Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Matrices a base de anticuerpos para detectar transductores de señales múltiples en células de rara circulación
ES2583079T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Jeanne Harvey Phillip Kim Sharat Singh Xinjun Liu Robert Barham Limin Liu - Current Assignee
- Nestec SA
Worldwide applications
Application ES12189529.6T events
2006-09-21
2007-09-20
2016-09-19
Application granted
2016-09-19
Status
Active
2027-09-20
Anticipated expiration
Description
translated from
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Matrices a base de anticuerpos para detectar transductores de senales multiples en celulas de rara circulacion ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCION
En la sangre de pacientes en diferentes fases tempranas de cancer se encuentran con frecuencia celulas tumorales, como “micrometastasis” (celulas tumorales diseminadas), que tambien se encuentran en canceres metastasicos. El numero de celulas tumorales en sangre depende de la fase y del tipo de tumor. Los tumores son extremadamente heterogeneos. Por consiguiente una biopsia de un solo lugar puede no ser representativa de la heterogeneidad de una poblacion tumoral. Las biopsias se obtienen habitualmente de tumores primarios; sin embargo no se hacen biopsias de la mayona de tumores metastasicos, lo cual dificulta todavfa mas el analisis molecular de muestras de tumores.
Durante la metastasis tumoral las celulas tumorales mas agresivas abandonan el tumor primario y viajan a traves de la sangre y del sistema linfatico para alcanzar una ubicacion alejada. Por tanto las celulas tumorales circulantes de la sangre representan la poblacion mas agresiva y homogenea de celulas tumorales. El numero de celulas tumorales metastasicas en la sangre puede variar desde una hasta varios miles de celulas por milfmetro de sangre. Por tanto se necesitan metodos espedficos y sensibles para detectar estas celulas con fines diagnosticos y pronosticos. La presente invencion satisface esta necesidad y ademas ofrece ventajas relacionadas.
La patente WO 02/090964 (de Genometrix Genomics Inc), publicada el 14 de noviembre de 2002, revela metodos para medir el rendimiento o la eficiencia de fijacion de analitos de las matrices, en particular de matrices proteicas o de moleculas pequenas, anadiendo una cantidad conocida de un analito de control a la solucion de la matriz o a la superficie de la matriz. Los controles se pueden analizar mediante programas informaticos y comparar con valores lfmite establecidos, a fin de determinar el rendimiento de la micromatriz. Los controles tambien pueden determinar errores o defectos de las micromatrices o de su procesamiento y la calidad de la muestra.
NIELSEN y otros, en "Profiling receptor tyrosine kinase activation by using Ab microarrays” [Perfilado de la activacion del receptor tirosina cinasa mediante el empleo de micromatrices Ab], Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, vol. 1 00, n° 16, 5 de agosto de 2003 (), paginas 9330-9335, revelan micromatrices de anticuerpos para cuantificar protemas. El antfgeno para la deteccion puede ser marcado y capturado directamente por un anticuerpo inmovilizado o bien puede ser capturado y luego detectado empleando un ensayo sandwich. Para controlar la activacion se usan anticuerpos de captura que son insensibles a la fosforilacion de la tirosina. Despues se utilizo un anticuerpo fosfoespedfico marcado con Cy3 y un anticuerpo panespedfico marcado con Cy5 para determinar la cantidad de protema y la fosforilacion. Se usan micromatrices de anticuerpos para controlar la activacion, la captacion y la senalizacion de receptores de tirosina-cinasas ErbB en lmeas celulares de tumores humanos. No hay ninguna interaccion ffsica ni qrnmica entre los marcadores de los anticuerpos.
NIELSEN y otros, en “Multiplexed sandwich assays in microarray format” [Ensayos sandwich multiplex en formato de micromatriz], Journal Of Immunological Methods, vol. 290, n° 1-2, julio de 2004 (07-2004), paginas 107-120, revelan micromatrices de anticuerpos como herramientas para cuantificar protemas y cualificar su estado de activacion en muestras biologicas. En particular se revelan ensayos ELISA sandwich multiplex realizados con micromatrices en los pocillos de placas multipocillo, lo cual permite el analisis de multiples muestras con una gran productividad y lecturas multivariadas. Aqu tampoco hay ninguna interaccion ffsica ni qrnmica entre los marcadores de los anticuerpos.
La patente WO 2006/054991 (Immunivest Corp) revela el uso del perfilado de proteomicos y transcritos de ARNm como fuente de informacion en el analisis de celulas tumorales para el diagnostico precoz del cancer y para predecir resultados clmicos. Se revelan metodos de diagnostico de la enfermedad consistentes en obtener una muestra de fluido corporal que comprende una poblacion de celulas mezcladas sospechosa de contener al menos un miembro de un grupo formado por celulas raras intactas y componentes celulares tales como fragmentos y restos de celulas procedentes de celulas raras y analizar el miembro del grupo, de modo que su presencia indica la existencia de la enfermedad.
BREVE RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCION
La presente invencion se refiere a un kit para llevar a cabo un metodo basado en matrices de anticuerpos para uno o mas analitos, que comprende:
(a) una serie de dilucion de varios anticuerpos de captura fijados sobre un soporte solido espedfico para uno o mas analitos; y
(b) varios anticuerpos de deteccion espedficos de uno o mas analitos, incluyendo
(i) varios anticuerpos independientes del estado de activacion, marcados con glucosa oxidasa, y
(ii) varios anticuerpos dependientes del estado de activacion, marcados con una peroxidasa, de modo que la union de ambos (i) y (ii) a un analito aproxima suficientemente la glucosa oxidasa a la peroxidasa, con lo cual una senal generada por glucosa oxidasa puede ser canalizada a la peroxidasa y como resultado se genera una senal detectable y/o amplificable.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ademas el kit puede incluir un reactivo de tiramida.
Varios anticuerpos independientes del estado de activacion pueden estar marcados con glucosa oxidasa y varios anticuerpos dependientes del estado de activacion con peroxidasa.
El soporte solido se puede seleccionar del grupo constituido por vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas, haces de fibras y combinaciones de ellos.
La presente invencion tambien se refiere al empleo de un kit para llevar a cabo un metodo basado en matrices de anticuerpos, de modo que la muestra usada en el metodo se elige del grupo constituido por sangre entera, suero, plasma, orina, esputos, fluido de lavado bronquial, lagrimas, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva, aspirado con aguja fina combinaciones de ellos. El kit comprende:
(a) una serie de dilucion de varios anticuerpos de captura fijados sobre un soporte solido espedfico para uno o mas analitos; y
(b) varios anticuerpos de deteccion espedficos de uno o mas analitos, incluyendo
(i) varios anticuerpos independientes del estado de activacion, marcados con glucosa oxidasa, y
(ii) varios anticuerpos dependientes del estado de activacion, marcados con una peroxidasa, de modo que la union de ambos (i) y (ii) a un analito aproxima suficientemente la glucosa oxidasa a la peroxidasa, con lo cual una senal generada por glucosa oxidasa puede ser canalizada a la peroxidasa y como resultado se genera una senal detectable y/o amplificable.
Las celulas para el uso del kit se pueden aislar de la muestra por separacion inmunomagnetica.
Las celulas aisladas para el uso del kit se pueden lisar con el fin de producir un extracto celular.
Las celulas aisladas para el uso del kit se pueden elegir del grupo formado por celulas tumorales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas madre cancerosas y combinaciones de las mismas.
Las celulas aisladas para el uso del kit se pueden estimular in vitro con factores de crecimiento.
Las celulas aisladas para el uso del kit se pueden lisar tras la estimulacion con factores de crecimiento, a fin de producir un extracto celular.
El analito o los varios analitos para el uso del kit pueden incluir una serie de moleculas transductoras de senales.
Otros objetivos, caractensticas y ventajas seran evidentes para el especialista en la materia, viendo la descripcion detallada y las figuras siguientes.
DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra tres anticuerpos unidos espedficamente a un analito activado.
La figura 2 muestra un esquema de ensayo en el cual los anticuerpos marcados que se han unido espedficamente a un analito activado estan sujetos a un soporte solido.
La figura 3 muestra la deteccion del RFCE total en celulas A431, empleando anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y anticuerpo detector en un ensayo ELISA. (a) Curva estandar del sandwich ELISA. La sensibilidad fue de aproximadamente 0,25 pg/pocillo, empleando un dominio extracelular recombinante de RFCE humano. (b) Curva de valoracion celular. La concentracion de RFCE en celulas A431 se detecto mediante ELISA. (c) Tabla de concentracion de RFCE calculada en pg/pocillo y en pg/celula. La concentracion de RFCE calculada fue de aproximadamente 0,6 pg en cada celula A431.
La figura 4 muestra la deteccion de RFCE fosforilado en celulas A431, empleando un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal marcado con biotina contra el RFCE fosforilado como anticuerpo detector en un ensayo ELISA. (a) Curva de valoracion celular con una serie de diluciones del anticuerpo de captura. (b) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo. La relacion senal/ruido fue de 1,78 al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,0625 pg/ml.
La figura 5 muestra la deteccion de ErbB2 total en celulas SKBr3, empleando anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de ErbB2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector en un ensayo ELISA. (a) Valoracion celular de ErbB2 total en celulas SKBr3. El rango de deteccion aproximado estaba comprendido entre 1.000 y 1,37 celulas. (b) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo. La relacion senal/ruido fue de 2,71 al nivel celular 1,37, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 1 pg/ml.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La figura 6 muestra la deteccion de ErbB2 fosforilado en celulas SKBr3, usando un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de ErbB2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra ErbB2 fosforilado como anticuerpo detector en un ensayo ELISA. (a) Valoracion celular de ErbB2 fosforilado en celulas SKBr3. El rango de deteccion aproximado estaba comprendido entre 500 y 5 celulas. (b) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo. La relacion senal/ruido fue de 3,03 al nivel celular 5, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 1 |jg/ml.
La figura 7 muestra la deteccion del total de protema Erk2 fosforilada en celulas SKBr3, empleando anticuerpos monoclonales contra Erk2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector en un ensayo ELISA. (a) Deteccion del total de protema Erk2, empleando anticuerpos monoclonales contra Erk2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector. (b) Deteccion de protema Erk2 fosforilada, usando un anticuerpo monoclonal contra Erk2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra Erk2 fosforilada como anticuerpo detector. (c) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo. La relacion senal/ruido fue de aproximadamente 3 al nivel celular 1,37 para la Erk2 total y fosforilada.
La figura 8 muestra la deteccion del total de RFCE en celulas A431, empleando anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y anticuerpo detector en una micromatriz ELISA. (a) Curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas. La micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar RFCE en aproximadamente 1 - 10.000 celulas, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. (b) Curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura, la cual indico que podfa detectarse RFCE a partir de una celula (flecha).
(c) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo a varias concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. La relacion senal/ruido fue de 2,11 al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,0625 mg/ml (flecha).
La figura 9 muestra la deteccion de RFCE fosforilado en celulas A431, empleando un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra RFCE fosforilado como anticuerpo detector en una micromatriz ELISA. (a) Curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas. La micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar RFCE fosforilado en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion.
(b) Curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura, la cual indico que podfa detectarse RFCE fosforilado a partir de una celula. (c) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo a varias concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. La relacion senal/ruido fue de 1,33 al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml (flecha).
La figura 10 muestra la deteccion de ErBb2 total en celulas SKBr3, empleando anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de ErBb2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector en una micromatriz ELISA. (a) Curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas. La micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar ErBb2 en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. (b) Curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura, la cual indico que podfa detectarse ErBb2 a partir de una celula (flecha).
(c) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo a varias concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. La relacion senal/ruido fue de 15,27 al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml (flecha).
La figura 11 muestra la deteccion de ErBb2 fosforilado en celulas SKBr3, usando un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de ErBb2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra ErBb2 fosforilado como anticuerpo detector en una micromatriz ELISA. (a) Curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas. La micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar ErBb2 en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. (b) Curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura, la cual indico que podfa detectarse ErBb2 fosforilado a partir de una celula (flecha). (c) Tabla de relacion senal/ruido (S/N) entre las celulas y el fondo a varias concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. La relacion senal/ ruido fue de 5,45 al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml (flecha).
La figura 12 muestra una comparacion de la sensibilidad de la micromatriz ELISA como detector dual de proximidad frente a la micromatriz ELISA como detector individual. Se diluyeron celulas A431 desde 10.000 hasta 0,01 celulas. Los anticuerpos de captura se diluyeron en serie, desde 1 mg/ml hasta 0,004 mg/ml.
La figura 13 muestra la especificidad de la micromatriz ELISA como detector individual frente a la micromatriz ELISA como detector dual de proximidad. (a) Curvas de valoracion de RFCE fosforilado en celulas A431 a diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en el formato de detector individual. Se observo un fondo muy elevado, debido a la falta de especificidad del anticuerpo de deteccion individual en este formato. (b) Curvas de valoracion de RFCE fosforilado en celulas A431 a diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en el formato de detector
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dual de proximidad. Se observo un fondo muy bajo, debido a la mayor especificidad obtenida al detectar en este formato la proximidad entre dos anticuerpos detectores.
La figura 14 muestra un ejemplo de forma de ejecucion del formato de la micromatriz disponible, con el empleo de una serie de diluciones de anticuerpos de captura para determinar los estados de activacion de varias moleculas transductoras de senales.
La figura 15 muestra los niveles de deteccion de Shc fosforilada en un analisis de valoracion de celulas A431 estimuladas. La matriz disponible proporciono simultaneamente informacion sobre la fosforilacion de RFCE y HER2.
La figura 16 muestra las curvas de dilucion de un anticuerpo de captura anti-RFCE. El rango dinamico de este ensayo fue superior a 5 logs. Cada curva individual tema un rango dinamico de aproximadamente 2 logs, pero el rango dinamico se incremento significativamente al combinar la informacion de las 6 curvas.
La figura 17 muestra un procedimiento de control de calidad para los oligonucleotidos conjugados de la presente invencion. Se muestra el patron de manchas de varias fracciones de GO-oligonucleotidos en la micromatriz. (b) Los anticuerpos conjugados Alexa 647-oligonucleotido tuvieron la mayor afinidad por los GO-oligonucleotidos en las fracciones 13-15.
La figura 18 muestra la formacion de un complejo multiplexado de RFCE fosforilado que comprende un anticuerpo conjugado Alexa 647-oligonucleotido anti-RFCE hibridado con un glucosa oxidasa (GO)-oligonucleotido, un anticuerpo HRP conjugado anti RFCE fosforilado y un anticuerpo de captura de RFCE sujeto a un soporte solido.
La figura 19 muestra la deteccion simultanea de RFCE total y fosforilado. (a) El RFCE total presente en 10.000 celulas se detecto mediante la senal de Alexa 647 generada por el anticuerpo conjugado Alexa 647-oligonucleotido anti-RFCE. El grado de fosforilacion se detecto controlando la senal de Alexa 555 mediada por tiramida. (b) El RFCE total (t-RFCE) se detecto mediante un ensayo directo de fijacion, partiendo de solo 10 celulas, y el RFCE fosforilado (p-RFCE) se detecto a partir de 1 celula. Con el metodo de amplificacion de la senal de proximidad se detectaron 10e5 moleculas de p-RFCE. El lfmite de deteccion del p-RFCE se incremento mas de 100 veces usando el formato de ensayo de proximidad.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCION
I. Introduccion
Se revelan metodos para detectar el estado de activacion y/o la cantidad total de varias moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion, empleando un sistema de ensayo basado en una matriz de anticuerpos. Se revela que los inmunoensayos multiplex de alto rendimiento pueden detectar el estado de activacion de una o mas moleculas transductoras de senales en celulas circulantes de un tumor solido a nivel de una sola celula. De hecho moleculas transductoras de senales como las de RFCE se pueden detectar con una sensibilidad de 100 zeptomoles aproximadamente y un rango dinamico lineal de aproximadamente 100 zeptomoles hasta 100 femtomoles. Como tal, la deteccion unicelular del estado de activacion de multiples transductores de senales en celulas de rara circulacion facilita el pronostico y el diagnostico del cancer, asf como el diseno de terapias selectivas personalizadas.
Entre las celulas de rara circulacion se encuentran las celulas de un tumor solido que han sido metastatizadas o micrometastatizadas a partir del mismo. Como ejemplos de algunas celulas circulantes de un tumor solido cabe citar las celulas de tumores circulantes, las celulas madre cancerosas y las celulas que migran hacia un tumor (p.ej. por quimioatraccion), tales como las celulas progenitoras endoteliales circulantes, las celulas endoteliales circulantes, las celulas mieloides proangiogenicas circulantes y las celulas dendnticas circulantes.
Las moleculas transductoras de senales que son de interes suelen extraerse poco despues de haber aislado las celulas circulantes, a fin de preservar su estado de activacion in situ, preferiblemente dentro de las primeras 24, 6 o 1 h y con mayor preferencia dentro de los primeros 30, 15 o 5 minutos, aproximadamente. Las celulas aisladas tambien se pueden incubar con uno o mas factores de crecimiento, normalmente a concentraciones nanomolares hasta micromolares durante aproximadamente 1-30 minutos, para reavivar o estimular la activacion de las moleculas transductoras de senales (vease p.ej. Irish y otros, Cell, 118:217-228 (2004)).
Tal como se explica aqrn mas detalladamente, con el fin de valorar potenciales terapias anticancer para un paciente individual, las celulas aisladas se pueden incubar con uno o mas farmacos anticancer en dosis variables. Luego se puede estimular el factor de crecimiento durante unos minutos (p.ej. 1-5 minutos) o varias horas (p.ej. 1-6 horas). La activacion diferencial de las vfas de senalizacion con y sin farmacos anticancer puede ayudar a elegir una terapia anticancer adecuada, a la dosis idonea para cada paciente. Las celulas circulantes tambien pueden aislarse de una muestra de un paciente durante el tratamiento con farmacos anticancer y estimularse con uno o mas factores de crecimiento, para determinar si hay que implementar un cambio en la terapia. Los metodos de la presente invencion ayudan ventajosamente al medico clmico a administrar el farmaco anticancer adecuado, en la dosis correcta y en el tiempo conveniente para cada paciente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
II. Definiciones
Tal como se usan aqrn, los siguientes terminos tienen los significados adscritos, a no ser que se especifique lo contrario.
El termino “cancer” pretende incluir cualquier tipo de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes. El termino abarca todos los canceres y estados neoplasicos conocidos, ya sean malignos, benignos, de tejido blando o solido, y los canceres de todas las fases y etapas, incluyendo los canceres pre- y postmetastasicos. Como ejemplos de los diferentes tipos de cancer cabe citar, sin limitarse a ellos, el cancer de pulmon (p.ej. cancer de pulmon de celulas no pequenas); canceres digestivos y gastrointestinales tales como cancer colorrectal, tumores del estroma gastrointestinal, tumores carcinoides gastrointestinales, cancer de colon, cancer rectal, cancer anal, cancer de los conductos biliares, cancer del intestino delgado y cancer de estomago (gastrico), cancer esofagico, cancer de la vesfcula biliar, cancer de hngado, cancer de pancreas, cancer de apendice; cancer de mama, cancer ovarico; cancer renal (p.ej. carcinoma de celulas renales); cancer del sistema nervioso central; cancer de piel; linfomas; coriocarcinomas; canceres de cabeza y cuello; sarcomas osteogenicos; y canceres de la sangre. Tal como se usa aqrn, un “tumor” comprende una o mas celulas cancerosas.
El termino “analito” incluye cualquier molecula de interes, normalmente una macromolecula polipeptfdica, cuya presencia, cantidad y/o identidad se determina. En ciertos casos el analito es un componente celular de celulas circulantes o de un tumor solido, preferiblemente una molecula transductora de senales.
Tal como se usa aqrn, el termino “serie de dilucion” pretende incluir una serie de concentraciones descendentes de una muestra (p.ej. lisado celular) o un reactivo (p.ej. anticuerpo) concretos. Una serie de dilucion suele prepararse mezclando una cantidad medida de una concentracion inicial de una muestra o reactivo con un diluyente (p.ej. un tampon de dilucion), para crear una concentracion mas baja de la muestra o reactivo, y repitiendo el proceso las veces suficientes para obtener el numero deseado de diluciones en serie. La muestra o reactivo se puede diluir en serie al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 o 1000 veces, para producir una serie de diluciones que tengan al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 concentraciones descendentes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, una serie de dilucion que comprenda una dilucion doble de un anticuerpo de captura a una concentracion inicial de 1 mg/ml de reactivo se puede obtener mezclando una cantidad de la concentracion inicial del anticuerpo de captura con igual cantidad de un tampon de dilucion, para crear una concentracion de 0,5 mg/ml del anticuerpo de captura y repitiendo el proceso para obtener concentraciones del anticuerpo de captura de 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,0325 mg/ml, etc.
Tal como se usa aqrn, el termino “rango dinamico superior” se refiere a la capacidad de un ensayo para detectar un analito espedfico en solo una celula o en miles de ellas. Por ejemplo, los inmunoensayos aqrn descritos tienen un rango dinamico superior, porque detectan ventajosamente una molecula concreta de interes transductora de senales en aproximadamente 1-10.000 celulas (p.ej. en aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 o 10.000 celulas), empleando una serie de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura.
El termino “molecula transductora de senales” o “transductor de senales” incluye protemas y otras moleculas que llevan a cabo el proceso por el cual una celula convierte una senal o estfmulo extracelular en una respuesta que normalmente implica secuencias ordenadas de reacciones bioqmmicas en el interior de la celula. Como ejemplos de moleculas transductoras de senales cabe citar, sin limitarse a ellas, receptores de tirosina-cinasas tales como RFCE (p.ej., RFCE/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, PDGFR (p.ej., PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de insulina), IGF- IR, IGF-IIR, IRR (receptor de insulina- receptor relacionado), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (leucocito tirosina cinasa), ALK (cinasa de linfoma anaplasico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, y RTK 106; no receptores de tirosina cinasas tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK; componentes de la cascada de senalizacion de tirosina tales como Akt, MAPK/ERK, mEk, RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), PI3K, Ras (p.ej., K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Racl, Cdc42, PLC, PKC, p70 S6 cinasa, p53, ciclina D1, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PDK, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67 y paxillina; y combinaciones de las mismas.
Tal como se usa aqrn, el termino “celulas circulantes” incluye celulas que se han metastatizado o micrometastatizado a partir de un tumor solido. Como ejemplos de celulas circulantes cabe mencionar, sin limitarse a ellas, las celulas de tumores circulantes, celulas madre cancerosas y/o celulas que migran hacia el tumor (p.ej. las celulas progenitoras endoteliales circulantes, las celulas endoteliales circulantes, las celulas mieloides proangiogenicas circulantes, las celulas dendnticas circulantes, etc.).
Tal como se emplea aqrn, el termino “muestra” comprende cualquier muestra biologica obtenida de un paciente. Las muestras incluyen, sin limitacion, sangre entera, plasma, suero, globulos rojos, globulos blancos (p.ej. celulas mononucleares de la sangre periferica), saliva, orina, excrementos (es decir, heces), esputos, lfquido de lavado bronquioalveolar, lagrimas, lfquido del pezon, linfa (p.ej. celulas tumorales diseminadas del nodo linfatico), aspirado con aguja fina, cualquier otro fluido corporal, una muestra de tejido (p.ej. de tejido tumoral) tal como una biopsia de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
un tumor (p.ej. biopsia con aguja) y extractos celulares de las mismas. Se revela que la muestra puede ser sangre entera o un componente fraccionario de la misma como plasma, suero o un sedimento celular. Se revela que la muestra se obtiene aislando celulas circulantes de un tumor solido, de la sangre entera o de una fraccion celular de la misma, empleando cualquier tecnica conocida del estado tecnico y preparando un extracto celular de las celulas circulantes. Se revela que la muestra puede ser de tejido tumoral embebida en parafina y fijada en formol (FFPE), p.ej. de un tumor solido del pulmon, del colon o del recto.
El termino “sujeto” o “paciente” incluye normalmente humanos, pero tambien puede referirse a animales, como p.ej. otros primates, roedores, canidos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.
Una “matriz” o “micromatriz” comprende un juego diferenciado y/o una serie de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados o sujetos sobre un soporte solido, como por ejemplo vidrio (p.ej. una placa de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, bolas (p.ej. magneticas, de poliestireno, etc.), papel, membranas (p.ej. de nylon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDf), etc.), haces de fibras o cualquier otro substrato adecuado. Los anticuerpos de captura se inmovilizan o se fijan generalmente sobre el soporte solido mediante interacciones covalentes o no covalentes (p.ej. enlaces ionicos, interacciones hidrofobas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En ciertos casos los anticuerpos de captura comprenden marcadores de captura que interaction con agentes de captura sujetos al soporte solido. Las matrices empleadas en los ensayos comprenden tfpicamente una serie de diferentes anticuerpos de captura y/o concentraciones de anticuerpo de captura que se acoplan a la superficie de un soporte solido en distintas ubicaciones conocidas/direccionables.
El termino “anticuerpo de captura” pretende incluir un anticuerpo inmovilizado que es espedfico (es decir, que se fija, es fijado por, o forma un complejo con) de uno o mas analitos de interes en una muestra tal como un extracto celular de celulas circulantes de un tumor solido. Se revela que el anticuerpo de captura puede estar sujeto sobre un soporte solido en una matriz. Anticuerpos de captura adecuados para inmovilizar cualquier variedad de moleculas transductoras de senales se pueden adquirir de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, Mo), y BD Biosciences (San Jose, CA).
Tal como se emplea aqrn, el termino “anticuerpo detector” incluye un anticuerpo con un marcador detectable que es espedfico (es decir, que se fija, es fijado por o forma un complejo con) de uno o mas analitos de interes en una muestra. El termino tambien engloba un anticuerpo que es espedfico para uno o mas analitos de interes y que puede ser fijado por otra especie que lleve un marcador detectable. Como ejemplos de marcadores detectables cabe citar, sin limitarse a ellos, los de biotina/estreptavidina, acido nucleico (p.ej. oligonucleotido), los qmmicamente reactivos, los marcadores fluorescentes, enzimaticos, radiactivos y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos idoneos para detectar el estado de activacion y/o la cantidad total de cualquier variedad de moleculas transductoras de senales se pueden adquirir de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO) y BD Biosciences (San Jose, CA). Como ejemplo no limitativo, pueden adquirirse de Santa Cruz Biotechnology anticuerpos fosfoespedficos contra varias formas fosforiladas de moleculas transductoras de senales tales como RFCE, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, Akt, MAPK, PTEN, Raf y MEK.
El termino “anticuerpo dependiente del estado de activacion” incluye un anticuerpo detector espedfico (es decir, que se fija, es fijado por, o forma un complejo con) de un estado de activacion particular de uno o mas analitos de interes en una muestra. Se revela que el anticuerpo dependiente del estado de activacion puede detectar el estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o la formacion de complejos de uno o mas analitos tales como moleculas transductoras de senales. Se revela que la fosforilacion de miembros de la familia RFCE de receptores de tirosina-cinasas y/o la formacion de complejos heterodfmeros entre miembros de la familia RFCE se detecta empleando anticuerpos dependientes del estado de activacion. Como ejemplos no limitativos de estados de activacion (listados entre parentesis) adecuados para la deteccion mediante anticuerpos dependientes del estado de activacion cabe citar: RFCE (EGFRvIII, fosforilado (p-) RFCE, RFCE:Shc, ubiquitinado (u-) RFCE, p-EGFRvIII); ErbB2 (p85: truncado (Tr)- ErbB2, p-ErbB2, p85:Tr-p-ErbB2, Her2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:RFCE, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p- ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R: IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); KIT (p-KIT); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p- HGFR2); RET (p-RET); PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP); VEGFR1 (p-VEGFR1, VEGFR1:PLCy, VEGFR1: Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:sulfato de heparina, VEGFR2:VE- cadherina); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tiel (p-Tiel); Tie2 (p-Tie2); EphA (p-EphA); EphB (p-EphB); NFKB y/o IKB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (S112, S136), Bad:14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-Jnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392, S20)); CREB (p-CREB (S133)); c-Jun (p-c-Jun (S63)); cSrc (p-cSrc (Y416)); y paxillina (p-paxillina (Y1l8)).
El termino “anticuerpo independiente del estado de activacion” incluye un anticuerpo detector espedfico (es decir, que se fija, es fijado por, o forma un complejo con) de uno o mas analitos de interes en una muestra, sin tener en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cuenta su estado de activacion. Por ejemplo, el anticuerpo independiente del estado de activacion puede detectar tanto formas fosforiladas como no fosforiladas de uno o mas analitos tales como una o mas moleculas transductoras de senales.
El termino “acido nucleico” o “polinucleotido” incluye desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y sus polfmeros, en forma mono- o bicatenaria como, por ejemplo, ADN y ARN. Los acidos nucleicos incluyen aquellos que contienen analogos de nucleotidos conocidos o restos o uniones de cadena modificadas que son de tipo sintetico, natural o no natural y poseen caractensticas de fijacion analogas a las del acido nucleico de referencia. Como ejemplos de tales analogos cabe citar, sin limitacion, fosforotioatos, fosforoamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2'-O- metil-ribonucleotidos y acidos nucleicos peptidicos (PNAs). Si no esta limitado espedficamente, el termino engloba acidos nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales con caractensticas de fijacion analogas a las del acido nucleico de referencia. Si no se indica lo contrario, una secuencia concreta de acido nucleico tambien engloba implfcitamente variantes con modificaciones conservadoras del mismo y secuencias complementarias, asf como la secuencia indicada explfcitamente.
El termino “oligonucleotido” se refiere a un oligomero o polfmero monocatenario de ARN, ADN, hforido ARN/ADN y/o un mimetico del mismo. En ciertos casos los oligonucleotidos estan compuestos por bases nucleicas, azucares y uniones entre nucleosidos (esqueleto) naturales (o sea, sin modificar). En algunos otros casos los oligonucleotidos comprenden bases nucleicas, azucares y/o uniones entre nucleosidos modificadas.
Tal como se emplea aqrn, el termino “motivo desapareado” o “region desapareada” se refiere a una porcion de un oligonucleotido que no tiene el 100% de complementariedad con su secuencia complementaria. Un oligonucleotido puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones desapareadas, que pueden ser contiguas o estar separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas nucleotidos. Los motivos o regiones desapareadas pueden comprender un solo nucleotido o dos, tres, cuatro, cinco o mas nucleotidos.
El termino “condiciones estrictas de hibridacion” se refiere a aquellas condiciones en las que un oligonucleotido se hibrida con su secuencia complementaria, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y son distintas en circunstancias diferentes. Las secuencias mas largas se hibridan espedficamente a temperaturas mas altas. En Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" [Tecnicas en bioqumica y biolog^a molecular - hibridacion con sondas nucleicas, “Resumen de los principios de hibridacion y estrategia de los ensayos con acidos nucleicos"] (1993) se encuentra una extensa grna sobre la hibridacion de acidos nucleicos. En general las condiciones estrictas se eligen de manera que esten aproximadamente 5-10°C por debajo del punto de fusion termico (Tm) de la secuencia espedfica a una fuerza ionica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica, un pH y una concentracion definidas) a la cual el 50% de las sondas complementarias de la diana se hibrida con la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias diana se hallan en exceso, a Tm, el 50% de las sondas estan ocupadas en equilibrio). Tambien se pueden conseguir condiciones estrictas con la adicion de agentes desestabilizantes como la formamida. Para la hibridacion selectiva o espedfica, una senal positiva es al menos dos veces el nivel de fondo, preferiblemente 10 veces la hibridacion de nivel de fondo.
Los terminos “sustancialmente identico” o “identidad sustancial”, en el contexto de dos o mas acidos nucleicos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o que poseen un porcentaje especificado de nucleotidos iguales (es decir, al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad a lo largo de una region especificada) cuando se cotejan y se alinean para ver la correspondencia maxima en una ventana de comparacion o en una region designada como medida, empleando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Cuando el contexto lo indica, esta definicion tambien se refiere analogamente al complemento de una secuencia. La identidad sustancial existe con preferencia en una region de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleotidos de longitud.
El termino “incubando” se usa como sinonimo de “poniendo en contacto” o “exponiendo” y no implica ningun tiempo concreto ni requisitos de temperatura, a no ser que se indique otra cosa.
III. Descripcion
Se revelan matrices a base de anticuerpos para detectar el estado de activacion y/o la cantidad total de varias moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion y metodos de empleo, con el fin de facilitar el pronostico y el diagnostico del cancer y el diseno de terapias selectivas personalizadas.
A. Matrices de anticuerpos
Se revela una matriz de rango dinamico superior que comprende varias series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos en un extracto celular, en la cual los anticuerpos de captura estan sujetos sobre un soporte solido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se revela que el extracto celular comprende un extracto de celulas circulantes de un tumor solido. Las celulas circulantes suelen aislarse de una muestra de un paciente, mediante el empleo de uno o mas metodos de separacion, incluyendo por ejemplo la separacion inmunomagnetica (vease p.ej. Racila y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth y otros, Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)), la separacion microflmdica (vease p.ej. Mohamed y otros, IEEE Trans. Nanobiosci., 3:251-256 (2004); Lin y otros, Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS (vease p.ej. Mancuso y otros, Blood, 97:3658-3661 (2001)), la centrifugacion por gradiente de densidad (vease p.ej. Baker y otros, Clin. Cancer Res., 13: 4865-4871 (2003)), y los metodos de deplecion (vease p.ej. Meye y otros, Int. J. Oncol., 21:521-530 (2002)).
Se revela que la muestra del paciente incluye sangre entera, suero, plasma, orina, esputos, lfquido de lavado bronquioalveolar, lagrimas, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva y/o aspirado con aguja fina. En algunos casos, de la muestra de sangre entera se separa una fraccion de plasma o suero y una fraccion celular (es decir, un sedimento celular). La fraccion celular contiene normalmente globulos rojos, globulos blancos y/o celulas circulantes de un tumor solido, como celulas tumorales circulantes (CTCs), celulas circulantes endoteliales (CECs), celulas progenitoras endoteliales circulantes (CEPCs), celulas madre cancerosas (CSCs) y combinaciones de las mismas. La fraccion de plasma o suero contiene, entre otras cosas, acidos nucleicos (p.ej. ADN, ARN) y protemas liberadas por las celulas circulantes de un tumor solido.
En algunos casos las celulas circulantes aisladas se pueden estimular in vitro con uno o mas factores de crecimiento antes, durante y/o despues de la incubacion con uno o mas farmacos anticancer de interes. Entre los factores estimulantes del crecimiento cabe citar, sin limitarse a ellos, el factor de crecimiento epidermico (EGF), la heregulina (HRG), TGF-a, PIGF, la angiopoyetina (Ang), NRG1, PGF, TNF-a, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, las citocinas y similares. En otros casos, las celulas circulantes aisladas se pueden lisar, p.ej. despues de la estimulacion con factores de crecimiento y/o del tratamiento con farmacos anticancer, a fin de producir el extracto celular (p.ej. lisado celular), usando cualquier tecnica conocida en este campo. La lisis celular se inicia preferiblemente unos 1-360 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento y, con mayor preferencia, en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) a unos 1-5 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento y (2) a unos 30-180 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento. Como alternativa el lisado celular se puede conservar a -80°C hasta su uso.
Se revela que el farmaco anticancer incluye un agente anti-senalizacion (es decir, un farmaco citostatico) tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina-cinasa, un agente antiproliferativo, un agente quimioterapeutico (es decir, un farmaco citotoxico) y/o cualquier otro compuesto capaz de reducir o abolir el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes como las de tipo canceroso. Se revela que las celulas circulantes aisladas son tratadas con un agente anti-senalizacion y/o un agente antiproliferativo, en combinacion con uno o mas agentes quimioterapeuticos.
Como ejemplos de agentes anti-senalizacion adecuados para usar en la presente invencion cabe mencionar, sin
limitacion, anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Herceptin®), alemtuzumab (Campath®), bevacizumab ® 1 ® ® ' 1 ' ® ' 1 ' ® (Avastin ), cetuximab (Erbitux ), gemtuzumab (Mylotarg ), panitumumab (Vectibix ), rituximab (Rituxan ) y
tositumomab (BEXXAR®); inhibidores de tirosina-cinasa tales como gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®), erlotinib
(Tarceva®), lapatinib (GW-572016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584),
sorafenib (BAY 43-9006; Nexavar®), imatinib mesilato (Gleevec®) y leflunomide (SU101); y combinaciones de los
mismos.
Como ejemplos de agentes antiproliferativos cabe citar inhibidores de mTOR tales como sirolimus (rapamycin), temsirolimus (CCI-779) y everolimus (RAD001); inhibidores de Akt como 1 L6-hidroximetil-quiro-inositol-2-(R)-2-O- metil-3-O-octadecil-sn-glicerocarbonato, 9-metoxi-2-metilellipticinio acetato, 1,3-dihidro-1-(1-((4-(6-fenil-1H-imidazo- [4,5-g]quinoxalin-7-il)fenil)metil)-4-piperidinil)-2H-benzimidazol-2-ona, 10-(4'-(N-dietilamino)butil)-2-cloropfenoxazina, 3-formilcromona tiosemicarbazona (complejo Cu(II)Ch), API-2, un peptido 15-mero derivado de los aminoacidos 1024 del proto-oncogen TCL1 (Hiromura y otros, J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1, y los compuestos descritos en Kozikowski y otros, J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) y Kau y otros, Cancer Cell, 4:463-476 (2003); y combinaciones de los mismos.
Como ejemplos no limitativos de agentes quimioterapeuticos cabe citar farmacos a base de platino (p.ej. oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes de alquilacion (p.ej. ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, busulfan, melfalan, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), anti-metabolitos (p.ej. 5-fluorouracilo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, pemetrexed, raltitrexed, etc.), alcaloides vegetales (p.ej. vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel, docetaxel, etc.), inhibidores de topoisomerasa (p.ej. irinotecano, topotecano, amsacrina, etoposido (VP16), etoposido fosfato, teniposido, etc.), antibioticos antitumorales (p.ej. doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), y sales farmaceuticamente aceptables, estereoisomeros, derivados, analogos y combinaciones de los mismos.
Se revela que uno o mas de los analitos contenidos en el extracto celular incluyen varias moleculas transductoras de senales. Arriba se describen ejemplos de moleculas transductoras de senales de interes, incluyendo receptores y no receptores de tirosina-cinasa y/o componentes de la cascada de senalizacion de tirosina-cinasa.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se revela que cada una de las series de dilucion de anticuerpos de captura incluye una serie de concentraciones descendentes de anticuerpo de captura. En ciertos casos los anticuerpos de captura van diluidos en serie al menos 2 veces (p.ej. 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1000 veces) para producir una serie de diluciones con un numero (p.ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o mas) de concentraciones descendentes de anticuerpo de captura puestas sobre la matriz. Sobre la matriz se colocan preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.
Se revela que el soporte solido comprende vidrio (p.ej. una placa de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas (p.ej. de nylon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro substrato adecuado. Se revela que los anticuerpos de captura pueden ir sujetos (p.ej. mediante interacciones covalentes o no covalentes) sobre placas de vidrio recubiertas con un polfmero de nitrocelulosa, como por ejemplo las placas FAST®, que comercializa Whatman Inc. (Florham Park, NJ).
Como ejemplo no limitativo la figura 14 representa una micromatriz direccionable que incluye varias series de dilucion de anticuerpos de captura para determinar los estados de activacion de RFCE, HER2, Shc, Erk y PI3K dirigiendo los anticuerpos de captura de cada serie de dilucion hacia uno de estos analitos. Por tanto las matrices pueden comprender varios anticuerpos de captura distintos en series de concentraciones descendentes (es decir, de diluciones en serie), donde los anticuerpos de captura se acoplan a la superficie del soporte solido en distintas ubicaciones direccionables.
Un experto en la materia apreciara que la matriz puede tener cualquier configuracion que permita detectar senales discretas de cada molecula transductora de senales activada. Asf, por ejemplo, la matriz puede ser una lmea o una cuadncula de distintas regiones (p.ej. puntos o manchas) sobre la superficie soporte, cada una de ellas con un anticuerpo o agente de captura diferente (es decir, para fijar el marcador de captura presente en el anticuerpo de captura). La matriz puede estar configurada para usar en aquellos metodos en que los estados de activacion de varias moleculas transductoras de senales se detectan en un solo ensayo multiplex. Se revela que la variedad abarca al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas moleculas transductoras de senales.
B. Ensayos de deteccion individual
Se revela que para detectar el estado de activacion de un determinado analito de interes en un extracto celular de celulas tumorales tales como las celulas circulantes de un tumor solido es un ensayo multiplex de deteccion individual (es decir, de dos anticuerpos) de gran rendimiento que tiene un rango dinamico superior. Como ejemplo no limitativo, los dos anticuerpos empleados en el ensayo pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura espedfico del analito y (2) un anticuerpo detector espedfico de una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilacion, de ubiquitinacion y/o de formacion de complejo del analito. Como alternativa el anticuerpo detector comprende un anticuerpo independiente del estado de activacion, que detecta la cantidad total del analito en el extracto celular. En general el anticuerpo independiente del estado de activacion es capaz de detectar tanto la forma activada como las formas no activadas del analito.
Se revela un metodo para realizar un inmunoensayo multiplex de gran rendimiento, que tiene un rango dinamico superior y consiste en:
(a) incubar un extracto celular con varias series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos del extracto celular, para formar varios analitos capturados, de manera que los anticuerpos de captura estan sujetos sobre un soporte solido;
(b) incubar los analitos capturados con anticuerpos detectores espedficos de los correspondientes analitos, para formar varios analitos capturados detectables;
(c) incubar los analitos capturados detectables con el primer y segundo miembros de un par de amplificacion de senales, para generar una senal amplificada; y
(d) detectar una senal amplificada generada desde el primer y segundo miembros del par de amplificacion de senales.
Se revela que el extracto celular comprende un extracto de celulas circulantes de un tumor solido. Las celulas circulantes se afslan normalmente de una muestra del paciente, con el uso de metodos de separacion conocidos del sector, incluyendo por ejemplo la separacion inmunomagnetica, la separacion microflmdica, FACS, la centrifugacion por gradiente de densidad y los metodos de deplecion. Los expertos en la materia conoceran otros metodos adecuados de separacion y/o aislamiento de celulas circulantes.
Se revela que la muestra del paciente incluye sangre entera, suero, plasma, orina, esputos, lfquido de lavado bronquioalveolar, lagrimas, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva y/o aspirado con aguja fina. En algunos casos, de la muestra de sangre entera se separa una fraccion de plasma o suero y una fraccion celular (es decir, un sedimento celular). La fraccion celular contiene normalmente globulos rojos, globulos blancos y/o celulas circulantes de un tumor solido, tales como CTCs, CECs, CEPCs y/o CSCs. La fraccion de plasma o suero contiene, entre otras cosas, acidos nucleicos (p.ej. ADN, ARN) y protemas liberadas por las celulas circulantes de un tumor solido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunos casos las celulas circulantes aisladas se pueden estimular in vitro con uno o mas factores de crecimiento antes, durante y/o tras la incubacion con uno o mas farmacos anticancer de interes. Los factores estimulantes de crecimiento estan descritos arriba. En otros casos, las celulas circulantes aisladas se pueden lisar, p.ej. despues de la estimulacion con factores de crecimiento y/o del tratamiento con farmacos anticancer, a fin de producir el extracto celular (p.ej. lisado celular), usando cualquier tecnica conocida en este campo. Preferiblemente la lisis celular se inicia unos 1-360 minutos despues de la estimulacion con factores de crecimiento y, con mayor preferencia, en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) a unos 1-5 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento y (2) a unos 30-180 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento. Como alternativa el lisado celular se puede conservar a -80°C hasta su uso.
Se revela que el farmaco anticancer comprende un agente anti-senalizacion (es decir, un anticuerpo monoclonal, un inhibidor de tirosina-cinasa, etc.), un agente antiproliferativo, un agente quimioterapeutico y/o cualquier otro compuesto capaz de reducir o abolir el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes como las de tipo canceroso. Arriba se proporcionan ejemplos de farmacos anticancer correspondientes a estas clases generales de agentes terapeuticos.
Se revela que uno o mas analitos del extracto celular incluyen varias moleculas transductoras de senales. Arriba se describen ejemplos de moleculas transductoras de senales de interes, incluyendo sin limitacion receptores de tirosina-cinasa, no receptores de tirosina-cinasa y/o componentes de la cascada de senalizacion de tirosina-cinasa.
Se revela que cada serie de dilucion de los anticuerpos de captura comprende una serie de concentraciones descendentes del anticuerpo de captura. En ciertos casos los anticuerpos de captura van diluidos en serie al menos 2 veces (p.ej. 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1000 veces) para producir una serie de diluciones con un numero (p.ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o mas) de concentraciones descendentes de anticuerpo de captura puestas sobre la matriz. Sobre la matriz se colocan preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.
Se revela que el soporte solido comprende vidrio (p.ej. una placa de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas (p.ej. de nylon, nitrocelulosa PVDF, etc.), haces de fibras o cualquier otro substrato adecuado Se revela que los anticuerpos de captura pueden estar sujetos sobre placas de vidrio recubiertas con un polfmero de nitrocelulosa, como por ejemplo las placas FAST®(de Whatman Inc. (Florham Park, NJ).
En ciertos casos el extracto celular se incuba con anticuerpos de captura ya sujetos sobre un soporte solido. En algunos otros casos el extracto celular se incuba primero con anticuerpos de captura en solucion y luego se pone en contacto con un soporte solido para inmovilizar los anticuerpos de captura, p.ej. mediante marcadores de captura presentes en el anticuerpo de captura, que interactuan con agentes de captura sujetos al soporte solido.
Se revela que los anticuerpos detectores se incuban con analitos que se fijan a anticuerpos de captura en solucion o sujetos a un soporte solido. En ciertos casos el extracto celular que contiene varios analitos se incuba primero con los anticuerpos detectores en solucion y luego se pone en contacto con anticuerpos de captura en solucion o sujetos a un soporte solido. En algunos otros casos el extracto celular que contiene varios analitos se incuba primero con anticuerpos de captura y anticuerpos detectores en solucion y luego se pone en contacto con un soporte solido para inmovilizar los complejos anticuerpo-analito, p.ej. mediante marcadores de captura presentes en los anticuerpos de captura o mediante anticuerpos detectores que interactuan con agentes de captura sujetos al soporte solido.
En algunos casos los anticuerpos detectores incluyen anticuerpos independientes del estado de activacion, que son utiles para detectar la cantidad total de uno o mas analitos en el extracto celular. Como ejemplo no limitativo, los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden detectar tanto formas fosforiladas como no fosforiladas de una o mas moleculas transductoras de senales. En algunos otros casos los anticuerpos detectores comprenden anticuerpos dependientes del estado de activacion, que sirven para detectar el estado de activacion de uno mas de los analitos contenidos en el extracto celular. Preferiblemente los anticuerpos dependientes del estado de activacion detectan el estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o formacion de complejo de una o mas moleculas transductoras de senales.
Los anticuerpos de captura y los anticuerpos detectores se seleccionan normalmente de manera que se minimice su concurrencia para la fijacion del analito (es decir, ambos anticuerpos, de captura y deteccion, pueden fijar al mismo tiempo sus correspondientes moleculas transductoras de senales.
Se revela que los anticuerpos detectores llevan un primer miembro de un par de fijacion (p.ej. biotina) y el primer miembro del par amplificador de senal comprende un segundo miembro del par de fijacion (p.ej. estreptavidina). Los miembros del par de fijacion se pueden acoplar directa o indirectamente a los anticuerpos detectores o al primer miembro del par amplificador de senal, usando metodos bien conocidos del sector. En algunos casos el primer miembro del par amplificador de senal es una peroxidasa (p.ej. peroxidasa de rabano picante (HRP), catalasa, cloro- peroxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinofil peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa tiroidea, deiodinasa, etc.) y el segundo miembro del par amplificador de senal es un reactivo de tiramida
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(p.ej. biotina-tiramida). En estos casos la senal amplificada es generada por la oxidacion del reactivo de tiramida con peroxidasa, para producir una tiramida activada en presencia de peroxido de hidrogeno (H2O2).
La tiramida activada se detecta directamente o tras la adicion de un reactivo detector de senales como, por ejemplo, un fluoroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Como ejemplos de fluoroforos adecuados para usar en la presente invencion cabe citar, sin limitarse a ellos, un colorante Alexa Fluor® (p.ej. Alexa Fluor® 555), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), Verde Oregon®; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un colorante CyDye® fluor (p.ej. Cy2, Cy3, Cy5) y equivalentes. El marcador de estreptavidina se puede acoplar directa o indirectamente al fluoroforo o a la peroxidasa usando metodos bien conocidos del sector. Como ejemplos no limitativos de reactivos cromogenicos adecuados para emplear en la presente invencion cabe mencionar 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-acido sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4CN) y/o porfirinogeno.
El experto en la materia apreciara que, ademas de anticuerpos, se pueden emplear otros componentes del par de fijacion para inmovilizar y/o detectar uno o mas analitos de un extracto celular, conforme a los ensayos de deteccion individual aqu descritos. Como ejemplos no limitativos de tales componentes del par de fijacion cabe citar ligandos o receptores del analito, substratos del analito, dominios de fijacion (p.ej. PTB, SH2, etc.), aptameros y similares.
C. Ensayos de deteccion dual de proximidad
Se revela que el ensayo para detectar el estado de activacion de un analito particular de interes en un extracto celular de celulas tumorales - como las celulas circulantes de un tumor solido - es un ensayo multiplex de proximidad (es decir, con tres anticuerpos) de gran rendimiento, con rango dinamico superior. Como ejemplo no limitativo, los tres anticuerpos empleados en el ensayo de proximidad comprenden: (1) un anticuerpo de captura espedfico del analito; (2) un anticuerpo detector espedfico de una forma activada del analito (es decir, un anticuerpo dependiente del estado de activacion); y (3) un anticuerpo detector de la cantidad total del analito (es decir, un anticuerpo independiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilacion, ubiquitinacion y/o formacion de complejo del analito. En general el anticuerpo independiente del estado de activacion es capaz, de detectar tanto las formas activadas como las formas no activadas del analito.
Se revela un metodo segun la reivindicacion 1, para realizar un inmunoensayo multiplex de gran rendimiento y rango dinamico superior, que consiste en:
(a) incubar un extracto celular con varias series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos contenidos en el extracto celular, para formar varios analitos capturados, estando los anticuerpos de captura sujetos sobre un soporte solido;
(b) incubar los analitos capturados con anticuerpos detectores espedficos de los correspondientes analitos, para formar varios analitos capturados detectables, de modo que los anticuerpos detectores incluyen:
(1) varios anticuerpos independientes del estado de activacion marcados con un fragmento facilitadory
(2) varios anticuerpos dependientes del estado de activacion marcados con un primer miembro de un par amplificador de la senal, de manera que el fragmento facilitador genera un agente oxidante que canaliza el primer miembro del par amplificador de la senal y reacciona con el;
(c) incubar los analitos capturados detectables con un segundo miembro del par amplificador de la senal, para generar una senal amplificada; y
(d) detectar la senal amplificada generada por el primer y segundo miembros del par amplificador de la senal.
La figura 1 explica un ejemplo de ensayo de proximidad en el cual un analito esta fijado a un anticuerpo de captura y a dos anticuerpos detectores (es decir, un anticuerpo independiente del estado de activacion y un anticuerpo dependiente del estado de activacion). El anticuerpo de captura 1 y el anticuerpo independiente del estado de activacion 2 fijan el analito 6 independientemente de su estado de activacion. El anticuerpo dependiente del estado de activacion 3 fija el analito dependiendo de su estado de activacion (es decir, el anticuerpo dependiente del estado de activacion solo fijara una forma activada del analito que lleva un resto fosforilado). El anticuerpo independiente del estado de activacion esta marcado con un fragmento facilitador (designado M1, 4) y el anticuerpo dependiente del estado de activacion con un primer miembro de un par amplificador de la senal (designado M2, 5). La fijacion de ambos anticuerpos detectores al analito aproxima suficientemente (tal como representa el area limitada por la lmea de puntos 7) el fragmento facilitador al primer miembro de un par amplificador de la senal, de manera que una senal generada por el fragmento facilitador se puede canalizar hacia el primer miembro de un par amplificador de la senal, produciendo una senal detectable y/o amplificable. En el estado tecnico se conocen varios metodos para la canalizacion de proximidad, incluyendo, por ejemplo, FRET, fluorescencia resuelta en el tiempo-FRET, LOCI, etc. Una ventaja de la canalizacion de proximidad, tal como se usa en los metodos de la presente invencion, es que se genera una senal individual detectable solo para aquellos analitos que se han fijado a los tres anticuerpos, lo cual aumenta la especificidad del ensayo, reduce el nivel de fondo y simplifica la deteccion.
Se revela que el extracto celular comprende un extracto de celulas circulantes de un tumor solido. Las celulas circulantes suelen aislarse de una muestra de paciente, empleando uno o mas metodos de separacion conocidos del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
estado tecnico, por ejemplo la separacion inmunomagnetica, la separacion microflmdica, FACS, la centrifugacion por gradiente de densidad y los metodos de deplecion
Se revela que la muestra del paciente comprende sangre entera, suero, plasma, orina, esputos, lfquido de lavado bronquioalveolar, lagrimas, Kquido aspirado del pezon, linfa, saliva y/o muestra aspirada con aguja fina. En algunos casos, de la muestra de sangre entera se separa una fraccion de plasma o suero y una fraccion celular (es decir, un sedimento celular). La fraccion celular contiene normalmente globulos rojos, globulos blancos y/o celulas circulantes de un tumor solido, tales como CTCs, CECs, CEPCs y/o CSCs. La fraccion de plasma o suero contiene normalmente, entre otras cosas, acidos nucleicos (p.ej. ADN, ARN) y protemas liberadas por las celulas circulantes de un tumor solido.
En algunos casos las celulas circulantes aisladas se pueden estimular in vitro con uno o mas factores de crecimiento antes, durante y/o despues de la incubacion con uno o mas farmacos anticancer de interes. Los factores estimulantes del crecimiento estan descritos arriba. En otros casos, las celulas circulantes aisladas se pueden lisar, p.ej. despues de la estimulacion con factores de crecimiento y/o del tratamiento con farmacos anticancer, a fin de producir el extracto celular (p.ej. lisado celular), usando cualquier tecnica conocida en este campo. La lisis celular se inicia preferiblemente unos 1-360 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento y, con mayor preferencia, en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) a unos 1-5 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento y (2) a unos 30-180 minutos tras la estimulacion con factores de crecimiento. Como alternativa el lisado celular se puede conservar a -80°C hasta su uso.
Se revela que el farmaco anticancer comprende un agente anti-senalizacion (p.ej. un anticuerpo monoclonal, un inhibidor de tirosina-cinasa, etc.), un agente antiproliferativo, un agente quimioterapeutico y/o cualquier otro compuesto capaz de reducir o abolir el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes como las de tipo canceroso. Arriba se dan ejemplos de farmacos anticancer espedficos, que corresponden a esta clase general de agentes quimioterapeuticos.
Se revela que el o los analitos contenidos en el extracto celular incluyen varias moleculas transductoras de senales. Mas arriba se describen ejemplos interesantes de moleculas transductoras de senales, incluyendo, sin limitacion, receptores de tirosina-cinasa, no receptores de tirosina-cinasa y/o componentes de la cascada de senalizacion de tirosina-cinasa.
Se revela que cada serie de dilucion de los anticuerpos de captura comprende una serie de concentraciones descendentes del anticuerpo de captura. En ciertos casos los anticuerpos de captura van diluidos en serie al menos 2 veces (p.ej. 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1000 veces) para producir una serie de diluciones con un numero (p.ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o mas) de concentraciones descendentes de anticuerpo de captura puestas sobre la matriz. Sobre la matriz se colocan preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.
Se revela que el soporte solido comprende vidrio (p.ej. una placa de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas (p.ej. de nylon, nitrocelulosa PVDF, etc.), haces de fibras o cualquier otro substrato adecuado. Se revela que los anticuerpos de captura pueden estar sujetos sobre placas de vidrio recubiertas con un polfmero de nitrocelulosa, como por ejemplo las placas FAST® (de Whatman Inc. (Florham Park, NJ).
En algunos casos el extracto celular se incuba con anticuerpos de captura que ya estan sujetos sobre un soporte solido. En algunos otros casos el extracto celular se incuba primero con anticuerpos de captura en solucion y luego se pone en contacto con un soporte solido, para inmovilizar los analitos capturados, p.ej. mediante marcadores de captura presentes en los anticuerpos de captura que interactuan con agentes de captura sujetos al soporte solido.
Se revela que los anticuerpos detectores se incuban con analitos fijados a anticuerpos de captura que se hallan en solucion o sujetos sobre un soporte solido. En algunos casos el extracto celular que comprende varios analitos se incuba primero con los anticuerpos detectores en solucion y despues se pone en contacto con anticuerpos de captura en solucion o sujetos a un soporte solido. En otros casos el extracto celular que comprende varios analitos se incuba primero con anticuerpos de captura y anticuerpos detectores en solucion y luego se pone en contacto con un soporte solido, para inmovilizar los complejos anticuerpo-analito, p.ej. mediante marcadores de captura presentes en anticuerpos de captura o en anticuerpos detectores, que interactuan con agentes de captura sujetos al soporte solido. Antes de la etapa de deteccion, los complejos inmovilizados se pueden lavar para eliminar los anticuerpos no complejados; los complejos lavados se pueden liberar sucesivamente de la superficie soporte y la canalizacion de proximidad de cada analito ensayado se puede detectar mediante un metodo adecuado, tal como se describe aquf
Se revela que la superficie soporte comprende agentes de captura sujetos en una matriz, la etapa de incubacion puede consistir en poner en contacto el extracto celular que contiene varios analitos en solucion con los anticuerpos de captura y de deteccion, usando un exceso de los tres anticuerpos para forzar que la reaccion sea completa. En una variacion del metodo los complejos anticuerpo-analito resultantes se fijan a una fase solida y se lavan para eliminar los anticuerpos no fijados. Haciendo referencia a la figura 2, el anticuerpo de captura 1 puede llevar un marcador de captura 10. Los complejos se fijan a una fase solida 12 mediante un agente de captura 11 que esta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
adherido a la fase solida y se une al marcador de captura, inmovilizando el complejo. El complejo inmovilizado se lava con un tampon adecuado y luego se libera de la fase solida, anadiendo el agente de liberacion 13. El agente de liberacion puede funcionar por cualquier mecanismo que libere el complejo lavado. Se revela que el marcador de captura puede incluir un sitio escindible que es reconocido y cortado por el agente de liberacion. En otro aspecto ejecucion, representado en la figura 2, el agente de liberacion compite con el marcador de captura por la fijacion al agente de captura. Por ejemplo, el agente de captura puede ser un primer oligonucleotido que se hibride con un oligonucleotido parcialmente complementario (es decir, el marcador de captura) fijado al anticuerpo de captura y el agente de liberacion puede ser un oligonucleotido totalmente complementario del agente de captura, dando como resultado el desplazamiento de la hebra y el desprendimiento del complejo lavado de la fase solida. Otros ejemplos de marcadores de captura/agentes de captura/agentes de liberacion adecuados para el uso incluyen, sin limitarse a ellos, 2,4-dinitrofenol (DNP)/anticuerpo anti-DNP/2,4-DNP lisina; T2/anticuerpo anti-T3 /T3; ouabaina/anticuerpo anti- digoxina/digoxina; y detiobiotina/estreptavidina/biotina (vease p.ej. Ishikawa y otros, J. Clin. Lab Anal., 12:98-107 (1998)).
Una vez liberado de la fase solida, el complejo lavado (1) se pone en contacto con una superficie soporte que tiene moleculas de captura sujetas en una matriz, para fijar espedficamente marcadores de captura en el anticuerpo de captura, o (2) se disocia y los anticuerpos detectores disociados se ponen en contacto con una superficie soporte que comprende agentes de captura para fijar espedficamente marcadores de captura en los anticuerpos detectores. La figura 2 representa el aspecto en que el complejo lavado se disocia y los anticuerpos detectores disociados se ponen en contacto con la superficie soporte 14. La superficie soporte comprende varias moleculas de captura sujetas en una matriz “direccionable” o de “codigo Zip”. Cada region distinta de la matriz tiene un solo agente de captura 9 que fija espedficamente el marcador de captura 8 presente en el anticuerpo detector independiente del estado de activacion 2 o en el anticuerpo detector dependiente del estado de activacion 3, reteniendo y organizando en la matriz los anticuerpos detectores marcados. Se revela que los agentes de captura y los marcadores de captura pueden ser oligonucleotidos que se hibridan espedficamente entre sf Las matrices direccionables que comprenden moleculas de captura oligonucleotidas son bien conocidas del estado tecnico (vease p.ej. Keramas y otros, Lab Chip, 4:152-158 (2004); Delrio-Lafreniere y otros, Diag. Microbiol. Infect. Dis., 48:23-31 (2004)).
La presencia de los anticuerpos detectores en cada region distinta de la matriz se puede detectar de manera directa o indirecta con un fragmento facilitador (designado M1, 4), o con un primer miembro de un par amplificador de la senal (designado M2, 5). Como ejemplos de fragmentos que pueden detectarse directamente cabe mencionar los fluoroforos, los cromoforos, el oro coloidal, el latex coloreado, etc. Se revela que ambos fragmentos pueden ser fluoroforos elegidos independientemente. Se puede utilizar cualquier par de fluoroforos que proporcione una lectura distinguible, estando muy cerca entre sf, como por ejemplo Cy3/Cy5, Cy5/ficoeritrina y analogos. Alternativamente, si se emplea una matriz direccionable de oligonucleotidos, ambos fragmentos pueden ser el mismo fluoroforo asignado a diferentes codigos zip. Se puede usar la microscopfa confocal de barrido por laser para detectar fragmentos fluoroforos adheridos a la matriz. En aquellos ensayos en que los complejos se liberan de la matriz antes de la deteccion, por ejemplo en ensayos de desplazamiento de hebras, los metodos adecuados para detectar fragmentos fluoroforos incluyen la fluorescencia inducida por laser confocal de flujo capilar, la nano-HPLC, la electroforesis microcapilar, etc.
Se revela que los anticuerpos independientes del estado de activacion llevan ademas un fragmento detectable. En estos casos la cantidad del fragmento detectable esta relacionada con la cantidad de uno o mas analitos en el extracto celular. Como ejemplos de fragmentos detectables cabe mencionar, sin limitarse a ellos, marcadores fluorescentes, marcadores qmmicamente reactivos, marcadores enzimaticos, marcadores radiactivos y similares. El fragmento detectable es preferiblemente un fluoroforo tal como un colorante Alexa Fluor® (p.ej. Alexa Fluor® 647), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), Verde Oregon®; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un colorante CyDye® fluor (p.ej. Cy2, Cy3, Cy5) y equivalentes. El fragmento detectable se puede acoplar directa o indirectamente a los anticuerpos independientes del estado de activacion, empleando metodos bien conocidos del estado tecnico.
Se revela que los anticuerpos independientes del estado de activacion se marcan directamente con el fragmento facilitador. El fragmento facilitador se puede acoplar a los anticuerpos independientes del estado de activacion empleando metodos bien conocidos del estado tecnico. Un fragmento facilitador utilizable en la presente invencion es cualquier molecula capaz de generar un agente oxidante que se canaliza (es decir, se dirige) hacia otra molecula proxima (es decir proxima o cercana en el espacio) al fragmento facilitador y reacciona con ella (es decir, se fija, es fijado por o forma un complejo con). Los ejemplos de fragmentos facilitadores incluyen sin limitacion enzimas como la glucosa oxidasa o cualquier otro enzima que catalice una reaccion de oxidacion/reduccion con oxfgeno molecular (O2) como el aceptor de electrones y fotosensibilizadores tales como azul de metileno, rosa de Bengala, porfirinas, colorantes de escuarato, ftalocianinas y similares. Como ejemplos no limitativos de agentes oxidantes cabe citar el peroxido de hidrogeno (H2O2), un oxfgeno singulete y cualquier otro compuesto que transfiera atomos de oxfgeno o gane electrones en una reaccion de oxidacion/reduccion. Preferentemente, en presencia de un substrato adecuado (p.ej. glucosa, luz, etc.), el fragmento facilitador (p.ej. glucosa oxidasa, fotosensibilizador) genera un agente oxidante (p.ej. peroxido de hidrogeno (H2O2), oxfgeno singulete, etc.) que se canaliza y reacciona con el primer miembro del par amplificador de la senal (por ejemplo peroxidasa de rabano picante (HRP), hapteno protegido con un grupo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
protector, un enzima inactivado mediante enlace tioeter a un inhibidor enzimatico, etc. ) cuando las dos moleculas estan una cerca de otra.
Se revela que los anticuerpos independientes del estado de activacion se marcan indirectamente con el fragmento facilitador mediante la hibridacion entre un oligonucleotido conector conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementary conector conjugado con el fragmento facilitador. Los oligonucleotidos conectores se pueden acoplar al fragmento facilitador o a los anticuerpos independientes del estado de activacion, empleando metodos bien conocidos del estado tecnico. Se revela que el conector oligonucleotido que puede estar conjugado con el fragmento facilitador es 100% complementario del conector oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion. Se revela que el par de oligonucleotidos conectores puede comprender al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones de apareamiento erroneo, p.ej. tras una hibridacion en condiciones rigurosas. Un experto en la materia apreciara que los anticuerpos independientes del estado de activacion que son espedficos de diferentes analitos pueden conjugarse con el mismo oligonucleotido conector o con oligonucleotidos conectores distintos.
La longitud de los oligonucleotidos conectores que estan conjugados con el fragmento facilitador o los anticuerpos independientes del estado de activacion puede variar. En general la secuencia conectora puede tener una longitud de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleotidos. Suelen generarse secuencias aleatorias de acidos nucleicos para el acoplamiento. Como ejemplo no limitativo puede decirse que una biblioteca de conectores oligonucleotidos tiene tres dominios contiguos distintos: un dominio espaciador, un dominio distintivo y un dominio de conjugacion. Preferentemente, los oligonucleotidos conectores estan indicados para un acoplamiento eficiente sin destruir la funcion del fragmento facilitador o de los anticuerpos independientes del estado de activacion con los que estan conjugados.
Las secuencias de oligonucleotidos conectores se pueden indicar para evitar o minimizar cualquier formacion de estructuras secundarias bajo diversas condiciones de ensayo. Normalmente, las temperaturas de fusion de cada segmento del conector se controlan cuidadosamente, para permitir su participacion en los procedimientos globales de ensayo. En general el rango de temperaturas de fusion del segmento de la secuencia conectora no es superior a 5°C. Para analizar cada uno de los tres dominios de cada conector se pueden usar algoritmos computacionales (p.ej. OLIGO 6.0) que determinen la temperatura de fusion, la estructura secundaria y la estructura de horquilla a unas concentraciones ionicas definidas. Las secuencias combinadas globales tambien se pueden analizar para ver sus caractensticas estructurales y su compatibilidad con otras secuencias de oligonucleotidos conectores, p.ej. si se hibridan en condiciones rigurosas con un conector oligonucleotido complementario.
La region espaciadora del conector oligonucleotido ofrece una separacion adecuada entre el dominio de conjugacion y el sitio de reticulacion del oligonucleotido. El dominio de conjugacion funciona uniendo moleculas marcadas con una secuencia oligonucleotida conectora complementaria del dominio de conjugacion, mediante hibridacion por acido nucleico. La hibridacion mediada por acido nucleico se puede efectuar antes o despues de la formacion del complejo anticuerpo-analito (es decir, antfgeno), proporcionando un formato de ensayo mas flexible. Al contrario que muchos metodos de conjugacion de anticuerpos, la union de oligonucleotidos relativamente pequenos a anticuerpos u otras moleculas tiene un impacto mmimo sobre la afinidad espedfica de los anticuerpos hacia su analito diana o en la funcion de las moleculas conjugadas.
Se revela que la secuencia del dominio distintivo del oligonucleotido conector se puede usar en ensayos multiplex complejos de protemas. Se pueden conjugar multiples anticuerpos a conectores oligonucleotidos con secuencias distintivas diferentes. En los inmunoensayos multiplex se pueden usar secuencias oligonucleotidas indicadoras, marcadas con sondas adecuadas, para detectar la hibridacion cruzada entre anticuerpos y antfgenos en el formato de ensayo multiplex.
Los oligonucleotidos conectores se pueden conjugar con anticuerpos u otras moleculas mediante varios metodos. Por ejemplo, los oligonucleotidos conectores se pueden sintetizar con un grupo tiol en el extremo 5' o 3'. El grupo tiol se puede desproteger usando agentes reductores (p.ej. TCEP-HCl) y los conectores resultantes se pueden purificar usando una columna centrifugadora de desalinizacion. Los oligonucleotidos conectores desprotegidos resultantes se pueden conjugar con las aminas primarias de anticuerpos o de otros tipos de protemas, empleando reticuladores heterobifuncionales como SMCC. Como alternativa, los grupos 5'-fosfato de los oligonucleotidos se pueden tratar con carbodiimida hidrosoluble EDC para formar fosfato-esteres y luego acoplarse a moleculas aminadas. En algunos casos el diol en el resto 3'-ribosa se puede oxidar a grupos aldehfdo y luego puede conjugarse con los grupos amino de anticuerpos u otros tipos de protemas, mediante aminacion reductora. En algunos otros casos el oligonucleotido conector se puede sintetizar con una modificacion de biotina en el extremo 3' o 5' y luego conjugar con moleculas marcadas con estreptavidina.
Los oligonucleotidos conectores se pueden sintetizar usando varias tecnicas conocidas en el sector, como las que se describen en Usman y otros, J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe y otros, Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott y otros, Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); y Wincott y otros, Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). En la smtesis de oligonucleotidos se utilizan generalmente grupos protectores y grupos de acoplamiento corrientes de acidos nucleicos, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. Los expertos en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
materia conocen reactivos de smtesis de oligonucleotidos, metodos de desproteccion de acidos nucleicos y metodos de purificacion de acidos nucleicos adecuados.
En algunos casos los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan directamente con el primer miembro del par amplificador de la senal. El miembro del par amplificador de la senal se puede acoplar a los anticuerpos dependientes del estado de activacion, usando metodos bien conocidos del estado tecnico. En algunos otros casos los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan indirectamente con el primer miembro del par amplificador de la senal mediante la union entre un primer miembro de un par amplificador de fijacion conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro del par de fijacion conjugado con el primer miembro del par amplificador de la senal. Los miembros del par de fijacion (p.ej. biotina/ estreptavidina) se pueden acoplar al miembro del par amplificador de la senal o a los anticuerpos dependientes del estado de activacion, utilizando metodos bien conocidos del estado tecnico. Como ejemplos de miembros del par amplificador de la senal cabe citar, sin limitarse a ellas, peroxidasas como la peroxidasa de rabano picante (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinofilo peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, tiroide peroxidasa, desyodasa y similares. Otros ejemplos de miembros del par amplificador de la senal incluyen haptenos protegidos con un grupo protector y enzimas inactivados por enlace tioeter a un enzima inhibidor.
Los anticuerpos de captura, los anticuerpos independientes del estado de activacion y los anticuerpos dependientes del estado de activacion se eligen tfpicamente de modo que la competencia entre ellos para la fijacion del analito sea minima (es decir, todos los anticuerpos pueden fijar simultaneamente sus correspondiente moleculas transductoras de senales).
En un ejemplo de canalizacion de proximidad el fragmento facilitador es glucosa oxidasa (GO) y el primer miembro del par amplificador de la senal es peroxidasa de rabano picante (HRP). Cuando la GO se pone en contacto con un substrato como glucosa, genera un agente oxidante (es decir, peroxido de hidrogeno (H2O2)). Si la HRP se halla cerca de la canalizacion de la GO, el H2O2 generado por la GO se canaliza hacia la HRP y se compleja con ella para formar un complejo HRP-H2O2, que en presencia del segundo miembro del par amplificador de la senal (es decir, un substrato quimioluminiscente tal como luminol o isoluminol o un substrato fluorogenico tal como tiramida (p.ej. biotina-tiramida), acido homovalmico o acido 4-hidroxifenilacetico) genera una senal amplificada. Los metodos de uso de GO y HRP en un ensayo de proximidad estan descritos p.ej. en Langry y otros, U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999). Cuando se usa biotina-tiramida como segundo miembro del par amplificador de la senal, el complejo HRP-H2O2 oxida la tiramida, generando un radical de tiramida reactivo que fija covalentemente restos nucleofilos cercanos. La tiramida activada se detecta directamente o tras la adicion de un reactivo detector de senales como, por ejemplo, un fluroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Como ejemplos de fluroforos adecuados para utilizar en la presente invencion cabe mencionar, sin limitarse a ellos, un colorante Alexa Fluor® (p.ej. Alexa Fluor® 555), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), Verde Oregon®; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un colorante CyDye® fluor (p.ej. Cy2, Cy3, Cy5) y equivalentes. El marcador de estreptavidina se puede acoplar directa o indirectamente al fluoroforo o a la peroxidasa, usando metodos bien conocidos del sector. Como ejemplos no limitativos de reactivos cromogenicos adecuados para emplear en la presente invencion cabe mencionar 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-acido sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4Cn) y/o porfirinogeno.
En otro ejemplo de canalizacion de proximidad el fragmento facilitador es un fotosensibilizador y el primer miembro del par amplificador de la senal es una molecula grande marcada con multiples haptenos protegidos con grupos protectores que impiden la fijacion de los haptenos a un componente de union espedfico (p.ej. ligando, anticuerpo, etc.). Por ejemplo, el miembro del par amplificador de la senal puede ser una molecula de dextrano marcada con moleculas de biotina, cumarina y/o fluorescema protegidas. Los grupos protectores adecuados incluyen, sin limitarse a ellos, los grupos fenoxi, anilino, olefino, tioeter y selenoeter. En la patente U.S. n° 5,807,675 se describen otros fotosensibilizadores y moleculas de hapteno protegidas, que sirven para los ensayos de proximidad. Cuando el fotosensibilizador es excitado por la luz genera un agente oxidante (p.ej. oxfgeno singulete). Si las moleculas de hapteno se encuentran cerca de la canalizacion hacia el fotosensibilizador, el oxfgeno singulete generado por el fotosensibilizador es canalizado y reacciona con tioeteres en los grupos protectores de los haptenos para dar grupos carbonilo (cetonas o aldehfdos) y acido sulfurico, liberando los grupos protectores de los haptenos. Entonces los haptenos desprotegidos estan disponibles para unirse espedficamente al segundo miembro del par amplificador de la senal (p.ej. un componente de union espedfico capaz de generar una senal). Por ejemplo, cuando el hapteno es biotina, el componente de union espedfico puede ser una estreptavidina marcada con enzima. Como ejemplos de enzima cabe citar fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, HRP, etc. Despues de lavar para eliminar reactivos no fijados, la senal detectable se puede generar anadiendo un substrato detectable (p.ej. fluorescente, quimioluminiscente, cromogenico, etc.) y detectarse mediante el empleo de metodos e instrumentos conocidos del estado tecnico. Como alternativa, la senal detectable se puede amplificar con el uso de tiramida y la tiramida activada se puede detectar directamente o tras la adicion de un reactivo detector de la senal, tal como se ha descrito arriba.
En otro ejemplo mas de canalizacion de proximidad el fragmento facilitador es un fotosensibilizador y el primer miembro del par amplificador de la senal es un complejo enzima-inhibidor. El enzima y el inhibidor (p.ej. dextrano
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
marcado con acido fosfonico) estan unidos entre s^ mediante un conector escindible (p.ej. tioeter). Cuando el fotosensibilizador es excitado por la luz genera un agente oxidante (p.ej. ox^geno singulete). Si el complejo enzima- inhibidor se encuentran cerca de la canalizacion hacia el fotosensibilizador, el oxfgeno singulete generado por el fotosensibilizador es canalizado y reacciona con el conector escindible, liberando el inhibidor del enzima y por tanto activando el enzima. Para generar una senal detectable se anade un substrato enzimatico o, como alternativa, un reactivo de amplificacion para generar una senal amplificada.
En otro ejemplo mas de canalizacion de proximidad el fragmento facilitador es HRP, el primer miembro del par amplificador de la senal es un hapteno protegido o un complejo de enzima-inhibidor como el descrito arriba, y los grupos protectores comprenden p-alcoxi-fenol. La adicion de fenilendiamina y H2O2 genera una fenilen diimina reactiva que es canalizada hacia el hapteno protegido o el complejo de enzima-inhibidor y reacciona con los grupos protectores p-alcoxi-fenol para dar los haptenos libres o un enzima reactivo. La senal amplificada se genera y se detecta del modo arriba descrito (veanse p.ej. las patentes U.S. n° 5,532,138 y 5,445,944).
Un experto en la materia apreciara que, ademas de anticuerpos, se pueden emplear otros componentes del par de fijacion para inmovilizar y/o detectar uno o mas analitos de un extracto celular, segun los ensayos de proximidad (es decir, tres anticuerpos) aqu descritos. Como ejemplos no limitativos de tales componentes del par de fijacion cabe citar ligandos o receptores del analito, substratos del analito, dominios de fijacion (p.ej. PTB, SH2, etc.), aptameros y similares.
D. Kits
Se revela que la presente invencion proporciona kits para realizar los metodos arriba descritos con matrices basadas en anticuerpos, incluyendo: (a) una serie de dilucion de varios anticuerpos de captura sujetos sobre un soporte solido y (b) varios anticuerpos detectores (p.ej. anticuerpos independientes del estado de activacion y/o anticuerpos dependientes del estado de activacion). En algunos casos los kits tambien pueden contener instrucciones para su empleo en la deteccion de los estados de activacion de varias moleculas transductoras de senales de celulas circulantes de un tumor solido. Los kits tambien pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales arriba descritos para llevar a cabo los metodos espedficos de la presente invencion, como, por ejemplo, el primer y segundo miembros del par amplificador de la senal, reactivos de amplificacion de la senal de tiramida, substratos para el fragmento facilitador, tampones de lavado, agentes de captura/liberacion, etc.
IV. Estructura de las matrices de anticuerpos
En algunos aspectos se revela que proporciona matrices de anticuerpos para detectar el estado de activacion de varias moleculas transductoras de senales en un extracto celular de celulas circulantes de un tumor solido mediante el empleo de una serie de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido. Las matrices usadas en los metodos de la presente invencion comprenden tfpicamente varios anticuerpos de captura diferentes, en un intervalo de concentraciones de anticuerpo de captura, acoplados a la superficie de un soporte solido en distintas ubicaciones direccionables.
El soporte solido puede comprender cualquier substrato adecuado para inmovilizar protemas. Como ejemplos de soportes solidos cabe citar, sin limitarse a ellos, vidrio (p.ej. una placa de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas (p.ej. perlas magneticas, de poliestireno), papel, membranas, haces de fibras, geles, metal, ceramica y analogos. Las membranas de nylon (Biotrans®, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), nitrocelulosa (Protran®, Whatman Inc. (Florham Park, NJ)) y PVDF (Immobilon™, Millipore Corp. (Billerica, MA)) son adecuadas para emplear como soportes solidos en las matrices. Los anticuerpos de captura estan inmovilizados preferiblemente sobre placas de vidrio recubiertas con un polfmero de nitrocelulosa, p.ej. placas FAST®, que comercializa Whatman Inc. (Florham Park, NJ).
Los aspectos particulares deseables del soporte solido comprenden la capacidad de fijar grandes cantidades de anticuerpos de captura, la capacidad de fijar anticuerpos de captura con la menor desnaturalizacion y la incapacidad de fijar otras protemas. Otro aspecto adecuado es que el soporte solido haga un mmimo efecto de “mecha” al aplicar sobre el soluciones de anticuerpos que contienen anticuerpos de captura. Un soporte solido con mmimo efecto de mecha permite aplicar sobre el mismo pequenos almuotas de solucion de anticuerpos de captura y obtener manchas pequenas y definidas del anticuerpo de captura inmovilizado.
Los anticuerpos de captura se inmovilizan directa o indirectamente (p.ej. mediante marcadores de captura) sobre el soporte solido mediante interacciones covalentes o no covalentes (p.ej. enlaces ionicos, interacciones hidrofobas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). Se revela que los anticuerpos de captura se pueden unir covalentemente al soporte solido, usando un reticulador homobifuncional o heterobifuncional en metodos y condiciones estandar. Pueden adquirirse reticuladores adecuados a suministradores comerciales como p.ej. Pierce Biotechnology (Rockford, IL).
Los metodos para generar las matrices incluyen, sin limitarse ellas, cualquier tecnica utilizada para construir matrices de protemas o acidos nucleicos. Se revela que los anticuerpos de captura se pueden sembrar por puntos usando un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
“microspotter”, que es normalmente una impresora robotizada provista de pasadores, agujas romas o impresion por chorro de tinta. Como sistemas roboticos para imprimir las matrices de anticuerpos aqu descritas son adecuados el robot PixSys 5000 (Cartesian Technologies; Irvine, CA), con pasadores ChipMaker2 (TeleChem International; Sunnyvale, CA), asf como otras impresoras robotizadas que comercializan BioRobics (Woburn, MA) y Packard Instrument Co. (Meriden, CT). Preferiblemente se siembran en la matriz al menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada anticuerpo de captura.
Otro metodo para generar las matrices de anticuerpos consiste en dispensar un volumen conocido de una dilucion de anticuerpo de captura en cada posicion elegida de la matriz, poniendo en contacto un dispensador capilar sobre cada soporte solido, en condiciones efectivas para dejar un volumen definido de lfquido sobre un soporte solido, y repitiendo este proceso con diluciones de anticuerpos de captura seleccionados en cada posicion de la matriz para crear una matriz completa. El metodo se puede realizar formando varias matrices de este tipo, de modo que la etapa de depositar la solucion se aplica a una posicion seleccionada sobre cada uno de varios soportes solidos en cada ciclo repetido. En la patente U.S. n° 5,807,522, p.ej., se puede encontrar una descripcion mas detallada de dicho metodo.
En ciertos casos, para generar las matrices de anticuerpos se pueden usar dispositivos de imprimir sobre papel. Por ejemplo, la dilucion del anticuerpo de captura deseado se puede cargar en el cabezal de una impresora de chorro de tinta de sobremesa e imprimirla en un soporte solido adecuado (vease p.ej. Silzel y otros, Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)).
Se revela que la matriz generada sobre el soporte solido puede tener al menos una densidad de 5 manchas/cm2 y preferiblemente al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 o 9000, o 10.000 manchas/cm2.
En algunos casos, cada una de las manchas sobre el soporte solido representa un anticuerpo de captura distinto. En algunos otros casos, varias manchas sobre el soporte solido representan el mismo anticuerpo de captura, p.ej. una serie de dilucion formada por varias concentraciones descendentes del anticuerpo de captura.
En las patentes U.S. n° 6,197,599, 6,777,239, 6,780,582, 6,897,073, 7,179,638 y 7,192,720; en las publicaciones de patente U.S. n° 20060115810, 20060263837, 20060292680 y 20070054326; y en Varnum y otros, Methods Mol. Biol., 264:161-172 (2004) se describen otros ejemplos de metodos de preparacion y formacion de matrices de anticuerpos sobre soportes solidos.
Los metodos de barrido de matrices de anticuerpos son conocidos del estado tecnico e incluyen, sin limitacion, cualquier tecnica empleada para escanear matrices de protemas o acidos nucleicos. Se pueden adquirir escaners de micromatrices adecuados para emplear en la presente invencion a las firmas PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precision (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA) y Axon Instruments (Union City, CA). Como ejemplo no limitativo, para la deteccion por fluorescencia se puede emplear un equipo GSI ScanArray3000, combinado con el programa ImaGene para la cuantificacion.
V. Produccion de anticuerpos
Segun la presente invencion, la generacion y la seleccion de anticuerpos todavfa no disponibles comercialmente, para analizar el estado de activacion y/o la cantidad total de moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion, se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, una via es expresar y/o purificar un polipeptido de interes (es decir, un antfgeno), usando metodos de expresion y purificacion conocidos del estado tecnico, y otra via es sintetizar el polipeptido de interes, usando metodos de smtesis peptfdica en fase solida conocidos del estado tecnico. Vease p.ej. Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso y otros, Chem. Pharm. Bull., 38:1192-99 (1990); Mostafavi y otros, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1:255-60, (1995); y Fujiwara y otros, Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996). El polipeptido purificado o sintetizado se puede inyectar, por ejemplo, en ratones o conejos, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Un experto en la materia reconocera que hay muchos procedimientos disponibles para la produccion de anticuerpos, por ejemplo, como los descritos en Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow y Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Un experto en la materia apreciara asimismo que los fragmentos de fijacion o fragmentos Fab mimetizadores de anticuerpos tambien se pueden preparar a partir de informacion genetica mediante varios procedimientos (vease p.ej. Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); y Huse y otros, J. Immunol., 149:3914-3920 (1992)).
Ademas numerosas publicaciones han informado del uso de la tecnologfa de presentacion de fagos para producir y analizar bibliotecas de polipeptidos, con el fin de fijar un antfgeno diana escogido (vease p.ej. Cwirla y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin y otros, Science, 249:404-406 (1990); Scott y otros, Science, 249: 386-388 (1990); y Ladner y otros, patente U.S. n°. 5,571,698). Una idea basica de los metodos de presentacion de fagos es el establecimiento de una asociacion ffsica entre un polipeptido codificado por el ADN fagico y un antfgeno
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
diana. Esta asociacion ffsica la proporciona la parffcula fagica, la cual presenta un polipeptido como parte de una capside que encierra el genoma del fago codificador del polipeptido. El establecimiento de una asociacion ffsica entre los polipeptidos y su material genetico permite el rastreo masivo simultaneo de un gran numero de fagos que llevan diferentes polipeptidos. Los fagos que presentan un polipeptido con afinidad por un anffgeno diana se fijan al anffgeno diana y estos fagos se enriquecen mediante rastreo de afinidad por el anffgeno diana. La identidad de los polipeptidos presentados a partir de estos fagos se puede determinar partiendo de sus respectivos genomas. Luego estos metodos permiten sintetizar en masa, por medios convencionales, un polipeptido que haya sido identificado como poseedor de una afinidad de fijacion por un anffgeno diana deseado (vease p.ej. la patente U.S. n° 6,057,098).
Despues los anticuerpos generados por estos metodos se pueden seleccionar rastreando primero su afinidad y especificidad para el polipeptido anffgeno de interes y, si es necesario, comparando los resultados con la afinidad y la especificidad respecto a otros polipeptidos anffgenos que se quieren excluir de la fijacion. El procedimiento de rastreo puede implicar la inmovilizacion de los polipeptidos anffgenos purificados en pocillos separados de las placas de microvaloracion. La solucion que contiene un anticuerpo o grupo de anticuerpos potenciales se coloca luego en los respectivos pocillos de microvaloracion se incuba durante aproximadamente 30 minutos hasta 2 horas. Despues se lavan los pocillos de microvaloracion y se anade un anticuerpo secundario marcado (p.ej. un anticuerpo anti-raton conjugado con fosfatasa alcalina, si los anticuerpos cultivados son de raton) a los pocillos, se incuban durante unos 30 minutos y luego se lavan. Se agrega substrato a los pocillos y aparecera una reaccion coloreada donde haya anticuerpo del polipeptido anffgeno inmovilizado.
Los anticuerpos asf identificados pueden analizarse luego para examinar su afinidad y especificidad. En el desarrollo de inmunoensayos para una protema diana, la protema diana purificada actua como un patron con el que se juzga la sensibilidad y la especificidad del inmunoensayo, empleando los anticuerpos que han sido seleccionados. Como la afinidad de fijacion de varios anticuerpos puede diferir, p.ej. ciertas combinaciones de anticuerpos pueden interferir estericamente entre ellos, el rendimiento del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida mas importante que la afinidad y especificidad de este anticuerpo.
Los expertos en la materia reconoceran que pueden hacerse muchas propuestas para la produccion de anticuerpos o fragmentos de fijacion y para el rastreo y seleccion de la afinidad y especificidad de los diversos polipeptidos de interes.
A. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se cultivan preferiblemente en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) de un polipeptido de interes y un adyuvante. Puede ser util conjugar el polipeptido de interes con un soporte proteico que sea inmunogenico en las especies que deben inmunizarse, p.ej. hemocianina de lapa californiana, albumina serica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o un agente de derivacion. Los ejemplos no limitativos de agentes bifuncionales o agentes de derivacion incluyen ester de maleimidobenzoM sulfosuccinimida (conjugacion mediante restos de cistema), N-hidroxisuccinimida (conjugacion mediante restos de lisina), glutaraldetffdo, antffdrido succmico, SOCh y RiN=C=NR, donde R y Ri son grupos alquilo distintos.
Los animales se inmunizan contra el polipeptido de interes o contra un conjugado inmunogenico o derivado del mismo, combinando, p.ej., 100 |jg (para conejos) o 5 |jg (para ratones) del anffgeno o conjugado con 3 volumenes de adyuvante de Freund completo e inyectando la solucion por via intradermica en multiples sitios. Al cabo de un mes los animales se estimulan con aproximadamente 1/5 hasta 1/10 de la cantidad inicial de polipeptido o derivado en adyuvante de Freund incompleto por inyeccion subcutanea en multiples sitios. Siete a catorce dfas mas tarde se sangran los animales y se analiza el fftulo de anticuerpo. Los animales se estimulan ffpicamente hasta el nivel del fftulo. Preferiblemente el animal se estimula con el conjugado del mismo polipeptido, pero tambien se pueden usar conjugados con una protema inmunogenica diferente y/o mediante un reactivo reticulador distinto. Tambien pueden prepararse conjugados en cultivos de celulas recombinantes, como protemas de fusion. En algunos casos pueden usarse agentes de agregacion, tales como alumbre, para intensificar la respuesta inmune.
B. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se obtienen en general de una poblacion de anticuerpos basicamente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales de que consta la poblacion son identicos, excepto en las posibles mutaciones de origen natural que pueda haber en pequenas cantidades. Por tanto el calificativo “monoclonal” hace referencia a que el anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el metodo del hibridoma descrito por Kohler y otros, Nature, 256:495 (1975) o por cualquier otro metodo de ADN recombinante conocido del estado tecnico (vease p.ej. la patente U.S. n° 4,816,567).
En el metodo del hibridoma se inmuniza un raton u otro animal huesped adecuado (p.ej. un hamster) del modo arriba descrito, para obtener como respuesta linfocitos productores de anticuerpos o capaces de producir anticuerpos que se unan espedficamente al polipeptido de interes empleado en la inmunizacion. Como alternativa los linfocitos se inmunizan in vitro. Despues los linfocitos inmunizados se fusionan con celulas de mieloma, usando un agente de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fusion idoneo, como por ejemplo polietilenglicol, para formar celulas de hibridoma (vease p.ej. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, p. 59-103 (1986)). Las celulas de hibridoma asf preparadas se siembran y crecen en un medio adecuado de cultivo que contiene preferentemente una o mas sustancias inhibidoras del crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parental carecen del enzima hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), el medio de cultivo para las celulas de hibridoma incluira normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que impiden el crecimiento de las celulas carentes de HGPRT.
Las celulas de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente y favorecen un elevado nivel de produccion estable de anticuerpos por las celulas productoras de anticuerpo seleccionadas y/o que son sensibles a un medio tal como el HAT. Como ejemplos de dichas lmeas celulares preferidas para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos cabe citar, sin limitarse a ellas, lmeas de mieloma murino tales como las derivadas de los tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 (que suministra el Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, CA), las celulas SP-2 o X63-Ag8-653 (que suministra la American Type Culture Collection; Rockville, MD) y lmeas celulares de mieloma humano o heteromieloma murino-humano (vease p.ej. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, p. 51-63
(1987) ).
El medio de cultivo en el cual crecen las celulas de hibridoma se puede ensayar para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipeptido de interes. La especificidad de fijacion de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina preferiblemente por inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de fijacion in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de fijacion de los anticuerpos monoclonales se puede determinar empleando p.ej. el analisis Scatchard de Munson y otros, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Una vez identificadas las celulas de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilucion limitante y cultivarse por metodos estandar (vease p.ej. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, p. 59-103 (1986)). Los medios de cultivo estable para esta finalidad incluyen, por ejemplo D-MEM o RPMI-1640. Ademas las celulas de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, del fluido ascffico o del suero mediante procedimientos comunes de purificacion de anticuerpos, como por ejemplo cromatograffa de protema A-sefarosa, cromatograffa de hidroxi- apatita, electroforesis en gel o cromatograffa de afinidad.
El ADN codificador de los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar facilmente por procedimientos convencionales (p.ej. usando sondas oligonucleotidas capaces de fijarse espedficamente a genes codificadores de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresion que luego se transfectan en celulas huesped tales como celulas de E. coli, celulas de simio COS, celulas ovaricas de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otra forma no producen anticuerpos, para inducir la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. Vease p.ej. Skerra y otros, Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993); y Pluckthun, Immunol Rev., 130:151-188 (1992). El ADN tambien se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo las secuencias murinas homologas por la secuencia codificadora de dominios constantes de cadenas pesadas y ligeras humanas (vease p.ej. la patente U.S. n° 4,816,567; y Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora de un polipeptido no inmunoglobulmico.
Se revela que se pueden aislar anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas con el uso de las tecnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty y otros, Nature, 348:552-554 (1990); Clackson y otros, Nature, 352:624-628 (1991); y Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). La produccion de anticuerpos monoclonales humanos de gran afinidad (rango nM) por intercambio de cadenas esta descrita en Marks y otros, BioTechnology, 10:779-783 (1992). El uso de la infeccion combinatoria y la recombinacion in vivo, como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy amplias, esta descrito en Waterhouse y otros, Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). Por lo tanto estas tecnicas son alternativas viables a los metodos tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales
C. Anticuerpos humanizados
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos del estado tecnico. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacido procedentes de una fuente no humana introducidos en el. Estos restos de aminoacido no humanos se denominan frecuentemente residuos “de importacion” y suelen tomarse de un dominio variable “de importacion”. La humanizacion se puede efectuar, esencialmente, sustituyendo las secuencias de la region hipervariable de un anticuerpo no humano por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Vease p.ej. Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332:323-327
(1988) ; y Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988). Por consiguiente dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quimericos (vease p.ej. la patente U.S. n° 4,816,567), en los cuales se ha sustituido mucho menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la practica los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos, en los cuales algunos restos de la region hipervariable y posiblemente algunos restos de la region marco (FR) estan sustituidos por restos de sitios analogos de anticuerpos de roedores.
La eleccion de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que deben utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados aqu descritos es una consideracion importante para reducir la antigenicidad. Conforme al metodo llamado de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se rastrea contra toda la biblioteca de secuencias conocidas de dominios variables humanos. Entonces la secuencia humana mas cercana a la del roedor se acepta como la FR para el anticuerpo humanizado (vease p.ej. Sims y otros, J. Immunol., 151:2296 (1993); y Chothia y otros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En otro metodo se usa una region FR particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligeras o pesadas. La misma FR se puede utilizar para diversos anticuerpos humanizados diferentes (vease p.ej. Carter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta y otros, J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Tambien es importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo una elevada afinidad por el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y de diversos productos humanizados conceptuales, utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina estan generalmente disponibles y son conocidos de los expertos en la materia. Se dispone de programas informaticos que explican y representan las probables estructuras de conformacion tridimensional de las secuencias candidatas de inmunoglobulina que han sido escogidas. El examen de estas representaciones permite analizar el probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para fijar su antfgeno. De esta forma los restos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias receptoras y de importacion, para lograr la caractenstica deseada del anticuerpo, como mayor afinidad por el o los antfgenos diana. En general, los restos de la region hipervariable intervienen directa y espedficamente en la fijacion del antfgeno.
Segun la presente invencion se contemplan varias formas de anticuerpos humanizados. Por ejemplo el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgA, IgG o IgM.
D. Anticuerpos humanos
Como alternativa a la humanizacion se pueden generar anticuerpos humanos. Se revela que se pueden producir animales transgenicos (p.ej. ratones) capaces de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos tras la inmunizacion, en ausencia de produccion endogena de inmunoglobulina. Se ha descrito por ejemplo que la delecion homocigotica del gen de la region de union de cadenas pesadas de los anticuerpos (JH) en ratones quimericos y mutantes de la lmea germinal produce la inhibicion total de la produccion endogena de anticuerpos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulinas humanas de la lmea germinal a dichos ratones mutantes de la lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos durante la exposicion al antfgeno. Vease p.ej. Jakobovits y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immun., 7:33 (1993); y patentes U.S. n° 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807.
Alternativamente se puede emplear la tecnologfa de visualizacion de fagos (vease p.ej. McCafferty y otros, Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, utilizando repertorios geneticos del dominio variable (V) de inmunoglobulinas procedentes de donantes no inmunizados. Segun esta tecnica los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco, en un gen de una protema principal o secundaria de la capside de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o fd, y se visualizan como fragmentos funcionales de anticuerpos sobre la superficie de la partmula fagica. Dado que la partmula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fagico, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo dan tambien como resultado la seleccion del gen codificador del anticuerpo que exhibe dichas propiedades. Asf, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la celula B. La visualizacion del fago se puede realizar en una variedad de formatos, tal como se describe p.ej. en Johnson y otros, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:564-571 (1993). Para visualizar los fagos se pueden usar varias fuentes de segmentos geneticos V. Vease p.ej. Clackson y otros, Nature, 352:624628 (1991). Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y aislar anticuerpos para una matriz diversa de antfgenos (incluyendo autoantfgenos), siguiendo esencialmente las tecnicas descritas en Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Griffith y otros, EMBO J., 12:725-734 (1993); y en las patentes U.S. n° 5,565,332 y 5,573,905.
En algunos casos se pueden generar anticuerpos humanos mediante celulas B activadas in vitro, tal como esta descrito p.ej. en las patentes U.S. n° 5,567,610 y 5,229,275.
E. Fragmentos de anticuerpos
Para producir fragmentos de anticuerpo se han desarrollado diversas tecnicas. Tradicionalmente estos fragmentos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se derivaban de la digestion proteolftica de anticuerpos intactos (vease p.ej. Morimoto y otros, J. Biochem. Biophys. Meth., 24:107-117 (1992); y Brennan y otros, Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, ahora estos fragmented pueden producirse directamente empleando celulas huesped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos tratadas anteriormente. Como alternativa se pueden recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de celulas E. coli y acoplarlos qmmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (vease p.ej. Carter y otros, BioTechnology, 10:163-167 (1992)). Segun otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivos de celulas huesped recombinantes. Otras tecnicas de produccion de fragmentos de anticuerpo seran evidentes para los especialistas. Se revela que el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Vease p.ej. la publicacion PCT n° WO 93/16185 y las patentes U.S. n° 5,571,894 y 5,587,458. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo lineal como el descrito p.ej. en la patente U.S. n° 5,641,870. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespedficos o biespedficos.
F. Anticuerpos biespedficos
Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos que tienen especificidades de fijacion para al menos dos epftopos diferentes. Los anticuerpos biespedficos ejemplares se pueden unir a dos epftopos diferentes del mismo polipeptido de interes. Otros anticuerpos biespedficos pueden combinar un sitio de fijacion para el polipeptido de interes con sitio(s) de fijacion para uno o mas antfgenos. Los anticuerpos biespedficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p.ej. anticuerpos biespedficos F(ab')2).
Los procedimientos de preparacion de anticuerpos biespedficos son conocidos del estado tecnico. La produccion tradicional de anticuerpos biespedficos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, donde las dos cadenas poseen diferentes especificidades (vease p.ej. Millstein y otros, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la diversidad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una posee la estructura biespedfica correcta. La molecula correcta suele purificarse por cromatograffa de afinidad. En la publicacion PCT n° wO 93/08829 y en Traunecker y otros, EMBO J., 10:36553659 (1991), se revelan procedimientos similares.
Segun un enfoque distinto, se fusionan dominios variables de anticuerpo que poseen las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo-antfgeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos una parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible que la primera region constante de cadena pesada (CH1) con el sitio necesario para la fijacion de cadena ligera este al menos presente en una de las fusiones. Los ADN codificadores de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de inmunoglobulina se insertan en vectores de expresion separados y son cotransfectados en un organismo huesped. Esto da una gran flexibilidad para el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptfdicos cuando el uso de proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptidas en la construccion produce los rendimientos optimos. No obstante es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o de las tres cadenas polipeptidas en un vector de expresion, cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptidas en proporciones iguales produce rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen ninguna importancia especial.
Se revela que los anticuerpos biespedficos pueden estar compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina hterida con una primera especificidad de fijacion en una rama y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina hterida (que proporciona una segunda especificidad de fijacion) en la otra rama. Esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespedfico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, porque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molecula biespedfica proporciona una via facil de separacion. Vease p.ej. la publicacion PCT n° WO 94/04690 y Suresh y otros Meth. Enzymol., 121:210 (1986).
Segun otro enfoque descrito en la patente U.S. n° 5,731,168, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo se puede disenar de forma que el porcentaje de heterodfmeros recuperados del cultivo de celulas recombinantes sea maximo. La interfaz preferida incluye al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacidos pequenos de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales mas largas (p.ej. de tirosina o triptofano). En la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo se crean “huecos” compensatorios de tamano identico o similar a la(s) cadena(s) grande(s), reemplazando cadenas laterales de aminoacidos grandes por otras mas pequenas (p.ej. de alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodfmero frente a otros productos finales no deseados, tales como los homodfmeros.
Los anticuerpos biespedficos comprenden anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a avidina y el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Los agentes y las tecnicas de reticulacion adecuadas son bien conocidas del estado tecnico y estan reveladas p.ej. en la patente U.S. n° 4,676,980.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En el estado tecnico tambien se conocen tecnicas apropiadas para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespedficos por enlace qmmico. En ciertos casos se pueden generar anticuerpos biespedficos por un procedimiento que consiste en dividir proteoffticamente anticuerpos intactos para producir fragmentos F(ab')2 (vease p.ej. Brennan y otros, Science, 229:81 (1985)). Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito sodico, a fin de estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos F(ab')2 generados se transforman luego en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte despues en el Fab'-tiol por reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equivalente del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespedfico.
Se revela que los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar anticuerpos biespedficos. Por ejemplo, una molecula F(ab')2 de anticuerpo biespedfico completamente humanizado se puede producir segun los metodos descritos en Shalaby y otros, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992). Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente de E. coli y sometido a un acoplamiento qmmico directo in vitro para formar el anticuerpo biespedfico.
Tambien se han descrito varias tecnicas para preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpos biespedficos a partir de cultivos de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos empleando cremalleras de leucina. Vease p.ej. Kostelny y otros, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los peptidos cremallera de leucina procedentes de las protemas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los anticuerpos homodfmeros se redujeron en la region bisagra para formar monomeros y despues se reoxidaron para formar los anticuerpos heterodfmeros. Este procedimiento tambien se puede utilizar para producir anticuerpos homodfmeros. La tecnologfa “diabody” (de “fragmento bivalente”), descrita por Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para obtener fragmentos de anticuerpos biespedficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente los dominios VH y VL de un fragmento estan forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando asf dos sitios de fijacion de anffgenos. En Gruber y otros, J. Immunol., 152:5368 (1994), se describe otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespedficos mediante el uso de dfmeros de Fv monocatenario (sFv).
Tambien se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Asf, por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespedficos. Vease p.ej. Tutt y otros, J. Immunol., 147:60 (1991).
G. Purificacion de anticuerpos
Cuando se usan tecnicas recombinantes, los anticuerpos se pueden producir dentro de una celula huesped aislada, en el espacio periplasmatico de una celula huesped aislada o pueden ser directamente secretados al medio por una celula huesped. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, primero se elimina el detrito particulado, por ejemplo mediante centrifugacion o ultrafiltracion. Carter y otros, BioTech., 10:163-167 (1992), describen un procedimiento para aislar los anticuerpos secretados en el espacio periplasmatico de E. coli. Resumiendo, se descongela pasta celular en presencia de acetato sodico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante 30 minutos aproximadamente. El detrito celular se puede eliminar por centrifugacion. Cuando el anticuerpo es secretado al medio, los sobrenadantes procedentes de estos sistemas de expresion se concentran generalmente mediante un filtro de concentracion de protemas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. En cualquiera de dichas etapas se puede incluir un inhibidor de proteasa como el PMSF para impedir la proteolisis y adjuntar antibioticos para evitar el crecimiento de contaminantes inesperados.
La composicion del anticuerpo preparado a partir de celulas se puede purificar usando, por ejemplo, cromatograffa de hidroxiapatita, electroforesis en gel, dialisis y cromatograffa de afinidad. La eficacia de la protema A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina presente en el anticuerpo. La protema A se puede usar para purificar anticuerpos basados en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (vease p.ej. Lindmark y otros, J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). La protema G esta recomendada para todos los isotipos murinos y para y3 humano (vease p.ej. EMBO J., 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la cual esta unido el ligando de afinidad es con mayor frecuencia de agarosa, pero tambien se dispone de otras matrices. Las matrices que tienen estabilidad mecanica, como las de vidrio de poro controlado o de poli(estirenodivinil)benceno, permiten indices de flujo mas rapidos y tiempos de proceso mas cortos que los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.) es util para la purificacion. Para la purificacion de protemas se dispone de otras tecnicas, como fraccionamiento en columna de intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatograffa sobre sflice, cromatograffa sobre heparina SEPHAROSE®, cromatograffa sobre una resina de intercambio anionico o cationico (como una columna de acido poliaspartico), cromatograffa de enfoque, SDS-PAGE y precipitacion con sulfato amonico, en funcion del anticuerpo que deba recuperarse.
Despues de cualquier etapa o etapas preliminares de purificacion, la mezcla que contiene el anticuerpo de interes y contaminantes se puede someter a una cromatograffa de interaccion hidrofoba a pH bajo, empleando un tampon de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
elucion a un pH comprendido aproximadamente entre 2,5-4,5, realizada preferiblemente a bajas concentraciones salinas (p.ej. 0-0,25 M de sal aproximadamente).
VI. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la presente invencion.
Ejemplo 1. Separacion, estimulacion y lisis de celulas circulantes.
Las celulas circulantes de un tumor solido comprenden celulas que han sido metastatizadas o micrometastatizadas a partir de un tumor solido, e incluyen celulas tumorales circulantes (CTCs), celulas madre cancerosas (CSCs) y/o celulas que migran hacia el tumor (p.ej. celulas progenitoras endoteliales circulantes (CEPCs), celulas endoteliales circulantes (CECs), celulas mieloides proangiogenicas circulantes, celulas dendnticas circulantes, etc.). Muestras de paciente que contengan celulas circulantes se pueden obtener de cualquier fluido biologico accesible (p.ej. sangre, orina, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva, aspirado con aguja fina, etc.). Las celulas circulantes se pueden aislar de una muestra de un paciente empleando uno o mas metodos de separacion, como por ejemplo la separacion inmunomagnetica (vease p.ej. Racila y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth y otros, Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)), la separacion microflmdica (vease p.ej. Mohamed y otros, IEEE Trans. Nanobiosci., 3:251-256 (2004); Lin y otros, Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS (vease p.ej. Mancuso y otros, Blood, 97:3658-3661 (2001)), la centrifugacion por gradiente de densidad (vease p.ej. Baker y otros, Clin. Cancer Res., 13: 4865-4871 (2003)), y los metodos de deplecion (vease p.ej. Meye y otros, Int. J. Oncol., 21:521-530 (2002)).
Aislamiento manual de CTCs:
Separacion inmunomagnetica de CTCs - aislamiento manual seguido por un ensayo de activacion:
1) Se emplean perlas magneticas (Dynal M450; Dynal AS; Oslo, Noruega) previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (Kordia Life Sciences; Leiden, Holanda).
2) Justo antes del uso, las perlas Dynabeads prerrevestidas se lavan una vez con un volumen igual de PBS con BSA al 0,01 %.
3) Se anaden 25 pl de las perlas Dynabeads prerrevestidas a 1 ml de la muestra.
4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8°C con suave inclinacion y rotacion.
5) El tubo se coloca en el separador magnetico (magneto MPL-1) durante 2 minutos.
6) Se descarta el sobrenadante y las celulas fijadas a las perlas se lavan tres veces por resuspension en PBS con BSA al 0,01 %, seguida de separacion magnetica.
7) La muestra se resuspende en 100 pl de tampon de estimulacion.
Preparacion de muestras:
1) Se extrae sangre periferica de pacientes humanos en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml de EDTA. Se descartan los primeros 3-5 ml para evitar la contaminacion con celulas epiteliales desprendidas de la vena pinchada.
2) Se diluye 1 ml de sangre entera en relacion 1:3 con NaCl al 0,9% antes del uso.
Preparacion de controles:
1) Se preparan controles de lmeas celulares anadiendo lmeas de celulas cancerosas humanas a celulas HL-60.
2) Los controles de lmeas celulares se usan a una concentracion de 2,5 x 106 celulas/ml.
Aislamiento manual de CECs y CEPCs:
Como ejemplo no limitativo, se pueden aislar CECs y CEPCs viables con la tecnica de separacion/enriquecimiento inmunomagnetico descrita en Beerepoot y otros, Ann. Oncology, 15:139-145 (2004). Resumiendo, se incuba sangre periferica con perlas magneticas (Dynal M450 IgG1) previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti- CD146 (Kordia Life Sciences). Este anticuerpo reconoce todos los linajes de celulas endoteliales, pero no celulas hematopoyeticas o epiteliales, en la sangre periferica (George y otros, J. Immunol. Meth., 139:65-75 (1991)). Se puede usar una seleccion negativa de celulas hematopoyeticas y epiteliales antes de la seleccion positiva con perlas magneticas conjugadas con anticuerpos adecuados (p.ej. perlas Dynal-CD45 para agotar leucocitos, perlas Dynal- CD14 para agotar monocitos, perlas Dynal-EpCAM para agotar celulas epiteliales (Invitrogen; Carlsbad, CA)). En este ejemplo solo se usa la seleccion positiva.
Separacion inmunomagnetica de CECs y CEPCs - aislamiento manual seguido por un ensayo de activacion:
1) Se usan perlas magneticas (Dynal M450) previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti- CD 146 (Kordia Life Sciences).
2) Justo antes del uso, las perlas Dynabeads prerrevestidas se lavan una vez con un volumen igual de PBS con BSA al 0,01 %.
3) Se anaden 25 pl de las perlas Dynabeads prerrevestidas a 1 ml de la muestra.
4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8°C con suave inclinacion y rotacion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5) El tubo se coloca en el separador magnetico (magneto MPL-1) durante 2 minutes.
6) Se descarta el sobrenadante y las celulas fijadas a las perlas se lavan tres veces por resuspension en PBS con BSA al 0,01 %, seguida de separacion magnetica.
7) La muestra se resuspende en 100 pl de tampon de estimulacion.
Preparacion de muestras:
1) Se extrae sangre periferica de pacientes humanos en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml de EDTA. Se descartan los primeros 3-5 ml para evitar la contaminacion con celulas endoteliales desprendidas de la vena pinchada.
2) Se diluye 1 ml de sangre entera en relacion 1:3 con NaCl al 0,9% antes del uso.
Preparacion de controles:
1) Se preparan controles de lmeas celulares anadiendo celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) a celulas hL-60.
2) Los controles de lmeas celulares se usan a una concentracion de 2,5 x 106 celulas/ml.
Aislamiento manual de CEPCs (sin CECs):
Las CEPCs son un subtipo circulante de celulas progenitoras derivadas de la medula osea, con capacidad de diferenciarse en celulas endoteliales maduras como respuesta a varios factores de crecimiento angiogenicos. Las CEPCs se pueden aislar por seleccion con anticuerpos que reconocen el marcador superficial CD34. El CD133 es un marcador superficial que diferencia las celulas progenitoras endoteliales inmaduras (EPCs) o las celulas madre hematopoyeticas primitivas HSCs) de las CEPCs. Se han descrito varios procedimientos de aislamiento de CEPCs de distintas fuentes, en los cuales se emplea el cultivo adherente o microperlas magneticas. En este ejemplo se usa un protocolo modificado respecto al descrito en Asahara y otros, Science, 275:964-967 (1997).
Separacion inmunomagnetica de CEPCs - aislamiento manual seguido por un ensayo de activacion:
1) Se usan perlas magneticas (Dynal M450 CD34). Estas perlas estan revestidas con un anticuerpo monoclonal espedfico del antfgeno superficial CD34.
2) Justo antes del uso, las perlas Dynabeads prerrevestidas se lavan una vez con un volumen igual de PBS con BSA al 0,01 %.
3) Se anaden 25 pl de las perlas Dynabeads prerrevestidas a 1 ml de la muestra.
4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8°C con suave inclinacion y rotacion.
5) El tubo se coloca en el separador magnetico (magneto MPL-1) durante 2 minutos.
6) Se descarta el sobrenadante y las celulas fijadas a las perlas se lavan tres veces por resuspension en PBS con BSA al 0,01 %, seguida de separacion magnetica.
7) La muestra se resuspende en 100 pl de tampon de estimulacion.
Preparacion de muestras:
1) Se extrae sangre periferica de pacientes humanos en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml de EDTA. Se descartan los primeros 3-5 ml para evitar la contaminacion con celulas endoteliales desprendidas de la vena pinchada.
2) Se diluyen 10 ml de sangre en relacion 1:1 con una solucion salina equilibrada.
3) Se extienden 4 ml de sangre diluida sobre 3 ml de Ficoll-Paque en tubos de 10 ml.
4) Los tubos se centrifugan a 400 x g durante 30-40 min a 18-20°C.
5) La capa superior que contiene plasma y plaquetas se extrae con una pipeta Pasteur esteril, sin tocar la capa de celulas mononucleares en la interfase.
6) Las celulas mononucleares se transfieren a un tubo esteril de centnfuga con una pipeta esteril.
7) Se anaden 6 ml de solucion salina equilibrada y las celulas se resuspenden suavemente.
8) La mezcla se centrifuga a 60-100 x g durante 10 min a 18-20°C.
9) Se elimina el sobrenadante y las celulas mononucleares de cada tubo se resuspenden en 1 ml de PBS. Aislamiento de CTCs, CECs y CEPCs usando el sistema Veridex:
Veridex (Warren, NJ) ha comercializado el sistema CellSearch, que consta de un sistema CellPrep, el kit CellSearch Epithelial Cell y el analizador CellSpotter. El sistema CellSearch es un sistema semiautomatizado de preparacion de muestras (Kagan y otros, J. Clin. Ligand Assay, 25:104-110(2002)). El kit CellSearch Epithelial Cell consta de: ferrofluidos recubiertos con anticuerpos anti-EpCAM espedficos de celulas epiteliales; anticuerpos de citoqueratinas 8, 18 y 19 conjugados con ficoeritrina; un anticuerpo anti-CD45 conjugado con aloficocianina; colorante DAPI y tampones para lavar, permeabilizar y resuspender las celulas. El protocolo utilizado en este ejemplo tambien esta descrito en Allard y otros, Clin. Cancer Res., 10:6897-6904 (2004). El sistema Veridex completo se puede usar para el recuento de CTC o puede servir de metodo de aislamiento previo al analisis de activacion de la via, retirando la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
muestra manualmente tras la separacion con el sistema CellPrep. El numero de CTCs puede server de informacion para el desarrollo del algoritmo.
Sistema Veridex - enriquecimiento de CTC seguido de recuento:
1) Se mezclan 7,5 ml de sangre con 6 ml de tampon, se centrifugan a 800 x g durante 10 minutos y se colocan en el sistema CellPrep.
2) Tras la aspiracion del sobrenadante por el aparato, este anade los ferrofluidos.
3) El aparato realiza la incubacion y la subsiguiente etapa de separacion magnetica.
4) Las celulas no fijadas y el plasma restante son aspirados.
5) Se agregan los reactivos de tincion junto con el tampon de permeabilizacion para la coloracion fluorescente.
6) Tras la incubacion por el sistema, las celulas se separan de nuevo magneticamente y se resuspenden en el dispositivo MagNest Cell Presentation para su analisis con el analizador CellSpotter.
7) Se coloca el dispositivo en el analizador CellSpotter, un microscopio de fluorescencia semiautomatizado de cuatro colores.
8) Las imagenes que cumplen los criterios definidos por Veridex se capturan y se muestran mediante un navegador de internet para la seleccion manual definitiva.
9) Los resultados del recuento de celulas se expresan como numero de celulas por 7,5 ml de sangre.
Sistema Veridex - enriquecimiento de CTC seguido de un ensayo de activacion:
1) Se mezclan 7,5 ml de sangre con 6 ml de tampon, se centrifugan a 800 x g durante 10 minutos y se colocan en el sistema CellPrep.
2) Tras la aspiracion del sobrenadante por el aparato, este anade los ferrofluidos.
3) El aparato realiza la incubacion y la subsiguiente etapa de separacion magnetica.
4) Las celulas no fijadas y el plasma restante son aspirados.
5) Se resuspende la muestra en 100 pl de tampon de estimulacion.
Sistema Veridex - enriquecimiento de CEC y CEPC seguido de un ensayo de activacion:
1) Veridex ofrece un kit CellTracks de celulas endoteliales que utiliza la captura de CECs y CEPCs con un anticuerpo anti-CD146. El kit CellTracks de celulas endoteliales se usa junto con el sistema CellTracks AutoPrep de Veridex para la preparacion de la muestra de sangre y el analizador CellTracks II para contar e identificar las CECs y CEPCs de la sangre entera. El protocolo es el mismo que para el kit CellSearch de celulas epiteliales.
Preparacion de muestras:
1) Se introduce sangre periferica de pacientes humanos en el tubo CellSave Preservative segun las instrucciones del fabricante. Se descartan los primeros 3-5 ml para evitar la contaminacion con celulas epiteliales o endoteliales desprendidas de la vena pinchada.
Aislamiento manual de CSCs:
Se esta demostrando que los tumores incluyen una pequena poblacion de celulas madre supuestamente cancerosas con mecanismos singulares de autorrenovacion y supervivencia (vease p.ej. Sells, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 51:128 (2004); Reya y otros, Nature, 414:105-111 (2001); Dontu y otros, Trends Endocrinol. Metal., 15:193-197 (2004); y Dick, Nature, 423:231-233 (2003)). Las celulas madre cancerosas (CSCs) pueden estar inactivas durante mucho tiempo, haciendose resistentes a los farmacos quimioterapeuticos que tiene como diana las celulas en division. Esta poblacion iniciadora de cancer se puede identificar por la activacion de vfas de autorrenovacion y supervivencia cuando se realiza una terapia de eliminacion selectiva. Se han descrito procedimientos de aislamiento de CSCs con el uso de un cultivo adherente o de microperlas magneticas. En este ejemplo se emplea un protocolo modificado respecto al descrito en Cote y otros, Clin. Can. Res., 12:5615 (2006).
Separacion inmunomagnetica de CSC - aislamiento manual seguido de un ensayo de activacion:
1) Se emplean perlas magneticas (Dynal AS; Oslo, Noruega). Estas perlas se recubren con un anticuerpo monoclonal espedfico del antfgeno superficial CD34 o CD133.
2) Justo antes de usarlas, las perlas Dynabeads prerrevestidas se lavan una vez con un volumen igual de PBS con BSA al 0,01 %.
3) Se anaden 1-107 Dynabeads prerrevestidas a 3 ml de la muestra.
4) La mezcla se incuba durante 60 minutos a 2-8°C con suave inclinacion y rotacion.
5) Se divide la mezcla en porciones de 1 ml y cada tubo se coloca en el separador magnetico (magneto MPL-1) durante al menos 6 minutos.
6) Se descarta el sobrenadante y las celulas fijadas a las perlas se lavan tres veces por resuspension en PBS con BSA al 0,01 %, seguida de separacion magnetica.
7) Se resuspende la muestra en 100 pl de tampon de estimulacion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Preparacion de muestras:
1) Se obtienen muestras de medula osea de pacientes de cancer inicial de mama, con el consentimiento del paciente informado.
2) La medula osea aspirada se procesa de la forma descrita en Bauer y otros, Clin. Can. Res., 6:3552-3559 (2000)). La fraccion celular mononuclear que contiene cualquier tipo de celulas tumorales diseminadas se enriquece mediante centrifugacion por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, usando una centnfuga Beckman GS-6 a 4000 x g durante 35 minutos, y se lava dos veces con PBS.
Estimulacion celular y lisis de CTCs aisladas:
Estimulacion celular:
1) Se anaden a las celulas los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Herceptin, Lapatanib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas anadiendo los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (realimentacion):
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Herceptin, Lapatanib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas con los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 120 minutos.
Las CTCs estimuladas se lisan empleando el siguiente protocolo:
1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos que figuran en la tabla 1.
2) Tras el lavado final las celulas se resuspenden en 100 pl de tampon enfriado sobre hielo.
3) La incubacion se efectua sobre hielo durante 30 minutos.
4) La mezcla se centrifuga durante 10 minutos en una centnfuga Microfuge a velocidad maxima, para separar las perlas del lisado.
5) El lisado se transfiere a un nuevo tubo de ensayo para analisis o almacenamiento a -80°C.
Tabla 1
- Receta de tampon de lisis (10 ml)
- Reactivos
- Conc. de reserva Conc. final Volumen
- Triton X-100 al 10%
- 10 1 1,00
- Tris 1 M, pH 7,5
- 1 0,05 0,05
- NaF 1 M
- 1 0,05 0,05
- NaCl 5 M
- 5 0,1 0,20
- B-glicerolfosfato 2 M
- 1 0,05 0,50
- NaaVO4 0,1M
- 0,1 0,001 0,10
- 1 mg/ml de pepstatina
- 1 0,10
- Mini proteasa completo
- 1 tableta
- EDTA 0,5 M
- 0,5 0,005 0,10
- Total (ml) 3,00
- Agua (ml) 7,00
Estimulacion celular y lisis de CECs y/o CEPCs aisladas:
Se cree que el VEGF favorece la supervivencia activando vfas antiapoptoticas tanto en las CEPCs (Larrivee y otros, J. Biol. Chem., 278:22006-22013 (2003)) como en las CECs maduras que han sido descamadas de la pared del recipiente (Solovey y otros, Blood, 93:3824-3830 (1999)). El VEGF tambien puede estimular la proliferacion de CEpCs o de CECs maduras, aunque parece que las CECs maduras tienen una capacidad de proliferacion limitada en comparacion con las CEPCs (Lin y otros, J. Clin. Invest., 105:71-77 (2000)). Por estas razones las CECs y/o las CEPCs se activan por incubacion con VEGF antes de la lisis.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Estimulacion celular:
1) Se anaden a las celulas los factores de crecimiento VEGF, FGF, PDGF, PIGF y/o angiopoyetina, cada uno de ellos a 100 nM, y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Avastin, Nexavar, Sutent y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas anadiendo los factores de crecimiento VEGF, FGF, PDGF, PIGF y/o angiopoyetina, cada uno de ellos a 100 nM, y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (realimentacion):
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Avastin, Nexavar, Sutent y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas anadiendo VEGF, FGF, PDGF, PIGF y/o angiopoyetina, cada uno de ellos a 100 nM, y se incuba a 37°C durante 120 minutos.
Las celulas CECs y/o CEPCs aisladas se lisan empleando el siguiente protocolo:
1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos que figuran en la tabla 1.
2) Tras el lavado final las celulas se resuspenden en 100 pl de tampon enfriado sobre hielo.
3) La incubacion se efectua sobre hielo durante 30 minutos.
4) La mezcla se centrifuga durante 10 minutos en una centnfuga Microfuge a velocidad maxima, para separar las perlas del lisado.
5) El lisado se transfiere a un nuevo tubo de ensayo para analisis o almacenamiento a -80°C.
Estimulacion celular y lisis de CSCs aisladas:
Celulas estimuladas:
1) Se anaden a las celulas los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Celulas estimuladas, con tratamiento farmacologico:
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Herceptin, Lapatanib, Tarceva y/o analogos de concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas anadiendo los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 5 minutos.
Celulas estimuladas, con tratamiento farmacologico (realimentacion):
1) La muestra se trata durante 30 minutos a 37°C con Herceptin, Lapatanib, Tarceva y/o analogos de concentraciones terapeuticamente efectivas.
2) Luego se estimulan las celulas anadiendo los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina IGF (100 nM) y se incuba a 37°C durante 120 minutos.
Las celulas CSC aisladas se lisan empleando el siguiente protocolo:
1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos que figuran en la tabla 1.
2) Tras el lavado final las celulas se resuspenden en 100 pl de tampon enfriado sobre hielo.
3) La incubacion se efectua sobre hielo durante 30 minutos.
4) La mezcla se centrifuga durante 10 minutos en una centrifuga Microfuge a velocidad maxima, para separar las perlas del lisado.
5) El lisado se transfiere a un nuevo tubo de ensayo para analisis o almacenamiento a -80°C.
Ejemplo 2. Deteccion de celulas individuales mediante ELISA sandwich con amplificacion de la senal de tiramida como detector individual.
Este ejemplo explica un detector individual ELISA Sandwich multiplex de gran rendimiento, con rango dinamico superior, que es adecuado para analizar los estados de activacion de las moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion:
1) Una placa de microvaloracion de 96 pocillos se recubrio por la noche a 4°C con anticuerpo de captura.
rapamicina a (100 nM) y/o
rapamicina a (100 nM) y/o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2) Al dfa siguiente la placa se bloqueo con BSA al 2%/TBS-Tween durante 1 hora.
3) Despues de lavar con TBS-Tween se anadio el lisado celular o protema recombinante en dilucion seriada y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente.
4) La placa se lavo 4 veces con TBS-Tween y luego se incubo con un anticuerpo detector marcado con biotina durante 2 horas a temperatura ambiente.
5) Tras la incubacion con el anticuerpo detector, la placa se lavo cuatro veces con TBS-Tween y luego se incubo con peroxidasa de rabano picante marcada con estreptavidina (SA-HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente, para permitir la fijacion de la SA-HRP al anticuerpo detector marcado con biotina.
6) Para amplificar la senal se agregaron 5 mg/ml de biotina-tiramida con 0,015% de H2O2 y se dejo reaccionar durante 15 minutos.
7) Despues de lavar seis veces con TBS-Tween se anadio SA-HRP y se incubo durante 30 minutos.
8) Despues de lavar el substrato HRP 6 veces con TBS-Tween se anadio TMB y el color se desarrollo durante 2-10 minutos en la oscuridad. La reaccion se detuvo agregando H2SO4 0,5 M. La senal se leyo a 450/570 nm en un lector de microplacas.
La figura 3 muestra la deteccion del RFCE total en celulas A431, empleando un ELISA que comprende anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpos de captura y deteccion. La sensibilidad del inmunoensayo fue aproximadamente de 0,25 pg/pocillo, basada en un dominio extracelular recombinante de RFCE humano. La concentracion de RFCE calculada fue aproximadamente de 0,6 pg en cada celula A431.
La figura 4 muestra la deteccion de RFCE fosforilado en celulas A431, empleando un ELISA que comprende un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de RFCE como el anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal marcado con biotina contra el RFCE fosforilado como el anticuerpo detector. Una dilucion doble en serie del anticuerpo de captura revelo un incremento de la senal de 1,78 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,0625 pg/ml.
La figura 5 muestra la deteccion de ErbB2 total en celulas SKBr3, empleando un ELISA que comprende anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de ErbB2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector. El rango de deteccion aproximado del inmunoensayo estaba comprendido entre 1.000 y 1,37 celulas. Hubo un incremento de la senal de 2,71 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido), al nivel celular 1,37, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 1 pg/ml.
La figura 6 muestra la deteccion de ErbB2 fosforilado en celulas SKBr3, empleando un ELISA que comprende un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de ErbB2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra ErbB2 fosforilado como anticuerpo detector. El rango de deteccion aproximado del inmunoensayo estaba comprendido entre 500 y 5 celulas. Hubo un incremento de la senal de 3,03 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido), al nivel celular 5, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 1 pg/ml.
La figura 7 muestra la deteccion del total de protema Erk2 fosforilada en celulas SKBr3, empleando un ELISA que comprende anticuerpos monoclonales contra Erk2 como anticuerpo de captura y anticuerpo detector. Hubo un incremento de la senal de 3,25 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) para la Erk2 total al nivel celular 1,37. Igualmente hubo un incremento de la senal de 3,17 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) para la Erk2 fosforilada, al nivel celular 1,37.
Ejemplo 3. Deteccion de celulas individuales mediante una micromatriz ELISA con amplificacion de la senal de tiramida como detector individual.
Este ejemplo explica un detector individual de micromatriz ELISA Sandwich multiplex de gran rendimiento, con rango dinamico superior, que es adecuado para analizar los estados de activacion de las moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion:
1) Se imprimio anticuerpo de captura en una placa FAST de 16 bloques (Whatman Inc.; Florham Park, NJ) con una dilucion doble seriada.
2) Despues de secarla por la noche, la placa se bloqueo con tampon de bloqueo Whatman.
3) Se anadieron 80 pl de lisado celular sobre cada bloque, diluido 10 veces en serie. La placa se incubo durante dos horas a temperatura ambiente.
4) Despues de seis lavados con TBS-Tween se incubaron 80 pl de anticuerpo detector marcado con biotina durante dos horas a temperatura ambiente.
5) Despues de seis lavados se anadio peroxidasa de rabano picante marcado con estreptavidina (SA-HRP) y se incubo durante 1 hora, para permitir la fijacion de la SA-HRP al anticuerpo detector marcado con biotina.
6) Para la amplificacion de la senal se agregaron 80 pl de biotina-tiramida a 5 mg/ml y se dejo reaccionar durante 15 minutos. La placa se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.
7) Se anadieron 80 pl de SA-Alexa 555 y se incubo durante 30 minutos. Luego la placa se lavo dos veces, se seco durante 5 minutos y se barrio en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.; Waltham, MA).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La figura 8 muestra la deteccion del total de RFCE en celulas A431, usando una micromatriz ELISA que comprende anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y anticuerpo detector. Un ensayo segun una curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas demostro que el formato de micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar RFCE en aproximadamente 1 - 10.000 celulas, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. Un ensayo segun una curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura demostro que podfa detectarse RFCE a partir de una celula. Hubo un incremento de la senal de 2,11 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,0625 mg/ml.
La figura 9 muestra la deteccion de RFCE fosforilado en celulas A431, empleando una micromatriz ELISA que comprende un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de RFCE como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra RFCE fosforilado como anticuerpo detector. Un ensayo segun una curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas demostro que el formato de micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar RFCE fosforilado en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. Un ensayo segun una curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura demostro que se podfa detectar RFCE a partir de una celula. Hubo un incremento de la senal de 1,33 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml.
La figura 10 muestra la deteccion de ErBb2 total en celulas SKBr3, usando una micromatriz ELISA que comprende anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de ErBb2 como el anticuerpo de captura y anticuerpo detector. Un ensayo segun una curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas demostro que el formato de micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar ErBb2 en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. Un ensayo segun una curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura demostro que podfa detectarse ErBb2 a partir de una celula. Hubo un incremento de la senal de 15,27 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml.
La figura 11 muestra la deteccion de ErBb2 fosforilado en celulas SKBr3, empleando una micromatriz ELISA que comprende un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de ErBb2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal contra ErBb2 fosforilado como anticuerpo detector. Un ensayo segun una curva de dilucion del anticuerpo de captura basada en el numero de celulas demostro que el formato de micromatriz ELISA tema un amplio rango dinamico para detectar ErBb2 en 1 - 10.000 celulas aproximadamente, con diferentes concentraciones de anticuerpo de captura en las series de dilucion. Un ensayo segun una curva de valoracion celular basada en las series de dilucion de concentraciones del anticuerpo de captura demostro que podfa detectarse ErBb2 a partir de una celula. Hubo un incremento de la senal de 5,45 veces respecto al fondo (relacion senal/ruido) al nivel celular uno, cuando la concentracion de anticuerpo de captura era de 0,125 mg/ml.
Ejemplo 4. Deteccion de celulas individuales mediante una micromatriz ELISA con amplificacion de la senal de tiramida como detector dual de proximidad.
Este ejemplo explica un detector dual de proximidad multiplex mediante una micromatriz ELISA Sandwich de gran rendimiento, con rango dinamico superior, que es adecuado para analizar los estados de activacion de las moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion:
1) Se imprimio anticuerpo de captura en una placa FAST de 16 bloques (Whatman Inc.; Florham Park, NJ) con una serie de dilucion de 1 mg/ml hasta 0,004 mg/ml.
2) Despues de secarla por la noche, la placa se bloqueo con tampon de bloqueo Whatman.
3) Se anadieron 80 pl de lisado de celulas A431sobre cada bloque, diluido 10 veces en serie. La placa se incubo durante dos horas a temperatura ambiente.
4) Despues de seis lavados con TBS-Tween se anadieron a las placas 80 pl de anticuerpos detectores para el ensayo de proximidad, diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1%. Como anticuerpos detectores se usaron: (1) un anticuerpo monoclonal anti-RFCE, conjugado directamente con glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado directamente con peroxidasa de rabano picante (HRP). La incubacion tuvo lugar durante 2 horas a temperatura ambiente.
5) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado con biotina. En estos casos, despues de seis lavados se incluyo una etapa adicional subsiguiente de incubacion con estreptavidina-HRP durante 1 hora.
6) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un conjugado del anticuerpo anti-RFCE con glucosa oxidasa (GO) a traves de un oligonucleotido. Se utilizo el conjugado directo de HRP con el anticuerpo de RFCE fosforilado o mediante biotina-estreptavidina (SA).
7) Para la amplificacion de la senal se agregaron 80 pl de biotina-tiramida a 5 mg/ml y se dejo reaccionar durante 15 minutos. La placa se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.
8) Se anadieron 80 pl de SA-Alexa 555 y se incubo durante 30 minutos. Luego la placa se lavo dos veces, se seco durante 5 minutos y se barrio en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.; Waltham, MA).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
La figura 12 muestra una comparacion entre la micromatriz ELISA de deteccion dual de proximidad y la micromatriz ELISA de deteccion individual. La tabla 2 muestra la sensibilidad de la micromatriz ELISA de deteccion dual de proximidad frente a la micromatriz ELISA de deteccion individual. Se indica para cada concentracion de celulas A431 la senal respecto al fondo (relacion senal/ruido) de los formatos de deteccion de proximidad e individual. Como se indica en la tabla 2 la micromatriz ELISA de deteccion dual de proximidad aumento 3 veces aproximadamente la sensibilidad al nivel celular uno.
Tabla 2
- N° de celulas
- Senal Senal espedfica Formato de proximidad (relacion S/R) Formato de deteccion individual (relacion S/R)
- 100
- 547 465 6,6 2,1
- 10
- 388 306 4,7 1,3
- 1
- 295 231 3,6 1,3
- 0
- 82
La figura 13 muestra la especificidad del ensayo de micromatriz ELISA de deteccion individual frente a la micromatriz ELISA de deteccion dual de proximidad. Los ensayos que generaron curvas de valoracion de RFCE fosforilado a varias concentraciones de anticuerpos de captura en el formato de deteccion individual mostraron un fondo muy alto, debido a la falta de especificidad del anticuerpo de deteccion individual. En cambio los ensayos que generaron curvas de valoracion de RFCE fosforilado a varias concentraciones de anticuerpos de captura en el formato de deteccion dual de proximidad mostraron un fondo muy bajo, debido a la mayor especificidad obtenida al detectar la proximidad entre dos anticuerpos detectores.
Ejemplo 5. Deteccion de celulas individuales en los estados de activacion de varios transductores de senales mediante micromatrices de deteccion dual de proximidad direccionables.
Este ejemplo explica un ensayo multiplex de gran rendimiento con una micromatriz direccionable de deteccion dual de proximidad, que tiene un rango dinamico superior adecuado para analizar los estados de activacion de varias moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion:
1) Se imprimieron anticuerpos de captura en una placa FAST de 16 bloques (Whatman Inc.). Los anticuerpos de captura impresos fueron RFCE, HER2, Erk, Shc, PI3K y pan-citoqueratina. Se uso una serie de dilucion doble de cada anticuerpo de captura (0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml y 0,0625 mg/ml) y de cada dilucion del anticuerpo se hicieron siembras dobles y cuadruples.
2) Despues de secarla por la noche, la placa se bloqueo con tampon de bloqueo Whatman.
3) Se anadieron 80 pl de lisado celular sobre cada bloque, diluido 10 veces en serie. La placa se incubo durante dos horas a temperatura ambiente.
4) Despues de seis lavados con TBS-Tween se anadieron a las placas 80 pl de anticuerpos detectores para el ensayo de proximidad, diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1%. Como anticuerpos detectores se usaron: (1) un anticuerpo monoclonal anti-RFCE, conjugado directamente con glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado directamente con HRP. La incubacion tuvo lugar durante 2 horas a temperatura ambiente.
5) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado con biotina. En estos casos, despues de seis lavados se incluyo una etapa adicional subsiguiente de incubacion con estreptavidina-HRP durante 1 hora.
6) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un conjugado del anticuerpo anti-RFCE con glucosa oxidasa a traves de un oligonucleotido. Se empleo el conjugado directo de HRP con el anticuerpo de RFCE fosforilado o mediante biotina-estreptavidina (SA).
7) Para detectar el HER2 total y la protema fosforilada, las etapas 4), 5) o 6) se llevaron a cabo empleando un anticuerpo monoclonal detector del hER2 en vez del anticuerpo monoclonal detector del RFCE.
8) Para la amplificacion de la senal se agregaron 80 pl de biotina-tiramida a 5 mg/ml y se dejo reaccionar durante 15 minutos. La placa se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.
9) Se anadieron 80 pl de SA-Alexa 555 y se incubo durante 30 minutos. Luego la placa se lavo dos veces, se seco durante 5 minutos y se barrio en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.; Waltham, MA).
La figura 14 muestra un ejemplo de forma de ejecucion del formato de la micromatriz direccionable. Cinco dianas son asequibles mediante anticuerpos de captura espedficos (p.ej. RFCE, HER2, Shc, Erk y PI3K). Los complejos fosforilados de Shc, Erk o PI3K con RFCE o HER2 se pueden detectar sobre esta matriz empleando el formato de deteccion dual de proximidad. La pan-citoqueratina (PanCK) sirve de control para normalizar al numero de celulas epiteliales.
La figura 15 muestra la deteccion de los niveles de Shc fosforilado en un analisis de valoracion de celulas A431 estimuladas. La matriz direccionable facilita simultaneamente informacion sobre la fosforilacion de RFCE y HER2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 6. Extension del rango dinamico de las micromatrices de deteccion dual de proximidad.
Este ejemplo explica que el rango dinamico para el analisis de los estados de activacion de moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion se puede aumentar realizando una serie de dilucion del anticuerpo de captura en un ensayo multiplex de gran rendimiento, con una micromatriz de deteccion dual de proximidad:
1) Se imprimieron anticuerpos de captura en una placa FAST de 16 bloques (Whatman Inc.). Cada anticuerpo de captura se diluyo en serie 2 veces para un total de nueve concentraciones (1 mg/ml inicial; 0,004 mg/ml final).
2) Despues de secarla por la noche, la placa se bloqueo con tampon de bloqueo Whatman.
3) Se anadieron 80 pl de lisado celular sobre cada bloque, diluido 10 veces en serie. La placa se incubo durante dos horas a temperatura ambiente.
4) Despues de seis lavados con TBS-Tween se anadieron a las placas 80 pl de anticuerpos detectores para el ensayo de proximidad, diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1%. Como anticuerpos detectores se usaron: (1) un anticuerpo monoclonal anti-RFCE, conjugado directamente con glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado directamente con HRP. La incubacion tuvo lugar durante 2 horas a temperatura ambiente.
5) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado con biotina. En estos casos, despues de seis lavados se incluyo una etapa adicional subsiguiente de incubacion con estreptavidina-HRP durante 1 hora.
6) Como alternativa, en la etapa de deteccion se empleo un conjugado del anticuerpo anti-RFCE con glucosa oxidasa a traves de un oligonucleotido. Se empleo el conjugado directo de HRP con el anticuerpo de RFCE fosforilado o mediante biotina-estreptavidina (SA).
7) Para la amplificacion de la senal se agregaron 80 pl de biotina-tiramida a 5 mg/ml y se dejo reaccionar durante 15 minutos. La placa se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.
8) Se anadieron 80 pl de SA-Alexa 555 y se incubo durante 30 minutos. Luego la placa se lavo dos veces, se seco durante 5 minutos y se barrio en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.; Waltham, MA).
La figura 16 muestra las curvas de dilucion de un anticuerpo de captura anti-RFCE. Mediante el empleo de matrices direccionables, el RFCE fosforilado y total se detecto al nivel celular simple para celulas A431 estimuladas. El rango dinamico de este ensayo fue superior a 5 logs. Cada curva individual tuvo un rango dinamico aproximado de 2 logs, pero el rango dinamico se incremento de manera significativa combinando los datos de las 6 curvas informativas.
Ejemplo 7 Conjugacion de oligonucleotidos con anticuerpos.
Este ejemplo explica un procedimiento de conjugacion y control de calidad para generar anticuerpos o enzimas conjugados con oligonucleotidos.
Conjugacion:
1) Se sintetizaron oligonucleotidos conectores 72-meros con un grupo 5'-SH y un espaciador de 6-carbonos.
2) Los oligonucleotidos conectores liofilizados se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4. Luego se trataron 125 nmoles de conectores con TCEP-HCl 0,5 M (Pierce; Rockford, IL), a una concentracion final de 50 mM, a la temperatura ambiente durante 2 horas. El Tris, la TCEP y los conectores no conjugados se eliminaron por centrifugacion en una columna desaladora.
3) Los oligonucleotidos conectores desprotegidos resultantes se conjugaron con las aminas primarias de protemas diana (p.ej. anticuerpos o enzimas) empleando un reticulador heterobifuncional tal como SMCC en un volumen de reaccion de 100 ml.
4) La mezcla reactiva se incubo a temperatura ambiente durante 2 h. Los anticuerpos o enzimas conjugados con oligonucleotidos se purificaron por filtracion en gel con una columna Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare; Piscataway, NJ).
Calificacion de los conjugados:
1) Despues de conjugar las moleculas de glucosa oxidasa (GO) con un primer oligonucleotido conector se recogieron tras la purificacion tres fracciones de los GO-oligonucleotidos resultantes y se imprimieron sobre placas recubiertas de nitrocelulosa diluidas 10 veces en serie.
2) Se conjugo IgG con Alexa 647 y con un segundo oligonucleotido conector que presentaba una secuencia complementaria del primer oligonucleotido conector. Los anticuerpos resultantes conjugados con Alexa 647- oligonucleotido se aplicaron sobre el chip y se hibridaron en tampon 1X PBS durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron varias veces.
3) Las placas se secaron y se examinaron con un escaner de micromatriz para confirmar la hibridacion espedfica de la secuencia nucleotida.
4) Un ensayo enzimatico con glucosa oxidasa confirmo que el proceso de conjugacion no altero la funcion del enzima.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La figura 17 demuestra que los anticuerpos conjugados con Alexa 647-oligonucleotido teman la mayor afinidad de fijacion por los GO-oligonucleotidos en las fracciones 13-15.
Ejemplo 8. Anticuerpos conjugados con oligonucleotidos para la deteccion simultanea del RFCE total y fosforilado.
Este ejemplo explica un ensayo multiplex de gran rendimiento con una micromatriz, para analizar los estados de activacion de moleculas transductoras de senales en celulas de rara circulacion, empleando los oligonucleotidos conjugados descritos en el ejemplo 7:
1) Se imprimio anticuerpo de captura en una placa FAST de 16 bloques (Whatman Inc.).
2) Despues de secarla por la noche, la placa se bloqueo con tampon de bloqueo Whatman.
3) Se anadieron 80 pl de lisado celular sobre cada bloque, diluido 10 veces en serie. La placa se incubo durante dos horas a temperatura ambiente.
4) Despues de seis lavados con TBS-Tween se anadieron a las placas 80 pl de anticuerpos detectores para el ensayo de proximidad, diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1%. Como anticuerpos detectores se usaron: (1) un anticuerpo monoclonal anti-RFCE, conjugado directamente con Alexa 647 y un oligonucleotido conector que comprende una secuencia complementaria de un oligonucleotido conector conjugado con glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal detector de RFCE fosforilado, conjugado directamente con peroxidasa de rabano picante (HRP). El conjugado de Alexa 647-oligonucleotido anti-RFCE se puso en contacto con el GO-oligonucleotido para formar el complejo representado en la figura 18. El exceso de reactivos no fijados se elimino lavando seis veces con TBS-Tween.
5) Luego se anadio glucosa a la reaccion, junto con tiramida-Alexa 555.
6) Los niveles totales de RFCE se detectaron por fijacion directa del anticuerpo anti-RFCE conjugado con Alexa 647- oligonucleotido. El RFCE fosforilado se detecto mediante la fijacion de proximidad del GO-oligonucleotido al anticuerpo anti-RFCE conjugado con HRP y se visualizo por amplificacion de la senal de tiramida.
7) La placa se analizo con un laser espedfico para Alexa 647 y Alexa 555 en un escaner de micromatriz (Perkin- Elmer, Inc.).
La figura 19 muestra la deteccion simultanea de RFCE total y RFCE fosforilado. El RFCE total (t-RFCE) se detecto mediante un ensayo de fijacion directa a partir de tan solo 10 celulas y el RFCE fosforilado (p-RFCE) se detecto a partir de una celula. Con el metodo de amplificacion de la senal de proximidad se detectaron 10e5 de moleculas de p-RFCE. El lfmite de deteccion de p-RFCE se incremento mas de 100 veces con el uso del formato de ensayo de proximidad.
Ejemplo 9. Deteccion de la senalizacion de celulas tumorales circulantes (CTC) en pacientes de cancer de mama.
La fabricacion y el procesamiento de micromatrices estan adaptados a partir de metodos descritos por Chan y otros, Nat. Med., 10:1390-1396 (2004). Se transfieren a una placa de polipropileno de 384 pocillos (de 50 pl/pocillo) anticuerpos (1 mg/ml) contra los transductores de senales RFCE, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF-1R, Akt, Erk, p70S6K, Bad, Rsk, Mek, cSrc, citoqueratina, tubulina, p-actina y anticuerpo anti-raton (control positivo) (matriz 4/4), usando una micromatriz robotica de impresion de contacto (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA) provista de agujas solidas para sembrar anticuerpos en placas FAST® (Whatman Inc.; Florham Park, NJ). Se utilizan placas recubiertas con 8 bloques sectorizados. Tras la impresion se bloquean las placas con una solucion de casema al 3%. Las placas se guardan en condiciones secas antes del uso, al menos durante la noche.
Los criterios de seleccion de pacientes, metodos de preparacion de muestras y diseno del estudio estan adaptados a partir de estudios publicados que evaluan celulas tumorales circulantes en mujeres supuestamente afectadas de cancer de mama (p.ej. Wulfing y otros, Clin. Cancer Res., 12:1715-1720 (2006); y Reinholz y otros, Clin. Cancer Res., 11:3722-3732 (2005)). Las mujeres con una anormalidad pectoral detectada por imagen que deben someterse a una biopsia de mama son candidatas para este estudio. Al menos cuarenta y dos pacientes diagnosticadas de cancer de mama primario estan incluidas. Al menos treinta y cinco pacientes no tienen ningun signo manifiesto de metastasis en el momento del diagnostico primario. Al menos siete pacientes tienen metastasis distantes en el momento del diagnostico y se consideran como grupo de referencia positivo. Ninguna de las pacientes tiene historial previo de cancer. Se anota de cada paciente la edad y la informacion sobre el tratamiento (p.ej. terapia quirurgica, quimioterapia, radioterapia, terapia endocrina, etc.). Se recogen aproximadamente 20 ml de sangre de cada paciente y se asigna un numero de identificacion unico a todas las muestras de sangre. Todos los ensayos se realizan sin que los investigadores conozcan los resultados de la biopsia.
Se anade sangre periferica (18 ml) a un sistema Accuspin Histopaque-1077 (Sigma Aldrich; St. Louis, MO) y se centrifuga a 1.500 rpm durante 10 minutos en una centnfuga de mesa Beckman CS-6R (Beckman Instruments; Palo Alto, CA). Se elimina la capa de celulas mononucleares, se lava dos veces con PBS y se diluye a 1 ml con PBS/ albumina de suero bovino al 0,1%. Las celulas epiteliales se enriquecen por captura inmunomagnetica mediante anticuerpos contra Ber-EP4 fijados a perlas magneticas, empleando el kit Dynabeads Epithelial Enrich conforme a las instrucciones del fabricante (Dynal AS; Oslo, Noruega). Las celulas se mezclan con 1-107 perlas en un volumen de 20 ml agitando durante 1 hora. El anticuerpo Ber-EP4 reconoce dos glicoprotemas sobre la superficie y en el citoplasma de celulas epiteliales, excepto en las capas superficiales de celulas epiteliales escamosas, hepatocitos y
5
10
15
20
25
30
35
40
celulas parietales. La suspension se pone sobre un iman, al menos durante 6 minutos, y el sobrenadante se elimina cuidadosamente. Las celulas fijadas a las perlas magneticas se lavan tres veces con 1 ml de PBS/albumina de suero bovino al 0,1%. Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), heregulina (100 nM) e IGF (100 nM) a las celulas y se incuba a 37°C durante 5 minutos. Las celulas se concentran y se lisan con el tampon de lisis/fijacion suministrado con el kit. La suspension del lisado celular (con las perlas fijadas) se almacena a -80°C hasta el procesamiento.
Metodo de ensayo 1: se aplican lisados (40 jl) a la matriz, se incuban durante la noche y se lavan tres veces con tampon de lavado. Se anade a la matriz anticuerpo anti-fosfo marcado con HRP (conjugado del modo descrito p.ej. en Kuhlmann, Immuno Enzyme Techniques, Verlag Chemie, Weinheim, p. 1-162 (1984)) contra cada uno de los transductores de senales y anticuerpo anti-total (es decir, independiente del estado de activacion) marcado con glucosa oxidasa (conjugado del modo descrito p.ej. en Kuhlmann, arriba citado), se incuba durante 2 horas y se lava tres veces con tampon de lavado. Se incorpora el reactivo de tiramida (Molecular Probes) y glucosa y la reaccion se desarrolla durante 1 hora y se lava tres veces. La matriz se incuba con estreptavidina-HRp durante 30 minutos y se lava y desarrolla con luminol intensificado (Molecular Probes). La senal se detecta con una camara CCD.
Metodo de ensayo 2: se transfieren anticuerpos (1 mg/ml) contra 2,4-dinitrofenol (DNP) a una placa de polipropileno de 384 pocillos (5 jl/pocillo) empleando una micromatriz robotica de impresion de contacto (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA) provista de agujas solidas para sembrar anticuerpos en placas FAST® (Whatman Inc.; Florham Park, NJ). Se utilizan placas recubiertas con 8 bloques sectorizados. Tras la impresion se bloquean las placas con una solucion de casema al 3%. Las placas se guardan en condiciones secas antes del uso, al menos durante la noche.
El lisado (40 jl) se mezcla con anticuerpo total marcado con DNP contra cada uno de los transductores de senales arriba mencionados, anticuerpo anti-fosfo marcado con Oligo y Alexa Fluor® 647 y anticuerpo anti-total marcado con Oligo y Alexa Fluor® 647, se anade a los anticuerpos anti-DNP, se incuba durante la noche y se lava tres veces con tampon de lavado. Se anade 2,4-dinitrolisina (Molecular Probes) para liberar los inmunocomplejos de los anticuerpos anti-DNP. Los inmunocomplejos liberados se anaden a una matriz “codigo Zip” (vease p.ej. Keramas y otros, Lab Chip, 4:152-158 (2004); y Delrio-Lafreniere y otros, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 48:23-31 (2004)) y se incuba por la noche. La matriz se lava tres veces y la placas procesadas se examinan mediante un escaner de micromatrices GenePix 4000A (Axon Scanner) con una resolucion de 10 micras.
Ejemplo 10. Deteccion de la senalizacion de celulas endoteliales circulantes (CEC) y de celulas precursoras endoteliales circulantes (CEP) en pacientes de cancer de mama.
Se emplean las mismas muestras de paciente, la misma preparacion de muestras y los mismos metodos de ensayo descritos en el ejemplo 9, exceptuando que las celulas CEC y CEP se enriquecen por captura inmunomagnetica mediante el anticuerpo monoclonal P1H12 o CD 146 fijado a perlas magneticas Dynabeads. Se fabrica y procesa una micromatriz empleando los metodos descritos en el ejemplo 9, exceptuando que los anticuerpos seleccionados son espedficos para los siguientes analitos: VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, TIE1, TIE2, PDGFR-a, PDGFR-p, FGFR1, FGFR2, Akt, Erk, p70S6K, Rsk, cSrc y p-actina. Los metodos de ensayo descritos en el ejemplo 9 se usan para detectar la senalizacion de CEC y CEP.
Claims (11)
Hide Dependent
translated from
Claims (11)
Hide Dependent
translated from
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Kit para llevar a cabo un metodo con matrices de anticuerpos para uno o mas analitos, que comprende:(a) una serie de dilucion de varios anticuerpos de captura fijados sobre un soporte solido espedfico para uno o mas analitos; y(b) varios anticuerpos de deteccion espedficos de uno o mas analitos, incluyendo(i) varios anticuerpos independientes del estado de activacion, marcados con glucosa oxidasa, y(ii) varios anticuerpos dependientes del estado de activacion, marcados con una peroxidasa, de modo que la de ambos (i) y (ii) a un analito aproxima suficientemente la glucosa oxidasa a la peroxidasa, con lo cual una generada por la glucosa oxidasa puede ser canalizada a la peroxidasa y como resultado se genera una detectable y/o amplificable.
- 2. El kit de la reivindicacion 1, que ademas incluye un reactivo de tiramida.
- 3. El kit de la reivindicacion 1, en el cual varios anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con glucosa oxidasa y varios anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con peroxidasa.
- 4. Uso del kit de la reivindicacion 1 para llevar a cabo un metodo con matrices de anticuerpos, de modo que la muestra utilizada en el metodo se elige del grupo formado por sangre entera, suero, plasma, orina, esputos, lfquido de lavado bronquial, lagrimas, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva, aspirado con aguja fina y combinaciones de los mismos.
- 5. Uso del kit segun la reivindicacion 4, aislando las celulas de la muestra por separacion inmunomagnetica.
- 6. Uso del kit segun la reivindicacion 5, lisando las celulas aisladas para producir un extracto celular.
- 7. Uso del kit segun la reivindicacion 5, seleccionando las celulas aisladas del grupo constituido por celulas tumorales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas madre cancerosas y combinaciones de las mismas.
- 8. Uso del kit segun la reivindicacion 5, estimulando in vitro las celulas aisladas con factores de crecimiento.
- 9. Uso del kit segun la reivindicacion 8, lisando las celulas aisladas despues de estimularlas con factores de crecimiento, para producir un extracto celular.
- 10. Uso del kit segun la reivindicacion 4, de manera que uno o mas analitos comprenden varias moleculas transductoras de senales.
- 11. El kit de la reivindicacion 1, en el cual el soporte solido esta seleccionado del grupo constituido por vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas, haces de fibras y combinaciones de ellos.unionsenalsenal