JP4831918B2 - コーティングされた酵素含有触媒 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は酵素触媒、特に酵素を含有するコーティングを顆粒に施した顆粒形態の酵素触媒に関する。
【０００２】
酵素活性を有する固定化細胞を含有する組成物は、例えば、欧州特許００８９１６５において知られており、これは、架橋重合体を用いて固定化されているＥ．ｃｏｌｉを含有するコーティングが不活性担体上に存在する組成物を開示している。この組成物はＬ−アスパラギン酸を調製するために使用される。欧州特許出願０２９７９１２号はコーティングが生物学的物質および架橋重合体を含有するコーティングされた粒子を有する生物学的に活性な物質を開示している。
【０００３】
我々はコーティングを施すする顆粒の内部コアに対して特定の厚みのコーティングを有するコーティングされた顆粒酵素物質が既知の酵素触媒物質を超える非常に有益な利点を示すことを発見した。
【０００４】
したがって、本発明は水中非分散性の顆粒形態の酵素触媒であって、該触媒が酵素物質を含有するコーティングによってコーティングを施された内部コアを有し、該コーティングが３０〜４００ミクロンの厚みを有し、コーティング厚みに対するコアの大きさの比が２〜２０であることを特徴とする前記酵素触媒を提供する。
【０００５】
本発明の酵素触媒はコーティングの厚みを制御することにより得られる顆粒触媒がより大きい酵素活性を示すという点において従来技術を超える利点を与える。
【０００６】
本発明は顆粒形態の酵素触媒、即ち以下に顆粒酵素触媒と称する物に関する。触媒は水中非分散性、好ましくは水不溶性でなければならない。この性質は内部コアにより与えられるものであり、これは水中で非分散性、好ましくは、水不溶性である。内部コアとして使用するのに適する物質はアルミナ、シリカ、ゼオライト、樹脂、ステアリン酸のような脂肪物質、ガラスビーズおよびプラスチックビーズを包含する。好ましくはコアはアルミナである。
【０００７】
コアは如何なる適当な形状、例えば正球、非正球、楕円等であってもよいが、好ましい形状は平均直径０．１〜５ミリメートル、好ましくは０．４〜２．５ミリメートルの正球である。コアはマクロ孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）、メソ孔性（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ）またはミクロ孔性（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）の何れかであってよい。好ましくは酵素物質が孔内に侵入するのを回避するために、大孔性ではない。
【０００８】
コアのコーティングは３０〜４００ミクロン、好ましくは１００〜２５０ミクロンの厚みを有する。コーティング厚に対するコアの大きさの比は２〜２０、好ましくは３〜１５である。本発明の目的のためには、コアの大きさは最大内部直径、即ち、コアの周璧上の外部の点二箇所の間の最大の距離と定義される。
【０００９】
顆粒触媒のコーティングは酵素物質を含有する。酵素物質は可溶性または細胞結合性等の酵素、微生物（未損傷または破壊された生細胞または非生細胞）、抗体および補酵素またはこれらの混合物であってよい。特に適する酵素物質には、グルコースイソメラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼが包含される。好ましい酵素物質はニトリラーゼである。
【００１０】
酵素物質のほかに、コーティングは更に重合体および架橋剤を含有するのが好ましい。これらの化合物が存在することにより、酵素物質を重合体の交差結合網目構造内に包埋することができる。この網目構造は固定化に関わる重大な問題点の１つ、即ち、固定化材料からの所望の酵素の漏出を克服可能とする。したがって、これは高分子量の物質に対して非透過性の遮蔽障壁を形成するのに有用である。適する重合体としては、ポリアゼチジン重合体、ポリエチレンイミンのようなポリアミン重合体、蛋白質のようなポリアミド重合体、イソシアネート重合体またはその混合物が挙げられる。好ましい重合体は、コーティング層に対して良好な機械的強度を与えることができる観点から、ポリアゼチジン重合体である。使用してよいポリアゼチジン重合体の例はＰｏｌｙｃｕｐ ２００２、Ｋｙｍｅｎｅ ６１７およびＫｙｍｅｎｅ ４５０（全商品名とも米国Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社のもの）のような市販の重合体である。適当な架橋剤としては、ヘキサメチレンジアミン、グルタルアルデヒドまたはアクロレインのようなアルデヒド類、アジピン酸のような酸類、ヘキサメチレンジイソシアネートのようなイソシアネート類が挙げられる。好ましい架橋剤はグルタルアルデヒドである。本発明の目的のためには、特に好ましいコーティングはニトリラーゼ、ポリアゼチジン重合体およびグルタルアルデヒドの混合物である。
【００１１】
触媒物質のコーティング中の酵素物質、重合体および架橋剤の量に関しては、乾燥コーティング中の各成分の量は酵素物質が５０〜８０％、好ましくは４０〜６０％；重合体物質が５〜２０％、好ましくは１０〜１５％；そして架橋剤が１〜５％、好ましくは２〜３％が適している。例えばグルコース、スクロース、トレハロース、マルチトール、ソルビトールおよびグリセロール等のポリオール類、および／または塩類、例えばリン酸塩のような別の成分もコーティング中に存在してよい。これらは０〜３５％の量で存在することができる。コーティングはまた限定的な量の水を含有してよい。水はコーティングの０〜３０％の量で存在するのが適している。
【００１２】
本発明の酵素触媒は当業者の知る如何なる適当な固定化方法により調製してもよく、例えばゲル捕獲または吸着によって行なってよい。欧州特許出願０２９７９１２、０２０６６８７および０５０２０３５号は顆粒への吸着により酵素物質を含有する水性混合物を付着させる操作法を開示している。その後顆粒を乾燥する。コーティングの付着のための代替法がＥＰ０８９１６５に開示されており、そこでは酵素物質を含有するペーストを形成し、ペーストを顆粒に適用し、次に得られた顆粒を乾燥することが行なわれている。
【００１３】
我々はコーティングされた顆粒酵素触媒はまたコーティング物質の混合物をコアに噴霧することによっても調製できることを発見し、これにより本発明の別の特徴によれば、上記した酵素触媒の調製方法が提供され、その方法は、酵素物質、重合体および架橋剤の水性懸濁液を形成すること、および、該懸濁液をコアに噴霧することにより、該コアをコーティングすることを包含する。
【００１４】
一般的に「噴霧コーティング」と称される噴霧技術を用いてコーティングされた酵素触媒を調製することは、本発明の酵素触媒の重要な特徴である所望の厚みを得るべくコーティングの厚みを制御できるという点において、他の知られた固定化方法を超える利点をもたらす。
【００１５】
噴霧コーティング技術を用いてコーティングされた顆粒酵素触媒を調製するためには、酵素物質、重合体および架橋剤の水性懸濁液を用いる。酵素物質は直接用いてよく、或いは、予め精製した後に本発明の方法において用いてもよい。回収は、遠心分離、濾過、沈殿または凝集により行なってよい。酵素物質は水または塩化ナトリウム、リン酸塩、ＥＤＴＡまたはマグネシウムのような塩を含有する水溶液で洗浄してよい。好ましい出発物質は培養ブロスを濾過または遠心分離することにより培養物より回収した酵素的に活性な細胞スラッジである。細胞スラッジはそのまま用いるか、または、予め洗浄して用いてよい、細胞はダイアフィルトレーションによるか、または再懸濁と遠心分離により洗浄してよい。
【００１６】
懸濁液は酵素物質５〜２５％、重合体１〜１２％、および、架橋剤０．２〜４％を含有してよく、これらの量は水性懸濁液の総重量に基づく。懸濁液中の水の量は重要な要因ではなく、当業者が適宜、噴霧に使用する材料に適合させてよい。懸濁液中の固形分は容量に対する重量として１０〜３０％が好ましい。懸濁液はまた、ポリオール類のような少量の物質、例えばグルコース、スクロース、トレハロース、マルチトール、ソルビトールおよびグリセロール；および塩類、例えば塩化ナトリウムも含有してよい。
【００１７】
必須ではないが、懸濁液のｐＨをｐＨ５〜９．５、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５の値に設定するのが好ましい。このためには、緩衝液を使用してよい。適宜、緩衝液はリン酸１カリウムまたは２カリウムまたはリン酸１ナトリウムまたは２ナトリウムのようなリン酸塩、または、炭酸塩であってよい。好ましい緩衝液はリン酸塩緩衝液である。緩衝液が懸濁液中に存在する場合は、乾燥酵素物質の重量に基づいて１５〜５０重量％の緩衝液を添加する。
【００１８】
懸濁液はまた如何なる適当な方法で調製してもよい。好ましくは、懸濁液の調製に際しては先ず水または緩衝液中の酵素物質の懸濁液を形成する。次に架橋剤を酵素物質の懸濁液に添加する。架橋剤が酵素物質のアミン、ヒドロキシルまたはカルボキシル官能基と反応するのに十分な時間、これを酵素物質に接触させたままとしたのち、重合体を添加する。噴霧工程を行う前に、ポリオール、緩衝液および塩化ナトリウムのような任意の物質を懸濁液に添加してもよい。
【００１９】
懸濁液は０〜５０℃、好ましくは１０〜３５℃の温度で調製するのが適している。
【００２０】
次に得られた懸濁液を特に留意することなく数日間保存した後に噴霧する。保存温度は０℃〜周囲温度とすることが好都合である。
【００２１】
懸濁液は何らかの噴霧コーティング装置、好ましくは空気流動床を用いてコアに付着させる。気流の流速は固体支持体の良好な流体化が達成できるように適宜調節する。空気導入温度は３０〜９０℃に適宜調節し、水性懸濁液の噴霧速度は流動床の温度が１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃に維持できるように操作中を通じて調節する。得られたコア上のコーティング層の厚みは３０〜４００ミクロンである。
【００２２】
このように上記した方法に従って調製された酵素触媒は水中、または緩衝媒体中、または乾燥状態で数ヶ月保存した後に使用することができる。
【００２３】
本発明の顆粒酵素触媒は如何なる適当な酵素的方法において使用してもよい。特に本発明の酵素触媒は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）から相当するアンモニウム塩、即ち２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム（ＨＭＴＢＳ）への変換において使用してよい。触媒はまたＮＹＬＯＮ６６オリゴマーの加水分解において使用してよい。本発明の触媒の特に有利な点は、これが他の知られた触媒よりも長い半減期を示す点である。特にコーティングされた顆粒酵素触媒は３０時間以上、好ましくは７０時間以上の半減期を有する。
【００２４】
本発明を以下の実施例を参照しながら更に説明する。
【００２５】
以下の実施例においては次の略記法を用いる。
ＨＭＴＢＮ ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル
ＨＭＴＢＳ ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム
【００２６】
実施例１
１．１ 酵素触媒の調製
菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ ７１４の構築
Ｐｔｒｐプロモーター、ファージｃｌｌ遺伝子（ＲＢＳｃＩＩ）のリボソーム結合部位およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０由来のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）を含む１．２７ｋｂのフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてプラスミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（特許出願ＷＯ９８／１８９４１）から抽出し、同じ制限酵素により開裂させたベクターｐＸＬ６４２（米国特許５，６２９，１９０記載）中でクローニングした。得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩおよびＢｓｍＩを用いて開裂させ、４．３ｋｂのフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（特許出願ＷＯ９８／１８９４１）由来の精製１３６ｂｐのＳＴｕｌ−ＢｓｍＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を得る。ｐＲＰＡ−ＢＣＡ１９の部分的配列決定によりニトロラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンとＡｓｎ２７９残基のコドンの置き換えが確認された。次にＰｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉｔＢ融合物を含んでいるｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９由来の１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを同じ酵素で開裂させたベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８中でクローニングし、６．２ｋｂのプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を得た。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８はｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願０８／１９４，５８８号）由来の３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラグメントをｐＨＰ４５Ｔｃ（Ｆｅｌｌａｙ等、１９８７，Ｇｅｎｅ ５２：１４７−１５４）由来の２．１ｋｂのＳｍａＩフラグメントに連結してアンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マーカーとおきかえることにより得た。部分的ＮｄｅＩ消化およびＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）の作用によりプラスミドｐＲPＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点に近接するＮｄｅｌ部位を破壊することにより、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を得た。
【００２７】
標準的なエレクトロポレーションによりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１およびｐＸＬ２０３５（Ｌｗｖｙ−Ｓｃｈｉｌｌ等、１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）をＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）に導入した。得られたクローンをＢＩＯＣＡＴ ７１４と命名した。
【００２８】
菌株の培養
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０由来のニトリラーゼを含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ（ＢＩＯＣＡＴ ７１４）を表１に示す組成を有する培地８０リットルの入った１００Ｌ容の培養槽で培養する。
【００２９】
【表１】
【００３０】
アンモニア水を添加することによりｐＨを７．０に維持した。酸素飽和度は攪拌しながら１ｖ／ｖ（培地／分）の速度で空気を添加することにより２０％に維持した。グルコースは初期は２ｇ／Ｌの濃度で導入した。その後、追加のグルコースは７００ｇ／Ｌグルコースおよび１９．６ｇ／L ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの保存溶液を用いて連続導入した。添加速度は２．２ｇグルコース／ｈ・Ｌ培地とした。２４時間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。固形分２６％のペースト状物を直接固定化に用いた。
【００３１】
乾燥菌体量２６．０重量％を含有する細胞ペレットの９５０ｇを１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液５７１．５ｇ中に希釈した。希釈は３パドルのヘリカル攪拌子を備えた反応器中、周囲温度で行った。希釈後のｐＨは８．０であった。１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液は脱イオン水１リットル中Ｋ２ＨＰＯ４１６５．５ｇおよびＫＨ２ＰＯ４６．８ｇを溶解することにより作製した。この溶液の初期ｐＨは９．０であった。
【００３２】
６重量％の濃度のグルタルアルデヒド水溶液１６４．６ｇを細胞懸濁液にゆっくり添加した。得られた混合物を周囲温度で最低１時間攪拌放置した後に、１２．５重量％のポリアゼチジン（Ｋｙｍｅｎｅ ６１７）水溶液３９５．２ｇを添加した。このようにして得られた細胞懸濁液の組成を以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
この細胞懸濁液１８００ｇを熱風気流中で流動（導入温度５３℃）させた直径２．０ｍｍのアルミナビーズ３５０ｇに噴霧した。噴霧速度はビーズの温度が３５℃に維持されるように調節した。１７０分噴霧した後、乾燥菌体２５．５重量％および残存水分１６．６％を含有する生物触媒８４１ｇが得られた。コーティングの厚みは３３０ミクロンであった。コーティングされた顆粒の直径は２．６ｍｍであった。コーティング厚に対する顆粒の大きさの比は７であった。
【００３５】
１．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
ＨＭＴＢＮ０．１ｍｏｌ／Ｌの存在下ｐＨ６．６、２５℃で測定した本触媒の活性は、触媒１ｋｇ当たり１時間当たりＨＭＴＢＮ０．５６ｋｇをアンモニウムの２−ヒドロキシ−３−メチルチオブタノエート（ＨＭＴＢＳ）に変換させるものであった。
【００３６】
内部直径３ｃｍ、長さ４５ｃｍのサーモスタットカラムに触媒１００ｇを充填した。カラムには再循環ループを介してポンプを装着した。反応器の総容量は４３０ｍＬであった。ループにはアンモニウム塩ＨＭＴＢＮの２５％溶液を充填した。溶液を上部からカラムに導入し、１時間当たり２０リットルの速度で底部まで通過させた。カラムの周囲の二重包囲部に水を循環させることにより温度を３５℃に維持した。ミネラルウォーターを４０ｇ／時の速度でループに導入した。カラム底部から過剰な液体を排除することにより反応器の容量を一定に維持した。連続流動は９５％ニトリルの変換を伴って達成された。反応器から出てくるＨＭＴＢＳの濃度は２５％であった。０．２モル／ＬのＨＭＴＢＮの存在下の３５℃における半減期は３０時間であった。
【００３７】
実施例２
２．１ 酵素触媒の調製
乾燥菌体２６重量％を含有し、実施例１に記載の通り調製した細胞ペレット１１００ｇを塩化ナトリウム９ｇ／Ｌを含有する水溶液１３．２ｋｇ中に希釈した。懸濁液を十分攪拌された反応槽中で３０分間室温で攪拌した。菌体を遠心分離により回収した。
【００３８】
乾燥菌体２６重量％を含有する洗浄した細胞ペレット９５０ｇを上記した実施例１に記載の通り処理し、処理懸濁液１８００ｇを得た。１７０分間噴霧した後、乾燥菌体２５．５重量％および残存水分１７％を含有する触媒８５０ｇを得た。コーティングの厚みは１９０ミクロンであった。コアの直径は２．２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１１．６であった。
【００３９】
２．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
触媒の活性および半減期は０．１ｍｏｌ／ＬのＨＭＴＢＮの存在下、ｐＨ６．６、３５℃にて実施例１に記載の通り測定した。活性は、触媒１ｋｇ当たり１時間当たりＨＭＴＢＮ０．５ｋｇをアンモニウムの２−ヒドロキシ−３−メチルチオブタノエート（ＨＭＴＢＳ）に変換させるものであった。半減期は７０時間であった。
【００４０】
実施例３
３．１ 酵素触媒の調製
重合体マトリックスがポリエチレンイミン２３％およびポリアゼチジン７７％を含有するものとした以外は実施例１と同様にして行なった。細胞懸濁液の最終組成を以下の表にまとめる。
【００４１】
【表３】
【００４２】
細胞懸濁液１３００ｇを実施例２と同様の操作条件下アルミナビーズ４００ｇに噴霧した。１３０分噴霧した後、乾燥菌体１７．６重量％および残存水分７．５％を含有する触媒５５３ｇを得た。コーティングの厚みは２１０ミクロンであった。コアの直径は２．２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１０であった。
【００４３】
得られた触媒をＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの変換に用い、上記した他の触媒と同様の結果を得た。
【００４４】
実施例４
４．１ ポリアミダーゼ活性を有する酵素触媒の調製
参照により本明細書に組み込まれる仏国特許出願９５０８９１６号に記載の通り調製した組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞ペースト１３４ｇをリン酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）２３０ｇ中に希釈した。実施例３に記載の操作法を反復し、細胞懸濁液５４０ｇを実施例１に記載の条件下アルミナビーズ４００ｇに噴霧した。
【００４５】
４．２ ＮＹＬＯＮ６６の触媒加水分解
ＦＲ９５０９８０１６号に記載の操作法に従って酵素活性を測定した。ＮＹＬＯＮ６，６オリゴマー５ｇ／Ｌの存在下３０℃、ｐＨ７で測定した酵素活性は触媒１リットル当たり1時間当たり１４０ｇのＮＹＬＯＮ６，６をアジピン酸に変換するものであった。半減期は７９０時間より長かった。
【００４６】
比較例Ａ
Ａ．１酵素触媒の調製
実施例１に記載の通り調製した細胞懸濁液１００ｇを熱風気流中で流動（導入温度５３℃）させた直径２．０ｍｍのアルミナビーズ３５０ｇに噴霧した。噴霧速度はビーズの温度が３５℃に維持されるように調節した。１７０分噴霧した後、乾燥菌体３重量％を有する触媒３８５ｇが得られた。コーティングの厚みは２０ミクロンであった。コアの直系は２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１００であった。
【００４７】
Ａ．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
この生物触媒の活性および半減期を０．１ｍｏｌ／ＬのＨＭＴＢＮの存在下２５℃、ｐＨ６．６で実施例１に記載の通り測定した。活性は触媒１ｋｇ当たり１時間当たり０．０６ｋｇのＨＭＴＢＮをアンモニウムの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタノエートに変換させるものであった。半減期は１１時間であった。
本発明は酵素触媒、特に酵素を含有するコーティングを顆粒に施した顆粒形態の酵素触媒に関する。
【０００２】
酵素活性を有する固定化細胞を含有する組成物は、例えば、欧州特許００８９１６５において知られており、これは、架橋重合体を用いて固定化されているＥ．ｃｏｌｉを含有するコーティングが不活性担体上に存在する組成物を開示している。この組成物はＬ−アスパラギン酸を調製するために使用される。欧州特許出願０２９７９１２号はコーティングが生物学的物質および架橋重合体を含有するコーティングされた粒子を有する生物学的に活性な物質を開示している。
【０００３】
我々はコーティングを施すする顆粒の内部コアに対して特定の厚みのコーティングを有するコーティングされた顆粒酵素物質が既知の酵素触媒物質を超える非常に有益な利点を示すことを発見した。
【０００４】
したがって、本発明は水中非分散性の顆粒形態の酵素触媒であって、該触媒が酵素物質を含有するコーティングによってコーティングを施された内部コアを有し、該コーティングが３０〜４００ミクロンの厚みを有し、コーティング厚みに対するコアの大きさの比が２〜２０であることを特徴とする前記酵素触媒を提供する。
【０００５】
本発明の酵素触媒はコーティングの厚みを制御することにより得られる顆粒触媒がより大きい酵素活性を示すという点において従来技術を超える利点を与える。
【０００６】
本発明は顆粒形態の酵素触媒、即ち以下に顆粒酵素触媒と称する物に関する。触媒は水中非分散性、好ましくは水不溶性でなければならない。この性質は内部コアにより与えられるものであり、これは水中で非分散性、好ましくは、水不溶性である。内部コアとして使用するのに適する物質はアルミナ、シリカ、ゼオライト、樹脂、ステアリン酸のような脂肪物質、ガラスビーズおよびプラスチックビーズを包含する。好ましくはコアはアルミナである。
【０００７】
コアは如何なる適当な形状、例えば正球、非正球、楕円等であってもよいが、好ましい形状は平均直径０．１〜５ミリメートル、好ましくは０．４〜２．５ミリメートルの正球である。コアはマクロ孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）、メソ孔性（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ）またはミクロ孔性（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）の何れかであってよい。好ましくは酵素物質が孔内に侵入するのを回避するために、大孔性ではない。
【０００８】
コアのコーティングは３０〜４００ミクロン、好ましくは１００〜２５０ミクロンの厚みを有する。コーティング厚に対するコアの大きさの比は２〜２０、好ましくは３〜１５である。本発明の目的のためには、コアの大きさは最大内部直径、即ち、コアの周璧上の外部の点二箇所の間の最大の距離と定義される。
【０００９】
顆粒触媒のコーティングは酵素物質を含有する。酵素物質は可溶性または細胞結合性等の酵素、微生物（未損傷または破壊された生細胞または非生細胞）、抗体および補酵素またはこれらの混合物であってよい。特に適する酵素物質には、グルコースイソメラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼが包含される。好ましい酵素物質はニトリラーゼである。
【００１０】
酵素物質のほかに、コーティングは更に重合体および架橋剤を含有するのが好ましい。これらの化合物が存在することにより、酵素物質を重合体の交差結合網目構造内に包埋することができる。この網目構造は固定化に関わる重大な問題点の１つ、即ち、固定化材料からの所望の酵素の漏出を克服可能とする。したがって、これは高分子量の物質に対して非透過性の遮蔽障壁を形成するのに有用である。適する重合体としては、ポリアゼチジン重合体、ポリエチレンイミンのようなポリアミン重合体、蛋白質のようなポリアミド重合体、イソシアネート重合体またはその混合物が挙げられる。好ましい重合体は、コーティング層に対して良好な機械的強度を与えることができる観点から、ポリアゼチジン重合体である。使用してよいポリアゼチジン重合体の例はＰｏｌｙｃｕｐ ２００２、Ｋｙｍｅｎｅ ６１７およびＫｙｍｅｎｅ ４５０（全商品名とも米国Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社のもの）のような市販の重合体である。適当な架橋剤としては、ヘキサメチレンジアミン、グルタルアルデヒドまたはアクロレインのようなアルデヒド類、アジピン酸のような酸類、ヘキサメチレンジイソシアネートのようなイソシアネート類が挙げられる。好ましい架橋剤はグルタルアルデヒドである。本発明の目的のためには、特に好ましいコーティングはニトリラーゼ、ポリアゼチジン重合体およびグルタルアルデヒドの混合物である。
【００１１】
触媒物質のコーティング中の酵素物質、重合体および架橋剤の量に関しては、乾燥コーティング中の各成分の量は酵素物質が５０〜８０％、好ましくは４０〜６０％；重合体物質が５〜２０％、好ましくは１０〜１５％；そして架橋剤が１〜５％、好ましくは２〜３％が適している。例えばグルコース、スクロース、トレハロース、マルチトール、ソルビトールおよびグリセロール等のポリオール類、および／または塩類、例えばリン酸塩のような別の成分もコーティング中に存在してよい。これらは０〜３５％の量で存在することができる。コーティングはまた限定的な量の水を含有してよい。水はコーティングの０〜３０％の量で存在するのが適している。
【００１２】
本発明の酵素触媒は当業者の知る如何なる適当な固定化方法により調製してもよく、例えばゲル捕獲または吸着によって行なってよい。欧州特許出願０２９７９１２、０２０６６８７および０５０２０３５号は顆粒への吸着により酵素物質を含有する水性混合物を付着させる操作法を開示している。その後顆粒を乾燥する。コーティングの付着のための代替法がＥＰ０８９１６５に開示されており、そこでは酵素物質を含有するペーストを形成し、ペーストを顆粒に適用し、次に得られた顆粒を乾燥することが行なわれている。
【００１３】
我々はコーティングされた顆粒酵素触媒はまたコーティング物質の混合物をコアに噴霧することによっても調製できることを発見し、これにより本発明の別の特徴によれば、上記した酵素触媒の調製方法が提供され、その方法は、酵素物質、重合体および架橋剤の水性懸濁液を形成すること、および、該懸濁液をコアに噴霧することにより、該コアをコーティングすることを包含する。
【００１４】
一般的に「噴霧コーティング」と称される噴霧技術を用いてコーティングされた酵素触媒を調製することは、本発明の酵素触媒の重要な特徴である所望の厚みを得るべくコーティングの厚みを制御できるという点において、他の知られた固定化方法を超える利点をもたらす。
【００１５】
噴霧コーティング技術を用いてコーティングされた顆粒酵素触媒を調製するためには、酵素物質、重合体および架橋剤の水性懸濁液を用いる。酵素物質は直接用いてよく、或いは、予め精製した後に本発明の方法において用いてもよい。回収は、遠心分離、濾過、沈殿または凝集により行なってよい。酵素物質は水または塩化ナトリウム、リン酸塩、ＥＤＴＡまたはマグネシウムのような塩を含有する水溶液で洗浄してよい。好ましい出発物質は培養ブロスを濾過または遠心分離することにより培養物より回収した酵素的に活性な細胞スラッジである。細胞スラッジはそのまま用いるか、または、予め洗浄して用いてよい、細胞はダイアフィルトレーションによるか、または再懸濁と遠心分離により洗浄してよい。
【００１６】
懸濁液は酵素物質５〜２５％、重合体１〜１２％、および、架橋剤０．２〜４％を含有してよく、これらの量は水性懸濁液の総重量に基づく。懸濁液中の水の量は重要な要因ではなく、当業者が適宜、噴霧に使用する材料に適合させてよい。懸濁液中の固形分は容量に対する重量として１０〜３０％が好ましい。懸濁液はまた、ポリオール類のような少量の物質、例えばグルコース、スクロース、トレハロース、マルチトール、ソルビトールおよびグリセロール；および塩類、例えば塩化ナトリウムも含有してよい。
【００１７】
必須ではないが、懸濁液のｐＨをｐＨ５〜９．５、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５の値に設定するのが好ましい。このためには、緩衝液を使用してよい。適宜、緩衝液はリン酸１カリウムまたは２カリウムまたはリン酸１ナトリウムまたは２ナトリウムのようなリン酸塩、または、炭酸塩であってよい。好ましい緩衝液はリン酸塩緩衝液である。緩衝液が懸濁液中に存在する場合は、乾燥酵素物質の重量に基づいて１５〜５０重量％の緩衝液を添加する。
【００１８】
懸濁液はまた如何なる適当な方法で調製してもよい。好ましくは、懸濁液の調製に際しては先ず水または緩衝液中の酵素物質の懸濁液を形成する。次に架橋剤を酵素物質の懸濁液に添加する。架橋剤が酵素物質のアミン、ヒドロキシルまたはカルボキシル官能基と反応するのに十分な時間、これを酵素物質に接触させたままとしたのち、重合体を添加する。噴霧工程を行う前に、ポリオール、緩衝液および塩化ナトリウムのような任意の物質を懸濁液に添加してもよい。
【００１９】
懸濁液は０〜５０℃、好ましくは１０〜３５℃の温度で調製するのが適している。
【００２０】
次に得られた懸濁液を特に留意することなく数日間保存した後に噴霧する。保存温度は０℃〜周囲温度とすることが好都合である。
【００２１】
懸濁液は何らかの噴霧コーティング装置、好ましくは空気流動床を用いてコアに付着させる。気流の流速は固体支持体の良好な流体化が達成できるように適宜調節する。空気導入温度は３０〜９０℃に適宜調節し、水性懸濁液の噴霧速度は流動床の温度が１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃に維持できるように操作中を通じて調節する。得られたコア上のコーティング層の厚みは３０〜４００ミクロンである。
【００２２】
このように上記した方法に従って調製された酵素触媒は水中、または緩衝媒体中、または乾燥状態で数ヶ月保存した後に使用することができる。
【００２３】
本発明の顆粒酵素触媒は如何なる適当な酵素的方法において使用してもよい。特に本発明の酵素触媒は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）から相当するアンモニウム塩、即ち２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム（ＨＭＴＢＳ）への変換において使用してよい。触媒はまたＮＹＬＯＮ６６オリゴマーの加水分解において使用してよい。本発明の触媒の特に有利な点は、これが他の知られた触媒よりも長い半減期を示す点である。特にコーティングされた顆粒酵素触媒は３０時間以上、好ましくは７０時間以上の半減期を有する。
【００２４】
本発明を以下の実施例を参照しながら更に説明する。
【００２５】
以下の実施例においては次の略記法を用いる。
ＨＭＴＢＮ ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル
ＨＭＴＢＳ ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム
【００２６】
実施例１
１．１ 酵素触媒の調製
菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ ７１４の構築
Ｐｔｒｐプロモーター、ファージｃｌｌ遺伝子（ＲＢＳｃＩＩ）のリボソーム結合部位およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０由来のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）を含む１．２７ｋｂのフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてプラスミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（特許出願ＷＯ９８／１８９４１）から抽出し、同じ制限酵素により開裂させたベクターｐＸＬ６４２（米国特許５，６２９，１９０記載）中でクローニングした。得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩおよびＢｓｍＩを用いて開裂させ、４．３ｋｂのフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（特許出願ＷＯ９８／１８９４１）由来の精製１３６ｂｐのＳＴｕｌ−ＢｓｍＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を得る。ｐＲＰＡ−ＢＣＡ１９の部分的配列決定によりニトロラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンとＡｓｎ２７９残基のコドンの置き換えが確認された。次にＰｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉｔＢ融合物を含んでいるｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９由来の１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを同じ酵素で開裂させたベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８中でクローニングし、６．２ｋｂのプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を得た。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８はｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願０８／１９４，５８８号）由来の３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラグメントをｐＨＰ４５Ｔｃ（Ｆｅｌｌａｙ等、１９８７，Ｇｅｎｅ ５２：１４７−１５４）由来の２．１ｋｂのＳｍａＩフラグメントに連結してアンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マーカーとおきかえることにより得た。部分的ＮｄｅＩ消化およびＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）の作用によりプラスミドｐＲPＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点に近接するＮｄｅｌ部位を破壊することにより、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を得た。
【００２７】
標準的なエレクトロポレーションによりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１およびｐＸＬ２０３５（Ｌｗｖｙ−Ｓｃｈｉｌｌ等、１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）をＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）に導入した。得られたクローンをＢＩＯＣＡＴ ７１４と命名した。
【００２８】
菌株の培養
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０由来のニトリラーゼを含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ（ＢＩＯＣＡＴ ７１４）を表１に示す組成を有する培地８０リットルの入った１００Ｌ容の培養槽で培養する。
【００２９】
【表１】
アンモニア水を添加することによりｐＨを７．０に維持した。酸素飽和度は攪拌しながら１ｖ／ｖ（培地／分）の速度で空気を添加することにより２０％に維持した。グルコースは初期は２ｇ／Ｌの濃度で導入した。その後、追加のグルコースは７００ｇ／Ｌグルコースおよび１９．６ｇ／L ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの保存溶液を用いて連続導入した。添加速度は２．２ｇグルコース／ｈ・Ｌ培地とした。２４時間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。固形分２６％のペースト状物を直接固定化に用いた。
【００３１】
乾燥菌体量２６．０重量％を含有する細胞ペレットの９５０ｇを１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液５７１．５ｇ中に希釈した。希釈は３パドルのヘリカル攪拌子を備えた反応器中、周囲温度で行った。希釈後のｐＨは８．０であった。１ ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液は脱イオン水１リットル中Ｋ２ＨＰＯ４１６５．５ｇおよびＫＨ２ＰＯ４６．８ｇを溶解することにより作製した。この溶液の初期ｐＨは９．０であった。
【００３２】
６重量％の濃度のグルタルアルデヒド水溶液１６４．６ｇを細胞懸濁液にゆっくり添加した。得られた混合物を周囲温度で最低１時間攪拌放置した後に、１２．５重量％のポリアゼチジン（Ｋｙｍｅｎｅ ６１７）水溶液３９５．２ｇを添加した。このようにして得られた細胞懸濁液の組成を以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】
この細胞懸濁液１８００ｇを熱風気流中で流動（導入温度５３℃）させた直径２．０ｍｍのアルミナビーズ３５０ｇに噴霧した。噴霧速度はビーズの温度が３５℃に維持されるように調節した。１７０分噴霧した後、乾燥菌体２５．５重量％および残存水分１６．６％を含有する生物触媒８４１ｇが得られた。コーティングの厚みは３３０ミクロンであった。コーティングされた顆粒の直径は２．６ｍｍであった。コーティング厚に対する顆粒の大きさの比は７であった。
【００３５】
１．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
ＨＭＴＢＮ０．１ｍｏｌ／Ｌの存在下ｐＨ６．６、２５℃で測定した本触媒の活性は、触媒１ｋｇ当たり１時間当たりＨＭＴＢＮ０．５６ｋｇをアンモニウムの２−ヒドロキシ−３−メチルチオブタノエート（ＨＭＴＢＳ）に変換させるものであった。
【００３６】
内部直径３ｃｍ、長さ４５ｃｍのサーモスタットカラムに触媒１００ｇを充填した。カラムには再循環ループを介してポンプを装着した。反応器の総容量は４３０ｍＬであった。ループにはアンモニウム塩ＨＭＴＢＮの２５％溶液を充填した。溶液を上部からカラムに導入し、１時間当たり２０リットルの速度で底部まで通過させた。カラムの周囲の二重包囲部に水を循環させることにより温度を３５℃に維持した。ミネラルウォーターを４０ｇ／時の速度でループに導入した。カラム底部から過剰な液体を排除することにより反応器の容量を一定に維持した。連続流動は９５％ニトリルの変換を伴って達成された。反応器から出てくるＨＭＴＢＳの濃度は２５％であった。０．２モル／ＬのＨＭＴＢＮの存在下の３５℃における半減期は３０時間であった。
【００３７】
実施例２
２．１ 酵素触媒の調製
乾燥菌体２６重量％を含有し、実施例１に記載の通り調製した細胞ペレット１１００ｇを塩化ナトリウム９ｇ／Ｌを含有する水溶液１３．２ｋｇ中に希釈した。懸濁液を十分攪拌された反応槽中で３０分間室温で攪拌した。菌体を遠心分離により回収した。
【００３８】
乾燥菌体２６重量％を含有する洗浄した細胞ペレット９５０ｇを上記した実施例１に記載の通り処理し、処理懸濁液１８００ｇを得た。１７０分間噴霧した後、乾燥菌体２５．５重量％および残存水分１７％を含有する触媒８５０ｇを得た。コーティングの厚みは１９０ミクロンであった。コアの直径は２．２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１１．６であった。
【００３９】
２．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
触媒の活性および半減期は０．１ｍｏｌ／ＬのＨＭＴＢＮの存在下、ｐＨ６．６、３５℃にて実施例１に記載の通り測定した。活性は、触媒１ｋｇ当たり１時間当たりＨＭＴＢＮ０．５ｋｇをアンモニウムの２−ヒドロキシ−３−メチルチオブタノエート（ＨＭＴＢＳ）に変換させるものであった。半減期は７０時間であった。
【００４０】
実施例３
３．１ 酵素触媒の調製
重合体マトリックスがポリエチレンイミン２３％およびポリアゼチジン７７％を含有するものとした以外は実施例１と同様にして行なった。細胞懸濁液の最終組成を以下の表にまとめる。
【００４１】
【表３】
細胞懸濁液１３００ｇを実施例２と同様の操作条件下アルミナビーズ４００ｇに噴霧した。１３０分噴霧した後、乾燥菌体１７．６重量％および残存水分７．５％を含有する触媒５５３ｇを得た。コーティングの厚みは２１０ミクロンであった。コアの直径は２．２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１０であった。
【００４３】
得られた触媒をＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの変換に用い、上記した他の触媒と同様の結果を得た。
【００４４】
実施例４
４．１ ポリアミダーゼ活性を有する酵素触媒の調製
参照により本明細書に組み込まれる仏国特許出願９５０８９１６号に記載の通り調製した組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞ペースト１３４ｇをリン酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）２３０ｇ中に希釈した。実施例３に記載の操作法を反復し、細胞懸濁液５４０ｇを実施例１に記載の条件下アルミナビーズ４００ｇに噴霧した。
【００４５】
４．２ ＮＹＬＯＮ６６の触媒加水分解
ＦＲ９５０９８０１６号に記載の操作法に従って酵素活性を測定した。ＮＹＬＯＮ６，６オリゴマー５ｇ／Ｌの存在下３０℃、ｐＨ７で測定した酵素活性は触媒１リットル当たり1時間当たり１４０ｇのＮＹＬＯＮ６，６をアジピン酸に変換するものであった。半減期は７９０時間より長かった。
【００４６】
比較例Ａ
Ａ．１酵素触媒の調製
実施例１に記載の通り調製した細胞懸濁液１００ｇを熱風気流中で流動（導入温度５３℃）させた直径２．０ｍｍのアルミナビーズ３５０ｇに噴霧した。噴霧速度はビーズの温度が３５℃に維持されるように調節した。１７０分噴霧した後、乾燥菌体３重量％を有する触媒３８５ｇが得られた。コーティングの厚みは２０ミクロンであった。コアの直系は２ｍｍであった。コーティング厚に対するコアの大きさの比は１００であった。
【００４７】
Ａ．２ ＨＭＴＢＮからＨＭＴＢＳへの触媒変換
この生物触媒の活性および半減期を０．１ｍｏｌ／ＬのＨＭＴＢＮの存在下２５℃、ｐＨ６．６で実施例１に記載の通り測定した。活性は触媒１ｋｇ当たり１時間当たり０．０６ｋｇのＨＭＴＢＮをアンモニウムの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタノエートに変換させるものであった。半減期は１１時間であった。
Claims (17)
- 水中非分散性の顆粒形態の酵素触媒であって、該触媒が酵素物質を含有するコーティングによってコーティングを施された内部コアを有し、該コーティングが３０〜４００ミクロンの厚みを有し、コーティング厚みに対するコアの大きさの比が３〜１５であり、前記コアが０．１〜５ミリメートルの平均直径を有することを特徴とする前記酵素触媒。
- 水に不溶性である請求項１記載の酵素触媒。
- コーティングの厚みが１００〜２５０ミクロンである請求項１または２に記載の酵素触媒。
- コアがメソ孔性（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ）またはミクロ孔性（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）である請求項１または３に記載の酵素触媒。
- コアがアルミナ、シリカ、ゼオライト、樹脂、脂肪物質、ガラスビーズおよびプラスチックビーズから選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- 酵素物質がグルコースイソメラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミデアーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼから選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- 酵素がニトリラーゼである請求項６記載の酵素触媒。
- コーティングが更に重合体および架橋剤を含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- 重合体がポリアゼチジン重合体、ポリアミン重合体、ポリアミド重合体およびイソシアネート重合体から選択され、架橋剤がアミン、アルデヒド、酸およびイソシアネートから選択される請求項８記載の酵素触媒。
- コーティングがニトリラーゼ、ポリアゼチジン重合体およびグルタルアルデヒドを含有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- コーティングが水０〜３０％を含有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- ３０時間以上、好ましくは７０時間以上の半減期を有する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素触媒。
- 酵素物質、重合体および架橋剤の懸濁液を形成すること、および、該懸濁液をコアに噴霧することにより該コアをコーティングすることを包含する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の顆粒酵素触媒の調製方法。
- 酵素物質が、懸濁液の形成の前に洗浄してある酵素的に活性な細胞スラッジである請求項１３記載の方法。
- 酵素的変換工程における請求項１〜１２の何れか１項に記載の酵素触媒の使用。
- ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルから２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウムへの変換における請求項１５記載の使用。
- ナイロン６６の加水分解における請求項１５に記載の使用。
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| WO1998018941A1 (fr) * | 1996-10-25 | 1998-05-07 | Rhone-Poulenc Nutrition Animale | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy 4-methylthio butyrique par utilisation d'une nitrilase |
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