JP4767382B2 - IgE産生抑制剤 - Google Patents
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【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫グロブリン(immunoglobulin)の一種であるIgEの産生抑制剤に関するものである。詳しくは、本発明は、ラクトフェリン類を有効成分として含有するIgE産生抑制剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、ペプチド又は蛋白質を有効成分とするIgE産生抑制剤としては、トリプスタチン関連化合物である合成ペプチドからなる新規IgE産生抑制物質(特開平6−239887号公報。以下、従来技術1と記載する。)、遺伝子工学的手法により製造される高親和性免疫グロブリンE受容体α鎖又はその可溶性断片からなるIgE産生抑制剤(特開平7−118168号公報。以下、従来技術2と記載する。)等が知られている。
【0003】
一方、ラクトフェリンは、乳汁中等に含まれている天然の分子量約80,000の鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている[ジャーナル・オブ・ペディアトリクス(Journal of Pediatrics)、第94巻、第1ページ、1979年、及びジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第67巻、第60ページ、1984年]。
【0004】
また、感染モデル動物におけるラクトフェリンの効果も報告されており、ザグルスキ(Zagulski)らは、ラットを用い、致死量の大腸菌を投与する24時間前にラクトフェリンを静脈内に投与した群及び無投与群について生存率を比較し、ラクトフェリンに感染防御作用があることを立証している[ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー(British Journal of Experimental Pathology )、第70巻、第697ページ、1989年]。更に、ウィルス感染実験においてもラクトフェリンに感染防御効果があることは知られている[キャンサー・リサーチ(Cancer Research)、第47巻、第4184ページ、1987年]。これらの感染動物で認められた効果は、ラクトフェリンのin vitro(試験管内)で認められた抗菌作用に起因するものではなく、ラクトフェリンが宿主の免疫力を賦活したことに起因するものと考えられている。
【0005】
即ち、ラクトフェリンには、抗菌作用の他に免疫賦活作用があると理解されている。このラクトフェリンの免疫賦活作用を抗癌に応用した例として、ベザウルト(Bezault)らは、癌モデルマウスにラクトフェリンを腹腔内投与し、ラクトフェリンが癌の成長を抑制する効果を有することを確認しているが、このラクトフェリンの抗癌作用は、その免疫賦活作用の観点からナチュラル・キラー細胞の活性化作用によるものと考えられている[キャンサー・リサーチ(Cancer Research)、第54巻、第2310ページ、1994年]。
【0006】
また、ラクトフェリンには、抗体の産生促進作用があることが知られており[アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry)、第54巻、第1087ページ、1990年]、無血清培地における抗体産生促進に関する技術(特開平2−257892号公報)も開示されている。
【0007】
更に、ラクトフェリン分解物からなるIgG及びIgMクラスの抗体産生を促進する免疫賦活剤(特開平7−179355号公報)、ラクトフェリン由来のペプチドからなる免疫促進剤(特表平7−507763号公報)等が知られている。
【0008】
しかしながら、ラクトフェリン類が免疫抑制作用、具体的にはIgE等の抗体の産生抑制作用を有することは知られておらず、文献にも記載されていない。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から明らかなとおり、従来技術1は、合成ペプチドであり、従来技術2は、遺伝子工学的手法により製造されることから、製造工程が繁雑で、天然物に比較して安全性試験を慎重に行う必要がある等の問題点を有していた。
【0010】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、従来技術の有する前記問題点を解決し得る天然物を有効成分とするIgE産生抑制剤を開発することを目的として鋭意研究を行った。その結果、驚くべきことに、免疫賦活作用が知られていたラクトフェリン類に、これとは全く逆の作用である免疫抑制作用の一種であるIgE産生抑制作用という有益な作用があることを見出し、本発明を完成した。
【0011】
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、安全性の高い天然物からなるIgE産生抑制剤を提供することを目的としている。
【0012】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、ラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンからなる群より選択された化合物、又はこれらの2種以上の混合物を有効成分として含有するIgE産生抑制剤である。
【0013】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について詳細に説明する。
【0014】
本発明のIgE産生抑制剤の有効成分であるラクトフェリン類は、ヒト、ウシ等の哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、このラクトフェリンを化学的に処理したラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、ラクトフェリンマンガン、及びアポラクトフェリンからなる群からより選択された化合物、又はこれらの2種以上の混合物であり、公知の方法により調製することができる。
【0015】
即ち、例えば特公平6−13560号公報記載の方法等により調製されたラクトフェリン、例えば特開昭62−249931号公報記載の方法等により調製されたアポラクトフェリン、例えば特許第2564185号公報記載の方法等により調製されたラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンを、それぞれ使用することができるが、より簡便には、市販のラクトフェリン(例えば、森永乳業社製等。)を使用することができる。
【0016】
尚、ラクトフェリンの分離、精製方法の具体的な一例は、次のとおりである。
【0017】
CM−セファロースFF(ファルマシア社製)をカラムに充填し、塩酸を通液し、水洗し、イオン交換体を平衡化し、4℃に冷却したpH6.9の脱脂牛乳をカラムに通液し、透過液を回収し、再度同様にカラムに通液する。次いで、蒸留水をカラムに通液し、次いで食塩水を通液し、イオン交換体に吸着している塩基性蛋白質の溶出液を得る。
【0018】
この溶液に飽和度80%で硫酸アンモニウムを添加し、蛋白質を沈殿させ、遠心分離して沈殿を回収し、飽和度80%の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水を添加して溶解し、得られた溶液を限外濾過膜モジュール(例えば、旭化成社製のSLP0053等。)を用いて限外濾過し、のち水を添加し、同装置を用いてダイアフィルトレーションを行い、脱塩し、凍結乾燥し、粉末状ウシ・ラクトフェリンを得る。
【0019】
以上の方法により得られたラクトフェリンの純度を、電気泳動法により測定した結果、95%(重量。以下、特に断りのない限り同じ。)以上の純度を有している。尚、凍結乾燥前の各精製工程におけるラクトフェリン含有液を本発明に使用できることは、いうまでもない。
【0020】
ラクトフェリン類は、乳由来の天然物であって摂取した場合の安全性が高く、牛乳等の食品中に含有され、日常的に摂取されており、毒性を示さず、長期間連続的に摂取しても副作用がほとんど認められない。従って、経口等の投与方法により適宜使用することが可能であり、公知の方法により錠剤、カプセル剤、トロ−チ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤、軟膏等に加工することも可能である。また、ラクトフェリン類を有効成分として食品中に含有させ、IgE産生抑制剤の一態様として、IgE産生抑制の機能を有する食品として加工することも可能である。
【0021】
本発明のIgE産生抑制剤の有効成分であるラクトフェリン類の投与量は、年齢、症状等により異なるが、IgE産生抑制の効果を発揮させるためには、少なくとも30mg/kg体重/日の割合で投与することが必要である。
【0022】
本発明のIgE産生抑制剤において、IgE産生抑制の効果を発揮させるために必要な有効成分であるラクトフェリン類の配合量は、IgE産生抑制剤中の配合量として、1g当たり少なくとも1mg含有されていることが必要である。
【0023】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明する。
【0024】
試験例1
この試験は、血清中の総IgE量を指標として、ラクトフェリン類の有効投与量を調べるために行った。
【0025】
(1)試験試料
市販のラクトフェリン(森永乳業社製)を生理食塩水(大塚製薬社製)に300mg/mlの濃度で溶解した溶液を使用し、空試験には、生理食塩水(大塚製薬社製)を使用した。
【0026】
(2)試験方法
試験動物として、6週齢BALB/c系雄性マウス(日本チャールスリバー社から購入)50匹を、無作為に1試験群10匹に分けて使用した。
【0027】
抗原としてオボアルブミン(シグマ社製)2.5μgを使用し、これをアジュバントである水酸化アルミニウム(和光純薬社製)1mgに吸着させ、前記各試験動物の腹腔内に投与した。投与後3日間放置し、試料を、試料中の有効成分であるラクトフェリンの投与量が、試験群毎に、0mg/kg体重/日(空試験)、20mg/kg体重/日、30mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日、又は300mg/kg体重/日の量となるように、1日1回、経口ゾンデを使用して強制的に3日間連続して投与し、4日間放置し、再び試料を3日間連続して投与し、1日間放置し、のちマウスの心臓より採血し、血清サンプルを得た。
【0028】
各血清サンプル中の総IgE量を常法のELISA法により測定した。
【0029】
即ち、一次抗体である抗マウスIgEモノクローナル抗体R35−92(ファーミンジェン社製)溶液を96ウェルマイクロプレート(ヌンク社製)に添加して、一晩4℃で吸着させ、次いでウシ血清アルブミン(シグマ社製)を使用してブロッキング処理を行い、血清サンプルを添加して反応させ、二次抗体としてビオチン標識抗マウスIgEモノクローナル抗体R35−118(ファーミンジェン社製)溶液を添加して反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジンD(ベクター・ラボラトリー社製)を添加して反応させ、発色用緩衝液であるパーオキシダーゼ基質溶液(キルケガード・ペリー・ラボラトリー社製)を添加して発色させ、405nmの吸光度を測定し、図1に示す検量線に基づいてIgE量を求め、各試験群10匹の平均値を算出し、試験群毎の血清中の総IgE量を試験した。
【0030】
尚、図1の検量線は、血清サンプルの変わりに標準IgE(ファーミンジェン社製)を使用して前記と同一の方法により予め作成した。
【0031】
(3)試験結果
この試験の結果は、表1に示すとおりである。表1から明らかなとおり、ラクトフェリンは、少なくとも30mg/kg体重/日の割合で投与することにより顕著なIgE産生抑制の効果を示した。
【0032】
尚、ラクトフェリン類の種類を変更して試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0033】
【表1】
【0034】
試験例2
この試験は、ラクトフェリン類による食物由来の蛋白質抗原によって誘導されるIgE産生抑制の効果を調べるために行った。
【0035】
(1)試験試料
市販のラクトフェリン(森永乳業社製)を生理食塩水(大塚製薬社製)に300mg/mlの濃度に溶解したものを使用した。
【0036】
(2)試験方法
伊藤らの方法[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(European Journal of Immunology)、第27巻、第3427乃至3437ページ、1997年]により次のとおり試験した。
【0037】
試験動物として、6週齢DBA/2系雌性マウス(日本チャールスリバー社から購入)40匹を、無作為に1試験群10匹に分けて使用した。
【0038】
食物由来の蛋白質抗原であるカゼイン25%を含む特殊精製飼料(オリエンタル酵母工業社製)を、前記試験動物に給餌した。給餌開始4日目から、試料中の有効成分であるラクトフェリンを300mg/kg体重の投与量に調整し、1週間当たりの投与回数を試験群毎に、1週間に0回、1回、3回、又は5回(具体的には、週1回は、月曜日のみに投与し、週3回は、月曜日、火曜日、及び水曜日にそれぞれ投与し、週5回は、月曜日、火曜日、水曜日、木曜日、及び金曜日にそれぞれ投与した。)経口ゾンデを使用して強制的に計3週間投与し、4日間放置し、のちマウスの心臓より採血し、血清サンプルを得た。
【0039】
血清サンプル中のカゼイン特異的IgE量は、前記伊藤らの方法により次のとおり測定した。
【0040】
即ち、0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.2)に10μg/mlの濃度で溶解したウシカゼイン(ナカライテスク社製)溶液を96ウェルマイクロプレートに50μl添加し、一晩4℃で吸着させた。次いでウシ血清アルブミン(シグマ社製)を使用してブロッキング処理を行い、血清サンプルを添加して反応させ、パーオキシダーゼ標識抗マウスIgE(Fc)抗ヤギ抗体(ノルディック・イミュノロジー社製)を添加して反応させ、発色用緩衝液であるパーオキシダーゼ基質溶液(キルケガード・ペリー・ラボラトリー社製)を添加して発色させ、405nmの吸光度を測定し、前記図1に示す検量線に基づいてIgE量を求め、各試験群10匹の平均値を算出し、試験群毎の血清中のカゼイン特異的IgE量を試験した。
【0041】
(2)試験結果
この試験の結果は、表2に示すとおりである。表2から明らかなとおり、1週間当たりの投与回数に拘らず、ラクトフェリン類投与群において、食物由来の蛋白質抗原により誘導されるIgE産生を抑制する効果が認められ、特に週3回以上の投与によりその抑制が顕著に認められた。この試験結果から、ラクトフェリン投与により総IgE量のみならず、食物由来の蛋白質抗原により発生する特異的なIgEの産生をも抑制し得ることが判明した。
【0042】
尚、ラクトフェリン類の種類を変更して試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0043】
【表2】
【0044】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0045】
【実施例】
実施例1
次の組成からなる錠剤のIgE産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン(森永乳業社製) 40.0(%)
ラクチュロース(森永乳業社製) 40.0
エリスリトール(日研化学社製) 8.5
マルチトール(東和化成工業社製) 8.0
ステビア(日本製紙社製) 0.1
グリセリン脂肪酸エステル(理研ビタミン社製) 3.0
ヨーグルトフレーバー(長谷川香料社製) 0.4
【0046】
ラクトフェリン、ラクチュロース、エリスリトール、マルチトール、ステビア、グリセリン脂肪酸エステル、及びヨーグルトフレーバーを均一に混合し、常法により打錠機(畑鐵工所社製。型式HT12SS)を使用し、20,000Paの圧力で打錠し、錠剤を製造した。
【0047】
実施例2
常法により次の組成からなるシロップ剤のIgE産生抑制剤を製造した。
アポラクトフェリン(森永乳業社製) 1.00(%)
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム(第一工業製薬社製) 0.20
クエン酸ナトリウム(和光純薬社製) 0.18
クエン酸(和光純薬社製) 0.22
果糖・ブドウ糖液糖(大塚製薬社製) 19.83
精製水(大塚製薬社製) 78.57
【0048】
実施例3
次の組成からなる散剤のIgE産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン(森永乳業社製) 5.0(%)
トウモロコシ澱粉(王子コーンスターチ社製) 57.5
結晶セルロース(和光純薬社製) 37.5
【0049】
前記各材料を均一に混合し、常法により散剤を製造した。
【0050】
実施例4
次の組成からなるカプセル剤のIgE産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン(ミライ社製) 30.0(%)
乳糖(和光純薬社製) 30.0
トウモロコシ澱粉(日清製粉社製) 20.0
結晶セルロース(和光純薬社製) 20.0
【0051】
前記各材料を均一に混合し、常法により全自動カプセル充填機(Cesere Pedini 社製。プレス式)を使用し、カプセル(日本エランコ社製。1号ゼラチンカプセル)に充填し、カプセル剤を製造した。
【0052】
実施例5
次の組成からなる軟膏状のIgE産生抑制剤を次の方法により製造した。
ラクトフェリン(森永乳業社製) 2.0(%)
カロボキシビニルポリマー
(カーボポール940。グッドリッチ社製) 0.5
水酸化ナトリウム(和光純薬社製) 0.5
注射用蒸留水(和光純薬社製) 97.0
【0053】
予め2%の濃度で注射用蒸留水に溶解したカロボキシビニルポリマー水溶液25重量部に対して、予め2%の濃度で注射用蒸留水に溶解した水酸化ナトリウム水溶液25重量部を撹拌しながら徐々に添加し、ゲルを形成させ、これに注射用蒸留水に溶解したラクトフェリンを添加し、注射用蒸留水を添加し、全量を100重量部として軟膏剤を製造した。
【0054】
【発明の効果】
以上詳細に説明したとおり、本発明は、ラクトフェリン類を有効成分として含有するIgE産生抑制剤に係るものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
(1)IgEの産生を抑制することができる。
(2)食物由来の蛋白質抗原によって誘導される特異的なIgEの産生を抑制することができる。
(3)副作用が少ないので、長期間投与することができる。
(4)経口投与が可能であり、従来の注射剤等に比較して、簡便で汎用性が高い。
(5)牛乳等の比較的安価な原料から得られ、大量生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、405nmの吸光度におけるIgE濃度の検量線である。
Claims (1)
- 哺乳類の乳汁から分離したラクトフェリン、ラクトフェリン亜鉛、ラクトフェリン鉄、ラクトフェリン銅、及びラクトフェリンマンガンからなる群より選択された化合物、又はこれらの2種以上の混合物を有効成分として含有するIgE産生抑制剤。
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