WO2012086802A1 - 癌細胞の検出方法 - Google Patents

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WO2012086802A1
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cell
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labeled
labeling substance
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英紀 高木
伊藤　博史
昌弘 小塚
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アークレイ株式会社
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Definitions

  • the present invention is as follows. [1] Contacting a peripheral blood-containing sample containing a test cell with a labeling substance in vitro, incorporating the labeling substance into the test cell, and labeling the test cell; and A method for detecting a cancer cell, comprising detecting, from the test cell, a cell having a higher degree of labeling with the labeling substance than a normal cell in a peripheral blood-containing sample as a cancer cell. [2] The method according to [1], wherein the labeling substance is a substance labeled with a fluorescent substance or a precursor of the fluorescent substance, and the detection includes obtaining a fluorescence intensity of the test cell labeled with the fluorescent substance. The detection method described.
  • a peripheral blood-containing sample containing a test cell and a labeling substance are contacted in vitro, the labeling substance is taken into the test cell, and the test cell is used. Labeling, and detecting, as cancer cells, cells having a higher degree of labeling with the labeling substance than the normal cells in the peripheral blood-containing sample.
  • a peripheral blood-containing sample containing a test cell and a labeling substance are contacted in vitro (hereinafter, also referred to as “contacting step”), and the test cell is used for the labeling.
  • a substance is taken up (hereinafter also referred to as “uptake step”), metabolized as necessary, and the test cell is labeled (hereinafter also referred to as “labeling step”), and from the test cell, Detecting a cell having a higher degree of labeling with the labeling substance than a normal cell in a peripheral blood-containing sample as a cancer cell (hereinafter also referred to as “detection step”).
  • the labeling of the sugar is not particularly limited as long as it is generally used in the art, and a labeling substance usually used for labeling a biological substance can be used.
  • a labeling substance usually used for labeling a biological substance examples include an enzyme that catalyzes a color reaction, a fluorescent substance, a radioisotope, biotin, and the like.
  • an enzyme, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance is preferable.
  • labels with fluorescent substances are preferred. By using a label with a fluorescent substance, for example, it can be easily detected based on the fluorescence intensity.
  • Fluorescent substance precursors include, for example, substances that are taken into cells to be described later to produce protoporphyrin 9.
  • the unnatural amino acid may be an amino acid derivative that is transported into the cell via the same amino acid transporter as the natural amino acid.
  • Benzoacrylony (Bacd) group acidine (Acd), 7-dimethylaminocoumarin-4-acetic acid (DMACA), 5-((2-Aminoethyl) amino) naphthalene-1 -It can be labeled with sulfonic acid (EDANS), naphthphalene (Nap), anthracene (Ant), but is not limited thereto.
  • the labeled amino acids may be used alone or in combination of two or more.
  • aminolevulinic acid methyl aminolevulinate, ethyl aminolevulinate, propyl aminolevulinate, hexyl aminolevulinate, heptyl aminolevulinate, octyl aminolevulinate and the like
  • aminolevulinic acid methyl ester aminolevulinate ethyl
  • esters of aminolevulinic acid and its derivatives such as ester, aminolevulinic acid propyl ester, aminolevulinic acid hexyl ester, aminolevulinic acid heptyl ester, and aminolevulinic acid octyl ester, or their hydrochlorides, sulfonates, ester phosphates, esters Salts of aminolevulinic acid and its derivatives such as sulfonate, phosphate, nitrate, sulfate, etc., and esters of aminolevulinic acid and their derivatives It includes salts of esters of.
  • aminolevulinic acid (trade name: 5-aminolevulinic acid hydrochloride) manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.
  • aminolevulinic acid methyl ester (trade name: 5-aminolevulinic acid methylester hydrochloride) manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • aminolevulinic acid (trade name: 5-aminolevulinic acid hydrochloride) manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.
  • aminolevulinic acid methyl ester (trade name: 5-aminolevulinic acid methylester hydrochloride) manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the labeling substance As the labeling substance, the labeled sugar, the labeled amino acid, or a substance that is taken into cells and metabolized to protoporphyrin 9 may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • the labeling substance can be used in combination with the labeled sugar and the labeled amino acid.
  • the labeling substance used for labeling the labeled sugar and the labeling substance used for labeling the labeled amino acid have equivalent fluorescence characteristics.
  • a combination of those having equivalent fluorescence characteristics a combination having a difference in maximum absorption wavelength within 75 nm and a difference in maximum fluorescence wavelength within 150 nm may be used.
  • the peripheral blood sample to be examined in the present invention corresponds to blood collected from a subject.
  • the subject is not particularly limited, and includes humans, primates such as monkeys, rodents such as mice or rats, domestic animals such as pigs, cows and horses, and pet animals such as dogs, cats and rabbits. There may be.
  • the peripheral blood sample only needs to be collected from venous blood by the method of collection. In order to adjust the density of the peripheral blood sample, it may be diluted to a predetermined concentration with an appropriate diluent.
  • the peripheral blood sample diluent that can be used for diluting the peripheral blood is preferably an osmotic pressure that is close to the osmotic pressure of the cell, and is not particularly limited as long as it is normally used.
  • physiological saline Phosphate buffer (PBS), Tris-HCl buffer, citrate-phosphate buffer, citrate buffer and the like.
  • the pH of the peripheral blood sample diluent may generally be in the range of pH 5 to pH 9.
  • the contact between the peripheral blood-containing sample and the labeling substance is not particularly limited, and usually, the labeling substance having a predetermined concentration may be added to the peripheral blood-containing sample (hereinafter referred to as “addition”). Also referred to as a "process"). For example, it may be added to the peripheral blood-containing sample so that the concentration of the labeling substance (final concentration) is 0.1 ⁇ M to 100 mM. For example, it may be added to the peripheral blood-containing sample so that the concentration (final concentration) of the labeling substance is preferably 0.3 ⁇ M to 75 mM. For example, it may be added to the peripheral blood-containing sample so that the concentration (final concentration) of the labeling substance is 1 ⁇ M to 50 mM.
  • the labeled sugar can be used at a concentration (final concentration) of 0.01 mM to 100 mM. Further, from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells, suppression of false positive rate, etc., the labeled sugar having a concentration (final concentration) of 0.05 mM to 75 mM can be used. More preferably, the labeled sugar at a concentration (final concentration) of 0.1 mM to 50 mM can be used from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells and suppression of false positive rate.
  • the labeled amino acid having a concentration (final concentration) of 0.1 ⁇ M to 100 mM can be used from the viewpoint of, for example, detection sensitivity of cancer cells.
  • the labeled amino acid at a concentration (final concentration) of 0.5 ⁇ M to 50 mM can be used from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells and suppression of false positive rate.
  • the labeled amino acid at a concentration (final concentration) of 1 ⁇ M to 10 mM can be used from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells and suppression of false positive rate.
  • the aminolevulinic acid or a derivative thereof at a concentration (final concentration) of 0.01 mM to 100 mM may be used from the viewpoint of, for example, detection sensitivity of cancer cells. it can. Further, from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells, suppression of false positive rate, etc., the aminolevulinic acid and derivatives thereof at a concentration of 0.05 mM to 50 mM (final concentration) can be used. More preferably, the aminolevulinic acid and derivatives thereof at a concentration of 0.1 mM to 10 mM (final concentration) can be used from the viewpoints of detection sensitivity of cancer cells and suppression of false positive rate.
  • an antibody for cell type identification can be contacted in vitro with the peripheral blood-containing sample containing the test cells.
  • a cell type identification antibody By contacting the peripheral blood-containing sample containing the test cells with a cell type identification antibody, various types of cells present in the peripheral blood sample can be individually labeled and recognized. Thereby, for example, the false positive rate can be reduced and the detection of cancer cells can be simplified.
  • the cell type antibody used for reducing the false positive rate May be at least one selected from the group consisting of an anti-CD45 antibody and an anti-CD34 antibody.
  • the cell type antibodies used for simplification of cancer cell detection include anti-cytokeratin (CK) antibody, anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibody, and anti-vimentin antibody. And at least one selected from the group consisting of anti-N-cadherin antibodies can be used.
  • the cell type identification antibodies may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the substance that induces endocytosis can be added to the cell suspension before the contact so that the final concentration of the substance that induces endocytosis is 0.1 ⁇ M to 20 mM.
  • the concentration of the substance that induces endocytosis (final concentration) can be 1 ⁇ M to 10 mM. More preferably, from the viewpoint of, for example, increasing the efficiency of aminolevulinic acid incorporation into test cells, the concentration of the substance that induces endocytosis (final concentration) can be 5 ⁇ M to 2 mM.
  • the ion having the stabilizing action of the cell membrane protein can stabilize the structure of the cell adhesion factor present in the cell membrane protein, or can keep the transporter of substances inside and outside the cell such as ATP-degrading enzyme in an activated state. It is a substance.
  • ions having a stabilizing effect on the cell membrane protein include Mg ions and Ca ions.
  • the Ca ion concentration can be added to the cell suspension before the contact so that the final Ca ion concentration is 0.1 mM to 10 mM.
  • the Ca ion concentration (final concentration) may be 0.25 mM to 5 mM. More preferably, from the viewpoint of, for example, increasing the efficiency of incorporation of aminolevulinic acid and its derivatives into test cells, the concentration of Ca ions (final concentration) can be 0.5 mM to 2 mM.
  • the substance that induces endocytosis and the ions having the stabilizing action of the cell membrane protein may be used alone or in combination of two or more.
  • the Mg ion and the Ca ion can be used in combination from the viewpoint of stabilizing the cell membrane of the test cell.
  • the test substance in the peripheral blood-containing sample is loaded with the labeling substance and labeled.
  • the labeling substance may be taken in by maintaining the contact state between the labeling substance and the test cell.
  • the temperature condition in the contact state here may be any condition as long as the test cell can take up the labeling substance and be labeled with the labeling substance. Such temperature conditions can be performed, for example, under conditions of 1 ° C. to 42 ° C.
  • the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 1 ° C. to 42 ° C. Further, preferably, from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 2 ° C. to 40 ° C. More preferably, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 4 ° C. to 37 ° C. from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 1 ° C. to 42 ° C., for example, from the viewpoint of cancer cell detection sensitivity and the like. Further, preferably, from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 2 ° C. to 40 ° C. More preferably, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 4 ° C. to 37 ° C. from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the uptake step or the labeling step can be performed at a temperature of 30 ° C. to 42 ° C. from the viewpoint of, for example, cancer cell detection sensitivity.
  • the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 33 ° C. to 42 ° C. More preferably, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 35 ° C. to 40 ° C. from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the uptake step and the labeling step are performed at a temperature of 1 ° C. to 42 ° C. from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells, for example. be able to. Further, preferably, from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 2 ° C. to 40 ° C. More preferably, the uptake step and the labeling step can be performed at a temperature of 4 ° C. to 37 ° C. from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the contact time can be set to 1 minute to 2 hours, for example, from the viewpoint of cancer cell detection sensitivity.
  • the contact time can be 2 to 60 minutes, for example, from the viewpoint of improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate. More preferably, the contact time can be 3 to 30 minutes from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the contact time can be set to 10 minutes to 5 hours from the viewpoint of detection sensitivity of cancer cells, for example.
  • the contact time is preferably 15 minutes to 120 minutes from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate. More preferably, the contact time can be set to 30 minutes to 90 minutes from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the “contact time” in the case where the labeling substance is the aminolevulinic acid and derivatives thereof is normal because the test cell can take up the labeling substance and metabolize in the cell. It is necessary that the degree of labeling with the cell labeling substance and the degree of labeling with the cancer cell labeling substance are different.
  • the contact time can be set to 1 minute to 2 hours from the viewpoint of, for example, detection sensitivity of cancer cells.
  • the contact time can be 2 to 60 minutes, for example, from the viewpoint of improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate. More preferably, the contact time can be 3 to 30 minutes from the viewpoint of, for example, improving the detection sensitivity of cancer cells and suppressing the false positive rate.
  • the final concentration of aminolevulinic acid and its derivatives is 0.01 mM to 100 mM
  • the contact time is 10 minutes to 5 hours
  • the contact temperature is 30. It can be set to °C-42 °C.
  • the final concentration of aminolevulinic acid and its derivatives and their derivatives is 0.05 mM to 50 mM
  • the contact time is 15 minutes to 120 minutes
  • the contact temperature is 33 It can be set to °C-42 °C.
  • the final concentration of the labeled sugar and labeled amino acid is 1 ⁇ M to 50 mM
  • the contact time is 3 minutes to 30 minutes
  • the contact temperature is 4 ° C. Up to 37 ° C.
  • the degree of labeling with the labeling substance may be determined by a method according to the type of labeling substance in the labeling substance. For example, when the labeling substance is an enzyme, a substrate for the enzyme is added and reacted, and the degree of coloration generated can be set as the degree of labeling with the labeling substance.
  • the labeling substance is the fluorescent substance, it was generated by irradiating the sample with the labeling substance and irradiating the sample with the excitation light after being metabolized in the cells as necessary.
  • the intensity of fluorescence can be the degree of labeling with the labeling substance.
  • detection of cancer cells based on the degree of color development or fluorescence intensity may be performed by visual observation, or may be performed by measurement values obtained by measuring absorbance or fluorescence intensity, respectively.
  • the detection of cells may be detection of the fluorescence intensity of the test cells labeled with the fluorescent substance.
  • the detection of the cells is at least one of detection of the average fluorescence intensity of the test cells labeled with the fluorescent substance and detection of the total fluorescence intensity of the fluorescent substance from the viewpoint of detection accuracy of cancer cells. Also good.
  • the detection of the cells can be performed based on the size of the test cell labeled with the fluorescent substance from the viewpoint of simple noise or platelet removal.
  • cells larger than the amount of the labeling substance taken up by normal cells can be detected as cancer cells.
  • cells are detected as cancer cells at least twice as much as the amount of labeled sugar taken up by normal cells as cancer cells. More preferably, it is more preferable to detect at least 5 times more cells as cancer cells.
  • the degree of labeling of normal cells in peripheral blood with the labeling substance may be based on cells that can normally be present in the peripheral blood of a healthy subject.
  • the degree of labeling with the labeling substance is already known in the literature under the same conditions, the literature value may be applied.
  • the method for detecting a cancer cell in the present invention may include isolating the detected cancer cell. Thereby, for example, it is possible to provide a sample for further studying the state and type of detected cancer cells.
  • an isolation method according to the type of the labeling substance may be selected, or an isolation method not restricted by the type of the labeling substance may be selected.
  • an isolation method according to the type of the labeling substance for example, when the labeling substance is labeled with a fluorescent substance, a cell sorter or the like is known in the art for separating cells based on fluorescence intensity. The method can be applied.
  • an isolation method that is not restricted by the type of the labeling substance an isolation method based on the size and form of cells can be applied.
  • a set of light spots obtained by combining adjacent light spots extracted in step 102 and having a predetermined size or more is extracted as an object. Further, an identification number for identifying each object is assigned to each extracted object.
  • the determination as to whether or not the size is a predetermined size can be made, for example, based on whether or not the diameter of the set of light spots is equal to or greater than a predetermined threshold Rth.
  • the threshold value Rth can be determined based on the size of the cell indicated by the set of light spots in consideration of the magnification of the image. For example, the threshold value Rth is 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 9 ⁇ m, more preferably 3 ⁇ m to 8.5 ⁇ m.
  • the present invention is not limited to the case where the diameter of the set of light spots is used, and it may be determined whether or not the size is equal to or larger than a predetermined size depending on whether or not the total number of pixels included in the set of light spots is equal to or larger than a predetermined number.
  • step 114 a cancer cell positive rate or a blood cell negative rate is calculated based on the number of objects extracted as cancer cells counted in step 110 and the total number of cells counted in step 116. Then, the image analysis processing routine ends.
  • step 108 the case where the average fluorescence intensity of each object is calculated has been described. However, the total fluorescence intensity that is the sum of the fluorescence intensity of each pixel included in each object may be calculated.
  • an image analysis processing routine shown in FIG. 2 is executed.
  • a set of light spots obtained by combining adjacent light spots extracted in step 202 and having a predetermined size or more is extracted as an object. Further, an identification number for identifying each object is assigned to each extracted object.
  • the determination as to whether or not the size is a predetermined size can be made, for example, based on whether or not the diameter of the set of light spots is equal to or greater than a predetermined threshold Rth.
  • the threshold value Rth can be determined based on the size of the cell indicated by the set of light spots in consideration of the magnification of the image. For example, the threshold value Rth is 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 9 ⁇ m, more preferably 3 ⁇ m to 8.5 ⁇ m.
  • step 306 the fluorescence image using the labeling substance and the fluorescence image using the cell type identification antibody (for false positive identification) are superimposed, and either of the objects set in step 304 is selected. Also in the fluorescence image, cells having fluorescence are excluded from positive cells as false positive cells.
  • step 308 the fluorescence image using the labeling substance and the fluorescence image using the cell type identification antibody (for cancer cell detection) are superimposed, and either of the objects set in step 304 is selected. Also in the fluorescence image, cells having fluorescence are counted as positive cells.
  • step 310 the fluorescence image using the labeling substance and the fluorescence image using the cell type identification antibody (for cancer cell detection) and the cell type identification antibody (for false positive identification) are superimposed.
  • the cells having fluorescence only in the fluorescence image using the labeling substance are counted as false positive cells.
  • step 312 the cell type identification antibody (for false positive identification) and the cell type identification antibody (for cancer cell detection) are overlapped and only the cell type identification antibody (for cancer cell detection) has fluorescence. Cells are counted as the total number of cancer cells.
  • step 314 the total number of cells in the bright field image acquired in step 300, the number of false positive cells counted in step 310, the number of positive cells counted in 308, and the total number of cancer cells counted in 312 are obtained. Based on this, a cancer cell positive rate or a blood cell false positive rate is calculated, and the image analysis processing routine is terminated.
  • the program is stored in a CD-ROM, a DVD disk, a magneto-optical disk, an IC card, or the like.
  • the program may be read from these storage media and executed when the image analysis processing is executed.
  • the program may be downloaded from a server or the like connected to the network.
  • the image analysis apparatus described above can be realized by a semiconductor integrated circuit (for example, ASIC (Application Specific Integrated Circuit)).
  • Example 1 Serum samples and precipitates are separated from normal human venous blood by centrifugation according to conventional methods, and a portion of the white blood cell layer and red blood cell layer are collected from the serum sample and resuspended in PBS to obtain white blood cells. Samples and red blood cell samples were prepared.
  • Breast cancer cell line MCF-7 purchased from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was added at 37 ° C., 5 ° C. using ⁇ MEM medium (Invitrogen, 10 vol% FBS, L-glutamine 2 mM, penicillin 100 U / mL and streptomycin 100 ⁇ g / mL). The culture was performed in a volume% CO 2 concentration environment. Immediately before the test, cells were collected using EDTA containing 0.25% trypsin, washed with PBS, and a cancer cell line sample was prepared.
  • Cancer cell lines, blood cells (leukocytes and erythrocytes) or a mixture thereof were each 300 ⁇ L (4 ⁇ 10 5 cells / mL) and 10 mM 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole- Samples 1 to 7 were prepared by adding 30 ⁇ L of 4-yl) amino] -2-deoxy-D-glucose (hereinafter 2-NBDG) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as described in Table 2, for 40 minutes at 37 ° C. Incubated at Note that the same amount of PBS was added to the sample to which 2-NBDG was not added.
  • Sample 2 to Sample 7 are a control group for denying the possibility of a difference in the degree of detection of cancer cells for so-called experimental procedures.
  • sample 2 is a control group for ensuring that cancer cells can be recognized by the labeled saccharide (the possibility of inhibition of uptake due to the presence of blood cells is denied).
  • Sample 3 is a control group for confirming that blood cells are not stained with anti-EpCAM antibody.
  • Sample 4 is a control group for negating the possibility that the work of mixing blood cells and cancer cells affects the uptake of labeled sugars of blood cells.
  • Sample 5 is a control group for confirming that cancer cells are stained with EpCAM antibody.
  • Sample 6 and Sample 7 are a control group for negating the possibility of the effect of double labeling cancer cells in the presence of blood cells. Control experiments in these control groups denied the possibility of differences in the degree of cancer cell detection for so-called procedural reasons (data not shown).
  • the sample 1 in which the cancer cell line and the blood cell are mixed has a mixture of cells labeled with 2-NBDG and cells not labeled (FIG. 4). 4 and FIG. 5), and cells labeled with 2-NBDG were confirmed to be cells stained with an anti-EpCAM antibody, respectively (see FIG. 6). Therefore, by using 2-NBDG, the cancer cell line in the mixed sample was clearly observed as a fluorescence image. On the other hand, white blood cells were observed with a fluorescence microscope field of view, but were much weaker than the fluorescence image of cancer cells, and the fluorescence intensity was less than half. Since the red blood cells had little activity, no fluorescence image was observed.
  • Example 2 ⁇ Preparation of blood cells> Blood is collected from a human using a vacuum blood collection tube (with EDTA / 2K). Blood cell separation is performed according to the package insert of HetaSep (STEMCELL). ⁇ Preparation of cancer cells> The cultured human fibrosarcoma cell line (HT1080: DS Pharma Biomedical) was collected by trypsin (Invitrogen) according to a conventional method. The human gastric cancer cell line (SNU-1: ATCC) which is a floating system is recovered as it is without being treated with trypsin. The collected cell suspension of cancer cells is centrifuged and the supernatant is removed.
  • HT1080 DS Pharma Biomedical
  • SNU-1 human gastric cancer cell line
  • the concentration of 2-NBDG added is 0.1 mM to 10 mM
  • the reaction temperature is 4 ° C. to 37 ° C.
  • the reaction time is 5 minutes or more
  • the average fluorescence intensity threshold is 280. It became clear that it should be ⁇ 1150. Further, it has been clarified that even when hemolysis is applied to remove a large amount of mixed red blood cells, the cancer cells are not affected and are not affected by the hemolysis.
  • Example 3 ⁇ Preparation of blood cells> Blood is collected from a human using a vacuum blood collection tube (with EDTA / 2K). Blood cell separation is performed according to the package insert of HetaSep (STEMCELL). ⁇ Preparation of cancer cells> According to a conventional method, a cultured human prostate cancer cell line (PC3: DS Pharma Biomedical) is collected using trypsin (Invitrogen). The human gastric cancer cell line (SNU-1: ATCC) which is a floating system is recovered as it is without being treated with trypsin. The collected cell suspension of cancer cells is centrifuged and the supernatant is removed.
  • PC3 DS Pharma Biomedical
  • trypsin Invitrogen
  • SNU-1 ATCC
  • Reaction (culture) is performed at the temperature and time described in Table 5 or Table 6. After the reaction, add Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant. Resuspend in Dulbecco's PBS, centrifuge and remove supernatant again. Resuspend in Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant again 2-3 times to wash the cells thoroughly. Resuspend using Dulbecco's PBS (-), adjust the concentration, and add dropwise to a 384 well plate. Centrifuge the plate to drop the cells to the bottom of the well. Take a picture with a fluorescence microscope (Nikon). Fluorescent filter set: B-2A (Nikon) is used.
  • Example 6 In the same manner as in Example 2, human breast epithelial cancer (cell line name MCF-7: DS Pharma Biomedical), human colon adenocarcinoma (cell line name SW620: DS Pharma Biomedical), human prostate cancer (cell line) Name PC3: DS Pharma Biomedical), human alveolar epithelial cancer (cell line name NCI-H358: DS Pharma Biomedical), human gastric cancer (cell line name SNU-1: ATCC) and human fibrosarcoma (cell line name) HT1080: DS Pharma Biomedical Co.) was used to detect cancer cells with labeled sugar (2-NBDG). The results are shown in Table 10. The final concentration of 2-NBDG is as described in Table 10.
  • Example 8 In the same manner as in Example 4, human breast epithelial cancer (cell line name MCF-7: DS Pharma Biomedical), human colon adenocarcinoma (cell line name SW620: DS Pharma Biomedical), human prostate cancer (cell line) Name PC3: DS Pharma Biomedical), human alveolar epithelial cancer (cell line name NCI-H358: DS Pharma Biomedical), human gastric cancer (cell line name SNU-1: ATCC) and human fibrosarcoma (cell line name) HT1080: DS Pharma Biomedical) was used to detect cancer cells with aminolevulinic acid. The results are shown in Table 12. The final concentration of aminolevulinic acid is as described in Table 12.
  • Human gastric cancer (cell line name SNU-1: ATCC), which is a floating cancer cell line, is recovered as it is without being treated with trypsin.
  • the collected cell suspension of cancer cells is centrifuged and the supernatant is removed. Resuspend in Dulbecco's PBS (-) (Nissui), centrifuge and remove the supernatant again.
  • - Dulbecco's PBS
  • STEMCELL package insert of ammonium chloride
  • H-Ala (2-Bacd) -OH (Watanabe Chemical Co., Ltd.) and 2-NBGD (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added (final concentrations described in Table 13), Suspend cells thoroughly. React at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, add Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant. Resuspend in Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove supernatant again. Resuspend in Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant again 2-3 times to wash the cells thoroughly.
  • the average fluorescence intensity threshold is set to 280 to 490, so that 2-NBDG alone has a low positive rate in gastric cancer cells, It became clear that H-Ala (2-Bacd) -OH alone can detect various types of cancer cells including colon cancer cells with a low positive rate with high sensitivity.
  • Example 10 ⁇ Preparation of cells>
  • the cultured human fibrosarcoma cell line (HT-1080: DS Pharma Biomedical) and human normal skin fibroblast cell line (NHDF: Lonza) are collected using trypsin (Invitrogen). .
  • the collected cell suspension of cancer cells is centrifuged and the supernatant is removed. Then, resuspend in Dulbecco's PBS (+) (Nissui), centrifuge, and remove the supernatant again.
  • Dulbecco's PBS (+) (Nissui)
  • the number of cells is counted using a hemocytometer, and the sample is divided into 10 5 to 10 6 samples (cell suspension).
  • Example 11 ⁇ Preparation of cells>
  • a cultured human breast epithelial cancer cell line (cell line name: MCF-7: DS Pharma Biomedical) is recovered using trypsin (Invitrogen).
  • the collected cancer cell suspension is centrifuged and the supernatant is removed. Resuspend in Dulbecco's PBS (+) (Nissui), centrifuge and remove the supernatant again.
  • Dulbecco's PBS (+) (Nissui), centrifuge and remove the supernatant again.
  • the number of cells is counted using a hemocytometer. Sort 2.8 ⁇ 10 5 cells into one sample.
  • the vertical axis indicates the fluorescence value
  • the horizontal axis indicates the reaction time.
  • a black square is a fluorescence value when Dulbecco PBS (-) not containing Mg ions and Ca ions is used.
  • a black triangle is a fluorescence value when Dulbecco's PBS (+) containing Mg ions and Ca ions is used.
  • the results represented by black squares are the results obtained in the same manner as in Example 11 except that Dulbecco PBS (+) in Example 11 was changed to Dulbecco PBS ( ⁇ ). From this result, it became clear that the reactivity of aminolevulinic acid improves by adding Mg ion and Ca ion in addition to aminolevulinic acid.
  • Example 12 In the same manner as in Example 11 except that aminolevulinic acid dissolved in Dulbecco's PBS (+) was added to 1 mM and 10 ⁇ M Endo-poter (GeneTools) was added during the staining in Example 11. Then, the fluorescence value of the cell suspension was measured. The results are shown in FIG. In FIG. 8, the vertical axis represents the fluorescence value, and the horizontal axis represents the reaction time. A black square is a fluorescence value when Dulbecco PBS (-) not containing Mg ions and Ca ions is used.
  • a black circle is a fluorescence value when Endo-poter is added to Dulbecco's PBS (+) containing Mg ions and Ca ions. From these results, it was revealed that the reactivity of aminolevulinic acid was further improved by adding Endo-porter in addition to aminolevulinic acid, Mg ions and Ca ions.
  • FIG. 9 summarizes the results of Example 11 and Example 12 in one figure. This improves the reactivity of aminolevulinic acid by adding Mg ions and Ca ions (black triangles) to aminolevulinic acid compared to aminolevulinic acid alone (black squares). It was revealed that the reactivity of aminolevulinic acid was further improved by adding Ca ions and Endo-porter (black circles).
  • Example 13 In ⁇ Staining> in Example 3, the labeling substance was changed from H-Ala (2-Bacd) -OH to H-Lys (DMACA) -OH (Watanabe Chemical Co., Ltd.) or H-Glu (EDANS) -OH (Watanabe). (Chemical Industry Co., Ltd.) Also, the wavelength of the fluorescent filter set was changed to EX (excitation wavelength) 365 / ⁇ 10, DM 400 or more, and BA (fluorescence wavelength) 470 ⁇ 20 in accordance with the fluorescence characteristics of the fluorescent substance, and the same as in Example 2. Thus, the fluorescence intensity of the cells was evaluated. The results are shown in Table 15.
  • Example 14 ⁇ Preparation of blood cells> Blood is collected from a human using a vacuum blood collection tube (with EDTA / 2K). Blood cell separation is performed according to the package insert of HetaSep (STEMCELL). ⁇ Preparation of cancer cells> According to a conventional method, a cultured human prostate cancer cell line (PC3: DS Pharma Biomedical) is collected using trypsin (Invitrogen). The collected cell suspension of cancer cells is centrifuged and the supernatant is removed. Resuspend in Dulbecco's PBS (+) (Nissui), centrifuge and remove the supernatant again.
  • PC3 DS Pharma Biomedical
  • a FITC-labeled anti-CD45 antibody (Miltenyi Biotec), a FITC-labeled anti-CD34 antibody (BioLegend), and a PE-labeled anti-EpCAM antibody (Miltenyi Biotec) were added according to the package inserts, respectively, at 23 degrees for 30 minutes. react. After the reaction, add Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant. Resuspend in Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove supernatant again. Resuspend in Dulbecco's PBS (-), centrifuge and remove the supernatant again 2-3 times to wash the cells thoroughly.
  • Wavelength of the fluorescent filter set 2 EX (excitation wavelength) 535 ⁇ 25 nm, DM 575 nm or more, BA (fluorescence wavelength) 590 nm or more.
  • Wavelength of fluorescent filter set 3 EX (excitation wavelength) 475 ⁇ 15 nm, DM 505 nm or more, BA (fluorescence wavelength) 525 ⁇ 10 nm.
  • the acquired image was analyzed using image analysis software (product name NIS-Elements Nikon), and the fluorescence intensity of the cells was evaluated. The results are shown in Table 16.

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Abstract

　被検細胞を含む末梢血含有試料と標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させること、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませて、前記被検細胞を標識させること、及び、前記被検細胞から、末梢血含有試料中の正常細胞の標識度合いよりも、前記標識用物質による標識度合いが強い細胞を、癌細胞として検出すること、を含む癌細胞の検出方法。

Description

癌細胞の検出方法
　本発明は、癌細胞の検出方法に関する。
　特許第３８３４３２６号公報には、免疫ビーズで癌細胞を回収し、抗体で免疫染色などをして検出する方法が開示されている。特開２００１－４１９５９号公報には、癌細胞を特異的に結合するリガンドを固定化した担体を、癌細胞を含む液体と接触させて、担体に結合した癌細胞を標識することによって、癌細胞を検出する方法が開示されている。このほかにも、細胞のサイズで正常細胞と分離した後、免疫染色で検出する方法や、密度勾配遠心で分離した後に免疫染色する方法などもある。また、血液中に含有される癌細胞の検出方法としては、例えば、特許第３８６７９６８号公報には、アデノウイルスを用いて癌細胞に感染させて、蛍光タンパク質を発現させて検出する方法が開示されている。
　しかしながら、特許第３８３４３２６号公報に記載された技術や、その他の免疫染色を用いた方法では、抗原を発現していないと検出できず、検出する場合でも予め標的抗原を特定しておく必要があり、またその標的を持った細胞しか検出できない。特開２００１－４１９５９号公報に開示された技術のように、癌細胞を特異的に結合するリガンドを固定化した担体を利用する方法では、予めこのような担体を調製する必要がある。また、特許第３８６７９６８号公報に記載された技術は、ウィルスを感染させるために培養する必要があり、蛍光測定するまで２４時間ほど時間を要する。
　従って、本発明の目的は、末梢血中の癌細胞を、短時間且つ簡便に検出可能な癌細胞検出方法を提供することである。
　本発明は以下のとおりである。
　［１］　被検細胞を含む末梢血含有試料と標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させること、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませて、前記被検細胞を標識させること、及び、前記被検細胞から、末梢血含有試料中の正常細胞の標識度合いよりも、前記標識用物質による標識度合いが強い細胞を、癌細胞として検出すること、を含む癌細胞の検出方法。
　［２］　前記標識用物質が蛍光物質で標識された物質又は蛍光物質の前駆物質であり、前記検出が前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の蛍光強度を得ることを含む［１］に記載の検出方法。
　［３］　前記標識用物質が蛍光物質で標識された物質又は蛍光物質の前駆物質であり、前記検出が前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の平均蛍光強度及び合計蛍光強度からなる群より選ばれる少なくとも一種を得ることを含む［１］又は［２］に記載の検出方法。
　［４］　前記検出が、さらに前記蛍光物質により標識された前記被検細胞のサイズに基づいて行われる［１］から［３］のいずれかに記載の検出方法。
　［５］　前記標識用物質が、標識化糖、標識化アミノ酸及び細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１］から［４］のいずれかに記載の検出方法。
　［６］　前記標識用物質が、標識化糖及び標識化アミノ酸である［１］から［５］のいずれかに記載の検出方法。
　［７］　前記標識用物質が前記標識化糖であり、前記標識化糖が、標識化単糖である［１］から［６］のいずれかに記載の検出方法。
　［８］　前記標識用物質が前記標識化糖であり、前記標識化糖が、蛍光標識化グルコース誘導体である［１］から［７］のいずれかに記載の検出方法。
　［９］　前記標識用物質が標識化アミノ酸であり、前記アミノ酸が、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１］から［８］のいずれかに記載の検出方法。
　［１０］　前記標識用物質が標識化アミノ酸であり、前記アミノ酸が、中性アミノ酸及び酸性アミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１］から［９］のいずれかに記載の検出方法。
　［１１］　前記標識用物質が細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質であり、前記物質が、アミノレブリン酸及びその誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１］から［１０］のいずれかに記載の検出方法。
　［１２］　前記標識用物質が細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質であり、前記物質がアミノレブリン酸及びその誘導体であり、前記アミノレブリン酸及びその誘導体が、それらの塩、それらのエステル、及びそれらのエステルの塩からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１］から［１１］のいずれかに記載の検出方法。
　［１３］　前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料が溶血処理されている［１］から［１２］のいずれかに記載の検出方法。
　［１４］　前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料に、細胞種識別用抗体をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させることを含む［１］から［１３］のいずれかに記載の検出方法。
　［１５］　前記細胞種識別用抗体が、抗ＣＤ４５抗体及び抗ＣＤ３４抗体からなる群より選ばれる少なくとも一種である［１４］に記載の検出方法。
　［１６］　鉄イオン及び還元剤の存在下において、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる［１］から［１５］のいずれかに記載の検出方法。
　［１７］　エンドサイトーシスを誘導する物質及び細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンからなる群より選ばれる少なくとも一種の存在下において、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる［１］から［１６］のいずれかに記載の検出方法。
　［１８］　０．１μＭ～１００ｍＭの濃度の前記標識用物質を用いて、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる［１］から［１７］のいずれかに記載の検出方法。
　［１９］　１℃～４２℃の条件下において、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、標識させる［１］から［１８］のいずれかに記載の検出方法。
　［２０］　１分～５時間、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、標識させる［１］から［１９］のいずれかに記載の検出方法。
　[２１]　標識用物質と、細胞種識別用抗体及び洗浄液からなる群より選ばれる少なくとも一方とを含む、癌細胞検出用キット。
　本発明によれば、末梢血中の癌細胞を、短時間且つ簡便に検出可能な癌細胞検出方法を提供することができる。
本発明にかかる画像処理の内容を示すフローチャートである。 本発明にかかる画像処理における他の例の内容を示すフローチャートである。 本発明にかかる画像処理における他の例の内容を示すフローチャートである。 本発明の実施例にかかる癌細胞株と血球細胞との混合液（試料１）の蛍光顕微鏡写真像（位相差観察）である。 本発明の実施例にかかる２－ＮＢＤＧを取り込みさせた試料１の蛍光顕微鏡写真像（蛍光観察）である。 本発明の実施例にかかる抗ＥｐＣＡＭ抗体染色した試料１の蛍光顕微鏡写真像（蛍光観察）である。 本発明の実施例にかかるアミノレブリン酸の反応性について示した図である。 本発明の実施例にかかるアミノレブリン酸の反応性について示した図である。 本発明の実施例にかかるアミノレブリン酸の反応性について示した図である。
　本発明の癌細胞検出方法は、被検細胞を含む末梢血含有試料と標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させること、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませて、前記被検細胞を標識させること、及び、前記被検細胞から、末梢血含有試料中の正常細胞の標識度合いよりも、前記標識用物質による標識度合いが強い細胞を、癌細胞として検出すること、を含む。
　本発明の癌細胞検出方法では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、末梢血細胞中の被検細胞に標識用物質を取り込ませ、正常細胞による標識の度合いよりも標識の度合いが強い細胞を癌細胞として検出する。一般に癌細胞は、正常細胞よりも代謝速度が速いため、標識用物質の取り込み量が正常細胞よりも多くなる。また、癌細胞は、正常の細胞とは異なる代謝経路を有するため、標識の度合いが、癌細胞と正常細胞とでは異なる。
　従って、本発明によれば、癌細胞の表面抗原の有無や特別な担体を用意する必要がなく、末梢血細胞中の被検細胞が癌細胞であるか正常細胞であるかの判断を、標識用物質による標識の度合いに基づいて短時間で且つ簡便に行うことができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
　また、本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　本明細書において、偽陽性とは、癌細胞の検出の際に、癌細胞以外の細胞が検出されることを意味する。
　本発明において、「末梢血含有試料」とは、末梢血試料を含有する試料を意味する。
　以下、本発明について説明する。
　本発明の癌細胞検出方法は、被検細胞を含む末梢血含有試料と標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させること（以下、「接触工程」ともいう）、前記被検細胞に、前記標識用物質を取り込ませて（以下、「取り込み工程」ともいう）、必要に応じて代謝させ、前記被検細胞を標識させること（以下、「標識工程」ともいう）、及び、前記被検細胞から、末梢血含有試料中の正常細胞の標識度合いよりも、前記標識用物質による標識度合いが強い細胞を、癌細胞として検出すること（以下、「検出工程」ともいう）、を含む。
　これにより、末梢血試料を含有する末梢血含有試料中の癌細胞の有無を、標識用物質による標識度合いに基づいて短時間で且つ簡便に行うことができる。
　被検細胞は、末梢血中を循環している細胞群である。被検細胞中の癌細胞は、一般に、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）と呼ばれることもあり、転移性の高い癌と推測されるが、これに限定されない。
　本発明において検出対象となる癌細胞は、末梢血中に存在しうる癌細胞であれば特に制限はない。このような癌としては、脳腫瘍、神経膠腫、下垂体腺腫、聴神経髄腫、網膜芽細胞腫、ぶどう膜悪性黒色腫、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、肺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管癌、胆のう癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、表皮内癌、有棘細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、遺伝性腫瘍、家族性腫瘍、原因不明癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病・慢性骨髄増殖性疾患、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これに限定されない。
　本発明における標識用物質は、癌細胞内に取り込まれた後に、後述する検出工程において、該標識用物質を取り込んだ該癌細胞を、認識可能にする物質であればよい。
　前記標識用物質としては、検出時に認識可能な物質であればよく、癌細胞内に取り込まれる前から認識可能な物質（例えば、蛍光物質で標識された物質）及び癌細胞内に取り込まれた後に認識可能な物質（例えば、蛍光物質の前駆物質）のいずれであってもよい。
　癌細胞内に取り込まれる前から認識可能な物質としては、例えば、公知の標識物質により標識された糖（標識化糖）、アミノ酸（標識化アミノ酸）、核酸（標識化核酸）、酢酸（標識化酢酸）、コリン（標識化コリン）、葉酸（標識化葉酸）等が挙げられる。
　また、癌細胞内に取り込まれた後に認識可能になる物質としては、例えば、細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質が挙げられる。
　また、本発明に係る検出方法の対象となる癌細胞の種類の拡大、及び検出感度の向上の観点から、標識用物質としては、前記標識化糖及び標識化アミノ酸を併用することができる。
　本発明における標識化糖は、細胞内へ取り込みされた後に細胞のエネルギー源となる栄養素として活用可能な糖を後述する方法で標識化したものであればよい。
　前記糖としては、単糖、二糖又は、糖単位が３～１０個程度で構成されたオリゴ糖等を挙げることができる。また、細胞のエネルギー源となる栄養素であり、常時取り込みが行われており、短時間の培養でも充分量の取り込みが行われるため、前記糖は単糖であってもよい。単糖以外の糖は、細胞へ取り込み可能な形態に修飾されていてもよい。前記糖の例示としては、例えば、グルコース、デオキシグルコース、グルコサミン、ガラクトース、マンノース、フルクトース、アラビノース、スクロース、ラクトース、マルトース等を挙げることができる。また、例えば細胞への取り込み等の観点から、グルコースが挙げられる。
　前記糖の標識は、当業界で一般的に用いられているものであれば特に制限はなく、通常、生体物質の標識に用いられる標識物質を用いることができる。このような標識物質としては、発色反応を触媒する酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープ、ビオチン等が挙げられるが、顕微鏡下での検出には、酵素、蛍光物質又は化学発光物質が好ましい。これらの標識のうち、蛍光物質による標識が好ましい。蛍光物質による標識とすることにより、例えば、蛍光強度に基づいて簡便に検出することができる。
　蛍光物質としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオロセイン誘導体、ローダミン、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、Ｃｙ色素、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、量子ドット、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ　Ａｃｅｔａｔｅ（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ　Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ　Ｙｅｌｌｏｗ、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ、ＳＰＲＤ、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣｌＢ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ‐１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ‐ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ　ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール（ＤＢＤ）基、Ｂｅｎｚｏａｃｒｙｄｏｎｙ（Ｂａｃｄ）基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ－４－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＭＡＣＡ）、５－（（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）ｎａｔｈｐｈａｌｅｎｅ　（Ｎａｐ）、ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ　（Ａｎｔ）、プロトポルフィリン９等の蛍光色素が挙げられるが、これに限定されない。
　蛍光物質の前駆物質としては、例えば後述する細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９が生成される物質が挙げられる。
　化学発光物質としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体、ロフィン、ルシゲニン、過シュウ酸エステルなどが挙げられる。
　また、前記酵素に対する基質としては、ジアミノベンチジンなどが使用可能である。
　標識物質としてビオチンを用いた場合には、さらにアビジンを結合させた酵素や蛍光物質を結合させることにより、検出を行うことができる。これらの標識物質による標識化は、常法により行うことができる。
　標識物質としては、例えば、Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ基を蛍光発色団として有する標識物質を用いることができる
　標識化糖としては、例えば被検細胞内への取り込み効率等の観点から、蛍光標識化グルコース又はグルコース誘導体を用いることができる。また、例えば安定した癌細胞の検出等の観点より、標識化糖としては、Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ基を蛍光発色団として有するＤ－グルコース誘導体を用いることができる。
　このようなＤ－グルコース誘導体としては、例えば２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＮＢＤＧ、Ｙａｍａｄａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５：２２２７８－２２２８３，　２０００）、６－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－６－デオキシ－Ｄ－グルコース（６－ＮＢＤＧ：Ｓｐｅｉｚｅｒ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　８１５：７５－８４，　１９８５））等が挙げられる。
　前記標識化糖は、単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。
　本発明における標識化アミノ酸において、アミノ酸としては天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれであってもよい。
　前記天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）等の中性アミノ酸、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）等の酸性アミノ酸、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）等の塩基性アミノ酸が挙げられる。
　前記非天然アミノ酸としては、前記天然アミノ酸と同様のアミノ酸トランスポーターを介して細胞内に輸送されるアミノ酸誘導体であればよい。前記非天然アミノ酸としては、例えば、α－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＣＢＣ）、α－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｅｔａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＡＣＰＣ） α－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＩＢ）等が挙げられるが、これに限定されない。
　前記非天然アミノ酸は、天然アミノ酸と同様に、その化学的性質により、中性アミノ酸、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に分類することができ、その分類に従い、本発明に係るアミノ酸として、天然アミノ酸と同様に使用することができる。
　偽陽性の低下等の観点より、前記アミノ酸としては、中性アミノ酸及び酸性アミノ酸からなる群より選ばれるアミノ酸を用いることができる。
　また、陽性率の向上等の観点より、前記アミノ酸としては、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなる群より選ばれるアミノ酸を用いることができる。
　また、偽陽性の低下及び陽性率の向上等の観点の観点より、前記アミノ酸としては、中性アミノ酸からなる群より選ばれるアミノ酸を用いることができる。
　前記アミノ酸は、前記標識化糖と同様の標識物質により標識されていればよい。好ましくは被検細胞内への取り込み効率等の観点からＢｅｎｚｏａｃｒｙｄｏｎｙ（Ｂａｃｄ）基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、７－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ－４－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＭＡＣＡ）、５－（（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）、ｎａｔｈｐｈａｌｅｎｅ　（Ｎａｐ）、ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ　（Ａｎｔ）により標識することができるが、これに限定されない。
　前記標識化アミノ酸は、単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。
　本発明における蛍光物質の前駆物質としては、例えば、「細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９が生成される物質」が挙げられ、「細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９が生成される物質」としては、例えば、アミノレブリン酸（５－アミノ－４－オキソ－ペンタン酸）もしくはその誘導体が挙げられる。なお、本明細書中では、「細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９が生成される物質」を「アミノレブリン酸及びその誘導体」とも称する。
　前記アミノレブリン酸及びその誘導体としては、アミノレブリン酸及びその誘導体、アミノレブリン酸及びその誘導体の塩、アミノレブリン酸及びその誘導体のエステル、並びにアミノレブリン酸のエステル及びその誘導体のエステルの塩が挙げられる。
　具体的には、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、アミノレブリン酸エチル、アミノレブリン酸プロピル、アミノレブリン酸ヘキシル、アミノレブリン酸ヘプチル、アミノレブリン酸オクチル等のアミノレブリン酸及びその誘導体が挙げられ、アミノレブリン酸メチルエステル、アミノレブリン酸エチルエステル、アミノレブリン酸プロピルエステル、アミノレブリン酸ヘキシルエステル、アミノレブリン酸ヘプチルエステル、アミノレブリン酸オクチルエステル等のアミノレブリン酸及びその誘導体のエステルが挙げられ、あるいはこれらの塩酸塩、スルホン酸塩、エステルリン酸塩、エステルスルホン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等のアミノレブリン酸及びその誘導体の塩、並びにアミノレブリン酸のエステル及びその誘導体のエステルの塩が挙げられる。
　市販品としては、例えば、コスモ・バイオ株式会社のアミノレブリン酸（商品名：５－アミノレブリン酸塩酸塩）、東京化成工業株式会社のアミノレブリン酸メチルエステル（商品名：５－アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩）などが挙げられるが、これに限定されない。
　なお、前記標識用物質は、前記標識化糖、標識化アミノ酸又は細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質を単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。
　前記標識用物質は、前記標識化糖及び標識化アミノ酸を併用することができる。前記標識化糖及び標識化アミノ酸を併用することにより、癌細胞の種類によって異なると推測される標識化糖又は標識化アミノ酸の取り込み速度の影響を受ける可能性が低減される。これにより、癌細胞の検出が簡便となる。また、様々な種類の癌細胞を検出することが可能となる。
　また、検出方法の簡便化の観点より、標識化糖の標識に用いる標識物質と、標識化アミノ酸の標識に用いる標識物質とは、同等の蛍光特性を有するものであることが挙げられる。同等の蛍光特性を有するものの組み合わせとしては、最大吸収波長の差が７５ｎｍ以内、かつ最大蛍光波長の差が１５０ｎｍ以内の組み合わせであればよく、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基とＢｅｎｚｏａｃｒｙｄｏｎｙ（Ｂａｃｄ）基、ＮＢＤ基とフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＢＤ基と同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＮＢＤ基とグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、ＮＢＤ基とＣａｌｃｅｉｎ　ＡＭ、ＮＢＤ基とＦＤＡ、ＮＢＤ基と同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＮＢＤ基と同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＮＢＤ基とＡ４３、ＮＢＤ基とＦａｍ、Ｂａｃｄ基とＦＩＴＣ、Ｂａｃｄ基と同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂａｃｄ基とＧＦＰ、Ｂａｃｄ基とＣａｌｃｅｉｎ　ＡＭ、Ｂａｃｄ基と同様の蛍光特性を持つ量子ドット、Ｂａｃｄ基と同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、Ｂａｃｄ基とＡ４３、Ｂａｃｄ基とＦａｍ、ＦＩＴＣと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＦＩＴＣとＧＦＰ、ＦＩＴＣとＣａｌｃｅｉｎ　ＡＭ、ＦＩＴＣと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＦＩＴＣと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＦＩＴＣとＡ４３、ＦＩＴＣとＦａｍ、ＧＦＰと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃａｌｃｅｉｎ　ＡＭと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ａ４３と同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ｆａｍと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ　ＢｌｕｅとＣａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ　ＢｌｕｅとＨｏｃ、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、フィコエリスリン（ＰＥ）とテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＰＥと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、ＰＥと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＰＥと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＰＥと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＰＥとローダミン、ＰＥとＴｍｒ、ＴＲＩＴＣとローダミン、ＴＲＩＴＣとＴｍｒ、ＴＲＩＴＣと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、ＴＲＩＴＣと同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＴＲＩＴＣと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＴＲＩＴＣと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ローダミンとＴｍｒ、ローダミンと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ローダミンと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ローダミンと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、Ｔｍｒと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、Ｔｍｒと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、Ｔｍｒと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＡＰＣと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＡＰＣと同様の蛍光特性を持つＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＡＰＣと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ　Ａｃｅｔａｔｅ（ＡＭＣＡ）と同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、ＡＭＣＡと同様の蛍光特性を持つ量子ドット、ＡＭＣＡと同様の蛍光特性を持つＣｙ色素、同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素と量子ドット、同様の蛍光特性を持つＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素とＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、同様の蛍光特性を持つ量子ドットとＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素等の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
　また、例えば後述する検出工程の簡便化等の観点から、標識化糖の標識に用いる標識物質と、標識化アミノ酸の標識に用いる標識物質とは、同一の標識物質であることが挙げられる。
　本発明における検査対象の末梢血試料は、被検体から採取した血液が該当する。被検体としては、特に制限はなく、ヒトの他、サルなどの霊長類、マウス又はラットなどの齧歯類、ブタ、ウシ又はウマなどの家畜動物や、イヌ、ネコ又はウサギなどのペット動物であってもよい。
　前記末梢血試料は、通常、採取される方法で静脈血より採取されたものであればよい。末梢血試料の密度を調整するために、適切な希釈液で所定濃度に希釈してもよい。前記末梢血を希釈するために使用可能な末梢血試料用希釈液としては、細胞の浸透圧に近い浸透圧のものが好ましく、通常用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸‐リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を挙げることができる。前記末梢血試料用希釈液のｐＨとしては、一般に、ｐＨ５～ｐＨ９の範囲であればよい。
　また、前記末梢血試料は、前記標識用物質と接触する前に癌細胞密度を高めるため濃縮してもよい。濃縮の方法としては通常用いられる方法、例えば遠心分離や、フィルター分離を用いればよい。この場合には、検査対象となる試料を、より高い癌細胞密度の試料に調製することができる。
　また、前記末梢血試料は、前記接触工程の前に溶血処理されたものであってもよい。末梢血試料が溶血処理されることにより、血球成分の大部分を示す赤血球を除去することができる。これにより、赤血球の存在による偽陽性率を低下させ、癌細胞の検出の簡便化及び検出感度の向上が可能となる。
　　前記溶血処理としては、公知の方法を用いることができる。例えば、溶血剤を用いて、予め血球分離した血球分画を処理することができる。溶血剤を用いて、血球分画を処理する条件については、溶血剤の種類によって異なるが、当業者であれば適切に選択可能である。
　前記溶血剤としては、公知のものを用いることができ、例えば、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、シュウ酸アンモニウム、サポニン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤、その他市販の溶血剤、例えばイムノプレップ（ベックマンコールター社）、イムノライズ（ベックマンコールター社）、ＢＤ　ＦＡＣＳ（登録商標）　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトン・ディッキンソン社）などが挙げられる。また、例えば前記被検細胞による前記標識用物質の取り込み効率や標識化効率等の観点より、溶血剤としては、塩化アンモニウム、サポニン、溶血力の弱い市販の溶血剤を使用することができる。
　前記溶血剤の量としては、例えば前記溶血剤の濃度（最終濃度）が０．０１質量％～１０質量％となるように前記末梢血試料に添加すること等が挙げられる。また、好ましくは例えば偽陽性率の低下等の観点より溶血剤の量としては、最終濃度として０．０５質量％～５質量％の範囲とすることができる。また、より好ましくは例えば偽陽性率の低下及び癌細胞の検出の簡便化などの観点より溶血剤の量としては、最終濃度として０．１質量％～１質量％の範囲とすることができる。
　前記接触工程において、前記末梢血含有試料と前記標識用物質との接触については、特に制限はなく、通常、末梢血含有試料に所定濃度の前記標識用物質を添加すればよい（以下、「添加工程」ともいう）。
　例えば、前記標識用物質の濃度（最終濃度）が０．１μＭ～１００ｍＭとなるように、前記末梢血含有試料に添加すればよい。例えば、好ましくは前記標識用物質の濃度（最終濃度）が０．３μＭ～７５ｍＭとなるように、前記末梢血含有試料に添加すればよい。例えば、より好ましくは前記標識用物質の濃度（最終濃度）が１μＭ～５０ｍＭとなるように、前記末梢血含有試料に添加すればよい。
　前記標識用物質が、前記標識化糖である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、０．０１ｍＭ～１００ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖を用いることができる。また、好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．０５ｍＭ～７５ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖を用いることができる。また、より好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．１ｍＭ～５０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖を用いることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化アミノ酸である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、０．１μＭ～１００ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化アミノ酸を用いることができる。また、好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．５μＭ～５０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化アミノ酸を用いることができる。また、より好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、１μＭ～１０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化アミノ酸を用いることができる。
　前記標識用物質が、アミノレブリン酸及びその誘導体である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、０．０１ｍＭ～１００ｍＭの濃度（最終濃度）の前記アミノレブリン酸及びその誘導体を用いることができる。また、好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．０５ｍＭ～５０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記アミノレブリン酸及びその誘導体を用いることができる。また、より好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．１ｍＭ～１０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記アミノレブリン酸及びその誘導体を用いることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を併用する場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、０．１μＭ～１００ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を用いることができる。また、好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、０．３μＭ～７５ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を用いることができる。また、より好ましくは癌細胞の検出感度及び偽陽性率の抑制等の観点から、１μＭ～５０ｍＭの濃度（最終濃度）の前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を用いることができる。
　前記添加工程において、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料に、細胞種識別用抗体をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させることができる。
　前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料に、細胞種識別用抗体を接触させることにより、末梢血試料中に存在する様々な種類の細胞を、個別に標識し、認識することができる。これにより、例えば偽陽性率の低下や癌細胞の検出簡便化等が可能となる。
　前記細胞種識別用抗体は、前記標識化糖において説明した標識物質により標識されていればよい。
　前記細胞種識別用抗体としては、末梢血細胞中に存在する様々な種類の細胞を、個別に標識し、認識することができるものであればよく、例えば偽陽性率低下のために用いる前記細胞種別用抗体や、癌細胞の検出簡便化のために用いる前記細胞種別用抗体等が挙げられる。
　偽陽性率低下のために用いる前記細胞種別用抗体としては、血球分画に含まれる癌細胞以外の細胞を認識する抗体であれば、いずれの抗体を用いてもよい。例えば、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＣＤ３０９抗体等が挙げられる。例えば溶血剤により除去困難な白血球、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、未分化白血球、造血系細胞の包括的な認識等の観点より、前記偽陽性率低下のために用いる前記細胞種別用抗体としては、抗ＣＤ４５抗体及び抗ＣＤ３４抗体からなる群より選ばれる少なくとも一種を用いることができる。
　癌細胞の検出簡便化のために用いる前記細胞種別用抗体としては、各種癌細胞を特異的に認識することが知られている抗体であれば、いずれの抗体を用いてもよい。例えば、抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体、抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、抗前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体、抗ムチン（ＭＵＣ）抗体、抗ｐ５３抗体、抗Ｓｉａｌｙｌ　ＬｅｗｉｓＸ抗体、抗ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅn）抗体、抗ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）抗体、抗α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗葉酸受容体抗体、抗ＴＲＯＰ‐２抗体、抗ｃ‐ｋｉｔ抗体、抗ｃ‐ｍｅｔ抗体、抗ＣＡ－１２５抗体、抗ＣＡ‐１９抗体、抗Ｅ‐カドヘリン抗体、抗Ｎ‐カドヘリン抗体、抗エストロゲン受容体（ＥＲ）抗体、抗熱ショック蛋白（ＨＳＰ）抗体、抗インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）抗体、抗Ｋｉ‐６７抗体、抗Ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体、抗ビメンチン抗体、抗テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗体等が挙げられる。例えば癌細胞を幅広く検出できるという観点より、癌細胞の検出簡便化のために用いる前記細胞種別用抗体としては、抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体、抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体、抗ビメンチン抗体及び抗Ｎ‐カドヘリン抗体からなる群より選ばれる少なくとも一種を用いることができる。
　前記細胞種識別用抗体は、単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。
　前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸及びその誘導体である場合には、鉄イオン及び還元剤の存在下において前記接触工程を行うことができる。
　前記標的細胞と、前記アミノレブリン酸及びその誘導体との前記接触工程を、鉄イオン及び還元剤の存在下において行うことにより、還元剤により、鉄イオンが２価の状態で安定化されるために、正常細胞では、一旦生成されたプロトポルフィリン９が速やかに代謝されてしまうので、偽陽性が抑制できると推測される。
　前記還元剤としては、例えばアスコルビン酸、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、トコフェロール、レシチン、カテキン、クエン酸、シュウ酸、グルコース、グルタチオン、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール等が挙げられる。水溶液中で鉄イオンを安定的に２価の状態に維持出来き、還元力が強くまた細胞毒性が低いという観点より、好ましくはアスコルビン酸、エリソルビン酸、カテキン、クエン酸等を使用することができる。また、より好ましくはアスコルビン酸等を使用することができる。
　この場合、鉄イオンの濃度は、０．０１ｍＭ～１００ｍＭであればよく、アスコルビン酸の濃度は０．０１ｍＭ～１００ｍＭであればよい。
　また、好ましくは例えば偽陽性率の抑制等の観点より鉄イオンは、２価の鉄イオンを用いることができ、該２価の鉄イオンの濃度は、０．０５ｍＭ～５０ｍＭであればよく、アスコルビン酸の濃度０．０５ｍＭ～５０ｍＭであればよい。また、より好ましくは例えば偽陽性率の抑制等の観点より鉄イオンは、２価の鉄イオンを用いることができ、該２価の鉄イオンの濃度は、０．１ｍＭ～１０ｍＭであればよく、アスコルビン酸の濃度は０．１ｍＭ～１０ｍＭであればよい。
　前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸およびその誘導体である場合には、エンドサイトーシスを誘導する物質、及び細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンからなる群より選ばれる少なくとも一種の存在下において、前記接触工程を行うことができる。
　前記標的細胞と、前記アミノレブリン酸およびその誘導体との前記接触工程を、前記エンドサイトーシスを誘導する物質、及び前記細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンからなる群より選ばれる少なくとも一種の存在下において行うことにより、アミノレブリン酸およびその誘導体の標的細胞への取り込みが促進されると推測される。なお、アミノレブリン酸およびその誘導体を使用する場合、検出工程のためにはこれらがプロトポルフィリン９に変換される必要があり、前記標的細胞と前記アミノレブリン酸およびその誘導体とを接触させ、かつ、インキュベートしてよい。そして、アミノレブリン酸への取り込みが促進されることにより、アミノレブリン酸およびその誘導体と標的細胞との接触（インキュベート）時間を短縮することができ、アミノレブリン酸およびその誘導体の反応性が向上する。
　前記エンドサイトーシスを誘導する物質とは、細胞への物質の取り込みを促進させる物質であり、例えば両親媒性ペプチド、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、中性脂質等が挙げられる。
　市販品としては、例えば、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ社の両親媒性ペプチド（商品名Ｅｎｄｏ－Ｐｏｒｔｅｒ）、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ社の両親媒性ペプチド（商品名Ｅｎｄｏ－Ｐｏｒｔｅｒ　Ａｑｕｅｏｕｓ）、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のカチオン性脂質（商品名Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ）、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のカチオン性脂質（商品名Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ）、Ｒｏｃｈｅ社のカチオン性脂質（商品名ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ）等が挙げられるが、これに限定されない。
　前記エンドサイトーシスを誘導する物質の濃度としては、前記エンドサイトーシスを誘導する物質の最終濃度が０．１μＭ～２０ｍＭとなるように、前記接触前の細胞懸濁液に添加することができる。また、好ましくは例えばアミノレブリン酸の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記エンドサイトーシスを誘導する物質の濃度（最終濃度）としては、1μＭ～１０ｍＭを添加することができる。また、より好ましくは例えばアミノレブリン酸の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記エンドサイトーシスを誘導する物質の濃度（最終濃度）としては、５μＭ～２ｍＭを添加することができる。
　前記細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンとは、細胞膜タンパク質に存在する細胞接着因子の構造を安定化、またはＡＴＰ分解酵素のような細胞内外の物質のトランスポーターを活性化状態に保つことができる物質である。
　前記細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンとしては、Ｍｇイオン、Ｃａイオンが挙げられる。
　前記Ｍｇイオンの濃度としては、前記Ｍｇイオンの最終濃度が０．１ｍＭ～１０ｍＭとなるように、前記接触前の細胞懸濁液に添加することができる。また、好ましくは例えばアミノレブリン酸およびその誘導体の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記Ｍｇイオンの濃度（最終濃度）としては、０．１５ｍＭ～５ｍＭを添加することができる。また、より好ましくは例えばアミノレブリン酸およびその誘導体の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記Ｍｇイオンの濃度（最終濃度）としては、０．２５ｍＭ～１ｍＭを添加することができる。
　前記Ｃａイオンの濃度としては、前記Ｃａイオンの最終濃度が０．１ｍＭ～１０ｍＭとなるように、前記接触前の細胞懸濁液に添加することができる。また、好ましくは例えばアミノレブリン酸およびその誘導体の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記Ｃａイオンの濃度（最終濃度）としては、０．２５ｍＭ～５ｍＭを添加することができる。また、より好ましくは例えばアミノレブリン酸およびその誘導体の被検細胞への取り込み効率の上昇等の観点より、前記Ｃａイオンの濃度（最終濃度）としては、０．５ｍＭ～２ｍＭを添加することができる。
　前記エンドサイトーシスを誘導する物質及び前記細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンは、単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。例えば被検細胞の細胞膜の安定化等の観点から、前記Ｍｇイオンと前記Ｃａイオンとを併用することができる。
　標識工程では、前記末梢血含有試料中の前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、標識させる。前記標識用物質の取り込みは、前記標識用物質と前記被検細胞の接触状態を維持すればよい。ここでの接触状態における温度条件としては、前記被検細胞が前記標識用物質の取り込みを行い、前記標識用物質により標識させることができるような条件であればよい。このような温度条件とは、例えば、１℃～４２℃の条件下において行うことができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、１℃～４２℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、２℃～４０℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、４℃～３７℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。
　前記標識用物質が、前記標識化アミノ酸である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、１℃～４２℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、２℃～４０℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、４℃～３７℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。
　前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸およびその誘導体である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、３０℃～４２℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、３３℃～４２℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、３５℃～４０℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖および前記標識化アミノ酸を併用する場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、１℃～４２℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、２℃～４０℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、４℃～３７℃の温度で前記取り込み工程や前記標識工程を行うことができる。
　接触時間としては、前記被検細胞が前記標識用物質の取り込みを行い、必要に応じて細胞内で代謝することができ、正常細胞の標識用物質による標識の度合いと癌細胞の標識用物質による標識の度合いとに差が生じる程度であればよく、例えば、１分～５時間とすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は２分～１２０分にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は３分～９０分にすることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、接触時間は、１分～２時間にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は２分～６０分にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は３分～３０分にすることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化アミノ酸である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、接触時間は、１分～２時間にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は２分～６０分にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は３分～３０分にすることができる。
　前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸及びその誘導体である場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、接触時間は、１０分～５時間にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は１５分～１２０分にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は３０分～９０分にすることができる。なお、前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸及びその誘導体である場合の「接触時間」は、前記被検細胞が前記標識用物質の取り込みを行い、かつ、細胞内で代謝することができ、正常細胞の標識用物質による標識の度合いと癌細胞の標識用物質による標識の度合いとに差が生じる程度である必要がある。
　前記標識用物質が、前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を併用する場合には、例えば癌細胞の検出感度等の観点より、接触時間は、１分～２時間にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は２分～６０分にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度の向上及び偽陽性率の抑制等の観点から、接触時間は３分～３０分にすることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖である場合には、標識化糖の最終濃度が０．０１ｍＭ～１００ｍＭであり、接触時間が１分～２時間であり、接触温度が１℃～４２℃にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、標識化糖の最終濃度が０．０５ｍＭ～７５ｍＭであり、接触時間が２分～６０分であり、接触温度が２℃～４０℃にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、前記標識化糖の最終濃度が０．１ｍＭ～５０ｍＭであり、接触時間が３分～３０分であり、接触温度が４℃～３７℃にすることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化アミノ酸である場合には、前記標識化アミノ酸の最終濃度が０．１μＭ～１００ｍＭであり、接触時間が１分～２時間であり、接触温度が１℃～４２℃にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、前記標識化アミノ酸の最終濃度が０．５ｍＭ～５０ｍＭであり、接触時間が２分～６０分であり、接触温度が２℃～４０℃にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、前記標識化アミノ酸の最終濃度が１μＭ～１０ｍＭであり、接触時間が３分～３０分であり、接触温度が４℃～３７℃にすることができる。
　前記標識用物質が、前記アミノレブリン酸及びその誘導体である場合には、アミノレブリン酸及びその誘導体の最終濃度が０．０１ｍＭ～１００ｍＭであり、接触時間が１０分～５時間であり、接触温度が３０℃～４２℃にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、アミノレブリン酸及びその誘導体およびその誘導体の最終濃度が０．０５ｍＭ～５０ｍＭであり、接触時間が１５分～１２０分であり、接触温度が３３℃～４２℃にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、アミノレブリン酸及びその誘導体およびその誘導体の最終濃度が０．１ｍＭ～１０ｍＭであり、接触時間が３０分～９０分であり、接触温度が３５℃～４０℃にすることができる。
　前記標識用物質が、前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸を併用する場合には、前記標識化糖及び前記標識化アミノ酸の最終濃度が０．１μＭ～１００ｍＭであり、接触時間が１分～２時間であり、接触温度が１℃～４２℃にすることができる。また、好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、前記標識化糖及び標識化アミノ酸の最終濃度が０．５μＭ～７５ｍＭであり、接触時間が２分～６０分であり、接触温度が２℃～４０℃にすることができる。また、より好ましくは例えば癌細胞の検出感度等の観点より、前記標識化糖及び標識化アミノ酸の最終濃度が１μＭ～５０ｍＭであり、接触時間が３分～３０分であり、接触温度が４℃～３７℃にすることができる。
　検出工程では、被検細胞から、前記標識用物質による標識度合いが、正常細胞の標識度合いよりも強い細胞を癌細胞として検出する。
　癌細胞は、被検細胞中の正常細胞と比較して３倍～８倍の代謝速度と考えられているため、前記標識用物質の取り込み量が正常細胞よりも多くなる。また、癌細胞は、正常の細胞とは異なる代謝経路を有するため、標識の度合いが、癌細胞と正常細胞とでは異なる。従って、検出工程では、このような前記標識用物質による標識の度合いが正常細胞より強い細胞を正常細胞と識別し、癌細胞として検出する。これにより、末梢血細胞中に、癌細胞が存在しているか否かがわかる。
　前記標識用物質による標識の度合いは、前記標識用物質における標識物質の種類に応じた方法に標識の度合いとすればよい。例えば、前記標識物質が酵素である場合には、その酵素に対する基質を加えて反応させ、生じる発色の程度を、前記標識用物質による標識の度合いとすることができる。また、前記標識物質が前記蛍光物質である場合には、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、必要に応じて細胞内で代謝させた後の試料に励起光を照射し、生じた蛍光の強度を、前記標識用物質による標識の度合いとすることができる。
　ここで発色の程度又は蛍光強度に基づく癌細胞の検出は、目視観察によって行ってもよく、それぞれ吸光度又は蛍光強度を測定することによって得られた測定値によって行ってもよい。
　本発明における検出方法では、正常細胞による前記標識用物質による標識の度合いよりも強い細胞を癌細胞として検出する。確実に癌細胞を検出するという観点より、細胞の検出は、前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の蛍光強度の検出であってもよい。
　また、前記細胞の検出は、癌細胞の検出精度の観点から、前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の平均蛍光強度の検出及び前記蛍光物質の合計蛍光強度の検出の少なくとも一種であってもよい。
　前記細胞の検出に加えて、簡便なノイズ又は血小板の除去の観点より、前記蛍光物質により標識された前記被検細胞のサイズに基づき、前記細胞の検出を実行することができる。具体的には、前記標識用物質により標識された光点の集合の直径が例えば、１μｍ～１０μｍより大きいもの、好ましくは２μｍ～９μｍより大きいもの、より好ましくは３μｍ～８．５μｍより大きいものをオブジェクトとして抽出することにより検出を実行することができる。
　本発明における検出方法において、前記標識用物質として前記標識化糖を用いる場合には、正常細胞による前記標識用物質の取り込み量よりも多い細胞を癌細胞として検出することができる。確実に癌細胞を検出するために、細胞の検出は、正常細胞による前記標識化糖の取り込み量が少なくとも２倍多い細胞を癌細胞として検出することが好ましく、少なくとも３倍多い細胞を癌細胞として検出することがより好ましく、さらに少なくとも５倍多い細胞を癌細胞として検出することがより好ましい。
　末梢血中の正常細胞の前記標識用物質による標識の度合いは、健常被検体の末梢血中に通常存在しうる細胞を基準としてよい。また、同一条件で前記標識用物質による標識の度合いが既に文献等によって公知である場合には、当該文献値を適用してもよい。
　末梢血中の正常細胞としては、健常被検体の末梢血中に通常存在しうる細胞であって、癌化していない細胞を意味し、例えば、赤血球、白血球（リンパ球、単球、顆粒球）、血小板、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、未分化白血球、未分化赤血球、造血幹細胞等を挙げることができる。これらの細胞種では、正常細胞であれば前記標識用物質による標識の度合いに大きな差が認められないため、いずれの細胞種を正常細胞として選択してもよい。例えば、白血球細胞の標識の度合いを正常細胞の標識の度合いとすることができる。
　本発明における癌細胞の検出方法は、検出された癌細胞を単離することを含んでもよい。これにより、例えば、検出された癌細胞の状態や種類などを更に検討するための試料を提供することができる。
　検出された癌細胞を単離する方法としては、前記標識用物質の種類に応じた単離方法を選択してもよく、前記標識用物質の種類に拘束されない単離方法を選択してもよい。前記標識用物質の種類に応じた単離方法としては、例えば、前記標識用物質が蛍光物質で標識化されている場合には、セルソーターなど、蛍光強度に基づいて細胞を分離する当業界で既知の方法を適用することができる。また、前記標識用物質の種類に拘束されない単離方法としては、細胞のサイズや形態に基づく単離方法を適用することができる。
　本発明における癌検出方法では、上述したように、末梢血試料中の癌細胞を効率よく検出することができる。また、前記癌検出方法では、末梢血試料中の癌細胞を良好な感度で検出可能であり、例えば、０．０１個／ｍＬ～１００００個／ｍＬの癌細胞密度の試料、好ましくは、０．０５個／ｍＬ～５０００個／ｍＬ、より好ましくは、０．１個／ｍＬ～１０００個／ｍＬの癌細胞密度の試料において、癌細胞を適切に検出することができる。
　本発明における癌細胞の検出方法は、画像解析装置により実行するようにしても良い。画像解析装置は、ＣＰＵ、後述する画像解析処理ルーチンを実現するためのプログラムを記憶したＲＯＭ、データを一時的に記憶するＲＡＭ、及びＨＤＤ等の記憶装置を含むコンピュータで構成することができる。
　ここで、本発明を適用した画像解析装置の作用について説明する。被検細胞を含む末梢血含有試料の同一視野について、蛍光画像及び明視野画像が撮像されると、画像解析装置において、図１、図２及び図３に示す画像解析処理ルーチンが実行される。
　ステップ１００で、撮像された蛍光画像及び明視野画像を取得する。次に、ステップ１０２で、上記ステップ１００で取得した蛍光画像から、蛍光強度（輝度値）が予め定めた閾値Ｐｔｈ以上の画素（光点）を抽出する。本ステップは、蛍光画像からノイズを除去するための処理であり、閾値Ｐｔｈは、ノイズを除去するために適した値を輝度値のレンジ等に応じて予め定めておく。閾値Ｐｔｈとしては、例えば、蛍光強度１００～３０００、好ましくは１５０～２５００、より好ましくは１８０～２２００の値で設定することができる。
　次に、ステップ１０４で、上記ステップ１０２で抽出された隣接する光点同士を結合した光点の集合であって、所定サイズ以上の光点の集合をオブジェクトとして抽出する。また、抽出された各オブジェクトに、オブジェクト各々を識別するための識別番号を付与する。所定サイズか否かの判定は、例えば、光点の集合の直径が予め定めた閾値Ｒｔｈ以上か否かにより行うことができる。閾値Ｒｔｈは、画像の倍率を考慮して、その光点の集合が示す細胞の大きさに基づいて定めることができ、例えば、１μｍ～１０μｍ、好ましくは２μｍ～９μｍにより好ましくは３μｍ～８．５μｍに対応した画像上の長さとすることができる。また、光点の集合の直径を用いる場合に限らず、光点の集合に含まれる全画素数が所定数以上か否かにより、所定サイズ以上か否かを判定するようにしてもよい。
　次に、ステップ１０６で、上記ステップ１０４で抽出された各オブジェクトに含まれる各画素の蛍光強度の和を、各オブジェクトに含まれる画素数で除して、平均蛍光強度を算出する。
　次に、ステップ１０８で、上記ステップ１０６で算出した各オブジェクトの平均蛍光強度に基づいて、癌細胞を検出するための検出閾値αを設定する。検出閾値αとしては、例えば、各オブジェクトの平均蛍光強度の平均や最小値等を設定することができ、例えば１００～３０００、好ましくは１５０～２５００、より好ましくは１８０～２２００と設定することが出来る。
　次に、ステップ１１０で、平均蛍光強度が、上記ステップ１０８で設定した検出閾値α以上のオブジェクトを癌細胞として検出する共に、その数をカウントする。
　次に、ステップ１１２で、上記ステップ１００で取得した明視野画像内の全細胞数をカウントする。
　次に、ステップ１１４で、上記ステップ１１０でカウントした癌細胞として抽出されたオブジェクト数と、上記ステップ１１６でカウントした全細胞数とに基づいて、癌細胞陽性率または血球細胞陰性率を算出して、画像解析処理ルーチンを終了する。
　なお、上記ステップ１０８では、各オブジェクトの平均蛍光強度を算出する場合について説明したが、各オブジェクトに含まれる各画素の蛍光強度の和である合計蛍光強度を算出するようにしてもよい。
　ここで、癌細胞のみおよび健常被検体の末梢血含有試料のみを用いた場合、すなわち明視野画像から抽出される細胞の全てが癌細胞もしくは健常被検体の末梢血含有試料の場合において、上記の画像解析処理により算出した癌細胞陽性率及び血球細胞陰性率の結果の一例を、表１に示す。
　また、上記ステップ１０８で行う癌細胞を検出するための検出閾値αを設定しない方法としては図２に示す画像解析処理ルーチンが実行される。
ステップ２００で、撮像された蛍光画像及び明視野画像を取得する。次に、ステップ２０２で、上記ステップ２００で取得した蛍光画像から、蛍光強度（輝度値）が予め定めた閾値Ｐｔｈ以上の画素（光点）を抽出する。本ステップは、蛍光画像からノイズを除去するための処理であり、閾値Ｐｔｈは、ノイズを除去するために適した値を輝度値のレンジ等に応じて予め定めておく。閾値Ｐｔｈとしては、例えば、蛍光強度１００～２０００、好ましくは１５０～１５００、より好ましくは１８０～１０００の値で設定することができる。
　次に、ステップ２０４で、上記ステップ２０２で抽出された隣接する光点同士を結合した光点の集合であって、所定サイズ以上の光点の集合をオブジェクトとして抽出する。また、抽出された各オブジェクトに、オブジェクト各々を識別するための識別番号を付与する。所定サイズか否かの判定は、例えば、光点の集合の直径が予め定めた閾値Ｒｔｈ以上か否かにより行うことができる。閾値Ｒｔｈは、画像の倍率を考慮して、その光点の集合が示す細胞の大きさに基づいて定めることができ、例えば、１μｍ～１０μｍ、好ましくは２μｍ～９μｍにより好ましくは３μｍ～８．５μｍに対応した画像上の長さとすることができる。また、光点の集合の直径を用いる場合に限らず、光点の集合に含まれる全画素数が所定数以上か否かにより、所定サイズ以上か否かを判定するようにしてもよい。
　次に、ステップ２０６で、光点の集合の直径が、上記ステップ２０４で設定したオブジェクトを癌細胞として検出する共に、その数をカウントする。
　次に、ステップ２０８で、上記ステップ２００で取得した明視野画像内の全細胞数をカウントする。
　次に、ステップ２１０で、上記ステップ２０６でカウントした癌細胞として抽出されたオブジェクト数と、上記ステップ２０８でカウントした全細胞数とに基づいて、癌細胞陽性率または血球細胞陰性率を算出して、画像解析処理ルーチンを終了する。
　また、上記ステップ１０８で行う癌細胞を検出するための検出閾値αを設定せず細胞種識別用抗体を使用する方法としては図３に示す画像解析処理ルーチンが実行される。
ステップ３００で、撮像された明視野画像、標識用物質を用いた蛍光画像、細胞種識別用抗体（偽陽性識別用）を用いた蛍光画像及び細胞種識別用抗体（癌細胞検出用）を用いた蛍光画像を取得する。次に、ステップ３０２で、上記ステップ３００で取得した標識用物質を用いた蛍光画像から、蛍光強度（輝度値）が予め定めた閾値Ｐｔｈ以上の画素（光点）を抽出する。本ステップは、蛍光画像からノイズを除去するための処理であり、閾値Ｐｔｈは、ノイズを除去するために適した値を輝度値のレンジ等に応じて予め定めておく。閾値Ｐｔｈとしては、例えば、蛍光強度１００～２０００、好ましくは１５０～１５００、より好ましくは１８０～１０００値で設定することができる。
　次に、ステップ３０４で、上記ステップ３０２で抽出された隣接する光点同士を結合した光点の集合であって、所定サイズ以上の光点の集合をオブジェクトとして抽出する。所定サイズか否かの判定は、例えば、光点の集合の直径が予め定めた閾値Ｒｔｈ以上か否かにより行うことができる。閾値Ｒｔｈは、画像の倍率を考慮して、その光点の集合が示す細胞の大きさに基づいて定めることができ、例えば、１μｍ～１０μｍ、好ましくは２μｍ～９μｍにより好ましくは３μｍ～８．５μｍに対応した画像上の長さとすることができる。また、光点の集合の直径を用いる場合に限らず、光点の集合に含まれる全画素数が所定数以上か否かにより、所定サイズ以上か否かを判定するようにしてもよい。
　次に、ステップ３０６で、上記標識用物質を用いた蛍光画像及と細胞種識別用抗体（偽陽性識別用）を用いた蛍光画像とを重ね合わせ、ステップ３０４で設定したオブジェクトのうち、どちらの蛍光画像においても蛍光を有する細胞を偽陽性細胞として陽性細胞から除外する。次に、ステップ３０８で、上記標識用物質を用いた蛍光画像及と細胞種識別用抗体（癌細胞検出用）を用いた蛍光画像とを重ね合わせ、ステップ３０４で設定したオブジェクトのうち、どちらの蛍光画像においても蛍光を有する細胞を陽性細胞としてカウントする。次に、ステップ３１０で、上記標識用物質を用いた蛍光画像及と細胞種識別用抗体（癌細胞検出用）と細胞種識別用抗体（偽陽性識別用）を用いた蛍光画像とを重ね合わせ、上記標識用物質を用いた蛍光画像のみで蛍光を有する細胞を偽陽性細胞としてカウントする。次に、ステップ３１２で、細胞種識別用抗体（偽陽性識別用）と細胞種識別用抗体（癌細胞検出用）とを重ね合わせ細胞種識別用抗体（癌細胞検出用）でのみ蛍光を有する細胞を癌細胞総数としてカウントする。
次に、ステップ３１４で、上記ステップ３００で取得した明視野画像内の全細胞数と上記ステップ３１０でカウントした偽陽性細胞数、３０８でカウントした陽性細胞数、３１２でカウントした癌細胞総数とに基づいて、癌細胞陽性率または血球細胞偽陽性率を算出して、画像解析処理ルーチンを終了する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、平均蛍光強度及び合計蛍光強度のいずれを用いた場合でも、高精度に癌細胞が検出できていることがわかる。ただし、合計蛍光強度を用いる場合には、抽出されたオブジェクトのサイズによる誤差の影響が大きくなる場合がある。例えば、蛍光画像撮影時の露光時間が長くなることから、撮影中のピントのズレがサイズに影響を与える。平均蛍光強度を用いた場合には、このようなサイズによる誤差の影響が小さいため、より高精度に癌細胞を検出することができる。
　なお、上記では、画像解析装置に予め画像解析処理ルーチンを実行するためのプログラムがインストールされた場合について説明したが、該プログラムをＣＤ－ＲＯＭやＤＶＤディスク、光磁気ディスクやＩＣカード等に記憶しておき、画像解析処理実行時にこれらの記憶媒体からプログラムを読み込んで実行するようにしてもよい。更にまた、該プログラムを、ネットワークに接続されたサーバ等からダウンロードするようにしてもよい。また、上記の画像解析装置を、半導体集積回路（例えば、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）等）で実現することも可能である。
　本発明における癌細胞検出キットは、前記標識用物質の他に、洗浄液や、本発明にかかる癌細胞の検出方法において必要とされる溶血剤や前記末梢血試料用希釈液、その他試薬類をさらに含んでいてもよい。
　その他試薬類の例としては、抗体の特異性を高めるための物質例えば、各種レセプターのブロッキング剤；偽陽性を抑制するための物質、例えば鉄イオン；鉄イオンの安定性を高めるための物質、例えば還元剤；細胞膜タンパク質の安定性を高めるための物質、例えばＭｇイオンやＣａイオン；および、細胞への物質の取込を促進させる物質、例えばエンドサイトーシス誘導物質、等が含まれる。
　また、本発明における癌細胞検出キットは、前記標識用物質と、前記標識用物質による標識度合いに基づいて癌細胞を検出する方法を記載した取扱説明書とを含む。
　本癌細胞検出キットによれば、末梢血試料中の癌細胞を短時間で且つ簡便に検出することができる。本キットにおける取扱説明書に記載された癌細胞を検出する方法としては、前記癌細胞検出方法において記述した事項がすべて適用される。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
［実施例１］
　健常人の静脈血から、常法に従って、遠心分離法により血清試料と沈殿物とを分離し、血清試料から、白血球層と赤血球層の一部を回収して、ＰＢＳに再懸濁して、白血球試料及び赤血球試料を調製した。
　ＤＳファーマバイオメディカル社より購入した乳癌細胞株ＭＣＦ－７を、αＭＥＭ培地（インビトロジェン社、１０容量％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ/ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ/ｍＬ添加）を用いて３７℃、５容量％ＣＯ２濃度環境下で培養した。試験直前に、０．２５％トリプシン含有ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、ＰＢＳにて洗浄後、癌細胞株試料を調製した。
　癌細胞株、血球細胞（白血球及び赤血球）又はこれらの混合物それぞれ３００μＬ（４×１０５細胞／ｍＬ）に、１０ｍＭの２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（以下、２－ＮＢＤＧ）（和光純薬社）を３０μＬ、表２の記載に従って添加して試料１～７を調製し、４０分間３７℃にてインキュベートした。なお、２－ＮＢＤＧを添加しない試料には同量のＰＢＳを添加した。
　インキュベート後に、各試料を、２０００ｒｐｍ×５分間（日立社）の遠心分離を行って細胞を回収後、抗ＥｐＣＡＭ抗体－ＰＥ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を１０μＬ添加して冷暗所にて３０分間静置させた。
　３０分後に、１０００μＬのＰＢＳを用いて洗浄し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心を行って常法に従って各細胞を回収した。
　回収された細胞を５０μＬのＰＢＳに再度、懸濁し、９６ウェルプレートに全量を移し、観察用の試料を調製した。
　各観察用の試料を、蛍光顕微鏡（ニコン社）にて観察し、２－ＮＢＤＧによる取り込み量を目視にて確認した。また、同様に、抗ＥｐＣＡＭ抗体－ＰＥによる染色像を観察して、癌細胞を確認した。試料１の観察結果を、それぞれ図４～図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、上記表２中、試料２～試料７は、いわゆる実験における手技上の理由で、癌細胞の検出度合いに差が出る可能性を否定するための対照群である。具体的には、試料２は、標識化糖類で癌細胞が認識できることを保証するための対照群である（血球細胞の存在による取り込み阻害の可能性を否定）。試料３は、血球細胞が抗ＥｐＣＡＭ抗体で染まらないことを確認するための対照群である。試料４は、血球細胞と癌細胞の混合作業が、血球細胞の標識化糖類の取り込み具合に影響する可能性を否定するための対照群である。試料５は、癌細胞がＥｐＣＡＭ抗体で染まることを確認するための対照群である。試料６及び試料７は、血球細胞の混在下で、癌細胞を二重標識することによる影響の可能性を否定するための対照群である。これら対照群でのコントロール実験により、いわゆる手技上の理由で癌細胞の検出度合いに差が出る可能性が否定された（データは図示せず）。
　図４～図６の対比観察から、癌細胞株と血球細胞とを混在させた試料１では、２－ＮＢＤＧによって標識化された細胞と標識化されていない細胞とが混在していること（図４及び図５参照）、及び、２－ＮＢＤＧで標識化された細胞は、抗ＥｐＣＡＭ抗体で染色された細胞であることが、それぞれ確認できた（図６参照）。従って、２－ＮＢＤＧを用いることによって、混合試料中の癌細胞株が蛍光像として明確に観察された。
　一方、白血球細胞はやや蛍光顕微鏡視野で観察されるが癌細胞の蛍光像よりも遙かに弱く、蛍光強度として半分以下であった。赤血球細胞は、ほとんど活性がないため蛍光像はまったく観察されなかった。
　従って、血液細胞と癌細胞とが混在する末梢血試料で、蛍光標識化糖の細胞内への取り込み量に基づいて、癌細胞株の有無を短時間で且つ簡便に確認することができる。
［実施例２］
＜血球の調製＞
　真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行う。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、血球分離を行う。
＜癌細胞の調製＞
　常法に従い、培養したヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）をトリプシン（インビトロジェン社）により回収した。なお、浮遊系であるヒト胃癌細胞株（ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）は、トリプシン処理を行うことなく、そのまま回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
　溶血処理を施す場合には、上記のようにして回収した血球分画に対して、塩化アンモニウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、塩化アンモニウムを用いて溶血処理を行う。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、各細胞の細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いてから、ダルベッコＰＢＳ（－）で溶解した２－ＮＢＤＧ（和光純薬社、表３又は表４に記載の最終濃度）を添加し、細胞を十分に懸濁させる。表３又は表４に記載の温度及び時間、反応（培養）する。反応後、ダルベッコＰＢＳ（－）を加えて、遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く工程を２～３回行い、細胞を十分に洗浄する。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、濃度調整をして３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。蛍光顕微鏡（ニコン社）で撮影を行う。蛍光フィルタセット：Ｂ－２Ａ（ニコン社）を用いる。Ｂ－２Ａの波長は次の通りである。　ＥＸ（励起波長）　４７５±１５ｎｍ、ＤＭ　５０５ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）５２０ｎｍ以上。
　画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、細胞の蛍光強度を評価する。
　結果を表３及び表４に示す。表３は、上述の溶血処理を行った末梢血試料を使用しており、表４は、溶血処理を行っていない末梢血試料を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この結果より、標識用物質として２－ＮＢＤＧを用いる場合、２－ＮＢＤＧの添加濃度が０．１ｍＭ～１０ｍＭ、反応温度が４℃～３７℃、反応時間は５分以上、平均蛍光強度閾値は２８０～１１５０であればよいことが明らかになった。また、混入している多量の赤血球を除去するために溶血処理を施しても、癌細胞への影響はなく、溶血処理による影響を受けないことが明らかとなった。
［実施例３］
＜血球の調製＞
　真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行う。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、血球分離を行う。
＜癌細胞の調製＞
　常法に従い、培養したヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収する。なお、浮遊系であるヒト胃癌細胞株（ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）は、トリプシン処理を行うことなく、そのまま回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
　溶血処理を施す場合には、回収した血球分画に対して、塩化アンモニウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、室温にて塩化アンモニウムを用いて溶血処理を行う。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、各細胞の細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いてから、Ｈ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨ（渡辺化学工業社）を添加（表５又は表６に記載の最終濃度）し、細胞を十分に懸濁させる。表５又は表６に記載の温度及び時間、反応（培養）する。反応後、ダルベッコＰＢＳ（－）を加えて、遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳを用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く工程を２～３回行い、細胞を十分に洗浄する。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、濃度調整をして３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。蛍光顕微鏡（ニコン社）で撮影を行う。蛍光フィルタセット：Ｂ－２Ａ（ニコン社）を用いる。Ｂ－２Ａの波長は実施例２と同様である。画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、細胞の蛍光強度を評価する。
　結果を表５及び表６に示す。表５は、上述の溶血処理を行った末梢血試料を使用しており、表６は、溶血処理を行っていない末梢血試料を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この結果より、標識用物質としてＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨを用いる場合、Ｈ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨの添加濃度が１μＭ～１００μＭ、反応温度が４℃～３７℃、反応時間は５分以上、平均蛍光強度閾値は２２７～２０４４であればよいことが明らかになった。また、混入している多量の赤血球を除去するために溶血処理を施しても、癌細胞への影響はなく溶血処理による影響を受けないことが明らかとなった。
［実施例４］
＜血球の調製＞
　真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行う。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、血球分離を行う。
＜癌細胞の調製＞
　常法に従い、培養したヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収する。なお、浮遊系であるヒト胃癌細胞株（ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）は、トリプシン処理を行うことなく、そのまま回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（＋）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
　溶血処理を施す場合には、回収した血球分画に対して、塩化アンモニウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、室温にて塩化アンモニウムを用いて溶血処理を行う。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いてから、ダルベッコＰＢＳ（＋）に溶解させたアミノレブリン酸（商品名５－アミノレブリン酸塩酸塩、コスモ・バイオ社、表７又は表８に記載の最終濃度）、アミノレブリン酸と同濃度のＦｅＣｌ２とアミノレブリン酸と同濃度のアスコルビン酸を添加し、細胞を十分に懸濁させる。表７又は表８に記載の温度及び時間、反応（培養）する。細胞数を調整して３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。蛍光顕微鏡（ニコン社）で撮影を行う。
蛍光フィルタセットの波長：ＥＸ（励起波長）４０２±７．５、ＤＭ　４３０以上、ＢＡ（蛍光波長）６２５±１５。
　画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、細胞の蛍光強度を評価した。
　結果を表７及び表８に示す。表７は、上述の溶血処理を行った末梢血試料を使用しており、表８は、溶血処理を行っていない末梢血試料を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　この結果より、標識用物質としてアミノレブリン酸を用いる場合、アミノレブリン酸の添加濃度が０．１ｍＭ～１ｍＭ、反応温度が２３℃～３７℃、反応時間は３０分以上であればよいことが明らかになった。また、混入している多量の赤血球を除去するために溶血処理を施しても、癌細胞への影響はなく、溶血処理による影響を受けないことが明らかとなった。
［実施例５］
　実施例２の＜染色＞において、標識用物質を２－ＮＢＤＧから６－ＮＢＤＧ（インビトロジェン社）に変更した以外は、実施例２と同様にして、細胞の蛍光強度を評価した。その結果を表９に示す。なお、２－ＮＢＤＧ及び６－ＮＢＤＧの最終濃度は表９に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　この結果より、標識化糖としては、２位に蛍光発色団を有するグルコースだけではなく、その他の位置に蛍光発色団を有するグルコースも利用可能であることが明らかとなった。
［実施例６］
　実施例２と同様にして、ヒト乳腺上皮癌（細胞株名　ＭＣＦ－７：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト結腸腺癌（細胞株名　ＳＷ６２０：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト前立腺癌（細胞株名　ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名　ＮＣＩ－Ｈ３５８：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト胃癌（細胞株名　ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）及びヒト繊維肉腫（細胞株名　ＨＴ１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）のそれぞれを用いて、標識化糖（２－ＮＢＤＧ）による癌細胞の検出を行った。
　その結果を表１０に示す。なお、２－ＮＢＤＧの最終濃度は表１０に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　この結果より、標識用物質として２－ＮＢＤＧを用いることにより、様々な種類の癌細胞を検出することが可能であることが明らかとなった。
［実施例７］
　実施例３と同様にして、ヒト乳腺上皮癌（細胞株名　ＭＣＦ－７：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト結腸腺癌（細胞株名　ＳＷ６２０：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト前立腺癌（細胞株名　ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名　ＮＣＩ－Ｈ３５８：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト胃癌（細胞株名　ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）及びヒト繊維肉腫（細胞株名　ＨＴ１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）のそれぞれを用いて、標識化アミノ酸による癌細胞の検出を行った。
　その結果を表１１に示す。なお、標識化アミノ酸Ｈ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨの最終濃度は表１１に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　この結果より、標識用物質としてＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨを用いることにより、様々な種類の癌細胞を検出することが可能であることが明らかとなった。
［実施例８］
　実施例４と同様にして、ヒト乳腺上皮癌（細胞株名　ＭＣＦ－７：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト結腸腺癌（細胞株名　ＳＷ６２０：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト前立腺癌（細胞株名　ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名　ＮＣＩ－Ｈ３５８：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト胃癌（細胞株名　ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）及びヒト繊維肉腫（細胞株名　ＨＴ１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）のそれぞれを用いて、アミノレブリン酸による癌細胞の検出を行った。
　その結果を表１２に示す。なお、アミノレブリン酸の最終濃度は表１２に記載した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　この結果より、標識用物質としてアミノレブリン酸を用いることにより、様々な種類の癌細胞を高感度で検出することが可能であることが明らかとなった。
［実施例９］
　真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行う。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、血球分離を行う。
＜癌細胞の調製＞
　常法に従い、培養したヒト乳腺上皮癌（細胞株名　ＭＣＦ－７：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト結腸腺癌（細胞株名　ＳＷ６２０：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト前立腺癌（細胞株名　ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名　ＮＣＩ－Ｈ３５８：ＤＳファーマバイオメディカル社）及びヒト繊維肉腫（細胞株名　ＨＴ１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）をトリプシン（インビトロジェン社）により回収する。なお、浮遊系の癌細胞株であるヒト胃癌（細胞株名　ＳＮＵ－１：ＡＴＣＣ）は、トリプシン処理を行うことなく、そのまま回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
＜溶血処理＞
　上記のようにして回収した血球分画に対して、塩化アンモニウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、室温にて塩化アンモニウムを用いて溶血処理を行う。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いた後で、Ｈ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨ（渡辺化学工業社）及び２－ＮＢＧＤ（和光純薬社）を添加（表１３に記載の最終濃度）し、細胞を十分に懸濁させる。３７℃、３０分反応させる。反応後、ダルベッコＰＢＳ（－）を加えて、遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く工程を２～３回行い、細胞を十分に洗浄する。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、濃度調整をして３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。蛍光顕微鏡（ニコン社）で撮影（露光時間１秒）を行う。蛍光フィルタセット：Ｂ－２Ａ（ニコン社）を用いる。
　画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、細胞の蛍光強度を評価する。その結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　この結果より、２－ＮＢＤＧとＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨとを併用することにより、平均蛍光強度閾値を２８０～４９０とすることで、２－ＮＢＤＧ単独では陽性率の低い胃癌細胞、Ｈ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨ単独では陽性率の低い大腸癌細胞を含む、様々な種類の癌細胞を、高感度で検出することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１０］
＜細胞の調製＞
　常法に従い、培養しているヒト繊維肉腫細胞株（ＨＴ－１０８０：ＤＳファーマバイオメディカル社）およびヒト正常皮膚繊維芽細胞株（ＮＨＤＦ：ロンザ社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。その後、ダルベッコＰＢＳ（＋）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いた後に、鉄イオンと還元剤を添加する条件では、ダルベッコＰＢＳ（＋）に溶解させた０．３ｍＭのアミノレブリン酸（商品名５－アミノレブリン酸塩酸塩、コスモ・バイオ社）、０．３ｍＭのＦｇＣｌ２、０．３ｍＭのアスコルビン酸を添加し、細胞を十分に懸濁させる。鉄イオンと還元剤を添加しない条件では、ダルベッコＰＢＳ（＋）に溶解させた０．３ｍＭのアミノレブリン酸のみを添加し、細胞を十分に懸濁させる。３７℃で６０分間反応させる。細胞数を調整して３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。
＜蛍光撮影＞
　蛍光顕微鏡（ニコン社）で明視野（対物×１０倍）および蛍光（対物×１０倍）を同一視野での観察を行い、偽陽性の程度について確認を行った。その結果を表１４に示す。
　蛍光フィルタセット：ＥＸ（励起波長）　４０２±７．５、ＤＭ　４３０以上、ＢＡ（蛍光波長）　６２５±１５。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　この結果より、アミノレブリン酸に加えて、ＦｇＣｌ２及びアスコルビン酸を添加することにより、偽陽性の発現率を抑制できることが明らかとなった。
［実施例１１］
＜細胞の調製＞
　常法に従い、培養しているヒト乳腺上皮癌細胞株（細胞株名　ＭＣＦ－７：ＤＳファーマバイオメディカル社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収する。回収した癌細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（＋）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントする。１サンプルに２．８×１０５個の細胞を分取する。Ｍｇイオン及びＣａイオンが配合されたダルベッコＰＢＳ（＋）に、アミノレブリン酸（商品名５－アミノレブリン酸塩酸塩、コスモ・バイオ社）を１ｍＭになるように添加し、細胞を十分に懸濁させる。３７℃で反応させる。
＜蛍光検出＞
　反応開始後、１５分、３０分、６０分、９０分での細胞懸濁液の蛍光値をｉ－ｄｅｎｓｙ（アークレイ社）を用いて測定した。蛍光値の測定条件：音調＆光量モードにて４０℃、ゲイン「３」、ＬＥＤ１（３９０±２０ｎｍ：励起）－　ＰＤ３（６４２．５±５７．５ｎｍ：検出）。
　結果を図７に示す。図７中、縦軸は蛍光値を示し、横軸は反応時間を示す。黒塗り四角は、Ｍｇイオン及びＣａイオンが配合されていないダルベッコＰＢＳ（－）を用いた場合の蛍光値である。黒塗り三角は、Ｍｇイオン及びＣａイオンが配合されたダルベッコＰＢＳ（＋）を用いた場合の蛍光値である。なお、黒塗り四角で表された結果は、実施例１１において、ダルベッコＰＢＳ（＋）を、ダルベッコＰＢＳ（－）に変更した以外は、実施例１１と同様に行った結果である。
　この結果より、アミノレブリン酸に加えて、Ｍｇイオン及びＣａイオンを添加することにより、アミノレブリン酸の反応性が向上することが明らかとなった。
［実施例１２］
　実施例１１の染色の際に、ダルベッコＰＢＳ（＋）に溶解させたアミノレブリン酸を１ｍＭになるように添加し、１０μＭのＥｎｄｏ－ｐｏｔｅｒ（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ社）を添加した以外は、実施例１１と同様にして、細胞懸濁液の蛍光値を測定した。
　結果を図８に示す。図８中、縦軸は蛍光値を示し、横軸は反応時間を示す。黒塗り四角は、Ｍｇイオン及びＣａイオンが配合されていないダルベッコＰＢＳ（－）を用いた場合の蛍光値である。黒塗り丸は、Ｍｇイオン及びＣａイオンが配合されたダルベッコＰＢＳ（＋）にＥｎｄｏ－ｐｏｔｅｒを添加した場合の蛍光値である。
　この結果より、アミノレブリン酸、Ｍｇイオン及びＣａイオンに加えて、Ｅｎｄｏ－ｐｏｒｔｅｒを添加することにより、アミノレブリン酸の反応性が、さらに向上することが明らかとなった。
　なお、図９は、実施例１１と実施例１２との結果を一図にまとめたものである。これにより、アミノレブリン酸のみのもの（黒塗り四角）に比べて、アミノレブリン酸にＭｇイオン及びＣａイオンを加える（黒塗り三角）ことにより、アミノレブリン酸の反応性が向上し、アミノレブリン酸に、Ｍｇイオン、Ｃａイオン及びＥｎｄｏ－ｐｏｒｔｅｒを加える（黒塗り丸）ことにより、アミノレブリン酸の反応性がさらに向上することが明らかとなった。
［実施例１３］
　実施例３の＜染色＞において、標識用物質をＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨから、Ｈ－Ｌｙｓ（ＤＭＡＣＡ）－ＯＨ（渡辺化学工業社）又はＨ－Ｇｌｕ（ＥＤＡＮＳ）－ＯＨ（渡辺化学工業社）に変更した。
　また、蛍光物質の蛍光特性に合わせて、蛍光フィルタセットの波長をＥＸ（励起波長）３６５/±１０、ＤＭ　４００以上、ＢＡ（蛍光波長）４７０±２０に変更した以外は、実施例２と同様にして、細胞の蛍光強度を評価した。結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　この結果より、標識化アミノ酸としては、標識化中性アミノ酸のＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨだけではなく、その他の標識化アミノ酸（標識化塩基性アミノ酸のＨ－Ｌｙｓ（ＤＭＡＣＡ）－ＯＨ及び標識化酸性アミノ酸のＨ－Ｇｌｕ（ＥＤＡＮＳ）－ＯＨ）も利用可能であることが明らかとなった。なお、陰性率の観点から標識化中性アミノ酸のＨ－Ａｌａ（２－Ｂａｃｄ）－ＯＨ、標識化酸性アミノ酸のＨ－Ｇｌｕ（ＥＤＡＮＳ）－ＯＨが癌細胞への選択性が高いことが明らかになった。
［実施例１４］
＜血球の調製＞
　真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行う。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、血球分離を行う。
＜癌細胞の調製＞
　常法に従い、培養したヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３：ＤＳファーマバイオメディカル社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収する。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（＋）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除く。
＜血球と癌細胞の混合液の調整＞
　血球分離を行った血球細胞懸濁液の細胞数を常法に従い、血球計算盤を用いてカウントする。また、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３）の細胞数も同様にカウントし、血球細胞数に対して１％の細胞数になるように血球細胞懸濁液に添加する。ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３）を添加した血球細胞懸濁液に対して、塩化アンモニウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、室温にて塩化アンモニウムを用いて溶血処理を行う。
＜染色＞
　常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントし、サンプルを１０５個の～１０６個の試料（細胞懸濁液）に分取する。遠心し、上清を除いてから、ダルベッコＰＢＳ（＋）に溶解させた０．３ｍＭのアミノレブリン酸（商品名５－アミノレブリン酸塩酸塩、コスモ・バイオ社）、０．３ｍＭのＦｅＣｌ２と０．３ｍＭのアスコルビン酸を添加し、細胞を十分に懸濁させる。３７度、６０分間反応（培養）する。反応後、遠心し、上清を除き、ＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を添付文書に従い添加し、４度、３０分間反応する。反応後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社社）及び、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社社）をそれぞれ添付文書に従い添加し、２３度、３０分間反応する。反応後、ダルベッコＰＢＳ（－）を加えて、遠心し、上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く。ダルベッコＰＢＳ（－）を用いて再懸濁し、遠心し、再度上清を除く工程を２～３回行い、細胞を十分に洗浄する。細胞数を調整して３８４ウェルプレートに滴下する。プレートを遠心して、細胞をウェル底面に落とす。蛍光顕微鏡（ニコン社）で撮影を行う。プロトポルフィリン９は蛍光フィルタセット１で、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体は蛍光フィルタセット２で、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体及び、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体は蛍光フィルタセット３で検出する。
　蛍光フィルタセット１の波長：ＥＸ（励起波長）４０２±７．５ｎｍ、ＤＭ　４３０ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）６２５±１５ｎｍ。
　蛍光フィルタセット２の波長：ＥＸ（励起波長）５３５±２５ｎｍ、ＤＭ　５７５ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）５９０ｎｍ以上。
　蛍光フィルタセット３の波長：ＥＸ（励起波長）４７５±１５ｎｍ、ＤＭ　５０５ｎｍ以上、ＢＡ（蛍光波長）５２５±１０ｎｍ。
　画像解析ソフト（製品名ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ニコン社）を用いて、取得した画像を解析し、細胞の蛍光強度を評価した。その結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　この結果より、アミノレブリン酸に加えて、抗ＣＤ３４抗体及び抗ＣＤ４５抗体を用いることで、偽陽性の発現率を抑制できることが明らかとなった。
　日本出願　特願２０１０－２８８９３６（出願日２０１０年１２月２４日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願及び技術規格は、個々の文献、特許出願及び技術規格が参照により取り込まれる具体的かつ個々に記載された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (21)

  1. 　被検細胞を含む末梢血含有試料と標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させること、
    　前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませて、前記被検細胞を標識させること、及び、
    　前記被検細胞から、末梢血含有試料中の正常細胞の標識度合いよりも、前記標識用物質による標識度合いが強い細胞を、癌細胞として検出すること、
    　を含む癌細胞の検出方法。
  2. 　前記標識用物質が蛍光物質で標識された物質又は蛍光物質の前駆物質であり、前記検出が前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の蛍光強度を得ることを含む請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記標識用物質が蛍光物質で標識された物質又は蛍光物質の前駆物質であり、前記検出が前記蛍光物質により標識された前記被検細胞の平均蛍光強度及び合計蛍光強度からなる群より選ばれる少なくとも一種を得ることを含む請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記検出が、さらに前記蛍光物質により標識された前記被検細胞のサイズに基づいて行われる請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記標識用物質が、標識化糖、標識化アミノ酸及び細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　前記標識用物質が、標識化糖及び標識化アミノ酸である請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 　前記標識用物質が前記標識化糖であり、前記標識化糖が、標識化単糖である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 　前記標識用物質が前記標識化糖であり、前記標識化糖が、蛍光標識化グルコース誘導体である請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 　前記標識用物質が標識化アミノ酸であり、前記アミノ酸が、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の検出方法。
  10. 　前記標識用物質が標識化アミノ酸であり、前記アミノ酸が、中性アミノ酸及び酸性アミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の検出方法。
  11. 　前記標識用物質が細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質であり、前記物質が、アミノレブリン酸及びその誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の検出方法。
  12. 　前記標識用物質が細胞内に取り込まれてプロトポルフィリン９に代謝される物質であり、前記物質がアミノレブリン酸及びその誘導体であり、前記アミノレブリン酸及びその誘導体が、それらの塩、それらのエステル、及びそれらのエステルの塩からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の検出方法。
  13. 　前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料が溶血処理されている請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の検出方法。
  14. 　前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料に、細胞種識別用抗体をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させることを含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の検出方法。
  15. 　前記細胞種識別用抗体が、抗ＣＤ４５抗体及び抗ＣＤ３４抗体からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１４に記載の検出方法。
  16. 　鉄イオン及び還元剤の存在下において、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の検出方法。
  17. 　エンドサイトーシスを誘導する物質及び細胞膜タンパク質の安定化作用を有するイオンからなる群より選ばれる少なくとも一種の存在下において、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の検出方法。
  18. 　０．１μＭ～１００ｍＭの濃度の前記標識用物質を用いて、前記被検細胞を含む前記末梢血含有試料と前記標識用物質とをｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて接触させる請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の検出方法。
  19. 　１℃～４２℃の条件下において、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、標識させる請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の検出方法。
  20. 　１分～５時間、前記被検細胞に前記標識用物質を取り込ませ、標識させる請求項１から請求項１９のいずれか一項に記載の検出方法。
  21. 　標識用物質と、細胞腫識別用抗体及び洗浄液からなる群より選ばれる少なくとも一方とを含む、癌細胞検出用キット。
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