CN104531759B - 一种吸收甲醛的青蒿及其培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种吸收甲醛的青蒿及其培育方法，含有Shmt基因和Fdm基因，Shmt基因的序列为SEQ ID NO:1，Fdm基因的序列为SEQ ID NO:2。本发明将恶臭假单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因Shmt和甲醛歧化酶基因Fdm基因克隆转化导入青蒿，提高青蒿中的丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶合成，获得丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶高含量的基因工程青蒿品种，大幅度提高了青蒿吸收甲醛的能力，使之成为清除家居装修中释放的甲醛的植物。
Description
技术领域
本发明涉及利用基因工程培育植物领域，具体是利用转基因技术培育一种可以吸收甲醛的青蒿。
背景技术
室内空气污染主要来自于家具、装修、抽烟及厨房的油烟、煤气热水器等，分为四大类，一类挥发性有机化合物，如甲醛、苯和氨等化学物质污染，NH3、CO、SO2等无机化合物，还有燃料燃烧产生的烟即可吸入颗粒物。二类放射性物质污染如氡，如来自建筑矿渣砖、水泥、水泥放射性污染物和装饰石材；三类微生物性物质污染，主要来自狗、猫、蟑螂、被褥和玩具等细菌、真菌、病毒孢子等；四类为物理污染，主要来自电器设备包括电磁辐射噪声及光污染等。
甲醛的来源与危害。甲醛40％的水溶液称为福尔马林，又名蚁醛，无色刺激气体，家居装修后以及新家具含有的甲醛，会慢慢逐渐释放出来，室内空气中甲醛主要来源于:A由于甲醛黏合性较强，用于室内装饰的细木工板、胶合板、刨花板以及中密度纤维等人造板材。甲醛同时还可加强板材硬度及防腐、防虫。人造板使用的胶粘剂脲醛树脂以甲醛为主要成分，人造板中脲醛树脂残留的和游离的甲醛会向家居室内释放，这些是室内装修甲醛的主体。B用人造板生产的家具。如果使用不合格的人造板，甲醛超标更严重。C其他各类装饰材料，如：壁纸、壁布、涂料、泡沫塑料和油漆等，随时向外界散发含有的甲醛成分。
甲醛对眼睛和鼻子的刺激性非常大，甲醛为有毒物，长期接触甲醛气体，可引发咽炎、鼻炎、皮肤炎和支气管炎等病症。研究表明甲醛与儿童白血病有一定关联性，甲醛对人体有强烈的有致癌、致畸、致突变，如果是孕妇则有致胎儿畸形的危险性，因而要采取措施预防室内甲醛污染。当然甲醛的危害也随着环境因素的变化而变化如，甲醛释放源和释放量，室内气温和相对湿度，通风量、甲醛浓度、业主置身于室内的时间，甲醛危害还取决于个体敏感程度的差异。预防甲醛污染的最好办法是在室内装修中使用合格的材料。
微生物对甲醛有降解作用，微生物以甲醛为其生长的碳源和能源而将其氧化、降解为无毒、无害的无机物，主要有甲基营养型细菌、真菌和非甲基营养菌。微生物有同化和异化作用两种机制降解甲醛。微生物体内甲醛的同化作用有核酮糖单磷酸途径、丝氨酸途径、核酮糖二磷酸途径，最终将甲醛同化成细胞的组成成份；微生物体内甲醛的异化作用通过氧化途径，需要依赖不同辅因子，最终甲醛被氧化成CO2。
微生物中甲醛代谢的丝氨酸途径，是Cl化合物和多碳化合物之间的羟基化反应，最终产生C3化合物，开始于亚甲基四氢叶酸的羟基化反应及甘氨酸合成丝氨酸的反应，C3化合物经过一系列的转化生成磷酸烯醇式丙酮酸，又经羧酸化生成苹果酸，苹果酸分解生成2个C2化合物，而后转换成甘氨酸，从而完成了整个循环过程。参与丝氨酸循环的特异性酶类主要有丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyl transferase SHMT)，由丝氨酸途径产生的C3化合物中，有两个C来自甲醛，另一个来自于CO2。据推测高等植物中甲醛的代谢可能通过一碳(C1)代谢途径进行：甲醛通过叶片气孔被吸收进细胞后可能会与四氢叶酸形成5，10-亚甲基一四氢叶酸，然后由丝氨酸羟甲基转移酶催化合成丝氨酸，或通过其他代谢途径参与泛酸或胸腺嘧啶的合成，参与甲硫氨酸或腺嘌呤的合成。甲醛氧化为CO2和H20，CO2又通过TAC循环转化为各种代谢中间产物---糖类化合物，糖类化合物可被利用合成细胞的各种结构成分。丝氨酸羟甲基转移酶可能参与丝氨酸或泛酸或胸腺嘧啶的合成。甲醛代谢产生的氨基酸如丝氨酸和甲硫氨酸等可参与蛋白质的合成。甲醛代谢产生的嘌呤和嘧啶可用于核酸的合成。
甲醛歧化酶(Formaldehyde dismutase，FDM)，也称甲醛氧化还原酶，是氧化还原酶，催化醛的歧化作用，包括甲醛，使两分子的甲醛生成一分子的甲酸和一分子的甲醇。甲醛歧化酶通过与水合醛类的歧化，一些非水合的醛类也可以被降解。因此歧化和水合歧化反应可以看做是与醛醇的氧化还原反应相耦合的。此外该酶催化自然醇和醛的氧化还原反应，使生物体内能够进行醇醛的交换。甲醛歧化酶有四个亚基组成，每个亚基含有非解离型的NAD+，每个亚基含有两锌原子。
但是，目前并没有能够直接用于家居装修中甲醛吸收的家居植物。
发明内容
本发明的目的是在青蒿基因组中导入能增加丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新品系，以提高其丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶合成能力，使其叶片中能超量蓄积丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶而达到超量转化吸入叶片细胞内甲醛的目的，使这种转基因青蒿品系成为清除家居装修中释放的甲醛的清除植物。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种吸收甲醛的青蒿，其特征在于：含有Shmt基因和Fdm基因，Shmt基因的序列为SEQ ID NO:1，Fdm基因的序列为SEQ ID NO:2。
优选的，上述Shmt基因的扩增引物上游引物如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQID NO:4所示；Fdm基因扩增引物上游引物如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示。
上述吸收甲醛的青蒿是通过将Shmt基因和Fdm基因导入pCAMBIA2301，构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt，最终将pCAMBIA2301导入青蒿。
上述吸收甲醛青蒿的制备方法，包括如下步骤：
(1)克隆恶臭假单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶的基因片段，记为Shmt基因片段，并将Shmt基因片段构建成Shmt基因植物表达载体；
(2)克隆恶臭假单胞菌甲醛歧化酶的基因片段，记为Fdm基因片段，并将Fdm基因片段构建成Shmt基因植物表达载体；
(3)并将其构建成Shmt和Fdm基因组合的植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt(简写为pCB-Fdm-Shmt)；
(4)利用转基因技术将Shmt和Fdm导入青蒿，获得包含Shmt和Fdm基因的青蒿植株。
步骤(4)中可以采用电击法将Shmt和Fdm导入同一根癌农杆菌LBA4404，然后将所述农杆菌LBA4404导入青蒿，构成包含Shmt和Fdm基因的青蒿植株。
优选的，上述农杆菌LBA4404导入青蒿，即青蒿外植体的转化，包括以下步骤：从青蒿无菌苗上部选取幼片,切成0.6cm×0.6cm小叶片,利用转化的农杆菌菌液浸泡8min,用无菌滤纸吸干净多的菌液,接种再附加含有2mg/L 6-BA的MS培养基,在(25±1)℃培养6～7d，期间保持黑暗中；然后转至具有480mg/L羧苄青霉素(Cb)和12mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选；再培养3-4周，挑选两端长出小愈伤下胚轴，逐渐长出绿色抗性芽和白色非抗性芽。等嫩芽长到约l cm长，转到具有相同抗生素的生根培养基，等2周后生根长成完整的青蒿小植株；小植株经过炼苗、移栽、生长、发育过程并生产种子；采取PCR方法鉴定转基因青蒿，提取再生青蒿DNA为模板，PCR扩增反应条件如下：96℃预变性5min，92℃变性1min，58℃退火45S，72℃延伸3min 15S，共34个循环，最后72℃延伸lO min；通过琼脂糖凝胶电泳，转基因青蒿扩增出了与含Shmt基因的重组质粒PCR相同的条带。
本发明用于作为Shmt和Fdm基因受体亲本的青蒿是同一品种。
有益效果
1.甲醛易溶于水，通过气孔和皮孔扩散到植物组织中，进入植物细胞内，与细胞质和细胞器内的相关酶发生反应，将甲醛转化成其它物质，或者以二氧化碳的形式被释放出来。青蒿中化学成分分为4类：倍半萜、香豆素、黄酮和挥发油。青蒿中的药用成分可分为挥发性和非挥发性2个部分：非挥发性成分主要是青蒿素；挥发性成分主要为挥发油，包括篙酮、异篙酮、左旋樟脑、龙脑、按油精、旅烯、丁香烯、倍半褚醇、石竹烯氧化物等成分.其中丁香烯、篙酮、异篙酮、樟脑、龙脑等含量较高。青蒿植株高大，气味芳香，将本发明所述的青蒿放置于新修小区或者新装修的房子内，可以压制或者清除异味，青蒿挥发成分如烯、酮、醇类等化学物质弥漫在空气中，能消耗掉空气中部分甲醛，达到清除甲醛的目的。
2.本发明将恶臭假单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因Shmt和甲醛歧化酶基因Fdm基因克隆转化导入青蒿，提高青蒿中的丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶合成，获得丝氨酸羟甲基转移酶和甲醛歧化酶高含量的基因工程青蒿品种，大幅度提高了青蒿吸收甲醛的能力，使之成为清除家居装修中释放的甲醛的植物。
3.本发明提供了构建Shmt和Fdm基因的植物表达载体,并获得重组工程青蒿植株。
4.本发明在青蒿中导入Shmt和Fdm基因可以提高青蒿吸收甲醛的能力，在密闭甲醛熏蒸室内，普通植株甲醛吸收为0.12mg/m2.h时,本发明得到的转基因青篙植株甲醛吸收最高0.33mg/m2.h,其甲醛吸收是非转化对照青篙含量的2.75倍(如图6)。本发明的方法对于清除家居装修中释放的甲醛具有重要意义。
附图说明
图1为用pET28a-Shmt转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，重组子单菌落培养后，不同IPTG浓度(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)刺激重组蛋白进行诱导表达；图中M标示Marker,1、2、3、4、5为不同IPTG浓度诱导表达的蛋白质SDS-PAGE。V为空载体pET28a Vector。
图2为用pET28a-Fdm转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，重组子单菌落培养后，不同IPTG浓度(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)刺激重组蛋白进行诱导表达；图中M标示Marker,1、2、3、4、5为不同IPTG浓度诱导表达的蛋白质SDS-PAGE。V为空载体pET28a Vector。
图3植物表达载体结构图；图中为pCAMBIA2301-Shmt载体构建示意图。
图4为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图，图中M标示Marker,V为仅转染Vector，1、2、3、4、5、6、7、8泳道为不同候选阳性植株,即转染Shmt+Fdm基因的阳性植株。
图5为候选转基因植株的实时定量PCR检测结果，其中，Vector表示对照植株，Shmt+Fdm表示候选转基因植株。
图6为阳性转基因植株与对照植株叶片对甲醛的吸收能力的数据统计数据图，其中，Vector表示对照，Shmt+Fdm表示候选转基因植株。
图7pCAMBIA2301结构图谱。
图8pMDl9结构图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
材料：采用常规野生青蒿，2008年来源于重庆秀山县，在重庆医药高等专科学校以常规种植了5代。
菌株：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来自某家具厂废物废水，经本实验室分离筛选得到，大肠杆菌Rosetta，农杆菌LBA4404
质粒：pMD18-T载体购于TaKaRa生物技术公司，原核表达载体pET-28a(+)，pMD19-T，质粒载体pCAMBIA2301。
酶和主要试剂:各种限制性内切酶如EcoRⅠ和BamHⅠ、NdeI和XhoI、Taq DNA聚合酶、IPTG、dNTP等购自TaKaRa生物技术公司，引物合成、DNA测序由上海生工技术公司。PCR引物由Sangon生物技术公司合成，随机引物标记试剂盒购自华美生物技工程公司。
分子生物学技术
下列实施例中未作特别说明的均按照常规实验条件进行，如分子克隆采取SAMBROOK.T等编著的实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory PreSS,1989)中描述条件,或采取制造厂商提供的试剂盒要求之条件进行。
实施例1
1.1Shmt和Fdm基因PCR扩增及原核表达载体的构建和酶蛋白表达克隆Shmt简并引物：
上游引物Primer1：5′-ATGCGAATTTTACCGGGTTTTT-3′,如SEQ ID NO:3所示。
下游引物Primer2：5′-TCGGCTGACATAATAAAACCAACGG-3′,如SEQ ID NO:4所示。
克隆Shmt PCR引物根据其保守氨基酸序列设计:
上游引物Primer3：5′-AGCATATGCTGGCTAGCTGTTAGCGTTTT-3′(划线部分为NdeI酶切位点),如SEQ ID NO:5所示。
下游引物Primer6：5′-CGCTCGAGGGGCTATAAGTAAACTGAAACGG-3′,(划线部分为XhoI酶切位点),如SEQ ID NO:6所示。
恶臭假单胞菌基因组DNA的提取参照分子克隆指南，PCR反应条件如下：97℃预变性5min，92℃变性1min，56℃退火45S，72℃延伸2min 15S，共35个循环，最后72℃延伸lOmin。通过琼脂糖凝胶电泳分离回收并纯化PCR扩增产物Shmt基因DNA(1.4kb)片段，然后亚克隆到pMD19-T载体上获得它们的TA克隆质粒pMD19-Shmt，经PCR及酶切鉴定确认，然后进行测定序列。序列分析正确后，用NdeI和XhoI把Shmt基因片断从pMD19-Shmt中切出，亚克隆插入原核表达载体pET28a的NdeI和XhoI位点之间，获得原核表达载体pET28a-Shmt。用pET28a-Shmt转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，挑取重组子单菌落，接种至含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜.将培养液稀释100倍接种至含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250r/min 37℃摇床培养，培养至OD600为0.6-1.0时，加入IPTG诱导重组蛋白的表达，30℃150r/min摇床培养，以空载体pET-28a(+)的重组菌作为阴性对照,通过设置不同IPTG浓度(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)对重组蛋白进行诱导表达，进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白是否表达(如图1)，经初步蛋白表达确认后，将重组质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切，回收约1.4kb小片段，并将此片段用T4DNA聚合酶连接到相同酶切的质粒载体pCAMBIA2301上，目的就是在目的基因前面加上酶蛋白启动子或者酶启动子在目的基因后面加上终止子，构建步骤如实施例1.2-1.4所述。
Fdm基因PCR扩增同上。
克隆Fdm简并引物：
上游引物Primer1：5′-CGTACGCTTGCAATGCTTCTCTGCTG-3′,如SEQ ID NO:7所示。
下游引物Primer2：5′-ATCGAAGACCTCAAGGCAAAGTGCGG-3′,如SEQ ID NO:8所示。
克隆Fdm PCR引物根据环羟基化加双氧酶保守氨基酸序列设计:
上游引物Primer1：5′-GCATATGCGTCGACATGGGGCTGCATAAGATG-3′(划线部分为NdeI酶切位点),如SEQ ID NO:9所示。
下游引物Primer2：5′-GCTCGAGGCGATAGCTCATCTAGCGTAAATAG-3′(划线部分为XhoI酶切位点),如SEQ ID NO:10所示。Fdm基因重组蛋白表达如图2。
1.2构建中间载体pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos
采用pMDl9-T和pCAMBIA2301为基本构建元件,构建pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos中间载体。具体实施步骤如下,由pCAMBIA2301上p35s-gfp*gus-nos的碱基序列设计一对引物,并在上、下游引物上分别引入限制性内切酶位点,以便于表达载体的构建。将pCAMBIA2301质粒作为模版,PCR扩增gfp*gus融合基因的表达盒,然后连接到pMD19-T载体,经转化筛选,挑取单克隆测序比对确认。
1.3构建中间载体
pMDl9-T-p35s-Shmt-nos的构建。以所述的pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos作为基础,用重组载体pMDl9-T-Shmt中的Shmt基因替换其上的gfp*gus融合基因。具体实施步骤:用SpeⅠ和BstEⅡ双酶切pMDl9-T-Shmt和pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos,回收Shmt基因片段和pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos大片段,Shmt基因片段分别与大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测(检测引物如SEQ ID NO:5、6所示)和酶切验证，确认无误。
1.4构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Shmt
以所述的pMD19-T-p35s-Shmt-nos为基础,将含有Shmt融合基因的表达盒置于植物双元表达载体pCAMBIA2301中,构建成植物双元表达载体pCAMBIA2301-Shmt。具体实施操作:用SmaⅠ和pstⅠ双酶切pCAMBIA2301,回收大片段,用SwaⅠ和PstⅠ双酶切pMD19-T-p35s-Shmt-nos,回收Shmt的表达盒。将Shmt表达盒与pCAMBIA2301大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测(检测引物如SEQ ID NO:5、6所示)和酶切验证。
重组质粒具有基因片段Shmt，该片段位于CaMV 35S启动子下游，对重组质粒进行酶切鉴定，将经过鉴定的重组质粒命名pCB-Shmt。以空载体pET-28a(+)的重组质粒作为阴性对照,PCR扩增检测鉴定，(检测引物如SEQ ID NO:5、6所示)
构建pCAMBIA2301-Fdm方法同上，PCR扩增检测鉴定，但检测引物如SEQ ID NO:9、10所示。
1.5构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt
以所述的pMD19-T-p35S-Shmt-nos为基础,将含有Shmt基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm中,构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt。具体操作步骤:用SmaⅠ和PstⅠ双酶切pCAMBIA2301-Fdm,回收大片段,用SwaⅠ和pstⅠ双酶切pMD19-T-p35s-Shmt-nos,回收Shmt基因的表达盒。将Shmt基因的表达盒与pCAMBIA2301-Fdm大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证,(检测引物如SEQ ID NO:5、6和9、10所示)获得含有Fdm基因和Shmt基因的植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt(简写为pCB-Fdm-Shmt)。
实施例2将重组质粒pCB-Fdm-Shmt含有的Shmt和Fdm基因导入青蒿基因组
1)将上述制备的pCB-Fdm-Shmt质粒采取电击法转化农杆菌感受态细胞LBA4404:将pCB-Fdm-Shmt导入农杆菌感受态细胞LBA4404，获得LBA4404/pFdm-Shmt。实施步骤根据英文影印版5《分子生物学芥实验手册》(科学出版社.2002)，采用Biorad公司电穿孔仪上自带的Agrobaterium(农杆菌)电击程序。导入的植物表达载体的农杆菌用于青蒿转化。
2)青蒿的转化以及再生：首先进行农杆菌的转化，制备农杆菌感受态和转化，将转化的农杆菌菌液涂布在含有卡那霉素60Lg/mL,利福平30Lg/mL,链霉素30Lg/mL的固体YEP培养基平板上,28℃培养18～24h,接种培养新鲜单菌落的转化和非转化农杆菌,分别提取质粒DNA,并以提取的质粒DNA为模板实施PCR扩增,用PCR的方法鉴定。引物为原来克隆Shmt基因的引物，设置的对照(CK)中除未加插入目的DNA片段外,其它的成分与处理一致.PCR扩增程序:96℃5min,92℃45s、65℃45s、72℃45s,35循环,72℃5min.琼脂糖凝胶电泳后观察.
3)青蒿外植体的转化：采用叶盘法对青蒿进行转化.从青蒿无菌苗上部选取幼片,切成0.6cm×0.6cm小叶片,利用转化的农杆菌菌液浸泡8min,用无菌滤纸吸干净多的菌液,接种再附加含有2mg/L6-BA的MS培养基,在(25±1)℃培养6～7d，期间保持黑暗中。然后转至具有480mg/L羧苄青霉素(Cb)和12mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选。再培养3-4周，挑选两端长出小愈伤下胚轴，逐渐长出绿色抗性芽和白色非抗性芽。等嫩芽长到约l cm长，转到具有相同抗生素的生根培养基，等2周后生根长成完整的青蒿小植株。小植株经过炼苗、移栽、生长、发育过程并生产种子。采取PCR方法鉴定转基因青蒿，提取再生青蒿DNA为模板，PCR扩增反应条件如下：96℃预变性5min，92℃变性1min，58℃退火45S，72℃延伸3min15S，共34个循环，最后72℃延伸lO min。通过琼脂糖凝胶电泳，转基因青蒿扩增出了与含Shmt基因的重组质粒PCR相同的条带，而浸染空载体pET-28a(+)没有相应扩增带(如图4)。
实施例3利用实时定量PCR分析Shmt和Fdm基因在阳性青蒿植株中的表达水平
提取PCR检测为阳性生物工程青蒿植株总RNA，反转录为cDNA。
设计内参基因β-actin的引物，标定内参。
上游引物:5′-GCCACCGATCCAGACACTGTACTTCC-3′如SEQ ID NO:11所示
下游引物:5′-ATTCAGGTGATGGTGTGAGCCACAC-3′如SEQ ID NO:12所示
目的基因Shmt目的基因检测引物(检测引物如SEQ ID NO:5、6所示)如前。扩增条件:94℃预变性4min；92℃变性30S,60℃(内参基因)或66℃(目的基因可调)退火30S，38个循环，72℃延伸10min，绘制曲线。如图4可看出，阳性生物工程青蒿植株体内目的基因Shmt基因表达量均高于对照青蒿植株，说明目的基因Shmt不仅整合到阳性生物工程青蒿植株的基因组内，且在阳性生物工程青蒿植株体内转录水平得到有效表达。目的基因Fdm基因检测同上，引物如SEQ ID NO:9、10所示(如图5)。
表1实时定量PCR检测结果
| Vector | Shmt+Fdm-1 | Shmt+Fdm-3 | Shmt+Fdm-5 | Shmt+Fdm-8 | Shmt+Fdm-9 | Shmt+Fdm-11 | Shmt+Fdm-13 | |
| SHMT | 1 | 2.12 | 2.23 | 2.54 | 2.32 | 2.54 | 3.42 | 2.52 |
| FDM | 1 | 1.95 | 2.24 | 2.12 | 2.23 | 2.25 | 2.12 | 2.42 |
实施例4植物对甲醛吸收能力测定
采取在密闭反应室内测定。先放入空载体对照青蒿植株，将10μL的甲醛溶液用喷雾器注人到密闭反应室内，打开内置风扇.让甲醛溶液完全挥发成气雾状，采用甲醛分析仪Interscan4160-3型每隔3h测量甲醛浓度一次，共24小时。甲醛初始浓度为1.28-2.86mg/m3。然后将转基因青蒿植株放人该密闭反应室中，方法同前，试验重复3次，每次放置3盆同种青蒿植株于该密闭反应室中。采用Li-3000A叶面积仪测量叶面积。为了便于比较青蒿植株对高浓度甲醛的吸收能力.将结果换算为单位时间单位面积的叶片吸收甲醛的量，单位为mg/(m2·h)。在密闭甲醛熏蒸室内，普通植株甲醛吸收为0.12mg/m2.h时,本发明得到的转基因青篙植株甲醛吸收最高0.33mg/m2.h,其甲醛吸收是非转化对照青篙含量的2.75倍。(如图6)。
转基因青蒿在不同暴露时间对空气中甲醛的吸收能力n＝3，mg/(m2.h)
| Time | Vector | Shmt+Fdm-16 | Shmt+Fdm-13 | Shmt+Fdm-14 | Shmt+Fdm-15 | Shmt+Fdm-17 | Shmt+Fdm-18 | Shmt+Fdm-10 |
| 3h | 0.12 | 0.28 | 0.25 | 0.26 | 0.31 | 0.33 | 0.24 | 0.25 |
| 6h | 0.09 | 0.25 | 0.25 | 0.24 | 0.27 | 0.31 | 0.21 | 0.25 |
| 9h | 0.08 | 0.24 | 0.23 | 0.24 | 0.24 | 0.28 | 0.21 | 0.24 |
| 12h | 0.08 | 0.23 | 0.21 | 0.21 | 0.23 | 0.23 | 0.18 | 0.19 |
| 15h | 0.08 | 0.18 | 0.16 | 0.18 | 0.21 | 0.23 | 0.17 | 0.18 |
| 18h | 0.05 | 0.15 | 0.15 | 0.14 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
| 21h | 0.05 | 0.12 | 0.14 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 | 0.12 |
| 24h | 0.05 | 0.08 | 0.11 | 0.07 | 0.12 | 0.11 | 0.08 | 0.12 |
Claims (2)
1.一种吸收甲醛的青蒿制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)克隆恶臭假单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶的基因片段，记为Shmt基因片段，并将Shmt基因片段构建成Shmt基因植物表达载体；
所述Shmt基因片段的序列为SEQ ID NO:1；
所述Shmt基因片段的扩增引物上游引物如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示；
(2)克隆恶臭假单胞菌甲醛歧化酶的基因片段，记为Fdm基因片段，并将Fdm基因片段构建成Fdm基因植物表达载体；
所述Fdm基因片段的序列为SEQ ID NO:2；
所述Fdm基因片段扩增引物上游引物如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示；
(3)并将其构建成Shmt和Fdm基因组合的植物双元表达载体pCAMBIA2301-Fdm-Shmt；
(4)采用电击法将pCAMBIA2301-Fdm-Shmt导入根癌农杆菌LBA4404，然后将所述农杆菌LBA4404导入青蒿，构成包含Shmt和Fdm基因的青蒿植株。
2.根据权利要求1所述的一种吸收甲醛的青蒿制备方法，其特征在于：所述农杆菌LBA4404导入青蒿，包括以下步骤：从青蒿无菌苗上部选取幼片,切成0.6cm×0.6cm小叶片,利用转化的农杆菌菌液浸泡8min,用无菌滤纸吸干净多的菌液,接种再附加含有2mg/L 6-BA的MS培养基,在25±1℃培养6～7d，期间保持黑暗中；然后转至具有480mg/L羧苄青霉素和12mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选；再培养3-4周，挑选两端长出小愈伤下胚轴，逐渐长出绿色抗性芽和白色非抗性芽，等嫩芽长到约1cm长，转到具有相同抗生素的生根培养基，等2周后生根长成完整的青蒿小植株；小植株经过炼苗、移栽、生长、发育过程并生产种子；采取PCR方法鉴定转基因青蒿，提取再生青蒿DNA为模板，PCR扩增反应条件如下：96℃预变性5min，92℃变性1min，58℃退火45S，72℃延伸3min 15S，共34个循环，最后72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳，转基因青蒿扩增出了与含Shmt基因的重组质粒PCR相同的条带。
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