CN117844812A - 一种核酸适体在制备分子胶蛋白降解剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸适体在制备分子胶蛋白降解剂中的应用。这是一种新的基于泛素化‑蛋白酶体系统的核酸适体分子胶降解剂。由于核酸适体分子胶降解剂可实现剂量依赖性降解肿瘤中高表达的核仁素蛋白，因此，可以实现肿瘤的靶向性治疗。由于识别的标志性蛋白核仁素蛋白在多种肿瘤细胞表面高表达，因此，该核酸适体的特异性识别核仁素可以用于多种肿瘤细胞的研究。由于核仁素蛋白可以被细胞内化，因此，可以将靶向核仁素的核酸适体作为靶向配体，为药物的靶向递送提供工具。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种核酸适体在制备分子胶蛋白降解剂中的应用。
背景技术
核酸适体(aptamer)是一种通过SELEX(指数富集的配体系统进化)技术从随机单链寡聚核苷酸库中筛选出来的能高亲和性结合靶分子的单链DNA或RNA。适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。因此，适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。
多数肿瘤的发生和发展与蛋白的异常表达密切相关，异常表达的蛋白不仅可作为肿瘤诊断和预后评估的理想标记分子，而且可成为抗肿瘤治疗的有效靶点。靶向蛋白降解技术是一种利用真核细胞内天然存在的蛋白降解系统直接降解疾病相关蛋白的新技术。其中分子胶蛋白降解剂是基于泛素化-蛋白酶体系统的蛋白降解技术。分子胶是一种诱导接近的小分子，通过诱导或稳定E3泛素连接酶与靶蛋白间的新型相互作用，导致靶蛋白被多聚泛素化修饰并发生依赖蛋白酶体降解。不同于传统占位驱动作用模式，事件驱动作用模式的分子胶降解剂具有两个主要优势：(1)靶向不可成药蛋白，靶标范围显著扩大。分子胶不需要在靶蛋白上有结合口袋，或者只需要与靶蛋白实现弱结合，即可降解先前不可接近或不可破坏的靶蛋白；(2)药物安全性高，极低剂量即可发挥作用。分子胶的生效机制类似催化反应，允许目标以亚化学计量的量驱动靶标泛素化降解，因此只需要极低剂量即可发挥效用，有望实现低剂量、低频次用药。但分子胶蛋白降解剂仍然面临着一些难以解决的问题和挑战。首先，分子胶药物大部分来源于小分子化合物，新型分子胶降解剂仍有待研发。目前只有极少数分子胶降解剂被偶然发现，并且可作为分子胶降解剂的小分子化合物种类较少，极大地限制了分子胶药物的开发和应用。其次，分子胶降解剂没有明确靶向，肿瘤靶向性的缺乏在一定程度上限制了分子胶降解剂抗肿瘤药物的开发和临床转化。
核仁素是一种重要的多功能蛋白，由710个氨基酸组成，结构上分为三个结构域：N端结构域存在核定位信号和多个磷酸化位点；中央结构域又称RNA结合结构域，含有4个RNA识别基序；C端为富含甘氨酸和精氨酸结构域。核仁素是一种核仁-细胞质-细胞膜穿梭蛋白，主要分布在细胞核仁中，参与核糖体的合成、rRNA的转录、mRNA的稳定等多项生命活动，是细胞存活和增殖的基础。相较于正常细胞，核仁素高表达于肿瘤细胞的细胞膜，并且是多种蛋白分子的受体或共受体，参与肿瘤的血管生成、迁移、增殖、凋亡和分化等。研究发现，在肿瘤细胞中，核仁素表达模式改变，蛋白稳态失衡引起核仁素水平升高，尤其是细胞膜的表达量明显上调。因此，核仁素是一个理想的靶标，被认为是一种有效的肿瘤标志物和抗肿瘤治疗靶标。我们通过一系列实验证明核酸适体HL识别肿瘤细胞的机制是通过结合细胞表面的核仁素蛋白，通过分子胶降解机制引起核仁素蛋白的降解，这为肿瘤的诊断和治疗研究提供了新的方法和手段。
靶向配体在抗肿瘤药物靶向传递方面有很大的应用潜能。其对靶分子结合的选择性可赋予抗癌药物靶向特异性，同时增加药物在病变组织内的富集。目前研究比较多的配体包括抗体、多肽、小分子等。抗体通常对靶点具有高亲和力，但免疫原性高。多肽分子量小且易于合成,但多肽在体循环中易于酶解，不适合在体内应用。小分子化合物，如叶酸(folic acid,FA)，分子量小，稳定性好，但对肿瘤靶向性不高，因为肾近端小管和脑血管脉络丛同样有高表达的叶酸受体。和这些配体相比，核酸适体可体外合成且易于修饰，因其带负电荷，在体循环中很少参加非特异性相互作用。同时，它们能高亲和力高特异性地结合靶分子，分子量小，使其具有很高的组织穿透性。由于核仁素蛋白在很多肿瘤细胞表面都高表达而且可以连续被细胞内化，因此，特异性结合核仁素的核酸适体，可以作为优秀的靶向配体，为药物的靶向递送提供工具。
发明内容
本发明的目的是旨在克服现有的技术不足，提供一种新型核酸适体分子，该类分子能够作为分子胶蛋白降解剂，特异性识别并降解核仁素蛋白，也能作为靶向配体，通过识别核仁素蛋白并快速内化进入细胞。
一种核酸适体，序列如下：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGGGGGGTGGGGTTAGGTTTGTTATGGACACG GTGGCTTAGT-3’；SEQ NO.1。
一种核酸适体或其衍生物，通过对上述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体；
或者对上述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到具有相同功能的核酸适体衍生物；
所述的相同功能包括以下至少一种：
1)特异性识别和/或结合核仁素蛋白；
2)特异性降解核仁素蛋白；
3)抑制肿瘤细胞。
进一步地，所述的核仁素蛋白包括肿瘤细胞的核仁素蛋白。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在制备识别核仁素蛋白制剂中的应用。
本发明还提供了一种识别核仁素蛋白的方法，使用上述的核酸适体或其衍生物进行识别。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在制备肿瘤诊断制剂中的应用。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在在制备肿瘤治疗制剂中的应用。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在制备降解核仁素蛋白制剂中的应用。
本发明还提供了一种降解核仁素蛋白的方法，使用上述的核酸适体或其衍生物进行降解。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在制备分子胶蛋白降解剂中的应用。
本发明还提供了上述的核酸适体或其衍生物在制备靶向载药制剂中的应用。
本发明方法可以仅用于科研，尤其是用于肿瘤细胞和正常细胞之间的差异化研究。
本发明为了鉴定核酸适体的靶标，方法为：
①通过胰蛋白酶实验证明HL结合细胞的膜蛋白；
②利用低渗缓冲液提取细胞膜蛋白；
③将生物素标记的HL或文库与膜蛋白孵育，再与琼脂糖珠孵育，离心得到与HL、文库结合的蛋白；
④利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析HL与文库的差异蛋白；
⑤切出差异蛋白，酶解，上质谱分析蛋白样品；
⑥再利用Knock down等技术验证质谱结果。
本发明的有益效果：
(1)核酸适体可体外合成且易于修饰，合成方便，成本低，具有高的穿透性，对靶物质可高亲和力并特异性地结合，显著优于其它识别标记物，如抗体等。
(2)提供一种新型核酸适体分子胶降解剂，可以特异性降解核仁素蛋白。由于核仁素是肿瘤细胞增殖、存活的标记，该核酸适体可以用来靶向降解核仁素蛋白发挥抗肿瘤治疗的功能。
(3)提供了一种新的可识别细胞表面标志性蛋白核仁素的核酸适体，可以用于肿瘤细胞和正常细胞之间的差异化研究。而且由于识别的标志性蛋白核仁素在多种肿瘤细胞表面高表达，该核酸适体可以用于多种肿瘤细胞的识别诊断。
(4)由于核仁素蛋白在很多肿瘤表面都高表达且可以连续被细胞内化，所以可以将特异性结合核仁素的核酸适体作为靶向配体，与抗肿瘤药物偶联构建靶向递送系统，用于肿瘤的靶向性治疗。
附图说明
图1核酸适体HL的靶标类型和靶标鉴定。
图2为确定HL的靶标蛋白是NCL的示意图。
图3为HL与HeLa细胞的NCL存在共定位示意图。
图4为通过敲低实验确定HL依赖NCL结合HeLa细胞示意图。
图5为适体HL对HeLa细胞的结合能力表征
图6为适体HL可特异性结合HeLa细胞示意图。
图7为HL可内化进入HeLa细胞并进入细胞核示意图。
图8为HL特异性降低靶蛋白NCL的蛋白水平示意图。
图9为HL通过蛋白酶体途径影响靶蛋白NCL的蛋白水平示意图。
图10为HL促进HeLa细胞中靶标蛋白NCL与泛素E3连接酶DDB1相互作用示意图。
图11为HL增强靶蛋白NCL的泛素化水平示意图。
图12为检测HL对人宫颈癌Hela细胞中靶蛋白NCL的降解效率。
图13为使用CCK8法检测HL对人宫颈癌Hela细胞的增殖影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。
细胞来源：
以下实施例中用到的宫颈癌细胞株HeLa来自上海细胞库。
Washing buffer：PBS溶液中含以下物质:5mM MgCl2，4.5g/L葡萄糖；
Binding buffer：PBS溶液中含以下物质：5mM MgCl2，4.5g/L葡萄糖,0.1mg/mLyeast tRNA,1mg/mL BSA and 20％ FBS。
低渗缓冲液：取25.2mL的Washing buffer于50mL离心管中，分别向其中加入3mL10×cocktail，1.5mL 1M的Tris-HCl，300μ100×的PMSF，震荡混匀后4℃保存。
膜蛋白裂解液：取5mL的低渗缓冲液于15mL的离心管中，向管中加入50μL的Triton-X-100，4℃保存。
购买的试剂：
ELISA试剂盒购于BD公司，该试剂盒包括：coating buffer(涂层缓冲液)，assaydiluent(封闭液)，SAv-HRP(链霉亲和素包被的HRP试剂)，substrate solution(底物溶液)，stop solution(终止溶液)等。
DPBS、BSA、EDTA、胰蛋白酶、蛋白酶K、RNAiMAX转染试剂、无血清DMEM培养基等购于赛默飞公司。
cocktail，PMSF，Triton-X-100购于sigma公司。
HRP-conjugated goat anti-mouse购于Jackson Immuno Research。
ECL化学发光液、TEAA、CCK-8、loading buffer、丙烯酰胶、Tris-HCl、SDS、APS、TEMED、溴酚蓝、考马斯亮蓝染色液等购于碧云天公司。
链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠购于GE公司。
HL：
ATCCAGAGTGACGCAGCAGGGGGGTGGGGTTAGGTTTGTTATGGACA CGGTGGCTTAGT，SEQNO.1。
本发明所有的对照组control均为：
ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTA TTAT，SEQNO.5。
实施例1：核酸适体HL的靶标类型和靶标鉴定
在HL与HeLa细胞孵育前，利用胰酶或者蛋白酶K消化细胞膜蛋白，通过流式细胞仪检测细胞荧光强度。结果如图1(A)所示，被胰酶或者蛋白酶K处理的细胞，与HL孵育后，未见检测到明显的荧光信号。说明细胞膜蛋白被消化后，HL丧失了与细胞的结合能力，因此证明了HL结合细胞上的靶标类型是细胞膜蛋白。通过开展蛋白质谱实验，为了明确目的蛋白的位置，加入了竞争组，即在biotin修饰的HL与蛋白孵育后，加入一倍或者四倍浓度的未修饰的HL，竞争biotin标记的HL与靶蛋白的结合。结果如图1(B)所示，相较于对照组，核酸适体HL组在100-150kDa之间有一条显著的差异条带，随着未修饰的HL链浓度的增加，此条带呈现梯度减弱的现象，表明100-150kDa之间的条带可能为HL靶标蛋白所在区域，因此将红色区标记条带以及相同位置处Control组的条带送去公司进行质谱的分析，结果如表1所示，在差异条带中共检测到的蛋白质中核仁素排在第一位，远且条带覆盖率达到了51％。考虑到核仁素为一种穿梭蛋白，我们推测核仁素蛋白很可能是HL结合的靶标(排在第二、三、四位的蛋白均为角蛋白，多来源于头发和皮肤的蛋白，排在第五位的蛋白为白介素增强结合因子3，是双链RNA结合蛋白，多位于细胞核，其出现可能是由于操作处理过程不当造成)。
表1
实施例2：确定HL的靶标蛋白是NCL
NCL蛋白是质谱得分以及差异度较高的蛋白，同时它也是一种仅在肿瘤细胞膜高表达的蛋白，因此我们初步认为NCL是HL的候选靶标。肽谱图如图2(A)所示，提示NCL是核酸适体的靶蛋白，通过aptamer-pull down实验，并进行western blotting实验，结果如图2(B)所示，NCL蛋白只存在于biotin-HL组，而不存在于Control组，表明HL与NCL蛋白之间存在相互作用。
实施例3：HL与HeLa细胞的NCL存在共定位
将Cy5修饰的HL和NCL一抗，共同加入到细胞中进行孵育后，使用鼠抗IgG Alexa488二抗对NCL一抗进行显色，随后用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像。如图3所示，绿色荧光通道和红色通道分别为NCL蛋白以及核酸适体HL在细胞中定位情况。在两个通道的合并图像中观察到强烈的黄色信号，表明核酸适体和NCL之间的存在共定位。计算适体与蛋白之间的皮尔森(Pearson)相关系数，发现NCL与HL皮尔森相关系数分别为0.417，这表明HL都与NCL蛋白质之间存在共定位。
实施例4：HL依赖NCL结合HeLa细胞
构建了两条不同序列的NCL-siRNA(siNCL)及无关序列NC，具体序列见表2，转染siRNA到HeLa细胞内。48h之后，检测NCL蛋白表达情况。结果如图4(A)所示，两条siNCL都能敲低NCL。进一步与HL孵育，当NCL蛋白被siRNA敲低之后，HL与细胞的结合能力被削弱，表明HL与细胞结合依赖于NCL(图4(B))。
表2
实施例5：HL对HeLa细胞的结合能力表征
通过流式细胞术实验，检测了HL与HeLa细胞结合的平衡解离常(Kd)数值。将不同浓度的FITC修饰的HL或者Control与靶细胞在37℃下孵育40min，随后流式细胞仪检测细胞的荧光信号，读取每组细胞的荧光值，计算Kd并绘制解离曲线。如图5所示，HL与HeLa细胞结合的解离系数为27.28±14.12nM，这表明核酸适体HL与HeLa细胞结合有较强的亲和力。
实施例6：HL可特异性结合HeLa细胞
将FITC修饰的HL与HeLa细胞在37℃下进行孵育，随后通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度。如图6(A)所示，与Control序列对比，由于核酸适体HL可以特异性结合HeLa细胞，导致细胞呈现显著的荧光信号。当HeLa细胞与修饰了FITC的HL或者Control进行孵育后，使用激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光强度。如图6(B)发现只有HL与HeLa细胞具有明显较强的荧光。同时，当Control与HeLa细胞孵育后成像，细胞没有荧光。结果表明了核酸适体HL具备特异性识别并结合HeLa细胞的能力。
实施例7：HL可内化进入HeLa细胞，并进入细胞核
利用流式细胞仪开展了核酸适体内化实验。首先让HL与细胞在37℃下孵育2h，随后使用蛋白酶或者胰酶消化细胞膜蛋白，去除细胞膜上结合的HL链。通过多次洗脱后，使用流式细胞仪检测细胞荧光强度变化。实验结果如图7(A)所示，在细胞孵育HL之后，消化细胞膜上的蛋白，发现细胞荧光虽然有所减弱，但是仍然具有较强的荧光，说明了核酸适体HL可以内化入细胞。通过核质分离实验分别提取HeLa细胞中的细胞质、细胞核，通过PCR检测不同部位的HL的量，结果如图7(B)所示，在细胞质和细胞核内均检测到HL的分布，证明HL具有较强的内化能力，能够进入细胞核。
实施例8：HL降低靶蛋白NCL的蛋白水平
将不同浓度的HL加入到HeLa细胞中，孵育5h后，提取蛋白，开展western blotting实验，对NCL蛋白表达情况进行了表征。结果如图8(A)所示，核酸适体浓度从50nM到500nM，都能够下调HeLa细胞中NCL蛋白表达水平。同时探究Control链对NCL蛋白水平的影响，结果如图8(B)所示，Control链不影响NCL的蛋白水平，即核酸适体HL能够特异性降低NCL的蛋白水平。
实施例9：HL通过蛋白酶体途径影响靶蛋白NCL的蛋白水平
在HeLa细胞中，提前给予50nM浓度的Control、HL处理细胞5h后，提取RNA，进行RT-PCR实验，分析HL的加入对HeLa细胞内NCL的mRNA水平的影响。结果如图9(A)所示，相较于Control组，50nM浓度的HL处理细胞5h后，NCLmRNA水平没有明显的下调，证明了HL介导的NCL蛋白的下调不是在其转录水平，而是在蛋白水平。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞1h后，加入50nM浓度的HL共孵育5h，提取蛋白，通过western blotting实验检测NCL蛋白表达情况。结果如图9(B)所示，当蛋白酶体途径被抑制后，HL诱导的NCL蛋白下降被阻断，说明了HL通过蛋白酶体途径影响靶蛋白NCL的蛋白水平。
实施例10：HL诱导靶蛋白NCL与E3泛素连接酶DDB1之间的相互作用
利用Gateway实验技术，将NCL基因全长(NM_005381.3)构建至pEGFP-C1载体(购自于Clontech公司)中，构建带有GFP标签的NCL质粒。在3组HeLa细胞中第1组转染pEGFP-C1(空载体)、第2和第3组均转染GFP-NCL质粒，24h后，在3组HeLa细胞中分别加入1μM浓度的Control(第1组)、Control(第2组)、HL(第3组)，孵育6h后，分别提取蛋白进行Co-IP实验，利用anti-GFP的磁珠沉降，anti-DDB1、anti-CAND1、anti-CUL4B、anti-CUL4A的抗体进行印迹，检测与GFP-NCL与上述E3泛素连接酶之间的相互作用。实验结果如图10所示，对比Control组，HL的加入诱导了靶蛋白NCL与E3泛素连接酶DDB1之间新的相互作用，而不影响NCL与CAND1、CUL4B、CUL4A之间的相互作用。分子胶降解剂一般通过结合E3泛素连接酶并修饰其分子表面，并诱导E3泛素连接酶底物受体与靶蛋白之间发生新的相互作用(正常情况下两者原先没有相互作用)，并且在E3泛素连接酶的作用下，导致靶蛋白的降解。因此，图10实验结果提示核酸适体HL以分子胶作用机制诱导了NCL与DDB1之间新的相互作用。
实施例11：HL增强靶蛋白NCL的泛素化水平
在HeLa细胞中转染pEGFP-C1(第1组)、GFP-NCL质粒(第2组)、GFP-NCL质粒(第3组)，24h后往HeLa细胞中加入MG132进行预处理1h，以抑制被泛素分子标记的蛋白被蛋白酶体识别降解；接着分别加入了1μM浓度的Control(第1组)、Control(第2组)、HL(第3组)，5h后，提取蛋白，利用anti-GFP磁珠沉降靶蛋白，anti-Ub抗体进行印迹，检测GFP-NCL蛋白的泛素化变化情况。实验结果如图11所示，对比Control组，HL的加入使NCL蛋白的泛素化修饰条带明显增强，这表明HL促进NCL蛋白上多聚泛素链的累积，增加了NCL蛋白的泛素化修饰水平。
实施例12：HL对人宫颈癌Hela细胞中靶蛋白NCL的降解效率
分别加入0，0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM，2μM的HL处理HeLa细胞，孵育6h后，收集蛋白裂解液进行蛋白印迹实验，分析NCL的蛋白水平，利用Image J软件对NCL的蛋白水平进行灰度分析，利用Prism 8.0软件计算DC50值和DCmax值，并拟合HL的降解能力曲线。结果如图12所示，HL降解靶蛋白NCL的DC50＝0.073μM，DCmax＝94.3％，HL对靶蛋白NCL具有非常明显的降解效果，具有良好的成药性。
实施例13：HL对人宫颈癌Hela细胞的增殖影响
将对数生长期的HeLa细胞调节细胞浓度至1×105个/mL在96孔板中铺板，100μL/孔，每孔接种103个细胞，培养24h。随后将不同浓度的HL或者Control链与细胞进行孵育，继续培养72h或者96h。随后加入1/10的CCK-8试剂，用酶标仪检测细胞在450nm处的吸光度，分析细胞活力，绘制细胞增殖折线图。结果如图13所示，在72h时，核酸适体HL能够显著抑制HeLa细胞的增殖，其IC50为2.803μM。随着时间延长至96h，HL表现更加显著的细胞特异性增殖抑制现象，在HeLa细胞中的IC50为1.562μM。这表明HL能够有效的抑制HeLa细胞的增殖，且这种抗肿瘤增殖活性随着时间的延长，效果更加显著。
Claims (10)
1.一种核酸适体，序列如下：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAGGGGGGTGGGGTTAGGTTTGTTATGGACACGGTGGCTTAGT-3’。
2.一种核酸适体或其衍生物，其特征在于，通过对权利要求1所述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体；
或者对权利要求1所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到具有相同功能的核酸适体衍生物；
所述的相同功能包括以下至少一种：
1)特异性识别和/或结合核仁素蛋白；
2)特异性降解核仁素蛋白；
3)抑制肿瘤细胞。
3.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备识别核仁素蛋白制剂中的应用。
4.一种识别核仁素蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物进行识别。
5.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备肿瘤诊断制剂中的应用。
6.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备肿瘤治疗制剂中的应用。
7.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备降解核仁素蛋白制剂中的应用。
8.一种降解核仁素蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物进行降解。
9.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备分子胶蛋白降解剂中的应用。
10.权利要求1所述的核酸适体，或者权利要求2所述的核酸适体或其衍生物在制备靶向载药制剂中的应用。
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