JP5745616B2 - 水溶性蛍光フラーレン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、水溶性蛍光フラーレン誘導体及びその製造方法に関し、より詳細には、第１溶媒にフラーレン及び末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを混合した後、触媒剤を利用して前記混合物を反応させることによって蛍光性に優れたフラーレン誘導体を簡単な方法で製造する水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法及び前記方法によって製造される水溶性蛍光フラーレン誘導体に関するものである。

一般に、フラーレン（fullerenes）は、炭素−炭素の二重結合を持つ五員環と六員環が結合して成り立った球状の化合物であり、フラーレンの独特の構造によってアルツハイマー等のような疾病や遊離ラジカルと関連する医薬分野、ナノ技術の産業分野等で利用の可能性が非常に高い。

特に、バックミンスターフラーレン（buckminster fullerene、Ｃ_６０）は、６０個の炭素からなり、球状の構造をした安定した炭素分子で、正２０面体（icosahedral）対称を成しており、全ての炭素の環境が同様である。これは、Ｃ−ＮＭＲで単一ピークを示すことによって確認された。Ｃ_６０フラーレンだけでなく、Ｃ_７０、Ｃ_８０フラーレンも合成されるが、その量が多くないため、現状はＣ_６０を主に合成して研究している。

フラーレン分子は、略球状構造を示す対称型非極性分子であり、水、アルコールといった極性溶媒には溶解せずベンゼンやトルエンといった非極性溶媒にだけよく溶解する。また、フラーレンは、光に非常に敏感な分子で、光を受けると励起状態になって、簡単にラジカルや光増感剤になりうる。フラーレンの電気化学的性質は、非常に有用であり、フラーレン分子は、溶液で六つの可逆的な酸化−還元が可能で、独特な構造のために、非常に硬い性質を持ち、最近ではアルカリ金属との混入時、超伝導体になれると知られており、産業的にもその応用性が注目されている。

フラーレンは、前述した通り光に非常に敏感で、特に紫外線領域（２１３、２５７及び３２９ｎｍ）の光吸収率は非常に高い方である。しかし、蛍光特性は概ね非常に低いと知らされているので、これは蛍光陽子効率で示すことができる。蛍光陽子効率とは、吸収された光子数に対する放出された蛍光光子を意味するもので、フラーレンの陽子効率は、常温で約１×１０^−４を示す。このような低蛍光効率のため、フラーレンの蛍光を利用した応用は成り立たないのが実情である。

また、独特の光学的、電気的性質を持っているにも拘らず、フラーレンは、それを応用するのにいくつかの困難がある。それは、有機溶媒に対する低い溶解度、自発的凝集現象等である。特に、フラーレンは周りの環境に非常に敏感であるため、物理的、化学的性質が簡単に変化する特徴を示しているので、これを調節するために種々の方法が開発されている。

その中で生物学的分野、医薬分野、ナノ技術分野等に応用するためには、フラーレンが水に簡単に溶解する水溶性特性が求められるため、水溶性フラーレンを製造することがひとまず何よりも重要である。

このように、水溶性フラーレン製造技術としては、代表的に化学的反応を介して水酸化基（ＯＨ）をフラーレン表面に導入してフレロール（fullerol）を製造［Tetrahedron, (1996) 52, 4963-4972; Chem. Comm., (1993) 1784; J. Mater. Chem., (2005) 15, 1049］したり、末端にフラーレンと結合できるリガンドで変形させたオリゴエチレングリコールや、ポリエチレンを導入する例［Langmuir, (2006), 22, 5366-537;, Polymer, (2007) 48, 1972-1980; Bioconjugate Chem., (2008) 19, 2280-2284］等が挙げられる。しかし、このような方法は、フラーレンと結合させるために多くの合成工程が必要であって、製造方法が複雑で、水に対する溶解度が高くないため、有用性が顕著に低い問題点がある。

従って、多くの研究者等は、簡単な反応を介して水に対する溶解度が高く、強い蛍光特性といった独特の光学的特性を持った水溶性蛍光フラーレンを開発することが、生物学的分野、医薬分野、ナノ技術分野に有用性を高めるに当たり重要な部分を占めているとの認識を共にしている。

そこで、本発明者等は、前記従来技術の問題点を解決しようと鋭意努力した結果、第１溶媒にフラーレン、及び末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを混合した後、触媒剤を利用して、前記混合物を反応させる場合、蛍光性が強い水溶性フラーレン誘導体を簡単な方法で容易に製造できることを確認して、本発明を完成するようになった。

本発明の主な目的は、簡単な方法で生体適合性に優れて、親水性であり強い蛍光性を持つフラーレン誘導体を製造する方法及びその方法によって製造される水溶性蛍光フラーレン誘導体を提供することにある。

前記のような目的を達成するために、本発明は（ａ）第１溶媒にフラーレンを分散させて分散物を取得する工程、（ｂ）前記分散物に触媒剤及び末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを混合して混合物を取得する工程、及び（ｃ）前記混合物を精製して蛍光フラーレン誘導体を製造する工程を含む、水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法及び前記方法によって製造され、末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを含む水溶性蛍光フラーレン誘導体を提供する。
さらに本発明は、フラーレンとリガンドが−Ｃ−Ｏ−に結合していることを特徴とする水溶性蛍光フラーレン誘導体を提供する。

本発明によると、触媒剤を利用して、混合物を反応させて、蛍光性が強い水溶性フラーレン誘導体を簡単な方法で容易に製造できる。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。

本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体製造方法の概略図である。 本発明に係るＣ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体のＳＥＭ写真である。 本発明に係るＣ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体のＦＴ−ＩＲスペクトルを示したグラフである。 本発明に係るＣ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体のＮＭＲスペクトルを示したグラフである。 本発明に係る濃度別Ｃ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体の写真で、（ａ）は白色光で撮影された写真で、（ｂ）は紫外線で撮影された写真である。 本発明に係る濃度別Ｃ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体の吸収スペクトル（ａ）及び蛍光スペクトル（ｂ）を示したグラフである。 本発明に係るＣ_６０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体の触媒種類別蛍光スペクトルを示したグラフである。 本発明に係るＣ_７０フラーレンで製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光スペクトルを示したグラフである。 本発明に係るジエチレングリコールリガンドを用いた水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光スペクトルを示したグラフである。 本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体のゼータ電位（zeta-potential）測定グラフである。 本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体を利用した細胞イメージング写真（ａ）及び（ｂ）及び細胞生存率測定グラフ（ｃ）である。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する実験方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。

本明細書において、「蛍光フラーレン誘導体」とは、光の刺激によって発光する現象を示すフラーレン誘導体をいう。

一観点において、本発明は（ａ）第１溶媒にフラーレンを分散させて分散物を取得する工程、（ｂ）前記分散物に触媒剤及び末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを混合して混合物を取得する工程、及び（ｃ）前記混合物を精製して蛍光フラーレン誘導体を製造する工程を含む、水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法に関する。

より具体的には、本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法は、図１に示したように、第１溶媒にフラーレンと末端にヒドロキシ基を含有するリガンドを混合した後、強塩基の触媒剤を利用して、前記混合物を反応させることによって簡単な方法で強い蛍光性を持つ水溶性フラーレン誘導体を製造できるだけでなく、フラーレンの量と触媒剤の種類によって蛍光の強さ及び波長を容易に調節することができる。

さらに、前記製造方法によって製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体は、生体親和的なリガンドを含有することによって、生物学的蛍光顔料として有用に用いられ、製造される蛍光フラーレン誘導体は、蛍光性を持つと同時に、溶媒に対する溶解度が優れており、生物学的分野、医薬分野、ナノ技術分野等に有用に用いられる。

本発明において、フラーレンは、Ｃ_６０の他にＣ_７０、Ｃ_８０、Ｃ_９０等のフラーレンファミリー系統のフラーレンが用いられ、前記フラーレンファミリーは、純粋に炭素で形成されており、球形状の対称を成している分子を通称するものであり、一部炭素数が多いフラーレンは、完全対称を成せないこともあり、第１溶媒相にフラーレンが分散しているものが用いられる。

前記第１溶媒は、フラーレンを分散させる役割を果たすもので、フラーレンを分散させられる溶媒であれば使用可能で、好ましくはトルエン、ベンゼン等の芳香族有機化合物とシクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン及びこれらの混合物からなる群から選択される。

本発明に係る製造方法において、第１溶媒相にフラーレンを分散時、フラーレンの濃度が０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬになるように分散させる。これは、フラーレンの濃度が０．０００１ｍｇ／ｍＬ未満であると、蛍光の強さが低くて有用性がなく、フラーレンの濃度が１０ｍｇ／ｍＬ超であれば、フラーレンの濃度が高くて触媒による反応性が劣る問題点が発生するからである。

また、フラーレンの添加量による蛍光の強さ及び波長の調節は、フラーレンの添加量が多いほど最終取得物である蛍光フラーレンが長波長の蛍光を放出して、蛍光の強さも減少し、第１溶媒相にフラーレンの添加量が少ないほど、最終取得物の蛍光フラーレンが短波長の蛍光を放出し、蛍光の強さも増加することによって第１溶媒相のフラーレンの添加量を加減して蛍光の強さ及び波長を調節することができる。

本発明において、末端にヒドロキシ基を含有するリガンドは、好ましくはエチレングリコール基を含有する化合物で、液体性物質であり、エチレングリコールの数は、１から数百まで含むものが用いられるが、必ずしもこれに限定されるのではなく、フラーレンが分散している第１溶媒との溶解度が高く、フラーレンを凝集させず、かつ片側または両側末端に１個以上のヒドロキシ基が含まれた化合物であれば、使用可能である。

そこで、本発明に係る末端にヒドロキシ基を含有するリガンドは、好ましくはジエチレングリコール（diethylene glycol）、トリエチレングリコール（triethylene glycol）、テトラエチレングリコール（tetraethylene glycol）、ヘクサエチレングリコール（hexaethylene glycol）、分子量が２００、３００、４００及び６００であるポリエチレングリコール（poly-ethylene glycol）、エタノールアミン（ethanolamine）、ジエタノールアミン（diethanolamine）、２−（ベンジルオキシ）エタノール［2-(Benzyloxy)ethanol］、２−（ブチルアミノ）エタノール［2-(butylamino)ethanol］、２−（シクロヘキシルオキシ）エタノール［2-(cyclohexyloxy)ethanol］、２−（ジブチルアミノ）エタノール［2-(dibutylamino)ethanol］、２−（ジイソプロピルアミノ）エタノール［2-(diisopropylamino)ethanol］、２−（ジエチルアミノ）エタノール［2-(diethylamino)ethanol］、２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール｛2-[2-(dimethylamino)ethoxy]ethanol｝、ジ（エチレングリコール）ベンジルエーテル［di(ethylene glycol)benzylether］、ジ（エチレングリコール）エチルエーテル［di(ethylene glycol)ethylether］、ジ（エチレングリコール）ヘキシルエーテル［di(ethylene glycol)hexylether］、ジエチレングリコールブチルエーテル（diethylene glycol butylether）、ジエチレングリコールメチルエーテル（diethylene glycol methylether）、ジエチレングリコールモノブチルエーテル（diethylene glycol monobutylether）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（diethylene glycol monoethylether）、ジエチレングリコールモノメチルエーテル（diethylene glycol monomethylether）、２−（２−エチルヘキシルオキシ）エタノール［2-(2-ethylhexyloxy)ethanol］、２−（３，４−ジメトキシフェニル）エタノール［1-(3,4-dimethoxyphenyl)ethanol］、及びこれらの混合物からなる群より選択される。

本発明において、触媒剤は、前記末端にヒドロキシ基を含有するリガンドと第１溶媒相に分散しているフラーレンとの化学的結合を誘導する役割を果たすもので、強塩基であれば制限なく使用可能であるが、好ましくは水酸化リチウム（lithium hydroxide、ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（sodium hydroxide、ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（potassium hydroxide、ＫＯＨ）、水酸化カルシウム［calcium hydroxide、Ｃａ（ＯＨ）_２］、水酸化マグネシウム［magnesium hydroxide、Ｍｇ（ＯＨ）_２］、水酸化バリウム（barium hydroxide）、水酸化カドミウム（cadminum hydroxide）、水酸化セシウム（cesium hydroxide）、水酸化コバルト（cobalt hydroxide）、水酸化銅（copper hydroxide）、水酸化ニッケル（nickel hydroxide）、水酸化ルビジウム（rubidium hydroxide）、水酸化アンモニウム（ammonium hydroxide）、水酸化テトラメチルアンモニウム（tetramethylammonium hydroxide）、水酸化テトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium hydroxide）、水酸化テトラブチルアンモニウム（tetrabutyl ammonium hydroxide）、水酸化テトラヘキシルアンモニウム（tetrahexylammonium hydroxide）、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム（benzyltrimethylammonium hydroxide）、水酸化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（hexadecyltrimethylammonium hydroxide）、水酸化ジエチルジメチルアンモニウム（diethyldimethylammonium hydroxide）及びこれらの混合物からなる群から選択される。

本発明に係る製造方法において、第１溶媒にフラーレンが分散した分散物に、末端にヒドロキシ基を含有するリガンド及び触媒剤の混合比率は、前記第１溶媒にフラーレンが分散した分散物１００重量部に対して、末端にヒドロキシ基を含有するリガンド０．０００１〜１００重量部及び触媒剤０．０００１〜１００重量部である。

これは、第１溶媒にフラーレンが分散した分散物１００重量部に対して、末端にヒドロキシ基を含有するリガンド０．０００１重量部未満で混合される場合、フラーレンと結合するリガンドの含有量が低く、溶媒に対する溶解度を提供できず、１００重量部を超える場合には未反応のリガンドが増加する恐れがある。

また、第１溶媒にフラーレンが分散した分散物１００重量部に対して、触媒剤が０．０００１重量部未満で混合される場合、フラーレンとリガンドとの反応を誘導できず、１００重量部を超える場合には触媒剤が不安定な反応を誘導する恐れがある。

また、本発明において、触媒剤は、触媒剤の種類に応じて蛍光波長を調節することができる。触媒剤の反応性に応じて、リガンドとフラーレンの結合を調節できるが、具体的には反応性が強いほど長波長の蛍光が現れ、反応性が落ちるほど短波長の蛍光が現れる。

前述のように製造された混合物は、無極性溶媒、極性溶媒、及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される第２溶媒を利用して、最終取得物である水溶性蛍光フラーレン誘導体を沈殿させて、前記水溶性蛍光フラーレン誘導体を未反応のフラーレン及び末端にヒドロキシ基を含有するリガンドから分離する精製過程を経る。前記第２溶媒は、トルエン、ベンゼン、ヘキサンといった無極性溶媒、エタノール、メタノールといった極性溶媒、及びこれらの混合溶媒からなる群から選択され、好ましくはエチルアセテート、エタノールのようなアルコールが用いられる。

本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法は、簡単な方法で容易に強い蛍光性を持つフラーレン誘導体を製造できるだけでなく、フラーレンの量と触媒剤の種類によって蛍光の強さ及び波長を容易に調節することができる。

他の観点において、本発明は、フラーレンとリガンドが−Ｃ−Ｏ−に結合していることを特徴とする水溶性蛍光フラーレン誘導体に関する。

本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体は、フラーレンが末端にヒドロキシ基を含有するリガンドと触媒反応する過程でフラーレンの炭素共有結合が崩れ、酸素原子と結合しながらフラーレンとリガンドが−Ｃ−Ｏ−で結合することになる。そこで、本発明の蛍光フラーレン誘導体は、フラーレンが自主的に持つ紫外線吸収波長（２２０、２６０及び３５０ｎｍ）は消えて、紫外線領域全般にわたって（２００〜４００ｎｍ）強く光を吸収すると同時に３５０ｎｍで照射した場合、５３０ｎｍで強い蛍光を放出するだけでなく、優秀な親水性及び水分散性を持つ。

本発明に係る蛍光フラーレン誘導体の水に対する溶解度は、室温（２５℃）で１００ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬであり、一般のＣ_６０フラーレンが１．３×１０^−１１ｍｇ／ｍＬ（Sivaraman, N. et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 6077-6079）の溶解度を持つのに対して、本発明で製造されたフラーレン誘導体は、水に対する溶解度が非常に高いことが分かる。

また、本発明に係る蛍光フラーレン誘導体の蛍光の強さは、５００〜５５０ｎｍの波長領域で２００〜１０００の蛍光の強さを持つものであり、蛍光量子収率（fluorescence quantum yield）が２×１０^−３〜５×１０^−３で、一般のフラーレンの蛍光量子収率１×１０^−４（J. Am. Chem. Soc., 115, 6378 (1993); J. Am. Chem. Soc., 116, 9763 (1994)）と比べて約２０〜５０倍程度高いことが分かった。

従って、本発明に係る蛍光フラーレン誘導体は、バイオイメージングのような生物学的分野、医薬分野、ナノ技術分野等に有用である。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：Ｃ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造
Ｃ_６０フラーレン（ＭＥＲ Ｃｏ．）を２ｍｇ／ｍＬになるようにトルエンに分散させ、前記分散物１０ｍＬをフラーレンの最終濃度が０．１２、０．２５、０．５及び１．０ｍｇ／ｍＬになるようにテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）に１：１で各々添加させて撹はんさせた後、前記撹はんされた混合物に水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）を７５ｍＭになるよう３２ｍｇを溶液に添加して常温で２０時間撹はんさせた。このように撹はんされた混合物中ピンク色を帯びたフラーレンがゆっくり茶色に変わったことを確認し、反応が完了するとエチレンアセテートを前記混合物に添加して蛍光フラーレン誘導体の沈殿を誘導させた後、遠心分離を利用して蛍光フラーレン誘導体を分離した。前記蛍光フラーレン誘導体が分離した混合物にエタノールを少量添加して、それにエチレンアセテートを過量添加して沈殿を誘導、分離過程をもう二回進行して、最終的に濃い茶色のＣ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体を各々製造した。

実施例２：Ｃ_７０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造
実施例１と同様の方法で製造して、Ｃ_７０フラーレン（ＭＥＲ Ｃｏ．）の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）と混合されたＣ_７０フラーレンを用いてＣ_７０フラーレン水溶性蛍光フラーレン誘導体を製造した。

実施例３：リガンドでジエチレングリコールを用いた水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造
実施例１と同様の方法で製造して、Ｃ_６０フラーレンの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようジエチレングリコールと混合されたＣ_６０フラーレンを用いて水溶性蛍光フラーレン誘導体を製造した。

実験例１：Ｃ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体の特性評価
実施例１で製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体中Ｃ_６０フラーレンの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）と混合されたＣ_６０フラーレンを用いて製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体を電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＦＥＩ、Ｓｉｒｉｏｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）で観察した結果、図２に示したように、平均径が１０ｎｍであることが分かった。

また、図３に示したように、赤外線スペクトル（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ＩＦ６６）で水溶性蛍光フラーレン誘導体の化学構造を測定した結果、Ｃ−Ｏ−Ｃ伸縮振動（stretching vibration）を示す８６７ｃｍ^−１とＣ−Ｏ伸縮振動を示す１０９０ｃｍ^−１及びＯ−Ｈ伸縮振動を示す３４２６ｃｍ^−１で吸収スペクトルが現れたため、芳香族炭素（aromatic carbon）に酸素（oxygen）が結合したことが分かり、図４に示したように、ＮＭＲ（磁気共鳴スペクトル）でフラーレン誘導体を分析した結果、エチレングリコールのアルキル構造を示す２３．３６と、芳香族炭素と酸素の結合構造を示す１７０．３８と、１８０．５２で信号を示しており、赤外線スペクトルの結果と類似することが分かった。

実験例２：Ｃ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光性測定
実施例１で製造されたＣ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体を水に分散させた後、ＵＶハンドランプ（ＵＶ．ＬＦ１０４Ｌ、ＵＶＩＴＥＣ）３６５ｎｍ波長の紫外線を照射して蛍光フラーレン誘導体の蛍光性を測定した。その結果、図５に示したように、可視光線で茶色（または、黄色）を帯びるＣ_６０フラーレンの蛍光フラーレン誘導体は、紫外線照射時添加されたフラーレンの量が多いほど青色から橙色を帯びることから、フラーレンの添加濃度が高いほど長波長の蛍光を放出することが分かり、フラーレンの添加濃度が低いほど短波長の蛍光を放出することが分かった。

実施例１で製造されたＣ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した結果、本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体は、短波長の紫外線で光を強く吸収することが示され（図６（ａ））、３５０ｎｍの紫外線を照射した場合には、フラーレンの添加濃度が高いほど５００ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光を放出することが分かった（図６（ｂ））。

また、本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光量子収率を測定するために、キニーネ硫酸塩（quinine sulfate、ＱＳ、５５×１０^−２）標準物質を用いて比較して測定、計算した。まず、３５０ｎｍ領域で吸光度が０．１以下の実施例１の水溶性蛍光フラーレン誘導体とキニーネ硫酸塩を濃度毎に五つのサンプルを準備して、各濃度で３５０ｎｍで励起させた後、４００〜７００ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。これと同様の方法で標準物質であるキニーネ硫酸塩の蛍光スペクトルを測定して、前記水溶性蛍光フラーレン誘導体と比較して蛍光量子収率を計算した。

その結果、本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光量子収率は、２×１０^−３であることから、一般のフラーレンの蛍光量子収率１×１０^−４（J. Am. Chem. Soc., 115, 6378 (1993); J. Am. Chem. Soc., 116, 9763 (1994)）により約２０倍高いことが分かった。

一方、実施例１と同様の方法で水溶性蛍光フラーレン誘導体を製造し、Ｃ_６０フラーレンの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）と混合されたＣ_６０フラーレンに触媒剤の種類をＬｉＯＨ、ＮａＯＨ及びＫＯＨと各々異なるように添加させて製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光性を測定した。その結果、図７に示したように、触媒の種類によって蛍光の波長が異なるように現れることが分かった。

実験例３：Ｃ_７０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体蛍光性測定
実施例２で製造されたＣ_７０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体蛍光スペクトルを測定した結果、図８に示したようにＣ_７０フラーレンを用いた場合も、３５０ｎｍの紫外線を照射時５４０ｎｍで８００以上の蛍光の強さで光を放出することが示された。

実験例４：ジエチレングリコールリガンドを水溶性蛍光フラーレン誘導体の蛍光性測定
実施例３で製造されたＣ_６０フラーレンの水溶性蛍光フラーレン誘導体蛍光スペクトルを測定した結果、図９に示したようにジエチレングリコールリガンドを用いた場合も３５０ｎｍの紫外線を照射時５４０ｎｍで２５０以上の蛍光の強さで光を放出することが示された。

実験例５：水溶性蛍光フラーレン誘導体の水に対する溶解度測定
蛍光フラーレン誘導体の分散性と関して、水に分散している蛍光フラーレン誘導体のゼータ電位（zeta-potential）をＥＬＳ−Ｚ（Ｏｔｓｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用して測定した。Ｃ_６０フラーレン（ＭＥＲ Ｃｏ．）の最終濃度が、１ｍｇ／ｍＬになるように製造された実施例１の水溶性蛍光フラーレン誘導体を用いてゼータ電位を測定した結果、図１０に示したように、約−２０ｍＶであることが分かった。これは、水溶性蛍光フラーレン誘導体が負電荷（negative charge）を帯びて、極性である水によく分散することが分かり、さらに、濃度を異なるようにして水分散したフラーレン誘導体を観察した時、高濃度（２０ｍｇ／ｍＬ）以下でかたまる現象はなく、黄色の溶液状態で存在することから、フラーレン誘導体の水分散性や溶解度が非常に高いことを確認することができた。

実験例６：水溶性蛍光フラーレン誘導体の細胞イメージング及び細胞安全性測定
本発明によって製造した水溶性蛍光フラーレン誘導体のバイオイメージング素材としての可能性を確認するために、実施例３で製造された水溶性蛍光フラーレン誘導体を癌細胞である子宮頸部癌細胞株（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ、ＫＣＬＢ１０００２、韓国細胞株銀行）に浸透させて、蛍光顕微鏡写真で観察した。図１１（ａ）は、水溶性蛍光フラーレン誘導体を含有している細胞の透過写真であり、図１１（ｂ）は、同じ位置で４２０ｎｍ光を励起させ５２５ｎｍフィルターを利用して得た蛍光写真で、図１１（ｂ）を見ると、図１１（ａ）と同じ細胞位置で緑色信号である水溶性蛍光フラーレン誘導体を確認することができる。また、水溶性蛍光フラーレン誘導体の細胞安全性を確認するために、ＭＴＴ ａｓｓａｙを実施した。対照群である水溶性蛍光フラーレンがない細胞と水溶性蛍光フラーレン誘導体の濃度を０．０６〜１．０ｍｇ／ｍＬに変化させて、細胞に処理した後、細胞生存率（cell viability）を比較した。

その結果、実施した水溶性蛍光フラーレン誘導体の全濃度で細胞安全性が対照群と似ていることから、約１０μｇ／ｍＬ以下で細胞安全性を持つ量子点のような無機金属を基盤とするナノ粒子の細胞安全性より本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の細胞安全性が高いことを確認した（図１１（ｃ））。

以上述べたように、本発明に係る水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法は、簡単な方法で強い蛍光性を持つ親水性フラーレン誘導体を製造できるだけでなく、フラーレンの量と触媒剤の種類に応じて蛍光の強さ及び波長を容易に調節でき、生体親和的なリガンドを含有することによって生物学的蛍光顔料として有用であり、製造される蛍光フラーレン誘導体は蛍光性を持つと同時に溶媒に対する溶解度が優れるため、生物学的分野、医薬分野、ナノ技術分野等に有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (8)

1. 下記の工程を含む、水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法：
   （ａ）第１溶媒に炭素数が６０〜２００であるフラーレンを分散させて分散物を取得する工程、
   （ｂ）前記分散物に触媒剤及びジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘクサエチレングリコールからなる群より選択されるリガンドを混合して、前記フラーレンの炭素とリガンドのヒドロキシ基とを反応させ、−Ｃ−Ｏ−結合を形成した蛍光フラーレン誘導体を含む反応物を取得する工程、及び
   （ｃ）前記反応物を精製して蛍光フラーレン誘導体を取得する工程。
2. 前記第１溶媒は、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
3. 前記触媒剤は、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化カルシウム［Ｃａ（ＯＨ）_２］、水酸化マグネシウム［Ｍｇ（ＯＨ）_２］、水酸化バリウム、水酸化カドミウム、水酸化セシウム、水酸化コバルト、水酸化銅、水酸化ニッケル、水酸化ルビジウム、水酸化アンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラヘキシルアンモニウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム、水酸化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、水酸化ジエチルジメチルアンモニウム及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
4. 前記工程（ａ）の分散物は、フラーレンの濃度が０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである請求項１に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
5. 前記工程（ｂ）で、リガンド及び触媒剤は、前記分散物１００重量部に対して、各々０．０００１〜１００重量部及び０．０００１〜１００重量部が使用される請求項１に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
6. 前記工程（ｃ）の精製は、前記反応物に第２溶媒を添加した後、蛍光フラーレン誘導体を沈殿させて分離することによって行われる請求項１に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
7. 前記第２溶媒は、無極性溶媒、極性溶媒、及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される請求項６に記載の水溶性蛍光フラーレン誘導体の製造方法。
8. 炭素数が６０〜２００であるフラーレンとジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘクサエチレングリコールからなる群より選択されるリガンドとが、両者の反応によって形成される−Ｃ−Ｏ−結合を介して結合しており、蛍光量子収率が２×１０^−３〜５×１０^−３であり、水に対する溶解度は、２５℃で０．１ｍｇ／ｍＬ以上である、水溶性蛍光フラーレン。