JP4719850B2

JP4719850B2 - ビフィズス菌増殖促進性組成物

Info

Publication number: JP4719850B2
Application number: JP2004328793A
Authority: JP
Inventors: 俊彦村岡; 泉平山; 賢司石原; 浩美国武
Original assignee: Kumamoto Prefecture; Fisheries Research Agency
Current assignee: Kumamoto Prefecture; Fisheries Research Agency
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2024-11-12
Also published as: JP2006136240A

Description

本発明は新規なビフィズス菌増殖促進性組成物に関する。詳しくは、酸性条件下でも有効に機能できる新規なビフィズス菌増殖促進性組成物に関する。本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、紅藻類アマノリ属であるノリ（海苔）から採取できる。

ビフィズス菌増殖促進物質は、体内の腸内細菌叢を改善し、アレルギー、抗腫瘍性、免疫機能強化、便秘症の改善、血清コレステロール低下機能などの健康機能を発現することにより、多くの飲料や食品の原料に用いられている。また、腸内細菌がビフィズス菌増殖促進物質を資化することにより生成する短鎖脂肪酸は、病原菌の生育の抑制、カルシウムの吸収促進、腸の蠕動機能の向上などの機能性を示す。

従来から、ビフィズス菌増殖促進物質として多くのものが公表されている。例えば、酵母エキス、Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖類、カゼイン分解物、単糖類、オリゴ糖などの少糖類、シクロデキストリンやコンニャクマンナンなどの多糖類がビフィズス菌増殖促進物質として知られている。
特開平７−５１０５７号公報特開平５−１５３６６号公報特開平６−１２５７１号公報特開平７−２６７８６６号公報特開平８−１７３１５１号公報特開平８−１９６２６８号公報特開平１０−１４３７号公報特開２００１−４６０５５号公報特開２００２−１９３９０３号公報恒星社厚生閣発行「改訂水産化学」３９１〜３９２頁食品化学新聞社発行「FOOD Style２１」１９９７年７月号の２５〜２７頁

従来から、ビフィズス菌の増殖促進性組成物に関する発明は多数特許出願されている。その数例を挙げれると以下のとおりである。すなわち、特許文献１には、海洋性微細藻類の藻体からの抽出物よりなる乳酸菌及びビフィズス菌の増殖促進物質含有物について記載されている。しかし、特許文献１のビフィズス菌の増殖促進物質含有物は、海洋性微細藻類の藻体、特にクリプトコティニウム属の藻類から抽出したものであって、特許文献１には、紅藻類アマノリ属であるノリ由来の抽出物やその成分であるグリセロールガラクトシドのことは何ら記載されていない。また、特許文献２には、酒粕水抽出物及び／又はこれを有効成分とする乳酸菌及びビフィズス菌の増殖促進剤について、特許文献３には、コーヒーノキ属植物の葉からの抽出物を主成分とする乳酸菌及びビフィズス菌の増殖促進剤について、さらに、特許文献４には、Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／又はシアリルラクトースを有効成分とする乳酸菌及びビフィズス菌の増殖促進剤について、それぞれ記載されている。さらに、特許文献５には、天然ゴムの樹液からラテックスを分離した母液物（ＮＲＳ）又はその分解物もしくはこれらの混合物を有効成分とするビフィズス菌の増殖促進剤について、特許文献６及び特許文献７には、カカオ豆及び／又はその外皮の溶媒抽出残渣もしく水不溶性繊維を有効成分とする、ビフィズス菌を含む乳酸菌の増殖促進物質について、それぞれ記載されている。また、特許文献８には、ゲオトリウム・キャンディダムの培養物から得られるビフィドバクテリウム属菌の増殖促進用組成物について記載されている。さらに、特許文献９には、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトノキンを有効成分とするビフィズス菌増殖促進用組成物について記載されている。しかし、これらの特許文献には、紅藻類アマノリ属であるノリ由来の抽出物やその成分であるグリセロールガラクトシドがビフィズス菌の増殖促進に有用であることは何ら開示されていない。

また、非特許文献１には、グリセリンにガラクトースが結合したガラクトシドが海藻から分離され、フロリドシドと名付けられたこと、及び、フロリドシドは、ツノマタ、ダルス、トサカノリなどの紅藻に広く分布することが判明した旨が記載されているが、それがビフィズス菌の増殖促進に有用であることは何ら開示されていない。さらに、非特許文献２には、藻類の生理活性物質と機能性について解説されているが、紅藻類アマノリ属であるノリ由来の抽出物やその成分であるグリセロールガラクトシドのことは何ら記載されていない。

現在ビフィズス菌増殖促進物質として最も幅広く使用されているフラクトオリゴ糖は、酸により分解されやすいため、酸性の飲料や食品に使用した場合、保存中に分解されるおそれがあり、添加物として使用できる範囲が限られている。そのため、ビフィズス菌増殖促進性物質として、他の菌よりもビフィズス菌に対して強い増殖促進作用を有し、かつ、耐酸性の強いものが求められている。

上記の状況に鑑み、本発明は、新規にして耐酸性の強いビフィズス菌増殖促進剤を提供することを第１の課題とする。また、本発明は、紅藻類アマノリ属であるノリ（海苔）を原料として、新規にして耐酸性の強いビフィズス菌増殖促進剤を提供することを第２の課題とするものである。

上記の課題を解決するための本発明のうち、特許請求の範囲・請求項１に記載する発明は、グリセロールガラクトシドよりなるか又は採取若しくは合成されたグリセロールガラクトシドを有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤である。

同請求項２に記載する発明は、グリセロールガラクトシドが紅藻類アマノリ属であるノリから採取したものである請求項１に記載のビフィズス菌増殖促進剤である。

また、同請求項３に記載する発明は、タンパク質含量が３０％以下のノリから採取したものである請求項２に記載のビフィズス菌増殖促進剤である。

さらに、同請求項４に記載する発明は、ｐＨ４以下の酸性飲料又は酸性食品に添加して用いる請求項１から３のいずれかに記載のビフィズス菌増殖促進剤である。

本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、強力なビフィズス菌増殖促進機能を有すると共に、強い耐酸性を有する。そのため、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物を摂取すると、胃液では分解されず、ビフィズス菌が生息する大腸にそのまま到達するので、ビフィズス菌の増殖を大いに促進することができる。しかも、酸性飲料や酸性食品に添加して保存しても分解されず、効力を持続できる。このように、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、ビフィズス菌増殖促進能を酸性条件下において十分に発揮できる。また、無色無臭であり、弱い甘みを有するだけである。そのため、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、ビフィズス菌増殖促進剤として、各種の食品や飲料にビフィズス菌増殖促進用の添加物として用いることができる。具体的には、酸性の清涼飲料や果実飲料、酸性乳飲料、酸性食品などに好適に用いることができる。また、ヨーグルト類、菓子類やダイエット甘味料などに添加しても強力なビフィズス菌の増殖促進作用を示す。さらに、魚介類や家畜類の飼料や餌料に添加しても有用である。その他、製剤化して直接服用することも可能である。

また、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、紅藻類アマノリ属であるノリから好適に採取できるので、本発明によってノリの活用方法を大きく拡げることができる。特に、本発明によって、タンパク質含量が少ないため従来は廃棄されていた低品質のノリをビフィズス菌の増殖促進作用素材として活用する途が開かれたことの意義は大きい。

本発明者らは、ノリに含まれる糖質について、鋭意研究した結果、ノリに含まれるグリセロールガラクトシド（フロリドシド、イソフロリドシドの混合物）が強いビフィズス菌増殖促進能を有することを見いだし、しかも、タンパク質含量が低くて食用に適さないノリには、このグリセロールガラクトシドが、食用として供されるノリの１０倍程度含有されていることを発見し、本発明を完成するに至った。

グリセロールガラクトシドは、ガラクトースのα−１−水酸基とグリセリンの水酸基がグリコシド結合して形成される。このように、グリセリンにガラクトースが縮合結合した特異的構造を有するグリセロールガラクトシドは、紅藻類の中に、フロリドシド（２−Ｏ−グリセロール−α−Ｄ−ガラクトシド）、イソフロリドシド（１−Ｏ−グリセロール−α−Ｄ−ガラクトシド）として、わずかに含まれていることが報告されているが、そのビフィズス菌増殖促進作用についてはこれまで全く知られていなかった（非特許文献１）。

海藻の糖質に関しては、アルギン酸、フコイダン、寒天、カラギーナンなどの粘質多糖類が、ゲル化剤として、また、抗腫瘍性・血清コレステロール低下能などを有する機能性素材として、食品をはじめさまざまな産業分野で使用されている。ノリに含まれる糖質についても、その粘質多糖ポルフィランに関して、産業上の利用は進んでいないが、さまざまな生理機能性、物理化学的機能性が報告されている（非特許文献２）。

しかし、現在のところ、ノリからビフィズス菌の増殖促進作用を有する物質は見いだされていない。ノリに含まれる難消化性糖質としては、これまで上記ポルフィランの他にマンナン、キシランとされており、これらに関してのビフィズス菌増殖促進能が調べられている。その報告によれば、ポルフィランには増殖促進能が認められず、マンナン、キシランに関しては、１種類のビフィズス菌にのみ弱い発酵能が認められただけである。また、ポルフィランをポルフィラン分解酵素により分解したポルフィラン由来オリゴ糖にも、ビフィズス菌増殖促進能は認められていない。

ノリは日本において盛んに養殖されているが、近年、珪藻プランクトンの発生に伴う養殖海域の栄養塩の減少に伴って色落ちと呼ばれる低品質のノリが多量に発生しており、社会問題にもなっている。このような低品質のノリは、タンパク質含量、アミノ酸含量が低く、しかも、外観の黒みが乏しいため、食用に適さず、その多くが廃棄処分されている。これら低品質のノリの有効利用は、水産業にとって重要な課題である。

ノリは、生育環境によりそのタンパク質含量が乾燥重量当たり１２〜４５％と大きく変動する。本発明の新規なビフィズス菌増殖促進性組成物であるグリセロールガラクトシドは、ノリから抽出するのが最適であるが、グリセロールガラクトシドはタンパク質含量が低いノリに多く含まれているので、タンパク質含量の低いノリを原料とすることが好ましい。ノリのタンパク質含量とグリセロールガラクトシド含量とは、図４に示すように、負の相関関係があり、ノリのタンパク質含量が低いほどグリセロールガラクトシドの含量が多くなるため、本発明では、原料としてタンパク質含量が３０％以下（図４から推定するとグリセロールガラクトシド含量４．５％以上）、好ましくは２５％以下（同７．５％以上）のノリを使用するとよい。

以下、ノリ由来グリセロールガラクトシドの好ましい抽出方法を説明する。
ノリ由来グリセロールガラクトシドは、原料であるノリの乾燥物をエタノール又は水により加熱抽出し、その抽出物から中性糖を採取することにより得ることができる。エタノール抽出の場合は、７５v/v ％エタノールをノリの濃度が５〜２５w/v ％となるように加え、温度２０〜８５℃、３０分間〜５時間にて抽出する。抽出液を濾過し、抽出残渣については同様の抽出操作を繰り返す。次いで、全濾液を２０〜５０℃にて減圧濃縮する。さらに、濃縮液に含まれるクロロフィルなどの脂溶成分をジエチルエーテルにて抽出除去する。このグリセロールガラクトシドを含む濃縮液を陽イオン交換樹脂、次いで、陰イオン交換樹脂により分離・精製することで、グリセロールガラクトシドを得ることができる。精製後のグリセロールガラクトシドは、白色の結晶であり、強い吸湿性を示し、乾燥させても粉末状にはなりにくい。少量の水に溶解し、溶けるとシロップ状を呈する。

ビフィズス菌増殖促進性組成物として有用なグリセロールガラクトシドは、生ノリに限らず、ノリの乾燥物（板状のノリ、ノリの粉末など。いわゆる「海苔」として製品化されているものも含む。）からも採取できる。また、上記のノリ由来のものに限らず、グリセロールガラクトシドであれば、どのような原料から製したものでもよい。グリセロールガラクトシドは、ノリに限らず、紅藻類に広く分布することが知られている。具体的には、石灰藻、ヒカゲノイト、ツノマタ、トサカノリ、ダルスなどから少量ずつ採取できる。また、ビフィズス菌増殖促進性組成物として有用なグリセロールガラクトシドは、どのような方法で製したものでもよく、例えば、酵素反応或いは化学反応により合成されたものでも差し支えない。

グリセロールガラクトシドは、後記試験例に示すとおり、消化酵素によって分解されない。また、胃液と同じ条件であるｐＨ２、３７℃における１００分間の反応によって分解が認められないので、胃液でも分解されないものと推定される。このように、グリセロールガラクトシドは強い耐酸性を有する。また、グリセロールガラクトシドは、反転腸試験の結果、小腸において能動輸送されず、濃度勾配による受動輸送によって小腸へごくわずかに吸収されるのみである。これらのことから、グリセロールガラクトシドは、摂取量のほとんどが、消化酵素で分解されず、小腸でも吸収されずに回腸、大腸に到達するものと認められる。

このように、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物であるグリセロールガラクトシドは、強い耐酸性を有するので、ｐＨ４以下の酸性飲料又は酸性食品に添加しても保存中に分解するおそれがない。なお、市販の酸性飲料は、例えば、グレープフルーツジュースでｐＨ３．３程度、黒酢ドリンクでｐＨ３．２程度であるから、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、ほとんどの酸性飲料ないし酸性食品に添加しても、その効力を安定に持続できる。また、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、無色無臭であり、弱い甘みがあるだけなので、各種の食品や飲料に添加してもほとんど味に影響を与えない。そのため、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物の好ましい用法は、ビフィズス菌増殖促進剤として、酸性飲料をはじめとする各種飲料や食品に添加したり、製剤化して直接服用することである。また、魚介類や家畜類（養鶏を含む）の飼料や餌料に混じて供与することもできる。

すなわち、本発明のビフィズス菌増殖促進性組成物を適宜の担体（例えば、でんぷん、コーンスターチ、カルボキシルメチルセルロース、乳糖など）と組み合わせて製剤化し、ビフィズス菌増殖促進剤として、直接に服用するようにしてもよい。この場合、グリセロールガラクトシドを資化するビフィズス菌と一緒に製剤化してもよいし、ビフィズス菌の増殖に必要な他の素材と合わせて製剤化してもよい。剤型としては、散剤、液剤、錠剤など任意の形態を採ることができる。なお、投与量や投与方法は、患者の年齢・体重・症状や使用目的などに応じて適宜定めればよく、一定ではない。
以下、実施例と試験例によって本発明をさらに説明する。

＜ノリ由来グリセロールガラクトシドの抽出方法＞
（１）抽出・濃縮
タンパク質含量２５％のノリ乾燥粉末（熊本県のノリ養殖業者が生産した乾燥ノリを５００μｍ以下に粉砕した粉末）１５０ｇに、７５v/v ％エタノール１Ｌを加え、９０℃の水浴中で３０分間加熱した。抽出液は５Ｂ濾紙で吸引濾過した。残渣に対して同様の抽出を２回繰り返した。各濾液を約２５０ｍＬまで減圧濃縮し、ジエチルエーテル２５０ｍＬによる脂溶成分の抽出除去を２回行なった。各濃縮液を合わせ、６０℃にて減圧濃縮し、１００ｍＬに定容した。
（２）イオン成分除去
この濃縮液１００ｍＬのうち２０ｍＬを分取し、これを、強酸性陽イオン交換樹脂（三菱化学ダイヤイオン：ＨＰＫ２５）を充填したカラムと強塩基性陰イオン交換樹脂（三菱化学ダイヤイオン：ＨＰＫ７５）を充填したカラムを連結したものに負荷し（各カラム長３０ｃｍ、内径２ｃｍ）、蒸留水にて、流速１ｍＬ／分にて展開し、イオン成分を除去した。流出液は０〜４００ｍＬを分取した。このイオン交換カラムによるイオン成分除去操作を計３回、濃縮液合計６０ｍＬについて行なった。全流出液を合わせ、６０℃で約３０ｍＬに減圧濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥したところ、８．９ｇの乾燥物を得た。原料としたノリ乾燥物粉末からの収率は９．９％であった。
（３）ＨＰＬＣ分析
この乾燥物の０．１％水溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した結果、ＲＴ１６．５分に１本のピークが出現していることが判った。そこで、この０．１％水溶液に１Ｎ塩酸を加え、１２１℃で２０分間加熱後のサンプルについて、ＨＰＬＣ分析した。その結果、ＲＴ１９．３分にガラクトースのピークが、ＲＴ２０．６分付近にグリセリンのピークが出現していることが判明した。また、そのピーク比から、モル比１対１で結合していることが判った。なお、ＨＰＬＣ分析の際、カラムとしてCARBOSep CHO-411(TRANSGENOMIC 社製) を使用し、カラム温度７５℃、移動相として蒸留水を使用し、流速０．５ｍＬ／分、注入量１０μＬにて測定を行なった。
（５）判定
以上から、この乾燥物は、グリセロールガラクトシド（２−Ｏ−グリセロール−α−Ｄ−ガラクトシド、１−Ｏ−グリセロール−α−Ｄ−ガラクトシド）を主成分とするものであると判断された。グリセロールガラクトシドの純度は、この乾燥物の０．１％水溶液に１Ｎ塩酸を加え、また、１２１℃で２０分間加熱することで、加水分解によって生じるガラクトース量を測定することにより求めた。ガラクトース量測定の際は、酵素法によるガラクトース測定キット（ロッシュ製Ｆキット）を使用した。その結果、この乾燥物におけるグリセロールガラクトシドの純度は、９３．５％であった。

試験例１

＜腸内細菌の資化性試験＞
（１）試験方法
ヒト由来腸内細菌の代表株１７株（理化学研究所微生物系統保存施設保存菌株）を用いてグリセロールガラクトシドの資化性について試験を行なった。グリセロールガラクトシドは実施例１の方法によって作ったものを用いた。なお、比較のため、グルコースについても同様の試験を行なった。
まず、供試菌株を変法ＧＡＭブイヨンにて嫌気培養した。培養は、アネロパック（三菱ガス化学株式会社製）を用いた嫌気ジャー（同）により、３７℃で２４〜４８時間嫌気的に行なった。嫌気培養した菌液をＧＡＭ糖分解用半流動１／４培地へ接種し、３７℃で４日間嫌気培養した。この菌液０．３ｍＬを、濃度が０．５％となるようにグリセロールガラクトシド又はグルコースを添加したＧＡＭ糖分解用半流動１／４培地へ接種し、３７℃で７日間嫌気培養した後、培養液のｐＨを測定した。対照として、糖質を添加していないＧＡＭ糖分解用半流動１／４培地について同様の試験を行なった。
（２）判定基準
供試菌株による資化性（すなわち増殖促進能）の有無又は強弱は、以下の基準により判定した。すなわち、ｐＨの低下の尺度として、△ｐＨを次式により算出した。
この△ｐＨが正であり、その値が大きいほど、すなわちｐＨの低下が大きいほど、資化性が大きいと判断した。

（３）試験結果
試験の結果を表１に示す。
表１から、腸内有用細菌ビフィズス菌であるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)
属５株のうち、ビフィドバクテリム・ブレベ(Bifidobacterium breve) 、ビフィドバクテリム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリム・アドレスセンテス(Bifidobacterium adolescentis)の４株に対する資化性（すなわち増殖促進能）が、他の菌株と比較して非常に大きいことが判る。また、グリセロールガラクトシドとグルコースの△ｐＨを比較するために、△ｐＨ（グルコース）−△ｐＨ（グルセロールガラクトシド）の値を表１に示しているが、強い増殖促進能が認められた上記４株は、この値が、−０．０４〜０．３となっており、グリセロールガラクトシドがグルコースとほぼ同等に資化されることが判る。
（４）所見
以上の結果から、グリセロールガラクトシドは、腸内有用細菌ビフィズス菌であるビフィドバクテリウム属５株のうち、４株に対して、他の細菌と比較して特異的に強い増殖促進能力を有することが明らかとなった。

試験例２

＜ヒト唾液由来α−アミラーゼによる加水分解試験＞
（１）試験方法
ヒト唾液由来のα−アミラーゼ(SIGMA社製) を４０unit添加した緩衝液（０．９ｍＭのＣａＣｌ_２を含む４５ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ６．０）２ｍＬに、実施例１の方法によって作ったグリセロールガラクトシドを０．２ｇ添加し、３７℃で３０分間反応させた。加熱失活後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で加水分解により生成したガラクトース量を測定した。カラムはCARBOSep CHO-411(TRANSGENOMIC 社製) を使用し、カラム温度７５℃、移動相として蒸留水を使用し、流速０．５ｍＬ／分、注入量１０μＬにて測定を行なった。
（２）試験結果
測定の結果、加水分解によるガラクトースの生成は認められなかった（分解率は３％以下）。
（３）所見
この結果から、グリセロールガラクトシドは、ヒト唾液由来α−アミラーゼにより加水分解されにくいことが確認された。

試験例３

＜胃酸による加水分解試験＞
（１）試験方法
実施例１の方法によって作ったグリセロールガラクトシド０．１ｇを１６．７ｍＭのＨＣｌ−ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）１ｍＬに溶かし、３７℃で１００分間反応させた後、ＨＰＬＣで、加水分解により生成したガラクトース量を測定した。ＨＰＬＣの分析条件は試験例２と同じである。
（２）試験結果
測定の結果、加水分解によるガラクトースの生成は認められなかった（分解率は３％以下）。
（３）所見
この結果から、グリセロールガラクトシドは、胃酸により加水分解されにくいことが確認された。また、このことは、グリセロールガラクトシドが酸に対して強い抵抗性があることを示すものである。

試験例４

＜膵液α−アミラーゼによる加水分解試験＞
（１）試験方法
豚膵液由来のα−アミラーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之内製）を８０unit添加した緩衝液（０．９ＭのＣａＣｌ_２を含む４５ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ６．６）２ｍＬに、実施例１の方法によって作ったグリセロールガラクトシドを０．２ｇ添加し、３７℃で６時間反応させた。加熱失活後、ＨＰＬＣで、加水分解により生成したガラクトース量を測定した。ＨＰＬＣの分析条件は試験例２と同じである。
（２）試験結果
測定の結果、加水分解によるガラクトースの生成は認められなかった（分解率は３％以下）。
（３）所見
この結果から、グリセロールガラクトシドは、膵液α−アミラーゼにより加水分解されにくいことが確認された。

試験例５

＜小腸粘膜酵素による加水分解試験＞
（１）試験方法
ラット小腸アセトン粉末(SIGMA社製) を２０unit（１unitは、５％マルトースから、１分間に１μモルのグルコースを生成するラット小腸アセトン粉末量）添加した緩衝液（４５ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ６．６）２ｍＬに、グリセロールガラクトシド（実施例１の方法で作ったもの）を０．２ｇ添加し、３７℃で３時間反応させた。加熱失活後、ＨＰＬＣで、加水分解により生成したガラクトース量を測定した。ＨＰＬＣの分析条件は試験例２と同じである。
（２）試験結果
測定の結果、加水分解によるガラクトースの生成は認められなかった（分解率は３％以下）。
（３）所見
この結果から、グリセロールガラクトシドは、小腸粘膜酵素により加水分解しにくいことが確認された。

試験例２〜同５では、ＨＰＬＣ測定でのガラクトース検出限界は０．００２％であるため、分解率を「３％以下」と算出したが、その計算は次式によるものである。
すなわち、各試験例では、分解液を１００倍に希釈し、使用したサンプルの濃度は１０％w/v であるから、
グリセロールガラクトシドが分解した場合の検出限界
＝ＨＰＬＣのガラクトース検出限界０．００２％
×グリセロールガラクトシドとガラクトースのモル比１．４１１＝０．００２８％
グリセロールガラクトシドの分解率
＝０．００２８％×１００／０．１＝２．８２２％
すなわち、グリセロールガラクトシドが３％以上分解しないと、ガラクトースの生成は検出できないことになる。

試験例６

＜反転腸を用いた小腸吸収試験＞
（１）試験方法
試験前夜から絶食させたwister系オスラット５週齢を屠殺後、小腸を取り出した。その空腸部分を約１０ｃｍ切り取り、先端を丸くしたガラス棒を差し込み、先端を木綿糸で縛り、腸管をガラス棒にそって裏返し、腸管の端を木綿糸できつく縛った。この結び目から約５ｃｍのところをカミソリで切断し、緩衝液（炭酸水素ナトリウム２．１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物０．３７３ｇ／Ｌを添加したクレブス・ヘンセライト(Krebs Henseleit) 緩衝溶液 (SIGMA 社製) 、ｐＨ７．４) １ｍＬを注射器で腸管内へ注入した。なお、このクレブス・ヘンセライト緩衝溶液は、グルコースを０．２w/v ％含んでいる。この注射筒を抜くと同時に木綿糸でかたく縛った。
グリセロールガラクトシド（実施例１の方法で作ったもの）を０．３w/v ％含む緩衝液を６ｍＬ入れた試験管の中に、作成した反転腸を浸し、３７℃の恒温槽で１時間インキュベートした。インキュベート中は５％ＣＯ_２／９５％Ｏ_２ガスでバブリングした。インキュベート終了後、反転腸内と試験管浴液中のグリセロールガラクトシドの濃度を測定した。また、比較のため、小腸で吸収される糖質であるグルコースに関してもその濃度を測定した。グリセロールガラクトシド量は、サンプル溶液０．２ｍＬに対して２Ｎ塩酸を１０μＬ添加し、１２１℃で２０分間加熱後、２Ｎ水酸化ナトリウム１０μＬを添加して中和してガラクトース測定キット（ロッシュ製Ｆキット）により、ガラクトース量を測定した。得られたガラクトース量に１．４１１及び１．１（希釈倍率）を掛けたものがグリセロールガラクトシド量となる。グルコース量は、グルコースＣIIテストワコーを用いて測定した。

（２）試験結果
測定結果は表２に示すとおりである。表２から、グルコースは、インキュベート前が試験管溶液、反転腸内部溶液共に０．２w/v ％であったものが、インキュベート後は小腸細胞による能動輸送により試験管溶液中のグルコースが反転腸内部に急速に輸送されることで、その濃度が５０％以下となり、反転腸内部の濃度は２倍近い値まで上昇していた。これに対してグリセロールガラクトシドは、インキュベート前が試験管溶液０．３w/v ％、反転腸内部溶液で０w/v ％であったものが、インキュベート後は試験管溶液中は０．３w/v ％と濃度変化しておらず、反転腸内部溶液の濃度はわずか０．０３w/v ％であった。これは、試験管溶液に含まれるグリセロールガラクトシド量の１／６０にすぎない。このことから、グリセロールガラクトシドは、グルコースのように能動輸送されず、単に濃度勾配による拡散により、細胞間の隙間を通り、小腸内部にごくわずか輸送されることが確認された。
（３）所見
以上の結果から、グリセロールガラクトシドは、小腸ではほとんど吸収されないことが確認された。

試験例７

＜ノリ乾燥物のビフィズス菌増殖促進能確認試験その１＞
（１）試験方法
ビフィズドバクテリア属５株に対するノリ乾燥物の増殖促進能について試験した。
まず、熊本県のノリ養殖業者が生産した乾燥ノリを５００μｍ以下に粉砕して、タンパク質含量２５％と４１％の２種類のノリ乾燥物粉末を作った。供試菌株を変法ＧＡＭブイヨンにて嫌気培養した。培養は、アネロパック（三菱ガス化学株式会社製）を用いた嫌気ジャー（同）により、３７℃で２４時間嫌気的に行なった。嫌気培養した菌液をＧＡＭ糖分解用半流動１／２培地へ接種し、３７℃で４日間嫌気培養した。次いで、ＧＡＭ糖分解用半流動１／２培地３０ｍＬに、ノリ乾燥物粉末を５w/v ％となるように添加し、１１５℃で１５分間滅菌後、この培養液に、嫌気培養した菌液０．７５ｍＬを接種した。３７℃で４日間嫌気培養した後、培養液のｐＨを測定した。対照として、ノリ乾燥物粉末を添加していないＧＡＭ糖分解用半流動１／２培地について同様の試験を行なった。
（２）判定基準
供試菌株により資化性（すなわち増殖促進機能）の有無又は強弱は、試験例１で用いた基準にしたがった。ただし、ノリの添加によって、培養前のｐＨが若干異なることから、以下の式を用いることとした。

（３）試験結果
試験の結果を表３に示す。表３から、タンパク質含量２５％のノリ乾燥物粉末は、腸内有用細菌ビフィズス菌であるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属５株のうち、ビフィドバクテリム・ブレベ(Bifidobacterium breve) 、ビフィドバクテリム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリム・アドレスセンテス(Bifidobacterium adolescentis)の４株に対する資化性（すなわち増殖促進能）が非常に大きいことが判明した。これに対して、タンパク質含量４１％のノリ乾燥物粉末に対する資化性は認められなかった。
（４）所見
以上の結果から、ノリ乾燥物のうち、タンパク質含量の低いものは、腸内有用細菌ビフィズス菌に対して強い増殖促進能を有しており、ビフィズス菌増殖促進素材として使用できることが明らかとなった。

試験例８

＜ノリ乾燥物のビフィズス菌増殖促進能確認試験その２＞
（１）試験方法
上記ビフィズス菌増殖促進能がノリ乾燥物中に含まれるどの物質に由来するのかを確認するために、以下の試験をした。
タンパク質含量２５％のノリ乾燥物粉末（５００μｍ以下）５０ｇを７％ホルマリン溶液７５０ｍＬに加え、液温２５℃で２４時間浸漬した。これに蒸留水２５０ｍＬを追加して沸騰水浴中で２４時間熱水抽出した。この抽出液を９０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離を行い、上澄みを珪藻土にて吸引濾過し、濾液をｐＨ７〜８に調整後、６５℃にて約２５０ｍＬまで減圧濃縮した。この濃縮液のうち、５ｍＬについて０．８Ｍ塩化ナトリウム溶液を移動相として、ゲル濾過クロマトグラフィー（東ソー：ＨＷ−４０Ｆ）に通し、溶出液を２０ｍＬごとに分画した。
次に、各分画についてビフィズス菌発酵能を調べた。すなわち、各分画を減圧濃縮後、Sephadex G-10(Amersham Biosciences社製) カラムにて脱塩し（カラム長３０ｃｍ、カラム内径２ｃｍ）、３ｍＬに減圧濃縮した。これに、ＧＡＭ糖分解用半流動培地３ｍＬを加え、１１５℃で１５分間滅菌した後、ＧＡＭ糖分解用半流動１／２培地にて４日間前培養したビフィドバクテリウム・アドレスセンテス培養液０．２ｍＬを接種し、３７℃で４日間の嫌気培養を行なった。対照として、３％の食塩水３ｍＬについて同様の操作をした。（２）判定基準
ビフィドバクテリウム・アドレスセンテスの増殖の程度は、培養後の対照のｐＨから各サンプルのｐＨを差し引き、その差である△ｐＨが大きいほど、より増殖していると判断した。
（３）試験結果
試験の結果を図１に示す。図１から、２８０〜３６０ｍＬ付近にかけて△ｐＨのピークが見られ、ビフィドバクテリウム・アドレスセンテス増殖促進作用のある物質が溶出していることが判った。このピークが、グリセロールガラクトシドによるものであるか否か、以下の試験例によって確認した。

試験例９

＜ノリ乾燥物のビフィズス菌増殖促進能確認試験その３＞
（１）試験方法
試験例８のとおり、ゲル濾過クロマトグラフィーにおける各分画を減圧濃縮後、Sephadex G-10(Amersham Biosciences社製) カラムにて脱塩し（カラム長３０ｃｍ、カラム内径２ｃｍ）、３ｍＬに減圧濃縮後、１１５℃で１５分間滅菌した。次に、０．２μｍフィルターにて濾過滅菌した２％酵素液を１ｍＬ添加した。酵素液は、セルラーゼオノズカ１２Ｓ（ヤクルト薬品工業製）０．６ｇを酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）３０ｍＬに溶かして調整した。なお、グリセロールガラクトシドは、セルラーゼオノズカ１２Ｓを、長期間作用させた場合、加水分解され、ガラクトースが生成されることが本発明者らによって既に確認されている。
酵素液添加後、４５℃にて７日間インキュベートし、各分画のガラクトース濃度をガラクトース測定キット（ロッシュ製Ｆキット）により測定した。また、参考までに、各分画の全糖量をフェノール硫酸法にて測定した。
（２）試験結果
試験の結果を図１に示す。図１には、各分画の全糖量をフェノール硫酸法にて測定した結果を併せて示した。図１から、酵素による加水分解によって生成するガラクトース濃度は、２８０〜３６０ｍＬ付近において明瞭なピークを示した。この生成ガラクトースノピーク位置と△ｐＨのピーク位置は一致していることから、ノリの熱水抽出物において、ビフィドバクテリウム・アドレスセンテスの増殖促進作用を示した糖質は、グリセロールガラクトシドであることが判明した。
（３）所見
上記の結果から、試験例７において、タンパク質含量２５％のノリ乾燥物が示した強いビフィズス菌増殖促進機能は、グリセロールガラクトシドによるものであることが確認できた。

試験例１０

＜ノリのタンパク質含量とグリセロールガラクトシド含量の関係確認試験＞
（１）試験方法
タンパク質含量の異なるノリ乾燥物１０種類について以下の試験を行い、それぞれのグリセロールガラクトシド含量を測定した。すなわち、ノリ乾燥物５ｇに、７５v/v ％エタノール１００ｍＬを加え、９０℃の水浴中で３０分間加熱した。抽出液は５Ｂ濾紙で吸引濾過した。残渣に対して７５v/v ％エタノール５０ｍＬにより、同様の抽出を２回繰り返した。各濾液を約５０ｍＬまで減圧濃縮し、ジエチルエーテル１００ｍＬによる脂溶成分の抽出除去を２回行なった。各濃縮液を合わせ、６０℃にて減圧濃縮し、５０ｍＬに定容した。これを０．４μｍフィルターで濾過した試料をＨＰＬＣにより分析し、ＲＴ１６．５付近のピーク面積を測定した。グリセロールガラクトシド０．１w/v ％溶液を標準として、各試料中のグリセロールガラクトシド量を求めた。
（２）試験結果
試験の結果を図２に示す。図２から、ノリのタンパク質含量とグリセロールガラクトシド含量の間に負の相関が認められた。すなわち、タンパク質含量が低いほど、グリセロールガラクトシド含量は急増する。特に、タンパク質含量が２０％以下の場合、グリセロールガラクトシド含量は１０％を超え、タンパク質含量が１７％の場合、グリセロールガラクトシド含量は１５％にまで達することが判明した。
（３）所見
上記の結果から、ノリのうち、タンパク質含量が低いものはグリセロールガラクトシドを豊富に含むため、強いビフィズス菌増殖促進能を有することが明らかとなった。すなわち、タンパク質含量が低いノリはビフィズス菌増殖促進物質の良好な原料となり得ることが確認された。具体的には、タンパク質含量が３０％以下、好ましくは２０％以下のノリはビフィズス菌増殖促進物質の良好な原料となり得ることが理解できた。

以下、本発明の実施例として、グリセロールガラクトシドを添加した酸性飲料や酸性食品の製造例を示す。これらの酸性飲料や酸性食品中でグリセロールガラクトシドは分解されることがなく、その効力を維持した状態で保存し得ることが確認されている。

＜グレープフルーツジュースの製造方法＞
グレープフルーツジュース（ｐＨ３．３１）１００ｍＬにグリセロールガラクトシドシロップ（７０％ w/v）（実施例１でノリ乾燥粉末から抽出して得たグリセロールガラクトシドの乾燥物７０ｇを清水に溶解して１００ｍＬに調整したもの）６ｍＬを溶解し、８０℃で２０分間殺菌した。
得られたグレープフルーツジュースは、グレープフルーツ本来の味を損なうことなく、風味もよく、美味である。また、ビフィズス菌増殖促進作用を有する美容飲料、健康飲料としても好適である。さらに、１０℃以下で７日間保存してもグリセロールガラクトシドは分解されず、酸性飲料中で効力を維持したまま保存可能であることが確認された。

＜グレープフルーツゼリーの製造方法＞
グレープフルーツジュース（ｐＨ３．３１）２５０ｇ、グラニュー糖３０ｇ、レモン汁１０ｍＬ、グリセロールガラクトシドシロップ（７０％ w/v）（実施例２で用いたもの）５ｍＬに熱湯３０ｍＬで溶かしたゼラチン５ｇを加えた後、８０℃で２０分間殺菌し、その後冷却した。
得られたグレープフルーツゼリーは、グレープフルーツ本来の味を損なうことなく、風味も良好である。また、ビフィズス菌増殖促進作用を有する美容食品、健康食品としても有用である。

＜コーヒーゼリーの製造方法＞
インスタントコーヒー（ｐＨ４．３７）２ｇ、清水２５０ｍＬ、グラニュー糖３０ｇ、グリセロールガラクトシドシロップ（７０％ w/v）（実施例２で用いたもの）５ｍＬに熱湯３０ｍＬで溶かしたゼラチン５ｇを加えた後、８０℃で２０分間殺菌し、その後冷却した。
得られたコーヒーゼリーは、コーヒー本来の味を損なうことなく、風味も良好である。また、ビフィズス菌増殖促進作用を有する美容食品、健康食品としても有用である。

＜ヨーグルトゼリーの製造方法＞
プレーンヨーグルト（ｐＨ４．０７）２５０ｇに牛乳２５ｍＬ、グラニュー糖３０ｇ、レモン汁１０ｍＬを加えて攪拌し、ｐＨ２．８２のヨーグルト混合物を作った。この混合物にグリセロールガラクトシドシロップ（７０％ w/v）（実施例２で用いたもの）５ｍＬとバニラエッセンス少々、及び熱湯３０ｍＬで溶かしたゼラチン５ｇを加えた後、８０℃で２０分間殺菌し、その後冷却した。
得られたヨーグルトゼリーは、ヨーグルト本来の味を損なうことなく、風味も良好である。また、ビフィズス菌増殖促進作用を有する美容食品、健康食品としても有用である。さらに１０℃で７日間保存してもグリセロールガラクトシドは分解されず、ヨーグルトゼリー中で効力を維持したまま保存可能であることが確認された。

産業上の利用性

以上、詳細に説明したとおり、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、強力なビフィズス菌増殖促進能を有し、特に、酸性下で分解されず、ビフィズス菌増殖促進能を酸性条件において十分に発揮できる。そのため、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、各種の酸性食品や酸性飲料にビフィズス菌増殖促進剤として添加して用いることができる。具体的には、酸性の清涼飲料や果実飲料、酸性乳飲料などに好適に用いることができる。また、ヨーグルト類、菓子類、ダイエット甘味料などに添加しても強力なビフィズス菌の増殖促進作用を示す。さらに、魚介類や家畜類の飼料や餌料に添加しても有用である。その他、適当な担体と組み合わせてビフィズス菌増殖促進剤として製剤化し、服用ないし供与してもよい。

また、本発明に係るビフィズス菌増殖促進性組成物は、紅藻類アマノリ属であるノリから好適に採取できるので、本発明によってノリの活用の途を大きく拡げることができる。特に、本発明により、タンパク質含量が少ないため従来は廃棄されていた低品質のノリをビフィズス菌の増殖促進作用素材として活用する途が開かれたことの意義は大きい。

ノリのビフィズス菌増殖促進能がグリセロールガラクトシドによるものであることを示すグラフ（試験例８、９に対応）ノリ中のタンパク質含量とグリセロールガラクトシド含量の関係を示すグラフ（試験例１０に対応）

Claims

グリセロールガラクトシドよりなるか又は採取若しくは合成されたグリセロールガラクトシドを有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤。
グリセロールガラクトシドが紅藻類アマノリ属であるノリから採取したものである請求項１に記載のビフィズス菌増殖促進剤。
タンパク質含量が３０％以下のノリから採取したものである請求項２に記載のビフィズス菌増殖促進剤。
ｐＨ４以下の酸性飲料又は酸性食品に添加して用いる請求項１から３のいずれかに記載のビフィズス菌増殖促進剤。