JP4963481B2

JP4963481B2 - 表面プラズモン共鳴測定用チップ

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Publication number: JP4963481B2
Application number: JP2008062921A
Authority: JP
Inventors: 高一南; 洋介竹内
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2012-06-27
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Description

本発明は、生理活性物質を固定化した表面プラズモン共鳴測定用チップに関するものである。

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、中でも煩雑な操作や標識物質を必要とせず、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。これらの技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、表面プラズモン共鳴（SPR）を例にとって説明する。

一般に生理活性物質を測定するために使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）上に、蒸着された金属膜、タンパク質等の生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜を順に有し、官能基を介して金属表面に生理活性物質が固定化されている。そして、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。

測定チップに生理活性物質を固定化するためのいくつかの手法が知られている。生理活性物質としてタンパク質を例にとった場合、測定チップとタンパク質を共有結合により固定化するための手法として、タンパク質のアミノ基と測定チップ上のカルボキシル基とを結合させる方法（アミンカップリング法）が知られている。しかしながら、この方法では、固定化によってタンパク質表面の任意のアミノ基が修飾されることになるため、固定化されるタンパク質の配向が一定にならない場合や、修飾されるアミノ基の位置によってタンパク質と基質との結合が阻害されてタンパク質の活性が低下する場合がある。また、この方法では、チップ上にタンパク質を濃縮する必要があるが、固定化の際にタンパク質を、固定化されるタンパク質のpIよりも低いpH、かつ低いイオン強度の緩衝液に溶解する必要がある。それゆえ、このような条件下で変性するタンパク質の場合には、活性を維持したまま固定化することができないという問題がある。

一方、遺伝子改変により人工的に合成されたタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に導入されたTagと呼ばれる部分を用いて、中性条件下で測定チップ上にタンパク質を固定化する手法が開発されている。その代表例として、His-tagを用いた固定化技術が挙げられる。この技術は、遺伝子組換えによって発現させたHis-tagタンパク質を精製するためのアフィニティーカラム用として開発されたものであるが、タンパク質を一定の配向性を持たせた状態で固体表面に固定化させる目的にも用いられている。

特に、NTA(Nitrilotriacetic acid)とNi(II)イオンとによるNTA-Ni(II)錯体を用いたHis-tagタンパク質の固定化では、錯体中の２つの配位座に配位した水分子がHis-tagタンパク質のオリゴヒスチジン残基の２つのイミダゾール基の窒素原子と置換することによって、His-tagタンパク質が特異的かつ一定方向に固体表面に結合する。このNTA-Ni(II)錯体を用いるHis-tagタンパク質の固定化では、酸性条件下でプレコンセントレーションを行う必要がないため、生理的条件の緩衝液（PBSなど）を用いてHis-tagタンパク質の固定化が可能となり、アミンカップリングの有する問題を解消することが可能である。

しかし、His-tagタンパク質とNTA-Ni(II)錯体との組み合わせは、アフィニティーカラムによる精製を目的として開発されているため、その結合は充分に強固ではなく、解離平衡が存在する。それゆえ、測定チップ上にNTA-Ni(II)錯体を介して固定化されたHis-tagタンパク質は、徐々に測定チップから解離してしまうという問題があり、そのままではバイオセンサー等の用途には適用できない。

この解離の問題を解決するために、いくつかの検討がなされている。例えば、特許文献１や２には、酸化剤等で酸化することによってHis-tagタンパク質に配位している金属イオンの置換不活性化による固定化方法が開示されている。しかし、これらの方法では、その酸化速度や酸化剤によってはタンパク質の失活が起こる場合があるという問題がある。また、特許文献３には、リガンドを上記NTAではなく、triNTAとすることによる結合の改善の試みが記載されているが、実用的に充分な固定化は得られていない。

ところで、非特許文献１には多糖類にNTAを固定する技術が開示されている。また、非特許文献２には、NTA-Ni(II)錯体を用いたHis-tagタンパク質の固定化において、His-tagタンパク質のイミダゾール基とNi(II)を多点でNTAのリガンドと結合する技術が開示されている。
特開2006-266831号公報特開平6-157600号公報特表2002-536428号公報 Anal.Chem.2006,78,3072-3079 Anal.Chem.2005,77,1096-1105

生理活性物質を多点で把持することができれば、結合力を高めることができ、上述のような解離の問題は解決できると考えられるが、上記非特許文献１および２では、いずれもどの程度のNTA密度であれば解離の問題が解決できるかという点は検討されていない。また、非特許文献２に記載されている固定技術近接しているリガンド同士がリジットであり、フレキシブルに動くことができないので、タンパク質に対し多点で金属が配位結合しにくく、実際にはタンパク質を多点で安定に固定することができないという問題がある。

本発明はこのような事情に鑑みなされたものであって、生理活性物質を安定に固定化した表面プラズモン共鳴測定用チップを提供することを目的とするものである。

本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップは、センサーチップ基板と、該基板表面に配置された金属膜と、該金属膜に結合された水溶性高分子膜と、該水溶性高分子膜に結合されたリガンドと、該リガンドに配位結合した金属イオンと、該金属イオンに固定された生理活性物質とを備えた表面プラズモン共鳴測定用チップにおいて、前記リガンドが1.0×10¹⁶個/mm³以上3.3×10¹⁸個/mm³以下の密度で結合され、かつ前記生理活性物質が前記金属イオンに配位結合するヒスチジンユニットを７以上有し、該ヒスチジンユニットを介して前記生理活性物質が前記金属イオンに固定されていることを特徴とするものである。
前記ヒスチジンユニットは８以上であることがより好ましい。

前記リガンドはニトリロトリ酢酸（NTA）であることが好ましい。
前記水溶性高分子膜はカルボキシ変性デキストランからなることが好ましい。
前記金属膜は、金、銀、銅、白金、パラジウムおよびアルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つの金属からなることが好ましい。

本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップは、センサーチップ基板と、該基板表面上に結合されたリガンドと、該リガンドに配位結合した金属イオンと、該金属イオンに固定された生理活性物質とを備えた表面プラズモン共鳴測定用チップにおいて、前記リガンドが1.0×10¹⁶個/mm³以上3.3×10¹⁸個/mm³以下の密度で結合され、かつ前記生理活性物質が前記金属イオンに配位結合するヒスチジンユニットを７以上有し、該ヒスチジンユニットを介して前記生理活性物質が前記金属イオンに固定されているので、生理活性物質が有するヒスチジンユニットと金属イオン、金属イオンとリガンドを多点で固定化することが可能となり、生理活性物質を安定に固定化することができる。

以下、図面を参照して本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップについて説明する。図１は、本発明の一実施の形態である表面プラズモン共鳴測定用チップの構成を示す概略模式図である。なお、図１では結合状態をわかりやすくするため、リガンドの一部を拡大し、リガンドとしてNTA、金属イオンとしてNi(II)、生理活性物質（図中Ｐで表示）としてヒスチジンユニットを有するタンパクを例にとり、２つのNTAがそれぞれ１組のヒスチジンユニットと結合している状態を示している。

図１に示す表面プラズモン共鳴測定用チップは、表面に金属膜が設けられたセンサーチップ基板と、この基板表面上に結合された水溶性高分子膜と、この水溶性高分子膜によって把持されたリガンド（NTA）と、このリガンドに配位結合した金属イオン（Ni(II)）と、金属イオンに固定された生理活性物質とを備え、リガンドは1.0×10¹⁶個/mm³以上3.3×10¹⁸個/mm³以下の密度で水溶性高分子膜に結合されており、生理活性物質が金属イオンに配位結合するヒスチジンユニットを７以上有し、このヒスチジンユニットを介して生理活性物質が金属イオンに固定している。ここでは、水溶性高分子膜として自己組織化膜（SAM）と水溶性高分子の組合せからなるものを例として示している。なお、生理活性物質はヒスチジンユニットを７以上有するものであるが、その結合状態をわかりやすく示すためにヒスチジンユニットは４つのみを示している。

以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップの各構成およびその構成の形成方法（活性化）について説明する。

（１）基板と金属膜
本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップにおける基板は、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

基板上には金属膜が配置される。ここで、基板上に配置されるとは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されないが、好ましくは金、銀、銅、白金、パラジウムおよびアルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つの金属であることが好ましく、特に金が好ましい。これらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にはクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、0.1nm以上500nm以下であることが好ましく、特に１nm以上200nm以下であることが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上10nm以下であることが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

（２）水溶性高分子膜
金属膜が形成された基板上には、水溶性高分子膜が配置される。特に好ましい態様によれば、金属膜が形成された基板上に、自己組織化膜形成分子と水溶性高分子の組み合わせから構成することができる。以下、この態様について説明する。

（２−１）自己組織化膜形成分子
自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。

自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式A-1（一般式A-1において、ｎは３から20の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作製される。一般式A-1においてX=NH₂である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。

末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式A-2）（一般式A-2において、ｎは３から20の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式A-3、A-4）（一般式A-3においてｎは３から20の整数を示し、一般式A-4においてｎはそれぞれ独立に１から20の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。

A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。

本発明に用いるポリアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ポリアミンが好ましい。水溶性ポリアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、1,4−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、4,4’−ジアミノビフェニル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルケトン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式A-5（一般式A-5において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から20の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは１，２−ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式A-5において、n=2，m=1）である。

アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。

本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式A-6）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式A-7）（一般式A-6において、ｎは３から20の整数を示し、一般式A-7において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から20の整数を示す）を用いることが好ましい。好ましくは、一般式A-6において、ｎは５以上であり、10以上であることがさらに好ましく、10〜30がさらに好ましく、最も好ましくは10〜16である。

アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。

本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと水酸基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には後述する水溶性高分子の結合量が低下し、水酸基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと水酸基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／1,000,000の範囲であることが好ましく、１〜１／1,000の範囲であることがより好ましく、１〜１／10の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、水酸基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。

本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。

（２−２）水溶性高分子
本発明で用いることができる水溶性高分子としては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。

本発明で用いる水溶性高分子としてはさらに、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭59-53836号明細書３頁20行〜６頁49行、特開昭59-71048号明細書３頁41行〜７ページ54行明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるCMD、CMD-L、CMD-D40（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。

本発明で用いる水溶性高分子の分子量は特に限定されないが、一般的には200以上5000000以下であることが好ましい。さらに好ましい水溶性高分子の分子量は10000以上2000000以下である。

上記したような水溶性高分子は、本明細書中以下に説明するような自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に結合させてもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した水溶性高分子は架橋することもできる。水溶性高分子の架橋は当業者に自明である。

センサー表面に結合する水溶性高分子は、水溶液中の膜厚が１nm以上300nm以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の水溶性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の水溶性高分子膜厚はAFM、エリプソメトリーなどで評価することができる。

センサー表面に固定する水溶性高分子の固定量は、３ng/mm²以上30ng/mm²以下であることが好ましく、３ng/mm²以上20ng/mm²以下が更に好ましく、3ng/mm²以上15ng/mm²以下が最も好ましい。又は、水溶性高分子の膜厚として、３nm以上30nm以下であることが好ましく、３nm以上20nm以下が更に好ましく、３nm以上15nm以下が最も好ましい。水溶性高分子の固定量は、種々の膜厚測定方法・重量測定方法などで検出した値を使用することができる。膜厚測定方法の例としては、原子間力顕微鏡（AFM）、走査型トンネル顕微鏡（STM）などの走査型プローブ顕微鏡（SPM）、透過型電子顕微鏡（TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、走査型透過電子顕微鏡(STEM)などの電子顕微鏡、エリプソメトリー法などの方法が挙げられる。

（２−３）水溶性高分子の活性化
水溶性高分子としてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に結合することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、又はEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、基板上に水溶性高分子を結合させることが可能となる。

また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式(Ia)又は(Ib)（式中、Ｒ¹及びＲ²は、互いに独立して電子吸引性基（例えばカルボニル基、芳香環、窒素原子など）を表し、Ｒ¹及びＲ²は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）に示される含窒素化合物を用いることもできる。

ここで、Ｒ¹及びＲ²は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ¹及びＲ²は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、3,4−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。

また、好ましくは下記に示される含窒素化合物を用いることもできる。

また、好ましくは含窒素化合物としては、下記一般式(I)（式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す）で表される化合物を用いることもできる。

一般式（I）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。

また、含窒素化合物としては、下記の化合物等も好ましくあげられる。

また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式(II)（式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）を用いることもできる。

ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Ｍで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Ｘで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。

一般式（II）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。

また、含窒素化合物としては、下記一般式(III)（式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）を用いることもできる。

一般式（III）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。

また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物などを用いることができる。

更に、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用することができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。

上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。

また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。

さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特開2006-58071号公報「0011」〜「0022」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開2006-90781号公報「0011」〜「0019」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。

なお、上記した特開2006-58071号公報における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体である。

（一般式１において、Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ³は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ^-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ⁴とＲ⁵はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ⁶は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ^-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ⁷はオニウム基を示し、Ｒ⁸及びＲ⁹はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
（２−４）水溶性高分子の基板への塗布
本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。

上記の通り、本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作製可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。

（３）リガンド
リガンドとなる化合物としては、各種キレート剤を用いることができ、ニトリロトリ酢酸誘導体（NTA）、イミノジ酢酸、フェナンスロリン、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ジエチレントリアミン、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ポリピラゾリルホウ酸、1,4,7−トリアゾシクロノナン、ジメチルグリオキシム、ジフェニルグリオキシム等の多座配位子を好ましくあげることができ、４座配位子であるNTAがより好ましい。リガンドの結合は、例えば、水溶性高分子膜が、カルボキシル基を有する水溶性高分子から構成されている場合には、このカルボキシル基を活性化した後に、リガンドとなる化合物を反応させることによって、リガンドを水溶性高分子膜に固定化することができる。

リガンドの密度は1.0×10¹⁶個/mm³以上3.3×10¹⁸個/mm³以下であり、より好ましくは1.0×10¹⁶個/mm³以上1.8×10¹⁷個/mm³以下、さらに好ましくは3.6×10¹⁶個/mm³以上1.8×10¹⁷個/mm³以下である。ただし、膜密度が高くなるほど、生理活性物質は膜内に進入しにくくなることがあるため、リガンドは多ければ多いほどよいというわけではない。

このリガンドの結合の際には添加剤として塩基を用いることが好ましい。塩基を用いることにより、リガンドの結合率をより高めることができる。この塩基の例としては、DBU（1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene）、DBN（1,5-diazabicyclo[4,3,0]non-5-ene）、イミダゾール、メチルイミダゾール、ピリミジン、ピリジン、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン、ピコリン、2,6-ルチジンキノリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジメチルフェニルアミン、DABCO（1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane）、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等が好ましく挙げられ、用いる有機溶媒によって適宜選択することができる。

用いる塩基の量としては結合リガンド量に対して0.1モル%以上10000モル％以下が好ましく、より好ましくは100モル％以上1000モル％以下、さらには300モル%以上500モル％以下であることが好ましい。

このリガンド密度は以下のようにして求めることができる。実際に測定を行って求める場合は、支持体上にリガンドを結合した後、金属イオンを付与し、支持体上に固定された金属イオンの数をICP分析装置などで求め、この金属イオンの数とリガンドが結合している部分の支持体の面積から、単位面積あたりのリガンドの数を求めることができる。計算によって求める場合は、リガンドの体積をCHEM３D（CambridgeSoft社製）などの計算ソフトを使用して求めることで、単位面積あたりのリガンドの数を求めることができる。リガンドの体積を計算ソフトで求めた場合、例えばNTAであれば0.3nm³程度と見積もられるので3.3×10¹⁸個/mm³よりも高い密度では理論上リガンドを結合することは困難である。なお、リガンド密度は固定化した生理活性物質を除去後、金属イオンの数を測定することによって求めることもできる。

有機溶剤としては、ジメチルスルホキサイド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、アセトン、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、sec-ブチルアルコール、tert−ブチルアルコール、ブチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジグライム等を好ましくあげることができ、リガンドの溶解性および副反応の抑制の観点からはジメチルスルホキサイドあるいはN、N−ジメチルホルムアミドを用いることがより好ましい。

（４）金属イオン
金属イオンは、不飽和金属錯体を形成する金属イオンであればよく、得られる金属錯体の安定性の観点からは遷移金属イオンが好ましく、具体的には、Ni(II)、Cu(I)、Cu(II)、Co(II)、Co(III)、Fe(II)、Fe(III)、Ga(III)のいずれかのイオンであり、リガンドの種類に応じて適宜選択することができる。中でも好ましくは、Ni(II)、Cu(II)、Co(III)、Fe(III)であり、さらに好ましくは、Ni(II)、Cu(II)である。金属イオンは、価数によって結合力が異なるが、Co(II)、Fe(II)の場合は、特開平6-157600 号の[0037]、[0038]に記載されている酸化還元方法で、金属イオンの酸化数を変化させ、結合力を変えることが可能である。
金属イオンとリガンド密度の組み合わせとしては、金属イオンがCu(II)の場合、リガンド密度は1.7×10¹⁶以上であることが好ましい。

（５）生理活性物質
生理活性物質は、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいは配位子結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。これらの生理活性物質は、金属イオンへの配位結合により基板上に固定されるものであり、金属イオンに対して配位可能なヒスチジンユニットを７以上有するものである。強固に結合させるという観点からはヒスチジンユニットは８以上であることがより好ましく、ヒスチジンユニットが100より大きい場合には、ヒスチジンユニット自身のサイズが生理活性物質の活性阻害を起こしやすくなる為、ヒスチジンユニットが100以下であることがより好ましい。本発明において、His-tagとはヒスチジンユニットのことを指す。

本発明において「多点で生理活性物質を固定する」とは、リガンドとHis-tag中の含窒素複素環基が複数の金属イオンと結合していることを指し、単位面積あたりのリガンドの密度を高くする、及び/又は、His-tagを長くすることによって複数の金属イオンと結合することができる。

（６）生理活性物質の固定化
生理活性物質の固定化は、生理活性物質を含む溶液を塗布することによって行う。本発明において、「塗布」とは、浸漬する方法も含む。生理活性物質が含窒素複素環基を有する場合、生理活性物質の含窒素複素環が金属イオンに配位結合し、錯体を形成することによって固定化される（図１参照）。

支持体に結合したリガンドに対して、金属イオンと、生理活性物質の含窒素複素環基と、を付与すると、金属イオンに、(1)リガンドと、(2)生理活性物質の含窒素複素環基と、(3)水分子または水酸化イオンと、が配位し、錯体を形成する。

例えば、リガンドとしてNTAを使用し、６配位可能な金属イオンを付与した場合、６配位部位中４つの配位部位を、(1)NTAが保有する３つのカルボキシル基と１つの窒素原子が占有し、残りの２つの配位部位は、(2)生理活性物質の含窒素複素環基と、(3)水分子または水酸化イオンなどが占有することにより、６配位の錯体を形成する。

リガンドとして、イミノジ酢酸を使用し、６配位可能な金属イオンを付与した場合は、６配位部位中３つの配位部位を、(1)イミノジ酢酸が保有する２つのカルボキシル基と１つの窒素原子が占有し、残りの３つの配位部位は、(2)生理活性物質の含窒素複素環基と、(3)水分子または水酸化イオンなどが占有することにより、６配位の錯体を形成する。

ここでは、金属イオンは、６配位可能な金属イオンを例に挙げて説明したが、配位数については７配位以上でもよく、５配位以下でもよい。また、錯体を形成するカルボキシル基は、１つのリガンドから供給されずともよく、複数のリガンドから供給され、錯体を形成してもよい。

（７）本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップの適用
本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに適用することができる。表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分を含む部材からなるが、本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップは生理活性物質を固定する部分を含む部材として用いることができる。

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。

表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平6-167443号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。

上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。

この全反射減衰（ATR）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θSP）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θSP）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平11-326194号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。

そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θSP）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。

また、全反射減衰（ATR）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第47巻第１号（1998）の第21〜23頁および第26〜27頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。

なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。

また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θSP）の角度を測定している。

試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θSP）を測定し、該全反射減衰角（θSP）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトIgG抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトIgG抗体を特定物質として用いることができる。

なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θSP）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θSP）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θSP）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開2003-172694号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θSP）の角度変化量の測定を行っている。

さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開2001-330560号公報に記載されている。

本発明の表面プラズモン共鳴測定装置用チップを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。

また、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置用チップは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーのチップとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。

この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平6-27703号公報４ページ48行目から14ページ15行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。

例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（SiO₂，SnO₂、Ta₂O₅，TiO₂，TiO₂-SiO₂，HfO₂，ZrO₂，Al₂O₃，Si₃N₄，HfON，SiON，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。

別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432号）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。

回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、CCDカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がCCDカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
以下に本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップについての実施例を示す。

（実施例１）
（アミノ基を有する基板の作製）
センサーチップ上に金膜のみが形成されているBiacore社センサーチップAuを12分間、UVオゾン処理を行った後、8mlのエタノールと2mlの超純水に10μmol の6-aminohexanethiol（Aldrich製）を溶解させた溶液と金膜を40℃で１時間反応させて、金膜上にアミノ基を形成し、エタノールで１回、超純水で１回洗浄した。

（CMDの活性エステル化）
超純水に0.5重量%となるようにCMD（名糖産業製：分子量100万）を溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の２％が活性化される計算量の0.4MのEDC(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)および0.1MのNHS（N-Hydroxysuccinimide）混合溶液を加え、室温で５分間攪拌した。

（CMD膜の作製）
上記アミノ基を形成した金膜上に、活性エステル化したCMD溶液を滴下し30秒後に除去することで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで１回、超純水で１回洗浄した。

（AB-NTA（（N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid）膜の作製）
１mmolのEDCと0.2mmolのNHSをDMSO１mlに添加した溶液を50μl加え、30分間室温で反応させた。溶液を除去、DMSOで１回洗浄後、0.1mmolのAB-NTA(同仁化学製)をDMSO１mlに添加した液を12時間反応させた。溶液を除去、超純水で１回洗浄した。

（タンパク質の固定）
作製した試料をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、SPR用HEPES緩衝液（20mM HEPES-HCl, 150mM NaCl, pH7.2）を10μl/minの流速で安定させ１mmol/lのNiCl₂水溶液を10μl添加した後に、HBS-Nバッファー20μlで洗浄し、その後に1μmol/lのHis10- Ubi（ヒスチジンユニットが１０個連なったものが結合しているユビキチン）水溶液を10μl添加し、共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（実施例２）
実施例１のタンパク質の固定で用いた金属イオン源NiCl₂に変えてCuCl₂を用い、AB-NTAの結合時に0.2mmolのEDCと0.04mmolのNHSをDMSO１mlに添加した溶液を50μl加え、30分間室温で反応させた以外は実施例１と同様にして共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（実施例３）
実施例１のタンパク質の固定で用いた金属イオン源NiCl₂に変えてCuCl₂を用い、CMDの活性化時に2MのEDCおよび0.5MのNHSの混合溶液を加え、AB-NTAの結合時に0.1mmolのAB-NTA(同仁化学製)のDMSO１ml溶解物を用いるかわりに、0.1mmolのAB-NTAとDBU(東京化成製)0.06ml、DMSO 0.94ml溶解物溶液を加えた以外は実施例１と同様にして共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（比較例１）
実施例１のタンパク質の固定で用いたHis10- Ubi（ヒスチジンユニットが１０個連なったものが結合しているユビキチン）に変えてHis６- Ubi（ヒスチジンユニットが６個連なったものが結合しているユビキチン）を用いた以外は実施例１と同様にして共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（比較例２）
実施例１においてAB-NTAの結合時に0.2mmolのEDCと0.04mmolのNHSをDMSO１mlに添加した溶液を50μl加え、AB-NTA濃度10mMのものを30分間室温で反応させた以外は実施例１と同様にして共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（リガンド密度）
実施例１〜３、比較例１および２の担体の作製において、AB-NTAを結合した後に、0.1MのNiCl₂水溶液を添加し、10分後に溶液を除去し、超純水で２回洗浄した。50mMのEDTA水溶液５mlで２度抽出を行った。この抽出液を合わせてICP分析装置で測定してNiの数を検出し、このNiの数とウエル底面積(38mm²)からリガンド数を換算し、リガンド密度を求めた。

（タンパク固定化率の測定）
タンパク固定直後と10分間バッファーを流したときのタンパク脱離量の経時変化をBiacore3000で測定し、タンパク固定直後のタンパク固定量と10分経過後のタンパク固定量でタンパク固定化率を算出した。

結果を表１および図２に示す。図２は実施例１と比較例１について、タンパク固定直後から10分間の経時変化におけるタンパク固定量（タンパク固定化率）を示したものである。

表１から明らかなように比較例１と比較例２ではタンパク固定化率、つまり10分間におけるタンパク保持能が小さいのに対し、実施例１〜３のリガンドが高密度かつ、ヒスチジンユニットが10個のものでは、タンパク固定化率が大きくなっている。タンパク固定化率が高ければ、安定して被検体物質との相互作用が検出可能であり、検出感度を高くすることができる。

（実施例4）
（CMD膜の作製）までは実施例１と同様に行い、それ以降の工程を以下のように変更した。
（AB-NTA膜の作製）
１mmolのEDCと0.2mmolのNHSをDMSO１mlに添加した溶液を50μl加え、30分間室温で反応させた。溶液を除去、DMSOで１回洗浄後、0.1mmolのAB-NTA(同仁化学製)とDBU(東京化成製)0.06ml、DMSO 0.94ml溶解物溶液をDMSO１mlに添加した液を2時間反応させた。溶液を除去、超純水で１回洗浄した。

（ペプチドの固定）
作製した試料をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、SPR用HEPES緩衝液（20mM HEPES-HCl, 150mM NaCl, pH7.2）を10μl/minの流速で安定させ１mmol/lのCuCl₂水溶液を10μl添加した後に、HBS-Nバッファー20μlで洗浄し、その後に5μmol/lのHis-His-His-His-Glycine-Serine-His-His-His-His水溶液（operon社製）を5μl添加し、共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（比較例３）
実施例4のペプチドの固定で用いたHis-His-His-His-Glycine-Serine-His-His-His-His水溶液（operon社製）をHis-His-His-Glycine-Serine-Glycine-Serine-His-His-His水溶液（operon社製）にかえた以外は実施例４と同様にして共鳴プラズモン測定用チップを作製した。

（リガンド密度）
実施例１〜３、比較例１および２と同様にして、リガンド密度を求めた。

（ペプチド固定化率の測定）
ペプチド固定直後と６時間バッファーを流したときのペプチド脱離量の経時変化をBiacore3000で測定し、ペプチド固定直後の固定量と６時間経過後のペプチド固定量でペプチド固定化率を算出した。
結果を表２に示す。

表２から明らかなように実施例４と比較例３ではペプチド固定化率、つまり６時間におけるペプチド保持能がヒスチジンユニット８個のもののほうが６個のものよりも大きくなっている。ペプチド固定化率が高ければ、安定して被検体物質との相互作用が検出可能であり、検出感度を高くすることができる。また、ヒスチジンユニットが連続していなくても固定可能であることがわかる。

本発明の共鳴プラズモン測定用チップの一実施の形態を示す概略模式図タンパク固定量（タンパク固定化率）の経時変化を示すグラフ

Claims

センサーチップ基板と、該基板表面に配置された金属膜と、該金属膜に結合された水溶性高分子膜と、該水溶性高分子膜に結合されたリガンドと、該リガンドに配位結合した金属イオンと、該金属イオンに固定された生理活性物質とを備えた表面プラズモン共鳴測定用チップにおいて、
前記リガンドが1.0×10¹⁶個/mm³以上1.8×10 ¹⁷個/mm³以下の密度で結合され、かつ前記生理活性物質が前記金属イオンに配位結合するヒスチジンユニットを７以上有し、該ヒスチジンユニットを介して前記生理活性物質が前記金属イオンに固定されていることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定用チップ。
前記リガンドが有機溶媒存在下で結合されるものであることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴測定用チップ。
前記ヒスチジンユニットが８以上であることを特徴とする請求項１または２記載の表面プラズモン共鳴測定用チップ。
前記リガンドがニトリロトリ酢酸であることを特徴とする請求項１、２または３記載の表面プラズモン共鳴測定用チップ。
前記水溶性高分子膜がカルボキシ変性デキストランからなることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴測定用チップ。
前記金属膜が、金、銀、銅、白金、パラジウムおよびアルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つの金属からなることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴測定用チップ。