/ml (Ro-che, Mannheim, Alemanha), DTT a 1 mM (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha),poli(dGdC) a 18-20 ug/ml (Sigma, Deisenhofen, Alemanha)), Tween 20 a0,05% (Roche, Mannheim, Alemanha). 2 ul de gancho AT de dsDNA de oli-gonucleotídeos de DNA biotinilados (mistura equimolar de 5'biotina-TC G A AAAAAG C A A A A A A A AA AAA A A A AA ACT G G C (34 nt) e 5'GCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTTTT (31 nt); 75 uM em NaCI a 150 mM (Ambion,Austin, TX, EUA)) são, então, adicionados e incubados durante mais 10 minem RT enquanto se agita. Os lotes são, então, transferidos para uma lâminapreta com 96 cavidades revestida com estreptavidina (ReactiBind da Pierce,Bonn, Alemanha)) e incubados durante 30 mins em RT enquanto se agitaligeiramente. Após isso, as cavidades da lâmina são lavadas três vezes, ca-da vez com 200 ul de TBSTCM (Tris/HCI a 20 mM, pH de 7,6 (Ambion, Aus-tin, TX, EUA); NaCI a 137 mM (Ambion, Austin, TX,! EUA), MgCI2 a 1 mM(Ambion, Austin, TX, EUA), CaCI2 a 1 mM (Sigma, Deisenhofen, Alemanha),Tween 20 a 0,05% (Roche, Mannheim, Alemanha)). 50 ul de uma soluçãode níquel-HRP diluída são adicionados a cada cavidade (ExpressDetectornickel-HRP, (Medac, Hamburg, Alemanha) a 1:1000 em BSA a 10 mg/ml(Roche, Mannheim, Alemanha) em TBSTCM) .e incubados durante 1 horaem RT enquanto se agita ligeiramente, as cavidades são, então, lavadas trêsvezes com 200 ul de TBSTCM a cada vez.
100 ul de substrato HRP fluorogênico (QuantaBlue, Pierce,Bonn, Alemanha) são, então, adicionados a cada cavidade e a fluorescênciaé medida após 15 mins (ex: 340/em: 405 nm).
Resultado
Foi mostrado que os spiegelmers NOX-A (50 nt), NOX-f (33 nt) eNOX-f (48 nt) competem, de uma maneira concentração-dependente, com aligação de HMGA1b-His6 ao DNA-Oligonucleotídeo biotinilado (Fig. 6). UmaIC5o de aproximadamente 15 nM é encontrada para o spiegelmer NOX-A.Em contraste ao spiegelmer ativo, um spiegelmer de controle com a seqüên-cia inversa ao NOX-A não mostrou, em uma concentração de até 0,5 uM,efeito sobre a ligação de HMGA1b-His6 ao oligonucleotídeo de DNA e inte-rações não específicas com HMGA1 b-His6 ocorrem apenas em concentra-ções acima de 1 uM (Fig. 7).
2.2 Uso de spiegelmers para detectar HMGA1 b através de Western blotExecução/Métodos
HMGAIb recombinantemente expresso foi separado através deeletroforese em gel sobre um gel de PAA-tricina a 16% e transferido, pormeio de eletroblotting, para membranas de nitrocelulose. A membrana foi,então, bloqueada com leite desnatado a 5% e spiegelmer não específico a100 nM em IxTBST (Tris/HCI a 20 mM, pH de 7,6, NaCI a 137 mM, Tween a0,1%) durante 1 hora e lavada três vezes durante 10 minutos com IxTBST.A detecção da HMGAIb recombinante foi realizada com spiegelmer NOX-Abiotinilado na extremidade 5' (5'bioNOX-A). 5'bioNOX-A foi diluído emIxTBST com cálcio e magnésio a 1 mM cada (TBST+Ca/Mg) e spiegelmernão específico a 100 nM e incubado durante 1,5 horas. A blot foi, então, la-vada três vezes durante 10 minutos com 1x TBST+ Ca/ Mg e o spiegelmerbiotinilado ligado foi incubado com um anticorpo anti-biotina em TBST+Ca/Mg durante 45 minutos. A blot foi, então, lavada cinco vezes durante 10minutos com 1 xTBST+Ca/Mg e o anticorpo secundário acoplado com pero-xidase de armorácia (HRP) foi detectado por meio do reagente de detecçãoLumiGLO (Cell Signaling Technology).
Resultado
A ligação de um spiegelmer biotinilado 5'-terminal à HMGAIbrecombinantemente expressa foi demonstrada por meio do processo antesdescrito. Similarmente a uma detecção baseada em anticorpos, 5 ug deHMGAIb foram detectados com bio-NOX-A a 3 nM após transferência parauma membrana de blot. O spiegelmer inverso de NOX-A não pôde reconhe-cer a HMGAIb, o que confirma a ligação específica de NOX-A (Fig. 8).
Exemplo 3: Formulação de PEI-Spiegelmer
3.1 Princípio de uma transfecção polietilenoimina-mediada de spiegel-mers
A molécula alvo HMGA1a/b é expressa no citosol e encontra,como um fator de transcrição, seu parceiro de ligação natural, o DNA fitadupla no núcleo celular. As respostas celulares HMGA1a/b-mediadas deve-rão ser antagonizadas através de ligação do spiegelmer à HMGA1a/b nocitosol e competição da HMGA1a/b ligada pelos ganchos AT ao DNA no nú-cleo celular. Levando-se em conta a carga negativa da membrana plasmáti-ca, as moléculas de DNA e RNA não são prontamente captadas através detransporte passivo de uma célula. Uma das abordagens ao transporte intra-celular por ácidos nucleicos é a condensação ou acondicionamento com par-tículas ou reagentes carregados, resultando em uma carga do complexoglobal. Desvantagens desse método são a estabilidade do DNA/RNA e aliberação do ácido nucleico do compartimento endossomico. No citosol dacélula, um lisossoma é rapidamente formado a partir do endossoma contraí-do através de introdução de proteases ou nucleases e através de protona-ção do compartimento. Nucleases digerem os ácidos nucleicos e, além dis-so, o ácido nucleico não é estável no meio ácido. O complexo todo é rapi-damente transportado novamente para fora da célula através de exocitose edecomposição no aparelho de Golgi e, portanto, somente uns poucos ácidosnucleicos passam para a célula. Uma das pré-condições para um sistema detransfecção adequado é, assim, a estabilização, bem como a liberação doácido nucleico do endossoma no citosol. Com .relação à estabilidade, spie-gelmers de RNA têm propriedades ideais para uma transfecção de célulaseucariotas uma vez que, sendo enantiômeros não naturais, eles não sãoclivados por enzimas.
O sistema de transfecção é baseado na formação de micelas deácidos nucleicos com polietilenoimina ramificada (PEI). A parte principal defosfato dos ácidos nucleicos interage com as posições de nitrogênio livre daPEI e forma pequenas micelas através de reticulação-ramificação, as quaistêm uma carga positiva levando-se em conta a PEI. A esse respeito, PEIcom um peso molecular de 3 a 800 kDa é usada. Quanto menor a PEI, me-nores são as micelas formadas. O uso de PEI reticulada ramificada de 25kDa (Sigma-AIdrich Cat. No. 40.872-7) leva, quando de adição a ácidos nu-cleicos, à formação de poliplexos com tamanho de 100 nm até 500 nm em-bora, tipicamente, poliplexos com tamanho de 100 a 200 nm. O acondicio-namento do ácido nucleico em micelas resulta em uma alteração no potenci-al zeta do complexo para (±) 21 mV com uma proporção de N/P de 3. Sabe-se que com aumento do potencial zeta positivo de complexos, a toxicidadedas células em cultura se eleva. Essas micelas, contudo, são facilmente cap-tadas como endossomas por uma célula através de constricção da membra-na plasmática. A PEI agora tampona o influxo de prótons, como um resulta-do do que muitos íons de cloreto no interior do endossoma levam a um intu-mescimento do compartimento, levando-se em conta a pressão osmótica.Esse efeito da PEI é descrito na literatura como o efeito de esponja de pró-tons (Sonawane e colaboradores, JBC, 2003, Vol. 278; No. 45(7) páginas44826-44831) e, por fim, leva à ruptura do endossoma e à liberação dos spi-egelmers no citosol.
O complexo de ácido nucleico-PEI tem uma tendência, levando-se em conta uma forte carga positiva, de interação e agregação com proteí-nas do soro e também de exibir a toxicidade celular antes descrita. Assim, foidescrito na literatura que altas doses de micelas de aminoácido-PEI, apósinjeção subcutânea e intravenosa em ratos, podem levar rapidamente a umacúmulo nos pulmões e, assim, a embolismos/enfartes. A solução para esseproblema é derivatizar o ácido nucleico com polietileno glicol (PEG) de 2kDa. Esses resíduos circundam as micelas tal como uma blindagem e impe-dem a ligação à proteínas do soro (Ogris e colaboradores, Gene Therapy,1999, 6 (595-605). Além disso, o potencial zeta é reduzido para +/- 0 mV, oque leva a uma menor toxicidade celular, ao mesmo tempo em que retém acapacidade de tamponamento da PEI com relação ao efeito de esponja deprótons.
3.2 Atividade de Spieaelmer com PEG2000
Os candidatos lead NOX-A e NOX-f foram produzidos sintetica-mente como aptâmero e spiegelmer com um grupo amino 3'-terminal e fo-ram, então, PEGuilados via o radical amino. Foi mostrado, por meio de en-saios de ligação em equilíbrio, que a PEGuilação não tem influência sobreas propriedades de ligação dos aptâmeros ao fragmento de HMGA1a/b. A-lém disso, foi mostrado, por meio de ensaios de competição com HMGA1a/bde comprimento total recombinante, que também a ligação de spiegelmers àHMGA1a/b de comprimento total é independente da PEGuilação 3'-terminal (Fig.9).
3.3 Acondicionamento de Spiegelmer
O acondicionamento de spiegelmer estéril, PEGuilado foi reali-zado em PBS através de adição de polietilenoimina reticulada ramificada de25 kDa (PEI) (ALDRICH, Cat.: 40.872-7) em uma proporção da fração denitrogênio absoluto da PEI para o fosfato absoluto da parte principal de ácidoribonucleico de 2,5:1 (N/P de 2,5). A solução de PEI estéril, submetida à au-toclave tinha uma concentração de nitrogênio de grupos livres de 200 mM efoi ajustada para um pH de 7,4 com ácido clorídrico a 1 M. O spiegelmer fil-trado estéril foi tomado em uma concentração de até 700 uM em 1 x PBScom Ca/Mg e, após adição de PEI filtrada estéril, foi incubado durante 30-60minutos em temperatura ambiente. Idealmente, a formação de complexoocorre com a menor concentração ajustada possível do spiegelmer adicio-nado, uma vez que altas concentrações de spiegelmer levam à agregadosaleatoriamente grandes. A formação de micelas de spiegelmer foi medidapor meio de um ensaio de exclusão de corante. Para isso, foi determinadoquanto spiegelmer pode ser detectado pelo corente antes e após acondicio-namento em micelas. RiboGreen (M. Probes) foi usado como corante e afluorescência foi medida com um leitor ELISA. Spiegelmer a 1 uM foi adicio-nado, em cada caso, a 100 pi de 1 x PBS e quantidades crescentes de PEIforam adicionadas. 100 ul de RiboGreen a 0,2 ug/ul foram colocados emuma lâmina de microtitulação com 96 cavidades adequada para fluorescên-cia e, após incubação do lote de micelas durante 30 minutos em temperaturaambiente, 10 pi foram pipeteados na lâmina de microtitulação. Começando apartir de uma proporção de N/P de 2, mais de 90% dos spiegelmers estavampresentes como micelas (Fig. 10). A esse respeito, a PEI sozinha não teveinfluência sobre a fluorescência do corante.
3.4 Estabilidade de Micelas de Spiegelmer
1 uM de micelas de spiegelmer foi armazenado sob as condi-ções especificadas na figura 11. A estabilidade de micelas de spiegelmer foimedida através do ensaio de exclusão de corante descrito na Seção 3.3. Umestudo de estabilidade das micelas mostrou que o armazenamento de mice-las em diferentes meios, bem como em diferentes temperaturas, não teminfluência sobre as micelas de spiegelmer. A liofilização dos complexos deribozima/PEI sem qualquer perda das propriedades da ribozima também édescrita na literatura (Brus-C e colaboradores, J. Contrai Release, 20 de Fe-vereiro de 2004, 95(1), 199-31).
3.5 Captação de Micelas de Spiegelmer
A captação intracelular de micelas de spiegelmer foi estabeleci-da em um sistema de cultura de células com células HS578T. 1 x 104 célulasHS578T foram deixadas crescer sobre lamínulas de vidro estéreis de 20 mmaté uma confluência de 30-40%. Spiegelmer 5'-rotulado NOX-A-3'-PEG foiacondicionado com uma proporção de N/P de 2,5:1 em micelas, adicionadoem uma concentração de 1 uM às células e incubado durante 16 horas a37°C. Como controle para a captação passiva de spiegelmers, 1 uM de spi-egelmer fluorescência-rotulado puro foi, em cada caso, incubado com ascélulas. As células foram, então, lavadas três vezes com 1 ml de PBS e fixa-das durante 30 minutos com paraformaldeído a 3%. Os preparados foramnovamente lavados três vezes com 1 ml de PBS, incubados durante mais10-20 segundos com uma solução de DAPI (1 ul de estoque para 10 ml de 1x PBS) para corar a cromatina no núcleo celular, lavados mais uma vez ecobertos com uma solução de montagem. Os preparados feitos dessa formaforam analisados em um microscópio de fluorescência (emissão a 488nm/extinção a 514-522 nm).
Foi mostrado que micelas de spiegelmer têm uma maior taxa detransfecção comparado com spiegelmers não acondicionados "nus" (Fig.12).
A eficiência de transfecção foi, a esse respeito, >95% de todasas células e não teve influência sobre a morfologia das células. O spiegelmer5'-FiTC-acoplado foi encontrado principalmente no citosol e associado àmembrana plasmática. A distribuição semelhante a pontos indica uma inclu-são em compartimentos e o padrão difuso aponta para spiegelmer liberado.Apenas um leve sinal de spiegelmer pôde ser detectado no núcleo celular.
3.6 Liberação de Spiegelmer
A distribuição semelhante a pontos do spiegelmer no citosol eespaço perinuclear das células H578T aponta para um acúmulo em compar-timentos celulares, por exemplo, endossomas. Para verificar a liberação dosspiegelmers desses compartimentos, o padrão de distribuição de célulasindividuais, grandemente aumentadas, foi analisado (Fig. 13). Além da loca-lização semelhante a pontos dos spiegelmers, um padrão de distribuiçãodifusa no citosol e na membrana plasmática foi detectado, o que aponta paraa liberação endossômica dos spiegelmers. Esse padrão não foi encontradono caso de spiegelmers "nus".
Exemplo 4: Bioatividade in vivo
4.1 Ensaio de Proliferação Sem PEI
Efeito sobre a proliferação de células MCF-7O papel potencial da HMGA1a/b na divisão celular foi investiga-do por meio de ensaios de proliferação. Primeiro, o spiegelmer foi adiciona-do em uma alta dose como ácido nucleico "nu" ao meio de cultura de célulase o crescimento das células foi acompanhado com o tempo. A linhagem decélulas de câncer de mama MCF-7 foi usada como modelo uma vez que,nessas células, uma menor expressão (antagonização) de HMGA1a/b foiverificada e o papel da HMGA1a/b na proliferação dessas células já tinhasido descrito na literatura. Reeves e colaboradores (Reeves-R e colaborado-res,, Molecular and Cellular Biology, Janeiro de 2001, páginas 575-594)mostraram que a super-expressão de HMGA1a/b em células MCF-7 leva auma proliferação aumentada e a inibição de HMGA1a/b por meio de estrutu-ras anti-senso expressas inibe a proliferação de células MCF-7.
Execução/Método
0,5 x 104 células MCF-7 (ATCC) foram cultivadas em lâminascom 96 cavidades (Costar) com uma base plana, transparente e cultivadasdurante 16-24 horas em 100 ul de meio RPMI 1640 com soro fetal de bezer-ro a 10% (FCS). As células foram, então, lavadas com PBS e cultivadas du-rante mais 48 horas com meio de cultura de células padrão com a adiçãodireta de spiegelmer filtrado estéril. Isso foi seguido pela adição de 10 ul deuma solução de resazurina (0,44 mM em PBS) aos respectivos lotes e outraincubação durante 2 horas a 37°C. A transformação de resazurina pelo me-tabolismo celular se correlaciona diretamente com o número de células. Aalteração na cor foi medida em um dispositivo de leitura com placa de multi-detecção Fluostar Optima (BMG) (emissão a 544 nm, extinção a 590 nm).Cada valor foi determinado três vezes por experimento e comparado comvalores das células de controle não tratadas.
Resultado
NOX-A inibiu, após dois dias, de uma maneira dose-dependente,a proliferação de células MCF-7 (n = 12) (Fig. 14). A inibição máxima da pro-liferação para aproximadamente 30% do valor das células não tratadas foiencontrada a 40 uM. Em concentrações de até 40 uM, nenhum efeito não-específico do spiegelmer de controle inverso foi encontrado.4.2 Ensaio de Proliferação com PEI
Efeito de micelas de spiegelmer sobre a proliferação de células H-1299Execução/Método
1x104 células NCI-H-1299 (células de carcinoma de pulmão;ATCC) foram cultivadas em lâminas com 24 cavidades (Costar) com umabase plana, transparente e cultivadas durante 16-24 horas em 1 ml de meioRPMI 1640 com FCS a 10%. As células foram, então, lavadas duas vezescom PBS e cultivadas durante mais três dias com meio de cultura de célulascontendo FCS a 1% e micelas de spiegelmer. O acondicionamento de spie-gelmer PEGuilado estéril foi realizado previamente em PBS através de adi-ção de polietilenoimina reticulada ramificada de 25 kDa (PEI) (Sigma) emuma proporção da fração de nitrogênio absoluto da PEI para o fosfato abso-luto da parte principal de ácido ribonucleico de 2,5:1 (N/P de 2,5). O spie-gelmer estéril foi usado em uma concentração de 30 uM e, após a adição daPEI, foi incubado durante 30-60 minutos em temperatura ambiente. As mice-las de spiegelmer foram, então, diluídas para 1 uM com meio de cultura decélulas contendo FCS a 1%, adicionadas diretamente às células lavadas eincubadas durante três dias a 37°C.
Isso foi seguido pela adição de 100 ul de solução de resazurinaaos respectivos lotes e outra incubação durante 2 horas a 37°C. A transfor-mação de resazurina pelo metabolismo celular se correlaciona diretamentecom o número de células. 100 ul foram removidos dos lotes, transferidospara uma lâmina com 96 cavidades e a alteração na cor foi medida em umdispositivo de leitura com placa de multidetecção Fluostar Optima (BMG)(emissão a 544 nm, extinção a 590 nm). Cada valor foi determinado duasvezes por experimento e comparado aos valores das células de controle nãotratadas.
Resultado
O uso de PEI (N/P de 2,5) com spiegelmer a 1 uM inicialmentenão tem qualquer efeito sobre a proliferação celular. Através de redução daquantidade de FKS no meio de cultura de células para abaixo de 1%, foimostrado que a transfecção com micelas de spiegelmer tem uma influênciasobre a proliferação de células H-1299, o que não era anteriormente visívelcom FKS a 10% (Fig 15). Possivelmente, o FKS estimula a proliferação a umponto tal que o leve efeito não pôde ser observado. A redução da concentra-ção de FKS em células MCF-7 leva à morte das células durante um períodode 3 dias.
4.3 Inibicão do Marcador de Tumor cdc25a (com PEI)
Efeito sobre a regulação HMGA1a/b-mediada de fatores do ciclocelular, no exemplo do oncogene potencial cdc25a
Reeves e colaboradores (Molecular and Cellular Biology, Janeirode 2001, páginas 575-594) mostraram, por meio de arranjos de cDNA atra-vés de super-expressão de HMGA1a/b em células MCF-7, que a HMGA1a/binduz à expressão de um grande número de genes. Ao mesmo tempo, fato-res do ciclo celular e fatores de crescimento tal como, por exemplo, cdc25a,identificado como oncogene potencial (fosfatase 25a do ciclo de divisão celu-lar 25a), o qual exerce um papel decisivo no controle de transição da faseG1 para a fase S do ciclo celular, são super-expressos em um fator de até100. A ativação de tais pontos de controle leva, após inibição de progressãodo ciclo celular, à transcrição de genes os quais estão envolvidos no reparode DNA ou, se o dano ao DNA é irreversível, à indução de apoptose. Comosistema de teste de cultura de células, células H-1299 foram escolhidas paraessa finalidade, uma vez que elas já exibiram uma expressão aumentada de HMGA1a/b.
Execução/Método
1x104 células H-1299 foram cultivadas em lâminas com 24 cavi-dades (Costar) com um piso plano, transparente e cultivadas durante 16-24horas em meio RPMI 1640 contendo FCS a 10% (volume de 1 ml). As célu-las foram, então, lavadas duas vezes com PBS e cultivadas durante maistrês dias em um meio de cultura de células com micelas de spiegelmer con-tendo FCS a 10%. O acondicionamento de spiegelmer PEGuilado estéril foirealizado previamente em PBS através de adição de polietilenoimina reticu-lada ramificada de 25 kDa (PEI) (Sigma) em uma proporção da fração denitrogênio absoluto da PEI para o fosfato absoluto da parte principal de ácidoribonucleico de 2,5:1 (N/P de 2,5). O spiegelmer estéril foi usado em umaconcentração de 30 uM e, após adição de PEI, foi incubado durante 30-60minutos em temperatura ambiente. As micelas de spiegelmer com meio decultura de células contendo FCS a 1 % foram, então, diluídas para a respec-tiva concentração, adicionadas diretamente às células lavadas e incubadasdurante três dias a 37°C. As células foram lavadas duas vezes com PBS ecoletadas por meio de um raspador de células. O mRNA das células foi, en-tão, isolado das células por meio do Roti-Quick-Kit (Roth, Cat. No. 979.1) e0,2-1 ug de RNA total foi usado como template para a PCR de cdc25a eGAPDH.
Os primers para a amplificação de GAPDH foram como segue: primerdianteiro: 5'-ACATGTTCCAATATGATTCC-3' e primer reverso: 5-TGGACTCCACGACGTACTCAG-3' em uma temperatura de anelamento de 51°C e,para a amplificação de cdc25a: primer dianteiro: 5'-GAGGAGTCTCACCTGGAAGTACA-3' e primer reverso: 5'-GCCATTCAAAACCAGATGCCATAA-3'em uma temperatura de anelamento de 59°C. As condições de PCR eramcomo segue: primer a 0,2-0,75 uM, MgCI2 a 1,5 mM e dNTPs a 0,2 rriM. Acada dois ciclos de PCR, uma alíquota de 5 ul foi quantificada através doPicoGreen e avaliada através de correlação com GAPDH como controle decarga: para isso, na primeira etapa para cada amostra investigada, o assimdenominado valor de "ponto de cruzamento" (CP) do gene de referência ésubtraído do valor de CP do gene que está sendo investigado (dCP = CP dogene alvo menos CP do gene de referência). CP é definido como o númerode ciclos de PCR que são requeridos de forma a atingir um valor de fluores-cência constantemente definido. A mesma quantidade de DNA recentementesintetizado é encontrada no CP em todos os vasos de reação. Após essapadronização, o valor de dCP de um controle (nesse caso, GAPDH) é sub-traído do valor de dCP das amostras experimentalmente tratadas; se chegaao assim denominado modelo de cálculo de "delta-delta CT". A diferença deexpressão relativa de uma amostra entre o tratamento e o controle (propor-ção), normalizada para o gene de referência e com referência a uma amos-tra padrão, é encontrada a partir da fórmula aritmética 2 :
dCP = CP (cdc25a)- CP (GAPDH)
ddCP = dCP (spiegelmer NOX-A de tratamento)- dCP (controle:
PBS ou NOX-A inverso)
Proporção = 2"ddCP
Resultado
cdc25a e HMGA1a/b foram detectados em células MCF-7 e H-1299 por meio de RT-PCR. Células MCF-7 mostraram uma baixa expressãode HMGA1a/b e também uma baixa expressão de cdc25a, enquanto queHMGA1a/b e cdc25a foram fortemente expressos em células H-1299. Atransfecção de células H-1299 durante dois dias com spiegelmers de HM-GA1a/b-ligação levou a uma redução dose-dependente significativa da ex-pressão de mRNA de cdc25a (Fig. 16 e figurai 7).
Até uma concentração de 4 uM, um spiegelmer de controle nãoexibiu efeito não-específico, nem sobre a expressão de mRNA de GAPDHou cdc25a. A partir disso, pode ser concluído que a super-expressão HM-GA1a/b-induzida do oncogene potencial cdc25a pode ser inibida por meio despiegelmers.
Exemplo 5. Estudo de Eficácia: Modelo de Xenoenxerto
Efeito de spiegelmers sobre o crescimento de tumor in vivoDe forma a testar a hipótese de que spiegelmers de HMGA1a/b-ligação inibem o crescimento de tumores in vivo, um modelo de xenoenxertofoi desenvolvido para as células PSN-1 de carcinoma pancreático expres-sando fortemente HMGA1a/b. Com base nesse modelo, um experimentoterapêutico foi realizado com 2 mg/kg de micelas de spiegelmer NOX-A emuma N/P de 2,5 (veja Exemplo 3, parágrafo 3.3).
Execução/Método
A camundongos machos nus (NMRI: nu/nu) (tamanho de grupon = 8) foram injetadas subcutaneamente no lado, em cada caso, 107 célulasPSN-1 (ECACC) e o crescimento do tumor foi observado durante 22 dias. Osanimais tinham um peso médio de 25-27 g e tinham 6-8 semanas de idade.O spiegelmer ativo NOX-A-3'PEG e o spiegelmer de controle inverso emINV-3'PEG foram acondicionados em micelas, conforme descrito acima, a-través de adição de PEI em uma proporção de N/P de 2,5. 100 ul da sus-pensão de micelas de spiegelmer (correspondendo a 3,46 nmoles/animal ou2 mg/kg) foram, em cada caso, diariamente injetados subcutaneamente naproximidade do tumor. O volume do tumor e peso corporal foram medidostrês vezes por semana. Os animais foram sacrificados no dia 22 e a distribu-ição de NOX-A no plasma, fígado, rins e tumor foi quantificada.
Para essa finalidade, os tecidos foram homogeneizados emtampão de hibridização (0,5x SSC, pH de 7,0; SDSarcosinato a 0,5% (pe-so/v)) e centrifugados durante 10 min a 4000x g. Os sobrenadantes obtidosforam armazenados a -20°C até outro uso.
A quantidade de spiegelmer nas amostras de plasma e nos ho-mogenatos teciduais foi investigada por meio de um ensaio de hibridização(Drolet e colaboradores, (2000) Pharm. Res. 17: 1503). O ensaio de hibridi-zação é baseado no seguinte princípio: o spiegelmer a ser detectado (molé-cula de l-RNA) é hibridizado sobre uma sonda de oligonucleotídeo de L-DNA imobilizada ( = sonda de captura NOX-A; nesse caso: 5'- CCCATATC-CACCCACGTATCAGCCTTTI I I I I -NH2 -3'; complementar à extremidade 5'da HMGA1a/b-NOX-A) e detectado com uma sonda de L-DNA de detecçãobiotinilada (= sonda detectora NOX-A; nesse caso: 5'-biotina-i i i i i i i iGGCTGAAACCACCCACATGG-3'; complementar à extremidade 3' da HM-GA1a/b-NOX-A). Para essa finalidade, um conjugado de fosfatase alcali-na/estreptavidina é, em uma outra etapa, ligado ao complexo. Após a adiçãode uma substância quimioluminescente, luz é gerada e medida em um lumi-nômetro.
Imobilização da sonda de oligonucleotídeo: 100 ul da sonda decaptura (0,75 pmoles/ml em tampão de acoplamento: Na2HP04a 500 mM,pH de 8,5, EDTA a 0,5 mM) foram transferidos para cada cavidade (depres-são em uma lâmina) em lâminas DNA-BIND (Corning Costar) e incubadosdurante a noite a 4°C. A sonda foi, então, lavada três vezes com 200 ul detampão de acoplamento a cada vez e incubada durante 1 horas a 37°C, emcada caso, com 200 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,5% (peso/v) emtampão de acoplamento). Após lavagem novamente com 200 ul de tampãode acoplamento e 3x 200 ul tampão de hibridização, as lâminas podem serusadas para a detecção.
Hibridização e detecção: 10 ul de plasma ou homogenato teci-dual em EDTA foram misturados com 90 ul de tampão de detecção (2 pmo-les/ul de sonda detectora em tampão de hibridização) e centrifugados. Puri-ficações adicionais foram realizadas conforme necessário. Os lotes foram,então, desnaturados durante 10 min a 95°C, transferidos para as cavidadesDNA-BIND adequadamente preparadas (veja acima) e incubados durante 45min a aproximadamente 40°C. As seguintes etapas de lavagem foram, en-tão, realizadas: 2x 200 ul tampão de hibridização e 3x 200 ul 1x TBS/Tween20 (Tris-CI a 20 mM, pH de 7,6, NaCI a 137 mM, Tween 20 a 0,1% (v/v)). 1ul de conjugado de fosfatase alcalina/estreptavidina (Promega) foi diluídocom 5 ml de TBS/Tween 20. 100 ul do conjugado diluído foram adicionadosa cada cavidade e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. Asseguintes etapas de lavagem foram, então, realizadas: 2x 200 ul deTBS/Tween 20 e 2x 200 ul de tampão de ensaio (Tris-CI a 20 mM, pH de9,8, MgCI2 a 1 mM). 100 ul de CSPD "Ready-To-Use Substrate" (AppliedBiosystems) foram, então, adicionados, incubados durante 30 min em tem-peratura ambiente e a quimioluminescência foi medida em um dispositivo deleitura com placa de multidetecção Fluostar Optima (BMG).
Resultado
Em um experimento preliminar, foi mostrado que células H-1299,após transplante como um tumor, crescem significativamente mais lenta-mente do que PSN-1 e, quando de comparação, os animais individuais exibi-ram um crescimento de tumor não homogêneo e, portanto, pareciam inade-quados como modelo de xenoenxerto para um estudo de tratamento. Célu-las PSN-1 exibiram um crescimento de tumor agressivo dentro de 22 dias.Foi mostrado que micelas de NOX-A, em uma dose de 2 mg/kg, reduziam ocrescimento de tumores PSN-1 significativamente comparado com o controlede PBS (Fig. 18). O peso dos animais não foi afetado pelo tratamento comas micelas de spiegelmer. O spiegelmer de controle não exibiu qualquer ini-bicão não-específica do crescimento de tumor e, da mesma forma, não teveefeito sobre o peso dos animais. As diferenças no tamanho do tumor eram, apartir do dia 10 de tratamento com micelas de NOX-A3'PEG, significativasou altamente significativas comparado com os animais não tratados (controlede PBS (t-teste de Student). A análise de end point após 22 dias mostrouuma redução específica altamente significativa no crescimento do tumor (p =0,0098 comparado com PBS e p = 0,022 comparado com o spiegelmer decontrole inverso) (Fig. 19). Camundongos tratados com PBS mostraram umcrescimento médio do tumor de 2,5 cm3, animais tratados com spiegelmerde controle tinham um volume médio do tumor de 2,6 cm3 e os animais tra-tados com NOX-A tinham um volume médio do tumor de 1,2 cm3 após 22dias (análise de caixa-e-whisker). Isso corresponde a uma redução do cres-cimento do tumor de mais de 50%. A análise da distribuição tecidual deNOX-A mostrou uma alta concentração no tumor (Fig. 20).
Exemplo 6: Comparação da Distribuição Tecidual in vivo de Spiegelmer A-condicionado e Não Acondicionado
De forma a verificar a incorporação eficiente de micelas de spiegel-mer, um spiegelmer não funcional (Prova de Conceito = POC) foi PEGuiladona extremidade 3' com PEG de 2 kDa e acondicionado com uma proporçãode nitrogênio/fosfato (N/P) de 2,5 em micelas (veja Exemplo 3, parágrafo3.3). De uma forma similar ao protocolo descrito no Exemplo 5, essa abor-dagem foi adotada para spiegelmer acondicionado em micelas, bem comopara spiegelmers livres, não acondicionados.
Execução/Método
A camundongos machos nus (NMRI: nu/nu) (tamanho de grupo n = 8)foram, em cada caso, injetadas subcutaneamente no Iado107 células PSN-1(ECACC) e o crescimento do tumor foi observado durante 25 dias. Os ani-mais tinham um peso médio de 25-27 g e tinham 6-8 semanas de idade. Ospiegelmer não funcional POC-3'PEG foi acondicionado em micelas atravésde adição de PEI em uma proporção de N/P de 2,5, conforme descrito aci-ma. O spiegelmer POC-3'PEG não acondicionado em micelas serviu comocontrole para a incorporação não mediada por PEI. 100 ul da suspensão despiegelmer-micela ou solução de spiegelmer (correspondendo a 1500 nmo-les/kg e 2000 nmoles/kg) foram diariamente injetados subcutaneamente naproximidade do tumor. O volume do tumor e peso corporal foram medidostrês vezes por semana. 24 e 96 horas após a última injeção, dois animais decada grupo foram sacrificados e a distribuição de POC-3'PEG (acondiciona-do/não acondicionado) no plasma, cérebro, coração, pulmões, fígado, rins,vesícula biliar, pâncreas e tumor foi quantificada.
Para essa finalidade, o tecido foi homogeneizado em tampão dehibridização (0,5x SSC, pH de 7,0; SDSarcosinato a 0,5% (peso/v)) e centri-fugado durante 10 min a 4000 x g. Os sobrenadantes resultantes foram ar-mazenados a -20°C até outro uso.
A quantidade de spiegelmer nas amostras de plasma e homoge-natos teciduais foi investigada por meio de um ensaio de hibridização (Drolete colaboradores, (2000) Pharm. Res. 17: 1503). O ensaio é baseado no se-guinte princípio: o spiegelmer (molécula de L-RNA) a ser detectado é hibridi-zado sobre uma sonda de oligonucleotídeo de L-DNA imobilizada (= sondade captura POC; aqui: 5'- NH2(C7)-I I I I I I II IAGCTCTGCACAGCGCT-3';complementar à extremidade 3' da POC) e é detectado com uma sonda deL-DNA de detecção biotinilada (= sonda detectora POC; aqui: 5'-CCGCATCAGACCGAGTTTCCTTAI I I I II IT-Biotina-3'; complementar à extremidade5' da POC). Para isso, um conjugado de fosfatase alcalina/estreptavidina foiligado, em uma outra etapa, ao complexo. Após adição de um substrato dequimioluminescência, luz é gerada e medida em um luminômetro.
Imobilização da sonda de oligonucleotídeo: 100 ul da sonda decaptura POC (0,75 pmoles/ml em tampão de acoplamento: Na2HP04 a 500mM, pH de 8,5, EDTA a 0,5 mM) foram transferidos para cada cavidade (de-pressão em uma lâmina) em lâminas DNA-BIND (Corning Costar) e incuba-dos durante a noite a 4°C. A sonda foi, então, lavada três vezes com 200 ulde tampão de acoplamento e incubada durante 1 hora a 37°C com 200 ul detampão de bloqueio (BSA a 0,5% (peso/v) em tampão de acoplamento). A-pós lavagem novamente com 200 ul de tampão de acoplamento e 3x 200 ulde tampão de hibridização, as lâminas pode ser usadas para a detecção.Hibridização e detecção: 10 ul de plasma ou homogenato teci-dual em EDTA foram misturados com 90 ul de tampão de detecção (2 pmo-les/ul de sonda detectora POC em tampão de hibridização) e centrifugados.Purificações adicionais foram realizadas conforme necessário. Os lotes fo-ram, então, desnaturados durante 10 min a 95°C, transferidos para cavida-des DNA-BIND adequadamente preparadas (veja acima) e incubados duran-te 45 min a aproximadamente 40°C. As seguintes etapas de lavagem foram,então, realizadas: 2x 200 ul de tampão de hibridização e 3x 200 ul 1xTBS/Tween 20 (Tris-CI a 20 mM, pH de 7,6, NaCI a 137 mM, Tween 20 a0,1% (v/v)). 1 ul de conjugado de fosfatase alcalina/estreptavidina (Promega)foi diluído com 5 ml de 1x TBS/Tween 20. 100 ul do conjugado diluído foramadicionados a cada cavidade e incubados durante uma hora em temperaturaambiente. As seguintes etapas de lavagem foram, então, realizadas: 2x 200pi de 1x TBS/Tween 20 e 2x 200 ul de 1x tampão de ensaio (Tris-CI a 20mM, pH de 9,8, MgCI2 a 1 mM). 100 ul de CSPD "Ready-To-Use Substrate"(Applied Biosystems) foram, então, adicionados, incubados durante 30 minem temperatura ambiente e a quimioluminescênciã foi medida em um dispo-sitivo de leitura com placa de multidetecção Fluostar Optima (BMG).
Resultado
A análise da distribuição de peso do spiegelmer não funcionalPOC-3'PEG, o qual foi acondicionado em micelas, mostrou após 24 horas,uma concentração significativamente maior nos tecidos de tumor (24,925 +/-13,301 pmoles/mg) comparado com o spiegelmer não acondicionado (0,840+/- 0,255 pmoles/mg) (Fig. 21 A). Enquanto que a concentração do spiegel-mer acondicionado tinha ido para metade (11,325 +/- 7,050 pmoles/mg) a-pós mais três dias (96 horas), apenas uma quantidade muito pequena dospiegelmer não acondicionado pôde ser detectada (0,120 +/- 0,057 pmoles/mg).
O nível no plasma do spiegelmer não acondicionado (2,950 +/-0,438 pmoles/ml) após 24 horas era comparável com aquele do spiegelmerPEI-acondicionado (1,930 +/- 2,729 pmoles/ml). Após 96 horas, diferençasevidentes foram encontradas, nas quais cerca de quatro vezes a quantidadede spiegelmer acondicionado, comparado com o spiegelmer não acondicio-nado, foram detectadas.
Um ligeiro acúmulo nos rins foi observado após 24 horas paraambas as formulações, enquanto que um ligeiro acúmulo no fígado e vesícu-Ia biliar foi encontrado apenas para o spiegelrper não acondicionado. Após96 horas, para ambas as formulações, apenas quantidades mínimas de spi-egelmer foram detectadas no fígado e rins. Por outro lado, valores ligeira-mente elevados foram encontrados na vesícula biliar e pancreas (mas comum alto desvio padrão) para o spiegelmer acondicionado comparado com ospiegelmer não acondicionado.
Para resumir, comparado com a distribuição de peso (24 e 96horas após a última injeção) de spiegelmers na presença e ausência de PEI,descobriu-se que micelas de spiegelmer têm um tempo de residência signifi-cativamente prolongado no plasma e tumor comparado com o material nãoacondicionado (Fig. 21B) e, assim, representa uma abordagem promissoraao uso de spiegelmers dirigidos contra moléculas alvo intracelulares.
As citações a seguir são incorporadas aqui como forma de refe-rência.
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<110> NOXXON Pharma AG
<120> Uso de spielgelmers
'<130> N 10048 PCT
<150> DE 10 2005 020 874.6
<151> 2005-05-04
<160> 50
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 47
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 1
gcugcugcaa auugacgggg gcgugguugg ggcgggucga uugcagc
<210> 2
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 2
gcugaaugag gaucgcaggg gcguggcugg ggugggcgac cguucagc
<210> 3
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 3
gcugcgcaag gagaggggcg cgguugggga ggcucuaagc gcugcagc
<210> 4
<211> 47
<212> RNA
<213> Artificial
<220><221> misc_feature
<223> sintético
<400> 4
gcuggcgcua uaggacaggg gugcgguugg ggcgguccgc ugucagc
<210> 5
<211> 48
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<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
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<210> 6
<211> 46
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético<400> 6
gcugccguaa agagggguga gguuggggag gcuuuacggu uucagc
<210> 7
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 7
gcugcaugcc gcgaucaggg gagcgguugg ggcgggaucc ggcucagc
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<213> Artificial
<220>
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<400> 8
gcugcgaggg agguagcggc ucugcgccgu gacgugggug gaugcagc
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<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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ggcugauacg uggguggaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
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<212> RNA
'<213> Artificial
<220>
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ggcugauacg ugggugaaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 11
ggcugauacg ugggaggaaa gguguaacua ccugugggag guuucagcc
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 12
ggcuggcacu cgcaggggug aagugaugau uggggugggc gagaccagcc
<210> 13
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 13
ggcugccgag ugguugggug guguaaggga gguggaaucc gcgggcagcc
<210> 14
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 14
ggcuguucgu gggaggaagg cucuuggaua gagucguggg ugguucagcc 50
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<211> 32
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 15
ggaucgcagg ggcguggcug gggugggcga cc 32
<210> 16
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 16
ggaucgcagg ggcguggcug gggugggcga ucc 33
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> sintético
<400> 17
Glu Pro Ser Glu Vai Pro Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys Asn Lys20
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> M1SC_FEATURE
<223> HMGAla
<400> 18
Ser Glu Ser Ser Ser Lys Ser Ser Gln Pro Leu Ala Ser Lys Gln Glu10 15
Lys Asp Gly Thr Glu Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro Arg Lys Gln Pro20 25 30
Pro Vai Ser Pro Gly Thr Ala Leu Vai Gly Ser Gln Lys Glu Pro Ser35 40 45
Glu Vai Pro Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Lys50 55 60
Asn Lys Gly Ala Ala Lys Thr Arg Lys Thr Thr Thr Thr Pro Gly Arg65 70 75 80
Lys Pro Arg Gly Arg Pro Lys Lys Leu Glu Lys Glu Glu Glu Glu Gly85 90 95
lie Ser Gln Glu Ser Ser Glu Glu Glu Gln100 105
<210> 19
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HMGAlb
<400> 19
Ser Glu Ser Ser Ser Lys Ser Ser Gln Pro Leu Ala Ser Lys Gln Glu1 5 10 15
Lys Asp Gly Thr Glu Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro Arg Lys Gln Pro20 25 30
Pro Lys Glu Pro Ser Glu Vai Pro Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg35 40 45
Pro Lys Gly Ser Lys Asn Lys Gly Ala Ala Lys Thr Arg Lys Thr Thr50 55 60
Thr Thr Pro Gly Arg Lys Pro Arg Gly Arg Pro Lys Lys Leu Glu Lys65 70 75 80
Glu Glu Glu Glu Gly lie Ser Gln Glu Ser Ser Glu Glu Glu Gln85 90 95<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HMGA2
<400> 20
Ser Ala Arg Gly Glu Gly Ala Gly Gln Pro Ser Thr Ser Ala Gln Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gln Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro Arg20 25 30
Lys Gln Gln Gln Glu Pro Thr Gly Glu Pro Ser Pro Lys Arg Pro Arg35 40 45
Gly Arg Pro Lys Gly Ser Lys Asn Lys Ser Pro Ser Lys Ala Ala Gln50 55 60
Lys Lys Ala Glu Ala Thr Gly Glu Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Arg65 70 75 80
Lys Trp Pro Gln Gln Vai Vai Gln Lys Lys Pro Ala Gln Glu Glu Thr85 90 95
Glu Glu Thr Ser Ser Gln Glu Ser Ala Glu Glu Asp100 105
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 21
tcgaaaaaag caaaaaaaaa aaaaaaaaac tggc
<210> 22
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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ggcugauacg uggguggaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
<210> 23
<211> 50
<212> RNA
'<213> Artificial
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<223> sintético
<400> 23
ccgacuuugg uggguguacc uugacggggu auaggugggu gcauagucgg
<210> 24
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
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<223> sintético
<400> 24
ggcugauacg uggguggaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
<210> 25
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
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<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 25
ccgacuuugg uggguguacc uugacggggu auaggugggu gcauagucgg
<210> 26
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 26
ccgacuuugg uggguguacc uugacggggu auaggugggu gcauagucgg
<210> 27<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 27
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 28
cccatatcca cccacgtatc agcctttttt tt
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 29
ttttttttgg ctgaaaccac ccacatgg
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 30
ttttttttta gctctgcaca gcgct
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature<223> sintético
<400> 31
ccgcatcaga ccgagtttcc ttattttttt t
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 32tcgacaccat gggtgagtc
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 33
gtctagaaag cttcccaact g
<210> 34
<211> 47
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 34
gcugcugcaa auugacgggg gcgugguugg ggcgggucga uugcagc
<210> 35
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 35
gcugaaugag gaucgcaggg gcguggcugg ggugggcgac cguucagc<210> 36
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 36
gcugcgcaag gagaggggcg cgguugggga ggcucuaagc gcugcagc
<210> 37
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature<223> sintético
<400> 37
gcuggcgcua uaggacaggg gugcgguugg ggcgguccgc ugucagc
<210> 38
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 38
gcuggauaga acgcaggggu gcgguuuggg gugggcguga uaugcagc
<210> 39
<211> 46
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 39
gcugccguaa agagggguga gguuggggag gcuuuacggu uucagc
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético<400> 40
gcugcaugcc gcgaucaggg gagcgguugg ggcgggaucc ggcucagc
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<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial
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<223> sintético
<400> 41
gcugcgaggg agguagcggc ucugcgccgu gacgugggug gaugcagc
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> sintético
<400> 42
ggcugauacg uggguggaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
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<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<223> sintético
<400> 43
ggcugauacg ugggugaaua uggggcaguu ccaugugggu gguuucagcc
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<211> 49
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 44
ggcugauacg ugggaggaaa gguguaacua ccugugggag guuucagcc
<210> 45<211> 50<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 45
ggcuggcacu cgcaggggug aagugaugau uggggugggc gagaccagcc
<210> 46
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<213> Artificial
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<223> sintético
<400> 46
ggcugccgag ugguugggug guguaaggga gguggaaucc gcgggcagcc
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<213> Artificial
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<223> sintético
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ggcuguucgu gggaggaagg cucuuggaua gagucguggg ugguucagcc
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<223> sintético
<400> 48
ggaucgcagg ggcguggcug gggugggcga cc
<210> 49
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<213> Artificial
<220>
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<223> sintético<400> 49
ggaucgcagg ggcguggcug gggugggcga ucc 33
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<223> sintético
<400> 50
gccagttttt tttttttttt tttgcttttt t 31
Claims (139)
1. Uso de um ácido L-nucleico como agente intracelularmenteativo.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o ácido L-nucleico é um spiegelmer.
3. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracteri-zado pelo fato de que o ácido L-nucleico interage com um receptor intracelular.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fatode que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo re-ceptores moleculares, enzimas, moléculas de chaperona, peptídeos sinali-zadores, estruturas intracelulares e intermediários metabólicos.
5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fatode que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo poli-peptídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, lipídios e combinações dos mes-mos.
6. Uso de acordo com uma das reivindicações 3 a 5, caracteri-zado pelo fato de que o ácido L-nucleico interage com um receptor intracelu-lar dentro de uma célula.
7. Uso de acordo com uma das reivindicações 3 a 6, caracteri-zado pelo fato de que o receptor intracelular é selecionado do grupo com-preendendo fatores de transcrição e proteínas de ligação a DNA ligando umgancho AT.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fatode que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendo prote-ínas HMG, de preferência do grupo compreendendo HMGA1, HMGAIa,HMGAIbe HMGA2.
9. Método para ligação de um receptor intracelular compreen-dendo:- fornecimento de uma célula contendo pelo menos um receptorintracelular,- fornecimento de um ácido L-nucleico, e- incubação da célula com o ácido L-nucleico.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a incubação ocorre sob condições de modo que o ácido L-nucleico se liga ao receptor intracelular na célula.
11. Método de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracteriza-do pelo fato de que o ácido L-nucleico é um spiegelmer.
12. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 11, ca-racterizado pelo fato de que, após incubação da célula com o ácido L-nucleico, é determinado se uma ligação, em particular uma ligação intracelu-lar, do ácido L-nucleico com o receptor intracelular ocorreu.
13. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 12, ca-racterizado pelo fato de que o receptor intracelular é selecionado do grupocompreendendo receptores moleculares, intermediários metabólicos e enzi-mas.
14. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 13, ca-racterizado pelo fato de que o receptor intracelular é selecionado do grupocompreendendo polipeptídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, lipídios ecombinações dos mesmos.
15. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 14, ca-racterizado pelo fato de que o receptor intracelular é selecionado do grupocompreendendo fatores de transcrição e proteínas de ligação a DNA ligandoum gancho AT.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe-lo fato de que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendoproteínas HMG, de preferência selecionadas do grupo compreendendo HM-GA1, HMGAIa, HMGAIb e HMGA2.
17. Uso de um ácido L-nucleico para a fabricação de um medi-camento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença, na qual a mo-lécula alvo do medicamento é uma molécula alvo intracelular.
18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fa-to de que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendoreceptores moleculares, enzimas, moléculas de chaperona, peptídeos sinali-zadores, estruturas intracelulares e intermediários metabólicos.
19. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendopolipeptídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, lipídios e combinações dosmesmos.
20. Uso de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracte-rizado pelo fato de que a molécula alvo é selecionada do grupo compreen-dendo fatores de transcrição e proteínas de ligação a DNA ligando um gan-cho AT.
21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelofato de que a molécula alvo é selecionada do grupo compreendendo proteí-nas HMG e é, de preferência, selecionada do grupo compreendendo HM-GA1, HMGA1 a, HMGA1 b e HMGA2.
22. Uso de acordo com uma das reivindicações 20 e 21, caracte-rizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo compreendendodoenças tumorígenas, infecções virais e arteriosclerose.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelofato de que a doença tumorígena é selecionada do grupo compreendendotumores mesenquimais, tumores epiteliais, tumores benignos, tumores ma-lignos e tumores metastáticos.
24. Uso de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, caracte-rizado pelo fato de que a molécula alvo é HMGA e a doença é selecionadado grupo compreendendo cânceres da próstata, pâncreas, tiróide, cérvix,estômago, mama, cólon/reto, ovários; neuroblastomas; linfomas, leiomiomasuterinos; lipomas; pólipos endometriais; hamartomas condróides dos pul-mões; adenomas pleomórficos das glândulas salivares; hemangiopericito-mas; tumores condromatosos; angiomixomas agressivos; astrocitomas difu-sos; osteoclastomas; câncer de pele; linfoma de Burkitt; câncer de pulmãode Lewis; leucemia; carcinoma de pulmão de células não-pequenas; bemcomo, em cada caso, metástases e/ou formas metastáticas dos mesmos.
25. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelofato de que a arteriosclerose é disparada ou causada pela formação de pia-cas arterioscleróticas mediada por HMGA1, HMGAIa, HMGAIb e/ou HM-GA2.
26. Uso de acordo com uma das reivindicações 17 a 25, caracte-rizado pelo fato de que a molécula alvo intracelular está presente intracelularmente.
27. Uso de um ácido L-nucleico para a fabricação de um agentediagnóstico para fins diagnósticos, a molécula alvo do agente diagnósticosendo uma molécula alvo intracelular.
28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelofato de que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendoreceptores moleculares, enzimas, moléculas de chaperona, peptídeos sinali-zadores, estruturas intracelulares e intermediários metabólicos.
29. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelofato de que o receptor intracelular é selecionado do grupo compreendendopolipeptídeos, carboidratos, ácidos nucleicos, lipídios e combinações dosmesmos.
30. Uso de acordo com uma das reivindicações 27 a 29, caracte-rizado pelo fato de que a molécula alvo é selecionada do grupo compreen-dendo fatores de transcrição e proteínas de ligação a DNA ligando um gan-cho AT.
31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que a molécula alvo é selecionada do grupo compreendendo proteí-nas HMG e é, de preferência, selecionada do grupo compreendendo HM-GA1, HMGA1 a, HMGA1 b e HMGA2.
32. Uso de acordo com a reivindicações 30 e 31, caracterizadopelo fato de que a doença é selecionada do grupo compreendendo doençastumorígenas, infecções virais e arteriosclerose.
33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a doença tumorígena é selecionada do grupo compreendendotumores mesenquimais, tumores epiteliais, tumores benignos, tumores ma-lignos e tumores metastáticos.
34. Uso de acordo com uma das reivindicações 30 a 33, caracte-rizado pelo fato de que a molécula alvo é HMGA e a doença é selecionadado grupo compreendendo carcinomas da próstata, pâncreas, tiróide, cérvix,estômago, mama, cólon/reto, ovários; neuroblastomas; linfomas, leiomiomasuterinos; lipomas; pólipos endometriais; hamartomas condróides dos pul-mões; adenomas pleomórficos das glândulas salivares; hemangiopericito-mas; tumores condromatosos; angiomixomas agressivos; astrocitomas difu-sos; osteoclastomas; câncer de pele; linfoma de Burkitt; câncer de pulmãode Lewis; leucemia; carcinoma de pulmão de células não-pequenas; bemcomo, em cada caso, metástases e/ou formas metastáticas dos mesmos.
35. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a arteriosclerose é disparada através de formação de placas ar-terioscleróticas mediada por HMGA1, HMGAIa, HMGAIb e/ou HMGA2.
36. Uso de acordo com uma das reivindicações 27 a 34, carac-terizado pelo fato de que a molécula alvo intracelular está presente intracelu-larmente.
37. Composição compreendendo ligação de um ácido L-nuc!eicoa uma molécula alvo intracelular e um veículo de distribuição.
38. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-da pelo fato de que o veículo de distribuição é um veículo de distribuiçãoadequado para a distribuição intracelular do ácido L-nucleico.
39. Composição de acordo com a reivindicação 37 ou 38, carac-terizada pelo fato de que o veículo de distribuição é selecionado do grupocompreendendo veículos, conjugados e meios físicos.
40. Composição de acordo com a reivindicação 39, caracteriza-da pelo fato de que o veículo de distribuição é um veículo, em que o veículoé selecionado do grupo compreendendo lipossomas, nanopartículas, micro-partículas, ciclodextrinas ou dendrímeros ou é uma vesícula consistindo depolipeptídeos, polietilenoimina e/ou moléculas anfifáticas.
41. Composição de acordo com a reivindicação 39, caracteriza-da pelo fato de que o veículo de distribuição é um conjugado, em que o con-jugado é um conjugado para endocitose receptor-mediada, um conjugadocom um peptídeo fusogênico, um conjugado com um peptídeo sinalizador,um conjugado com um ácido nucleico, de preferência um conjugado com umspiegelmer ou é um conjugado lipofílico.
42. Composição de acordo com a reivindicação 39, caracteriza-da pelo fato de que o veículo de distribuição é um meio físico, em que omeio é, de preferência, selecionado do grupo cqmpreendendo eletroporação,iontoforese, pressão, ultra-som e microondas.
43. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracteriza-da pelo fato de que o veículo de distribuição compreende polietilenoimina.
44. Composição de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-da pelo fato de que a polietilenoimina é uma polietilenoimina ramificada comum peso molecular de cerca de 25 kDa.
45. Composição de acordo com a reivindicação 43 ou 44, carac-terizada pelo fato de que a polietilenoimina forma uma micela ou uma estru-tura semelhante à micela.
46. Composição de acordo com uma das reivindicações 37 a 45,caracterizada pelo fato de que o ácido L-nucleico é um spiegelmer.
47. Composição de acordo com a reivindicação 46, caracteriza-da pelo fato de que o spiegelmer traz uma modificação, a modificação sendoselecionada do grupo compreendendo resíduos de PEG.
48. Composição de acordo com a reivindicação 47, caracteriza-da pelo fato de que o resíduo de PEG tem um peso molecular de cerca de-1.000 a 10.000 Da, de preferência um peso molecular de cerca de 1.500 a-2.500 Da e, ainda mais preferivelmente, um peso molecular de cerca de-2.000 Da.
49. Composição de acordo com uma das reivindicações 47 e 48,caracterizada pelo fato de que a modificação é ligada ao 5' término ou ao 3'término do ácido L-nucleico.
50. Composição de acordo com uma das reivindicações 46 a 49,caracterizada pelo fato de que, na composição, a proporção do número totalde grupos nitrogênio da polietilenoimina para o número total de grupos fosfa-to do ácido nucleico contido na composição é cerca de 1 a 20, de preferên-cia cerca de 1,5 a 10, mais preferivelmente cerca de 2 a 5 e, ainda mais pre-ferivelmente, cerca de 2 a 3.
51. Composição de acordo com uma das reivindicações 37 a 50,caracterizada pelo fato de que a composição proporciona o ácido L-nucleicointracelularmente.
52. Composição farmacêutica compreendendo uma composiçãode acordo com uma das reivindicações 37 a 51 e um veículo farmaceutica-mente aceitável.
53. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, em que oácido L-nucleico é uma composição de acordo com uma das reivindicações-37 a 52.
54. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 16, emque o ácido L-nucleico é uma composição de acordo com uma das reivindi-cações 37 a 52.
55. Uso de acordo com uma das reivindicações 17 a 26, em queo ácido L-nucleico é uma composição de acordo com uma das reivindica-ções 37 a 52.
56. Uso de acordo com uma das reivindicações 27 a 36, em queo ácido L-nucleico é uma composição de acordo com uma das reivindica-ções 37 a 52.
57. Ácido nucleico de HMGA-ligação, caracterizado pelo fato deque o ácido nucleico compreende uma seção de Caixa A1 e uma seção deCaixa A2, em que a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são unidasuma à outra por uma seção intermediária e em que a Caixa A1 e Caixa A2são selecionadas, individual e independentemente uma da outra, do grupocompreendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG.
58. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 57, caracterizado pelo fato de que a seção intermediária consiste emuma seção intermediária Z1 compreendendo seis ou sete nucleotídeos ou deuma seção intermediária Z2 compreendendo 12 a 25 nucleotídeos.
59. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico na extremi-dade 5' da seção de Caixa A1 compreende uma primeira seção e na extre-midade 3' da seção de Caixa A2 compreende uma segunda seção em que,de preferência, ambas as seções, independentemente uma da outra, com-preendem, em cada caso quatro a oito nucleotídeos.
60. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 59, caracterizado pelo fato de que as dgas seções são, pelo menosparcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, a hibridização seestendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
61. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico na extremi-dade 5' da seção de Caixa A1 compreende uma seção de Hélice A1 e naextremidade 3' da seção de Caixa A2 compreende uma seção de Hélice A2em que, de preferência, a seção de Hélice A1 compreende quatro a oito nu-cleotídeos e, de preferência, a seção de Hélice A2 compreende quatro a oitonucleotídeos e em que, de preferência, a seção de Hélice A1 forma a primei-ra seção na extremidade 5' da seção de Caixa A1 ou uma parte da mesma eem que, de preferência, a seção de Hélice A2 forma a segunda seção naextremidade 3' da seção de Caixa A2 ou uma parte da mesma, o compri-mento da seção de Hélice A1 sendo independente do comprimento da seçãode Hélice A2.
62. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 61, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice A1 e Hélice A2são, pelo menos parcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, ahibridização se estendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
63. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' daseção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, uma seção deHélice B1 está disposta e, entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e aextremidade 5' da seção de Hélice A2, uma seção de Hélice B2 está dispos-ta em que, de preferência, o comprimento da seção de Hélice B1 e Hélice B2compreende, em cada caso individual e independentemente, um comprimen-to de quatro a oito nucleotídeos.
64. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 63, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice B1 e Hélice B2são, pelo menos parcial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, ahibridização se estendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
65. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 63 ou 64, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' daseção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice B1, zero a cinconucleotídeos estão dispostos.
66. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 65, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' da seçãode Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice B1, dois nucleotídeosestão dispostos.
67. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' da seção de Hélice B2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2, zero aseis nucleotídeos estão dispostos.
68. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 67, de preferência na medida em que essa se refere à reivindicação66, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' da seção de Héli-ce B2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2, um nucleotídeo está dis-posto.
69. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dásreivindicações 63 a 68, em que a soma dos nucleotídeos da seção de HéliceA1 e da seção de Hélice B1 é 10 a 12 nucleotídeos e a soma dos nucleotí-deos da seção de Hélice A2 e da seção de Hélice B2 é 10 a 12 nucleotídeos.
70. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 69, em que a soma dos nucleotídeos hibridizados da hibridização daseção de Hélice A1 com a seção de Hélice A2 e da seção de Hélice BT coma seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nucleotídeo.
71. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 63 a 70, de preferência 63 ou 64, caracterizado pelo fato deque o ácido nucleico compreende nenhuma seção de Hélice A1 e Hélice A2,pelo que a seção de Hélice B1 está disposta na extremidade 5' do ácido nu-cleico e a Hélice B2 está disposta na extremidade 3' do ácido nucleico emque, de preferência, o comprimento da seção de Hélice B1 e Hélice B2 com-preende, em cada caso individual e independentemente, um comprimento dequatro a oito nucleotídeos.
72. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 71, em que as seções de Hélice B1 e Hélice B2 são, pelo menos par-cial ou completamente, hibridizadas uma com a outra, a hibridização se es-tendendo sobre quatro a oito pares de nucleotídeo.
73. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 61 e 62, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade-3' da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, um acinco nucleotídeos estão dispostos e, entre a extremidade 3' da seção deCaixa A2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2, um a três nucleotídeosestão dispostos.
74. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 63 a 72, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade-3' da seção de Hélice B1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, dois nu-cleotídeos estão dispostos e, entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 ea extremidade 5' da seção de Hélice B2, um a sete nucleotídeos estão dis-postos.
75. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 58 a 65, a reivindicação 67 na medida em que essa se refereàs reivindicações 63 a 65, as reivindicações 69 e 70 na medida em que es-sas se referem às reivindicações 63 a 65 e 67, as reivindicações 71 e 72 namedida em que essas se referem às reivindicações 63 a 65 e 67 e 69 e 70ou a reivindicação 74, na medida em que essa se refere às reivindicações 63a 65, 67, 69 a 72, em cada caso no escopo restrito aqui, caracterizado pelofato de que a seção intermediária Z1 compreende seis ou sete nucleotídeos.
76. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 75, caracterizado pelo fato de que a seção intermediária Z1 compre-ende a seqüência NíNaGNsNalVUNõ, em que:N1= 11, C, AouG;N2 = G ou U;N3 = U ou C;N4 = U ou A;N5 = G ou A; eNa = U ou está ausente.
77. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 76, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende umaseção de Caixa A1 e uma seção de Caixa A2, em que a extremidade 3' daseção de Caixa A1 é unida diretamente à extremidade 5' da seção interme-diária Z1 e a extremidade 3' da seção intermediária Z1 é unida diretamente àextremidade 5' da seção de Caixa A2.
78. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 75 a 77, em particular a reivindicação 77, caracterizado pelofato de que o ácido nucleico compreende uma seção de Hélice B1 e umaseção de Hélice B2.
79. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 78, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice B1 e Hélice B2compreendem, em cada caso individual e independentemente uma da outra,quatro a oito nucleotídeos os quais são, de preferência, completa ou parci-almente hibridizadas uma com a outra.
80. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 78 e 79, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' da seção de Hélice B1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, dois nu-cleotídeos N6, N7 estão dispostos na direção 5'-3', em que N6 é G, A ou U eN7é G ou U.
81. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 78 a 80, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' da seção de Hélice B2, nenhumnucleotídeo está disposto ou a seqüência de nucleotídeo GNy está dispostana direção 5'-3', em que Ny compreende zero a seis nucleotídeos, de prefe-rência 0 ou 6 nucleotídeos.
82. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 75 a 81, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico com-preende uma seção de Hélice A1 e uma seção de Hélice A2.
83. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 82, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice A1 e Hélice A2compreendem, em cada caso e independentemente uma da outra, quatro aoito nucleotídeos em que, de preferência, as seções de Hélice A1 e HéliceA2 são completa ou parcialmente hibridizadas uma com a outra.
84. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 82 e 83, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade-3' da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice B1, umaseqüência de nucleotídeo Nx está disposta, em que Nx compreende zero acinco nucleotídeos.
85. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 82 a 84, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade-3' da seção de Hélice B2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2, umaseqüência de nucleotídeo Nz está disposta, em que N2 compreende zero aseis nucleotídeos.
86. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 78 a 85, em que a soma dos nucleotídeos hibridizados dahibridização da seção de Hélice A1 com a seção de Hélice A2 e da seção deHélice B1 com a seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nucleotídeo.
87. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 81 a 86, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade-3' da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' da seção de Hélice B2, a se-qüência de nucleotídeo GNy está disposta na direção 5'-3', em que Ny com-preende zero a seis nucleotídeos, de preferência 0 ou 6 nucleotídeos.
88. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 87, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice A1-N„-Hélice B1-N6N7|cãÍxa AllNil^GNeNa^NJCÃIXA A2|G-NY-Hélice B2-N7-Hélice A2em que:N1 = U, C, AouG;N2 = G ou U;N3=UouC;N4 = U ou A;N5 = G ou A;N6 = G,AouU;N7 = G ou U;N8 = U ou nenhum nucleotídeo;Nx = zero a cinco nucleotídeos;Ny = zero ou seis nucleotídeos; eNz = zero a seis nucleotídeos;em que a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são, emcada caso selecionadas, individual e independentemente uma da outra, dogrupo de seqüências de nucleotídeo compreendendo GGGCG, GGGUG eGGGAG;a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2 compreendem, emcada caso individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nu-cleotídeos em que, de preferência, as seções de Hélice A1 e Hélice A2 sãocompleta ou parcialmente hibridizadas uma com a outra, eas seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nucleotídeosem que, de preferência, as seções de Hélice B1 e Hélice B2 são completaou parcialmente hibridizadas uma com a outra e a região de hibridizaçãocompreende quatro a oito nucleotídeos e em que a soma dos nucleotídeoshibridizados da hibridização da seção de Hélice A1 com a seção de HéliceA2 e da seção de Hélice B1 com a seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nu-cleotídeo.
89. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 87 ou 88, compreendendo uma seqüência selecionado do grupo com-preendendo SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 5,SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 e SEQ. ID. No. 13.
90. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 81 a 86, caracterizado pelo fato de que a extremidade 3' daseção de Caixa A2 é unida diretamente à extremidade 5' da seção de HéliceB2.
91. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 90, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice A1-N„-Hélice B1-N6N7|Caixa Al|NiN2GN8N3N4NjCAlXA A2lHélice B2-N7-Hélice A2em que:Ni = U, C, AouG;N2 = G ou U;N3=UouC;N4= U ou A;N5 = GouA;N6 = G, AouU;N7 = GouU;N8 = U ou nenhum nucleotídeo;Nx = zero a cinco nucleotídeos; eN2 = zero a seis nucleotídeos;em que a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2 são, emcada caso selecionadas, individual e independentemente uma da outra, dogrupo de seqüências de nucleotídeo compreendendo GGGCG, GGGUG eGGGAG;a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2 compreendem, emcada caso individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nu-cleotídeos em que, de preferência, as seções de Hélice A1 e Hélice A2 sãocompleta ou parcialmente hibridizadas uma com a outra, eas seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, quatro a oito nucleotídeosem que, de preferência, as seções de Hélice B1 e Hélice B2 são completaou parcialmente hibridizadas uma com a outra e a região de hibridizaçãocompreende quatro a oito nucleotídeos e em que a soma dos nucleotídeoshibridizados da hibridização da seção de Hélice A1 com a seção de HéliceA2 e da seção de Hélice B1 com a seção Hélice B2 é 10 a 12 pares de nu-cleotídeo.
92. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 90 ou 91, compreendendo a seqüência incluindo SEQ. ID. No. 3.
93. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 88, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice B1-N6N7|CaixaÃllN1N2GN8N3N4N5lCAIXA"Ã2ÍG-NY-Hélice B2
94. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 91, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice B1 -N6N7lCaixa A1|N1 NaGNaIWNsICAIXA A2|Hélice B2
95. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 93, em que a seqüência é selecionada do grupo compreendendoSEQ. ID. No. 15 e SEQ. ID. No. 16.
96. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 58 a 70 e 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que a seçãointermediária Z2 compreende 12 a 25 nucleotídeos.
97. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 96, caracterizado pelo fato de que a seção intermediária Z2 compre-ende uma seção de Hélice C1 e uma seção de Hélice C2.
98. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 97, caracterizado pelo fato de que uma seção central Nc está dispostaentre a seção de Hélice C1 e a seção de Hélice C2.
99. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 97 ou 98, caracterizado pelo fato de que o comprimento da seção deHélice C1 e Hélice C2 é idêntico.
100. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 97 a 99, caracterizado pelo fato de que o comprimento daseção de Hélice C1 e Hélice C2 é, individual e independentemente, três aseis nucleotídeos.
101. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com as reivin-dicações 97 a 100, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice C1 eHélice C2 são completa ou parcialmente hibridizadas uma com a outra.
102. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 96 a 101, caracterizado pelo fato de que a seção central Nccompreende três a cinco nucleotídeos.
103. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 96 a 102, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleicocompreende uma seção de Caixa A1 e uma seção de Caixa A2 em que, en-tre a extremidade 3' da seção de Caixa A1 e a extremidade 5' da seção deHélice C1, uma seqüência de nucleotídeo Nb está disposta e compreendetrês nucleotídeos.
104. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 96 a 103, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleicocompreende uma seção de Caixa A1 e uma seção de Caixa A2 em que, en-tre a extremidade 3' da seção de Hélice C2 e a extremidade 5' da seção deCaixa A2, uma seqüência de nucleotídeo Nd está disposta e compreendedois a cinco nucleotídeos.
105. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 96 a 104, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleicocompreende uma seção de Hélice A1 e uma seção de Hélice A2.
106. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 105, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice A1 e HéliceA2 compreendem, em cada caso individual e independentemente uma daoutra, cinco a seis nucleotídeos em que, de preferência, a seção de HéliceA1 e a seção de Hélice A2 são completa ou parcialmente hibridizadas umacom a outra.
107. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 105 e 106, caracterizado pelo fato de que, entre a extremida-de 3' da seção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, umaseqüência de nucleotídeo Na está disposta, em que Na compreende um acinco nucleotídeos.
108. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 105 a 107, caracterizado pelo fato de que, entre a extremida-de 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2, umaseqüência de nucleotídeo GNe está disposta na direção 5'-3', em que Necompreende um a dois nucleotídeos, de preferência A ou UU.
109. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 105 a 108, caracterizado pelo fato de que a seção de HéliceC1 e a seção de Hélice C2 têm, em cada caso individual e independente-mente uma da outra, um comprimento de cinco ou seis nucleotídeos em que,de preferência, as seções de Hélice C1 e Hélice C2 são completa ou parci-almente hibridizadas uma com a outra.
110. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 109, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice A1-Na-|Caixa Al|-Nb-i'HelÍce C1 i-NcnHélice"C2|-Nd-|Caixa"Ã2|-G-Ne Héli-ce A2 (III)em que:Na = um a cinco nucleotídeos;Nb = três nucleotídeos;Nc = três a cinco nucleotídeos;Nd = dois a cinco nucleotídeos; eNc = um a dois nucleotídeos, de preferência A ou UU;a seção de Caixa A1 e a seção de Caixa A2, em cada caso, sãoselecionadas, individual e independentemente uma da outra, do grupo com-preendendo GGGCG, GGGUG e GGGAG,as seções de Hélice A1 e Hélice A2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente uma da outra, cinco ou seis nucleotídeos,eas seções de Hélice C1 e Hélice C2 compreendem, em cadacaso, cinco ou seis nucleotídeos os quais são, de preferência, completa ouparcialmente hibridizados uns com os outros.
111. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 110, compreendendo uma seqüência a qual é selecionada do grupoincluindo SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 11,SEQ. ID. No. 14, SEQ. ID. No. 22 e SEQ. ID. No. 24.
112. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 96 a 101, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleicocompreende uma seção de Caixa A1 e uma seção de Hélice C1, em que umnucleotídeo A está disposto entre a extremidade 3' da seção de Caixa A1 e aextremidade 5' da seção de Hélice C1.
113. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 112, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende umaseção de Hélice C2 e uma seção de Caixa A2, em que um nucleotídeo Gestá disposto entre a extremidade 3' da seção de Hélice C2 e a extremidadeda seção de Caixa A2.
114. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 112 ou 113, caracterizado pelo fato de que a seção central Nc com-preende quatro nucleotídeos, em que Nc é, de preferência, GAUG.
115. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 112 a 114, compreendendo uma seção de Hélice B1 e umaseção de Hélice B2.
116. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 115, caracterizado pelo fato de que as seções de Hélice B1 e HéliceB2 compreendem, individual e independentemente uma da outra em cadacaso, cinco nucleotídeos em que, de preferência, a seção de Hélice B1 éhibridizada com a seção de Hélice B2.
117. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 115 ou 116, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' daseção de Hélice B1 e a extremidade 5' da seção de Caixa A1, uma seqüên-cia de nucleotídeo compreendendo dois nucleotídeos Nj está disposta, emque Nj é, de preferência, AG.
118. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 115 a 117, caracterizado pelo fato de que um nucleotídeo Gestá disposto entre a extremidade 3' da seção de Caixa A2 e a extremidade-5'de Hélice B2.
119. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 112 a 118, compreendendo uma seção de Hélice A1 e umaseção de Hélice A2.
120. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 119, em que as seções de Hélice A1 e Hélice A2 compreendem, indi-vidual e independentemente uma da outra em cada caso seis nucleotídeose, de preferência, a seção de Hélice A1 e a seção de Hélice A2 são hibridi-zadas uma com a outra.
121. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que, entre a extremidade 3' daseção de Hélice A1 e a extremidade 5' da seção de Hélice B1, uma seqüên-cia de nucleotídeo compreendendo dois nucleotídeos Nj está disposta, emque Ni é, de preferência, CA.
122. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 119 a 121, caracterizado pelo fato de que um nucleotídeo Aestá disposto entre a extremidade 3' da seção de Hélice B2 e a extremidade 5' da seção de Hélice A2.
123. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com uma dasreivindicações 112 a 122, caracterizado pelo fato de que as seções de Héli-ce C1 e Hélice C2, em cada caso, compreendem três nucleotídeos em que,de preferência, as seções de Hélice C1 e Hélice C2 são hibridizadas umacom a outra.
124. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 123, compreendendo a seguinte estrutura:Hélice A1-Ni-Hélice B1 -NrlCaixa AÍl-A-ÍHé"Íic"e ~CJi-Nc-ÍHéTice ~C2i-G-|CaixaA2|-G-Hélice B2-A -Hélice A2em que:Ni compreende dois nucleotídeos e é, de preferência, CA;Nj compreende dois nucleotídeos e é, de preferência, AG;Nc compreende quatro nucleotídeos e é, de preferência, GAUG;as seções Caixa A1 e Caixa A2 são, em cada caso seleciona-das, individual e independentemente uma da outra, do grupo compreenden-do as seqüências GGGCG, GGGUG e GGGAG;as seções de Hélice A1 e Hélice A2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente, seis nucleotídeos os quais são, de prefe-rência, hibridizadas uma com a outra;as seções de Hélice B1 e Hélice B2 compreendem, em cada ca-so individual e independentemente, cinco nucleotídeos em que, de preferên-cia, a seção de Hélice B1 e a seção de Hélice B2 são hibridizadas uma coma outra, eas seções de Hélice C1 e Hélice ,C2 compreendem, em cadacaso individual e independentemente, três nucleotídeos em que, de prefe-rência, as seções de Hélice C1 e Hélice C2 são hibridizadas uma com a ou-tra.
125. Ácido nucleico de HMGA-ligação de acordo com a reivindi-cação 124, compreendendo uma seqüência que é selecionada do grupo in-cluindo SEQ. ID. No. 12.
126. Ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 57 a125, caracterizado pelo fato de que ele se liga a fatores de transcrição, emparticular fatores de transcrição que compreendem um gancho AT.
127. Ácido nucleico de ligação a um fator de transcrição com-preendendo um gancho AT, em que o ácido nucleico tem uma estrutura deacordo com uma das reivindicações 57 a 126.
128. Composição de acordo com uma das reivindicações 37 a52, em que o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com uma dasreivindicações 57 a 127.
129. Uso de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, em que oácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações-57 a 127.
130. Método de acordo com uma das reivindicações 9 a 16, emque o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com uma das reivindi-cações 57 a 127.
131. Uso de acordo com uma das reivindicações 17 a 26, emque o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com uma das reivindi-cações 57 a 127.
132. Método de acordo com uma das reivindicações 27 a 36, emque o ácido L-nucleico é um ácido nucleico de acordo com uma das reivindi-cações 57 a 127.
133. Método para seleção de um antagonista de HMGA ou ago-nista de HMGA, compreendendo as seguintes etapas:- fornecimento de um antagonista de HMGA candidato e/ou umagonista de HMGA candidato,- fornecimento de um ácido nucleico de acordo com uma dasreivindicações 57 a 127,- fornecimento de um sistema de teste, o qual distribui um sinalna presença de um antagonista de HMGA e/ou um agonista de HMGA, e- determinação se o antagonista de HMGA candidato é um anta-gonista de HMGA e/ou se o agonista de HMGA candidato é um agonista deHMGA.
134. Método para seleção de um agonista de HMGA e/ou umantagonista de HMGA, compreendendo as seguintes etapas:- fornecimento de uma HMGA imobilizada sobre uma fase, depreferência uma fase sólida,- fornecimento de um ácido nucleico de acordo com uma dasreivindicações 57 a 127, de preferência um ácido nucleico de acordo comuma das reivindicações 57 a 127 que é rotulado,- adição de um agonista de HMGA candidato e/ou um antagonis-ta de HMGA candidato, e- determinação se o agonista de HMGA candidato é um agonistade HMGA e/ou se o antagonista de HMGA candidato é um antagonista deHMGA.
135. Método de acordo com a reivindicação 134, caracterizadopelo fato de que a determinação é realizada através de testagem se o ácidonucleico é substituído pelo agonista de HMGA candidato ou pelo antagonistade HMGA candidato.
136. Kit para a detecção de HMGA, compreendendo um ácidonucleico de acordo com uma das reivindicações 57 a 127.
137. Antagonista de HMGA, obtenível através de um método deacordo com uma das reivindicações 134 e 135.
138. Agonista de HMGA, obtenível através de um método deacordo com uma das reivindicações 134 e 135.
139. Complexo compreendendo uma proteína HMGA e um ácidonucleico de acordo com uma das reivindicações 57 a 127.
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