JP4717375B2 - 蛍光顕微鏡および観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、医学、生物学などの研究分野において生物組織からの蛍光を観察する蛍光顕微鏡および観察方法に関するものである。

従来、蛍光観察装置として、医学および生物学などの分野において生物組織細胞上で蛍光標識を施した蛋白や遺伝子などを観察するものとして蛍光顕微鏡が知られている。

このような蛍光顕微鏡は、蛍光標識を施された生物細胞に対し、ある特定幅の波長のみ含む照明光（励起光）を照射すると、生物細胞は励起光よりも長い波長の光（蛍光）を発することから、この蛍光を観察するようになっている。

ところで、蛍光顕微鏡は、照明装置として水銀ランプやキセノンランプといった比較的連続的な波長を持つ光源が使用されており、このような光源から発生する光を励起フィルタに入射して特定の波長光を選択し、この選択された光を、励起光波長域では反射特性を有し、蛍光波長域では透過特性を有するダイクロイックミラーで反射させ、励起光として標本に照射し、標本より発せられる蛍光をダイクロイックミラーを透過し、吸収フィルタにより蛍光波長域のみ透過させることにより蛍光観察を行なうようにしており、これら励起フィルタ、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルタを組み合わせることにより任意の励起光と蛍光の観察条件を設定可能としている。

この場合、これら励起フィルタ、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルタの光学素子は、それぞれ各種特性のものを複数用意し、各光学素子毎にターレット上に配置して、光路上で切り換え可能にしたり、あるいは励起フィルタとダイクロイックミラー、ダイクロイックミラーと吸収フィルタ、あるいは励起フィルタと吸収フィルタとダイクロイックミラーをそれぞれ組み合わせてユニット化したものを複数用意し、これらユニットを光路上で切り換え可能にするようにしている。

ところが、励起フィルタ、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルタによる励起光と蛍光の組み合わせは、観察者が任意に設定可能であるために、これら光学素子の組み合わせの選択肢は膨大な数となり、それぞれの光学素子の特性を熟知していなければ、最適な蛍光観察ができないという問題を生じる。

そこで、従来、特許文献１に開示されるように、光源の近くにシャッタ等の遮光手段を配置し、励起フィルタ、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルタのそれぞれの光学素子の波長特性を比較し、例えば励起光が観察光路側に抜けるような組み合わせの場合は、不適当として、シャッタを閉じ、光源からの光を遮光するようにしたものが提案されている。
特開２００３−２０２５０３号公報

ところで、最近になって蛍光観察により取得される蛍光を撮像するものとして、高精度な冷却ＣＣＤカメラが用いられるようになっており、このようなＣＣＤカメラの登場により、従来不可能であったアプリケーションも実現可能となり、蛍光観察の核となる励起フィルタ、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルタの各光学素子にも、多種多様なものが用いられるようになっている。具体例として、マルチバンドパスフィルタに代表されるような一つのフィルタに透過波長領域が複数存在するようなものが用いられることがある。

このような特異な波長特性を有する光学素子を用いるような場合、上述した特許文献１に開示されるもののように、各光学素子について単純に波長特性の比較を行なうのでは、光学素子の組み合わせの適／不適の判定が難しく、観察したい組み合わせであっても不適と判断され、光源が遮光されることがある。また、特許文献１では、すべての光学素子について予め波長特性の組み合わせの適／不適の設定が必要であるため、これら光学素子に関する波長特性などの入力が非常に煩雑になるばかりか、入力ミスを生じるおそれもある。

さらには、上述したＣＣＤカメラを用い肉眼観察を行なわないようなアプリケーションを実現するための光学素子の組み合わせの場合でも、光学素子の組み合わせによっては光源からの光をシャッタにより遮光することがあるため、ＣＣＤカメラを用いた撮像観察ができなくなるという問題もあった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、肉眼観察と撮像観察に最適な光学素子の組み合わせを確実に設定することができる蛍光顕微鏡および観察方法を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、試料からの蛍光を接眼レンズを有する観察光学系を介して観察する蛍光顕微鏡において、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの光学素子のうち少なくとも前記ダイクロイックミラーを有する組み合わせにより構成された光学部材を複数個有し、前記複数の光学部材のうち１つを選択的に光路に挿入可能とした光学部材切換え手段と、前記観察光学系の直前に配置され、前記光学部材切換え手段の前記光学部材を介して前記観察光学系に導入される前記試料からの前記蛍光を遮光可能とする遮光手段と、前記光学部材切換え手段に設けられ、前記光学部材切換え手段により前記光路に挿入される前記光学部材が前記観察光学系を介しての肉眼観察の可能性があるか否かの情報を検出する情報検出手段と、前記情報検出手段の検出出力に応じて前記遮光手段による遮光を制御する制御手段とを具備し、前記制御手段は、計時機能を有するタイマを有し、該タイマにより前記情報検出手段より検出される前記肉眼観察の可能性がある前記光学部材が前記光路に挿入されている継続時間を計測し、該計測時間が所定時間経過すると前記遮光手段により前記光路を開放することを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記情報検出手段は、前記光学部材にかかる前記情報として、前記観察光学系での観察に用いられる前記光学素子の組み合わせにより構成される前記光学部材を検出可能としたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記情報検出手段は、前記観察光学系での観察に用いられる前記光学素子の組み合わせにより構成される前記光学部材に対応させて設けられる磁気発生手段と、該磁気発生手段から発生する磁気を検出する磁気検出手段とを有することを特徴としている。

請求項４記載の発明は、試料からの蛍光を接眼レンズを有する観察光学系を介して観察する蛍光顕微鏡の観察方法であって、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの光学素子のうち少なくとも前記ダイクロイックミラーを有する組み合わせにより構成された光学部材を複数個有する光学部材切換え手段により前記複数の光学部材のうち１つを選択的に光路に挿入可能とし、前記光学部材切換え手段の前記光学部材を介して前記観察光学系に導入される前記試料からの前記蛍光を遮光手段により前記光路を遮断し、前記光学部材切換え手段により前記光路に挿入される前記光学部材が前記観察光学系を介しての肉眼観察の可能性があるか否かの情報を情報検出手段により検出し、計時機能を有するタイマにより前記情報検出手段から検出される前記肉眼観察の可能性がある前記光学部材が前記光路に挿入されている継続時間を計測し、該計測時間が所定時間を経過すると前記遮光手段により前記光路を開放することを特徴としている。

本発明は、肉眼観察、撮像観察に最適な光学素子の組み合わせを確実に設定することができる蛍光顕微鏡および観察方法を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は本発明の第１の実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成を示すものである。

図において、１は光源で、この光源１は、水銀ランプ及びキセノンランプ等からなっている。光源１から発せられる光の光路１ａ上には、光源１からの光を集光するコレクタレンズ２、視野絞り３、開口絞り４、レンズ５を介して蛍光キューブターレット２０が配置されている。

蛍光キューブターレット２０は、図２（ａ）（ｂ）に示すように回転軸２０２により回転可能に支持された円板部材２０１の周縁部に沿って光学部材として複数（図示例では６個）のキューブカセット２１〜２６が着脱可能に配置されている。これらのキューブカセット２１〜２６は、光学素子として励起フィルダ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタのうち少なくともダイクロイックミラーを含む組み合わせにより構成されている。この場合、これらのキューブカセット２１〜２６は、必ずしも励起フィルダ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの３つの光学素子が設けられる必要はなく、例えば、励起フィルタとダイクロイックミラー、ダイクロイックミラーと吸収フィルタというように、２つの光学素子を選択的に組み合わせて構成したもの、もしくはダイクロイックミラーのみで構成したものなどが用いられる。

ここでは、キューブカセット２１〜２６のうち、キューブカセット２１〜２３および２６は、観察光学系１０での観察に用いられる光学素子の組み合わせ、つまり、肉眼観察に用いられる可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成され、その他のキューブカセット２４，２５は、肉眼以外のＣＣＤカメラなどによる撮像観察に用いられる可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されている。ここでは、具体例として、肉眼観察に用いられるキューブカセット２１は、励起光における不要な波長成分を除去するための励起フィルタ２１１、特定波長領域の光を反射し、それ以外の波長領域の光を透過する性質を有するダイクロイックミラー２１２および蛍光に含まれる不要な波長成分を除去するための吸収フィルタ２１３により構成され、また、撮像観察に用いられるキューブカセット２４は、マルチカラー観察用のマルチバンドフィルタ２４１により構成されている（図１参照）。なお、キューブカセット２５は、ダイクロイックミラーの代わりとして不図示の全反射ミラーにより構成されている。

蛍光キューブターレット２０には、情報検出手段として磁気検出手段としてのホール素子等からなる状態検出装置２７とキューブカセット２１〜２３および２６に対応して配置される磁気発生手段としての磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａが設けられている。磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａは、円板部材２０１周縁部に着脱可能に配置されるもので、状態検出装置２７が、これら磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａを検出することで、光路１ａ中に挿入されているキューブカセット２１〜２３および２６にかかる情報（肉眼観察に用いられる可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されたもの）の検出を可能にしている。ここでは、状態検出装置２７が磁石２１Ａを検出すると、キューブカセット２１が光路中に挿入されているのを検出し、同様に、磁石２２Ａを検出するとキューブカセット２２が、磁石２３Ａを検出するとキューブカセット２３が、磁石２６Ａを検出するとキューブカセット２６がそれぞれ光路中に挿入されているのを検出するようになっている。図示例では、状態検出装置２７が磁石２１Ａを検出していて、キューブカセット２１が光路１ａに挿入されている状態を示している。

蛍光キューブターレット２０は、円板部材２０１周縁部に近接してクリック機構２８が配置されている。このクリック機構２８は、円板部材２０１の回転により各キューブカセット２１〜２６が光路中に挿入された状態で、位置ずれを生じないように機械的にクリック位置決めを行なうためのものである。この場合、状態検出装置２７は、キューブカセット２１〜２３および２６に対応する磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａを検出した状態で直ちに検出信号を出力することなく、クリック機構２８により光路中に正確に位置決めがされたことを確認した後に、検出信号を出力するようにしている。つまり、円板部材２０１がクリック機構２８のクリック位置から外れ、キューブカセットが光路上からわずかにずれた位置にある場合は、キューブカセットが光路に挿入されていない状態を表わす信号を出力し続けるようになっている。

図１に戻って、蛍光キューブターレット２０に入射された光は、光路中のキューブカセット２１のダイクロイックミラー２１２にて下方に反射される。ダイクロイックミラー２１２の下方の反射光路には、対物レンズ６を介して、試料ステージ７に載置された観察試料８が配置されている。これにより、ダイクロイックミラー２１２で反射した光は、対物レンズ６を介して観察試料８を照明する。

この場合、観察試料８は、予め蛍光色素によって染色されており、励起光波長よりも長波長領域にシフトした蛍光を発する。観察試料８から発せられた蛍光は、対物レンズ６を介してダイクロイックミラー２１２へ入射する。ダイクロイックミラー２１２は、励起光波長よりも長波長領域にある波長を有する蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー２１２の透過光路には、吸収フィルタ２１３と光路切換え手段としての光路切り換え装置９が配置されている。

吸収フィルタ２１３は、ダイクロイックミラー２１２を透過した蛍光のうち、不要な波長領域の光を除去して蛍光像の波長のみを透過するものである。光路切換え装置９は、ビームスプリッタ９ａを有し、このビームスプリッタ９ａにより吸収フィルタ２１３を透過した光を結像レンズと接眼レンズとを有する観察光学系１０およびＣＣＤカメラ１１ａを有する撮像光学系１１の少なくとも一方に導くようにしている。

光路切換え装置９には、状態検出装置９ｂが設けられている。この状態検出装置９ｂは、光路切換え装置９が蛍光キューブターレット２０から導入された光を撮像光学系１１に導いている状態、観察光学系１０に導いている状態、あるいは撮像光学系１１と観察光学系１０の両方に導いている状態をそれぞれ検出するようにしている。

光路切り換え部９と観察光学系１０との間の光路、つまり観察光学系１０の直前には、遮光手段として遮光装置１２が配置されている。この遮光装置１２は、シャッタ１２ａと状態検出装置１２ｂを有している。シャッタ１２ａは、開閉動作により光路切り換え部９から観察光学系１０に入射する光を遮光する状態と非遮光とする状態を取り得るようになっている。また、状態検出装置１２ｂは、シャッタ１２ａが光路を遮断して遮光状態（閉じ）にあるか、開放して非遮光状態にあるかを検出するようにしている。

撮像光学系１１の光路には、吸収フィルタユニット１３が配置されている。吸収フィルタユニット１３は、上述した蛍光キューブターレット２０のキューブカセット２４が光路中に位置されたときのみ吸収フィルタとしての機能が有効となり、その他のキューブカセット２１〜２３、２５、２６が光路中に位置する場合は、空穴となるように構成されている。

蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７、光路切換え装置９の状態検出装置９ｂ、シャッタ１２ａの状態検出装置１２ｂには、制御手段として顕微鏡コントローラ３０が接続されている。この顕微鏡コントローラ３０は、図３に示すように制御装置３１、操作手段３２および駆動装置３３が設けられている。制御装置３１は、蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７、光路切換え装置９の状態検出装置９ｂおよびシャッタ１２ａの状態検出装置１２ｂからの状態検出信号が与えられている。操作手段３２は、観察者からの操作指示を制御装置３１に入力可能にしたものである。駆動装置３３は、制御装置３１の指示によりシャッタ１２ａを上述した遮光または非遮光のいずれかの状態に駆動するためのものである。

次に、このように構成された蛍光顕微鏡の動作を図４に示すフローチャートに従い説明する。

いま、顕微鏡コントローラ３０の電源を投入すると（ステップ４０１）、制御装置３１は、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光状態にするように制御する（ステップ４０２）。

この状態で、制御装置３１は、状態検出装置１２ｂからの検出信号により、シャッタ１２ａが光路を遮断して遮光（閉）状態にあることを確認すると、光路切換え装置９の状態検出装置９ｂからの検出信号により、蛍光キューブターレット２０から導入された蛍光を観察光学系１０へ導いているか否かを判別する（ステップ４０３）。そして、観察光学系１０へ導入していることが判別されると、ステップ４０４へ進む。

一方、ステップ４０３において、光路切換え装置９が蛍光キューブターレット２０から入射された蛍光を観察光学系１０へ導入していないことを判別すると、ステップ４０６へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光（閉）状態にするように制御し、ステップ４０３へ戻る。

ステップ４０４では、制御装置３１は、蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７の検出信号により、キューブカセット２１〜２６のうち、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されているか否かを判別する。これらキューブカセット２１〜２３および２６の一つが光路中に挿入されていることを判別すると、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を開放して非遮光（開）状態にするように制御する（ステップ４０５）。そして、この状態から、光路切換え装置９により蛍光キューブターレット２０から入射された蛍光を観察光学系１０へ導入させる。

一方、ステップ４０４において、キューブカセット２１〜２３および２６のいずれも光路中に挿入されていないことを判別すると、ステップ４０７へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光（閉）状態にするように制御し、ステップ４０３へ戻る。

なお、制御装置３１は、ステップ４０２、４０５、４０６、４０７において、シャッタ１２ａが、既に次の駆動状態に移行していることを検出した時は、改めて駆動装置３３にシャッタ駆動の指示を出さない。

また、光路切換え装置９および蛍光キューブターレット２０は、制御装置３１の指示に関係なく、いずれのステップにおいても操作可能となっている。

このために、蛍光キューブターレット２０のみを単独で操作した場合、状態検出装置２７は、光路中にあるキューブカセットの情報にかかわらず、キューブカセットが光路から外れた瞬間に、一旦肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセットでないことを示す検出信号を出力する。制御装置３１は、ステップ４０４での判別結果に従いステップ４０７へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光状態にするように制御する。

続けて、蛍光キューブターレット２０を操作して、いずれかのキューブカセットを光路中に挿入させると、このキューブカセットが肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるものであれば、制御装置３１は、ステップ４０４での判別結果に従いステップ４０５へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を開放して非遮光状態に制御する。そして、この状態から、光路切換え装置９により蛍光キューブターレット２０から入射された蛍光を観察光学系１０へ導入させることで、観察光学系１０において蛍光像を観察することができる。勿論、この場合も、蛍光キューブターレット２０により光路に挿入されたキューブカセットが肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるものでなければ、シャッタ１２ａは、遮光（閉）状態のまま維持される。

一方、光路切換え装置９を操作して観察光学系１０へ蛍光を導入していない状態、すなわち撮像光学系１１へ光路を切り換えた場合、状態検出装置９ｂは、観察光学系１０へは観察光を導入していないことを示す信号を制御装置３１へ送る。この場合、制御装置３１は、ステップ４０３での判別結果に従い、ステップ４０６へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光状態にするように制御する。この状態は、光路切り換え装置９を再び操作して、観察光学系１０へ蛍光を導入している状態にするまで維持される。

従って、このようにすれば、観察試料８から発せられる蛍光を肉眼観察する観察光学系１０の直前に自動制御可能なシャッタ１２ａを配置し、各種のキューブカセット２１〜２６を設けた蛍光キューブターレット２０の肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されている状態を状態検出装置２７が検出したときのみシャッタ１２ａを開放して観察試料８からの蛍光を肉眼観察可能としているので、肉眼観察に最適な光学素子の組み合わせを確実に設定することができる。また、肉眼観察する可能性のないフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２４，２５を介した観察光が観察光学系１０に侵入するのを防止することもできる。さらに、従来の全ての光学素子について予め波長特性の組み合わせの適／不適の設定を行なうため、これら光学素子に関する波長特性などの情報を事前に入力するようにしたものと比べ、煩雑な入力作業を必要とすることがなくなり、入力ミスなどを生じることも確実に防止できる。

さらに、ＣＣＤカメラなどの撮像光学系１１を用いて肉眼観察を行なわないようなアプリケーションを実現する場合も、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６が光路中に挿入される場合を含め、その他の肉眼観察する可能性のないフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２４，２５が光路中に挿入された場合も、観察試料８からの蛍光を撮像光学系１１に導くことができるので、撮像観察に最適な光学素子の組み合わせを確実に設定でき、これら最適な光学素子の組み合わせによりＣＣＤカメラ１１ａによる撮像を行なうことができる。

（変形例）
第１の実施の形態では、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９は、それぞれ手動操作するものについて述べたが、これらは、モータ等を組み込んだ電動制御可能なものであってもよい。この場合、顕微鏡コントローラ３０は、図３と同一部分には同符号を付した図５に示すように制御装置３１、操作手段３２および駆動装置３３に加えて、さらに駆動装置３４、３５が設けられている。駆動装置３４は、制御装置３１の指示により蛍光キューブターレット２０を回転駆動させ、また、駆動装置３５は、制御装置３１の指示により光路切換え装置９を観察光学系１０へ蛍光を導入する状態と導入しない状態を切換えるためのものである。

このようにしても、第１の実施の形態と同様の効果を得られる。

なお、上述では、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９の両方を電動式としたが、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９のどちらか一方のみ電動式であってもよい。また、顕微鏡コントローラ３０にＬＥＤ等の表示手段を設けて、シャッタ１２ａの開閉状態に対応させて表示を行なうようにしてもよい。さらに、第１の実施の形態では、光路切換え装置９に状態検出装置９ｂが設けられているが、この状態検出装置９ｂを省略することもできる。この場合、図４に示すフローチャート中の光路切換え装置９に係る動作（ステップ４０３，４０６）を省略した、図６に示すフローチャートで表わすことができる。このようにしても、第１の実施の形態と同様の効果が期待できる。さらに、図４に示すフローチャートのステップ４０５では、キューブカセット２１〜２３および２６の一つが光路中に挿入されていることを判別すると、自動的に駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａを開放するようにしているが、観察者が操作手段３２により指示を与えたときに初めてシャッタ１２ａを開放させるようにしてもよい。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

この第２の実施の形態では、蛍光観察を肉眼で行なう可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセットが光路に挿入された状態で、一定時間経過した後にシャッタを開いて観察光学系に蛍光を導入するようにしたことを特徴としている。

この場合、第２の実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

図７は、このような蛍光顕微鏡に適用される顕微鏡コントローラの概略構成を示すもので、図３と同一部分には、同符号を付している。

この場合、制御装置３１には、タイマ３６が接続されている。このタイマ３６は、予め設定された一定時間を制御装置３１からの指示により計測し、この計測時間が設定時間経過すると、その旨の通知信号を制御装置３１に送信するように構成されている。

その他は、図３と同様である。

次に、このように構成された蛍光顕微鏡の動作を図８に示すフローチャートに従い説明する。

いま、顕微鏡コントローラ３０の電源を投入すると（ステップ８０１）、制御装置３１は、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光（閉）状態にするように制御する（ステップ８０２）。

この状態で、制御装置３１は、状態検出装置１２ｂからの検出信号により、シャッタ１２ａが光路を遮断して遮光（閉）状態にあることを確認すると、光路借換え装置９の状態検出装置９ｂからの検出信号により、蛍光キューブターレット２０から導入された蛍光を観察光学系１０へ導いているか否かを判別する（ステップ８０３）。そして、観察光学系１０へ導入していることが判別されると、ステップ８０５へ進む。

一方、ステップ８０３において、光路切換え装置９が蛍光を観察光学系１０へ導入していないことを判別すると、ステップ８０４へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光（閉）状態にするように制御し、ステップ４０３へ戻る。

ステップ８０５では、制御装置３１は、蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７の検出出力により、キューブカセット２１〜２６のうち、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されているか否かを判別する。これらキューブカセット２１〜２３および２６の一つが光路中に挿入されていることを判別すると、シャッタ１２ａが閉じているか否かを判別する（ステップ８０７）。

一方、ステップ８０５において、キューブカセット２１〜２３および２６のいずれも光路中に挿入されていないことを判別すると、ステップ８０６へ進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を遮断して遮光（閉）状態にするように制御し、ステップ８０３へ戻る。

また、ステップ８０７において、シャッタ１２ａが閉じていないと判別すると、なにもせずステップ８０３へ戻るが、シャッタ１２ａが閉じていると判別すると、ステップ８０８へ進み、制御装置３１の指示によりタイマ３６のカウントをスタートする。タイマ３６は、現在光路中にある肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６が光路から外されるか、予め設定された時間を経過するまでカウントを継続する（ステップ８０９、８１１）。

ここで、光路中にあるキューブカセット２１〜２３および２６が光路から外されると、制御装置３１は、蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７から該当キューブカセットが存在しない旨の通知信号を受け取り（ステップ８０９）、ステップ８１０へ進む。

ステップ８１０では、カウント中のタイマ３６をクリアし、カウントを停止させた後、ステップ８０３へ戻る。

一方、光路中にあるキューブカセット２１〜２３および２６が光路から外されることがなく、タイマ３６のカウントが予め設定された時間を経過すると、このことが制御装置３１に通知される。制御装置３１は、タイマ３６から設定時間経過の通知信号を受け取ると（ステップ８１１）、ステップ８１２に進み、タイマ３６をクリアしてカウントを停止させる。そして、最終ステップ８１３に進み、駆動装置３３を駆動してシャッタ１２ａにより光路を開放して非遮光（開）状態とし、光路切換え装置９から射出される蛍光を観察光学系１０へ導入させる。

なお、制御装置３１は、ステップ８０２、８０４、８０６において、シャッタ１２ａが、既に次の駆動状態に移行していることを検出した時は、改めて駆動装置３３にシャッタ駆動の指示を出さない。また、光路切換え装置９および蛍光キューブターレット２０は、制御装置３１の指示に関係なく、いずれのステップにおいても操作可能となっている。

従って、このようにすれば、光路切換え装置９が観察光学系１０に光を導入している状態を状態検出装置９ｂが検出している状態で、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されごとにタイマ３６を起動し、これらキューブカセット２１〜２３および２６が一定時間継続して光路中に固定されているか否かを確認した後、次のシャッタ１２ａの動作に移行するようにしたので、例えば、蛍光キューブターレット２０を回転操作する際に、隣接するキューブカセットへの切換えでなく、離れた位置のキューブカセットに切換えるような場合、その間のキューブカセットが光路中に入って通り過ぎる際には、シャッタ動作に移行せず、目標としているキューブカセットが光路に入ったときに、始めて次のシャッタ動作に移行するようにできる。これにより、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のうち、所望するキューブカセットが光路に入ったときのみシャッタ１２ａの動作を実行することができるので、無駄なシャッタ開閉動作を防止することができ、観察者が煩わしさを感ずるようなことを回避できる。また、シャッタ１２ａの開閉回数も少なくできるためにシャッタ駆動装部における製品寿命も長くすることが可能である。

（変形例）
第２の実施の形態では、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９は、それぞれ手動操作するものについて述べたが、これらは、モータ等を組み込んだ電動制御可能なものであってもよい。勿論、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９のどちらか一方のみ電動式であってもよい。また、顕微鏡コントローラ３０にＬＥＤ等の表示手段を設けて、シャッタ１２ａの開閉状態に対応させて表示を行なうようにしてもよい。さらに、第２の実施の形態では、光路切換え装置９に状態検出装置９ｂが設けられているが、この状態検出装置９ｂを省略することもできる。この場合、図８に示すフローチャート中の光路切換え装置９に係る動作（ステップ８０５，８０６）を省略した、図９に示すフローチャートで表わすことができる。このようにしても、第１の実施の形態と同様の効果が期待できる。また、図８に示すフローチャートのステップ８１３では、タイマ３６のクリア後にシャッタ１２ａを自動的に開放するようにしているが、観察者が操作手段３２により指示を与えたときに初めてシャッタ１２ａを開けるようにしてもよい。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。

この場合、第３の実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

図１０は、このような蛍光顕微鏡に適用される顕微鏡コントローラの概略構成を示すもので、図３と同一部分には、同符号を付している。

この場合、顕微鏡コントローラ３０は、シャッタ１２ａを駆動するための駆動装置を省略し、新たに駆動装置３７、３８が設けられている。駆動装置３７は、制御装置３１の指示により図示しないモータを介して蛍光キューブターレット２０を回転駆動し、キューブカセット２１〜２６のうち一つを光路上に位置させるものである。また、駆動装置３８は、制御装置３１の指示により図示しないモータを介して光路切換え装置９を駆動し、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に導入している状態、観察光学系１０に導入している状態、さらには撮像光学系１１と観察光学系１０の両方に導入している状態のいずれかを選択可能としたものである。

その他は、図３と同様である。

次に、このように構成された蛍光顕微鏡の動作を図１１に示すフローチャートに従い説明する。

いま、顕微鏡コントローラ３０の電源を投入すると（ステップ１１０１）、制御装置３１は、初期動作として、ステップ１１０２〜１１０６の直前までを実行する。

まず、制御装置３１は、ステップ１１０２において、状態検出装置１２ｂからの検出信号により、シャッタ１２ａが光路を閉じて遮光（閉）状態にあるか否かを判別し、閉じていると判別すると、ステップ１１０４に進み、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を観察光学系１０に導入している状態へ移行させる。また、ステップ１１０２において、シャッタ１２ａが開いていると判別すると、ステップ１１０３に進み、蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７の検出信号により、キューブカセット２１〜２６のうち、蛍光観察を肉眼で行なう可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されているか否かを判別する。

ここで、キューブカセット２１〜２３および２６のいずれも光路中に挿入されていないことを判別すると、ステップ１１０５に進み、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に導入している状態に移行させる。これにより、初期動作が完了する。

次に、ステップ１１０６において、再び蛍光キューブターレット２０の状態検出装置２７の検出信号により、キューブカセット２１〜２６のうち、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６のいずれかが光路中に挿入されているか否かを判別する。

ここで、キューブカセット２１〜２３および２６のいずれも光路中に挿入されていないことを判別すると、ステップ１１０７へ進み、シャッタ１２ａの状態検出装置１２ｂの検出信号に基づきシャッタ１２ａの開閉状態を判別する。そして、シャッタ１２ａが開いていると判別すると、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に導入している状態に移行させる。つまり、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６が光路に挿入されず、その他のキューブカセット２４，２５が光路中に挿入されている状態では、観察光学系１０の直前のシャッタ１２ａが開いているときは、光路切換え装置９を制御して、観察光学系１０へ光が導入されない状態にする。

次に、ステップ１１０９において、観察者が操作手段３２のボタン等（不図示）を操作することによって、なんらかの操作指示を実行したかどうかを判別する。そして、操作指示があると判断すると、ステップ１１１０に進み、この操作指示が光路切換えに関するものか判別する。ここで、光路切換えに関する操作指示と判断した場合は、光路切換え動作処理に移行する（ステップ１１１１）。また、操作指示が光路切換えに関するものでないと、ステップ１１１２に進み、蛍光キューブターレット２０の操作に関するものであるかを判断する。ここで、蛍光キューブターレット２０の操作に関する操作指示と判断した場合は、ステップ１１１３に進み、蛍光キューブターレット２０の動作処理に移行する。

図１２は、光路切換え動作処理にかかるフローチャートを示している。

この場合、光路切換え装置９は、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に１００％導入する状態、観察光学系１０に１００％導入する状態、さらには撮像光学系１１と観察光学系１０の両方に導入している状態がある。

まず、ステップ１２０１において、操作手段３２からの操作指示が、光路を１００％撮像光学系１１に導入させる状態に対応するものか判別する。ここで、１００％撮像光学系１１の状態であると判別されると、ステップ１２０２に進み、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に１００％導入するための実際の光路切換えを実行する。

一方、ステップ１２０１で、１００％撮像光学系１１に導入させる状態に対応するものでないと判別すると、ステップ１２０３に進み、現在光路に挿入されているキューブカセットが蛍光観察を肉眼で行なう可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６であるか否かを判別する。ここで、キューブカセット２１〜２３および２６が光路に挿入されていると判別するとステップ１２０４へ進む。

ステップ１２０４では、操作手段３２からの操作指示が、光路を１００％観察光学系１０に導入させる状態に対応するものか判別する。ここで、１００％観察光学系１０の状態であると判別されると、ステップ１２０５に進み、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を観察光学系１０に１００％導入するための実際の光路切換えを実行する。また、１００％観察光学系１０の状態でないと判別されると、ステップ１２０６に進み、光路切換え装置９の駆動装置３８に指示して、蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を観察光学系１０と撮像光学系１１に導入するための実際の光路切換えを実行する。

なお、ステップ１２０４において、全てに該当しない場合は、光路切換え動作は実行されず処理を終了する。

図１３は、蛍光キューブターレット２０の動作処理にかかるフローチャートを示している。この場合、操作手段３２からの操作指示が、蛍光キューブターレット２０の操作に関するものであると、ステップ１３０１で、シャッタ１２ａが閉じ状態であるか否か判別する。ここで、シャッタ１２ａが閉じ状態であれば、ステップ１３０２において、蛍光キューブターレット２０の駆動装置３７に指示して、操作手段３２からの操作指示に対応したキューブカセット２１〜２６を光路に挿入させるような制御を実行する。

従って、このようにすれば、シャッタ１２ａ、蛍光キューブターレット２０、光路切換え装置９について、それぞれの状態検出装置１２ｂ、２７、９ｂが設けられ、肉眼観察の可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されるキューブカセット２１〜２３および２６が光路に挿入されず、それ以外のキューブカセット２４，２５が光路中に挿入されている状態を検出すると、仮に、シャッタ１２ａが開いていることがあっても、光路切換え装置９により強制的に蛍光キューブターレット２０から射出された蛍光を撮像光学系１１に導入している状態に移行させ、観察光学系１０へ光が導入されない状態に設定することができる。これにより、手動のシャッタを備えた蛍光顕微鏡においても、肉眼観察する可能性のない観察光が観察光学系１０に侵入するのを防止することもできる。

（変形例１）
例えば、顕微鏡コントローラ３０にＬＥＤ等の表示手段を設けて、蛍光キューブターレット２０状態検出装置２７の出力に対応した表示を行なうようにしても良い。また、上述では、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９の両方を電動式としたが、蛍光キューブターレット２０および光路切換え装置９のどちらか一方のみ電動式で、他方が手動で操作するものであっても同様の効果が得られる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１乃至３の実施の形態では、顕微鏡コントローラ３０は顕微鏡本体と別体に構成されているが、顕微鏡本体内部に組み込んだものであってもよい。また、上述では、蛍光キューブターレット２０のキューブカセット２１〜２３および２６と磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａの関係は、例えば、上述した図２と同一部分には同符号を付した図１４（ａ）（ｂ）に示すようにキューブカセット２１〜２３および２６に直接磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａを設けるように構成してもよい。さらに、上述では、蛍光キューブターレット２０の状態検出は磁石２１Ａ〜２３Ａおよび２６Ａとホール素子等からなる状態検出装置２７の組み合わせとしたが、発光素子を用いたものとして遮光部材とフォトインタラプタを組み合わせたものや、反射部材とフォトリフレクタを組み合わせたものを用いることもできる。また、状態検出装置２７に用いられるホール素子は、磁気抵抗体など他の磁気センサで構成してもよい。さらに、上述した第１乃至３の実施の形態では、キューブカセット２１〜２６にかかる情報として、肉眼観察に用いられる可能性のあるフィルタ組み合わせにより構成されたものを検出するようにしたが、所定以上の光エネルギーの光が導入される光学素子の組み合わせにより構成されるキューブカセットを検出可能とするようにしてもよい。 さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

なお、上述した実施の形態には、以下の発明も含まれる。

（１）請求項１または２記載の蛍光顕微鏡において、前記情報検出手段は、前記光学部材にかかる情報として、所定以上の光エネルギーの光が導入される光学素子の組み合わせにより構成される光学部材を検出可能としたことを特徴としている。

（２）請求項３記載の蛍光顕微鏡において、前記情報検出手段は、前記観察光学系での観察に用いられる光学素子の組み合わせにより構成される光学部材に対応させて設けられる発光素子と、該発光素子の光変化を検出する検出手段を有することを特徴としている。

（３）請求項１乃至６のいずれかに記載の蛍光顕微鏡において、前記情報検出手段の検出状態に応じて表示状態を変化する表示手段を有することを特徴としている。

本発明の第１の実施の形態に係る蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられる蛍光キューブターレットの概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられる顕微鏡コントローラの概略構成を示す図。 第１の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第１の実施の形態の変形例に用いられる顕微鏡コントローラの概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例の動作を説明するためのフローチャート。 本発明の第２の実施の形態に用いられる顕微鏡コントローラの概略構成を示す図。 第２の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第２の実施の形態の変形例の動作を説明するためのフローチャート。 本発明の第３の実施の形態に用いられる顕微鏡コントローラの概略構成を示す図。 第３の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第３の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第３の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。 第３の実施の形態の変形例に用いられる蛍光キューブターレットの概略構成を示す図。

符号の説明

１…光源、１ａ…光路
２…コレクタレンズ、３…視野絞り、４…開口絞り
５…レンズ、６…対物レンズ、７…試料ステージ
８…観察試料、９…光路切換え装置
９ａ…ビームスプリッタ、９ｂ…状態検出装置
１０…観察光学系、１１…撮像光学系、１１ａ…ＣＣＤカメラ、
１２…遮光装置１２ａ…シャッタ、１２ｂ…状態検出装置
１３…吸収フィルタユニット、２０…蛍光キューブターレット
２０１…円板部材、２１〜２６…キューブカセット
２１Ａ〜２３Ａ、２６Ａ…磁石、２１１…励起フィルタ
２１２…ダイクロイックミラー、２１３…吸収フィルタ
２４１…マルチバンドフィルタ、２７…状態検出装置
２８…クリック機構、３０…顕微鏡コントローラ
３１…制御装置、３２…操作手段、３３…駆動装置
３４．３５…駆動装置、３６…タイマ、３７．３８…駆動装置

Claims (4)

1. 試料からの蛍光を接眼レンズを有する観察光学系を介して観察する蛍光顕微鏡において、
   励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの光学素子のうち少なくとも前記ダイクロイックミラーを有する組み合わせにより構成された光学部材を複数個有し、前記複数の光学部材のうち１つを選択的に光路に挿入可能とした光学部材切換え手段と、
   前記観察光学系の直前に配置され、前記光学部材切換え手段の前記光学部材を介して前記観察光学系に導入される前記試料からの前記蛍光を遮光可能とする遮光手段と、
   前記光学部材切換え手段に設けられ、前記光学部材切換え手段により前記光路に挿入される前記光学部材が前記観察光学系を介しての肉眼観察の可能性があるか否かの情報を検出する情報検出手段と、
   前記情報検出手段の検出出力に応じて前記遮光手段による遮光を制御する制御手段と、
   を具備し、
   前記制御手段は、計時機能を有するタイマを有し、該タイマにより前記情報検出手段より検出される前記肉眼観察の可能性がある前記光学部材が前記光路に挿入されている継続時間を計測し、該計測時間が所定時間経過すると前記遮光手段により前記光路を開放する、
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 前記情報検出手段は、前記光学部材にかかる前記情報として、前記観察光学系での観察に用いられる前記光学素子の組み合わせにより構成される前記光学部材を検出可能としたことを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
3. 前記情報検出手段は、前記観察光学系での観察に用いられる前記光学素子の組み合わせにより構成される前記光学部材に対応させて設けられる磁気発生手段と、
   該磁気発生手段から発生する磁気を検出する磁気検出手段と、
   を有することを特徴とする請求項２記載の蛍光顕微鏡。
4. 試料からの蛍光を接眼レンズを有する観察光学系を介して観察する蛍光顕微鏡の観察方法であって、
   励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの光学素子のうち少なくとも前記ダイクロイックミラーを有する組み合わせにより構成された光学部材を複数個有する光学部材切換え手段により前記複数の光学部材のうち１つを選択的に光路に挿入可能とし、
   前記光学部材切換え手段の前記光学部材を介して前記観察光学系に導入される前記試料からの前記蛍光を遮光手段により前記光路を遮断し、
   前記光学部材切換え手段により前記光路に挿入される前記光学部材が前記観察光学系を介しての肉眼観察の可能性があるか否かの情報を情報検出手段により検出し、
   計時機能を有するタイマにより前記情報検出手段から検出される前記肉眼観察の可能性がある前記光学部材が前記光路に挿入されている継続時間を計測し、
   該計測時間が所定時間を経過すると前記遮光手段により前記光路を開放する、
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡の観察方法。

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