JP5749707B2 - アルデヒド含有製品からアルデヒドを減少させるための酵素の使用 - Google Patents
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Description
配列番号1
ホルムアルデヒドジスムターゼの核酸配列、GenBank受入番号L25862 (CDS 323..1522)。
配列番号2
ホルムアルデヒドジスムターゼのタンパク質配列、GenBank受入番号L25862。
配列番号3
Pseudomonas putida F61由来FDM(1197 bp)の最適化されたDNA配列。
配列番号4
pDHE-FDMのヌクレオチド配列。
配列番号5
pAgroのヌクレオチド配列。
配列番号6
pHSGのヌクレオチド配列。
配列番号7
ホルムアルデヒドジスムターゼIle-301-Leuの核酸配列。
配列番号8
ホルムアルデヒドジスムターゼIle-301-Leuのタンパク質配列。
配列番号9
ホルムアルデヒドジスムターゼPhe-93-Ala / Ile-301-Leuの核酸配列。
配列番号10
ホルムアルデヒドジスムターゼPhe-93-Ala / Ile-301-Leuのタンパク質配列。
当然のことながら、本発明は、そのように記載された特定の方法論、プロトコール、細胞株、植物種または属、構築物、および試薬に限定されない。やはり当然のことながら、本明細書で使用される専門用語は、個別の実施形態を説明することだけを目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形"a"、"an"、および"the"は、文脈から明らかにそうでないと指示されない限り、複数の指示を含んでいる。したがって、たとえば、"a vector"「ベクター(単数)」は、1つもしくは複数のベクターへの言及であり、当業者に公知のその同等物を含んでおり、その他も同様である。「約」という表現は、本明細書において、「およそ」、「ざっと」、「〜前後」、または「〜の辺り」を意味するために使用される。「約」という表現が数字で表した範囲とともに使用される場合、その境界を表記された数値の上および下に広げることによってその範囲を加減する。一般に、「約」という表現は、本明細書において、数値を、表記された数値の上下に、20%、好ましくは10%の相違分だけ上下に(高く、または低く)加減するために使用される。本明細書において、「または」という用語は、ある特定の一覧の任意のいずれかのメンバーを意味し、その一覧のメンバーの任意の組合せを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において相互に置き換え可能なものとして使用され、ペプチド結合により互いに連結された、任意の長さの重合したアミノ酸を表す。
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」「核酸分子」という用語は、本明細書において相互に置き換え可能なものとして使用され、分枝せずに重合した任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか一方、またはこの2つの組み合わせを表す。
タンパク質の「ホモログ」は、当該の非改変タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を有し、しかも元の非改変タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を含んでいる。
「誘導体」には、当該タンパク質のような天然型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然に存在しないアミノ酸残基によるアミノ酸置換、または天然に存在しないアミノ酸残基の付加を含んでいると考えられるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドが含まれる。タンパク質の「誘導体」には、天然型のポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、天然に存在する改変された(グリコシル化、アシル化、プレニル化、リン酸化、ミリストイル化、硫酸化など)アミノ酸残基、または天然に存在しない改変されたアミノ酸残基を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドも含まれる。誘導体は、元のアミノ酸配列と比較して、1つもしくは複数の非アミノ酸置換または付加を含んでいてもよく、たとえば、アミノ酸配列に共有結合もしくは非共有結合したレポーター分子もしくは他のリガンド、たとえば、検出を容易にするために結合させたレポーター分子、ならびに天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して天然に存在しないアミノ酸残基を含んでいてもよい。さらに、誘導体には、天然型タンパク質と、FLAG、HIS6もしくはチオレドキシンなどのタグを付るペプチドとの融合物も含まれる(タグを付けるペプチドに関する総説については、Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003を参照されたい)。
本発明は、ホルムアルデヒド含有製剤中のホルムアルデヒド含量を減少させるために、ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品を使用することに関する。
本発明のタンパク質
本発明は、具体的に明記された「アルデヒドジスムターゼ活性を有するタンパク質」に限定されず、それと機能的に同等なものにも及ぶ。
上記の意味における「機能的同等物」はまた、記載されたポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。
(i) 配列番号8または10のうちいずれか1つによって表されるアミノ酸配列;
(ii) 配列番号8または10のうちいずれか1つによって表されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%配列同一性を有するアミノ酸配列;
(iii) 上記(i)もしくは(ii)で与えられるアミノ酸配列のうちいずれかの誘導体。
本発明はまた、本明細書に記載の酵素をコードする核酸配列に関する。
あるいはまた、同一性は、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500、ウェブページ:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html、ならびに下記の設定にしたがって決定することができる:
本明細書に記載のあらゆる核酸配列(一本鎖および二本鎖DNAおよびRNA配列、たとえばcDNAおよびmRNA)は、既知の方法で、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成、たとえば、二重らせんの個々のオーバーラップした相補的核酸ビルディングブロックのフラグメント縮合によって作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、たとえば、既知の方法で、ホスホアミダイト法(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897)によって実施することができる。合成オリゴヌクレオチドを集積すること、およびDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてギャップを埋めること、およびライゲーション反応、ならびに一般的なクローニング法は、Sambrook et al. (1989)に記載されているが、以下を参照されたい。
(i) 配列番号7または9のいずれか1つで表される核酸;
(ii) 配列番号7または9のいずれか1つで表される核酸と相補的な核酸;
(iii) 好ましくは遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号8または10のいずれか1つで表されるポリペプチドをコードする核酸であって、この単離された核酸が、配列番号8または10のいずれか1つにより表されるポリペプチド配列に由来するといえる、前記核酸;
(iv) 配列番号7または9の核酸配列のいずれかと、少なくとも30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の配列同一性を有する核酸;
(v) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(i)から(iv)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(vi) アルデヒドジスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、そのポリペプチドが、配列番号8または10のいずれか1つにより表されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の配列同一性を有する、前記核酸。
本発明はまた、核酸制御配列の遺伝的制御下で、本発明のポリペプチドもしくは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現構築物;ならびに少なくとも1つのこうした発現構築物を含んでなるベクターに関する。
文脈に応じて、「微生物」という用語は、出発微生物(野生型)もしくは本発明にしたがって遺伝的に改変された微生物、またはその両者を意味する。
本発明はまた、本発明のタンパク質を発現する微生物を培養し、その培養物から所望の生成物を単離することによって、前記タンパク質を製造するための方法に関する。
本発明はまた、アルデヒドジスムターゼ活性を有し、配列番号2のバリアントを含有する単離されたポリペプチドを、アルデヒド含有製剤中のアルデヒド含量を減少させるために使用することに関するが、このバリアントにおいて、配列番号2の93位のフェニルアラニン、および/または配列番号2の301位のイソロイシン、および/または配列番号2の337位のメチオニン、および/または配列番号2の127位のフェニルアラニンが他の任意のアミノ酸により置換されている。
下記の手順は、既述のプロトコール(Yanase, H., Moriya, K., Mukai, N., Kawata, Y., Okamoto, K., Kato, N. (2002) Effects of GroESL Coexpression on the Folding of Nicotinoprotein Formaldehyde Dismutase from Pseudomonas putida F61 Biosci. Bitechnol. Biochem., 66(1), 85-91)に基づいており、さらに最適化された。FDMをコードする遺伝子のコドン使用頻度は大腸菌に最適化した。新たなDNA配列を合成し、ラムノース誘導性発現ベクターであるpDHE(配列番号4)にクローニングした。GroEL/Sシャペロンは可溶性FDMの産生に必要であって、IPTG誘導性pAgroベクター(配列番号5)にクローニングされている。lacリプレッサーはpHSGベクター(配列番号6)によりコードされる。FDMの発現は大腸菌TG10、すなわちTG1に由来するラムノースイソメラーゼを持たない菌株、を用いて行われた。pAgroおよびpHSGを含有するTG10細胞(TG10+)は、pDHE-FDMで形質転換し、アンピシリン(pDHE)、スペクチノマイシン(pAgro)およびクロラムフェニコール(pHSG)存在下、LB中で37℃にて5時間培養した。この培養物5 mlを、100μM IPTGおよび0.5 g/lラムノースを含有する同じ培地、500 mLに移した。37℃にて約18時間、誘導を行った。遠心により細胞を集め、溶解バッファー(10 mM KH2PO4、pH 7、0.5 mM MgCl2、140 μM PMSF)に再懸濁した。超音波処理によって細胞の溶解を起こさせた(<1’, 1s/1s> x10、振幅70%)。37℃で10'インキュベートして遠心後、透明な溶解液に硫酸アンモニウムを50%飽和まで加えた。不要なタンパク質(たとえばシャペロン)を氷上で2-4時間沈殿させた。
FDM活性は、20 mMホルムアルデヒド、100 mM KCl、0.25 mM KH2PO4 (pH 7)を含有する標準反応混合物中でアッセイした。25 mL反応混合物に5μL酵素溶液を添加することにより、室温にて反応を行った。5 mM NaOHを用いてpHスタット滴定により5分間にわたってギ酸生成をモニターした。1ユニットは、1分当たり1μmolのギ酸生成を触媒するのに必要な酵素量と定義される。TG10+において発現されるFMDは、100-200 U/mgの比活性を有していた。
省令第112号の方法の検出原理は、アンモニア存在下でホルムアルデヒドとアセチルアセトンとが反応して、黄色化合物3,5-ジアセチル-1,4-ジヒドロルチジンを生成すること(Hantzsch反応)によるものである(Nash, T. (1953) The Colorimetric Estimation of Formaldehyde by Means of the Hantzsch Reaction Biochem. J., 55(3), 416-421、およびFregert, S., Dahlquist, I., Gruvberger, B. (1984) A Simple Method for the Detection of Formaldehyde Contact Dermatitis, 10, 132-134)。定量的なホルムアルデヒド検出のために、試薬溶液は以下のように調製される:15 g酢酸アンモニウム、0.2 mLアセチルアセトン、0.3 mL酢酸を100 mL蒸留水中で混合する(4℃にて1週間保存可能)。検量線のために5から25 ppmまでのホルムアルデヒド水溶液を調製する。0.1 mLのサンプル水溶液(または標準もしくはブランクとして水)を0.15 mL試薬溶液と混合することにより反応を開始し、60℃にて10分インキュベートする。この溶液を室温に冷却した後、蒸留水を最終容量1 mLとなるまで添加する。3,5-ジアセチル-1,4-ジヒドロルチジンの生成を412 nmでモニターする。
繊維製品に応用するためのホルムアルデヒドジスムターゼの有効性を確定するために、さまざまな濃度の酵素を220 ppmホルムアルデヒド(100 mM KH2PO4、pH 8溶液)とともに室温で30分インキュベートした。前記アセチルアセトン法でサンプルを分析した。酵素原液の比活性は165 U/mgであった。結果を表1に示す。
ジメチロールジヒドロキシエチレン尿素架橋剤で仕上げ加工された綿繊維をFDMで処理した。架橋剤と綿繊維とを縮合させた後、繊維製品中に約114 ppmの遊離のホルムアルデヒドが、アセチルアセトン法で測定された。次にこの繊維製品サンプルを、さまざまな濃度の酵素溶液(100 mM KH2PO4、pH 8、0-150 mg/L酵素)に浸漬し、ただちに2つの金属回転シリンダーに通した(図3)。湿潤サンプルを30℃で60分インキュベートした。1グラムの繊維サンプルから抽出されたホルムアルデヒドを、アセチルアセトン法(省令第112号)により定量した。そのデータを表3にまとめる。
ジスムターゼなしでホルムアルデヒド含量は約70 ppmに減少した(乾燥繊維製品からは95)が、これはおそらく浸漬工程中のなんらかの「ウォッシュアウト」効果によるのかもしれない。概して、ホルムアルデヒドジスムターゼは、明らかに、ホルムアルデヒド抽出量を20から40 ppmレベルまで低下させることができる。湿潤と乾燥のホルムアルデヒド検出の相違は、繊維製品の含水量の見積もりの相違によるのかもしれない。表4は、大量のFAを含有する別のジメチロールジヒドロキシエチレン尿素架橋剤で架橋された繊維製品に対して実施した同じ実験を示す(酵素処理前の繊維製品中641 ppmホルムアルデヒド)。
繊維製品中のホルムアルデヒド含量を減少させる別の方策は、繊維製品との縮合ステップの前に架橋剤溶液に直接、ジスムターゼを使用することである。そのために、3つの製剤を、ホルムアルデヒドジスムターゼを用いてテストした:ジメチロールジヒドロキシエチレン尿素製剤(製剤1)、メトキシメチル化メラミン製剤(製剤2)およびFA含量の少ない重縮合メトキシメチル化メラミン製剤(製剤3)。架橋剤製剤1は、高濃度で弱酸性(pH 5-6)の水溶液で、0.1から1%のホルムアルデヒド(1000から10,000 ppm)を含有する。製剤2は、濃縮された水溶液(pH 8-9)で、1.5から2.5%のホルムアルデヒドを含有する。製剤3は、弱塩基性水溶液で0.2から1%のホルムアルデヒドを含有する(pH 8-9)。
セルロース繊維素材、およびセルロース繊維と合成繊維との混紡素材の繊維製品のイージーケア加工のために架橋剤が使用される。このような化学物質の重要な一群が、修飾されたジメチロールジヒドロキシエチレン尿素化合物群である。そこで、本発明者らは、4つの異なる製剤をホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)で処理し、製剤中に残存するホルムアルデヒドを測定した。さらに、酵素処理した製剤を綿の仕上げ加工に使用した。繊維製品(綿)のホルムアルデヒド含量を定量し、仕上げ加工の性能を数値化した。
スルホン化メラミン-FA重縮合物は、特にセメントおよび硫酸カルシウムを基本とする混合物の流動化および減水のために最適化されている。典型的には、これらの製品は、20%w/v水溶液として使用され、pH値は約9から11.4(サンプル1)および7から10(サンプル2)である。本項では(表9参照)、2つのサンプルの20%w/v希釈標準溶液をFDM(終濃度140 mg/L)で処理し、さまざまなインキュベーション時間後に、残存するホルムアルデヒドを既述のアセチルアセトン法により定量した(値はppm単位)。
修飾されたアニオン性ポリアルキル-フェノール-アルデヒド樹脂は、特にセメントおよび硫酸カルシウムを基本とする混合物の流動化および減水のために最適化されている。この製品は、濃縮された水溶液(pH 5-8)として調製される。酵素処理は、製品に直接FDMを添加することにより行われた。未処理の製品は、アセチルアセトン法による測定で、約250 ppmホルムアルデヒドを含有している。下記の表(表10)は、FDMとともに0.5時間、3時間および24時間インキュベートした後の残存ホルムアルデヒド(ppm単位)を示す。
FDMの活性部位は、比較的狭い、ほとんど疎水性のポケット内にホルムアルデヒド分子が結合することを示す。しっかり結合したNADHコファクター分子により供与される水素化物イオンによる求核攻撃を目的として、戦略的に配置された亜鉛イオンがルイス酸として機能して、基質を活性化する。不均化反応の想定される反応メカニズムは、2つの共役した半反応からなる。第1の半反応では、ホルムアルデヒド分子は、酵素(E)-NAD+複合体によって不可逆的に酸化され、ギ酸および(E)-NADH複合体が形成される。第2の半反応では、もう一つのホルムアルデヒド分子が(E)-NADHと結合し、不可逆的に還元されてメタノールとなり、次の反応のために(E)-NAD+が残される。FDMにより触媒される不均化について想定される反応メカニズムは、Tanaka et al. (2002), Journal of Molecular Biology, 324, 519-533に記載され、説明されている。2.3Åの分解能でのP. putida F61由来FDMの活性部位は、Hasegawa et al. (2002), Acta Crystallogr.,Sect.A, 58, C102-C102により報告され、説明されている。ホルムアルデヒドは疎水性ポケット内にしっかりと詰め込まれており(Met 337、Ile 301、Phe 93およびPhe 127)、亜鉛イオンよびNAD(H)コファクターのすぐ近くにある。
FDMおよびそのバリアントの活性は、20 mMホルムアルデヒド、100 mM KCl、0.25 mM KH2PO4 (pH 7)を含有する標準反応混合物中で、pHスタット滴定によってアッセイした。反応は、25 mLの反応混合物に5μL酵素溶液を添加することにより行った(活性に応じて、典型的には0.1-0.5μg/mL酵素)。ギ酸の生成は、5 mM NaOHを用いた滴定によって5分間にわたってモニターした。1ユニットは、1分当たり1μmolのギ酸生成を触媒するのに必要な酵素量と定義される。FDM F93A / I301L (0,7μg/mL)は、pH 7でホルムアルデヒドの代わりに20 mMアセトアルデヒドを用いてpHスタット滴定によりテストした唯一の変異体であった。FDMおよび単一変異体のすべてのアセトアルデヒドに対する活性が弱すぎてpHスタット滴定で追跡できないことから、FDMおよびそのバリアントをHPLC(Aminex HPX-87 Hカラム、5 mM H2SO4中、RIにより検出、0,5 mL/分)によって比較することを決定した。酵素反応は、50 mM KH2PO4 (pH 8)、100 mM KClおよび20 mMアセトアルデヒド中で行った。反応は、FDMまたはそのバリアント(50μg/mL)の添加により開始した。アセトアルデヒド、エタノールおよび酢酸は、30分間隔で定量した(保持時間:アセトアルデヒド21.2分;エタノール25.2分;酢酸18.9分)。反応初速度が測定され(30分値)、1分間に1μmol酢酸を生成するのに必要とされる酵素量としてユニット数が算出された。
FDMおよびそのバリアントの重要な性質は、酵素精製(滅菌)中にも、技術的応用中にも、温度上昇に対して耐性があることである。FDM、FDM I301LおよびFDM I301L / F93Aの温度安定性を、酵素をさまざまな温度で20分間(25-65℃)プレインキュベートした後、そのサンプルをアセトアルデヒドまたはホルムアルデヒドについてテストすることによって、比較した。FDM I301LおよびFDM I301L / F93Aサンプルは、アセトアルデヒド活性についてはHPLCで上記のようにテストした。データは、室温で得られた値と比較した相対活性として示す(図4)。
FDM I301L / F93AおよびFDM I301Lの結晶は、スイス、ビリンゲン(Villingen)にあるシンクロトロンSLSで測定した(表12)。
イソロイシン301のロイシンへの変異は、電子密度地図において明確に認められる。側鎖は活性部位から離れる方向になるのでVal 303、Phe 265およびPhe 57との疎水的接触が強まる。こうした相互作用の強化は、熱安定性が高まる原因となる可能性がある。この変異はフェニルアラニン127にも影響を及ぼす。側鎖全体が少し動いて、フェニル環は野生型と比べて約70°回転する(図8)。フェニル環は、基質結合ポケットの一部であって、その側鎖の新しい位置は、ホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドのカルボニル基がNADHコファクターからの水素化物移動のためにもっと好ましい位置にくるように、結合ポケットをすぼめている。その上、イソロイシン301のロイシンへの変異は、結合ポケットを反対側に広げるので、野生型と比較して、立体的により条件が厳しいアセトアルデヒドを、基質としてもっとうまく受け入れることが可能になる。
イソロイシン301のロイシンへの変異は、単一変異体の構造におけるLeu 301およびPhe 127への影響と同じ影響を及ぼす。第2の変異(Phe 93からAlaへ)は、野生型のフェニル環のCε位の近傍にある水分子(H2O 339)に余地を与える。水分子は、NADHのニコチンアミド酸素、および触媒亜鉛のリガンドの1つであるAsp 170のカルボニル酸素に、水素結合する。Ala 338の主鎖カルボニル酸素と、第3の弱い水素結合が形成される。水分子とAsp 170との強い水素結合は、主鎖のコンフォメーションを変形させるので、亜鉛の配位を弱める。水素結合を形成するためにAsp 170の側鎖は約14°回転する必要がある(図9)。この回転によって、亜鉛イオンとそのカルボニル酸素間の距離が2.0から2.4Åに増加する。亜鉛の最適な配位が失われることで、二重変異体の活性の全体的低下が説明されるであろう。さらに、野生型酵素およびI301L変異体より大きい活性部位は、ホルムアルデヒドが触媒反応のために有利な向きをとることを妨げると思われる。このことは、観察された、ホルムアルデヒドからアセトアルデヒドへの特異性の切り替えを説明することができると考えられる。変異のもう一つの影響はMet 337のコンフォメーションの変化である。Met 337のCε原子は前のフェニル環の位置に向かって90°回転している。このコンフォメーションは、タンパク質においてメチオニンにもっとも好ましい回転異性体であるため、非常に低エネルギーのコンフォメーションである。
約120 ppmの残存FA含量を有する、さらに改変されたアニオン性ポリアルキルグリコール-フェノール-FA樹脂を、乾燥FDM I301L製剤(製剤の比活性:約50 U/mg)で処理した。テストは、樹脂に50 mg/Lの酵素粉末を加えた後、室温でインキュベートすることにより行った。次の表(表13)は、5時間後および42日後の残存ホルムアルデヒド(ppm)を示す。
水溶性ポリマー溶液(改変βナフタレン-FAスルホネート樹脂)をさまざまな量のFDM I301L乾燥製剤で処理し(20から200 mg製剤/ Lポリマー溶液)、室温にて5時間インキュベートした。この時点で同じ量の酵素を添加し、インキュベーションを11日までの間継続した。次の表(表14)は、2 x 50 mg/Lの乾燥酵素製剤を用いた5時間、24時間、4日、7日および11日後の残存ホルムアルデヒド(ppm)を示す。
安定化されたアニオン性アクリレートコポリマー水中分散液(固体含量54%)を、室温にて、10 mg/L の乾燥FDM I301L製剤で処理した。遠心(14,000 rpmで2-4時間、室温)後、透明な水相のホルムアルデヒド含量を測定した。次の表(表15)は、酵素処理の5、24および96時間後の分散液中のホルムアルデヒド含量(ppm)を示す。
ホルムアルデヒド含量は実施例3に記載のように、アセチルアセトン法により測定した。
[1] ホルムアルデヒド含有製剤におけるホルムアルデヒド含量を低下させるための、ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品の使用。
[2] 酵素標品がEC分類E.C. 1.2の酵素を含有する、1に記載の使用。
[3] 酵素標品が、その補酵素と密接に結合した酵素を含有する、1または2に記載の使用。
[4] 酵素標品が、配列番号2のアミノ酸配列を有する酵素、またはそのバリアントを含有する、1〜3のいずれか1つに記載の使用。
[5] バリアントが、他の任意のアミノ酸で置換された、93位のフェニルアラニン、および/または301位のイソロイシン、および/または337位のメチオニン、および/または127位のフェニルアラニンを有する、4に記載の使用。
[6] 製剤が樹脂である、1〜5のいずれか1つに記載の使用。
[7] 樹脂が、繊維製品の仕上げ加工に適した架橋剤、または顔料捺染のための固定剤である、6に記載の使用。
[8] 繊維製品がセルロース繊維を含有する、7に記載の使用。
[9] 繊維製品が綿である、8に記載の使用。
[10] 樹脂がポリマー分散剤である、6に記載の使用。
[11] ポリマー分散剤が、ナフタレンホルムアルデヒド縮合物、フェノールホルムアルデヒド縮合物、尿素ホルムアルデヒド縮合物、およびメラミンホルムアルデヒド縮合物、ならびにそれらの混合物からなる一群から選択される、10に記載の使用。
[12] ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品とホルムアルデヒド含有製剤を接触させることを含む、前記製剤中のホルムアルデヒド含量を減少させるための方法。
[13] 製剤が、繊維製品の仕上げ加工に適した架橋剤、またはポリマー分散剤である、12に記載の方法。
[14] ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品と繊維製品を接触させることを含む、繊維製品中のホルムアルデヒド含量を減少させるための方法。
[15] 酵素標品が、2〜5のいずれか1つに記載の酵素を含有している、12〜14のいずれか1つに記載の方法。
[16] 繊維製品仕上げ加工に適した製剤であって、架橋剤、およびホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品を含有する前記製剤。
[17] 架橋剤が、メラミン-FA、尿素-FA、もしくはジメチロールジヒドロキシエチレン尿素、またはそれらの誘導体からなる一群から選択される、16に記載の製剤。
[18] 建築資材、繊維板、パーチクルボード、合板、木材、革、塗料、および/または絨毯を処理するために好適な製剤であって、ポリマー分散剤、およびホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品を含有する前記製剤。
[19] ポリマー分散剤が、ナフタレンホルムアルデヒド縮合物、フェノールホルムアルデヒド縮合物、尿素ホルムアルデヒド縮合物、およびメラミンホルムアルデヒド縮合物、ならびにそれらの混合物からなる一群から選択される、18に記載の製剤。
[20] 酵素標品が、2〜5のいずれか1つに記載の酵素を含有している、16〜19のいずれか1つに記載の製剤。
[21] アルデヒドジスムターゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号2の93位のフェニルアラニン、および/または配列番号2の301位のイソロイシン、および/または配列番号2の337位のメチオニン、および/または配列番号2の127位のフェニルアラニンが任意の他のアミノ酸で置換されている配列番号2のバリアントを含有する、前記ポリペプチド。
[22] ポリペプチドが、
(i) 配列番号8または10のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列;
(ii) 配列番号8、10または12のうちいずれか1つによって表されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%配列同一性を有するアミノ酸配列;
(iii) 上記(i)もしくは(ii)で与えられるアミノ酸配列のうちいずれか1つの誘導体、
から選択される、21に記載のポリペプチド。
[23] 21または22に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
[24] 核酸が、
(i) 配列番号7または9のいずれか1つで表される核酸;
(ii) 配列番号7または9のいずれか1つで表される核酸の相補物;
(iii) 好ましくは遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号8または10のいずれか1つで表されるポリペプチドをコードする核酸であって、この単離された核酸が、配列番号8または10のいずれか1つにより表されるポリペプチド配列から導かれうる、前記核酸;
(iv) 配列番号7または9の核酸配列のいずれか1つと、少なくとも30 %, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の配列同一性を有する核酸;
(v) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(i)から(iv)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(vi) アルデヒドジスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、そのポリペプチドが、配列番号8または10のいずれか1つにより表されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の配列同一性を有する、前記核酸、
から選択される、23に記載の核酸。
[25] 少なくとも1つの核酸制御配列に機能的に連結された、23または24に記載の核酸を含んでなる、発現カセット。
[26] 25に記載の発現カセット、または23もしくは24に記載の核酸を含んでなる、組換え発現ベクター。
[27] 26に記載の発現ベクターを保有する組換え微生物。
[28] 21または22に記載のポリペプチドを調製する方法であって、27に記載の組換え微生物を培養すること、ならびに、必要に応じて培養物から前記ポリペプチドを単離することを含んでなる、前記方法。
[29] アルデヒド含有製剤中のアルデヒド含量を減少させるための、21もしくは22に記載のポリペプチド、または28にしたがって調製された発現産物の使用。
[30] アルデヒドがアセトアルデヒドまたはメチルグリオキサールである、29に記載の使用。
Claims (16)
- ホルムアルデヒド含有樹脂におけるホルムアルデヒド含量を低下させるための、ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品の使用、ここで
前記樹脂は繊維製品の仕上げ加工に適した架橋剤であり、
前記酵素標品は配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するホルムアルデヒドジスムターゼを含有し、ここで
a) 301位のイソロイシンがロイシンで置換され、かつ/または
b) 93位のフェニルアラニンがアラニンで置換されている、前記使用。 - 前記ホルムアルデヒドジスムターゼが配列番号8または10に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の使用。
- 繊維製品がセルロース繊維及び/又は綿を含有する、請求項1または2に記載の使用。
- 前記架橋剤が、メラミンホルムアルデヒド、尿素ホルムアルデヒドもしくはジメチロールジヒドロキシエチレン尿素、またはそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 繊維製品仕上げ加工に適したホルムアルデヒド含有架橋剤中のホルムアルデヒド含量を低減する方法であって、前記架橋剤を、ホルムアルデヒドの分解を触媒する酵素標品と接触させる工程を含み、かつ
前記酵素標品が配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するホルムアルデヒドジスムターゼを含有し、ここで
a) 301位のイソロイシンがロイシンで置換され、かつ/または
b) 93位のフェニルアラニンがアラニンで置換されている、前記方法。 - 前記ホルムアルデヒドジスムターゼが配列番号8または10に記載のアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の方法。
- 繊維製品がセルロース繊維及び/又は綿を含有する、請求項5または6に記載の方法。
- 前記架橋剤が、メラミンホルムアルデヒド、尿素ホルムアルデヒドもしくはジメチロールジヒドロキシエチレン尿素、またはそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 繊維製品仕上げ加工に適した製剤であって、該製剤は、架橋剤と、配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するホルムアルデヒドジスムターゼを含有する酵素標品とを含み、ここで
a) 301位のイソロイシンがロイシンで置換され、かつ/または
b) 93位のフェニルアラニンがアラニンで置換されている、前記製剤。 - 前記架橋剤が、メラミンホルムアルデヒド、尿素ホルムアルデヒドもしくはジメチロールジヒドロキシエチレン尿素、またはそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項9に記載の製剤。
- 前記ホルムアルデヒドジスムターゼが配列番号8または10に記載のアミノ酸配列を有する、請求項9または10に記載の製剤。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するホルムアルデヒドジスムターゼ、ここで
a) 301位のイソロイシンがロイシンで置換され、かつ/または
b) 93位のフェニルアラニンがアラニンで置換されている、前記ホルムアルデヒドジスムターゼ。 - 配列番号8または10に記載のアミノ酸配列を有する、請求項12に記載のホルムアルデヒドジスムターゼ。
- 請求項12または13に記載のホルムアルデヒドジスムターゼをコードする核酸。
- 請求項14に記載の核酸を有する微生物。
- 請求項12または13に記載のホルムアルデヒドジスムターゼを調整するために請求項14に記載の微生物を培養すること、ならびに、必要に応じて培養物から前記ポリペプチドを単離することを含んでなる、ホルムアルデヒドジスムターゼを調製する方法。
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