JP5490283B2

JP5490283B2 - ケトール脂肪酸の包接化合物

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Publication number: JP5490283B2
Application number: JP2013087577A
Authority: JP
Inventors: 一輝 ▲高▼木; 峰幸横山; 令二宮原; 治男島田
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Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2033-04-18
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Description

本発明は、シクロデキストリンを用いたケトール脂肪酸の安定化又は保存方法、シクロデキストリンで包接されたケトール脂肪酸の包接化合物、及び当該包接化合物の製造方法に関する。

炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸のカルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位またはγ位の位置にあり、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在するケトール脂肪酸（以下、特定のケトール脂肪酸という）は、植物花芽形成促進作用、植物賦活作用、及びそれらを包含する植物成長調整作用を有する植物ホルモンとして知られている。その中で、特に、９-ヒドロキシ-１０-オキソ-cis-１２(Ｚ),１５(Ｚ)-オクタデカジエン酸（以下、ＫＯＤＡという）はさまざまな植物種において存在することが知られており、特に優れた植物成長調整作用を有する(特許文献１〜４)。

特定のケトール脂肪酸は、上記のように優れた作用を有する植物ホルモンであるが、ケトールと二重結合を含んでいることから、水溶液、特級や１級エタノールなどの溶媒系での安定性は良好とはいえず、輸送や保管は、-２０℃〜-８０℃といった低温で、しかもエタノール溶液状態でなければ貯蔵できず、常温での流通が難しかった。植物ホルモンである特定のケトール脂肪酸の利用を図るために、特定のケトール脂肪酸を常温での流通を可能にする技術が望まれており、これまで使用する溶媒系や、安定化剤について種々検討されてきた。それにより、不揮発性不純物が０．０００５％以下である純化された有機溶媒中で保存する方法（特許文献５）や、ケトール脂肪酸を溶媒中でヒドロキサム酸類と共存させる方法（特許文献６）が開発されていた。

特開平９-２９５９０８号公報特開平１１-２９４１０号公報特開２００１-１３１００６号公報特開２００９-１７８２９号公報特開２００１-６４２２９号公報特開２００３−１１３１３９号公報

従来の研究により、溶液状態で一定の安定性をもって貯蔵することが可能になってはいたものの、固体状態で高い安定性を与える方法については未だ得られておらず、特定のケトール脂肪酸を常温、固体状態で安定化する方法が望まれていた。常温、固体状態での安定化は、流通の面で特に利点がある。

本発明者らが、特定のケトール脂肪酸を安定化させる方法について数多くの安定化剤を配合したり、保存条件を検討するなど鋭意研究を行った結果、数多ある安定化剤の中で、驚くべきことにシクロデキストリンを用いて、特定のケトール脂肪酸のうちの一つであるＫＯＤＡを包接した場合に、ＫＯＤＡの安定性が増加するばかりでなく、粉末化した場合にも安定性を保つことができることを見出した。したがって、本発明者らは、上記発見に基づき、下記の発明を完成させた。

[１] 炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸のカルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位またはγ位の位置にあり、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在する、ケトール脂肪酸又はその塩と、シクロデキストリンからなる、包接化合物。
[２] 前記ケトール脂肪酸の炭素原子数が１８であり、かつ、炭素間の二重結合が２か所存在する、項目[１]に記載の包接化合物。
[３] 前記ケトール脂肪酸が、以下の式（Ｉ）：

で表される９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸である、項目[１]又は[２]に記載の包接化合物。
[４] 前記シクロデキストリンが、β-デキストリン及び／又はγ-デキストリンである、項目[１]〜[３]のいずれか一つに記載の包接化合物。
[５] 前記包接化合物が、固体状態の包接化合物である、項目[１]〜[４]に記載の包接化合物。
[６] 項目[１]〜[５]のいずれか一つに記載の包接化合物の製造方法であって、前記ケトール脂肪酸と、シクロデキストリンとを溶液中で混合する工程を含む、前記製造方法。
[７] 炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸のカルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位またはγ位の位置にあり、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在する、ケトール脂肪酸又はその塩の保存方法であって、シクロデキストリンと、上記ケトール脂肪酸とを溶液中で混合し、乾燥する工程を含む、前記保存方法。
[８] 前記乾燥工程が、凍結乾燥である、項目[７]に記載の保存方法。
[９] 溶媒で前記ケトール脂肪酸を抽出する工程を含む、項目[７]又は[８]に記載の保存方法。
[１０] 前記ケトール脂肪酸の炭素原子数が１８であり、かつ、炭素間の二重結合が２か所存在する、項目[７]〜[９]のいずれか一項に記載の前記保存方法。
[１１] 前記ケトール脂肪酸が、以下の式（Ｉ）：

で表される９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸である、項目[１０]に記載の前記保存方法。

本発明により、シクロデキストリンにより特定のケトール脂肪酸を包接させることにより、特定のケトール脂肪酸の安定化が可能になり、長期間の常温での保存が可能となった。

図１は、各種シクロデキストリンによりＫＯＤＡを包接したことを示す図である。図２は、各種シクロデキストリンにより包接されたＫＯＤＡの保存安定性を示す図である。図３は、γ−シクロデキストリンに包接されたＫＯＤＡを、温度を変えて貯蔵した際における保存安定性を示す図である。図４は、各種シクロデキストリンにより包接されたＫＯＤＡの貯蔵後において、生成したＤ−ＫＯＤＡの濃度を示す図である。図５は、γ−シクロデキストリンに包接されたＫＯＤＡを、温度を変えて貯蔵した際における生成したＤ−ＫＯＤＡの濃度を示す図である。図６は、各種シクロデキストリンにより包接されたＫＯＤＡの貯蔵後において、活性成分（ＫＯＤＡ及び貯蔵中に生成したＤ−ＫＯＤＡ）の残存率を示す図である。図７は、γ−シクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡを、温度を変えて貯蔵した際における活性成分（ＫＯＤＡ及び貯蔵中に生成したＤ−ＫＯＤＡ）の残存率を示す図である。

本発明は、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸のカルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位またはγ位の位置にあり、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在する、ケトール脂肪酸（特定のケトール脂肪酸）又はその塩が、シクロデキストリンにより包接されている、上記ケトール脂肪酸又はその塩の包接化合物に関する。

本発明において、好ましい特定のケトール脂肪酸は、炭素原子数が１８であり、また好ましい特定のケトール脂肪酸では、炭素間の二重結合が２か所存在する。所望の植物賦活効果を発揮するうえでは、カルボニル基を構成する炭素原子と、水酸基が結合した炭素原子とは、α位の位置にあることが好ましい。より好ましくは、特定のケトール脂肪酸は、以下の式（Ｉ）：

で表される化合物（ＫＯＤＡ）である。

本発明における特定のケトール脂肪酸は、様々な植物成長調整作用を有する。成長調整作用とは、植物の成長に関わる現象を調整する作用であり、具体的には、例えば植物の成長促進、成長抑制、ストレス抑制、花芽形成誘導、花芽形成抑制、結実促進、休眠防止、ストレス耐性などの作用を意味するものである。植物の成長促進・抑制には、植物の各部位ごとの作用が含まれており、例えば根、茎、葉、又は花の成長促進・抑制が含まれる。

本発明における特定のケトール脂肪酸の製造方法は、例えば特許文献３に記載されており、天然物から抽出精製する抽出法、不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼ等の酵素を、植物体内における脂肪酸代謝経路に準じて作用させる酵素法、並びに所望する特定ケトール脂肪酸の具体的構造に応じて，通常公知の化学合成法を駆使する化学合成法のいずれかにより、特定ケトール脂肪酸を得ることができる。

本発明における特定のケトール脂肪酸は、包接の間において部分的変換を受けて生じる生成物であっても、当該一部分解生成物が、上記特定のケトール脂肪酸の定義に合致する限り（すなわち、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸のカルボニル基を構成する炭素原子と水酸基が結合した炭素原子が、α位またはγ位の位置にあり、炭素間の二重結合が１〜６か所（ただし、この二重結合数は、ケトール脂肪酸の炭素結合数を超えることはない）存在する、ケトール脂肪酸である限り）は、元の特定のケトール脂肪酸と同様に植物成長調整作用を有する。より具体的に、以下の式（Ｉ）：

で表されるＫＯＤＡは、包接の間において部分的な変換を受けて、以下の式（II）：

で表されるＤ−ＫＯＤＡへと変換されるが、Ｄ−ＫＯＤＡも特定のケトール脂肪酸の一種であり、ＫＯＤＡと同様に植物成長調整作用を有する。

したがって、本発明において、「保存」は、特定のケトール脂肪酸の貯蔵後において、貯蔵前の特定のケトール脂肪酸と同一の特定のケトール脂肪酸が変換・分解を受けずに存在することをいうが、特定のケトール脂肪酸の活性の有無の観点から、貯蔵後において同様の活性を有する別の特定のケトール脂肪酸へと変換・分解された場合も「保存」に含まれるものとする。

保存の際の貯蔵温度は、任意の温度が選択されてもよく、例えば、−２００℃〜１００℃のあいだで選択することができる。貯蔵温度は、所望の保存期間及び残存率に応じて当業者であれば適宜選択することができる。温度の上限として、例えば６０℃、５０℃、４０℃、３５℃及び３０℃からなる群から選択されてもよく、温度の下限として、例えば−２００℃、−８０℃、−２０℃、０℃、４℃、１０℃、１５℃、２０℃、及び２５℃からなる群から選択されてもよい。室温、例えば約２５℃においても、本願の包接化合物は長期間にわたる優れた貯蔵安定性を示すことができるが、低温であるほどより貯蔵安定性が高まる。一方で、生理活性成分を保存する観点では、室温や室温より高い温度、例えば２５℃や４０℃であっても長期の貯蔵安定性が示されていることから（図７）、室温（通常２５℃）で保存されてもよい。流通の観点から、４℃又は室温の温度で貯蔵することが好ましい。

本発明における特定のケトール脂肪酸の塩は、特定のケトール脂肪酸の植物成長調整作用を損なわないものであることが好ましいが、貯蔵後に特定のケトール脂肪酸の塩を特定のケトール脂肪酸よりも強い酸で処理すれば遊離酸を容易に取得できることから、特定のケトール脂肪酸の植物成長調整作用が失われている塩であってもよい。特定のケトール脂肪酸の塩として、無機塩基又は有機塩基のいずれかとの塩であってもよく、上記ケトール脂肪酸の製造方法の過程で得られるケトール脂肪酸の塩であってもよいし、ケトール脂肪酸を無機塩基又は有機塩基と反応させることにより得られる塩であってもよい。具体的にナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの無機塩や、アンモニア塩などの有機塩が挙げられる。

本発明の包接化合物は、特定のケトール脂肪酸又はその塩と、シクロデキストリンとを溶液中で混合することにより製造される。より具体的に、シクロデキストリン溶液、例えばシクロデキストリン水溶液と、特定のケトール脂肪酸又はその塩の溶液とを混合攪拌することにより包接が生じる。特定のケトール脂肪酸は、低温で貯蔵されていたものを使用することから、貯蔵時に使用される溶媒、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの有機溶媒に溶解した溶液が使用される。貯蔵時に使用される溶媒の点から、ケトール脂肪酸のエタノール溶液や、ヒドロキサム酸類が溶解した水溶液を用いることが好ましい。攪拌が行われる温度は、シクロデキストリン及び特定のケトール脂肪酸が分解せずに包接が生じる範囲であれば任意の温度であってよく、好ましくは０℃、５℃、１０℃、及び１５℃から選ばれる下限値、及び１５℃、２０℃、２５℃、３０℃及び４０℃から選ばれる上限値により規定される任意の範囲（ただし下限値が上限値より大きいことはない）で行われ、さらに好ましくは室温（２５℃）で行われる。攪拌時間は、包接が実質的に生じなくなるまで行われればよく、例えば３時間行われる。操作時間を短縮する観点からは、実質的な包接が生じない範囲内で短い攪拌時間が好ましく、例えば攪拌時間が２時間以内、１．５時間以内、１時間以内、３０分間以内、１５分間以内、１０分間以内、及び５分間以内のいずれかから選ばれる時間の間行われるのが好ましい。好ましくは、攪拌は５分〜３時間、より好ましくは１５分〜２時間、さらに好ましくは３０分〜１時間行われる。包接が済んだ化合物は、その溶解度が低下し、沈殿を形成する。沈殿を、遠心分離（５０００〜１５０００ｒｐｍ）により遠心分離を行い、乾燥、好ましくは凍結乾燥を行い、固体状態の包接化合物が得られる。

本発明は、シクロデキストリンにより包接された特定のケトール脂肪酸の包接化合物のみならず、未包接のシクロデキストリンを含む貯蔵用の組成物であってもよい。好ましくは当該組成物は、粉末組成物であり、さらに好ましくは安定剤であるヒドロキサム酸類などを更に含んでいてもよい。

特定のケトール脂肪酸を包接する場合のシクロデキストリンの量については、特定のケトール脂肪酸に対して過剰量であればよく、包接する特定のケトール脂肪酸のモル当量の範囲として、下限が、１倍、２倍、３倍及び５倍モル当量からなる群から選ばれ、上限が１０倍、２０倍、４０倍、５０倍及び１００倍モル当量からなる群から選ばれる範囲が選択される。好ましくは、１倍〜４０倍モル当量であり、十分な包接が行われる観点では、３〜２０倍当量であることが好ましい。より好ましくは５〜１０倍当量で包接が行われる。

本発明において、「シクロデキストリン」とは、５以上のグルコースが１−４グルコシド結合により環を形成した環状オリゴ糖のことを指す。ここでグルコースの数は、化合物を包接する観点から、５〜１０が好ましく、より好ましくは６〜８である。特にグルコースの数が６個のシクロデキストリンはα-シクロデキストリン、７個のデキストリンはβ-シクロデキストリン、及び８個のシクロデキストリンはγ-シクロデキストリンと呼ばれており、それらの環状構造の内部に種々の小分子を包接することができることが知られている。シクロデキストリンの内径は、α体で約０．４５-０．６ｎｍ、β体で約０．６-０．８ｎｍ、γ体で約０．８-０．９５ｎｍであることが知られている。シクロデキストリンにより、特定のケトール脂肪酸を包接し、その後回収する観点からは、β-シクロデキストリン及びγ-シクロデキストリンが好ましい。

本発明において「包接」とは、ある分子の３次元構造中にできた空間に、適当な大きさの別の分子が入ることをいう。より具体的に、本発明では、環構造を形成するシクロデキストリンの中央部に該当する部位に、特定のケトール脂肪酸の鎖が入り込むことにより包接が行われると考えられる。シクロデキストリンの中央部は、疎水性であり、特定のケトール脂肪酸の分解を抑制する観点から、シクロデキストリンが、特定のケトール脂肪酸の二重結合部位を包接していると考えられるが、包接される部位は限定されるものではない。通常１の特定のケトール脂肪酸に対し、１のシクロデキストリンが包接すると考えられるが、安定性を増加させる観点では、２以上のシクロデキストリンが包接していてもよい。

本発明において、「固体状態」とは、本発明の包接化合物が固体の状態にあることを指す。すなわち、固体状態とは、包接化合物の融点以下の温度にて、かつ溶媒に溶解していない状態をいう。たとえば、沈殿している状態も固体状態に含まれるが、本発明において好ましくは、固体状態は、本発明の包接化合物が凍結乾燥処理により乾固されて生じた粉末の状態である。

本発明において保存期間の終了後に、シクロデキストリン包接ケトール脂肪酸から、ケトール脂肪酸を抽出して、又は抽出せずにそのまま使用することができる。抽出を行う場合、ケトール脂肪酸が溶解し、シクロデキストリンが溶解しない溶媒を用いて、シクロデキストリン包接ケトール脂肪酸からケトール脂肪酸を抽出することができる。抽出溶媒としては、ケトール脂肪酸の溶解度が高い一方で、シクロデキストリンの溶解度が低い溶媒であれば任意の溶媒を使用することができ、例えばアルコール類や、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルムなどの有機溶媒を用いることができるが、特にエタノールが好ましい。

実施例１：シクロデキストリンによるＫＯＤＡの包接
（１）α-シクロデキストリン
α‐シクロデキストリン（１．５６ｇ，１６ｍｍｏｌ）（塩水港精糖株式会社、デキシーパールα−１００）に純水を加え９５ｍＬとした後に、マグネティックスターラーを用いて溶解させた。このα-シクロデキストリン溶液に、特許文献３に記載の酵素法により得られた３２ｍＭのＫＯＤＡのエタノール溶液５ｍＬ（１．６ｍｍｏｌ）を加えマグネティックスターラーにて３時間攪拌した。攪拌後、白色の沈殿を含む混合液を得た。

（２）β‐シクロデキストリン
β‐シクロデキストリン（１．８１ｇ，１６ｍｍｏｌ）（塩水港精糖株式会社、デキシーパールβ−１００）に純水を加え９５ｍＬとした後に、マグネティックスターラーを用いて溶解させた。このα-シクロデキストリン溶液に、特許文献３に記載の酵素法により得られた３２ｍＭのＫＯＤＡのエタノール溶液５ｍＬ（１．６ｍｍｏｌ）を加えマグネティックスターラーにて３時間攪拌した。攪拌後、白色の沈殿を含む混合液を得た。

（３）γ-シクロデキストリン
γ‐シクロデキストリン（２．０７ｇ，１６ｍｍｏｌ）（塩水港精糖株式会社、デキシーパールγ−１００）に純水を加え９５ｍＬとした後に、マグネティックスターラーを用いて溶解させた。このα-シクロデキストリン溶液に、特許文献３に記載の酵素法により得られた３２ｍＭのＫＯＤＡエタノール溶液５ｍＬ（１．６ｍｍｏｌ）を加えマグネティックスターラーにて３時間攪拌した。攪拌後、白色の沈殿を含む混合液を得た。

包接の確認
シクロデキストリンによるＫＯＤＡの包接時に、３０分おきに２．５時間までサンプル採取を行った。包接時に生成する包接物と考えられる白色の沈殿を遠心分離にて沈殿させた後に、上澄み液を採取し、ＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１００Ｓｅｒｉｅｓ、移動相溶媒：５０％アセトニトリル（０．０２%トリフルオロ酢酸を含む）、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、カラム温度：４０℃、サンプル導入量：１０μＬ、検出波長：２１０ｎｍ）にて上澄み液中のＫＯＤＡ濃度を確認した。この結果を図１に示す。この結果より、α‐シクロデキストリン溶液にＫＯＤＡエタノール溶液を添加後、上澄み液中のＫＯＤＡ濃度が低下していたため、ＫＯＤＡがシクロデキストリンに包接されていると考えられた。また、βおよびγ‐シクロデキストリンにＫＯＤＡエタノール溶液を添加後、上澄み液中のＫＯＤＡ濃度は３０分で速やかに低下していたため、ＫＯＤＡがシクロデキストリンに包接されていると考えられる。特にβ‐シクロデキストリンの包接速度は極めて早くＫＯＤＡエタノール溶液添加直後に白沈の生成が認められ、上澄み中のＫＯＤＡ濃度が即座に低下していた（図１）。

実施例２：シクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡの粉末化
α−、β−、又はγ−シクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡを含む混合液を、マグネティックスターラーを用いて攪拌しながら、５００μＬづつチューブに分注し、遠心濃縮（２５℃、１，１２０ｒｐｍ）によりエタノールを除去した。この後に凍結乾燥を行いシクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡを粉末化した。コントロール実験として、ＫＯＤＡエタノール溶液（１．６ｍＭ）を５００μＬチューブに取り、濃縮乾固したものを調製した。

実施例３：シクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡの保存安定性試験
実施例２で粉末化しされたシクロデキストリン包接ＫＯＤＡを４０℃にて１２０日間貯蔵し、残存しているＫＯＤＡの保存安定性を試験した。貯蔵開始後０日、５日、１０日、１５日、２０日、３０日、４５日、６０日、７５日、９０日、１０５日および１２０日後にサンプリングを行った。回収したサンプル（チューブに入った状態の粉末化したシクロデキストリン包接ＫＯＤＡ）に５００μＬのエタノールを加え、ＫＯＤＡを抽出した。３時間抽出を行い、適宜攪拌しながら抽出を行った。抽出後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）にてシクロデキストリンを沈殿させた後に、上澄みのエタノールを２００μＬ取り出し、ＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１００Ｓｅｒｉｅｓ、移動相溶媒：５０％アセトニトリル（０．０２%トリフルオロ酢酸を含む）、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、カラム温度：４０℃、サンプル導入量：１０μＬ、検出波長：２１０ｎｍ）にて上澄みエタノール中のＫＯＤＡ濃度を確認した。コントロール実験として、ＫＯＤＡエタノール溶液を濃縮乾固したものも、４０℃にて保存安定性の確認を行った。

保存安定性試験の結果
ＫＯＤＡの保存安定性
この結果、ＫＯＤＡの保存安定性は図２に示す通りとなった。β‐シクロデキストリンにてＫＯＤＡを包接したものに関しては、貯蔵開始後２０日で８２％のＫＯＤＡが残存していた。また貯蔵開始後６０日でも５６％と半分以上のＫＯＤＡが残存していた。γ‐シクロデキストリンにてＫＯＤＡを包接したものに関しては、貯蔵開始後２０日で５５％、６０日後で２８％のＫＯＤＡが残存していた。これに対し、コントロールであるＫＯＤＡのみを濃縮乾固させたものでは、貯蔵開始後１日でその残存率は４．５％にまで低下していた。また、貯蔵開始後７日後にはその残存率は０．７％にまで低下していた。この結果から、β−又はγ−シクロデキストリンで包接することによりＫＯＤＡの安定性が飛躍的に上昇することが認められた。

実施例４：γ−シクロデキストリンに包接させたＫＯＤＡの温度依存的保存安定性
実施例２において得られた粉末状のγ−シクロデキストリン包接ＫＯＤＡを、それぞれ以下に記す４０℃以外の温度にて温度依存的保存安定性を試験した。温度依存性を試験するに当たり、試験温度を２５℃、４℃、-２０℃とし、それぞれの温度水準にて９２日間貯蔵し、貯蔵後のＫＯＤＡの保存安定性を試験した。貯蔵開始後０日、２日、５日、１０日、１７日、３５日、５０日、６３日、７３日、及び９２日後にサンプリングを行った。回収したサンプル（チューブに入った状態の粉末化したγ−シクロデキストリン包接ＫＯＤＡ）に５００μＬのエタノールを加え、ＫＯＤＡを抽出した。３時間抽出を行い、適宜攪拌しながら抽出を行った。抽出後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）にてγ−シクロデキストリンを沈殿させた後に、上澄みのエタノールを２００μＬ取り出し、ＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１００Ｓｅｒｉｅｓ、移動相溶媒：５０％アセトニトリル（０．０２%トリフルオロ酢酸を含む）、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、カラム温度：４０℃、サンプル導入量：１０μＬ、検出波長：２１０ｎｍ）にて上澄みエタノール中のＫＯＤＡ濃度を確認し、結果を、実施例３のγ−シクロデキストリンで包接させて、４０℃で貯蔵した場合の結果とともに、図３に示した。コントロール実験は、ＫＯＤＡエタノール溶液を濃縮乾固したもの（図中Cont.）、並びにシクロデキストリンの代わりに、デキストリンと混合して濃縮乾固したＫＯＤＡもの(図中Dex)について、４０℃にて保存安定性の確認を行った時の結果である。

実施例５：Ｄ‐ＫＯＤＡの生成
貯蔵されたサンプルをＨＰＬＣにて分析した結果、シクロデキストリンで包接したＫＯＤＡ以外にも類縁体が生成していることを確認した。類縁体の構造決定は、ＤＡＲＴ−ＭＳ（５００℃、ｎｅｇａｔｉｖｅｉｏｎｍｏｄｅ）を用いて行われ、類縁体は、ｍ／ｚ３０９．２０８０［Ｍ‐Ｈ］^-（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ₁₈Ｈ₂₉Ｏ₄）を示し、分子式Ｃ₁₈Ｈ₂₉Ｏ₄ を得た。以下の表１に示した¹Ｈ‐ＮＭＲ、¹³Ｃ‐ＮＭＲの測定結果より、類縁体はＫＯＤＡのＣ１２−１３の二重結合がＣ１１−１２に転移した構造を有するＤ−ＫＯＤＡであった。またＣ１１−１２の幾何異性体は、ＪＨ_11,12＝１６Ｈｚを基にＥであると決定した。

上記のデータおよび分子式に基づきＤ−ＫＯＤＡの平面構造を、以下の式（ＩＩ）：

の通り決定した。

Ｄ‐ＫＯＤＡはＫＯＤＡの類縁体であり、ＫＯＤＡと同等の生理活性を有している。β又はγ−シクロデキストリンで包接されたＫＯＤＡを４０℃にて貯蔵した後に、実施例３と同様の方法によりＫＯＤＡ及びＤ−ＫＯＤＡを抽出し、ＨＰＬＣにてＤ−ＫＯＤＡの生成量を定量した結果を図４に示す。β‐シクロデキストリンでＫＯＤＡを包接した場合、貯蔵中にＤ‐ＫＯＤＡの生成が認められ、貯蔵後６０日以降でＤ‐ＫＯＤＡの生成量が約１４０μＭほどであった。一方、γ‐シクロデキストリンでＫＯＤＡを包接した場合も同様にＤ‐ＫＯＤＡの生成が認められ、貯蔵後６０日以降で約１，０００μＭほどであった。これに対しコントロールであるＫＯＤＡのみを濃縮乾固させたものでは、Ｄ‐ＫＯＤＡの生成は認められるもののその濃度は最大でも１４μＭと非常に低かった。この結果をまとめると、ＫＯＤＡをシクロデキストリンで包接して貯蔵すると生理活性成分であるＤ‐ＫＯＤＡが生成し、このＤ‐ＫＯＤＡの生成はγ‐シクロデキストリンで包接した場合に顕著に高いことが示された。

実施例６：温度依存的Ｄ−ＫＯＤＡの生成
実施例２において得られた粉末状のγ−シクロデキストリン包接ＫＯＤＡを、それぞれ以下に記す４０℃以外の温度にて温度依存的Ｄ−ＫＯＤＡの生成量を試験した。温度依存性を試験するに当たり、試験温度を２５℃、４℃、-２０℃とし、それぞれの温度水準にて９２日間貯蔵し、生成したＤ−ＫＯＤＡを測定した。貯蔵開始後０日、２日、５日、１０日、１７日、３５日、５０日、６３日、７３日、及び９２日後にサンプリングを行った。回収したサンプル（チューブに入った状態の粉末化したγ−シクロデキストリン包接ＫＯＤＡ）に５００μＬのエタノールを加え、ＫＯＤＡ及び類縁体を抽出した。３時間抽出を行い、適宜攪拌しながら抽出を行った。抽出後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）にてγ−シクロデキストリンを沈殿させた後に、上澄みのエタノールを２００μＬ取り出し、ＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１００Ｓｅｒｉｅｓ、移動相溶媒：５０％アセトニトリル（０．０２%トリフルオロ酢酸を含む）、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、カラム温度：４０℃、サンプル導入量：１０μＬ、検出波長：２１０ｎｍ）にて上澄みエタノール中のＤ−ＫＯＤＡ濃度を確認し、結果を、実施例５のγ−シクロデキストリンで包接させて、４０℃で貯蔵した場合の結果とともに図５に示した。コントロール実験は、ＫＯＤＡエタノール溶液を濃縮乾固したもの（図中Cont.）、並びにシクロデキストリンの代わりに、デキストリンと混合して濃縮乾固したＫＯＤＡもの(図中Dex)について、４０℃にて保存安定性の確認を行った時の結果である。温度が高いほど、Ｄ−ＫＯＤＡの生成が促進され、４℃では、ほとんど生成しないことが示された。

実施例７：活性成分としてのＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡの残存量
実施例３の試験において、貯蔵後のサンプルについて、ＨＰＬＣによるＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡの定量を行い、生理活性成分としてのＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡの合算値から活性成分の残存率を算出した。この結果を図６に示す。β‐シクロデキストリンにてＫＯＤＡを包接した場合、貯蔵開始後３０日で８１％、６０日後で６３％のＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡが残存していることが認められた。γ‐シクロデキストリンにてＫＯＤＡを包接した場合、貯蔵開始後３０日で９５％、６０日後で９１％のＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡが残存していることが認められた。これに対しコントロールであるＫＯＤＡのみを濃縮乾固させたものでは、貯蔵開始後１５日の時点で０．６％のＫＯＤＡおよびＤ‐ＫＯＤＡしか残存していないことが認められた。Ｄ−ＫＯＤＡもＫＯＤＡと同様の生理活性を示すことから、ＫＯＤＡのみの残存率ではなく、ＫＯＤＡ及びＤ−ＫＯＤＡの両成分の残存率を調べることが、活性成分の保存の点で重要である。したがって、活性成分の保存の観点では、β−シクロデキストリンよりもγ−シクロデキストリンにより保存することが好ましいことが示された。これまでＫＯＤＡは、保存安定性が非常に悪かったことから、β−シクロデキストリンを使用した場合であっても十分に保存安定性が高まったといえる。

実施例８：γ−シクロデキストリン包接ＫＯＤＡにおける活性成分（ＫＯＤＡ及びＤ−ＫＯＤＡ）の温度依存的残存量
実施例４及び６の試験において、貯蔵後サンプルについて、ＨＰＬＣによるＫＯＤＡ及びＤ−ＫＯＤＡの合算値を測定し、貯蔵温度に応じた生理活性成分の残存率を算出した。この結果を図７に示す。４０℃の温度では、保存日数を経るにしたがい、活性成分の残存率が減少する（９０日で９０％弱）一方で、−２０℃、４℃、及び２５℃の温度では活性成分はほとんど減少しないことが示された。これにより、γ−シクロデキストリンを用いてＫＯＤＡの包接を行うことにより、生理活性成分の室温での長期貯蔵が可能になることが示された。

Claims

以下の式（Ｉ）：

で表される９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸又はその塩の保存方法であって、当該化合物と、γ-シクロデキストリンとを配合し、乾燥する工程を含む、前記保存方法。
以下の式（Ｉ）：

で表される９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸又はその塩と、γ-シクロデキストリンからなる包接化合物。
前記包接化合物が、固体状態の包接化合物である、請求項２に記載の包接化合物。
請求項２又は３に記載の包接化合物の製造方法であって、９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸又はその塩と、γ-シクロデキストリンとを溶液中で混合する工程を含む、前記製造方法。
さらに乾燥工程を含む、請求項４に記載の製造方法。
以下の式（Ｉ）：

で表される９−ヒドロキシ−１０−オキソ−１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカジエン酸又はその塩とγ-シクロデキストリンからなる包接化合物、及び以下の式（II）：

で表される化合物又はその塩とγ-シクロデキストリンからなる包接化合物を含む、貯蔵用組成物。