JP5563170B2 - ナノ粒子を単離するためのシステム、材料および方法 - Google Patents

Description

本出願は、組成物からナノ粒子を単離する方法に関する。

多くの消費材製品は、廃水流中に放出され得るナノ粒子を含んでいる。いくつかの種類のナノ粒子は、廃水処理から得られるスラッジ中に、そして最終的には土地還元後の土壌中にバイオソリッドとして、蓄積し得ることを示唆する証拠が増加している。これらのナノ粒子は、食物連鎖内で蓄積し、健康リスクをもたらす可能性がある。したがって、廃水流からこれらのナノ粒子を除去する必要性が高まっている。

ナノ粒子を単離するための典型的な方法には、溶液を濾過してナノ粒子を除去することが含まれる。しかしながら、これらの方法は、ナノメートルサイズの粒子を除去するために非常に微小な細孔サイズを有するフィルタを必要とする。微小な細孔サイズは、高圧および／または低流速を必要とするため、この方法は非効率的となり得る。

ナノ粒子を除去するための代替の方法は、ナノ粒子を凝集させて粒子サイズを増大させることである。この方法は、高いナノ粒子濃度の場合には効果的となり得るが、低濃度では、ナノ粒子の量が顕著な凝集を得るのに不十分であるため、効果的に作用しない可能性がある。

混合物からナノ粒子を単離するための方法が開示される。本方法は、複数のナノ粒子および少なくとも１種の熱ヒステリシス分子（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を有する水性混合物を用意することと、ナノ粒子の少なくとも一部を含む氷晶を水性混合物中で形成するために効果的な温度に水性混合物を調節することと、水性混合物から氷晶を単離することとを含む。

いくつかの実施形態において、単離することは、特定の密度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ）に基づいて氷晶を分離することを含む。いくつかの実施形態において、単離することは、水性混合物を遠心分離することを含む。

いくつかの実施形態において、単離することは、混合物から氷晶を濾過することを含む。いくつかの実施形態において、濾過することは、約１μｍを超えるサイズを有する成分を除去するように構成される。

いくつかの実施形態において、前記温度は、約０℃以下である。いくつかの実施形態において、前記温度は、約−０．５℃以下である。いくつかの実施形態において、前記温度は、約−４０℃以上である。いくつかの実施形態において、水性混合物は、単離する過程中、前記温度に維持される。

いくつかの実施形態において、氷晶は、少なくとも約５μｍの平均サイズを有する。いくつかの実施形態において、氷晶は、約２５０μｍ以下の平均サイズを有する。

いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約５００ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約１００ｎｍ以下の平均サイズを有する。

いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１種の無機材料を含む。いくつかの実施形態において、無機材料は、金属およびセラミックから選択される。いくつかの実施形態において、無機材料は、金、銀、銅、カドミウム、鉛、セレン、水銀、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１種の合成ポリマーを含む。

いくつかの実施形態において、水性混合物は、少なくとも５０容量％の水を含む。いくつかの実施形態において、水性混合物は、少なくとも８０容量％の水を含む。いくつかの実施形態において、水性混合物は、本質的に水である溶媒を含む。

いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、少なくとも約１μｇ／ｍＬの濃度で水性混合物中に存在する。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、少なくとも約１００μｇ／ｍＬの濃度で水性混合物中に存在する。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で水性混合物中に存在する。

いくつかの実施形態において、水性混合物は、少なくとも約１０ｐｐｍのナノ粒子を含む。

いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、不凍タンパク質または不凍糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、Ｉ型不凍タンパク質である。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、ＩＩ型不凍タンパク質である。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、ＩＩＩ型不凍タンパク質である。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、不凍糖タンパク質である。

いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、合成有機化合物である。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリカルボン酸、ポリグリセロール、メチルアクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、またはそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、ナノ粒子の少なくとも約５０重量％が、水性混合物から単離される。

本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、水を含む溶媒と、複数のナノ粒子と、熱ヒステリシス分子とを含む、ナノ粒子を単離するための組成物を含む。いくつかの実施形態において、溶媒は、少なくとも８０容量％の水を含む。いくつかの実施形態において、複数のナノ粒子は、少なくとも１種の無機材料を含む。いくつかの実施形態において、熱ヒステリシス分子は、不凍タンパク質または不凍糖タンパク質である。

上述の概要は、例示のみを目的としたものであり、決して限定を意図するものではない。上記した例示的な態様、実施形態および特徴に加えて、さらなる態様、実施形態および特徴が、図面および以下の発明を実施するための形態を参照することにより明らかとなる。

ナノ粒子を単離するための方法の例示的実施形態である。 ナノ粒子を単離するための方法において使用され得るスクリューポンプの例示的実施形態である。 ナノ粒子を単離するための方法において使用され得る遠心分離機の例示的実施形態である。

以下の発明を実施するための形態において、本発明の一部を成す添付の図面が参照される。図面において、文脈上異なる解釈が必要とされない限り、同じの符号は、典型的には同じ構成要素を指している。発明を実施するための形態、図面および特許請求の範囲に記載される例示的実施形態は、限定を意図するものではない。本明細書に示される主題の精神または範囲から逸脱せずに、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更がなされてもよい。本明細書において概説され、図に示されるような本開示の態様は、多種多様な構成で配設、置換、結合および設計することができ、その全てが明示的に企図され本開示の一部を成すことが、容易に理解されよう。

本明細書において、ナノ粒子を単離するための方法が開示される。これらの方法のいくつかの実施形態は、ナノ粒子を含有する氷晶を形成することと、これらのナノ粒子を単離することとを含む。本明細書において開示される方法は、例えば、非効率的な濾過または凝集手順を必要とすることなく低濃度のナノ粒子を単離することを可能とするため、有利となり得る。また、ナノ粒子を単離するための組成物も、本明細書において開示される。

本明細書において別段に具体的に指定されない限り、以下に記載の用語は、以下の定義を有する。

本明細書において使用される場合、「ナノ粒子」は、約２５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば直径）を有する任意の粒子を指す。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、固体または半固体である。

本明細書において使用される場合、「熱ヒステリシス分子」は、混合物の凝固点と融点との間の差を形成する分子である。例えば、純水に熱ヒステリシス分子を添加すると、約０℃の融点に対し、約−１℃に凝固点が低下し得る。熱ヒステリシスは、例えば、ナノリットル浸透圧計を使用して決定され得る。

ナノ粒子を単離するための方法
図１は、本明細書において開示される方法の一実施形態を表すフローチャートである。複数のナノ粒子および少なくとも１種の熱ヒステリシス分子を有する水性混合物が、ステップ１１０において用意される。例えば、熱ヒステリシス分子が、ナノ粒子を含有する水性混合物（例えば溶液）と合わせられてもよい。次いで、ステップ１２０において、ナノ粒子の少なくとも一部を含有する氷晶を形成するように、水性混合物の温度が調節されてもよい。次いで、ステップ１３０において、混合物から氷晶が単離され得る。本出願の教示に従い当業者に理解されるように、各ステップは順番に完了されてもよく、または、１つもしくは複数のステップがほぼ同時に完了されてもよい。一例として、ナノ粒子を含有する水性混合物に熱ヒステリシス分子を合わせるのとほぼ同時に、水性混合物の温度が調節されてもよい。

図１中のステップ１１０に戻ると、水性混合物の組成は、特に限定されない。水性混合物は、水、ナノ粒子および熱ヒステリシス分子を含んでもよい。様々な成分を互いに混合して分散液を形成してもよい。

いくつかの実施形態において、水性混合物は、氷晶が形成するように十分な量の水を含んでもよい。例えば、水性混合物は、溶媒として水およびエタノールを含んでもよい。エタノールに対する水の相対体積は、氷晶が形成するように、共晶点より大きくてもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物は、水が熱ヒステリシスを示すのに十分な量の水を含んでもよい。すなわち、水の量は、混合物中の水の融点が凝固点よりも大きくなるのに十分な量である。結晶を形成するために十分な水の量は、所与の溶媒系（例えば、水／エタノールか水／アセトンか）と共に変動する。本出願の教示に従い、当業者は、例えばナノリットル浸透圧計を使用して、所与の混合物中で結晶を形成するために十分な水の量を容易に決定することができる。

他の溶媒に対する混合物中の水の量は、例えば、少なくとも約５０容量％の水、少なくとも約６０容量％の水、少なくとも約７０容量％の水、少なくとも約８０容量％の水、少なくとも約９０容量％の水、少なくとも約９５容量％の水、少なくとも約９７容量％の水、少なくとも約９９容量％の水であってもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物は、本質的に水からなる溶媒を含む。すなわち、溶媒は、水の量が氷晶の形成を可能とするために十分である限り、水および任意の他の溶媒を含む。いくつかの実施形態において、水性混合物は、水からなる溶媒を含む。

いくつかの実施形態において、水性混合物は、少なくとも１種の有機溶媒を含んでもよい。有機溶媒は、例えば、非極性溶媒、極性非プロトン性溶媒、極性プロトン性溶媒、またはそれらの組合せであってもよい。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、水と混和性（例えば、極性非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒）である。水と混和性の有機溶媒の非限定的な例は、ケトン、エーテル、および、アセトン、テトラヒドロフランおよび酢酸等の有機酸を含む。他の溶媒に対する水性混合物中の有機溶媒の量は、例えば、約５０容量％以下、約４０容量％以下、約３０容量％以下、約２０容量％以下、約１０容量％以下、約５容量％以下、約３容量％以下、または約１容量％以下であってもよい。いくつかの実施形態において、水溶液は、有機溶媒を実質的に含まない。

水性混合物中のナノ粒子もまた、特に限定されない。ナノ粒子は、例えば、無機材料を含んでもよい。いくつかの実施形態において、無機材料は、金属、セラミック、またはそれらの組合せを含んでもよい。金属の非限定的な例は、金、銀、銅、カドミウム、鉛、セレン、水銀、またはそれらの組合せを含む任意の材料を含む。これらの金属は、純金属、合金、または金属酸化物であってもよい。セラミックの一例は、二酸化ケイ素であるが、本出願は、いかなる特定の材料にも限定されない。ナノ粒子は、全て単一種類のナノ粒子であってもよく、または、２種以上の異なるナノ粒子の混合物を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１種のポリマーを含んでもよい。ポリマーのいくつかの例は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（１−トリメチルシリル−１−プロピン）（ＰＴＭＳＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−プロピレン）（ＥＰＲ）、エチレン−プロピレン−ブタジエンターポリマー（ＥＰＤＭ）、ポリアクリレート、ならびにそれらの混合物およびコポリマーを含むが、これらに限定されない。ポリマーは、例えば、少なくとも約１０００Ｄａ、少なくとも約５０００Ｄａ、少なくとも約１００００Ｄａ、または少なくとも約５００００Ｄａの重量平均分子量を有してもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーは、合成ポリマーである。

他の材料がナノ粒子に含まれてもよい。例えば、ナノ粒子は、Ｃ_６０（すなわちバッキーボール）等のフラーレン、単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ等を含んでもよい。

ナノ粒子の形状は特に限定されず、本出願の方法は、異なる構造を有する様々なナノ粒子と共に使用することができる。例えば、ナノ粒子は、中心対称性、ロッド形状等であってもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、２つ以上の別個の異なる成分を有する「Ｊａｎｕｓ粒子」である。

ナノ粒子のサイズもまた、特に限定されない。いかなる特定のサイズにも制限されないが、本出願の方法は、微小ナノ粒子（例えば約５０ｎｍ未満のサイズ）に特に有利である。ナノ粒子は、例えば、約２５００ｎｍ未満、約２０００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、約７５０ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満の平均サイズ（例えば直径）を有してもよい。ナノ粒子は、例えば、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、または少なくとも約５０ｎｍの平均サイズを有してもよい。一例として、ナノ粒子は、約１０ｎｍから約２０ｎｍまでの範囲内の平均サイズを有してもよい。

本明細書において開示される方法により単離され得るナノ粒子のいくつかの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００７／００１２１８９号、米国特許第７８２０９２１号、米国特許出願公開第２００８／０２０６５６２号、米国特許出願公開第２００８／０２３４３９４号および米国特許第７３８１４６５号に記載されている。

様々な量のナノ粒子が、水性混合物中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物は、所定の閾値を超えるナノ粒子の量を含む。例えば、５００ｐｐｍを超えるナノ粒子の濃度は望ましくないと決定され得る。したがって、水性混合物は、約５００ｐｐｍ以上のナノ粒子濃度を含んでもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物は、ナノ粒子の少なくとも一部の除去を必要とする混合物として特定される。水性混合物は、例えば、少なくとも約１０ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約２５ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約５０ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約１００ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約２５０ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約５００ｐｐｍのナノ粒子、少なくとも約１ｇ／Ｌのナノ粒子、または少なくとも約５ｇ／Ｌのナノ粒子を含んでもよい。水性混合物は、例えば、約２０ｇ／Ｌ以下のナノ粒子の量を有してもよく、約１０ｇ／Ｌ以下、約５ｇ／Ｌ以下、約１ｇ／Ｌ以下、約７５０ｐｐｍ以下、約５００ｐｐｍ以下、約２５０ｐｐｍ以下、または約１００ｐｐｍ以下を含んでもよい。一例として、水性混合物は、約１０ｐｐｍから約１ｇ／Ｌまでの範囲内のナノ粒子の量を有してもよい。

本出願はまた、いかなる特定の熱ヒステリシス分子にも限定されない。多くの熱ヒステリシス分子が当該技術分野において知られており、本出願の方法は、それらの知られた熱ヒステリシス分子のいずれか１種を含み得ることが企図される。

熱ヒステリシス分子の１つの種類は、不凍タンパク質および不凍糖タンパク質である。不凍タンパク質および不凍糖タンパク質は、周知であり、広く報告されている。これらの不凍タンパク質のタンパク質配列の多くが決定されており、公共データベースを通して入手可能である。表１は、文献において報告されている不凍タンパク質および不凍糖タンパク質の非限定的なリストを示す。これらの分子の多くは魚類から得られるが、他の多くの動物および植物が、不凍タンパク質を含むことが判明している。表２は、魚類以外の動物および植物から得られるいくつかの非限定的な例示的不凍タンパク質および不凍糖タンパク質を示す。

不凍タンパク質および不凍糖タンパク質は、（ｉ）ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０００／００５１２、（ｉｉ）Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｊ．およびＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｏｌａｒ ｆｉｓｈｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（６）：２５８９〜９３（１９７７）、（ｉｉｉ）Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ ３５７：９２７〜９３５（２００２）、（ｉｖ）Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．およびＨｅｗ，Ｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：２４６０〜２４６８（１９９０）、（ｖ）米国特許第５６２７０５１号、（ｖｉ）Ｈｏｎ，Ｗ．ら、Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｗｉｎｔｅｒ Ｒｙｅ Ａｒｅ Ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：８７９〜８９９（１９９５）、（ｖｉｉ）Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ，Ｍ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｒｏｔ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４０：３８５〜９１（１９９９）、ならびに（ｖｉｉｉ）米国特許第５６５４２７９号等の様々な刊行物に記載されている。

不凍タンパク質は、少なくとも３つの種類のタンパク質を含むことが知られており、（ｉ）Ｉ型タンパク質は、約３０００Ｄａから約５０００Ｄａまでの範囲内の分子量を有するアラニンが豊富なポリペプチドであり、（ｉｉ）ＩＩ型タンパク質は、約１２０００Ｄａの分子量を有するシステインが豊富なポリペプチドであり、（ｉｉｉ）ＩＩＩ型タンパク質は、システインまたはアラニンが豊富ではなく、約６０００Ｄａの分子量を有する。一方、不凍糖タンパク質は、アラニン、トレオニンおよびＧａｌ−ＧａｌＮＡｃを含み、約２７００Ｄａから約３６０００Ｄａの分子量を有する。

いかなる特定の理論にも束縛されないが、これらの動物および植物は、低温条件下で生き残るために不凍タンパク質および不凍糖タンパク質を発達させたと考えられている。例えば、不凍タンパク質を有するほとんどの魚類は、温度が０℃未満に達し得る北極の水中に見られる。厳密な作用機序についてはまだ議論の余地があるが、不凍タンパク質は、結晶の表面に吸収し、氷晶が成長するのを防止すると考えられている。したがって、不凍タンパク質を含有する水性混合物は、融点より若干低い温度で微小な結晶を形成し得る。

いくつかの実施形態において、不凍タンパク質および不凍糖タンパク質は、本出願に記載される特定の種（または種の綱）のいずれかから単離され得る。例えば、本方法は、ニンジンから単離された不凍タンパク質を含んでもよい。不凍タンパク質および不凍糖タンパク質は、従来の方法により植物または動物から抽出され得る。タンパク質または糖タンパク質の単離および精製は、クロマトグラフィー手段、ならびに吸収、沈殿および蒸発により容易に達成され得る。多くは文献において説明されている他の方法が、当業者により使用されてもよい。不凍タンパク質および不凍糖タンパク質はまた、従来の化学合成または組換えＤＮＡ技術を使用して、合成により調製されてもよい。

また、熱ヒステリシス分子は、ポリマーであってもよい。熱ヒステリシスを示すことが知られているポリマーの非限定的な例は、ポリカルボン酸、ポリグリセロール、メチルアクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ（ビニルアルコール−ｃｏ−酢酸ビニル）を含むが、これらに限定されない。これらのポリマーの熱ヒステリシス特性は、（ｉ）米国特許第４４８４４０９号、（ｉｉ）米国特許第６３９１２２４号、（ｉｉｉ）日本国特許公開第２００９−１６７２９２号公報および（ｉｖ）米国特許第６６１６８５８号に記載されている。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、および他のカルボン酸含有アクリレートポリマー等のポリカルボン酸である。熱ヒステリシスポリマーは、単独で、または他のポリマーもしくは熱ヒステリシス分子と組み合わせて使用されてもよい。例えば、ポリ（アクリル酸）は、不凍タンパク質と組み合わせて使用されてもよい。

他の有機化合物も熱ヒステリシスを示すことが知られており、本出願の範囲内である。例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ１９９６／３０４５９およびＷＯ１９９９／１８１６９において、１，３−ｃｉｓ−シクロヘキサンジオールは熱ヒステリシスをもたらすことが示されている。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もまた、熱ヒステリシス分子として機能すると考えられている。

熱ヒステリシス分子の様々な組合せが、ナノ粒子を単離する方法において使用され得る。例えば、水溶液は、１種、２種、３種またはそれ以上の不凍タンパク質または不凍糖タンパク質を含んでもよい。別の例として、水溶液は、熱ヒステリシスを示す１種、２種、３種またはそれ以上のポリマーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、水溶液は、少なくとも１種の不凍タンパク質または不凍糖タンパク質と、熱ヒステリシスを示す少なくとも１種のポリマーとを含む。

水溶液中の熱ヒステリシス分子の濃度は、限定されるものではなく、熱ヒステリシス分子および水溶液中のナノ粒子の量等の様々な因子に依存して変動する。本出願の教示に従い、当業者は、熱ヒステリシス分子の適切な量を容易に決定することができる。水溶液中の熱ヒステリシス分子の濃度は、少なくとも約０．１℃、少なくとも約０．２℃、少なくとも約０．３℃、少なくとも約０．５℃、少なくとも約１．０℃、少なくとも約１．５℃、少なくとも約２．０℃、または少なくとも約３．０℃の熱ヒステリシスを生成するために有効であってもよい。

熱ヒステリシス分子の濃度は、例えば、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬであってもよい。熱ヒステリシス分子の濃度は、例えば、約３００ｍｇ／ｍＬ以下、約２００ｍｇ／ｍＬ以下、約１００ｍｇ／ｍＬ以下、約５０ｍｇ／ｍＬ以下、約３０ｍｇ／ｍＬ以下、約１０ｍｇ／ｍＬ以下、約５ｍｇ／ｍＬ以下、または約１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

水溶液のｐＨは、熱ヒステリシス分子の活性を改変し得る。例えば、Ｗｕ，Ｄ．ら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｒｖａｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｅｔｌｅ Ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ ｃａｎａｄｅｎｉｓ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｂ １６１：２７１〜２７８（１９９１）を参照されたい。したがって、水性混合物のｐＨは、任意選択で、熱ヒステリシス分子の特性を維持または変更するように調節されてもよい。本出願の教示に従い、当業者は、ナノ粒子を単離するための適切なｐＨを決定することができる。適切なｐＨは、溶液の組成、単離されるナノ粒子の種類、特定の熱ヒステリシス分子等の様々な因子に依存して変動し得る。例えば、ｐＨは、ナノ粒子を単離する前のｐＨに調節または維持されてもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物のｐＨは、所定のｐＨに調節または維持されてもよい。

水性混合物のｐＨは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、または少なくとも約７．５のｐＨに調節または維持されてもよい。水性混合物のｐＨは、約１２以下、約１１以下、約１０以下、約９以下、または約８以下のｐＨに調節または維持されてもよい。いくつかの実施形態において、水性混合物のｐＨは、約２から約１２までの範囲内のｐＨに調節または維持されてもよい。

いくつかの実施形態において、水性混合物のｐＨは、ｐＨ調整剤を添加することにより調節または維持され得る。ｐＨ調整剤は、ｐＨを低下させるための酸性化剤、ｐＨを上昇させるための塩基性化剤、およびｐＨを所望の範囲内に制御するための緩衝剤を含み得る。ｐＨ調整剤の非限定な例は、カルボン酸、リン酸およびスルホン酸、酸性塩（例えば、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、リンゴ酸一ナトリウム等）、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸塩、セスキ炭酸塩）、ボレート、シリケート、ホスフェート（例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ピロリン酸塩等）、イミダゾール等を含む。

再び図１に戻ると、ステップ１２０は、氷晶を形成するように水性混合物の温度を調節することを含む。氷晶をナノ粒子の周囲に優先的に形成するため、氷晶は、ナノ粒子の少なくとも一部を含み得る。いかなる特定の理論にも束縛されないが、結晶は、不均一核形成の結果としてナノ粒子を優先的に含むと考えられている。氷晶形成は、一般に、核形成および成長の２つのステップを含む。核形成は、分子が新たな結晶に配列する初期プロセスであり、成長は、既存の結晶への分子の追加が関与する。後者のプロセスは、熱ヒステリシス分子により阻害または遅延されると考えられている。核形成は、均一核形成または不均一核形成により生じ得る。不均一核形成は、新たな結晶を形成するための表面エネルギーを低下させる相境界または不純物を含むため、不均一核形成は、均一核形成よりも頻繁に生じる。水溶液中のナノ粒子は、不均一核形成の間に新たな結晶中に組み込まれる不純物として作用すると考えられている。

一般に、水性混合物は、水性混合物中で氷晶を形成するために効果的な温度に調節されてもよい。本出願の教示に従い、当業者は、適切な温度を容易に決定することができる。一般に、温度は、氷晶を形成するために十分低いが、溶液全体が凍結するのを防ぐために十分高くなるべきである。水性混合物は、例えば、約０℃以下、約−０．１℃以下、約−０．２℃以下、約−０．３℃以下、約−０．５℃以下、約−１．０℃以下、約−１．５℃以下、約−２．０℃以下、または約−２．５℃以下の温度に調節されてもよい。水性混合物は、例えば、約−４０℃以上、約−３０℃以上、約−２０℃以上、約−１０℃以上、約−８℃以上、約−５℃以上、または約−３℃以上の温度に調節されてもよい。

いくつかの実施形態において、水性混合物の温度は、水性混合物を冷却することにより調節されてもよい。例えば、水性混合物は、室温から約−１．０℃に冷却されてもよい。いくつかの実施形態において、温度は、所定の温度に調節される。水性混合物を冷却する速度は特に限定されないが、速度は、結晶形成に影響し得る。したがって、いくつかの実施形態において、水性混合物は、所定のプロトコルに従い冷却される。例えば、水溶液は、氷晶が形成されるまで、約３℃／分以下で冷却されてもよい。

氷晶のサイズは、多くの因子に依存して変動し得る。例えば、氷晶のサイズおよび構造は、特定の熱ヒステリシス分子およびその濃度に依存して変動し得る。温度もまた結晶サイズに影響し得る。氷晶は、例えば、少なくとも約１μｍ、少なくとも約４μｍ、少なくとも約８μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１２μｍ、または少なくとも約１５μｍの平均サイズを有してもよい。氷晶は、例えば、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約３０μｍ以下、約２５μｍ以下、または約２０μｍ以下の平均サイズを有してもよい。

再び図１に戻ると、ステップ１３０は、水性混合物から含んでいる氷晶を単離することを含み、氷晶は、ナノ粒子の少なくとも一部を含有する。

氷晶を単離する方法もまた、特に限定されない。いくつかの実施形態において、氷晶を単離することは、特定の密度に基づいて氷晶を分離することを含む。氷は水より低い密度を有するため（例えば、氷は約０．９２ｇ／ｃｍ^３となり得、水は約１．０ｇ／ｃｍ^３となり得る）、氷晶は、特定の密度差に基づいて分離され得る。したがって、例えば、方法は、水性混合物を遠心分離して、より低密度の成分を分離することを含んでもよい。

図２は、本出願の方法において使用され得るスクリューポンプの例示的実施形態である。スクリューポンプ２００は、スクリュー２２０を収容する筐体２１０を含む。入口導管２３０は、水性混合物を筐体２１０内に流入させるために使用され得る。スクリュー２２０は、遠心力および流動が生成され、より高密度の成分を導管２４０から流出すると共に、より低密度の成分を導管２５０から流出させるように回転され得る。筐体２１０は、比較的一定の温度を維持するために絶縁層２６０を任意選択で含んでもよい。したがって、氷晶を有する水性混合物は、入口導管２２０を通ってスクリューポンプ２００に進入し得る。氷晶の高濃度溶液は導管２５０から出ることができ、一方低減された濃度のナノ粒子を有する溶液は導管２４０から出ることができる。

図３は、本出願の方法において使用され得る１つの遠心分離機の別の例示的実施形態である。遠心分離機３００は、モータ３２０により駆動される回転体３１０を含み得る。入口導管３３０は、流体を回転体３１０に供給し得る。より低密度の流体は、回転軸により近い開口部を含む上部導管３４０で回収され得る。より高密度の流体は、上部導管３４０と比較して回転軸からより離れた開口部を含む下部導管３５０で回収され得る。したがって、氷晶を有する水性混合物が入口導管３３０を通して供給され得、氷晶の高濃度溶液が上部導管３４０を通して回収され得る。

スクリューポンプおよび遠心分離機の例を示したが、本出願は、いかなる特定の装置にも限定されない。一般に、特定の密度および／またはサイズに基づいて氷晶を単離する任意の方法が、本出願における方法に好適となり得る。

いくつかの実施形態において、氷晶は、そのサイズに基づいて単離され得る。例えば、水性混合物は、ある特定のサイズを超える氷晶を除去するために濾過され得る。具体例として、直径において約１０μｍの直径を有する氷晶の水溶液が、氷晶を除去するために約１μｍの平均細孔サイズを有するフィルタに通過され得る。

本出願の方法は、いくつかの実施形態において、ナノ粒子のサイズより大きい成分を除去するように構成されたフィルタ（例えば、フィルタは、ナノ粒子よりも大きい細孔サイズを有する）の使用を可能とするため、有利である。本出願の方法は、例えば、約１μｍより大きい成分を除去するように構成されたフィルタを含み得る。一方、溶液（例えば、いかなる氷晶も含まない溶液）からナノ粒子を濾過する従来の方法は、約１００ｎｍ未満の成分を除去するように構成されたフィルタを必要とし得る。一般に、より小さい成分を除去するように構成されたフィルタは、より高い圧力および／またはより低い流量を必要とする。したがって、氷晶の形成は、より効率的な濾過を実現し得る。

したがって、氷晶を単離するためのフィルタは、氷晶を除去するように構成され得る。いくつかの実施形態において、フィルタは、水溶液の液相中のナノ粒子（例えば、氷晶内に含有されないナノ粒子）を除去するように構成されない。氷晶を単離するためのフィルタは、例えば、少なくとも約１μｍ、少なくとも約４μｍ、少なくとも約８μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１２μｍ、または少なくとも約１５μｍのサイズを有する成分を除去するように構成され得る。例えば、フィルタは、フィルタが指定のサイズを下回る平均細孔サイズを有するためにその指定のサイズより大きい成分を除去するように構成され得る。

水性混合物は、単離する過程中、氷晶の存在を維持するために効果的な温度であってもよい。例えば、単離する過程中、温度は、氷晶が融解するのを防止するために十分に低温であってもよい。いくつかの実施形態において、温度は、図１中のステップ１２０において水溶液が調節される温度とほぼ同じ温度に維持されてもよい。例えば、水性混合物は、氷晶を形成させるために最初に約−２℃に冷却されてもよく、次いで、水性混合物は、単離する過程（例えば、遠心分離、濾過等）において、約−２℃に維持されてもよい。水性混合物は、例えば、約０℃以下、約−０．１℃以下、約−０．２℃以下、約−０．３℃以下、約−０．５℃以下、約−１．０℃以下、約−１．５℃以下、約−２．０℃以下、または約−２．５℃以下の温度に維持されてもよい。水性混合物は、例えば、約−４０℃以上、約−３０℃以上、約−２０℃以上、約−１０℃以上、約−８℃以上、約−５℃以上、または約−３℃以上の温度に維持されてもよい。

本出願の教示に従い当業者に理解されるように、水性混合物をさらに精製するために、様々な単離ステップが組み合わされてもよく、または繰り返されてもよい。例えば、ナノ粒子の量を連続的に低減するために、複数の遠心分離ステップが完了されてもよい。別の例として、水性混合物は、まず濾過され、次いで遠心分離されてもよく、または、水性混合物は、まず遠心分離され、次いで濾過されてもよい。１回または複数回の単離ステップが、連続プロセスまたはバッチ形式で完了されてもよい。

いくつかの実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の少なくとも約５０％を単離する。いくつかの実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の少なくとも約６０％を単離する。いくつかの実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の少なくとも約７０％を単離する。いくつかの実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の少なくとも約８０％を単離する。いくつかの実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の少なくとも約９０％を単離する。理想的な実施形態において、本出願の方法は、水性混合物中のナノ粒子の約１００％を単離する。

いくつかの実施形態において、本出願の方法（例えば、図１に示される方法）は、水性混合物をさらに精製するために繰り返されてもよい。例えば、方法は、氷晶の形成および単離の各サイクルにおいてナノ粒子の９０％を除去し得る。方法を２回繰り返すと、ナノ粒子の約９９％の除去が提供され得る。方法は、ナノ粒子を除去するために、１回、２回、３回またはそれ以上完了してもよい。いくつかの実施形態において、方法は、ナノ粒子の濃度が所定の最高濃度を下回るまで、反復して繰り返されてもよい。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、連続プロセスであり得る。例えば、熱ヒステリシス分子およびナノ粒子を含む混合物は、比較的一定の流速で槽に添加されてもよい。これらの成分は、槽内で混合され、冷却装置に結合した導管から回収される。各成分が比較的一定の速度で導管を通って流動する間に冷却されて、氷晶を形成し得る。導管は、氷晶を除去するフィルタに流体結合され得る。

また、本出願の方法の前、後またはその間に、様々な追加の処理ステップが含まれてもよいことが理解されよう。例えば、ナノ粒子を含有する混合物をまず粗いフィルタに通過させ、粗大固体を除去してもよい。また、いくつかの実施形態において、本方法は、ナノ粒子の高濃度溶液（例えば、遠心分離後に図３中の下部導管３から受容される流体）を生成してもよい。この高濃度溶液からナノ粒子を単離するために、ナノ粒子の凝集等の高濃度のナノ粒子を除去するための従来の方法が実行されてもよい。次いで、残りの液体は、処分されてもよく、またはナノ粒子を単離するための方法（例えば、図１に示される方法）を通してリサイクルされてもよい。

ナノ粒子を単離するための組成物
本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、ナノ粒子を単離するための組成物を含む。組成物は、例えば、水を含む溶媒と、複数のナノ粒子と、少なくとも１種の熱ヒステリシス分子とを含んでもよい。

組成物は、概して、ナノ粒子を単離する方法に従い調製された組成物のいずれであってもよい。したがって、例えば、組成物は、図１中のステップ１１０またはステップ１２０において提供される組成物であってもよい。したがって、組成物は、方法に関して本出願において記載される特徴のいずれかを有し得る。例えば、組成物は、少なくとも８０容量％の水を含む溶媒を含んでもよい。別の例として、組成物は、氷晶を含んでもよく、または約−１℃以下の温度に維持されてもよい。

前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、一実施形態において使用される１つまたは複数の要素は、そのような置き換えが技術的に実現不可能でない限り、別の実施形態においても交換可能に使用され得る。請求される主題の範囲から逸脱せずに、様々な他の省略、追加および修正が上述の方法および構造に行われてもよいことが、当業者に理解されよう。そのような修正および変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義される主題の範囲内に含まれることが意図される。

本明細書における実質的に全ての複数形および／または単数形の用語の使用に対して、当業者は、状況および／または用途に適切なように、複数形から単数形に、および／または単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形／複数形の置き換えは、理解しやすいように、本明細書で明確に説明することができる。

通常、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（たとえば、添付の特許請求の範囲の本体部）において使用される用語は、全体を通じて「オープンな（ｏｐｅｎ）」用語として意図されていることが、当業者には理解されよう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「含むがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきである、など）。導入される請求項で具体的な数の記載が意図される場合、そのような意図は、当該請求項において明示的に記載されることになり、そのような記載がない場合、そのような意図は存在しないことが、当業者にはさらに理解されよう。例えば、理解の一助として、添付の特許請求の範囲は、導入句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を使用して請求項の記載を導くことを含む場合がある。しかし、そのような句の使用は、同一の請求項が、導入句「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」および「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による請求項の記載の導入が、そのように導入される請求項の記載を含む任意の特定の請求項を、単に１つのそのような記載を含む発明に限定する、ということを示唆していると解釈されるべきではない（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味すると解釈されるべきである）。同じことが、請求項の記載を導入するのに使用される定冠詞の使用にも当てはまる。また、導入される請求項の記載で具体的な数が明示的に記載されている場合でも、そのような記載は、通常、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることが、当業者には理解されよう（例えば、他の修飾語なしでの「２つの記載（ｔｗｏ ｒｅｃｉｔａｔｉｏｎｓ）」の単なる記載は、通常、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣ、などの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている事例では、通常、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを共に、ＡおよびＣを共に、ＢおよびＣを共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。「Ａ、Ｂ、またはＣ、などの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている事例では、通常、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを共に、ＡおよびＣを共に、ＢおよびＣを共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に、などを有するシステムを含むが、それに限定されない）。２つ以上の代替用語を提示する事実上いかなる離接する語および／または句も、明細書、特許請求の範囲、または図面のどこにあっても、当該用語の一方（ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｒｍｓ）、当該用語のいずれか（ｅｉｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｒｍｓ）、または両方の用語（ｂｏｔｈ ｔｅｒｍｓ）を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者にはさらに理解されよう。例えば、句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」あるいは「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されよう。

さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループで記載される場合、本開示がまたマーカッシュグループの任意の個々の要素または要素のサブグループでも記載されていることが、当業者に理解されよう。

当業者に理解されるように、ありとあらゆる目的において、例えば文章による説明の提供に関して、本明細書において開示された全ての範囲は、そのありとあらゆる可能な部分範囲および部分範囲の組合せをも包含する。任意の列挙された範囲は、少なくとも等価な２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分割された同じ範囲についても十分に説明するものであり有効であることが、容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書において議論される各範囲は、下限側の３分の１、中間の３分の１、および上限側の３分の１等に容易に分割され得る。同じく当業者に理解されるように、「〜まで」、「少なくとも」、「〜を超える」、「未満」等の用語は全て、挙げられた数を含み、上述のような部分範囲に実質的に分割され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は、個々の要素のそれぞれを含む。したがって、例えば、１〜３個の物品を有する群は、１個、２個または３個の物品を有する群を指す。同様に、例えば、１〜５個の物品を有する群は、１個、２個、３個、４個または５個の物品を有する群を指す。

本明細書において様々な態様および実施形態が開示されたが、他の態様および実施形態も当業者に明らかであろう。本明細書において開示された様々な態様および実施形態は、例示を目的とし、限定を意図せず、真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲により示される。

実施例
以下の実施例において、追加の実施形態をさらに詳細に開示するが、実施例は、決して特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。

ナノ粒子として５００ｐｐｂ（ｐｐｂ＝０．００００００１％）のフラーレン（Ｃ_６０）を含有する水を処理する。Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ， Ｍ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｒｏｔ （Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３４０：３８５〜９１（１９９９）に開示されるように、ニンジンの根（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）から、不凍糖タンパク質を得る。リン酸緩衝生理食塩水、炭酸水素アンモニウム、または他の適切な緩衝剤を添加することによりｐＨレベルを約７．５〜７．９に調節しながら、１ｍｇ／ｍＬの不凍糖タンパク質を水に添加する。混合物を−０．３℃で４０分間保存し、多数の非常に微細な氷晶を形成させる。これらの氷晶の少なくとも一部は、フラーレンを含む。遠心分離機を用いて氷晶を除去する。

ナノ粒子として１００ｐｐｂの金ナノ粒子を含有する水を処理する。炭酸水素アンモニウムまたは他の適切な緩衝剤を添加することによりｐＨレベルを約７．９に調節しながら、Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｓｈｉｋａｒｉｅｎｓｉｓ（米国特許第７４４２７６９号を参照）から得られた２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質を水に添加する。混合物を０．９℃で６０分間保存し、多数の非常に微細な氷晶を形成させる。これらの氷晶の少なくとも一部は、金ナノ粒子を含む。フィルタを用いて氷晶を除去する。

Claims (20)

1. 複数の２５００ｎｍ未満のサイズの粒子および少なくとも１種の熱ヒステリシス分子を含む水性混合物を用意することであって、前記水性混合物は１ｇ／Ｌ以下の前記粒子の量を含む、ことと、
   前記水性混合物全体を凝固させることなく前記水性混合物中で氷晶を形成するための温度に前記水性混合物を調節する工程であって、前記氷晶は前記粒子の少なくとも一部を含む、ことと、
   前記水性混合物から前記氷晶を単離することであって、前記水性混合物から前記氷晶を濾過すること、または前記氷晶と前記水性混合物の溶液との間の特定の密度差に基づいて前記氷晶を単離するために前記水性混合物に遠心力を加えることのうち、少なくとも１つを含む、ことと
   を含む、混合物から前記粒子を単離するための方法。
2. 前記単離することが、前記氷晶と前記水性混合物の溶液との間の特定の密度差に基づいて前記氷晶を分離することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記単離することが、前記水性混合物を遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記単離することが、混合物から氷晶を濾過することを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記濾過することが、１μｍを超えるサイズを有する成分を除去するように構成される、請求項４に記載の方法。
6. 前記温度が、０℃以下である、請求項１に記載の方法。
7. 前記水性混合物が、単離する過程中、前記温度で維持される、請求項１に記載の方法。
8. 前記粒子が、少なくとも１種の無機材料を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記無機材料が、金属およびセラミックからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記無機材料が、金、銀、銅、カドミウム、鉛、セレン、水銀、またはそれらの組合せを含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記熱ヒステリシス分子が、少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で前記水性混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。
12. 前記水性混合物が、少なくとも１０ｐｐｍの前記粒子を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記熱ヒステリシス分子が、不凍タンパク質または不凍糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
14. 前記熱ヒステリシス分子が、Ｉ型不凍タンパク質である、請求項１に記載の方法。
15. 前記熱ヒステリシス分子が、ＩＩ型不凍タンパク質である、請求項１に記載の方法。
16. 前記熱ヒステリシス分子が、ＩＩＩ型不凍タンパク質である、請求項１に記載の方法。
17. 前記熱ヒステリシス分子が、不凍糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
18. 前記熱ヒステリシス分子が、合成有機化合物である、請求項１に記載の方法。
19. 前記熱ヒステリシス分子が、ポリマーである、請求項１に記載の方法。
20. 前記ポリマーが、ポリカルボン酸、ポリグリセロール、メチルアクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレート−ｃｏ−ビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、またはそれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。

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