JP5288700B2 - バイオセンサー装置及びその使用方法 - Google Patents
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Description
上記のとおり、センサー20、120は、固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを有する。なお、以下の記載は図2のセンサー20を参照しながらなされるものだが、センサー120にも同様であることは言うまでもない。
一つの実施態様において、抗原−メリチン複合体を有するプローブ結合抗原は、上記のように前記反応チャンバーの壁面に乾燥させることができる。その場合、前記検出チャンバーにはフェロシアニドのようなメディエーターを入れたリポソーム又は脂質の小胞を含めることができる。前記抗原−メリチン複合体が前記リポソームに到達すると、それらは破裂し、前記フェロシアニドを放出する。これにより前記シグナルの急速な増幅を誘導し、すなわち少量のフリーの抗原が前記抗体との結合部位において前記抗原−メリチン複合体と競合し、それが高濃度のフェロシアニド放出につながる。
従来技術のELISAでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)又はアルカリフォスファターゼ(AP)は、高感度アッセイ用酵素として使用されている。しかしながら、これらの両酵素を電気化学的アッセイに適用することを可能にするような基質が開発された。本発明の実施態様において、APはp−アミノフェニルリン酸と共に、HRPはテトラチアフルバレンと共に使用することができる。
グルコースデヒドロゲナーゼ(組み換え大腸菌由来酵素、キッコーマン社)であるGDH及びモノクローナル抗体4C28のクローンC2(Hytest社)のコンジュゲートを、MBS試薬(M−Maleimidobenzoyl−N−Hydroxysuccinimide ester)を使用し、O Sullivanらの文献(Anal.Biochem.100,100−108,1979)に記載の方法に基づき行った。
6mgのシステアミン塩酸塩(Sigma−Aldrich社)を0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.4)、0.15M塩化ナトリウム及び2.5mM EDTAを有するバッファー(反応バッファー)中に2mg/mlのモノクローナル抗体C2を有する溶液1mlと、37℃にて90分インキュベートした。前記混合液を反応バッファーで平衡化された脱塩カラム(PD−10、Amerscham社)にアプライし、同じバッファーでそれに続き溶出させることにより、前記反応を終了させた。フラクションを1.5mlずつ回収し、前記タンパク質の大半を有する3つのフラクションをプールした。プールの直後、この材料を前記マレイミドにより活性化された酵素と反応させた。タンパク質濃度は、C2抗体を1mg/mlで有する溶液における280nmの吸光度を1.35と換算して測定された。
同時に、2mgのGDHを1.0mlの前記反応バッファーに溶解し、MBS(Pierce社)を7.6mg/mlで含有するDMSO溶液を50μl添加し、37℃にて30分間インキュベートした。前記混合液を反応バッファーで平衡化された脱塩カラム(PD−10、Amerscham社)にアプライし、同じバッファーでそれに続き溶出させることにより、前記反応を終了させた。フラクションを1.5mlずつ回収し、前記タンパク質の大半を有する3つのフラクションをプールした。
前記還元されたIgG及びマレイミドと反応したGDHを、1mgの抗体に対し0.9mgのGDHの割合で共に混合し、4℃にて一晩インキュベートした。前記反応は6mgのシステアミン塩酸塩の添加により終了させ、室温にて15分間インキュベートし、その溶液1.5mlを、20mM Tris及び0.15M塩化ナトリウム(pH7.4)(TBS)を有するバッファーで平衡化した脱塩カラムにアプライし、またそのバッファー中に溶出させた。各カラムからの前記高濃度のタンパク質を有する前記3つの0.5m1のフラクションをプールした。塩化カルシウムの最終濃度1mM、アジ化ナトリウムの最終濃度0.1%及びPQQの最終濃度0.05mg/mlとした。コンジュゲートの使用の前に、4℃にて保存した。
また、サンプルにおけるCRPレベルを従来技術による酵素イムノアッセイにより測定した。全てのインキュベートを室温にて行った。
センサーストリップは以下のとおり作製した。
1)178μm厚のメリネックス(登録商標)を有する電極のウェブを金によりスパッタリングした。前記金コーティングの表面抵抗は8−12ohms/sqであった。
2)前記電極を0.3mMの2−メルカプトエタンスルフォン酸溶液により20分間コーティングし、更に空気の噴射により乾燥させた。この工程により前記電極の親水性が保たれ、また空気浮遊炭化水素及び他の不純物によるフォールディングを減少させることができる。
3)ウェブの工程を、前記電極上に化学物質(例えば、上記の試薬)を乾燥させたストライプに適用した。前記ウェブは固定されたカミソリの刃の付近を通って移動し、それにより前記表面に引っ掻きを形成し、前記反応電極の領域の区画が行われた。前記ウェブはその後、以下の試薬すなわち
−前記引っ掻きに積層させるための前記電気化学的試薬(フェリシアニド、グルコース等)、及び
−前記電気化学的試薬から1〜2mm隔てた、引っ掻きと反対側の部分に施される前記抗体−酵素コンジュゲート
をそれぞれ蓄えたシリンジポンプにつながった、2本の鈍い先端のステンレスのピペッティングニードルの付近に移動させた。
4)前記化学物質のストライプを、赤外線ドライヤー及び50℃の温風乾燥により形成した。
5)前記反応及び検出チャンバーを、ロータリー式のクラッシュカット装置を使用したスペーサー層のキスカットにより形成した。
6)前記スペーサーを、前記抗体−酵素コンジュゲートが前記反応チャンバーに位置し、前記電気化学的試薬が前記検出チャンバーに位置するように前記電極上に積層した。
7)前記フィリングチャンバーはオスメス打ち抜き装置を使用して前記二重ラミネートをパンチングすることにより形成した。
8)常磁性体磁気ビーズに結合した抗原を、別の電極フィルム上にストライプした。
9)その後前記常磁性体磁気ビーズを有する前記電極を、前記工程(6)の二重ラミネートに接着した。そこでは前記抗原−ビーズのストライプは前記反応チャンバーにおいて前記抗体−酵素コンジュゲートに対面して位置する。
10)オスメス打ち抜き装置を使用して前記三重ラミネートをパンチングし、各センサーにつき前記通気口を形成した。
11)前記通気口及び前記フィリングチャンバーの開口側を「マジックテープ(登録商標)」(3M)により被覆した。
12)前記三重ラミネートのウェブを単離し、反応センサーを完成させた。
5mg/mlの2,3ジメトキシ,5−メチル1,4ベンゾキノン(Aldrich社)、326mg/mlのカリウム−フェリシアニド及び400mMグルコースを、0.26mg/mlシトラコン酸(Sigma社)及び13.3mg/mlのシトラコン酸二カリウムを有するバッファーに溶解させた溶液を調製した。
400μg/mlのGDHを有する溶液を、1mM塩化カルシウム、10mg/mlのBSA、0.26mg/mlのシトラコン酸、13.3mg/mlのシトラコン酸二カリウム、及び10mg/mlのスクロースを有する溶液により100μg/mlに希釈した。
CRPコートされたビーズ5mg/ml、100mg/mlのスクロース、1mMの塩化カルシウム、0.26mg/mlのシトラコン酸、及び13.3mg/mlのシトラコン酸二カリウムを有する溶液を調製した。
通常のヘパリン化された血液であり、ヘマトクリットが42%であり血漿中のCRP濃度が1μg/mlの血液(CRP血液)を以下の実験に使用した。l00μlの全血液に対して、リン酸バッファーに2.5mg/mlのCRPを溶解した溶液10μlを添加した。また10μlのリン酸バッファーを別の100μlのサンプルに添加し、コントロールとした。
約5μlの血液を前記フィリングチャンバー(図3の符号107)に添加した。前記血液をフィリングチャンバー107及び反応チャンバー122に流し込んで満たし、検出チャンバー128の入口付近で止めた。前記血液は反応チャンバー122の壁面から前記コンジュゲートを溶解させ、それを前記反応チャンバー122の下に設置されている磁石によって反応チャンバー122の底に引っ張られている前記磁気ビーズとの反応のために供給した。CRPの添加がない場合は、コンジュゲートの大部分は前記磁気ビーズに結合する。
Claims (22)
- 液体サンプル中の検出対象を検出するためのバイオセンサーであり、以下の構成要素、すなわち:
毛細管現象により充填されるように調節されたフィリングチャンバー、
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを有する反応チャンバーであり、前記プローブコンジュゲートが前記固相化結合部位と結合するように調節された結合パートナーを有し、前記固相化結合部位が少なくとも一つの磁気ビーズ上に位置し、前記固相化結合部位および前記プローブコンジュゲートが前記反応チャンバーの異なる表面上に位置する、反応チャンバー、
内部の電気化学的反応を検出する電極を有する検出チャンバー、及び
前記反応チャンバーと前記検出チャンバーとの間の液体流路、
を有し、前記液体サンプル中の検出対象の有無が、前記反応チャンバー中で結合したプローブコンジュゲートの量の変化となって表れ、前記変化が前記検出チャンバー中で電気化学的反応により検出可能である、バイオセンサー。 - 前記固相化結合部位が抗原であり、前記結合パートナーが抗体である、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 前記固相化結合部位が抗体であり、前記結合パートナーが抗原である、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 前記反応チャンバーの毛細管のサイズが、前記フィリングチャンバーのサイズより小さい、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 前記検出チャンバーが通気口を有する、請求項1から4のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 前記通気口が前記バイオセンサーの外部層の貫通により開けることができる、請求項5に記載のバイオセンサー。
- 前記通気口が前記バイオセンサーの外部層の部分を除去することにより開けることができる、請求項5に記載のバイオセンサー。
- 前記通気口がミシン目に沿って破ることにより開けることができる、請求項5に記載のバイオセンサー。
- 前記反応チャンバーが大気に向けて開口部を有する、請求項1から8のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 磁石を更に有する、請求項1から9のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 前記磁石が配置され、それにより、前記反応チャンバーに前記液体サンプルが添加された後に少なくとも一つの磁気ビーズが移動し、前記プローブコンジュゲートとの緊密な接触がなされる、請求項10に記載のバイオセンサー。
- 前記プローブコンジュゲートが酵素を有する、請求項1から11のいずれかに記載のバイオセンサー。
- メディエーター及び酵素基質を更に有する、請求項12に記載のバイオセンサー。
- 液体サンプル中の検出対象を検出する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち:
請求項1から13のいずれかに記載の前記バイオセンサーにサンプルを移送する工程、
前記反応チャンバーにおいて固相化結合部位及びプローブコンジュゲートの間での反応を進行させる工程、
前記サンプルを前記検出チャンバーに移動させ、プローブコンジュゲートのレベルを電気化学的に検出する工程であり、前記サンプルでの前記検出対象の存在が前記検出チャンバーにおいて検出されたプローブコンジュゲートの量の増減として表れる工程、を有する、方法。 - 前記固相化結合部位が標的抗原を含み、前記プローブコンジュゲートが前記標的抗原と結合するよう調節された抗体を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記プローブコンジュゲートが酵素を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルが前記反応チャンバーから前記検出チャンバーに毛細管現象により移動する、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルの前記移動の工程が、通気口を開けることを有する、請求項14に記載の方法。
- 前記検出チャンバーから受けた電気的シグナルに基づいて、前記サンプル中の標的抗原の量の定量を行う工程を更に有する、請求項14に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち:
第1層を提供する工程、
前記第1層の一部を除去する工程であり、それによりフィリングチャンバー部分、反応チャンバー部分、及び検出チャンバー部分を形成する工程、
第2層を提供する工程、
前記第2層の第1面を前記第1層の第1面に取り付ける工程、
前記フィリングチャンバー部分にわたって広がりかつ前記フィリングチャンバー部分と実質的に重なる前記第2層の一部を除去する工程であり、前記第2層が前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって更に広がる工程、
第3層を提供する工程、
前記第3層の第1面を前記第1層の第2面に取り付ける工程であり、前記第3層が、前記フィリングチャンバー部分、前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって広がる工程、
密封層の第1面を前記第2層の第2面に取り付ける工程であり、それにより前記第1層、前記第2層、前記第3層及び前記密封層を含む前記の層が、複数の外部表面を有するストリップを形成する工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。 - 請求項1から13のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち:
第1層及び第2層を提供する工程、
前記第1層の少なくとも一部を前記第2層の第1面に取り付ける工程であり、それによりフィリングチャンバー部分、反応チャンバー部分及び検出チャンバー部分を形成する工程、
第3層を提供する工程、
前記第3層の第1面を前記第1層の第2面に取り付ける工程であり、前記第3層が、前記フィリングチャンバー部分、前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分にわたって広がる工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程、及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。 - 請求項1から13のいずれかの前記バイオセンサーを製造する方法であり、前記方法が以下の工程、すなわち:
第1層を提供する工程、
第2層を提供する工程、
前記第2層の第1面を前記第1層の第1面に取り付ける工程、
第3層を提供する工程、
前記第3層の第1面を前記第1層の第2面に取り付ける工程、
前記第1層の一部を除去する工程であり、それによりフィリングチャンバー部分を形成する工程、
前記第1層の一部を除去する工程であり、それにより反応チャンバー部分を形成する工程、
前記第1層の一部を除去する工程であり、それにより検出チャンバー部分を形成する工程であり、それにより前記反応チャンバー部分及び前記検出チャンバー部分が前記フィリングチャンバー部分との間で液体の移動のために連結される工程、
前記ストリップの外部表面を通り前記検出チャンバーの中に延びる流路を形成する工程であり、それにより検出チャンバー通気口を形成する工程、
前記流路の開口部にわたる層を前記ストリップの前記外部表面に取り付ける工程であり、
それにより前記検出チャンバー通気口を閉じる工程、及び
固相化結合部位及びプローブコンジュゲートを前記反応チャンバーの中に設置する工程、を有する、方法。
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