JP5722298B2 - 希少循環細胞における多様なシグナル伝達物質検出のための抗体に基づくアレイ - Google Patents
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Description
本出願は、2006年9月21日に出願され、米国仮出願第号に変更された、米国出願第11/525,598号、2007年4月20日に出願された米国仮出願第60/913,087号の優先権を主張し、それらの開示は、すべての目的のため、その全体が参照により本明細書に援用される。
(a)複数の捕捉された分析物を形成するために、細胞抽出物を、細胞抽出物中の1つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記捕捉抗体が固相担体に拘束されていることを特徴とする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するため、複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートする工程;
(c)増幅されたシグナルを生成するために、複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子とインキュベートする工程;及び
(d)シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程。
(a)複数の捕捉された分析物を形成するため、細胞抽出物を、細胞抽出物中の1つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記捕捉抗体が固相担体に拘束されていることを特徴とする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するため、複数の捕捉された分析物を、それに対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記検出抗体は:
(1)促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、と
(2)シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体と、を備え、
前記促進部分は、シグナル増幅対の第一の構成因子に向けられ且つそれと反応する酸化剤を生成する、
ことを特徴とする工程;
(c)増幅シグナルを生成するために、複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートする構成;及び
(d)シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程。
本発明は、抗体に基づくアレイ分析システムを用いた希少循環細胞における複数のシグナル伝達分子の活性状態及び/又は総量を検出するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明の多重で、ハイスループットの免疫分析は、単一の細胞レベルでの固形腫瘍の循環細胞における1つ又はそれ以上のシグナル伝達分子の活性状態を検出することができる。実際に、EGFRのようなシグナル伝達分子は、約100zmolの感度と約100zmolから約100fmolまでの直線性のダイナミックレンジで検出され得る。このように、希少循環細胞における複数のシグナル伝達物質の活性状態の単一細胞での検出は、個別の標的治療法の設計と同様に、癌の予後診断及び診断を促進する。
本明細書において、他に規定されない限り、次の用語は以下に定義される意味を有する。
本発明は、希少循環細胞における複数のシグナル伝達分子の活性状態及び/又は総量を検出するための抗体に基づくアレイ及び癌の予後診断及び診断の促進、及び個別の標的治療法の設計のためのこれらの使用方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、細胞抽出物における1つ又はそれ以上の分析物に対する特異的な複数の希釈系列の捕捉抗体から構成される優れたダイナミックレンジを有するアレイを提供し、その捕捉抗体は、固相担体に拘束される。
他の形態において、固形腫瘍の循環細胞のような腫瘍細胞の細胞抽出物における対象となる特定の分析物の活性状態を検出するための分析は、優れたダイナミックレンジを有する、多重で、ハイスループットな単一の検出(すなわち2抗体)分析である。非限定的な例として、この分析で用いられる2つの抗体は、以下の構成を備え得る:(1)分析物に特異的な捕捉抗体;及び(2)分析物の活性型に特異的な検出抗体(すなわち活性状態依存抗体)。活性状態依存抗体は、例えば分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び/又は複合体形成状態を検出することができる。代替的には、検出抗体は、細胞抽出物中の分析物の総量を検出する活性状態非依存抗体から構成される。活性状態非依存抗体は、一般的に分析物の活性型及び不活性型を検出することができる。
(a)複数の捕捉された分析物を形成するために細胞抽出物における1つ又はそれ以上の分析物に特異的であり、固相担体上に拘束された複数の希釈系列の捕捉抗体と細胞抽出物をインキュベートする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するために対応する分析物に特異的な検出抗体と複数の捕捉された分析物をインキュベートする構成;
(c)増幅シグナルを生成するためにシグナル増幅対の第一及び第二の構成因子と複数の検出可能な捕捉された分析物をインキュベートする工程;及び
(d)シグナル増幅対の第一又は第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程。
他の例では、単離された循環細胞は、当該分野で既知の任意の技術を用いて、細胞抽出物(例えば細胞溶解物)を生成するために、例えば増殖因子の刺激及び/又は抗癌剤処理の後に、溶解され得る。好ましくは、細胞溶解は、増殖因子の刺激後1〜360分の間に開始され、より好ましくは2つの異なる時間間隔で開始される:(1)増殖因子の刺激後、約1〜5分で;及び(2)増殖因子の刺激後、約30〜180分の間。代替的には、細胞溶解物は使用まで−80℃で保存され得る。
さらに他の形態では、固形腫瘍の循環細胞のような腫瘍細胞の細胞抽出物における対象となる特定の分析物の活性状態を検出するための分析は、優れたダイナミックレンジを有する、多重、ハイスループットの近接(すなわち3抗体)分析である。非限定的な例として、この近接分析で用いられる3つの抗体は、以下の構成を備え得る:(1)分析物に特異的な捕捉抗体;(2)分析物の活性型に特異的な検出抗体(すなわち活性状態依存抗体);及び(3)分析物の総量を検出する検出抗体(すなわち活性状態非依存抗体)。活性状態依存抗体は、例えば分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び/又は複合体形成状態を検出することができる。活性状態依存抗体は一般的に分析物の活性型及び不活性型の両方を検出することができる。
(a)複数の捕捉された分析物を形成するため、細胞抽出物における1つ又はそれ以上の分析物に特異的な複数の希釈系列の捕捉抗体と、細胞抽出物をインキュベートする工程であって、前記捕捉抗体が固相担体上に拘束されていることを特徴とする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するため、複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートする工程であって、前記検出抗体は:
(1)促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、と
(2)シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体と、を備え、
前記促進部分は、シグナル増幅対の第一の構成因子に向けられ且つそれと反応する酸化剤を生成する、
ことを特徴とする工程;
(c)増幅シグナルを生成するために、複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートする工程;及び
(d)シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程。
さらなる態様において、本発明は上述した抗体に基づくアレイ方法を実行するためのキットを提供し、以下の構成を備える:(a)固相担体上に拘束された複数の捕捉抗体の希釈系列;及び(b)複数の検出抗体(例えば、活性状態非依存抗体、及び/又は活性状態依存抗体)。ある例では、このキットはさらに、固形腫瘍の循環細胞の複数のシグナル伝達分子の活性状態を検出するためにこのキットを用いる方法のための使用説明書を含むことができる。このキットはまた、例えば、シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子、チラミドシグナル増幅試薬、促進部分のための基質、洗浄緩衝液、捕捉/放出試薬等のような、本発明の特異的な方法を実行することに関する上述したあらゆる付加的な試薬を包含してもよい。
ある形態において、本発明は、固相担体上に拘束された捕捉抗体の希釈系列を用いて、固形腫瘍の循環細胞の細胞抽出物における複数のシグナル伝達分子の活性状態を検出するための抗体に基づくアレイを提供する。本発明の分析において使用されるアレイは、典型的には、異なるアドレス可能な位置における固相担体の表面に連結された一定範囲の捕捉抗体濃度の複数の異なる捕捉抗体から構成される。
本発明に関して希少循環細胞におけるシグナル伝達分子の活性状態及び/又は総量を分析するためにまだ市販で入手できない抗体の生成及び選択は、様々な方法で達成できる。例えば、1つの方法は、対象となるポリペプチド(すなわち抗原)を当該分野で既知のタンパク質発現及び精製方法を用いて、発現し及び/又は生成することであり、一方、他の方法は、当該分野で既知の固層ペプチド合成法を用いて対象のポリペプチドを合成することである。例えば、Guideto Protein Purification,Murray P.Deutcher,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.182(1990);SolidPhase Peptide Synthesis,Greg B.Fields,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.289(1997);Kisoら、Chem.Pharm.Bull.,38:1192−99(1990);Mostafaviら、Biomed.Pept.ProteinsNucleic Acids,1:255−60,(1995);及びFujiwaraら、Chem.Pharm.Bull.,44:1326−31(1996)を参照する。精製され又は合成されたポリペプチドは、その後、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製するために、例えばマウス又はウサギに注射され得る。当業者は、例えばAntibodies,ALaboratory Manual,Harlow and Lane,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1988)に記載されているように、多くの手法が抗体の生成のために利用できることを認識するだろう。当業者はまた、抗体を模倣した結合断片又はFab断片が様々な手法によって遺伝子情報から準備され得ることを認識しているだろう(例えば、AntibodyEngineering:A Practical Approach,Borrebaeck,Ed.,Oxford University Press,Oxford(1995);及びHuseら、J.Immunol.,149:3914−3920(1992)を参照)。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、対象となるポリペプチド及びアジュバントの複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射によって動物内で上昇する。対象となるポリペプチドを、例えば二官能性又は誘導体化物質として用いられるスカシガイヘモシアニン(keyholelimpet hemocyanin)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン(bovine thyroglobulin)、又は大豆トリプシン阻害剤(soybeantrypsin inhibitor)のような、免疫された種において免疫原性であるタンパク質キャリアに共役することは有用であるかもしれない。二官能性又は誘導体化物質の非限定的な例は、マレイミドベンソイルスルフォスクシニミドエステル(maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester)(システイン残基を通した共役)、N−ヒドロキシスクシニミド(N−hydroxysuccinimide)(リジン残基を通した共役)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、コハク酸無水物、SOCl2及びRとR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを含む。
モノクローナル抗体は、一般的に実質的に相同な抗体の集団から獲得され、即ちその集団を構成する各抗体は、少量存在するかもしれない起こりうる自然発生変異を除き、同一である。従って、「モノクローナル(monoclonal)」という修飾語は、個々に異なる抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495(1975)によって開示されたハイブリドーマ法を用いて、又は当業者に既知の任意の組み換えDNA法(例えば米国特許第4,816,567号を参照)によって作製され得る。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野では既知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである試料源からの抗体に導入された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「取り込み(import)」残基と言われ、典型的には「取り込み(import)」可能なドメインから取得される。ヒト化は、本質的には、非ヒト抗体の超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列と置き換えることによって実行され得る。例えば、Jonesら、Nature,321:522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−327(1988);及びVerhoeyenら、Science,239:1534−1536(1988)を参照する。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(例えば、米国特許第4,816,567号)であって、完全なヒト可変ドメインは、本質的には決して非ヒトの種からの対応する配列によって置換されていない。実際に、ヒト化された抗体は、典型的には、いくらかの超可変領域残基及び可能であればいくらかのフレームワーク領域(FR)残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
ヒト化の代替として、ヒト抗体が生成され得る。ある実施の形態では、内因性免疫グロブリン生産の欠損下で、免疫付与によって、全ての種類のヒト抗体を生成することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)が生成され得る。例えば、キメラ生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接合領域(JH)遺伝子のホモ欠損が、内因性抗体生成の完全な阻害をもたらすことが述べられている。そのような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の形質転換は、抗原投与でヒト抗体の生産をもたらすだろう。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら、Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら、Yearin Immun.,7:33(1993);及び米国特許第5,591,669号、5,589,369号及び5,545,807号を参照する。
様々な技術が抗体断片の生成のために開発されてきた。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク質切断を介して得られた(例えば、Morimotoら、J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107−117(1992);及びBrennanら、Science,229:81(1985)を参照)。しかしながら、これらの断片は、現在、組み換え宿主細胞を用いて直接的に生成され得る。例えば、抗体断片は上述した抗体ファージライブラリーから単離され得る。代替的には、Fab’−SH断片がE.coli細胞から直接回収され、そしてF(ab’)2を形成するよう化学的に結合され得る(例えばCarterら、BioTechnology,10:163−167(1992)を参照)。他のアプローチによると、F(ab’)2断片は、組み換え宿主細胞培養から直接単離され得る。抗体断片の生成のための他の技術は、当業者には明らかであるだろう。他の実施の形態において、選択の抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。例えば、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号を参照する。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されるようにリニア抗体(linearantibody)であってもよい。そのようなリニア抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であるかもしれない。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、対象となる同一のポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合するかもしれない。他の二重特異性抗体は、対象となるポリペプチドに対する結合部位を一つ又はそれ以上の追加的な抗原に対する結合部位と組み合わせるかもしれない。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として用意され得る。
組み換え技術を用いると、抗体は、単離された宿主細胞内、宿主細胞のペリプラズム空間で生成され得、又は宿主細胞から培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成されると、例えば、遠心又は限外ろ過によって微粒子破片が先ず除去される。Carterら、BioTech.,10:163−167(1992)は、E.coliのペリプラズム空間に分泌された抗体を単離するための手法を記載する。簡単に言うと、細胞ペーストは、約30分間、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の存在中で溶解される。細胞破片は、遠心分離によって分離され得る。抗体が培地中に分泌される際、そのような発現システムからの上清は、一般的に、市販で入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMilliporePelliconの限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。PMSFのような、プロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するための前述の任意のステップに含まれ、抗生物質は、外来の混入物の増殖を抑制するために含まれてもよい。
固形腫瘍の循環細胞は、固形腫瘍から転移した又は微小転移した細胞から構成され、循環腫瘍細胞(CTC)、癌幹細胞(CSC)及び/又は腫瘍へと移動している細胞(例えば、循環内皮前駆細胞(CEPC)、循環内皮細胞(CEC)、循環血管新生促進骨髄性細胞、循環樹状細胞、等)を含む。循環細胞を含む患者試料は、あらゆる入手可能な生体液(例えば、血液、尿、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、等)から獲得され得る。循環細胞は、例えば、免疫磁気分離法(例えば、Racilaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589−4594(1998);Bilkenrothら、Int.J.Cancer,92:577−582(2001)を参照)、マイクロ流体分離法(例えばMohamedら、IEEETrans.Nanobiosci.,3:251−256(2004);Linら、Abstract No.5147,97th AACR Annual Meeting,Washington,D.C.(2006)を参照)、FACS(例えばMancusoら、Blood,97:3658−3661(2001)を参照)、密度勾配遠心分離法(例えばBakerら、Clin.CancerRes.,13:4865−4871(2003)を参照)、及び減少法(例えばMeyeら、Int.J.Oncol.,21:521−530(2002)を参照)のような一つ又はそれ以上の分離方法を用いて患者試料から単離され得る。
CTCの免疫磁気分離法−活性分析が続く手動単離:
1)前もって抗−EpCAMモノクローナル抗体(KordiaLife Sciences;Leiden,The Netherlands)に結合された磁気ビーズ((Dynal M450;Dynal AS;Oslo,Norway)が用いられる。
2)使用直前に、事前に覆われたダイナビーズ(Dynabead)は、0.01%BSAを含む等量のPBSで一度洗浄される。
3)25mlの事前に覆われたダイナビーズが1mlの試料に添加される。
4)その混合物は、2〜8℃で20分間、緩やかな傾斜と回転でインキュベートされる。
5)そのチューブは、2分間、磁気分離器(MPL−1magnet)に設置される。
6)その上清が廃棄され、ビーズに結合した細胞が0.01%BSAを含むPBSで再懸濁され、続いて磁気分離されることによって3回洗浄される。
7)その試料は、100μlの活性化緩衝液に再懸濁される。
1)ヒト対象物からの末梢血が1mg/mlのEDTAを含むシリコン処理チューブに引き抜かれる。最初の3〜5mlは、穴の開いた血管から放出された上皮細胞での汚染を避けるために廃棄される。
2)1mlの全血が使用前に0.9%のNaClで1:3に希釈される。
1)細胞系列の対照がヒト癌細胞系列をHL−60細胞にスパイクすることによって作製される。
2)細胞系列の対照は、2.5x106細胞/mlの濃度で使用される。
非限定的な例として、生存CEC及びCEPCは、Beerepootら、Ann.Oncology,15:139−145(2004)に記載された免疫磁気単離/濃縮手法を用いて単離され得る。つまり、末梢血が前もって抗CD146モノクローナル抗体(KordiaLife Sciences)に共役された磁気ビーズ(Dynal M450 IgG1)とともにインキュベートされる。この抗体は、末梢血中の内皮細胞の全ての系統を認識し、造血細胞又は上皮細胞を認識しない(Georgeら、J.Immunol.Meth.,139:65−75(1991)を参照)。造血細胞及び上皮細胞の消極的な選択は、適切な抗体に共役された磁気ビーズ(例えば、白血球を除くためのDynal−CD45ビーズ、単球を除くためのDynal−CD14ビーズ、上皮細胞を除くためのDynal−EpCAM(Invitrogen;Carlsbad,CA))での積極的選択に先立って使用され得る。この例では、積極的選択のみが使用される。
1)前もって抗−CD146モノクローナル抗体(KordiaLife Sciences)を結合された磁気ビーズ(Dynal M450)が使用される。
2)使用直前に、事前に被覆されたダイナビーズは、0.01%BSAを含む等量のPBSで一回洗浄される。
3)25μlの事前に被覆されたダイナビーズが1mlの試料に添加される。
4)その混合物は、2〜8℃で20分間、緩やかな傾斜と回転でインキュベートされる。
5)そのチューブは、2分間、磁気分離器(MPL−1magnet)に置かれる。
6)その上清が廃棄され、ビーズ結合細胞が、0.01%BSAを含むPBSでの再懸濁され、続いて磁気分離されることによって3回洗浄される。
7)その試料は、100μlの活性化緩衝液に再懸濁される。
1)ヒト対象物からの末梢血が、1mg/mlEDTAを含むシリコン処理されたチューブに引き抜かれる。最初の3〜5mlは穴の開いた血管から放出された上皮細胞での汚染を防ぐため、廃棄される。
2)1mlの全血は、使用前に0.9%NaClで1:3に希釈される。
1)細胞系列の対照が、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)をHL−60細胞にスパイクすることによって作製される。
2)細胞系列の対照は、2.5x106細胞/mlの濃度で使用される。
CEPCは、様々な血管新生増殖因子に応答して、成熟内皮細胞へ分化する能力を有する骨髄由来の前駆細胞の循環型である。CEPCは、表層マーカーCD34を認識する抗体での選択によって単離されてよい。CD133は、未熟内皮細胞(EPC)又は原始造血幹細胞(HSC)をCEPCから区別する細胞表層マーカーである。異なる入手源からのCEPCの様々な単離手法は、接着培養又は磁気マイクロビーズを用いて開示されている。この例では、Asaharaら、Science,275:964−967(1997)に記載されたものから改良されたプロトコールが使用される。
1)磁気ビーズ(DynalM450 CD34)が使用される。これらのビーズはCD34表層抗原に対し特異的なモノクローナル抗体で覆われる。
2)事前に覆われたダイナビーズは、使用直前に、0.01%BSAを含む等量のPBSで一回洗浄される。
3)25μlの事前に覆われたダイナビーズが1mlの試料に添加される。
4)その混合物は、2〜8℃で20分間、緩やかな傾斜と回転でインキュベートされる。
5)そのチューブは、2分間、磁気分離器(MPL−1magnet)に置かれる。
6)その上清が廃棄され、ビーズ結合細胞が、0.01%BSAを含むPBSに再懸濁され、続いて磁気分離されることによって3回洗浄される。
7)その試料は、100μlの活性化緩衝液に再懸濁される。
1)ヒト対象物からの末梢血が、1mg/mlのEDTAを含むシリコン処理されたチューブに引き抜かれる。最初の3〜5mlは、穴の開いた血管から放出された内皮細胞での汚染を避けるために廃棄される。
2)10mlの血液は、平衡塩類溶液で1:1に希釈される。
3)4mlの希釈血液は、10mlチューブ中で3mlのFicoll−Paque上に積層される。
4)チューブは、18〜20℃で30〜40分間、400×gで回転される。
5)血漿及び血小板を含む上層は、滅菌パスツールピペットを用いて取り除かれ、界面で乱れていない単核細胞層を残す。
6)単核細胞は、滅菌ピペットを用いて滅菌遠心管へ移される。
7)6mlの平衡塩類溶液が添加され、細胞は穏やかに再懸濁される。
8)混合物は、18〜20℃で10分間、60〜100×gで遠心される。
9)上清が、除去され、各チューブからの単核細胞が1mlのPBSに再懸濁される。
Veridex(Warren,NJ)は、CellPrepシステム、CellSearch上皮細胞キット、及びCellSpotterアナライザーから構成されるCellSearchシステムを市販している。CellPrepシステムは、半自動化された試料準備システムである(Kaganら、J.Clin.LigandAssay,25:104−110(2002)を参照)。CellSearch上皮細胞キットは:内皮細胞に特異的な抗−EpCAM抗体で覆われた鉄流動体(ferrofluid);サイトケラチン(cytokeratins)8、18及び19に対するフィコエリスリン(phycoerythrin)共役抗体;アロフィコシアニン(allophycocyanin)に共役した抗−CD45抗体;DAPI染色剤;及び細胞を洗浄、浸透、及び再懸濁するための緩衝液、から構成される。この例で使用されるプロトコールはまた、Allardら、Clin.CancerRes.,10:6897−6904(2004)に記載されている。全Veridexシステムは、CTCの計数のために使用され得、又は、CellPrepシステムで単離された後に手動で試料を除去することによって、経路活性化のための分析に先だった単離の方法を提供することができる。CTCの数は、アルゴリズム開発のために情報を提供し得る。
1)7.5mlの血液が6ml緩衝液と混合され、10分間800×gで遠心され、CellPrepシステムに移される。
2)装置が上清を吸引した後、その装置は鉄流動体を添加する。
3)その装置が、インキュベートとそれに続く磁気分離工程を実行する。
4)非結合細胞及び残存血漿が吸引される。
5)染色試薬が、蛍光染色のために浸透化緩衝液と組み合わせて添加される。
6)そのシステムによるインキュベート後、細胞は、CellSpotterアナライザーを用いた分析のため、再びMagNestCell Presentation装置にて磁気的に分離され、そして再懸濁される。
7)その装置は、CellSpotterアナライザー、4色半自動化蛍光顕微鏡、上に設置される。
8)画像は、Veridexの定義した基準に合うように得られ、最終的な手動選択のためにウェブに基づくブラウザを介して示される。
9)細胞計数の結果は、7.5ml血液あたりの細胞数として表される。
1)7.5ml血液が6mlの緩衝液と混合され、10分間800×gで遠心され、その後CellPrepシステムに移される。
2)装置が上清を吸引した後、その装置は鉄流動体を添加する。
3)その装置はインキュベートとそれに続く磁気分離工程を実行する。
4)非結合細胞と残存血漿が吸引される。
5)試料は、100μlの活性化緩衝液で再懸濁される。
1)Veridexは、CD146抗体でのCEC及びCEPCの捕獲に用いるCellTracks内皮細胞キットを提案する。CellTracks内皮細胞キットは、血液試料の準備のためのVeridexのCellTracksAutoPrepシステム及び全血からのCEC及びCEPCを数え、特徴づけるためのCellTracksアナライザーIIとを組み合わせて用いられる。このプロトコールは、CellSearch上皮細胞キットのものと同一である。
1)ヒト対象物からの末梢血は、製造元の指導に従って、CellSavePreservativeチューブに引き抜かれる。最初の3〜5mlは、穴の開いた血管から放出される上皮又は内皮細胞での汚染を回避するために廃棄される。
腫瘍が特徴的な自己再生及び生存機構を有する少数の推定癌幹細胞を含むことの証拠が確立しつつある(例えばSells,Crit.Rev.Oncol.Hematol.,51:1−28(2004);Reyaら、Nature,414:105−111(2001);Dontuら、TrendsEndocrinol.Metal.,15:193−197(2004);and Dick,Nature,423:231−233(2003)を参照)。癌幹細胞(CSC)は、長期間静止状態で存在し、分裂する細胞を標的とする化学療法剤に対し耐性を獲得するかもしれない。この癌を発生させる集団は、選択的な除去のための標的化された治療を受けた自己再生及び生存経路の活性化として特徴づけられ得る。CSCの単離手法は、接着培養又は磁気マイクロビーズを用いて開示されている。この例では、Coteら、Clin.Can.Res.,12:5615(2006)で開示されたものから改変したプロトコールが使用される。
1)磁気ビーズ(DynalAS;Oslo,Norway)が使用される。これらのビーズは、CD34又はCD133表層抗原のいずれかに対し特異的なモノクローナル抗体で覆われる。
2)使用直前に、事前に覆われたダイナビーズが0.01%BSAを含む等量のPBSで一回洗浄される。
3)1〜107の事前に覆われたダイナビーズが、3mlの試料に添加される。
4)混合物が、2〜8℃で60分間、緩やかな傾斜と回転でインキュベートされる。
5)混合物は、1mlの部分に分割され、各チューブは、少なくとも6分間、磁気分離器(MPL−1magnet)上に置かれる。
6)その上清が廃棄され、ビーズ結合細胞が、0.01%BSAを含むPBSに再懸濁され、続いて磁気分離されることによって3回洗浄される。
7)その試料は、100μlの活性化緩衝液に再懸濁される。
1)骨髄試料が、インフォームド・コンセントを得た後に早期乳癌患者から獲得される。
2)骨髄吸引処理は、Bauerら、Clin.Can.Res.,6:3552−3559(2000)に記載のとおり実行される。あらゆる播種性腫瘍細胞を含む単核細胞画分は、BeckmanGS−6遠心機を用いて、35分間4000×gでのFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離法によって濃縮され、PBSで2回洗浄される。
細胞活性化:
1)増殖因子TGF−α(100nM)、ヘレグリン(heregulin)(100nM)、及び/又はIGF(100nM)が細胞に添加され、37℃で5分間インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度で、ヘルセプチン(Herceptin)、ラパタニブ(Lapatanib)、タルセバ(Tarceva)、及び/又はラパマイシン(Rapamycin)類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、増殖因子TGF−α(100nM)、ヘレグリン(100nM)、及び/又はIGF(100nM)を添加することによって活性化され、37℃で5分間、インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度で、ヘルセプチン、ラパタニブ、タルセバ、及び/又はラパマイシン類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、TGF−α(100nM)、ヘレグリン(100nM)、及び/又はIGF(100nM)によって活性化され、37℃で120分間インキュベートされる。
1)新鮮な溶解緩衝液は、表1に記載された試薬を混合することによって、新たに用意される。
2)最終洗浄後、細胞は、氷上で、100μlの冷却した緩衝液中に再懸濁される。
3)インキュベートが氷上で30分間行われる。
4)混合物は、溶解物からビーズを分離するために、10分間最速でマイクロチューブ中で遠心分離される。
1)溶解物は、分析のため、新しいチューブに移され、−80℃で保存される。
VEGFは、CEPC(Larriveeら、J.Biol.Chem.,278:22006−22013(2003))及び、血管壁が剥がれ落ちた成熟CEC(Soloveyら、Blood,93:3824−3830(1999))の両方において抗アポトーシス経路を活性化することによって、生存を促進すると考えられている。成熟CECは、CEPCと比較して、限定された増殖能力しか有していないようであるが、VEGFはまた、CEPC又は成熟CECの増殖を促進するかもしれない(Linら、J.Clin.Invest.,105:71−77(2000))。これらの理由のため、CEC及び/又はCEPCは、溶解の前にVEGFとのインキュベートによって活性化される。
1)増殖因子VEGF,FGF,PDGF,PIGF,及び/又はアンギオポイエチン(angiopoietin)は、各100nMで細胞に添加され、37℃で5分間インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度のアバスタチン(Avastin)、ネクサバール(Nexavar)、スーテント(Sutent)及び/又はラパマイシン類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、増殖因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF、及び/又はアンギオポイエチンを添加することによって活性化され、37℃で5分間インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度のアバスチン、ネクサバール、スーテント、及び/又はラパマイシン類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、VEGF、FGF、PDGF、PIGF、及び/又はアンギオポイエチンを各100nMで添加することによって活性化され、37℃で120分間インキュベートされる。
1)新鮮な溶解緩衝液が表1に記載された試薬を混合することによって新たに用意される。
2)最終洗浄後、細胞は、氷上で、100μlの冷却された緩衝液に再懸濁される。
3)インキュベートが30分間氷上で行われる。
4)混合物は、溶解物からビーズを分離するために、10分間最速で、マイクロチューブ中で遠心分離される。
5)溶解物は、分析のために新しいチューブに移され、−80℃で保存される。
活性化された細胞:
1)増殖因子TGF−α(100nM)、ヘレグリン(10nM)、及び/又はIGF(100nM)が細胞に添加され、37℃で5分間インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度のヘルセプチン、ラパタニブ、タルセバ、及び/又はラパマイシン類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、増殖因子TGF−α(100nM)、ヘレグリン(100nM)、及び/又はIGF(100nM)を添加することによって活性化され、37℃で5分間インキュベートされる。
1)試料は、37℃で30分間、治療に効果的な濃度のヘルセプチン、ラパタニブ、タルセバ、及び/又はラパマイシン類縁体で処理される。
2)細胞は、その後、増殖因子TGF−α(100nM)、ヘレグリン(100nM)、及び/又はIGF(100nM)を添加することによって活性化され、37℃で120分間インキュベートされる。
1)新鮮な溶解緩衝液が表1に記載された試薬を混合することによって新たに用意される。
2)最終洗浄後、細胞は、氷上で、100μlの冷却された緩衝液に再懸濁される。
3)インキュベートが30分間氷上で行われる。
4)混合物は、溶解物からビーズを分離するために、10分間最速で、マイクロチューブ中で遠心分離される。
5)溶解物は、分析のために新しいチューブに移され、−80℃で保存される。
この実施例は、希少循環細胞中の単一の伝達分子の活性状態を分析するために適した、優れたダイナミックレンジを有する、多重、ハイスループットの単一検出サンドイッチELISAを説明する:
1)96穴マイクロタイタープレートは、4℃で一晩、捕捉抗体で覆われた。
2)プレートは、翌日、1時間、2%BSA/TBS−Tweenで遮断(ブロック)された。
3)TBS−Tweenで洗浄後、細胞溶解物又は組み換えタンパク質は、一連の希釈で添加され、室温で2時間インキュベートされた。
4)プレートは、TBS−Tweenで4回洗浄され、その後、室温で2時間、ビオチン標識検出抗体とともにインキュベートされた。
5)検出抗体とのインキュベート後、プレートはTBS−Tweenで4回洗浄され、その後、ストレプトアビジン標識西洋わさびペルオキシダーゼ(SA−HRP)がビオチン標識検出抗体に結合するように、室温で1時間、SA−HRPとインキュベートされた。
6)シグナル増幅のため、ビオチン−チラミドは、0.015%H2O2とともに5μg/mlで添加され、15分間反応させられた。
7)TBS−Tweenで6回洗浄後、SA−HRPが添加され、30分間インキュベートされた。
8)TBS−Tweenで6回洗浄後、HRP基質TMBが添加され、色が遮光下で2〜10分間発色させられた。反応は、0.5MH2SO4を添加することによって停止された。シグナルは、マイクロプレートリーダーにて450/570nmで走査された。
この実施例は、希少循環細胞中の単一の伝達分子の活性状態を分析するために適した、優れたダイナミックレンジを有する、多重で、ハイスループットの単一検出マイクロアレイELISAを説明する:
1)捕捉抗体は、2倍連続希釈で16パッドFASTスライド(WhatmanInc.;Florham Park,NJ)上に印刷された。
2)一晩乾燥後、スライドは、Whatmanブロッキング緩衝液で遮断(ブロック)された。
3)細胞溶解物80μlが10倍連続希釈で各パッドに添加された。このスライドは、室温で2時間インキュベートされた。
4)TBS−Tweenで6回洗浄後、80μlのビオチン標識検出抗体が、室温で2時間インキュベートされた。
5)6回洗浄後、ストレプトアビジン標識西洋わさびペルオキシダーゼ(SA−HRP)が添加され、SA−HRPがビオチン標識検出抗体に結合するように、1時間インキュベートされた。
6)シグナル増幅のため、5μg/mlのビオチン−チラミド80μlが添加され、15分間反応させられた。このスライドは、TBS−Tweenで6回、20%DMSO/TBS−Tweenで2回、そしてTBSで1回洗浄された。
7)80μlのSA−Alexa555が添加され、30分間インキュベートされた。このスライドは、その後、2回洗浄され、5分間乾燥され、マイクロアレイ検出器(Perkin−Elmer,Inc.;Waltham,MA)で走査された。
この実施例は、希少循環細胞中の単一の伝達分子の活性状態を分析するために適した、優れたダイナミックレンジを有する、多重で、ハイスループットの近接2重検出マイクロアレイELISAを説明する:
1)捕捉抗体は、1mg/mlから0.004mg/mlまでの連続希釈で16パッドFASTスライド(WhatmanInc.)上に印刷された。
2)一晩乾燥後、スライドは、Whatmanブロッキング緩衝液で遮断(ブロック)された。
3)A431細胞溶解物80μlが10倍連続希釈で各パッドに添加された。このスライドは、室温で2時間インキュベートされた。
4)TBS−Tweenで6回洗浄後、TBS−Tween/2%BSA/1%FBS中で希釈された近接分析のための検出抗体80μlがスライドに添加された。使用された検出抗体は:(1)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接共役された抗−EGFRモノクローナル抗体;及び(2)西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)に直接共役されたリン酸化EGFRの細胞を認識するモノクローナル抗体、であった。インキュベートは、室温で2時間であった。
5)代替的には、検出工程は、リン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体のビオチン結合体を用いた。これらの例では、6回洗浄後、1時間のストレプトアビジン−HRPとのインキュベートの追加の連続工程が含まれた。
6)代替的には、検出工程は、抗EGFR抗体のオリゴヌクレオチドを介したグルコースオキシダーゼ(GO)結合体を用いた。リン酸化EGFRの細胞へのHRPの直接に結合された又はビオチン−ストレプトアビジン(SA)を介した結合体が用いられた。
6)シグナル増幅のため、5μg/mlのビオチン−チラミド80μlが添加され、15分間反応させられた。このスライドは、TBS−Tweenで6回、20%DMSO/TBS−Tweenで2回、そしてTBSで1回洗浄された。
7)80μlのSA−Alexa555が添加され、30分間インキュベートされた。このスライドは、その後、2回洗浄され、5分間乾燥され、マイクロアレイ検出器(Perkin−Elmer,Inc.)で走査された。
この実施例は、希少循環細胞における複数のシグナル伝達分子の活性状態を解析するために適した優れたダイナミックレンジを有する、多重で、ハイスループットで、アドレス可能な近接2重検出マイクロアレイを説明する:
1)捕捉抗体は、16パッドFASTスライド(WhatmanInc.)上に印刷された。印刷された捕捉抗体は、EGFR、HER2、Erk、Shc、PI3K、及びパン−サイトケラチン(pan−cytokeratin)であった。各捕捉抗体の2倍希釈系列(0.25mg/ml,0.125mg/ml、及び0.0625mg/ml)が使用され、2重及び4重のスポットが各抗体希釈に対して作製された。
2)一晩乾燥後、スライドは、Whatmanブロッキング緩衝液で遮断(ブロック)された。
3)細胞溶解物80μlが10倍連続希釈で各パッドに添加された。このスライドは、室温で2時間インキュベートされた。
4)TBS−Tweenで6回洗浄後、TBS−Tween/2%BSA/1%FBSで希釈された近接分析のための検出抗体80μlがスライドに添加された。使用された検出抗体は、(1)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接共役された抗EGFRモノクローナル抗体;及び(2)HRPに直接共役されたリン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体であった。インキュベートは、室温で2時間であった。
5)代替的には、検出工程は、リン酸化EGFRの細胞を認識するモノクローナル抗体のビオチン結合体を用いた。これらの例では、6回洗浄後、1時間ストレプトアビジン−HRPとのインキュベートの追加の連続工程が含まれた。
6)代替的には、検出工程は、抗EGFR抗体のオリゴヌクレオチドを介したグルコースオキシダーゼ共役体を用いた。リン酸化EGFRの細胞へのHRPの直接共役された又はビオチン−ストレプトアビジン(SA)を介した共役体のいずれかが使用された。
7)総HER2及びリン酸化タンパク質を検出するため、工程4)、5)、又は6)がEGFRを認識するモノクローナル抗体の代わりにHER2を認識するモノクローナル抗体を用いて行われた。
8)シグナル増幅のため、5μg/mlのビオチン−チラミド80μlが添加され、15分間反応させられた。このスライドは、TBS−Tweenで6回、20%DMSO/TBS−Tweenで2回、TBSで1回洗浄された。
9)80μlのSA−Alexa555が添加され、30分間インキュベートされた。このスライドは、その後、2回洗浄され、5分間乾燥され、そしてマイクロアレイ検出器(Perkin−Elmer,Inc.)で取り込まれた。
この実施例は、希少循環細胞におけるシグナル伝達分子の活性状態を分析するためのダイナミックレンジが、多重、ハイスループットな、近接2重検出マイクロアレイ分析における捕捉抗体の希釈系列化を行うことによって増大され得ることを説明する:
1)捕捉抗体は、16パッドFASTスライド(WhatmanInc.)上に印刷された。各捕捉抗体は、全部で9つの濃度のために連続的に2倍に希釈された(1mg/mlで開始し;0.004mg/mlで終了する)。
2)一晩乾燥後、スライドは、Whatmanブロッキング緩衝液で遮断(ブロック)された。
3)細胞溶解物80μlが10倍連続希釈で各パッドに添加された。このスライドは、室温で2時間インキュベートされた。
4)TBS−Tweenで6回洗浄後、TBS−Tween/2%BSA/1%FBSに希釈された近接分析のための検出抗体80μlがスライドに添加され亜。使用された検出抗体は:(1)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接共役された抗EGFRモノクローナル抗体;及び(2)HRPに直接共役されたリン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体であった。インキュベートは、室温で2時間であった。
5)代替的には、検出工程は、リン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体のビオチン結合体を用いた。これらの例では、6回洗浄後、1時間ストレプトアビジン−HRPとのインキュベートの追加の連続工程が含まれた。
6)代替的には、検出工程は、抗EGFR抗体のオリゴヌクレオチド抗体のオリゴヌクレオチドを介したグルコースオキシダーゼ結合体を用いた。リン酸化EGFRの細胞へのHRPの直接結合された又はビオチン−ストレプトアビジン(SA)を介した結合体のいずれかが使用された。
7)シグナル増幅のため、5μg/mlのビオチン−チラミド80μlが添加され、15分間反応させられた。このスライドは、TBS−Tweenで6回、20%DMSO/TBS−Tweenで2回、TBSで1回洗浄された。
8)80μlのSA−Alexa555が添加され、30分間インキュベートされた。このスライドは、その後、2回洗浄され、5分間乾燥され、そしてマイクロアレイ検出器(Perkin−Elmer,Inc.)で取り込まれた。
この実施例は、オリゴヌクレオチド結合抗体又は酵素を生成するための共役及び品質制御過程を説明する。
1)72塩基のオリゴヌクレオチドリンカーが5’−SH基と6−炭素スペーサーとともに合成された。
2)凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドリンカーは、pH7.4、20mMのTris−HClに溶解される。125nmolのリンカーは、その後、室温で2時間、終濃度50mMで、0.5MのTCEP−HCl(Pierce;Rockford,IL)と処理された。反応混合物中のトリス、TCEP、及び非結合リンカーは、脱塩回転カラムを用いて除かれた。
3)結果として生じた脱保護オリゴヌクレオチドリンカーは、100μl反応容量中で、SMCCのようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて標的タンパク質の第1アミンに結合させられた。
4)反応混合物は、室温で2時間インキュベートされた。オリゴヌクレオチド結合抗体又は酵素は、SephacrylS−200 HRカラム(GE Healthcare;Piscataway,NJ).を用いたゲルフィルターろ過を用いて精製された。
1)グルコースオキシダーゼ(GO)分子が第1のオリゴヌクレオチドリンカーに結合された後、結果として生じたGO−オリゴヌクレオチドの3つの画分が精製後に回収され、10倍希釈系列で、ニトロセルロースで覆われたスライド上に印刷された。
2)IgGは、Alexa647及び第1のオリゴヌクレオチドリンカーに相補する配列を有する第2のオリゴヌクレオチドリンカーに結合された。結果として生じたAlexa647−オリゴヌクレオチドが結合した抗体は、チップ上に添加され、1倍濃度PBS緩衝液中、室温で1時間ハイブリダイズされ、そして数回洗浄された。
3)スライドは、乾燥され、そして核酸配列特異的なハイブリダイゼーションを確認するために、マイクロアレイ検出器で走査された。
4)グルコースオキシダーゼ酵素分析は、共役の過程が酵素の機能を変えていないことを確認した。
この実施例は、実施例7で記載したオリゴヌクレオチド結合体を用いた希少循環細胞中のシグナル伝達分子の活性状態を分析するための、多重で、ハイスループットなマイクロアレイ分析を説明する。
1)捕捉抗体は、16パッドFASTスライド(WhatmanInc.)上に印刷された。
2)一晩乾燥後、スライドは、Whatmanブロッキング緩衝液で遮断(ブロック)された。
3)細胞溶解物80μlが10倍連続希釈で各パッドに添加された。空井度は、室温で2時間インキュベートされた。
4)TBS−Tweenで6回洗浄後、TBS−Tween/2%BSA/1%FBSに希釈された近接分析のための検出抗体80μlがスライドに添加された。使用された検出抗体は:(1)Alexa647と、及びグルコースオキシダーゼ(GO)に共役されたオリゴヌクレオチドに相補する配列から構成されるオリゴヌクレオチドリンカーと、に直接共役された抗−EGFRモノクローナル抗体;及び(2)西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)に直接共役されたリン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体、であった。Alexa647−オリゴヌクレオチド結合抗EGFR抗体は、図18に示された複合体を形成するため、GO−オリゴヌクレオチドと接触した。過剰な非結合試薬はTBS−Tweenで6回洗浄することによって除去された。
5)グルコースは、その後、チラミド−Alexa555とともに反応に添加された。
6)総EGFR量は、Alexa647−オリゴヌクレオチド−結合抗EGFR抗体の直接結合によって検出された。リン酸化EGFRは、HRP共役抗p−EGFR抗体へのGO−オリゴヌクレオチドの隣接共役によって検出され、チラミドシグナル増幅によって可視化された。
7)スライドは、マイクロアレイ検出器(Perkin−Elmer,Inc.)で、Alexa647及びAlexa555に特異的なレーザーで走査された。
マイクロアレイの作製及び処理工程は、Chanら、Nat.Med.,10:1390−1396(2004)に記載の方法から適応される。シグナル伝達因子EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF−1R、Akt、Erk、p70S6K、Bad、Rsk、Mek、cSrc、サイトケラチン、チューブリン、β−アクチン(β−actin)に対する抗体(1mg/ml)、及び抗−マウス抗体(陽性対照)(4/4アレイ)は、FAST(登録商標)スライド(WhatmanInc.;Florham Park,NJ)に抗体をスポットするための固相スポッティングピンで適合された密接印刷ロボットマイクロアレイ作製機(Bio−Rad Laboratories;Hercules,CA)を用いて384穴ポリプロピレンプレート(50μl/穴)に移される。8分割されたパッドで覆われたスライドが使用される。印刷後、スライドは、3%カゼイン溶液で遮断(ブロック)される。スライドは、使用前に乾燥条件下で少なくとも一晩保存される。
CEC及びCEP細胞が、磁気ダイナビーズに付着したモノクローナル抗体P1H12又はCD146を用いた免疫磁気捕獲によって濃縮されることを除いて、実施例9で記載された同一の患者試料、使用準備、及び分析方法が使用される。マイクロアレイは、配置された抗体が以下の分析物に特異的であることを除いて、実施例9に記載の方法を用いて作製され、処理される:VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3,TIE1,TIE2,PDGFR−α,PDGFR−β,FGFR1,FGFR2,Akt,Erk,p70S6K,Rsk,cSrc、及びβ−アクチン。実施例9に記載の分析方法は、CEC及びCEPシグナル伝達を検出するために用いられる。
1.優れたダイナミックレンジを有する、多重で、ハイスループットな免疫分析を行うための方法であって、
前記方法は、
(a)複数の捕捉された分析物を形成するために、細胞抽出物を、前記細胞抽出物中の一つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、
前記捕捉抗体が、固相担体に拘束されている、ことを特徴とする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するために、前記複数の捕捉された分析物を、前記対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記検出抗体は、
(1)促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、及び
(2)シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体、
から構成され、
前記促進部分は、前記シグナル増幅対の前記第一の構成因子に方向付けられ且つ前記第一の構成因子と反応する酸化剤を生成する、ことを特徴とする工程;
(c)増幅されたシグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された分析物を前記シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートする工程;及び
(d)前記シグナル増幅対の前記第一及び第二の構成因子から生じた前記増幅されたシグナルを検出する工程、
を備える、ことを特徴とする免疫分析方法。
2.前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物から構成される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
3.前記細胞が免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、ことを特徴とする実施形態2に記載の免疫分析方法。
4.前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態3に記載の免疫分析方法。
5.前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態3に記載の免疫分析方法。
6.前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子で刺激される、ことを特徴とする実施形態3に記載の免疫分析方法。
7.前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、ことを特徴とする実施形態6に記載の免疫分析方法。
8.前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態7に記載の免疫分析方法。
9.前記単離された細胞が、前記細胞抽出物を作製するために、増殖因子の刺激の後に、溶解される、ことを特徴とする実施形態6に記載の免疫分析方法。
10.前記一つ又はそれ以上の分析物が、複数のシグナル伝達分子から構成される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
11.前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
12.前記活性状態非依存抗体がさらに、検出可能な部分を備える、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
13.前記検出可能な部分が、フルオロフォアである、ことを特徴とする実施形態12に記載の免疫分析方法。
14.前記検出可能な部分の量が、一つ又はそれ以上の前記分析物の量と相関関係にある、ことを特徴とする実施形態12に記載の免疫分析方法。
15.前記活性状態非依存抗体が、チャネリング部分で直接標識される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
16.前記活性状態非依存抗体が、前記活性状態非依存抗体に共役されたオリゴヌクレオチドと前記チャネリング部分に共役された相補オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを介して前記チャネリング部分で標識される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
17.前記活性状態依存抗体が、前記シグナル増幅対の第一の構成因子で直接標識される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
18.前記活性状態依存抗体が、前記活性状態依存抗体に共役された結合対の第一の構成因子と前記シグナル増幅対の第一の構成因子に共役された前記結合対の第二の構成因子との間の結合を介して前記シグナル増幅対の第一の構成因子で標識される、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
19.前記結合対の前記第一の構成因子がビオチンである、ことを特徴とする実施形態18に記載の免疫分析方法。
20.前記結合対の前記第二の構成因子がストレプトアビジンである、ことを特徴とする実施形態18に記載の免疫分析方法。
21.前記チャネリング部分がグルコースオキシダーゼである、ことを特徴とする実施形態1に記載の免疫分析方法。
22.前記酸化剤が過酸化水素(H2O2)である、ことを特徴とする実施形態21に記載の免疫分析方法。
23.前記シグナル増幅対の前記第一の構成因子がペルオキシダーゼである、ことを特徴とする実施形態22に記載の免疫分析方法。
24.前記ペルオキシダーゼが西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)である、ことを特徴とする実施形態23に記載の免疫分析方法。
25.前記シグナル増幅対の前記第二の構成因子がチラミド試薬である、ことを特徴とする実施形態23に記載の免疫分析方法。
26.前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、ことを特徴とする実施形態25に記載の免疫分析方法。
27.前記増幅されたシグナルが、活性型チラミドを生産するための前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、ことを特徴とする実施形態26に記載の免疫分析方法。
28.前記活性型チラミドが直接検出される、ことを特徴とする実施形態27に記載の免疫分析方法。
29.前記活性型チラミドが、シグナル検出試薬の添加で検出される、ことを特徴とする実施形態27に記載の免疫分析方法。
30.前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、ことを特徴とする実施形態29に記載の免疫分析方法。
31.前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組み合わせである、ことを特徴とする実施形態29に記載の免疫分析方法。
32.前記発色試薬が、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、ことを特徴とする実施形態31に記載の免疫分析方法。
33.細胞抽出物中の一つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体から構成される、優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、前記捕捉抗体が固相担体に拘束される、ことを特徴とするアレイ。
34.前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物から構成される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
35.前記細胞が、免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、ことを特徴とする実施形態34に記載のアレイ。
36.前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態35に記載のアレイ。
37.前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態35に記載のアレイ。
38.前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子で刺激される、ことを特徴とする実施形態35に記載のアレイ。
39.前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の前に、抗癌剤とインキュベートされる、ことを特徴とする実施形態38に記載のアレイ。
40.前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態39に記載のアレイ。
41.前記単離された細胞が、前記細胞抽出物を作製するために、増殖因子の刺激の後に、溶解される、ことを特徴とする実施形態38に記載のアレイ。
42.前記一つ又はそれ以上の分析物が、複数のシグナル伝達分子から構成される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
43.前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
44.各希釈系列が少なくとも3つの下降する捕捉抗体濃度から構成される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
45.各希釈系列が少なくとも6つの下降する捕捉抗体濃度から構成される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
46.各希釈系列における前記捕捉抗体が少なくとも2倍で連続的に希釈される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
47.前記一つ又はそれ以上の分析物が、約1細胞中で検出される、ことを特徴とする実施形態33に記載のアレイ。
48.優れたダイナミックレンジを有し、多重で、ハイスループットな免疫分析を行うための方法であって、
前記方法は、
(a)複数の捕捉された分析物を形成するために、細胞抽出物を、前記細胞抽出物中の一つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記捕捉抗体が固相担体に拘束されている、ことを特徴とする工程;
(b)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成するために、前記複数の捕捉された分析物を、前記対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートする工程;
(c)増幅されたシグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子とインキュベートする工程;及び
(d)前記シグナル増幅対の前記第一及び第二の構成因子から生じた増幅されたシグナルを検出する工程、
を備える、ことを特徴とする免疫分析方法。
49.前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物から構成される、ことを特徴とする実施形態48に記載の免疫分析方法。
50.前記細胞が、免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、ことを特徴とする実施形態49に記載の免疫分析方法。
51.前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態50に記載の免疫分析方法。
52.前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態50に記載の免疫分析方法。
53.前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子で刺激される、ことを特徴とする実施形態50に記載の免疫分析方法。
54.前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、ことを特徴とする実施形態53に記載の免疫分析方法。
55.前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態54に記載の免疫分析方法。
56.前記単離された細胞が、前記細胞抽出物を生成するために、増殖因子の刺激の後に、溶解される、ことを特徴とする実施形態53に記載の免疫分析方法。
57.前記一つ又はそれ以上の分析物が、複数のシグナル伝達分子から構成される、ことを特徴とする実施形態48に記載の免疫分析方法。
58.前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせから構成される集団から選択される、ことを特徴とする実施形態48に記載の免疫分析方法。
59.前記検出抗体が、結合対の第一の構成因子から構成される、ことを特徴とする実施形態48に記載の免疫分析方法。
60.前記結合対の前記第一の構成因子がビオチンである、ことを特徴とする実施形態59に記載の免疫分析方法。
61.前記シグナル増幅対の前記第一の構成因子が、前記結合対の第二の構成因子から構成される、ことを特徴とする実施形態48に記載の免疫分析方法。
62.前記結合対の前記第二の構成因子が、ストレプトアビジンである、ことを特徴とする実施形態61に記載の免疫分析方法。
63.前記シグナル増幅対の前記第一の構成因子がペルオキシダーゼであることを特徴とする実施形態61に記載の免疫分析方法。
64.前記ペルオキシダーゼが西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)である、ことを特徴とする実施形態63に記載の免疫分析方法。
65.前記シグナル増幅対の前記第二の構成因子がチラミド試薬である、ことを特徴とする実施形態63に記載の免疫分析方法。
66.前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、ことを特徴とする実施形態65に記載の免疫分析方法。
67.前記増幅されたシグナルが、活性型チラミドを作製するための前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、ことを特徴とする実施形態66に記載の免疫分析方法。
68.前記活性型チラミドが直接検出される、ことを特徴とする実施形態67に記載の免疫分析方法。
69.前記活性型チラミドが、シグナル検出試薬の添加で検出される、ことを特徴とする実施形態67に記載の免疫分析方法。
70.前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、ことを特徴とする実施形態69に記載の免疫分析方法。
71.前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組み合わせである、ことを特徴とする実施形態69に記載の免疫分析方法。
72.前記発色試薬が、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、ことを特徴とする実施形態71に記載の免疫分析方法。
Claims (10)
- 抗体に基づくアレイ方法を実行するためのキットであって、
(a)固相担体上に拘束された複数の捕捉抗体の希釈系列;
(b)i)グルコースオキシダーゼでそれぞれ標識された複数の活性状態非依存抗体、及びii)ペルオキシダーゼでそれぞれ標識された複数の活性状態依存抗体を含む、一つ又はそれ以上の分析物に特異的な複数の検出抗体;及び
(c)一つ又はそれ以上の分析物の活性状態を検出するためにこのキットを用いる方法のための使用説明書
を含み、
活性状態非依存抗体、及び活性状態依存抗体の両方の分析物への結合は、グルコースオキシダーゼを十分に近接した範囲内でペルオキシダーゼに向かわせ、グルコースオキシダーゼによって生成された過酸化水素(H 2 O 2 )は、ペルオキシダーゼに向けられ、結果として検出可能な及び/又は増幅可能なシグナルの生成をもたらす、キット。 - 前記一つ又はそれ以上の分析物が、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項1に記載のキット。
- 前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1または2に記載のキット。
- 細胞抽出物中の一つ又はそれ以上の分析物の活性状態を検出するための請求項1〜3のいずれか一項に記載のキットの使用であって、前記複数の捕捉抗体は、細胞抽出物中の一つ又はそれ以上の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体を含む、キットの使用。
- 前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む、請求項4に記載のキットの使用。
- 前記細胞が、免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、請求項5に記載のキットの使用。
- 前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項6に記載のキットの使用。
- 前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項6に記載のキットの使用。
- 前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子で刺激される、請求項6に記載のキットの使用。
- 前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の後に溶解されて、前記細胞抽出物を生成する、請求項9に記載のキットの使用。
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