CN104198705B

CN104198705B - 检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列

Info

Publication number: CN104198705B
Application number: CN201410364918.4A
Authority: CN
Inventors: J·哈维; S·辛格; P·金; X·刘; R·巴罕姆; L·刘
Original assignee: Societe dAssistance Technique pour Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2027-09-20
Also published as: JP5722298B2; AU2007299774A1; NZ575827A; CA2664108C; MX2009003048A; CN104198705A; RU2009114851A; IL225305A; EP2064549A2; EP2064549B1; CA2664108A1; ES2398596T3; DK2064549T3; HK1135178A1; KR101424304B1; WO2008036802A3; JP2013068627A; JP2010504532A; WO2008036802A2; ES2583079T3

Abstract

本发明提供了用于检测稀有循环细胞内众多信号转导分子的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列以及使用该阵列来帮助癌症预后和诊断及设计个性化、定向治疗的方法。

Description

检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列

本申请是申请日为2007年9月20日、发明名称为“检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列”的中国专利申请200780042849.3(国际申请号PCT/US2007/079002)的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2006/9/21提交的美国专利申请号11/525,598(该申请已变为美国临时专利申请No.____)和2007/8/20提交的美国临时申请号60/913,087的优先权，出于所有目的将它们的内容通过引用全文纳入本文。

发明背景

经常在癌症不同早期阶段的患者血液内发现“微小转移”肿瘤细胞(散布肿瘤细胞)，在转移癌中也有发现。血液中肿瘤细胞的数目取决于肿瘤的阶段和类型。肿瘤是极其异质性的。因此，单个部位的活检样品可能无法代表肿瘤群的异质性。活检样品通常从原发性肿瘤上获得；然而，无法对大多数转移瘤进行活检，从而更难于对肿瘤样品进行分子分析。

在肿瘤转移期间，最具攻击性的肿瘤细胞离开原发性肿瘤并经血液和淋巴系统到达远端位置。因此，血液中的循环肿瘤细胞是肿瘤细胞中最具攻击性和同质性的群体。每毫升血液中转移肿瘤细胞的数目可从一个到几千个。因此，需要特异且灵敏的方法为诊断和预后目的来检测这些细胞。本发明满足了这一需要并提供了有关优点。

发明概述

本发明提供了用于检测稀有循环细胞内众多信号转导分子的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列以及其用法，其优点在于具有酶联免疫吸附试验的特异性、信号放大的灵敏性以及微阵列的高通量多重性。

一方面，本发明提供了一种具有高动态范围(superior dynamic range)的阵列，其包含细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上。

另一方面，本发明提供了一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(a)将细胞提取物与该细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列一起培育以形成众多捕获分析物，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上；

(b)将该众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物；

(c)将该众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育以产生放大信号；和

(d)检测由信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

在还有另一方面，本发明提供了一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(b)将该众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物，其中该检测抗体包含：

(1)众多用易化部分(facilitating moiety)标记的活化状态非依赖性抗体，和

(2)众多用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体，

其中所述易化部分产生导向信号放大对的第一成员并与其反应的氧化剂；

(c)将众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第二成员一起培育以产生放大信号；和

(d)检测由该信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

本发明还提供了进行上述基于抗体的阵列方法的试剂盒，其包含：(a)局限在固相支持体上的众多捕获抗体的稀释系列；和(b)众多检测抗体。该试剂盒还任选包含诸如信号放大对的第一和第二成员等其他试剂。

通过以下详述和附图，本领域技术人员能明白本发明的其它目的、特征和优点。

附图简述

图1显示了特异性结合于活化分析物的三个抗体。

图2显示了试验过程，其中已经特异性结合于活化分析物的标记的抗体局限在固相支持体上。

图3显示了在ELISA中用抗EGFR胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测A431细胞中的总EGFR。(a)夹心ELISA标准曲线。采用人EGFR重组胞外域的灵敏度为约0.25pg/孔。(b)细胞滴定曲线。A431细胞内的EGFR浓度通过ELISA检测。(c)以pg/孔和pg/细胞计算出的总EGFR浓度。计算出的各A431细胞内的EGFR浓度为约0.6pg。

图4显示了在ELISA中用抗EGFR胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化EGFR的生物素-标记的单克隆抗体作为检测抗体检测A431细胞中的磷酸化EGFR。(a)采用捕获抗体稀释系列获得的细胞滴定曲线。(b)细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.0625微克/毫升时单细胞水平的信/噪比为1.78。

图5显示了在ELISA中用抗ErbB2胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测SKBr3细胞中的总ErbB2。(a)SKBr3细胞中总ErBb2的细胞滴定。检测范围介于约1,000个细胞至约1.37个细胞。(b)细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为1微克/毫升时1.37细胞水平的信/噪比为2.71。

图6显示了在ELISA中用抗ErbB2胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化ErbB2的单克隆抗体作为检测抗体检测SKBr3细胞中的磷酸化ErBb2。(a)SKBr3细胞中磷酸化ErBb2的细胞滴定。检测范围介于约500个细胞至约5个细胞。(b)细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为1微克/毫升时5细胞水平的信/噪比为3.03。

图7显示了在ELISA中用抗Erk2单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测SKBr3细胞中总的和磷酸化的Erk2蛋白。(a)用抗Erk2单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测总的Erk2蛋白。(b)用抗Erk2单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化Erk2单克隆抗体作为检测抗体检测磷酸化Erk2蛋白。(c)细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。在1.37细胞水平时总的和磷酸化的Erk2的信/噪比约为3。

图8显示了在微阵列ELISA中用抗EGFR胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测A431细胞中的总EGFR。(a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10,000个细胞内的EGFR。(b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞(箭头)检测EGFR。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.0625毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为2.11。

图9显示了在微阵列ELISA中用抗EGFR胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化EGFR的单克隆抗体作为检测抗体检测A431细胞中的磷酸化EGFR。(a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10,000个细胞内的磷酸化EGFR。(b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞检测磷酸化EGFR。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为1.33。

图10显示了在微阵列ELISA中用抗ErBb2胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测SKBr3细胞中的总ErBb2。(a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10,000个细胞内的ErBb2。(b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞(箭头)检测ErBb2。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为15.27。

图11显示了在微阵列ELISA中用抗ErBb2胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化ErBb2的单克隆抗体作为检测抗体检测SKBr3细胞中的磷酸化ErBb2。(a)基于细胞数的捕获抗体稀释曲线。微阵列ELISA具有宽动态范围，可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10,000个细胞内的ErBb2。(b)基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线，显示可从一个细胞(箭头)检测磷酸化ErBb2。(c)稀释系列中各种捕获抗体浓度的细胞和背景之间的信/噪(S/N)比列表。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时(箭头)单细胞水平的信噪比为5.45。

图12显示了相近双检测器(proximity dual detector)微阵列ELISA与单检测器微阵列ELISA的灵敏度比较。A431细胞从10,000稀释到0.01细胞。捕获抗体从1毫克/毫升连续稀释到0.004毫克/毫升。

图13显示了单检测器微阵列ELISA与相近双检测器微阵列ELISA的检测特异性。(a)单检测器模式下各种捕获抗体浓度时A431细胞中磷酸化EGFR的滴定曲线。由于该模式下单个检测抗体缺乏特异性因此观察到非常高的背景。(b)相近双检测器模式下各种捕获抗体浓度时A431细胞中磷酸化EGFR的滴定曲线。由于该模式下通过检测两个检测抗体之间的相近性获得了提高的特异性因此观察了非常低的背景。

图14显示了采用捕获抗体稀释系列检测众多信号转导分子活化状态的可寻址微阵列模式的一个示例性实施方式。

图15显示了在受激A431细胞的滴定分析中检测磷酸化Shc的水平。可寻址阵列同时提供EGFR和HER2磷酸化信息。

图16显示了抗-EGFR捕获抗体的稀释曲线。该试验的动态范围大于5个log。每条单独曲线的动态范围约为2个log，当将6条提供信息曲线的信息组合时动态范围显著增加。

图17显示了本发明寡核苷酸偶联的质量控制过程。(a)显示了各种GO-寡核苷酸组分的微阵列点样图式。(b)Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗体对组分13-15中的GO-寡核苷酸具有最高结合亲和力。

图18显示了包含与葡萄糖氧化酶(GO)-寡核苷酸杂交的Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗-EGFR抗体、HRP-偶联的抗-磷酸化EGFR抗体、以及局限在固相支持体上的EGFR捕获抗体的多重磷酸化EGFR复合体的形成。

图19显示了同时检测总EGFR和磷酸化EGFR。(a)10,000个细胞中的总EGFR通过Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗-EGFR抗体生成的Alexa647信号来检测。EGFR磷酸化程度通过监测酪酰胺(tyramide)-介导的放大的Alexa555信号来检测。(b)总EGFR(t-EGFR)通过仅有10个细胞的直接结合试验来检测，磷酸化EGFR(p-EGFR)从1个细胞检测。10e⁵p-EGFR分子采用相近信号放大法(proximity signal amplification method)检测。采用该相近试验模式使得p-EGFR的检出限提高100倍以上。

发明详述

介绍

本发明提供了用基于抗体的阵列试验系统检测稀有循环细胞内众多信号转导分子的活化状态和/或总量的方法。一些实施方式中，本发明的多重、高通量免疫测定可在单个细胞水平上检测实体瘤循环细胞内一种或多种信号转导分子的活化状态。事实上，信号转导分子如EGFR的检测灵敏度约为100则摩尔(zeptomole，10^-21摩尔)，线性动态范围介于约100则摩尔至约100毫微微摩尔(femtomole)。如此，单细胞检测稀有循环细胞中多重信号转导分子活化状态有助于癌症预后和诊断以及个性化定向治疗的设计。

稀有循环细胞包括从实体瘤转移或微转移的实体瘤的循环细胞。循环肿瘤细胞、癌症干细胞以及移行到肿瘤的细胞(例如，由于化学吸引(chemoattraction))如循环内皮祖细胞、循环内上皮细胞、循环前血管生成(pro-angiogenic)骨髓细胞，以及循环树突细胞是实体瘤循环细胞的一些例子。

感兴趣的信号转导分子通常在分离循环细胞后不久被提取以保持它们的原位活化状态，优选在约24、6或1小时内，更优选在约30、15或5分钟内。分离细胞也可与一种或多种通常为纳摩尔至微摩尔浓度的生长因子一起培育约1-30分钟以回复或刺激信号转导分子的活化(参见，例如，Irish等，Cell，118：217-228(2004))。

如文中更加详细的解释，为评价用于个体患者的潜在抗癌疗法，可将分离细胞与一种或多种不同剂量的抗癌药一起培育。然后可用生长因子刺激数分钟(例如，约1-5分钟)或数小时(例如，约1-6小时)。有或没有抗癌药时信号传导途径的差异激活能够帮助选择对于各个体患者的合适剂量的合适癌症疗法。循环细胞也可在抗癌药治疗或用一种或多种生长因子刺激期间从患者样品分离，以便确定是否需要对疗法进行改进。如此，本发明方法能有利地帮助临床医生为每名患者在正确的时间提供正确剂量的正确抗癌药。

定义

在本文中，除非另有说明，以下术语具有它们自己的含义。

术语“癌症”意指包括以异常细胞非受控生长为特征的一类疾病的任何成员。该术语包括所有已知的癌症和肿瘤症状，无论其定性为恶性、良性、软组织性或实体性，以及包括转移前和转移后癌症在内的所有阶段和等级的癌症。不同癌症类型的例子包括但不限于：肺癌(例如，非小细胞肺癌)；消化道和胃肠道癌症如结肠直肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和胃癌；食管癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；乳腺癌；卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经系统癌症；皮肤癌；淋巴瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨原性肉瘤；和血癌。文中，“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。

术语"分析物"包括任何感兴趣的分子，通常是大分子如多肽，其存在、含量和/或同一性是确定的。某些情况下，分析物是实体瘤循环细胞的细胞组分，优选信号转导分子。

文中，术语"稀释系列"意指包括一系列递减浓度的特定样品(例如，细胞裂解液)或试剂(例如，抗体)。制备稀释系列时通常将测定量的起始浓度的样品或试剂与稀释剂(例如，稀释缓冲液)混合以形成较低浓度的样品或试剂，并重复该过程足够次数以获得所需数量的连续稀释液。样品或试剂可以至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500或1000-倍连续稀释以制得包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个递减浓度的样品或试剂的稀释系列。例如，为制造包含起始浓度为1毫克/毫升的捕获抗体试剂2-倍连续稀释的稀释系列，可将一定量起始浓度的捕获抗体与等量稀释缓冲液混合以得到浓度为0.5毫克/毫升的捕获抗体，并重复该过程以获得浓度为0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.0625毫克/毫升、0.0325毫克/毫升等的捕获抗体。

术语"高动态范围"在文中指本发明的试验检测少达一个细胞或多达数千细胞的特定分析物的能力。例如，本文所述免疫测定能采用捕获抗体浓度的稀释系列来有利地检测约1-10,000个细胞(例如，约1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10，000个细胞)中的感兴趣的特定信号转导分子，因此具有高动态范围。

术语"信号转导分子"或"信号转导分子"包括能执行某过程的蛋白质或其他分子，通过该过程细胞能将胞外信号或刺激转换成某反应，通常涉及细胞内有序的生化反应。信号转导分子的例子包括但不限于：受体酪氨酸激酶如EGFR(例如，EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体相关受体)、CSF-1R、FGFR1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA1-8、EPHB1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE1-2、TEK、RYK、DDR1-2、RET、c-ROS、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(间变性淋巴瘤激酶)、ROR1-2、MUSK、AATYK1-3和RTK106；非受体酪氨酸激酶如BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号传导级联组分如Akt、MAPK/ERK、MEK、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、PI3K、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p70S6激酶、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、PTEN、RSK1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；以及它们的组合。

文中，术语"循环细胞"包括已经从实体瘤转移或微转移的细胞。循环细胞的例子包括但不限于：循环肿瘤细胞，癌症干细胞，和/或移行到肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞，循环内皮细胞，循环前血管生成骨髓细胞，循环树突细胞，等等)。

术语"样品"在文中包括从患者获得的任何生物标本。样品包括但不限于：全血，血浆，血清，红血细胞，白血细胞(例如，外周血单核的细胞)，唾液，尿液，粪便(即，排泄物)，痰液，支气管灌洗液，泪液，乳头抽吸物，淋巴液(例如，淋巴结的弥散性肿瘤细胞)，细针抽吸物，任何其他体液，组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤活检样品(例如，针头活检样品)，以及它们的细胞提取物。一些实施方式中，所述样品是全血或其组成成分如血浆、血清或细胞团。在优选实施方式中，所述样品是采用本领域已知的任何技术从全血或其细胞组分分离实体瘤循环细胞并制备循环细胞的细胞提取物而获得的。在其他实施方式中，所述样品是，例如，来自肺、结肠或直肠的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织样品。

术语"对象"或"患者"通常包括人，但也包括其他动物，如其他灵长类、啮齿类、犬类、猫类、马类、羊类、猪类等等。

"阵列"或"微阵列"包括固定或局限在固相支持体上的捕获抗体的不同组和/或稀释系列，所述固相支持体例如玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如，磁珠，聚苯乙烯珠，等等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素，聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纤维束或任何其他合适基材。捕获抗体通常通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)固定或局限在固相支持体上。某些情况下，捕获抗体包含与结合于固相支持体的捕获剂相互作用的捕获标签。用于本发明试验的阵列通常包含偶联于固相支持体表面不同的已知/可寻址位点的众多不同的捕获抗体和/或捕获抗体浓度。

术语"捕获抗体"意指包括对样品中的一种或多种感兴趣分析物如实体瘤循环细胞的细胞提取物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合体)的固定抗体。在优选实施方式中，所述捕获抗体局限在阵列的固相支持体上。将任何一种信号转导分子固定在固相支持体上的合适捕获抗体获自加州特默库拉的奥普斯特公司(Upstate，Temecula，CA)、加州卡玛利奥的生物源公司(Biosource，Camarillo，CA)、马萨诸塞州丹维斯的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technologies(Danvers，MA)、明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)、加州弗里蒙特的实验室视觉公司(Lab Vision，Fremont，CA)、加州桑塔库兹的桑塔库兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)、密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO)、以及加州圣何塞的BD生物科技公司(BD Biosciences，San Jose，CA)。

术语"检测抗体"在文中包括包含对样品中的一种或多种感兴趣分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合体)的可检测标签的抗体。该术语还包括对一种或多种感兴趣分析物具有特异性的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标签的其他种类结合。可检测标签的例子包括但不限于：生物素/链霉抗生物素蛋白标签，核酸(例如，寡核苷酸)标签，化学反应性标签，荧光标签，酶标签，放射性标签，以及它们的组合。用于检测各种信号转导分子中任何一种的活化状态和/或总量的合适检测抗体获自加州特默库拉的奥普斯特公司(Upstate，Temecula，CA)、加州卡玛利奥的生物源公司(Biosource，Camarillo，CA)、马萨诸塞州丹维斯的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technologies(Danvers，MA)、明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)、加州弗里蒙特的实验室视觉公司(Lab Vision，Fremont，CA)、加州桑塔库兹的桑塔库兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO)、以及加州圣何塞的BD生物科技公司(BD Biosciences，San Jose，CA)。一个非限制性的例子是，抗EGFR、c-KIT、c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK、PTEN、Raf和MEK之类各种磷酸化形式的信号转导分子的磷酸特异性抗体获自桑塔库兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。

术语"活化状态依赖性抗体"包括对样品中一种或多种感兴趣分析物的特定活化状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合体)的检测抗体。在优选实施方式中，所述活化状态依赖性抗体检测一种或多种分析物如一种或多种信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合状态。一些实施方式中，受体酪氨酸激酶EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异二聚复合体的形成用活化状态依赖性抗体检测。适合用活化状态依赖性抗体检测的活化状态(在括号中列出)的非限制性例子包括：EGFR(EGFRvIII，磷酸化(p-)EGFR，EGFR：Shc，泛素化(u-)EGFR，p-EGFRvIII)；ErbB2(p85：截短的(Tr)-ErbB2，p-ErbB2，p85：Tr-p-ErbB2，Her2：Shc，ErbB2：PI3K，ErbB2：EGFR，ErbB2：ErbB3，ErbB2：ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3，ErbB3：PI3K，p-ErbB3：PI3K，ErbB3：Shc)；ErbB4(p-ErbB4，ErbB4：Shc)；IGF-1R(p-IGF-1R，IGF-1R：IRS，IRS：PI3K，p-IRS，IGF-1R：PI3K)；INSR(p-INSR)；KIT(p-KIT)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRa(p-PDGFRa)；PDGFRP(p-PDGFRP)；VEGFR1(p-VEGFR1，VEGFR1：PLCγ，VEGFR1：Src)；VEGFR2(p-VEGFR2，VEGFR2：PLCγ，VEGFR2：Src，VEGFR2：硫酸肝素，VEGFR2：VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；Tiel(p-Tiel)；Tie2(p-Tie2)；EphA(p-EphA)；EphB(p-EphB)；NFKB和/或IKB(p-IK(S32)，p-NFKB(S536)，p-P65：IKBa)；Akt(p-Akt(T308，S473))；PTEN(p-PTEN)；Bad(p-Bad(S112，S136)，Bad：14-3-3)；mTor(p-mTor(S2448))；p70S6K(p-p70S6K(T229，T389))；Mek(p-Mek(S217，S221))；Erk(p-Erk(T202，Y204))；Rsk-1(p-Rsk-1(T357，S363))；Jnk(p-Jnk(T183，Y185))；P38(p-P38(T180，Y182))；Stat3(p-Stat-3(Y705，S727))；Fak(p-Fak(Y576))；Rb(p-Rb(S249，T252，S780))；Ki67；p53(p-p53(S392，S20))；CREB(p-CREB(S133))；c-Jun(p-c-Jun(S63))；cSrc(p-cSrc(Y416))；以及桩蛋白(p-桩蛋白(Y118))。

术语"活化状态非依赖性抗体"包括对样品中一种或多种感兴趣分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合体)而不考虑它们的活化状态的检测抗体。例如，所述活化状态非依赖性抗体可检测一种或多种分析物如一种或多种信号转导分子的磷酸化和非磷酸化形式。

术语"核酸"或"多核苷酸"包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸类似物或者修饰的主链残基或连接键的核酸，它可以是合成的、天然产生的和非天然产生的，并具有参比核酸的类似结合特性。这种类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯，氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非特别限定，该术语包括具有参比核酸的类似结合特性的含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有说明，具体的核酸序列还隐含包括其保守性修饰的变体和互补序列以及隐含表示的序列。

术语"寡核苷酸"指RNA、DNA、RNA/DNA杂交体和/或其模拟物的单链寡聚体或聚合体。某些情况下，寡核苷酸由天然产生的(即，未修饰的)核碱基、糖和核苷内(主链)连接键构成。在某些其他情况下，寡核苷酸包括修饰的核碱基、糖和/或核苷内连接键。

文中，术语"错配基序"或"错配区"指寡核苷酸中不与其互补序列100％互补的部分。寡核苷酸可有至少1、2、3、4、5、6或更多错配区。错配区可以是毗连的或隔开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸。所述错配基序或错配区可包含单个核苷酸或者可包含2、3、4、5或更多核苷酸。

短语"严格杂交条件"指寡核苷酸将与其互补序列但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并将在不同情况下有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的更多指导可在Tijssen的《生物化学和分子生物学技术－核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes)，“杂交原则和核酸测定策略概述”(Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays)(1993)中找到。一般，选择的严格条件是在规定的离子强度pH下比特定序列的热解链温度(T_m)低约5-10℃。T_m是平衡时有50％的与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列过量时，在T_m下有50％的探针在平衡时被占据)。也可加入去稳定剂如甲酰胺来获得严格条件。对于选择性和/或特异性杂交，正信号至少是背景的2倍，优选至少是背景杂交的10倍。

对于两个或多个核酸，术语"基本相同"或“基本同一性”表示当采用序列比较算法或通过手工比对和目检在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，这两个或多个序列或亚序列是相同的或有规定比例的核苷酸是相同的(即，在特定区域上至少约60％，优选至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同)。当文中涉及该定义时还类似地表示序列互补物。优选地，在长度至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸的区域上存在这种基本同一性。

术语"培育"与“接触”和“暴露”以相同含义使用，且不暗指任何具体的时间或温度要求，如有说明除外。

实施方式的描述

抗体阵列

一方面，本发明提供了一种具有高动态范围的阵列，其包含对细胞提取物中一种或多种分析物具有特异性的捕获抗体的众多稀释系列，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上。

一些实施方式中，所述细胞提取物包含实体瘤循环细胞提取物。所述循环细胞通常采用一种或多种分离方法从患者样品分离，所述方法包括，例如，免疫磁分离(参见，例如，Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer，92：577-582(2001))，微流体分离(参见，例如，Mohamed等，IEEETrans.Nanobiosci.，3：251-256(2004)；Lin等，摘要编号5147，第97届AACR年会，华盛顿特区(2006))，FACS(参见，例如，Mancuso等，Blood，97：3658-3661(2001))，密度梯度离心(参见，例如，Baker等，Clin.Cancer Res.，13：4865-4871(2003))，以及耗竭法(参见，例如，Meye等，Int.J.Oncol.，21：521-530(2002))。

在其他实施方式中，所述患者样品包含全血、血清、血浆、尿液、痰液、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴液、唾液和/或细针抽吸物样品。在某些情况下，全血样品被分离成血浆或血清部分以及细胞部分(即，细胞团)。所述细胞部分通常含有红血细胞、白血细胞和/或实体瘤循环细胞如循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环内皮祖细胞(CEPC)、癌症干细胞(CSC)，以及它们的组合。所述血浆或血清部分通常含有核酸(例如，DNA、RNA)和由实体瘤循环细胞释放的蛋白质。

一些情况下，分离的循环细胞在与感兴趣的一种或多种抗癌药一起培育之前、期间和/或之后可用一种或多种生长因子体外刺激。刺激性生长因子包括但不限于：表皮生长因子(EGF)，调蛋白(HRG)，TGF-α，PIGF，血管生成素(Ang)，NRG1，PGF，TNF-α，VEGF，PDGF，IGF，FGF，HGF，细胞因子，等等。其他情况下，例如在生长因子刺激和/或抗癌药处理之后可用本领域已知的任何技术裂解分离的循环细胞以产生细胞提取物(例如，细胞裂解液)。优选地，在生长因子刺激后约1-360分钟之间开始细胞裂解，更优选在两个不同时间间隔进行裂解：(1)生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)生长因子刺激后约30-180分钟之间。或者，细胞裂解液可储存于-80℃直至使用。

在某些实施方式中，所述抗癌药包括抗-信号传导剂(即，细胞生长抑制药)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂(即，细胞毒药物)；和/或能够降低或消除异常细胞如癌性细胞不受控生长的任何其他化合物。一些实施方式中，联用抗-信号传导剂和/或抗增殖剂与一种或多种化疗剂处理分离的循环细胞。

适用于本发明的抗-信号传导剂的例子包括但不限于：单克隆抗体如曲妥单抗阿仑单抗贝伐单抗西妥昔单抗吉姆单抗帕木单抗(panitumumab)(Vectibix^TM)，利妥昔单抗和托西莫单抗酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼(gefitinib)舒尼替尼(sunitinib)埃罗替尼(erlotinib)拉帕替尼(lapatinib)(GW-572016)，卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)，赛玛西尼(semaxinib)(SU5416)，瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)，索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006；)，甲磺酸伊马替尼和来氟米特(SU101)；以及它们的组合。

抗增殖剂的例子包括：mTOR抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)，坦西罗利玛斯(temsirolimus)(CCI-779)和依维莫司(RAD001)；Akt抑制剂如1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯，9-甲氧基-2-甲基乙酸玫瑰花碱(9-methoxy-2-methylellipticinium acetate)，1，3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹噁啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮，10-(4'-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩噁嗪，3-甲酰色酮缩氨硫脲(Cu(II)Cl₂复合体)，API-2，衍生自原癌基因TCL1氨基酸10-24的15聚肽(Hiromura等，J.Biol.Chem.，279：53407-53418(2004)，KP372-1，和Kozikowski等，J.Am.Chem.Soc.，125：1144-1145(2003)和Kau等，Cancer Cell，4：463-476(2003)所述的化合物；以及它们的组合。

化疗剂的非限制性例子包括基于铂的药物(例如，奥沙利铂，顺铂，卡铂，螺铂，异丙铂，沙铂等等)，烷基化剂(例如，环磷酰胺，异磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法仑，氮芥，乌拉莫司汀，塞替派，亚硝基脲等等)，抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，亚叶酸，卡培他滨，阿糖胞苷，氟尿苷，氟达拉滨，吉西他滨，培美曲塞，雷替曲塞等等)，植物生物碱(例如，长春新碱，长春碱，长春瑞滨，长春地辛，鬼臼毒素，紫杉醇，多西他赛等等)，拓扑异构酶抑制剂(例如，伊立替康，托泊替康，安吖啶，依托泊苷(VP16)，磷酸依托泊苷，替尼泊苷等等)，抗肿瘤抗生素(例如，多柔比星，阿霉素，柔红霉素，表柔比星，放线菌素，博来霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素等等)，其药学上可接受的盐，其立体异构体，其衍生物，其类似物，以及它们的组合。

在优选实施方式中，所述细胞提取物中一种或多种分析物包含众多信号转导分子。感兴趣的信号转导分子的例子在上文中描述并包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶信号传导级联组分。

一些实施方式中，捕获抗体的各稀释系列包含一系列递减的捕获抗体浓度。某些情况下，所述捕获抗体被连续稀释至少2-倍(例如，2、5、10、20、50、100、500或1000-倍)以制得包含设定数目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)递减捕获抗体浓度的稀释系列，该稀释系列被点在阵列上。优选地，在阵列上点上各捕获抗体稀释液的至少2、3、4、5或6个复本。

在其他实施方式中，所述固相支持体包括玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纤维束或任何其他合适的基材。在一优选实施方式中，所述捕获抗体局限(例如，通过共价或非共价相互作用)在用硝酸纤维素聚合物涂布的玻璃载玻片上，例如，从新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司(Whatman Inc.，Florham Park，NJ)购得的载玻片。

作为一个非限制性例子，图14例举了一种可寻址微阵列，其包含众多捕获抗体稀释系列以测定EGFR、HER2、Shc、Erk和PI3K的活化状态，其中各稀释系列内的捕获抗体定向于这些分析物中的一种。因此，本发明的阵列包含众多一系列递减浓度的不同捕获抗体(即，连续稀释液)，其中所述捕获抗体偶联于不同可寻址位点内的固相支持体表面。

本领域技术人员将了解，该阵列可采取允许各活化信号转导分子的离散信号得以检测的任何构型。例如，阵列可以是支持表面上的线形或网状不同区域(例如，点或斑点)，各区域包含不同捕获抗体或捕获剂(即，用来结合捕获抗体上的捕获标签)。所述阵列可被构造成用于在单次多重试验中检测众多信号转导分子的活化状态的方法。在不同实施方式中，所述众多信号转导分子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多信号转导分子。

单检测试验

另一方面，检测肿瘤细胞如实体瘤循环细胞的细胞提取物中感兴趣特定分析物的活化状态的试验是一种具有高动态范围的多重、高通量单检测(即，两-抗体)试验。作为一个非限制性例子，用于该试验的两抗体可包含：(1)分析物的特异性捕获抗体；和(2)该分析物活化形式的特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)。例如，所述活化状态依赖性抗体能够检测分析物的磷酸化、泛素化和/或复合状态。或者，所述检测抗体包含活化状态非依赖性抗体，其检测细胞提取物中分析物的总量。所述活化状态非依赖性抗体通常能够检测活化和非活化形式的分析物。

在一个优选的方面，本发明提供了一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(b)将所述众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物；

(c)将众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育以产生放大信号；和

(d)检测该信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

一些实施方式中，所述细胞提取物包含实体瘤循环细胞的提取物。循环细胞通常采用本领域已知的一种或多种分离方法从患者样品分离，所述方法包括，例如，免疫磁分离、微流体分离、FACS、密度梯度离心和耗竭法。本领域技术人员将了解适合分开和/或分离循环细胞的其他方法。

在其他实施方式中，所述患者样品包含全血、血清、血浆、尿液、痰液、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴液、唾液和/或细针抽吸物样品。在某些情况下，全血样品被分离成血浆或血清部分以及细胞部分(即，细胞团)。所述细胞部分通常含有红血细胞、白血细胞和/或实体瘤循环细胞如CTC、CEC、CEPC和/或CSC。所述血浆或血清部分通常含有核酸(例如，DNA、RNA)和由实体瘤循环细胞释放的蛋白质，等等。

一些情况下，分离的循环细胞在与感兴趣的一种或多种抗癌药一起培育之前、期间和/或之后可用一种或多种生长因子体外刺激。刺激性生长因子在上文中描述。其他情况下，例如在生长因子刺激和/或抗癌药处理之后可用本领域已知的任何技术裂解分离的循环细胞以产生细胞提取物(例如，细胞裂解液)。优选地，在生长因子刺激后约1-360分钟之间开始细胞裂解，更优选在两个不同时间间隔进行裂解：(1)生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)生长因子刺激后约30-180分钟之间。或者，细胞裂解液可储存于-80℃直至使用。

在某些实施方式中，所述抗癌药包括抗-信号传导剂(例如，单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂，等等)、抗增殖剂、化疗剂和/或能够降低或消除异常细胞如癌性细胞不受控生长的任何其他化合物。落入这些常规治疗剂类别的具体抗癌药的例子在上文中提供。

在优选实施方式中，所述细胞提取物中一种或多种分析物包含众多信号转导分子。感兴趣的信号转导分子的例子在上文中描述并包括但不限于受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和/或酪氨酸激酶信号传导级联组分。

在其他实施方式中，所述固相支持体包括玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、PVDF等等)、纤维束或任何其他合适的基材。在一优选实施方式中，所述捕获抗体局限在用硝酸纤维素聚合物涂布的玻璃载玻片上，例如新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司的载玻片。

某些情况下，细胞提取物与已经局限在固相支持体上的捕获抗体一起培育。在某些其他情况下，细胞提取物先与溶液中的捕获抗体一起培育，然后接触固相支持体以固定捕获分析物，例如，通过与结合于固相支持体的捕获剂相互作用的捕获抗体上存在的捕获标签来固定。

一些实施方式中，检测抗体与结合于溶液中的或局限在固相支持体上的捕获抗体的分析物一起培育。某些情况下，包含众多分析物的细胞提取物首先与溶液中的检测抗体一起培育，然后接触溶液中的或局限在固相支持体上的捕获抗体。在某些其他情况下，包含众多分析物的细胞提取物首先与溶液中的捕获抗体和检测抗体一起培育，然后接触固相支持体以固定抗体-分析物复合体，例如，通过与结合于固相支持体的捕获剂相互作用的捕获抗体或检测抗体上存在的捕获标签来固定。

某些情况下，检测抗体包含活化状态非依赖性抗体，它可用于检测细胞提取物中一种或多种分析物的总量。作为一个非限制性例子，活化状态非依赖性抗体可检测一种或多种信号转导分子的磷酸化和非磷酸化形式。在某些其他情况下，检测抗体包含活化状态依赖性抗体，它用于检测细胞提取物中一种或多种分析物的活化状态。优选地，活化状态依赖性抗体检测一种或多种信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合状态。

就分析物接合而言，通常选择捕获抗体和检测抗体以尽可能减小它们之间的竞争(即，捕获抗体和检测抗体能同时结合它们相应的信号转导分子)。

在一优选实施方式中，检测抗体包含结合对的第一成员(例如，生物素)，而信号放大对的第一成员包含该结合对的第二成员(例如，链霉抗生物素蛋白)。采用本领域熟知方法可将结合对成员直接或间接偶联于检测抗体或偶联于信号放大对的第一成员。某些情况下，信号放大对的第一成员是过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)，过氧化氢酶，氯过氧化物酶，细胞色素c过氧化物酶，嗜曙红细胞过氧化物酶，谷胱甘肽过氧化物酶，乳过氧化物酶，髓过氧化物酶，甲状腺过氧化物酶，脱碘酶等等)，信号放大对的第二成员是酪酰胺试剂(酪酰胺试剂)(例如，生物素-酪酰胺)。这些情况中，放大信号是在有过氧化氢(H₂O₂)存在时由过氧化物酶氧化酪酰胺试剂以产生活化的酪酰胺而生成的。

活化的酪酰胺可直接检测或在加入信号检测试剂后检测，所述信号检测试剂例如链霉抗生物素蛋白-标记的荧光团或链霉抗生物素蛋白-标记的过氧化物酶和显色试剂的组合。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于：Alexa染料(例如，Alexa555)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，Oregon Green^TM；罗丹明，得克萨斯红，异硫氰酸四罗丹明(TRITC)，CyDye^TM荧光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等。可采用本领域熟知的方法将链霉抗生物素蛋白标签直接或间接偶联于荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的显色试剂的非限制性例子包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)，2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，4-氯-1-萘酚(4CN)，和/或卟啉原。

本领域技术人员将了解，按照这里所述的单检测试验，也可用除抗体外的结合伴侣来固定和/或检测细胞提取物中的一种或多种分析物。这种结合伴侣的非限制性例子包括分析物的配体或受体、分析物的底物、结合域(例如，PTB、SH2等等)、适体，等等。

相近双检测试验

另一方面，检测肿瘤细胞如实体瘤循环细胞的细胞提取物中感兴趣特定分析物的活化状态的试验是一种具有高动态范围的多重、高通量相近(即，三-抗体)试验。作为一个非限制性例子，用于该相近试验的三抗体可包含：(1)分析物的特异性捕获抗体；(2)该分析物活化形式的特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)；和(3)检测分析物总量的检测抗体(即，活化状态非依赖性抗体)。例如，所述活化状态依赖性抗体能够检测分析物的磷酸化、泛素化和/或复合状态。所述活化状态依赖性抗体通常能够检测活化和非活化形式的分析物。

(a)将细胞提取物与所述细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列一起培育以形成众多捕获分析物，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上；

(b)将所述众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物，其中所述检测抗体包含：

(1)众多用易化部分标记的活化状态非依赖性抗体，和

(d)检测信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

图1列举了一种示例性相近试验，其中的分析物结合于捕获抗体和两种检测抗体(即，一种活化状态非依赖性抗体和一种活化状态依赖性抗体)。捕获抗体1和活化状态非依赖性抗体2各自结合分析物6而与其活化状态无关。活化状态依赖性抗体3根据分析物的活化状态与其结合(例如，活化状态依赖性抗体将仅结合具有磷酸化残基的分析物的激活形式)。活化状态非依赖性抗体用易化部分(表示为M1，4)标记，而活化状态依赖性抗体用信号放大对的第一成员(表示为M2，5)标记。两种检测抗体与分析物的结合使得其内的易化部分充分接近(用虚线7内的区域表示)信号放大对的第一成员，从而易化部分生成的信号能够导向信号放大对的第一成员从而导致生成可检测和/或可放大的信号。各种相近导向(proximity channeling)方法是本领域已知的并包括，例如，FRET，时间解析荧光-FRET，LOCI等等。如本发明方法采用的相近导向的一个优点是，只有那些结合所有三种抗体的分析物才产生单个可检测的信号，从而提高了试验特异性、降低了背景并简化了检测。

一些实施方式中，所述细胞提取物包含实体瘤循环细胞的提取物。循环细胞通常采用本领域已知的一种或多种分离方法从患者样品分离，所述方法包括，例如，免疫磁分离、微流体分离、FACS、密度梯度离心和耗竭法。

某些情况下，细胞提取物与已经局限在固相支持体上的捕获抗体一起培育。在某些其他情况下，细胞提取物先与溶液中的捕获抗体一起培育，然后接触固相支持体以固定捕获的分析物，例如，通过与结合于固相支持体的捕获剂相互作用的捕获抗体上存在的捕获标签来固定。

一些实施方式中，检测抗体与结合于溶液中的或局限在固相支持体上的捕获抗体的分析物一起培育。某些情况下，包含众多分析物的细胞提取物首先与溶液中的检测抗体一起培育，然后接触溶液中的或限制在固相支持体上的捕获抗体接触。在某些其他情况下，包含众多分析物的细胞提取物首先与溶液中的捕获抗体和检测抗体一起培育，然后接触固相支持体以固定抗体-分析物复合体，例如，通过与结合于固相支持体的捕获剂相互作用的捕获抗体或检测抗体上存在的捕获标签来固定。在检测步骤之前，可洗涤固定的复合体以除去未形成复合体的抗体，经洗涤的复合体随后可从支持体表面释放并通过本文所述的合适方法检测各测试分析物的相近导向。

在支持体表面包含局限在阵列内的捕获剂的实施方式中，培育步骤可包括使溶液中的包含众多分析物的细胞提取物接触捕获抗体和检测抗体，使用的所有三种抗体应过量以使反应完全进行。在该方法的一种变化中，所得抗体-分析物复合体附于固相并洗涤以除去未结合的抗体。参考图2，捕获抗体1可包含捕获标签10。该复合体通过粘附于固相并与捕获标签结合的捕获剂11而附于固相12，从而固定该复合体。固定的复合体用合适的缓冲液洗涤，然后加入释放剂13以从固相释放。释放剂可通过导致洗涤过的复合体释放的任何机制起作用。一实施方式中，捕获标签包含被释放剂识别和切割的可切割位点。在图2所示的另一个实施方式中，释放剂与捕获标签竞争结合捕获剂。例如，捕获剂可以是与附于捕获抗体的部分互补寡核苷酸(即，捕获标签)杂交的第一寡核苷酸；而释放剂可以是与捕获剂完全互补的寡核苷酸，从而导致链置换和洗过的复合体从固相释放。可使用的合适捕获标签/捕获剂/释放剂的其他例子包括但不限于：2，4-二硝基酚(DNP)/抗-DNP抗体/2，4-DNP赖氨酸；T2/抗-T3抗体/T3；G毒毛旋花苷/抗-地高辛抗体/地高辛；以及脱硫生物素/链霉抗生物素蛋白/生物素(参见，例如，Ishikawa等，J.Clin.Lab Anal.，12：98-107(1998))。

洗涤过的复合体从固相释放之后对其进行以下处理之一：(1)与包含局限在阵列中的捕获分子的支持体表面接触，所述分子特异性结合捕获抗体上的捕获标签，或(2)解离，并使解离的检测抗体接触包含捕获剂的支持体表面，所述捕获剂特异性结合检测抗体上的捕获标签。图2描绘的实施方式中洗涤过的复合体是解离的并使解离的检测抗体接触支持体表面14。支持体表面包含众多局限在"可寻址"或"邮编码"阵列内的捕获分子。阵列的各个不同区域包含特异性结合活化状态非依赖性检测抗体2或活化状态依赖性抗体3上存在的捕获标签8的独特的捕获剂9，从而将有标签的检测抗体局限并组织在阵列内。在一优选实施方式中，所述捕获剂和捕获标签是相互特异性杂交的寡核苷酸。包含寡核苷酸捕获分子的可寻址阵列是本领域熟知的(参见，例如，Keramas等，Lab Chip，4：152-158(2004)；Delrio-Lafreniere等，Diag.Microbiol.Infect.Dis.，48：23-31(2004))。

阵列的各个不同区域处检测抗体的存在可用诸如易化部分(表示为M1，4)或信号放大对的第一成员(表示为M2，5)等部分直接或间接检测。可直接检测的部分的例子包括荧光团、生色团、胶体金、有色乳胶等等。一实施方式中，所述两个部分是独立选择的荧光团。可使用当相互非常接近时能提供可区别读数的任何荧光团对，例如，Cy3/Cy5，Cy5/藻红蛋白，等等。或者，如果使用寡核苷酸可寻址阵列，这两个部分可以是递送到不同邮编码的相同荧光团。可采用激光扫描共焦显微术来检测附在阵列上的荧光团部分。在复合体在检测之前从阵列上释放的试验中，如在标准置换试验中，检测荧光团部分的合适方法包括毛细管流共焦激光诱导的荧光、纳米-HPLC、微毛细管电泳等等。

一些实施方式中，活化状态非依赖性抗体还包含可检测部分。这种情况下，可检测部分的量与细胞提取物中一种或多种分析物的量相关。可检测部分的例子包括但不限于：荧光标记物，化学反应性标记物，酶标记物，放射性标记物，等等。优选地，所述可检测部分是荧光团如Alexa染料(例如，Alexa647)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，Oregon Green^TM；罗丹明，得克萨斯红，异硫氰酸四罗丹明(TRITC)，CyDye^TM荧光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等。可采用本领域熟知的方法将可检测部分直接或间接偶联于活化状态非依赖性抗体。

某些情况下，所述活化状态非依赖性抗体用易化部分直接标记。可采用本领域熟知的方法将易化部分偶联于活化状态非依赖性抗体。用于本发明的合适的易化部分包括任何能够生成导向(即，定向于)相近(即，在空间上接近或靠近)易化部分的另一个分子并与之反应(即，结合、被结合或与之形成复合体)的氧化剂的分子。易化部分的例子包括但不限于：酶类如葡萄糖氧化酶或任何其他催化涉及分子氧(O₂)作为电子受体的氧化/还原反应的酶，以及光敏剂如亚甲基蓝，玫瑰红，卟啉，方酸(squarate)染料，酞箐染料，等等。氧化剂的非限制性例子包括：过氧化氢(H₂O₂)，单线态氧，以及在氧化/还原反应中转移氧原子或获得电子的任何其他化合物。优选地，有合适底物(例如，葡萄糖、光等等)存在时，当两个部分相互相近时易化部分(例如，葡萄糖氧化酶，光敏剂等等)生成导向信号放大对的第一成员(例如，辣根过氧化物酶(HRP)，被保护基保护的半抗原，被连接于酶抑制剂的硫醚灭活的酶，等等)并与之反应的氧化剂(例如，过氧化氢(H₂O₂)，单线态氧等等)。

在某些其他情况下，所述活化状态非依赖性抗体通过偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头与偶联于易化部分的互补寡核苷酸接头之间的杂交而用易化部分间接标记。可采用本领域熟知的方法将寡核苷酸接头偶联于易化部分或偶联于活化状态非依赖性抗体。一些实施方式中，偶联于易化部分的寡核苷酸接头与偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头100％互补。在其他实施方式中，例如，在严格杂交条件下杂交时，寡核苷酸接头对包含至少1、2、3、4、5、6或更多错配区。本领域技术人员将了解，不同分析物的特异性活化状态非依赖性抗体可偶联于相同的寡核苷酸接头或偶联于不同的寡核苷酸接头。

偶联于易化部分或偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头的长度可以不同。通常，接头序列的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。通常，可产生随机核酸序列进行偶联。作为一个非限制性例子，可设计具有三个不同毗连区的寡核苷酸接头文库：间隔区；特征区；和偶联区。优选地，寡核苷酸接头被设计成足以进行偶联而不破坏它们所偶联的易化部分或活化状态非依赖性抗体的功能。

寡核苷酸接头序列可被设计成能防止或尽可能减小各种试验条件下二级结构的形成。通常小心监测接头内各区段的解链温度以使它们参与所有试验过程。通常，接头序列区段的解链温度范围不大于5℃。测定规定离子浓度下的解链温度、二级结构和发夹结构的计算机算法(例如，OLIGO6.0)可用于分析各接头内的各自三个不同区域。也可分析整体组合序列的结构特征以及它们与其他偶联的寡核苷酸接头序列的可比性，例如，它们在严格杂交条件下是否将与互补寡核苷酸接头杂交。

寡核苷酸接头的间隔区使得偶联区与寡核苷酸交联位点充分分开。偶联区的功能是通过核酸杂交将互补寡核苷酸接头序列标记的分子连接于偶联区。可在抗体-分析物(即，抗原)复合体形成之前或之后进行核酸-介导的杂交以提供更加灵活的试验模式。与许多直接抗体偶联法不同，将相对小的寡核苷酸连接到抗体或其他分子对抗体对它们的靶分析物的特异性亲和力或对偶联分子功能的影响最小。

一些实施方式中，寡核苷酸接头的特征序列区可用于复合体多重蛋白质试验。多重抗体可与具有不同特征序列的寡核苷酸接头偶联。在多重免疫测定中，用合适探针标记的报告寡核苷酸序列在多种试验模式中可用于检测抗体与它们的抗原之间的交叉杂交。

可采用若干不同方法将寡核苷酸接头偶联于抗体或其他分子。例如，可在寡核苷酸接头的5'或3'端与硫醇基团合成。可用还原剂(例如，TCEP-HCl)将该硫醇基团去保护并用脱盐旋转柱纯化所得接头。可采用异双功能交联接头如SMCC将所得去保护的寡核苷酸接头偶联于抗体或其他类型蛋白质的伯胺上。或者，寡核苷酸上的5'-磷酸基可用水溶性碳二亚胺EDC处理以形成磷酸酯并随后与含胺分子偶联。某些情况下，3'-核糖残基上的二醇可被氧化成醛基然后采用还原性胺化与抗体或其他类型蛋白质的胺基偶联。在某些其他情况下，可合成在3'或5'端有生物素修饰的寡核苷酸接头并与链霉抗生物素蛋白-标记的分子偶联。

寡核苷酸接头可采用本领域已知的各种技术合成，如Usman等，J.Am.Chem.Soc.，109：7845(1987)；Scaringe等，Nucl.Acids Res.，18：5433(1990)；Wincott等，Nucl.AcidsRes.，23：2677-2684(1995)；and Wincott等，Methods Mol.Bio.，74：59(1997)中描述的那些。通常，合成寡核苷酸时采用常规核酸保护基和偶联基，如5'-端的二甲氧基三苯甲基和3'-端的亚磷酰胺。寡核苷酸合成的合适试剂、核酸去保护方法以及核酸纯化方法是本领域技术人员已知的。

某些情况下，活化状态依赖性抗体用信号放大对的第一成员直接标记。可采用本领域熟知的方法将信号放大对成员偶联于活化状态依赖性抗体。在某些其他情况下，所述活化状态依赖性抗体通过偶联于活化状态依赖性抗体的结合对第一成员与偶联于信号放大对的第一成员的结合对第二成员之间的结合而用信号放大对的第一成员间接标记。可采用本领域熟知方法将结合对成员(例如，生物素/链霉抗生物素蛋白)偶联于信号放大对成员或活化状态依赖性抗体。信号放大对成员的例子包括但不限于：过氧化物酶类如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜曙红细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶，等等。信号放大对成员的其他例子包括被保护基保护的半抗原以及通过硫醚连接于酶抑制剂而灭活的酶。

就分析物接合而言，通常选择的捕获抗体、活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体应尽可能减小它们之间的竞争(即，所有抗体能同时结合它们相应的信号转导分子)。

在相近导向的一个例子中，易化部分是葡萄糖氧化酶(GO)，而信号放大对的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与葡萄糖之类底物接触时生成氧化剂(即，过氧化氢(H₂O₂))。如果HRP与GO导向相近，则由GO生成的H₂O₂被导向HRP并与之形成HRP-H₂O₂复合体，当存在信号放大对的第二成员(例如，化学发光底物如鲁米诺或异鲁米诺，或生荧光底物如酪酰胺(例如，生物素-酪酰胺)、高香草酸或4-羟苯基乙酸)时该复合体生成放大信号。在相近试验中使用GO和HRP的方法描述于，例如，Langry等，美国能源部第UCRL-ID-136797号报告(1999)。当使用生物素-酪酰胺作为信号放大对的第二成员时，HRP-H₂O₂复合体氧化酪酰胺以产生共价结合附近的亲核残基的反应性酪酰胺残基。活化的酪酰胺可直接检测或在加入信号检测试剂后检测，所述信号检测试剂例如链霉抗生物素蛋白-标记的荧光团或链霉抗生物素蛋白-标记的过氧化物酶和显色试剂的组合。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于：Alexa染料(例如，Alexa555)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，Oregon Green^TM；罗丹明，得克萨斯红，异硫氰酸四罗丹明(TRITC)，CyDye^TM荧光素(例如，Cy2，Cy3，Cy5)，等等。可采用本领域熟知的方法将链霉抗生物素蛋白标记直接或间接偶联于荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的显色试剂的非限制性例子包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)，2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，4-氯-1-萘酚(4CN)，和/或卟啉原。

在相近导向的另一个例子中，易化部分是光敏剂，而信号放大对的第一成员是用多个半抗原标记的大分子，所述半抗原被保护基保护以防该半抗原与特异性结合伴侣(例如，配体，抗体等等)结合。例如，信号放大对成员可以是用保护的生物素、香豆素和/或荧光素分子标记的右旋糖分子。合适的保护基包括但不限于：苯氧基-，苯胺基(analino-)，烯烃-，硫醚-，以及硒代醚(selenoether)-保护基。适用于本发明的相近试验的其他光敏剂和保护的半抗原分子描述于美国专利号5，807，675。当光敏剂被光激发时生成氧化剂(即，单线态氧)。如果半抗原分子与光敏剂导向相近，则光敏剂生成的单线态氧被导向半抗原保护基上的硫醚并与之反应产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，从半抗原上释放保护基。未保护的半抗原然后可特异性结合信号放大对的第二成员(例如，可生成可检测信号的特异性结合伴侣)。例如，当半抗原是生物素，所述特异性结合伴侣可以是酶-标记的链霉抗生物素蛋白。示例性的酶包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等等。洗涤除去未结合试剂之后可加入酶的可检测(例如，荧光、化学发光、生色等等)底物以生成可检测信号并用本领域已知的合适方法和设备进行检测。或者，可采用酪酰胺信号放大来放大可检测的信号并直接检测或加入如上所述的信号检测试剂后检测活化的酪酰胺。

在相近导向的再一个例子中，易化部分是光敏剂，而信号放大对的第一成员是酶-抑制剂复合体。所述酶和抑制剂(例如，磷酸-标记的右旋糖)由可切割接头(例如，硫醚)连接在一起。当光敏剂被光激发时生成氧化剂(即，单线态氧)。如果酶-抑制剂复合体与光敏剂导向相近，则光敏剂生成的单线态氧导向到可切割接头并与之反应，从酶上释放抑制剂，从而将酶激活。加入酶底物以产生可检测信号，或者加入放大试剂以产生放大信号。

在相近导向进一步的例子中，易化部分是HRP，信号放大对的第一成员是上述保护的半抗原或酶-抑制剂复合体，而保护基包含对-烷氧基苯酚。加入苯二胺和H₂O₂能生成反应性亚苯基二亚胺，其导向被保护的半抗原或酶-抑制剂复合体并与对苯氧基苯酚保护基反应以产生暴露的半抗原或反应性酶。生成放大信号并按照上文描述进行检测(参见，例如，美国专利号5，532，138和5，445，944)。

本领域技术人员将了解，按照这里所述的相近(即，三-抗体)试验也可用除抗体外的结合伴侣来固定和/或检测细胞提取物中的一种或多种分析物。这种结合伴侣的非限制性例子包括分析物的配体或受体、分析物底物、结合域(例如，PTB、SH2等等)、适体，等等。

试剂盒

在进一步的方面，本发明提供了进行上述基于抗体的阵列方法的试剂盒，其包含：(a)局限在固相支持体上的众多捕获抗体的稀释系列；和(b)众多检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体和/或活化状态依赖性抗体)。一些情况下，所述试剂盒可进一步包含用该试剂盒来检测实体瘤循环细胞的众多信号转导分子的活化状态的使用说明书。所述试剂盒还可包含上文就进行本发明具体方法所述的任何其他试剂，如信号放大对的第一和第二成员、酪酰胺信号放大试剂、易化部分底物、洗涤缓冲液、捕获/释放试剂，等等。

抗体阵列的构建

在某些方面，本发明提供基于抗体的阵列，它采用局限在固相支持体上的捕获抗体的稀释系列来检测实体瘤循环细胞的细胞提取物中众多信号转导分子的活化状态。用于本发明试验的阵列通常包含偶联于固相支持体表面不同可寻址位点的一定捕获抗体浓度范围内的众多不同的捕获抗体。

固相支持体可包含用于固定蛋白质的任何合适基材。固相支持体的例子包括但不限于：玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如，磁珠、聚苯乙烯珠等)、纸、膜、纤维束、凝胶、金属、陶瓷等等。诸如尼龙(Biotrans^TM，加州科斯达麦萨的ICNB公司(ICNBiomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA)；加州赫尔克里斯的伯乐公司(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA))，硝酸纤维素(新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司(Whatman Inc.，Florham Park，NJ))和PVDF(Immobilon^TM，马萨诸塞州比勒瑞卡的微孔公司(Millipore Corp.，Billerica，MA))之类的膜适合用作本发明阵列的固相支持体。优选地，所述捕获抗体局限在用硝酸纤维素聚合物涂布的玻璃载玻片上，例如，从新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司(Whatman Inc.，Florham Park，NJ)购得的载玻片。

所需的固相支持体的具体方面包括能够结合大量捕获抗体、能结合捕获抗体而变性最小、以及无法结合其他蛋白质。另一种合适方面是当在固相支持体上施加含有捕获抗体的抗体溶液时支持体显示出最小“芯吸(wicking)”。具有最小芯吸的固相支持体能够将捕获抗体溶液的小试样施加到支持体上从而得到固定捕获抗体的小而确定的斑点。

捕获抗体通常通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)直接或间接(例如，经捕获标签)局限在固相支持体上。一些实施方式中，用同双功能或异双功能交联剂通过标准交联方法和条件将捕获抗体共价附于固相支持体。合适的交联剂可从例如伊利诺伊州罗克福德的皮尓斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Rockford，IL)购得。

生成本发明阵列的方法包括但不限于任何用来构建蛋白质或核酸阵列的技术。一些实施方式中，捕获抗体用微型点样器(microspotter)点到阵列上，所述微型点样器通常是装备有开口销、钝销钉或喷墨印刷器的自动印刷机。用来印刷本文所述抗体阵列的合适自动系统包括装备有ChipMaker2开口销(加州桑尼维尔泰莱化学国际公司(TeleChemInternational；Sunnyvale，CA))的PixSys 5000机器人(加州欧文的笛卡尔技术有限公司(Cartesian Technologies；Irvine，CA))以及购自马萨诸塞州乌本的生物自动化公司(BioRobics，Woburn，MA)和康涅狄格州麦瑞登的派卡德仪器公司(Packard InstrumentCo.，Meriden，CT)的其他自动印刷机。优选地，在阵列上点上各捕获抗体稀释液的至少2、3、4、5或6个复本。

产生本发明的抗体阵列的另一种方法包括在能将规定体积液体吸取到支持体上的有效条件下使毛细管分配器接触固相支持体从而将已知体积的捕获抗体稀释液分配到各个选定阵列位置，其中，在各选出的阵列位置上用选择的捕获抗体溶液重复该过程以形成完整阵列。可实施该方法以形成众多此类阵列，其中溶液沉积步骤适用于各个重复周期内众多固相支持体各自的选定位置。该方法的进一步描述可在例如美国专利号5，807，522中找到。

某些情况下，可使用在纸上印刷的装置来产生本发明的抗体阵列。例如，可将所需捕获抗体稀释液加载到桌面喷墨打印机的打印头上并印刷到合适的固相支持体上(参见，例如，Silzel等，Clin.Chem.，44：2036-2043(1998))。

一些实施方式中，固相支持体上所产生阵列的密度至少约5个斑点/cm²，优选至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000、或者10000个斑点/cm²。

某些情况下，固相支持体上的斑点各自代表不同的捕获抗体。在某些其他情况下，固相支持体上的多个斑点代表相同的捕获抗体，例如，当稀释系列包含一系列递减的捕获抗体浓度时。

在固相支持体上制备和构建抗体阵列的方法的其他例子描述于美国专利号6197599，6777239，6780582，6897073、7179638和7192720；美国专利公布号20060115810、20060263837、20060292680和20070054326；以及Varnum等，Methods Mol.Biol.，264：161-172(2004)。

扫描抗体阵列的方法是本领域已知的且包括但不限于用来扫描蛋白质或核酸阵列的任何技术。适用于本发明的微阵列扫描仪获自马萨诸塞州波士顿的PE公司(PerkinElmer，Boston，MA)、加州帕洛阿托的AT公司(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，华盛顿州依沙库哈的AP公司(Applied Precision，Issaquah，WA)，马萨诸塞州比勒瑞卡的GSIL公司(GSI Lumonics Inc.，Billerica，MA)，以及加州联合城的AI公司(AxonInstruments，Union City，CA)。作为一个非限制性例子，用于荧光检测的GSIScanArray3000可与进行量化的ImaGene软件一起使用。

抗体的制造

尚未市售获得的根据本发明分析稀有循环细胞内信号转导分子的活化状态和/或总量的抗体可通过几种方法制造。例如，一种方法是用本领域已知的蛋白质表达和纯化方法来表达和/或纯化感兴趣的多肽(即，抗原)，而另一种方法是用本领域已知的固相肽合成方法来合成感兴趣的多肽。参见，例如，《蛋白质纯化指南》(Guide to ProteinPurification)，Murray P.Deutcher编，Meth.Enzymol.，第182卷(1990)；《固相肽合成》(Solid Peptide Synthesis)，Greg B.Fields编，Meth.Enzymol.，第289卷(1997)；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等，Biomed.Pept.《蛋白质核酸》(Proteins Nucleic Acids)，1：255-60，(1995)；和Fujiwara等，Chem.Pharm.Bull.，44：1326-31(1996)。例如，纯化或合成的多肽然后可注射到小鼠或家兔体内以产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员将知道有许多方法可用来制造抗体，例如《抗体实验室手册》(Antibodies,A Laboratory Manual)，Harlow和Lane编，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1988)中所述。本领域技术人员还将知道，也可采用各种方法从遗传信息制备模拟抗体的结合片段或Fab片段(参见，例如，《抗体工程：实践方法》(Antibody Engineering：APractical Approach)，Borrebaeck编，牛津大学出版社，牛津(1995)；和Huse等，J.Immunol.，149：3914-3920(1992))。

此外，许多出版物已经报道了用噬菌体展示技术来制造和筛选与选定的靶抗原结合的多肽文库(参见，例如，Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249：404-406(1990)；Scott等，Science，249：386-388(1990)；和Ladner等，美国专利号5，571，698)。噬菌体展示方法的基本概念是在噬菌体DNA编码多肽和靶抗原之间建立物理相关性。这种物理相关性由噬菌体颗粒提供，其展示的多肽作为围绕编码该多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。多肽与它们遗传物质之间物理相关性的建立能同时普查非常大量的带有不同多肽的噬菌体。展示对靶抗原具有亲和力的多肽的噬菌体结合该靶抗原，并通过亲和力筛选将这些噬菌体富集于靶抗原。这些噬菌体展示的多肽的相同性可从它们各自的基因组来确定。采用这些方法，然后可通过常规方法大量合成被鉴定为对所需靶抗原具有结合亲和力的多肽(参见，例如，美国专利号6，057，098)。

然后可对通过这些方法产生的抗体进行选择，首先就对纯化的感兴趣多肽抗原的亲和力和选择性进行筛选，如果需要可将该抗体与不需要结合的其他多肽抗原的亲和力和特异性结果进行比较。筛选过程可包括将纯化的多肽抗原固定在微滴定板的不同孔中。然后在各个微滴定孔内加入含有潜在抗体或抗体组的溶液并培育约30分钟至2小时。然后洗涤微滴定孔并在孔中加入标记的第二抗体(例如，如果产生的抗体是小鼠抗体则加入偶联于碱性磷酸酶的抗-小鼠抗体)并培育约30分钟，然后洗涤。在孔中加入底物，当存在固定的多肽抗原的抗体时将出现显色反应。

然后进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在靶蛋白的免疫测定法的开发中，纯化的靶蛋白作为标准品来判断用所选抗体进行免疫测定试验的灵敏度和特异性。由于各种抗体的结合亲和力可能不同，例如，某些抗体组合可能会在空间上相互影响，因此抗体的试验性能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的度量。

本领域技术人员将了解，可采取许多方法来制造抗体或结合片段并筛选和选择其对各种感兴趣多肽的亲和力和特异性，但这些方法不改变本发明的范围。

多克隆抗体

多克隆抗体优选通过多点皮下注射(sc)或腹膜内注射(ip)感兴趣多肽和佐剂在动物内制备。用双功能试剂或衍生化试剂将感兴趣多肽偶联于在要免疫物种中呈免疫原性的蛋白质载体是有用的，所述蛋白质载体例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。双功能试剂或衍生化试剂的非限制性例子包括马来酰亚氨基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基偶联)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂和R₁N＝C＝NR(其中R和R₁是不同的烷基基团)。

用感兴趣多肽或其免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，例如，将100微克(用于兔)或5微克(用于小鼠)抗原或偶联物与3倍体积的弗氏完全佐剂组合并在多个部位皮内注射溶液。1个月后用约1/5到1/10初始量的弗氏不完全佐剂配制的多肽或偶联物在多个部位皮下注射来加强免疫动物。7-14天后采集动物血液，检验血清的抗体效价。通常再加强免疫动物次直到平台期。优选用相同多肽的偶联物来加强免疫动物，但可采用偶联于不同免疫原性蛋白和/或通过不同的交联剂。偶联物也可作为融合蛋白在重组细胞培养物内制造。某些情况下，可使用明矾等凝聚剂来增强免疫应答。

单克隆抗体

单克隆抗体通常从一群基本均质的抗体(即该群所含的各抗体除了可能天然发生的数量很少的突变外都是一致的)获得。因此，修饰语"单克隆"表示抗体的特征为不是离散抗体的混合物。例如，单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256:495(1975)描述的杂交瘤方法或者通过本领域已知的任何重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，按照本文所述的免疫小鼠或其他合适的宿主动物(例如，仓鼠)以刺激能够产生抗体的淋巴细胞，其中的抗体可与用于免疫的感兴趣多肽特异性结合。另外，也可在体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合试剂如聚乙二醇将免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(参见，例如，Goding，单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies:Principles and Practice)，学术出版社(Academic Press)，第59-103页(1986))。将如此制备的杂交瘤细胞接种到合适培养基中并在其中生长，培养基内优选含有一种或多种能抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果母体骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，则杂交瘤细胞培养基一般包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质能防止HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些可有效融合并支持所筛选出的抗体产生细胞稳定高水平地生产抗体的细胞，和/或对培养基如HAT培养基敏感的细胞。用于制造人单克隆抗体的这种优选的骨髓瘤细胞系的例子包括但不限于：鼠骨髓瘤细胞系如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自美国加州圣地亚哥的索尔克细胞销售中心(Salk InstituteCell Distribution Center；San Diego,CA)，SP-2或X63-Ag8-653细胞(获自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；Rockville，MD)，以及人骨髓瘤或小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeur等，《单克隆抗体制造技术和应用》(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications),MD公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，第51-63页(1987))。

检测培养杂交瘤细胞的培养基中是否产生针对感兴趣多肽的单克隆抗体。优选的是，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合分析如放免分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来确定。单克隆抗体的结合亲和力可以采用，例如，Scatchard分析(Munson 等，Anal.Biochem.，107:220(1980))来确定。

鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤亚克隆该克隆并通过标准方法培养(参见，例如，Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，学术出版社，第59-103页(1986))。适用于此种目的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物体内培养。通过常规抗体纯化方法，如A蛋白-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析由培养基、腹水或血清分离所述亚克隆分泌的单克隆抗体。

利用常规方法(例如，通过利用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)不难分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离，则可将该DNA放入表达载体中，然后转染入大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等宿主细胞，或不产生抗体的骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中诱导单克隆抗体合成。参见，例如，Skerra等，Curr.Opin.Immunol.,5:256-262(1993)；和Pluckthun，Immunol Rev.,130:151-188(1992)。DNA也可被修饰，例如，用人重链和轻链恒定区编码序列替代同源的鼠序列(参见，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的的全部或一部分共价连接。

在进一步的实施方式中，可从抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段，所述文库是采用例如McCafferty等，Nature,348:552-554(1990)；Clackson等，Nature,352:624-628(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述的技术产生。通过链改组制造高亲和力(nM范围)人单克隆抗体描述于Marks等，BioTechnology，10：779-783(1992)。用组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的方案描述于Waterhouse等，Nuc.Acids Res.，21：2265-2266(1993)。因此，这些技术可代替传统的单克隆抗体杂交瘤方法来生产单克隆抗体。

人源化抗体

将非人抗体人源化的方法是本领域已知的。优选地，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，该残基通常取自“输入”可变结构域。人源化实质上可用非人抗体的超变区序列代替人抗体的相应序列来进行。参见，例如，Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)。因此，这种"人源化"抗体是嵌合抗体(参见，例如，美国专利号4，816，567)，其中基本上不到完整的人可变结构域被非人种类的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常是其中的某些超变区残基以及可能的一些框架区(FR)残基被啮齿类抗体类似位点的残基取代的人抗体。

为降低抗原性需要着重考虑用于制造本文所述人源化抗体的人可变结构域(包括轻链和重链)的选择。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”方法，用已知的人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。与啮齿类序列接近的人序列然后被接受作为人源化抗体的人FR(参见，例如，Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；和Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定FR。相同FR可用于数种不同的人源化抗体(参见，例如，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.，151:2623(1993))。

人源化抗体保留与抗原的高亲和力和其它优良的生物学特性也是重要的。为实现该目的，通过母体序列的分析方法和利用母体和人源化序列的三维模型的各种概念性人源化产物制备人源化抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些显示信息能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从受者和输入序列选择和合并FR残基，从而获得所需抗体特性，如提高的对靶抗原的亲和力。通常，超变区残基直接地并特异性地影响抗原结合。

本发明考虑了人源化抗体的各种形式。例如，所述人源化抗体可以是抗体片段，如Fab片段。或者，所述人源化抗体可以是完整抗体，如完整的IgA、IgG或IgM抗体。

人抗体

作为人源化的替代方案，可产生人抗体。一些实施方式中，可制造转基因动物(例如，小鼠)，在免疫之后这种动物能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生人抗体的所有成分。例如，已经描述过嵌合和种系突变型小鼠中抗体重链结合区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变型小鼠将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year inImmun.，7：33(1993)；以及美国专利号5591669、5589369和5545807。

或者，可采用噬菌体展示技术(参见，例如，McCafferty等，Nature，348：552-553(1990))，利用未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因的所有组分在体外制造人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因被框内克隆到如M13或fd等丝状噬菌体的主要或次要衣壳蛋白基因内，并作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒表面展示。由于这种丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性进行选择也能选出显示那些特性的抗体的编码基因。因此，这种噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可采取，例如，Johnson等，Curr.Opin.Struct.Biol.，3：564-571(1993)中描述的各种方式进行。一些来源的V-基因区段也用于噬菌体展示。参见，例如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)。基本上可按照Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Griffith等，EMBO J.，12：725-734(1993)；以及美国专利号5565332和5573905中描述的技术构建未免疫的人供体的V基因的所有组分并分离针对不同抗原(包括自体抗原)阵列的抗体。

在某些情形中，人抗体也可以通过例如美国申请号5,567,610和5,229,275所述的体外活化B细胞来制备。

抗体片段

已经开发了许多制造抗体片段的技术。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整抗体衍生得到的(参见，例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Meth.，24：107-117(1992)；和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，可使用重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，Fab'-SH片段可从大肠杆菌细胞直接回收并化学偶联以形成F(ab')₂片段(参见，例如，Carter等，BioTechnology，10：163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')₂片段可从重组宿主细胞培养物直接分离。制造抗体片段的其他技术对于本领域技术人员显而易见。在其他实施方式中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见，例如，PCT公布号WO 93/16185；和美国专利号5571894和5587458。抗体片段也可以是线性抗体，如美国专利号5641870中所述。这种线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。

双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示范性双特异性抗体可结合于同一感兴趣多肽的两种不同表位。其他双特异性抗体可将感兴趣多肽的结合位点与一种或多种其他抗原的结合位点组合。双特异性抗体可作为全长抗体或作为抗体片段(例如，F(ab')₂双特异性抗体)来制备。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四体杂交瘤)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析来纯化正确的分子。PCT公布号WO 93/08829和Traunecker等，1991,EMBOJ.,10:3655-3659披露了类似方法。

根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)融合于免疫球蛋白恒定区序列。优选与含有绞链区、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有结合轻链所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物，如果需要还有免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的不同比例的三种多肽链提供最优产率的实施方式中，这为调节三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，当表达比例相同的至少两种多肽链导致高产率或该比例没有特别意义时，可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。

在该方法的一个优选实施方式中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。这种不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供了一种容易的分离方式。参见，例如，PCT公布号WO 94/04690和Suresh等，Meth.Enzymol.，121:210(1986)。

根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可以工程改造一对抗体分子之间的界面以尽可能增大从重组细胞培养物中回收的异源二聚体百分比。优选界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自于第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链取代(如，酪氨酸或色氨酸)。用较小的氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链会在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿“空洞”。这提供了提高异二聚体相对于不良终产物如同二聚体的产率的机制。

双特异性抗体包括交联的或“异偶联物”抗体。例如，异偶联物中的一种抗体可偶联于亲和素，另一种抗体偶联于生物素。可采用任何常规的交联方法制备异偶联物抗体。合适的交联剂和技术是本领域众所周知的并描述于美国专利号4,676,980。

从抗体片段制备双特异性抗体的合适技术技术也是本领域已知的。例如，可以利用化学连接的方法制备双特异性抗体。某些情况下，双特异性抗体是通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab')₂片段而产生的(参见，例如，Brennan等，Science，229：81(1985))。这些片段在二巯基复合试剂亚砷酸钠存在的条件下被还原以稳定连位二巯基化合物，防止分子间二硫键形成。产生的Fab'片段再被转化成硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一个Fab'-TNB衍生物转化成Fab'-巯基，与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。

一些实施方式中，Fab'-SH片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成双特异性抗体。例如，完全人源化的双特异性抗体F(ab')₂分子可通过Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述的方法来制造。各Fab'片段由大肠杆菌单独分泌并对其进行定向体外化学偶联以形成双特异性抗体。

直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有报道。例如，利用亮氨酸拉链可制备出双特异性抗体。参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.，148:1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合的方式连接到两个不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。这种方法还被用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所述的"二体"技术为制造双特异性抗体片段提供了另一种机制。该片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)，所述接头过短而不能使同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段中的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。使用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性抗体片段的另一种方法描述于Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。

本发明还包括二价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。参见，例如，Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。

抗体纯化

当采用重组技术时，抗体可在分离的宿主细胞内、宿主细胞的壁膜间隙中产生，或从宿主细胞直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，则首先通过，例如，离心或超滤去除颗粒碎片。Carter等，BioTech，10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌壁膜间隙中的抗体的方法。简言之，细胞浆在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。离心去除细胞碎片。如果抗体被分泌到培养基中，那么通常采用市售的蛋白质浓缩滤器如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩这种表达系统的上清液。任何上述步骤中可包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，还可包含抗生素以防止偶发性污染物的生长。

可采用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A是否合适作为亲和配体依赖于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。可用蛋白A来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如，Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(参见，例如，Guss等，EMBO J.，5:1567-1575(1986))。连接亲和配体的最常见基质是琼脂糖，但也可采用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯的流动速率较快和加工时间较短。如果抗体包含CH3区，那么可以利用Bakerbond ABX^TM树脂(新泽西州飞利浦堡的JTB公司(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.))进行纯化。根据所回收的抗体，用于蛋白纯化的其他技术如利用离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSE^TM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也可以使用。

初步纯化步骤后，对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，该层析使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下进行(例如，约0-0.25M盐)。

实施例

提供以下实施例来阐述，而非限制本发明。

实施例1循环细胞的分离、刺激和裂解

实体瘤循环细胞从实体瘤转移或微转移的细胞，并包括循环肿瘤细胞(CTC)、癌症干细胞(CSC)和/或移行到肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞(CEPC)、循环内皮细胞(CEC)、循环前血管生成骨髓细胞、循环树突细胞等等)。含有循环细胞的患者样品可从任何可接触的生物流体(例如，血液、尿液、乳头抽吸物、淋巴液、唾液、细针抽吸物等等)获得。所述循环细胞可采用一种或多种分离方法从患者样品分离，所述方法例如：免疫磁分离(参见，例如，Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer，92：577-582(2001))，微流体分离(参见，例如，Mohamed等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3：251-256(2004)；Lin等，摘要编号5147，第97届AACR年会，华盛顿特区(2006))，FACS(参见，例如，Mancuso等，Blood，97：3658-3661(2001))，密度梯度离心(参见，例如，Baker等，Clin.Cancer Res.，13：4865-4871(2003))，以及耗竭法(参见，例如，Meye等，Int.J.Oncol.，21：521-530(2002))。

手工分离CTC

免疫磁分离CTC-手工分离后进行激活试验：

1)采用已经偶联于抗-EpCAM单克隆抗体(KLS公司(Kordia Life Sciences)；莱顿(Leiden)，荷兰)的磁珠(Dynal M450；戴纳公司(Dynal AS)；奥斯陆，挪威)。

2)就在使用之前用等体积的含0.01％BSA的PBS洗涤预涂布的Dyna珠一次。

3)在1ml样品中加入25微升预涂布的Dyna珠。

4)将混合物在2-8℃培育20分钟同时温和倾斜和旋转。

5)将试管在磁力分离器(MPL-1磁体)上放置2分钟。

6)弃去上清液，将与珠结合的细胞重悬于含0.01％BSA的PBS然后磁力分离，以此洗涤三次。

7)将样品重悬于100微升刺激缓冲液。

样品制备：

1)将人对象的外周血吸到含1毫克/毫升EDTA的硅化管内。弃去前3-5毫升以避免被刺穿的静脉释放的上皮细胞所污染。

2)在使用前用0.9％NaCl以1：3稀释1毫升全血。

制备对照：

1)将人癌细胞系加入HL-60细胞以制造细胞系对照。

2)细胞系对照以2.5x10⁶细胞/毫升的浓度使用。

手工分离CEC和CEPC：

作为一个非限制性例子，可采取Beerepoot等，Ann.Oncology，15：139-145(2004)描述的免疫磁分离/富集技术分离活的CEC和CEPC。简言之，将外周血与已经偶联于抗-CD146单克隆抗体(KLS公司)的磁珠(Dynal M450IgG₁)一起培育。该抗体识别外周血中的所有内皮细胞谱系，但不识别造血细胞或上皮细胞(George等，J.Immunol.Meth.，139：65-75(1991))。用偶联于合适抗体的磁珠(例如，用Dynal-CD45珠耗尽白细胞，用Dynal-CD14珠耗尽单核细胞，用Dynal-EpCAM耗尽上皮细胞(加州卡尓斯拜德的英杰公司(Invitrogen；Carlsbad，CA)))进行正选择之前可对造血细胞和上皮细胞进行负选择。在该实施例中仅采用正选择。

免疫磁分离CEC和CEPC-手工分离后进行激活试验：

1)采用已经偶联于抗-CD146单克隆抗体(KLS公司)的磁珠(Dynal M450)。

3)在1ml样品中加入25微升预涂布的Dyna珠。

4)将混合物在2-8℃培育20分钟同时温和倾斜和旋转。

5)将试管在磁力分离器(MPL-1磁体)上放置2分钟。

7)将样品重悬于100微升刺激缓冲液。

样品制备：

1)将人对象的外周血吸到含1毫克/毫升EDTA的硅化管内。弃去前3-5毫升以避免被刺穿的静脉释放的内皮细胞所污染。

2)在使用前用0.9％NaCl以1：3稀释1毫升全血。

制备对照：

1)将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)加入HL-60细胞以制造细胞系对照。

2)细胞系对照以2.5x10⁶细胞/毫升的浓度使用。

手工分离CEPC(无CEC)：

CEPC是能够响应各种生血管生成因子而分化成成熟内皮细胞的骨髓衍生祖细胞的循环亚型。可用识别表面标记CD34的抗体进行选择来分离CEPC。CD133是一种区分不成熟内皮祖细胞(EPC)或原始造血干细胞(HSC)与CEPC的表面标记。使用贴壁培养或磁性微珠从不同来源分离CEPC的各种方法已见诸描述。在本实施例中，采用了Asahara等，Science，275：964-967(1997)所述的改进方法。

免疫磁分离CEPC-手工分离后进行激活试验：

1)使用磁珠(Dynal M450CD34)。这些珠用CD34表面抗原的特异性单克隆抗体涂布。

3)在1ml样品中加入25微升预涂布的Dyna珠。

4)将混合物在2-8℃培育20分钟同时温和倾斜和旋转。

5)将试管在磁力分离器(MPL-1磁体)上放置2分钟。

7)将样品重悬于100微升刺激缓冲液。

样品制备：

2)用平衡盐溶液以1：1稀释10毫升血液。

3)使4毫升稀释的血液叠加在10毫升试管内的3毫升菲可帕克(Ficoll-Paque)上。

4)试管在18-20℃下400x g旋转30-40分钟。

5)用无菌巴斯德吸管吸出含有血浆和血小板的上层，不搅动界面上的单核的细胞层。

6)用无菌移液管将单核的细胞转移到无菌离心管中。

7)在细胞中加入6毫升平衡盐溶液温和重悬。

8)混合物在18-20℃下60-100x g旋转10分钟。

9)除去上清液并将各管的单核的细胞重悬于1毫升PBS。

用Veridex系统分离CTC、CEC和CEPC

新泽西州沃伦的伟德公司(Veridex，Warren，NJ)出售CellSearch系统，该系统由CellPrep系统、CellSearch上皮细胞试剂盒和CellSpotter分析仪构成。CellPrep系统是一种半自动的样品制备系统(Kagan等，J.Clin.Ligand Assay，25：104-110(2002))。CellSearch上皮细胞试剂盒的构成为：涂布有上皮细胞的特异性抗-EpCAM抗体的铁磁流体；细胞角蛋白8、18和19的藻红蛋白-偶联抗体；偶联于别藻蓝蛋白的抗-CD45抗体；DAPI染料；和用于洗涤、透化和重悬细胞的缓冲液。该实施例采用的方法还描述于Allard等，Clin.Cancer Res.，10：6897-6904(2004)。完整的Veridex系统可用于CTC计数，或者，用CellPrep系统分离之后通过手工除去样品可提供一种在分析途径活化(pathwayactivation)之前分离的方法。CTC的数目可为算法开发提供信息。

Veridex系统-CTC富集然后计数：

1)将7.5毫升血液与6毫升缓冲液混合，800x g离心10分钟，并置于CellPrep系统上。

2)仪器吸出上清液后，加入铁磁流体。

3)仪器进行培育和随后的磁力分离步骤。

4)吸出未结合的细胞和剩余的血浆。

5)加入染色试剂和透化缓冲液进行荧光染色。

6)培育系统之后再次机械分离细胞并将其重悬于MagNest细胞呈递装置以便使用CellSpotter分析仪进行分析。

7)将该装置置于CellSpotter分析仪(一种四色半自动荧光显微镜)。

8)捕获满足Veridex规定标准的图像并通过基于网络的浏览器显示以进行最终的手工选择。

9)细胞计数结果表示为每7.5毫升血液的细胞数。

Veridex系统-CTC富集然后进行活性测定：

1)将7.5毫升血液与6毫升缓冲液混合，800x g离心10分钟，然后置于CellPrep系统上。

2)仪器吸出上清液后，加入铁磁流体。

3)仪器进行培育和随后的磁力分离步骤。

4)吸出未结合的细胞和剩余的血浆。

5)将样品重悬于100微升刺激缓冲液。

Veridex系统–CEC和CEPC富集然后进行活性测定：

1)Veridex提供了一种CellTrack上皮细胞试剂盒，其利用抗-CD146抗体捕获CEC和CEPC。所述CellTracks上皮细胞试剂盒与用于制备血液样品的Veridex的CellTracksAutoPrep系统和CellTracks分析仪II联用以计数和表征全血的CEC和CEPC。该方案与CellSearch上皮细胞试剂盒相同。

样品制备：

1)按照制造商的说明把人对象的外周血吸入Cellsave防腐管。弃去前3-5毫升以避免被刺穿的静脉释放的上皮或内皮细胞所污染。

手工分离CSC：

已知证据表明，肿瘤含有一小群具有独特自我更新和存活机制的假定癌症干细胞(参见，例如，Sells，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，51：1-28(2004)；Reya等，Nature，414：105-111(2001)；Dontu等，Trends Endocrinol.Metal.，15：193-197(2004)；和Dick，Nature，423：231-233(2003))。癌症干细胞(CSC)可长时间以休眠状态存在，这使得它们能抵抗靶向分裂细胞的化疗药。这种癌症初始群体可表征为在遭受选择性除去的定向治疗时能激活自我更新和存活途径。已经描述过用贴壁培养或磁性微珠分离CSC的过程。在该实施例中，采用了Cote等，Clin.Can.Res.，12：5615(2006)所述的改进方法。

免疫磁分离CSC-手工分离后进行激活试验：

1)使用磁珠(挪威奥斯陆的戴纳公司(Dynal AS；Oslo,Norway))。这些珠用CD34或CD133表面抗原的特异性单克隆抗体涂布。

3)在3ml样品中加入1-10⁷预涂布的Dyna珠。

4)将混合物在2-8℃培育60分钟同时温和倾斜和旋转。

5)将混合物分成1毫升一份，并将各个将试管在磁力分离器(MPL-1磁体)上放置至少6分钟。

7)将样品重悬于100微升刺激缓冲液。

样品制备：

1)征得患者同意后，从早期乳腺癌患者获得骨髓标本。

2)如Bauer et al.,Clin.Can.Res.,6:3552-3559(2000))所述加工骨髓抽吸物。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心，采用Beckman GS-6离心机在4000x g离心35分钟并用PBS洗涤两次来富集含有任何弥散性肿瘤细胞的单核细胞组分。

分离的CTC的细胞刺激和裂解：

细胞刺激：

1)在细胞中加入生长因子TGF-α(100nM)、调蛋白(100nM)和/或IGF(100nM)并在37℃培育5分钟。

用药物处理进行细胞刺激：

1)37℃用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。

2)然后加入生长因子TGF-α(100nM)、调蛋白(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞并在37℃培育5分钟。

用药物处理进行细胞刺激(反馈环(feedback loop))：

1)样品用治疗有效浓度的赫赛汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕霉素类似物在37℃处理30分钟。

2)然后用TGF-α(100nM)、调蛋白(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞并在37℃培育120分钟。

采用以下方案裂解刺激过的CTC：

1)将表1中所列试剂混合来新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。

2)最后的洗涤后在冰上将细胞重悬于100微升冷却的缓冲液。

3)在冰上培育30分钟。

4)混合物在微量离心机(microfuge)中以最大速度旋转10分钟以分离珠和裂解液。

5)将裂解液转移到新的试管中进行测定或储存于-80℃。

表1

裂解缓冲液配方(10ml)

分离的CTC和/或CEPC的细胞刺激和裂解：

认为VEGF能通过激活CEPC(Larrivee等，J.Biol.Chem.，278：22006-22013(2003))和已经从管壁脱落的成熟CEC(Solovey等，Blood，93：3824-3830(1999))中的抗凋亡途径从而促进存活。VEGF还能刺激CEPC或成熟CEC增殖，尽管与CEPC相比成熟CEC似乎只有有限的增殖能力(Lin等，J.Clin.Invest.，105：71-77(2000))。出于这些原因，在裂解之前将CEC和/或CEPC与VEFG一起培育进行激活。

细胞刺激：

1)在细胞中加入生长因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)并在37℃培育5分钟。

用药物处理进行细胞刺激：

1)37℃用治疗有效浓度的阿伐斯汀(Avastin)、耐克斯伐(Nexavar)、休顿特(Sutent)和/或雷帕霉素类似物处理样品30分钟。

2)然后加入生长因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)刺激细胞并在37℃培育5分钟。

用药物处理进行细胞刺激(反馈环)：

2)然后加入VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)刺激细胞并在37℃培育120分钟。

采用以下方案裂解分离的CTC和/或CEPC：

1)混合表1中所列试剂来新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。

2)最后洗涤之后在冰上将细胞重悬于100微升冷却的缓冲液。

3)在冰上培育30分钟。

5)将裂解液转移到新的试管中进行测定或储存于-80℃。

分离的CSC的细胞刺激和裂解：

刺激的细胞：

用药物处理刺激的细胞：

用药物处理刺激的细胞(反馈环)：

2)然后加入生长因子TGF-α(100nM)、调蛋白(100nM)和/或IGF(100nM)刺激细胞并在37℃培育120分钟。

采用以下方案裂解分离的CSC细胞：

1)混合表1中所列试剂来新鲜制备新鲜的裂解缓冲液。

2)最后的洗涤之后在冰上将细胞重悬于100微升冷却的缓冲液。

3)在冰上培育30分钟。

5)将裂解液转移到新的试管中进行测定或储存于-80℃。

实施例2用单检测器夹心ELISA和酪酰胺信号放大进行单细胞检测。

该实施例列举了适合分析稀有循环细胞中信号转导分子的活化状态的具有高动态范围的多重、高通量、单检测器夹心ELISA。

1)4℃用捕获抗体涂布96孔微滴定平板过夜。

2)第二天用2％BSA/TBS-Tween封闭平板1小时。

3)用TBS-Tween洗涤之后，加入连续稀释的细胞裂解液或重组蛋白并室温培育2小时。

4)平板用TBS-Tween洗涤4次，然后与生物素-标记的检测抗体一起室温培育2小时。

5)与检测抗体一起培育之后平板用TBS-Tween洗涤4次，然后与链霉抗生物素蛋白-标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)一起室温培育1小时以使SA-HRP结合生物素-标记的检测抗体。

6)为进行信号放大，加入5微克/毫升的生物素-酪酰胺和0.015％H₂O₂并反应15分钟。

7)用TBS-Tween洗涤6次之后加入SA-HRP并培育30分钟。

8)用TBS-Tween洗涤6次之后加入HRP底物TMB并在黑暗中显色2-10分钟。加入0.5MH₂SO₄终止反应。用微板阅读器读取450/570nm的信号。

图3显示了用包括抗EGFR胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体的ELISA检测A431细胞中的总EGFR。基于人EGFR重组胞外域，所述免疫测定的灵敏度为约0.25pg/孔。计算出的各A431细胞内的EGFR浓度为约0.6pg。

图4显示了用包含抗EGFR胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化EGFR的生物素-标记的单克隆抗体作为检测抗体的ELISA检测A431细胞中的磷酸化EGFR。对捕获抗体进行2倍连续稀释显示，当捕获抗体浓度为0.0625μg/ml时单细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高1.78倍。

图5显示了用包含抗ErbB2胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体的ELISA检测SKBr3细胞中的总ErbB2。免疫测定检测范围介于约1,000个细胞至约1.37个细胞。当捕获抗体浓度为1μg/ml时，1.37细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高2.71倍。

图6显示了用包括抗ErbB2胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化ErbB2的单克隆抗体作为检测抗体的ELISA检测SKBr3细胞中的磷酸化ErBb2。免疫测定检测范围介于约500个细胞至约5个细胞。当捕获抗体浓度为1μg/ml时，5细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高3.03倍。

图7显示了用包括抗Erk2单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体的ELISA检测SKBr3细胞中总的和磷酸化的Erk2蛋白。在1.37细胞水平时总Erk2的信号相比背景(信/噪比)提高3.25倍。同样，在1.37细胞水平时磷酸化Erk2的信号相比背景(信/噪比)提高3.17倍。

实施例3用单检测器微阵列ELISA和酪酰胺信号放大进行单细胞检测。

该实施例列举了适合分析稀有循环细胞中信号转导分子的活化状态的具有高动态范围的多重、高通量、单检测器微阵列夹心ELISA。

1)以2倍连续稀释将捕获抗体印刷于16-衬垫(16-pad)FAST载玻片(新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司)。

2)干燥过夜后用Whatman封闭缓冲液封闭载玻片。

3)以10倍连续稀释在各个衬垫上加入80微升细胞裂解液。将载玻片室温培育24小时。

4)用TBS-Tween洗涤6次后，室温培育80微升生物素-标记的检测抗体2小时。

5)洗涤6次后加入链霉抗生物素蛋白-标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)并培育1小时以使SA-HRP结合生物素标记的检测抗体。

6)为进行信号放大，加入80微升5μg/ml的生物素-酪酰胺并反应15分钟。载玻片用TBS-Tween洗涤6次，用20％DMSO/TBS-Tween洗涤2次，并用TBS洗涤一次。

7)加入80微升SA-Alexa555并培育30分钟。然后将载玻片洗涤两次，干燥5分钟，并用微阵列扫描仪(马萨诸塞州华生的PE公司(Perkin-Elmer,Inc.；Waltham,MA))扫描。

图8显示了用包括抗EGFR胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体的微阵列ELISA检测A431细胞中的总EGFR。基于细胞数的捕获抗体稀释曲线实验显示，微阵列ELISA模式具有宽动态范围，从而可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10，000个细胞内的EGFR。基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线实验，显示可从一个细胞检测EGFR。当捕获抗体浓度为0.0625毫克/毫升时，单细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高2.11倍。

图9显示了用包含抗EGFR胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化EGFR的单克隆抗体作为检测抗体的微阵列ELISA检测A431细胞中的磷酸化EGFR。基于细胞数的捕获抗体稀释曲线实验显示，微阵列ELISA模式具有宽动态范围，从而可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10，000个细胞内的磷酸化EGFR。基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线实验，显示可从一个细胞检测磷酸化EGFR。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时，单细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高1.33倍。

图10显示了用包括抗ErBb2胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体的微阵列ELISA检测SKBr3细胞中的总ErBb2。基于细胞数的捕获抗体稀释曲线实验显示，微阵列ELISA模式具有宽动态范围，从而可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10，000个细胞内的ErBb2。基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线实验显示可从一个细胞检测ErBb2。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时，单细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高15.27倍。

图11显示了用包括抗ErBb2胞外域的单克隆抗体作为捕获抗体和抗磷酸化ErBb2的单克隆抗体作为检测抗体的微阵列ELISA检测SKBr3细胞中的磷酸化ErBb2。基于细胞数的捕获抗体稀释曲线实验显示，微阵列ELISA模式具有宽动态范围，从而可用稀释系列中各种捕获抗体浓度检测约1-10，000个细胞内的ErBb2。基于捕获抗体浓度稀释系列的细胞滴定曲线实验，显示可从一个细胞检测磷酸化ErBb2。当捕获抗体浓度为0.125毫克/毫升时，单细胞水平的信号相比背景(信/噪比)提高5.45倍。

实施例4用相近双检测器微阵列ELISA和酪酰胺信号放大进行单细胞检测。

该实施例列举了适合分析稀有循环细胞中信号转导分子的活化状态的具有高动态范围的多重、高通量、相近双检测器微阵列夹心ELISA。

1)以1毫克/毫升到0.004毫克/毫升连续稀释将捕获抗体印刷于16-衬垫FAST载玻片(沃特曼有限公司)。

2)干燥过夜后用Whatman封闭缓冲液封闭载玻片。

3)以10倍连续稀释在各个衬垫中加入80微升A431细胞裂解液。将载玻片室温培育2小时。

4)用TBS-Tween洗涤6次后在载玻片上加入80μl稀释于TBS-Tween/2％BSA/1％FBS的检测抗体用于相近试验。使用的检测抗体是：(1)直接偶联于葡萄糖氧化酶(GO)的抗-EGFR单克隆抗体；和(2)直接偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的识别磷酸化EGFR的单克隆抗体。室温培育2小时。

5)或者，检测步骤利用识别磷酸化EGFR的单克隆抗体的生物素偶联物。这些情况中，洗涤6次后还包括与链霉抗生物素蛋白-HRP一起培育1小时的额外连续步骤。

6)或者，检测步骤利用抗-EGFR抗体的寡核苷酸-介导的葡萄糖氧化酶(GO)偶联物。可使用直接偶联的或生物素-链霉抗生物素蛋白(SA)连接的磷酸化EGFR抗体的HRP偶联物。

7)加入80微升SA-Alexa555并培育30分钟。然后将载玻片洗涤两次，干燥5分钟，并用微阵列扫描仪(PE公司)扫描。

图12显示邻近双检测器微阵列ELISA与单检测器微阵列ELISA的比较。表2显示邻近双检测器微阵列ELISA与单检测器微阵列ELISA的灵敏度。显示了各种A431细胞浓度下邻近模式和单检测器模式相比于背景的信号(信/噪比)。如表2所示，邻近双检测器微阵列ELISA使得单细胞水平的灵敏度进一步提高了约3倍。

表2

图13显示了单检测器微阵列ELISA与邻近双检测器微阵列ELISA的试验特异性。由于缺乏单个检测抗体的特异性，以单检测器模式生成各种捕获抗体浓度下磷酸化EGFR滴定曲线的试验显示非常高的背景。相反，由于通过检测两个检测抗体之间的相近性提高了特异性，以相近双检测器模式生成各种捕获抗体浓度下磷酸化EGFR滴定曲线的试验显示非常低的背景。

实施例5用可寻址相近双检测器微阵列对众多信号转导分子的活化状态进行单细胞检测。

该实施例列举了适合分析稀有循环细胞中众多信号转导分子的活化状态的具有高动态范围的多重、高通量、可寻址相近双检测器微阵列试验：

1)将捕获抗体印刷于16-衬垫FAST载玻片(沃特曼有限公司)。印刷的捕获抗体是EGFR、HER2、Erk、Shc、PI3K和各类细胞角蛋白(pan-cytokeratin)。使用各种捕获抗体的2倍稀释系列(0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升和0.0625毫克/毫升)，各抗体稀释液点两个和四个斑点。

2)干燥过夜后用Whatman封闭缓冲液封闭载玻片。

3)以10倍连续稀释在各个衬垫中加入80微升细胞裂解液。将载玻片室温培育2小时。

4)用TBS-Tween洗涤6次后在载玻片上加入80μl稀释于TBS-Tween/2％BSA/1％FBS的检测抗体用于相近试验。使用的检测抗体是：(1)直接偶联于葡萄糖氧化酶(GO)的抗-EGFR单克隆抗体；和(2)直接偶联于HRP的识别磷酸化EGFR的单克隆抗体。室温培育2小时。

6)或者，检测步骤利用抗-EGFR抗体的寡核苷酸-介导的葡萄糖氧化酶偶联物。可使用直接偶联的或生物素-链霉抗生物素蛋白(SA)连接的磷酸化EGFR抗体的HRP偶联物。

7)为检测总的HER2和磷酸化蛋白质，用识别HER2的单克隆抗体代替识别EGFR的单克隆抗体进行步骤4)、5)或6)。

8)为进行信号放大，加入80微升5μg/ml的生物素-酪酰胺并反应15分钟。载玻片用TBS-Tween洗涤6次，用20％DMSO/TBS-Tween洗涤2次，并用TBS洗涤一次。

9)加入80微升SA-Alexa555并培育30分钟。然后将载玻片洗涤两次，干燥5分钟，并用微阵列扫描仪(PE公司)扫描。

图14显示了可寻址微阵列模式的一个示例性实施方式。5个靶点可通过特异性捕获抗体(例如，EGFR、HER2、Shc、Erk和PI3K)寻址。Shc、Erk或PI3K与EGFR或HER2形成的磷酸化复合物可在这种阵列上用相近双检测器模式检测。各类细胞角蛋白(PanCK)作为对照来标准化上皮细胞的数目。

图15显示了在受激A431细胞的滴定分析中检测磷酸化Shc的水平。可寻址阵列同时提供EGFR和HER2的磷酸化信息。

实施例6相近双检测器微阵列的动态范围扩展。

该实施例说明，在多重、高通量、相近双检测器微阵列试验中进行捕获抗体连续稀释能提高分析稀有循环细胞中信号转导分子活化状态的动态范围：

1)将捕获抗体印刷于16-衬垫FAST载玻片(沃特曼有限公司)。各捕获抗体2倍连续稀释获得总共9种浓度(从1毫克/毫升开始；结束于0.004毫克/毫升)。

2)干燥过夜后用Whatman封闭缓冲液封闭载玻片。

7)为进行信号放大，加入80微升5μg/ml的生物素-酪酰胺并反应15分钟。载玻片用TBS-Tween洗涤6次，用20％DMSO/TBS-Tween洗涤2次，并用TBS洗涤一次。

8)加入80微升SA-Alexa555并培育30分钟。然后将载玻片洗涤两次，干燥5分钟，并用微阵列扫描仪(PE公司)扫描。

图16显示了抗-EGFR捕获抗体的稀释曲线。采用可寻址阵列在单细胞水平检测受激A431细胞的磷酸化EGFR和总EGFR。该试验的动态范围大于5个log。每条单独曲线的动态范围约为2个log，当将6条提供信息曲线的信息组合时动态范围显著增加。

实施例7寡核苷酸与抗体的偶联。

该实施例例举了生成寡核苷酸偶联的抗体或酶的偶联和质控过程。

偶联：

1)用5'-SH基团和6-碳间隔子合成72-聚体寡核苷酸接头。

2)将冻干的寡核苷酸接头溶于20mM Tris-HCl，pH7.4。125纳摩尔接头然后用0.5MTCEP-HCl(伊利诺伊州罗克福德的皮尓斯生物技术公司)室温处理2小时，终浓度为50mM。用脱盐旋转柱(desalting spin column)除去反应混合物中的Tris、TCEP和未偶联的接头。

3)用100微升反应体积的异双功能交联剂如SMCC使所得去保护的寡核苷酸接头与靶蛋白(例如，抗体或酶)的伯胺偶联。

4)将反应混合物室温培育2小时。寡核苷酸-偶联的抗体或酶用Sephacryl S-200HR柱(新泽西州皮斯卡塔韦的GE健康护理公司(GE Healthcare；Piscataway，NJ))通过凝胶过滤纯化。

偶联物的鉴定：

1)使葡萄糖氧化酶(GO)分子与第一寡核苷酸接头偶联，在纯化后收集所得GO-寡核苷酸的三个组分并以10倍稀释系列印刷于硝酸纤维素涂布的载玻片。

2)使IgG与Alexa 647和第二寡核苷酸接头，该接头具有第一寡核苷酸接头的互补序列。将所得Alexa 647-寡核苷酸-偶联的抗体应用于芯片，在1X PBS缓冲液中室温杂交1小时，并洗涤数次。

3)将载玻片干燥并用微阵列扫描仪扫描以证实核苷酸序列-特异性杂交。

4)葡萄糖氧化酶的酶试验证实偶联过程不会改变酶的功能。

图17显示Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗体对组分13-15中的GO-寡核苷酸具有最高结合亲和力。

实施例8同时检测总EGFR和磷酸化EGFR的寡核苷酸-偶联的抗体。

该实施例列举了一种采用实施例7所述寡核苷酸偶联物分析稀有循环细胞内信号转导分子活化状态的多重、高通量、微阵列试验：

1)将捕获抗体印刷于16-衬垫FAST载玻片(沃特曼有限公司)。

2)干燥过夜后用Whatman封闭缓冲液封闭载玻片。

4)用TBS-Tween洗涤6次后在载玻片上加入80μl稀释于TBS-Tween/2％BSA/1％FBS的检测抗体用于相近试验。使用的检测抗体是：(1)直接偶联于Alexa647和寡核苷酸接头的抗体，其中所述寡核苷酸接头包含与偶联于葡萄糖氧化酶(GO)的寡核苷酸接头互补的序列；和(2)直接偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的识别磷酸化EGFR的单克隆抗体。使Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗-EGFR抗体接触GO-寡核苷酸以形成图18所示复合体。用TBS-Tween洗涤6次以除去过量的未结合试剂。

5)然后在反应体系中接入葡萄糖以及酪酰胺-Alexa555。

6)通过Alexa647-寡核苷酸-偶联的抗-EGFR抗体的直接结合检测总EGFR水平。通过GO-寡核苷酸与HRP-偶联的抗-p-EGFR抗体的相近结合并通过酪酰胺信号放大可视化来检测磷酸化EGFR。

7)在微阵列扫描仪(PE公司)上用Alexa647和Alexa555的特定激光扫描载玻片。

图19显示了总EGFR和磷酸化EGFR的同时检测。总EGFR(t-EGFR)通过仅有10个细胞的直接结合试验来检测，磷酸化EGFR(p-EGFR)从1个细胞检测。10e⁵p-EGFR分子采用相近信号放大法(proximity signal amplification method)检测。采用该相近试验模式使得p-EGFR的检出限提高100倍以上。

实施例9检测乳腺癌患者的循环肿瘤细胞(CTC)信号传导。

按照Chan等，Nat.Med.，10：1390-1396(2004)描述的方法进行微阵列制造和处理。将针对信号转导分子EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF-1R、Akt、Erk、p70S6K、Bad、Rsk、Mek、cSrc、细胞角蛋白、微管蛋白、β-肌动蛋白的抗体和抗-小鼠抗体(阳性对照)(4/4阵列)转移到384孔聚丙烯平板(50μl/孔)，使用装备有固态点样针的接触印刷自动微阵列仪(contactprinting robotic microarrayer)(加州赫尔克里斯的伯乐公司)将抗体点在载玻片上(新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司)。使用涂有8个扇形衬垫的载玻片。印刷之后用3％酪蛋白溶液封闭载玻片。载玻片在干燥环境中储存至少一夜后再使用。

按照公布的评价乳腺癌疑似女性循环肿瘤细胞的研究确定患者选择标准、样品制备方法和研究设计(参见，例如，Wulfing等，Clin.Cancer Res.，12：1715-1720(2006)；和Reinholz等，Clin.Cancer Res.，11：3722-3732(2005))。成像检测显示乳腺异常并要接受乳腺活检的女性被采纳进行该研究。包括至少42名被诊断为原发性乳腺癌的患者。至少35名患者在初步诊断没有明显的转移迹象。至少7名患者在诊断时有远端转移并被作为阳性参比组。没有患者有既往癌症史。收集各患者的年龄和治疗信息(例如，手术疗法、化疗、放疗、内分泌疗法等等)。从各患者收集约20毫升血液并给所有血液样品指定唯一标识号。所有试验由不知道活检结果的研究人员进行。

将外周血(18毫升)加入Accuspin Histopaque-1077系统(密苏里州圣路易斯的西格玛阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich；St.Louis，MO))并在Beckman CS-6R台式离心机(加州帕洛阿托的贝克曼仪器公司(Beckman Instruments；Palo Alto，CA))中以1500rpm离心10分钟。将单核的细胞层除去，用PBS洗涤两次，并用PBS/0.1％牛血清白蛋白稀释到1毫升。使用Dyna珠上皮细胞富集试剂盒按照制造商(挪威奥斯陆的戴纳公司)的说明用附于磁珠的抗Ber-EP4抗体通过免疫磁捕获富集上皮细胞。将细胞与20毫升1-107珠混合并振荡1小时。除了鳞状上皮细胞、肝细胞和周缘细胞的浅表层，Ber-EP4抗体识别上皮细胞表面上和胞质内的两种糖蛋白。将悬浮液在磁体上放置至少6分钟并小心除去上清液。附于磁珠的细胞用1ml PBS/0.1％牛血清白蛋白洗涤三次。在细胞中加入生长因子TGF-α(100nM)、调蛋白(100nM)和IGF(100nM)并在37℃培育5分钟。将细胞浓缩并用随试剂盒提供的裂解结合缓冲液裂解。裂解的细胞悬浮液(附有珠子)储存于80℃直到处理。

试验方法1：将裂解产物(40微升)施加于阵列，培育过夜，并用洗涤缓冲液洗涤三次。在阵列中加入抗各种信号转导分子的HRP-标记的抗-磷酸化抗体(按照例如Kuhlmann，《免疫酶技术》(Immuno Enzyme Techniques)，VC出版社(Verlag Chemie)，维海姆(Weinheim)，第1-162页(1984)的描述偶联)和葡萄糖氧化酶(按照Kuhlmann的描述偶联，同上)标记的抗-总抗体(即，活化状态非依赖性)，培育2小时，并用洗涤缓冲液洗涤三次。加入酪酰胺试剂(分子探针公司(Molecular Probes))和葡萄糖，反应1小时，洗涤三次。将阵列与链霉抗生物素蛋白-HRP一起培育30分钟，洗涤并用增强的鲁米诺(分子探针公司)显影。信号采用CCD照相机检测。

试验方法2：将抗2，4-二硝基苯酚(DNP)抗体(1毫克/毫升)转移到384孔聚丙烯平板(5微升/孔)，使用装备有固态点样针的接触印刷自动微阵列仪(加州赫尔克里斯的伯乐公司)将抗体点在载玻片上(新泽西州沃佛罗汉姆公园的沃特曼有限公司)。使用涂有8个扇形衬垫的载玻片。印刷之后用3％酪蛋白溶液封闭载玻片。载玻片在干燥环境中储存至少一夜后再使用。

将裂解产物(40微升)与总DNP-标记的抗上述各信号转导分子的抗体、用Oligo和Alexa647标记的抗-磷酸化抗体、以及用Oligo和Alexa647标记的抗-总抗体混合，加入抗-DNP抗体，培育过夜，并用洗涤缓冲液洗涤三次。加入2，4-二硝基赖氨酸(分子探针公司)从抗-DNP抗体上释放免疫复合体。将释放的免疫复合体加入邮编码阵列(参见，例如，Keramas等，Lab Chip，4：152-158(2004)；和Delrio-Lafreniere等，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.，48：23-31(2004))并培育过夜。将该阵列洗涤三次并用GenePix4000A微阵列扫描仪(艾克森扫描仪公司(Axon Scanner))以10微米分辨率扫描处理过的载玻片。

实施例10检测乳腺癌患者中循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(CEP)的信号传导。

采用实施例9中所述相同的患者样品、样品制备和试验方法，但CEC和CEP细胞采用附于磁性Dyna珠的单克隆抗体P1H12或CD146通过免疫磁捕获富集。采用实施例9所述方法制造和处理微阵列，但排列的抗体对以下分析物具有特异性：VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、TIE1、TIE2、PDGFR-α、PDGFR-β、FGFR1、FGFR2、Akt、Erk、p70S6K、Rsk、cSrc和β-肌动蛋白。实施例9所述试验方法被用于检测CEC和CEP的信号传导。

本说明书引用的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请专门且单独地表明通过引用纳入本文那样。虽然出于清晰理解的目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思和范围的情况下作出某些改变和修改。

Claims

1.一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(b)将所述众多捕获的分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物，其中所述检测抗体包含：

(1)众多用易化部分标记的活化状态非依赖性抗体，所述活化状态非依赖性抗体对样品中一种或多种感兴趣分析物具有特异性而不考虑它们的活化状态，所述易化部分是任何能够生成导向相近易化部分的另一个分子并与之反应的氧化剂的分子，和

(2)众多用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体，所述活化状态依赖性抗体对样品中一种或多种感兴趣分析物的特定活化状态具有特异性，

(d)检测信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号，

其中所述方法不用于疾病的诊断或治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞提取物包括实体瘤循环细胞的提取物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞是通过免疫磁分离从患者样品中分离的。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者样品选自下组：全血，血清，血浆，尿液，痰液，支气管灌洗液，泪液，乳头抽吸物，淋巴液，唾液，细针抽吸物，以及它们的组合。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞选自下组：循环肿瘤细胞，循环内皮细胞，循环内皮祖细胞，癌症干细胞，以及它们的组合。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞用生长因子体外刺激。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞用生长因子刺激之前与选自单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂，免疫抑制剂，以及它们的组合的抗癌药一起培育。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞用生长因子刺激之后被裂解以产生细胞提取物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包括众多信号转导分子。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自下组：玻璃，塑料，纸，以及它们的组合。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自下组：针，珠，膜，纤维束，以及它们的组合。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自下组：芯片，滤器，以及它们的组合。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体还包含可检测部分。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述可检测部分的量与一种或多种分析物的量相关。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体用易化部分直接标记，其中所述易化部分是葡萄糖氧化酶。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体通过偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸与偶联于易化部分的互补寡核苷酸之间的杂交而用易化部分标记。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体用信号放大对的第一成员直接标记。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体通过偶联于活化状态依赖性抗体的结合对第一成员与偶联于信号放大对的第一成员的结合对第二成员之间的结合而用信号放大对的第一成员标记，所述结合对第一成员是生物素，所述结合对第二成员是链霉抗生物素蛋白。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第二成员是酪酰胺试剂，其是生物素-酪酰胺。

21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述放大信号由过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺产生活化的酪酰胺而生成。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺是直接检测的。

23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺在加入信号检测试剂后检测。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋白-标记的荧光团。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋白-标记的过氧化物酶与显色试剂的组合。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于所述显色试剂是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。