JP4272991B2 - 凍結乾燥製剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、凍結乾燥製剤に関する。詳細には、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤に関する。
背景技術
白金錯体であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁剤は、肝臓ガン、悪性リンパ腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、表在性膀胱ガンに対し、従来の薬剤より優れた効果を示す薬剤として知られている。特に下記構造を有するシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁剤は優れた効果を有することが知られている。
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁剤は、注射剤として投与される。従って、無菌化する工程が必要である。無菌化する方法としては溶媒に溶解し、濾過する方法が一般的である。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の場合、溶解する溶媒としては、例えば、２−メチル−２−プロパノール、クロロホルム等が挙げられる。好ましい溶媒としては、２−メチル−２−プロパノールが挙げられる（日本国特許第２８８６２４７号）。しかし、２−メチル−２−プロパノールを用いて、無菌濾過し、注射用凍結乾燥製剤を製造し、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁すると、時間と共に粘度が上昇していくこと、および懸濁液を長時間放置すると二層に分離するという問題があった。
発明の開示
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を臨床に応用するために、上記の問題が発生し難く、安定で、均一かつ取り扱いやすい製剤を開発することが本発明の目的である。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の無水物あるいは水和物を２−メチル−２−プロパノールに溶解し、凍結乾燥した時の粒子径の分布をコントロールすることにより、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した後、安定でかつ取り扱いやすくなることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
詳しくは、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解し、該溶液の水分量を調整することにより、または、水分量を調整し、速やかに凍結させることによって、粒子径の分布をコントロールすることにより、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した後、安定でかつ懸濁性が良好で取り扱いやすくなることを見いだした。
すなわち本発明は、
１． 粒子径が３〜２５μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
２． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である１．記載の凍結乾燥製剤：
３． 粒子径が５〜２０μｍを中心に分布する、１．または２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４． Ｄ９０％値が３３μｍ以下である１．〜３．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５． Ｄ９０％値が３０μｍ以下である１．〜３．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
６． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
７． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である６．記載の凍結乾燥製剤：
８． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
９． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である８．記載の凍結乾燥製剤：
１０． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
１１． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
１２． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である１１．記載の凍結乾燥製剤：
１３． 凍結を２０分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１４． 凍結を１５分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１５． 凍結を１０分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１６． 溶液の水分量を１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１７． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１８． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１９． 凍結を−４０℃で行う１１．〜１８．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２０． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる１１．〜１９．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２１． バイアル中で凍結乾燥される１１．〜１９．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２２． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
２３． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である２２．記載の無菌凍結乾燥製剤：
２４． 凍結を２０分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２５． 凍結を１５分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２６． 凍結を１０分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２７． 溶液の水分量を１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２８． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２９． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３０． 凍結を−４０℃で行う２２．〜２９．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３１． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる２２．〜３０．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３２． バイアル中で凍結乾燥される２２．〜３１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３３． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を０．１から１０Ｔｏｒｒの範囲で減圧凍結乾燥する工程：
３４． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である３３．記載の無菌凍結乾燥製剤：
３５． 凍結を２０分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３６． 凍結を１５分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３７． 凍結を１０分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３８． 溶液の水分量を１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３７．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３９． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤。
４０． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３９．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４１． 凍結を−４０℃で行う３３．〜４０．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４２． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる３３．〜４１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４３． バイアル中で凍結乾燥される３３．〜４２．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４４． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜３．５ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
４５． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である４４．記載の凍結乾燥製剤：
４６． 凍結を１時間以内に行う４４．または４５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４７． 凍結を４０分以内に行う４４．または４５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４８． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４９． 溶液の水分量を１．５〜２．５ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５０． 溶液の水分量を１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５１． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる４４．〜５０．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５２． バイアル中で凍結乾燥される４４．〜５１．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５３． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を減圧凍結乾燥する工程：
５４． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を減圧凍結乾燥する工程：
５５． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を０．１から１０Ｔｏｒｒの範囲で減圧凍結乾燥する工程：
５６． 凍結を２０分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５７． 凍結を１５分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５８． 凍結を１０分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５９． 溶液の水分量を１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６０． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤。
６１． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６２． 凍結を−４０℃で行う５３．〜６１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６３． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜３．５ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：等
に関する。
発明の詳細な説明
本発明の特徴は、凍結乾燥製剤の主成分の粒度分布を所定の範囲内に制御することである。このことにより、懸濁性が良好で層分離がしにくい、粘度が変化しにくいなどといった、取り扱いやすく安定な注射剤を製造することができる。すなわち、安定な注射剤を得るためには、凍結乾燥製剤の粒度分布について、粒子径が３〜２５μｍを中心に分布していることが好ましく、さらに３〜２０μｍを中心に分布していることが好ましく、特に５〜２０μｍを中心に分布していることが好ましい。ここで、例えば、「粒子径が３〜２５μｍを中心に分布する」とは、最頻度粒子径画分（最も分布頻度の多い粒子径が存在している粒子径範囲）つまり粒度分布プロファイルのピークが３〜２５μｍの範囲に含まれていることをいう。また、Ｄ９０％値が４０μｍ以下であることが好ましく、さらにＤ９０％値が３３μｍ以下、Ｄ７５％値が２２μｍ以下、Ｄ５０％値が１５μｍ以下であることがより好ましく、とりわけＤ９０％値が３０μｍ以下、Ｄ７５％値が２０μｍ以下、Ｄ５０％値が１３μｍ以下であることが好ましい。また、このように凍結乾燥製剤の粒度分布を制御する手段については後述する。
ここで、粒度分布の指標のＤ値は、当業界で一般的に用いられる通りの意味である。すなわち、「Ｄｘ％値がｐμｍである」というのは、粒子全体のｘ％の個数の粒子はｐμｍ以下で、（１００−ｘ）％の個数の粒子はｐμｍより大きい、ということを意味する。また、粒子の“大きさ”は、所謂球相当径であり、例えばレーザー回折計における測定では当該大きさの標準球状粒子と同等の回折挙動を示すことをいう。
本発明の凍結乾燥製剤は、上記所定の粒度分布を有するシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を主成分とするものである。ここで、「主成分とする」とは、前記化合物を凍結乾燥製剤中に９５重量％以上（好ましくは９７〜１００重量％、特に好ましくは１００重量％）含むことをいう。
本発明において使用する、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）におけるＲ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基であって、例えば、ヘキサノイルオキシ、ヘプタノイルオキシ、オクタノイルオキシ、ノナノイルオキシ、デカノイルオキシ、ウンデカノイルオキシ、ドデカノイルオキシ、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ、ヘキサデカノイルオキシ、ヘプタデカノイルオキシ、オクタデカノイルオキシ、ノナデカノイルオキシ、アイコサノイルオキシ等が挙げられる。好ましいアルカノイルオキシ基としては、炭素数１０から１６のアルカノイルオキシ基が挙げられ、具体的には例えば、デカノイルオキシ、ウンデカノイルオキシ、ドデカノイルオキシ、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ、ヘキサデカノイルオキシ等が挙げられる。更に好ましいアルカノイルオキシ基としては、炭素数１３から１５のアルカノイルオキシ基が挙げられ、具体的には例えば、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ等が挙げられる。特に好ましいアルカノイルオキシ基としては、テトラデカノイルオキシ等が挙げられる。
本発明に使用されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）としては、無水物でも水和物でもよい。これらを以下「主薬」と総称する。
本発明に係る注射用凍結乾燥製剤は、以下のように製造することができる。
製造方法１
（１）溶解工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに加え、室温で粉砕懸濁する。懸濁液に２−メチル−２−プロパノールを加え、溶解させる。または、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）に２−メチル−２−プロパノールを加え、３０℃から５０℃にして、超音波等を１０分から一時間照射し、溶解させる。２−メチル−２−プロパノールの量としては、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の溶解度以上の量であればよい。
（２）水分調整工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の２−メチル−２−プロパノール溶液の水分量をカールフィッシャー水分計等で測定する。測定した水分量をもとに、溶液の水分量を調整する。水分量は、該溶液の凍結の方法（後述）によって異なる。急速に溶液を凍結させる場合は、１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬの範囲から選択される。好ましくは１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられ、より好ましくは１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬの範囲が、更に好ましくは１．５〜３．５ｍｇ／ｍＬの範囲が、更により好ましくは１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられる。溶液を急速に凍結させない場合は、１．５〜３．５ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられ、好ましくは１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬの範囲が、より好ましくは１．５〜２．５ｍｇ／ｍＬの範囲が、更に好ましくは１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられる。
（３）濾過工程
溶液を、滅菌用のフィルターを用いて無菌濾過を行う。
（４）分注工程
無菌化した溶液の所定量をバイアルに充填する。
（５）凍結工程
凍結乾燥機の棚温度を溶液の凍結温度以下に設定し、バイアルを置き、凍結させる。或いは、溶液の凍結温度以上に設定し、バイアルを置き、一定の冷却速度で凍結温度まで冷却させて凍結させる。（４）および（５）の工程は、吸湿を防止しながら行うことが好ましい。凍結は急速に行うのが好ましい。本明細書において、「急速に凍結させる」とは、２０分以内に凍結させることをいうが、凍結は、１５分以内に行うことがより好ましく、さらに１０分以内、特に２〜１０分で行うことが特に好ましい。
（６）凍結乾燥工程
凍結乾燥機内を減圧し、凍結乾燥する。
製造方法２
（１）溶解工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）・一水和物を２−メチル−２−プロパノールに加え、室温で粉砕懸濁する。２−メチル−２−プロパノールの量はシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）１ｇ（無水物に換算して）に対し、１２．５ｍｌ±５％の範囲から選択される。懸濁液に２−メチル−２−プロパノールを加え、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）１ｇ（無水物に換算して）当たり、２−メチル−２−プロパノールが２５０ｍＬとなるように調整する。温度を約３０〜４０℃にし、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）・一水和物を溶解させる。本工程に使用される２−メチル−２−プロパノールは医薬品製造に用いることができる品質のものであればよく、好ましくは、蒸留した２−メチル−２−プロパノールを用いる。
（２）水分調整工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の２−メチル−２−プロパノール溶液の水分量を、カールフィッシャー水分計等を用いて測定する。測定した水分量をもとに、溶液の水分量が約１．０〜約５．０ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水を添加する。本工程に使用する蒸留水としては、無菌のものが望ましく、具体的には注射用蒸留水が挙げられる。（１）および（２）の工程はアイソレーター中で行うことが好ましい。
（３）濾過工程
溶液を、窒素加圧（圧力：通常、１．５ｋｇｆ／ｃｍ２以下、好ましくは０．１〜０．９ｋｇｆ／ｃｍ２）し、孔径約０．２μｍのフィルターを用いて無菌濾過を行う。使用するフィルターは有機溶媒用のものが好ましい。
（４）分注工程
無菌化した溶液の所定量をバイアルに充填する。例えば、２０ｍｇ製剤の場合は５ｍＬ、７０ｍｇ製剤の場合は１７．５ｍＬ、８０ｍｇ製剤の場合は２０ｍＬ充填する。
（５）凍結工程
凍結乾燥機の棚温度を−４０℃に設定し、その上に半打栓したバイアルを置く。２０分以内、好ましくは１５分以内（より好ましくは２〜１０分）でバイアル中の溶液を凍結させる。（４）および（５）の工程は、低湿度環境下（環境温度：２８〜３５℃、相対湿度：５〜４０％）にて吸湿を防止しながら行うことが好ましい。
（６）凍結乾燥工程
凍結乾燥機内を減圧し、凍結乾燥する。凍結乾燥は、以下のように行うことが好ましい。
一次乾燥条件：棚温度−２０〜１０℃、真空度０．１〜５Ｔｏｒｒ
二次乾燥条件：棚温度４０〜６０℃、真空度０．１〜１Ｔｏｒｒ。
本発明の注射用凍結乾燥製剤の投与量は、一般に成人に対して、主薬として、１〜５００ｍｇ／日である。投与方法としては、例えば局所動注が挙げられ、特に肝動注が好ましい。
本発明の注射用凍結乾燥製剤は、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル等に懸濁した状態で投与することができる。この場合、主薬の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍＬが望ましい。上述の方法により製造した凍結乾燥製剤をヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した場合には、時間の経過に伴う、粘度上昇および懸濁液の層分離を抑制できることが明らかになった（実験例参照）。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［実験例１］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（４ｇ）に２−メチル−２−プロパノール（１０００ｍｌ）を加え、超音波を３０分間照射し、３０〜４０℃で攪拌して溶解した（実験例２以下では、この溶液を「薬液」という）。この溶液をフィルター（孔径０．２２μｍ）でろ過し、無菌化した。この溶液を５ｍＬずつバイアルに充填した。３０℃に設定された棚にバイアルを置き、約２時間かけて徐々に−４０℃まで冷却しながら凍結させた。これを凍結乾燥し、様々の粒径（以下の「実験例１−１」にて測定する）の注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）を得た。
［実験例１−１］
前記注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに４ｍＬのミリスチン酸イソプロピルを加えて懸濁し、オリンパス製正立式微分干渉顕微鏡を用いて粒子形状を観察すると共に、島津製作所製レーザー回折式粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００を用いて粒度を測定した。結果を図１、図２に示す。
島津製作所製レーザー回折式粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００における粒度の測定条件としては以下の通りである。
・懸濁希釈溶媒 ：ＩＰＭ−ＥＸ（ミリスチン酸イソプロピル）
・測定時の主薬濃度 ：約０．０３ｍｇ／ｍＬ
・屈折率 ：２．４０−０．２０ｉ
・分布基準 ：体積
・ふるい上下 ：ふるい下
・分布関数 ：無変換
・スムージングレベル：０
・データシフト ：０
・測定回数 ：１回
・測定吸光度範囲 ：最大値０．２００、最小値０．０１０
その結果、粒子形状の観察結果からは２つのタイプに大別された。１つは、殆どの粒子が不定形で、中には５０〜１００μｍを超えるような大きい不定形粒子を含むロット、もう一つは、殆どの粒子が５〜２０μｍの球状粒子からなるロットであった。また、これらのロットの粒度は、表１に示すようにＤ９０％値が５０〜１００μｍ、１０〜３０μｍの２タイプに分類された。粒度分布プロファイルを図２に示す。このうち、Ｄ９０％値が１０〜３０μｍであるロット（製剤Ｎｏ．５および６）が本発明の実施例に相当し、それ以外のロット（製剤Ｎｏ．１〜４）が比較例に相当する（表１）。
［実験例１−２］
実験例１で得られた注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．７ｍｇ／ｍＬ）を加えることで、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）の懸濁液を得た。懸濁液の主薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬである。その後、室温にて静置し、経時的粘度変化を測定した。
粘度測定に用いる簡易粘度計の校正を実施した。粘度校正用標準液（日本工業規格ＪＩＳ Ｚ８８０９）ＪＳ５０、ＪＳ２００を簡易粘度計の流下孔より吸い取り、規定距離の流下時間をストップウォッチにて２回計測し、秒単位で小数点以下２桁まで記録した。得られた２回の流下時間の平均値（秒単位で小数点以下２桁まで）をもとに、（１）式より各標準液でのＫ値を小数点以下４桁まで求めた。さらに、各標準液でのＫ値を平均して小数点以下４桁まで求め、使用する簡易粘度計のＫ値とした。粘度校正用標準液は恒温器等で液温を２０℃に保っておき、取り出した後直ちに測定した。
Ｋ値＝２０℃での動粘度［ｍｍ２／ｓ］÷流下時間の平均値［ｓｅｃ］
（１）式
次に、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁液の粘度を、バイアルごとに経時的に室温下で測定した。すなわち、検定された簡易粘度計の流下孔より、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁液を吸い取り、規定距離の流下時間をストップウォッチにて２回計測し、秒単位で小数点以下２桁まで記録した。得られた２回の流下時間の平均値（秒単位で小数点以下１桁まで）をもとに、粘度を（２）式より計算し、小数点以下１桁まで求めた。
粘度［ｍＰａ・ｓ］＝ 流下時間の平均値［ｓｅｃ］×Ｋ値×ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルの密度１．２８１［ｇ／ｃｍ２］ （２）式
粘度測定の結果を図３に示す。
実験例１−１及び実験例１−２の結果から、粘度上昇の違いに粒度或いは粒子形状が関与することが示唆された。
［実験例２］
次に凍結前の薬液の水分量を変化させた場合に、凍結乾燥後の製剤物性がどのように変化するか調べた。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物を２−メチル−２−プロパノールで溶解した後、カールフィッシャー水分計を用いて水分量を測定し、水分量が０．５ｍｇ／ｍＬ〜６．０ｍｇ／ｍＬとなるように計算量の注射用蒸留水を添加し、異なる水分量の薬液をそれぞれ調製した。水分量１〜４ｍｇ／ｍＬのロットが本発明の実施例に相当し、それ以外のロットが比較例に相当する。各薬液をフィルター（孔径：０．２２μｍ）で無菌ろ過した。この各薬液を５ｍＬずつバイアルに充填し、半打栓した。３０℃に設定された棚にバイアルを置き、約２時間かけて徐々に−４０℃まで冷却しながら凍結させた。これを凍結乾燥し、注射用凍結乾燥製剤を得た。
［実験例２−１］
実施例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、実験例１−２と同じ方法により、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の粘度変化を評価した。結果を図４に示す。凍結前の水分量が増加するに従い、経時的な粘度上昇は抑制されることが分かった。
［実験例２−２］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、実験例１−１と同じ方法で、粒度分布を測定した。結果を図５、図６、表２に示す。
凍結乾燥前の水分量が０．５ｍｇ／ｍＬ未満の時は、ブロードな粒度分布を示し、水分量の増加に伴い大きい粒子径画分の相対粒子数が減少し、水分量約１．５ｍｇ／ｍＬでは比較的分布幅の狭いシャープな分布を示した。更に水分量が増加すると大きい粒子径画分が増え、ブロードとなり、水分量が約４．０ｍｇ／ｍＬ付近からピークトップ（最頻度粒子径画分）が大きい粒子径側にシフトしたブロードな分布を示した。粒度の変化をＤ９０％値で比較すると、凍結乾燥前の水分量が約０．５ｍｇ／ｍＬ未満で５０μｍ以上の値を示し、水分量の増加に伴い次第に小さくなり、水分量約１．５ｍｇ／ｍＬ付近では約２０μｍの値となった。更に水分量が増加すると再びＤ９０％値の値は大きくなり、約４．０〜約５．０ｍｇ／ｍＬでは約３５〜約５０μｍの値を示した。
［実験例２−３］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに４ｍＬのミリスチン酸イソプロピルを加えて懸濁し、実験例１−１と同じ方法により懸濁液中の粒子形状を、オリンパス製微分干渉顕微鏡を用いて観察した。その結果を図７に示す。凍結乾燥前の水分量が約０．５ｍｇ／ｍＬ未満の場合は、殆どの粒子が不定形で、約５０〜約１００μｍを超える不定形粒子が含まれていた。粒子表面は凸凹としての規則性は認められなかった。凍結乾燥前の水分量が増加し、約１．５〜約３．０ｍｇ／ｍＬでは、殆どの粒子が約５〜約３０μｍの球状粒子で、不定形粒子は殆ど認められなかった。水分量の増加に従い、粒子個々が大きくなり球状粒子表面が針状化しだした。更に、水分量が約５．０ｍｇ／ｍＬになると、約３０〜約５０μｍの球状粒子表面が針状化した粒子となった（表３）。
［実験例２−４］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、懸濁後、二層に分離せず均一な懸濁液として安定に存在できる時間を測定した。注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）に１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ）を加えて懸濁し、経時的に懸濁液の溶状を観察した。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い、主薬が懸濁液下層に沈降し、二層に分離するまでの時間が短くなる傾向が認められた（表４）。
［実験例２−５］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルによる懸濁操作性を比較した。実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）に１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ）を加え、以下のいずれの操作で、均一な懸濁液が調製できるかを評価した。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルを添加し、バイアルを回しながら主薬と馴染ませた後、手で軽く振とう攪拌するたけで均一に懸濁するものを「容易」とし、以上の操作だけでは十分均一にならず、手でバイアル底を叩くように振動させないと懸濁できないものを「困難」とした。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い、懸濁性は困難となる傾向が認められた（表５）。
以上の結果から、凍結前の薬液の水分量が変化することで凍結乾燥後の製剤物性は大きく変化し、この水分量を制御することで取り扱いやすい製剤を得られることが判明した。つまり、注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）を凍結乾燥機棚温３０℃において−４０℃まで約２時間かけて徐々に冷却しながら凍結させ、凍結乾燥する場合、粘度上昇抑制を考えると水分量は約１．５ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、懸濁後の均一性（懸濁後も長時間二層に分離しない）及び懸濁操作の容易性を考えると水分量は約４．０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましいことから、１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬが至適範囲と考えられた。一方で、凍結乾燥後の主薬粉末の粒度をＤ９０％値で約３３μｍ以下に、或いは球状粒子として制御することで、取り扱いやすく安定な注射用凍結乾燥製剤が得られることが示唆された（表６）。
［実験例３］
凍結乾燥前の薬液の水分量を約１．５〜約６ｍｇ／ｍＬの範囲で変化させ、無菌ろ過し、バイアル充填し、これを様々な凍結条件で凍結乾燥させて２０ｍｇ製剤および８０ｍｇ製剤を作製した。そして、得られた製剤について、粒度（Ｄ９０％値）、粒子形状、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の粘度変化と懸濁後の安定性（二層分離せずに均一な懸濁液として存在できる時間）及び懸濁性を評価した。
［実験例３−１］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、粒度（Ｄ９０％値）及び粒子形状を評価した。粒度は、実験例１の方法と同じく製剤をミリスチン酸イソプロピルに懸濁し、レーザー回折式粒度分布計（ＳＡＬＤ−３０００、島津製作所製）を用いて測定した。結果を図８及び図９に示す。粒子形状は、実験例１と同様に製剤をミリスチン酸イソプロピルに懸濁し、懸濁液中の粒子形状をオリンパス製正立式微分干渉顕微鏡により観察した。結果を図１０に示す。
その結果、２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤共に、いずれの凍結条件においても実験例２で認められたように凍結乾燥前の薬液の水分量によって、粒度（Ｄ９０％値）及び粒子形状が変化した。２０ｍｇ製剤では、いずれの凍結条件においても凍結乾燥前の薬液の水分量を約２．０〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲にすることで、Ｄ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍの球状粒子であることが確認された。−４０℃凍結及び３０℃に仕込み、１時間で−４０℃まで冷却する条件（以下、「３０℃→−４０℃／１ｈ条件」と表す）では、凍結乾燥前の薬液の水分量がもっと高い場合でもＤ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍ程度の球状粒子であることが確認された。他の凍結条件では水分量が約３．０ｍｇ／ｍＬ以上で、ロット間及びバイアル間でＤ９０％値が大きくばらついた。
８０ｍｇ製剤では、−４０℃凍結及び３０℃→−４０℃／１ｈ凍結条件において凍結乾燥前の薬液の水分量が約１．５〜約３．０ｍｇ／ｍＬまでの範囲でＤ９０％値は３３μｍ以下となり、特に−４０℃凍結においては凍結乾燥前の薬液の水分量が約１．５〜約５．０ｍｇ／ｍＬまでの範囲で、Ｄ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍ程度の球状粒子であることが確認された。その他の凍結条件では、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の凍結乾燥製剤を得るための薬液の水分量範囲が、約０．５ｍｇ／ｍＬ程度と狭くなり、−４０℃凍結に比べＤ９０％値が大きくなった。これらのことから、Ｄ９０％値の制御、粒子形状の制御の観点からは、−４０℃凍結条件が最も優れていた（表７）。
［実験例３−２］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の室温放置２４時間後の粘度変化を評価した。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．７ｍｇ／ｍＬ）を各製剤に主薬濃度約２０ｍｇ／ｍＬとなるように加え均一に懸濁し、室温で２４時間静置後の粘度を、実験例１−２に記載の方法に従い簡易式流下式粘度計にて測定した。その結果を図１１に示す。全ての凍結条件において凍結乾燥前の薬液の水分量が高い程粘度は低く、同じ水分量では他の凍結条件に比べ−４０℃凍結の方が、８０ｍｇ製剤よりも２０ｍｇ製剤の方が、粘度が高くなる傾向が認められた。
更に、Ｄ９０％値と懸濁２４時間後の粘度を図１２に示す。凍結条件、製剤用量に関わらず、凍結前の薬液水分量が１．５ｍｇ／ｍＬ以上での不定形粒子を殆ど含まない製剤については、Ｄ９０％値が大きくなるに従い懸濁２４時間後の粘度は低く、粘度上昇しにくいことがわかった。
［実験例３−３］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、実験例２と同じ方法により、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後、二層に分離せず均一な懸濁液として安定に存在できるか検討した。その結果、いずれの条件でも凍結前の水分量の増加に伴い、懸濁後の経過時間が長くなると主薬が懸濁液下層に沈降し二層に分離する傾向が認められた。この傾向は２０ｍｇ製剤より８０ｍｇ製剤の方が少ない水分量から認められた。しかし、−４０℃凍結条件の場合は、３０℃から徐々に−４０℃に冷却して凍結させる条件に比べ、水分量が多い場合でも二層に分離しにくく均一な懸濁液として安定に存在できた。
懸濁後の安定性とＤ９０％値及び粒子形状の関係を調べたところ、製剤の用量及び凍結条件に関わらず、Ｄ９０％値が４０μｍ以上と大きくなり、それに伴い粒子形状も球状粒子表面から針状化してくるに従い二層分離しやすくなることがわかった（表８）。
［実験例３−４］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルによる懸濁操作性を実験例２と同じ方法で比較した。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い懸濁性は困難となり、２０ｍｇ製剤より８０ｍｇ製剤の場合の方が少ない水分量から懸濁性が困難となった。しかし、−４０℃凍結条件の場合は、３０℃から徐々に−４０℃に冷却して凍結させる条件に比べ、水分量が多い場合でも懸濁性は良好であった（表９）。
以上の結果から、懸濁後の粘度上昇が起こりにくく、懸濁後も二層に分離しにくく、懸濁性も良好な取り扱いやすい製剤としては、凍結乾燥後の主薬粒子の粒度及び粒子形状を制御する必要がある。その制御範囲としては、粒度としてＤ９０％値が約４０μｍ以下で、最頻度粒子画分が３〜２５μｍの範囲であり、粒子形状としては不定形粒子でないことが好ましかった。粒子形状として球状粒子表面が針状化しだすと、二層分離の頻度や懸濁性の困難度が増す。この粒子形状の針状化の度合いは、Ｄ９０％値を約４０μｍ以下にするとよい。
［実験例４］
水分量約１．５〜約６ｍｇ／ｍＬの薬液を調製後、０．２μｍフィルターで無菌ろ過した液としない液のそれぞれを様々な条件で凍結させて凍結乾燥し、２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。そして、無菌ろ過有無による粒度への影響について比較した。結果を図１３に示す。尚、無菌ろ過前の薬液は無色透明であった。
無菌ろ過の有無によりＤ９０％値に差が認められた。同じ水分量では無菌ろ過した方がＤ９０％値は小さくなった。この違いは、３０℃に仕込み後約２．２時間で−４０℃まで冷却する条件（３０℃→−４０℃／２．２ｈ）或いは３０℃に仕込み後４時間で−４０℃まで冷却する条件（３０℃→−４０℃／４ｈ）の凍結条件でより顕著な差として認められた。
次に、約２〜約３．５ｍｇ／ｍＬの水分量の薬液を無菌ろ過し、別途薬液から析出した主薬粉末を、微量添加し、−４０℃で凍結し、共和真空製凍結乾燥機を用いて２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。そして得られた凍結乾燥製剤について、主薬析出粉末の添加有無による粒度及び粒子形状への影響について調べた。結果を図１４に示す。２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤共に、何れの水分量においても主薬粉末を添加した場合は、Ｄ９０％値は僅かに大きくなった。粒子形状は、主薬粉末らしき不定形な粉末片が僅かに認められたが、Ｄ９０％値の大きさに応じた球状粒子を有しており、明らかな変化は認められなかった。
［実施例５］
−４０℃凍結条件では、凍乾機仕込み時の薬液温度が変動すると凍結速度が変化し、ロット間或いはロット内で粒度にバラツキが生じることが懸念された。そこで、約１．５〜約４．０ｍｇ／ｍＬの水分量に調整後無菌ろ過された薬液を、薬液温度を約２８℃〜約４０℃の範囲で変動させてから−４０℃にまで凍結させ、凍結乾燥後の粒度への影響を調べた。結果を図１５、図１６に示す。その結果、凍結前の薬液温度が上昇するに従いＤ９０％値は小さくなり粒度分布もシャープになった。従って、液調温度（約３５〜約４０℃）及び充填環境温度（約３０℃）を制御し、仕込み時の薬液温度の急激な低下を防止することで、粒度に与える影響は少なくなった。
［実施例６］
製造スケールが大きくなり凍結乾燥機の庫内棚上に次々にバイアルが仕込まれると、−４０℃に設定された棚温は、薬液からの熱により上昇する。又、凍結乾燥機の性能によっては、−４０℃の制御可能幅も異なる。スケールアップ時の、製造条件の至適化及び設備選定の観点から、−４０℃凍結条件における棚温の許容幅を調べた。薬液の水分量を約１．５〜約４．０ｍｇ／ｍＬに調整し、無菌ろ過し、５℃〜−４５℃の棚温で、仕込み、凍結させ、凍結乾燥し、２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。得られた製剤の粒度及び粒子形状を上述の方法により評価し、仕込み時の棚温度の違いによる影響について検討した。その結果を図１７、図１８、及び図１９に示す。２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤ともに、仕込み時の棚温が−２０℃以上の場合は、仕込み時の棚温度の上昇に伴いＤ９０％値は大きくなった。しかし、−４５℃〜−２０℃の棚温度で凍結した場合は、Ｄ９０％値を約３０μｍに制御することができた。
仕込み時棚温度が５℃の場合は、Ｄ９０％値は大きくなり、狭い範囲の水分量幅でしか約４０μｍのＤ９０％値に制御することができなかった。粒子形状についても−２０℃以下の棚温度の場合に比べ低い水分量でも粒子表面の針状化が確認された。凍結乾燥前の薬液水分量が約４．０ｍｇ／ｍＬの２０ｍｇ製剤において、５℃仕込み後数分でバイアル底面から凍結が始まるバイアルと、仕込み後約３０分経過してから一瞬で凍結したバイアルに分類した。前者（図１７の×プロット）のＤ９０％値は約３０μｍで、粒子表面が針状化していた。後者（図１７の◇プロット）のＤ９０％値は約１０μｍと小さく、１０μｍ程度の球状粒子であった。
［実験例７］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（以下、原薬ともいう）を、２−メチル−２−プロパノールに溶解する方法を検討した。
ホモジナイザーで原薬を細かく粉砕した高濃度懸濁液を調製し、これを液調濃度まで２−メチル−２−プロパノールを加えて溶かすことで溶解させる方法について検討した。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物に、濃度約８０ｍｇ／ｍＬ（液調濃度の約２０倍）となるように２−メチル−２−プロパノールを加え、特殊機化工業（株）社製ＴＫロボミックスを用いて約５０００〜約１００００ｒｐｍで約１０分間粉砕懸濁した。これを液調濃度約４．０ｍｇ／ｍＬとなるように２−メチル−２−プロパノールを加え、マグネットスターラーで攪拌した。作業中の薬液温度は約３５〜約４０℃に維持し、原薬が完全に溶解したことを確認した。その結果、本操作により主薬の溶解が従来の溶解方法（超音波懸濁後、マグネットスターラー攪拌）に比べ短時間で可能となり、主薬分解等による黒色異物も発生しないことがわかった。
次にホモミキサー攪拌により含量及び類縁物質に影響しないか検討した。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物に、液調濃度約４．０ｍｇ／ｍＬとなるように２−メチル−２−プロパノールを加えた。これを２本の三角フラスコにそれぞれ調製した。１本の三角フラスコは、超音波照射後、液温約４０℃にてスターラー攪拌した。残りの１本の三角フラスコは、ホモジナイザーと同様の機構で粉砕溶解するＩＫＡ社製ポリトロン粉砕機（粉砕径Ｇ８）を用いて、液温約４０℃にて約１００００ｒｐｍで攪拌した。原薬が溶解した時点をそれぞれ０時間目として攪拌を継続し、経時的に薬液をサンプリングし、溶状の観察及び含量と類縁物質を測定した。その結果、いずれの攪拌方式とも、黒色異物等は認められず、表１０に示すように含量及び類縁物質についても変化は認められなかった。
［実施例８］
凍結乾燥時の製剤の飛散抑制及び乾燥工程短縮化の両者を満たす乾燥条件の検討を行った。
薬液５ｍＬを充填し、半打栓した１８ｍＬバイアル（２０ｍｇ製剤に相当）及び薬液２０ｍＬを充填し半打栓した３０ｍＬバイアル（８０ｍｇ製剤に相当）を凍結乾燥機に仕込み、凍結し、様々な真空度及び棚温にて一次乾燥を行った。同時に、庫内のぞき窓から昇華状況が観察できるようにブランク溶液（２−メチル−２−プロパノール）も同様に充填して一次乾燥を行った。庫内のぞき窓からブランク溶液が全て昇華しなくなったことを確認後、二次乾燥（真空度約１．０Ｔｏｒｒまで１時間で到達させ、その後棚温４０℃で６時間乾燥）を実施した。二次乾燥終了後、打栓を行い飛散状況を観察した。
乾燥工程における昇華速度に影響するのは品温である。品温に影響するのは棚温と真空度である。サンプルの昇華界面の品温は真空度に依存し、アントワンの式より品温と蒸気圧の理論値を求めることができる。しかし、サンプルの昇華界面以下の凍結相は、棚温からの熱供給の影響を受けバイアル底部に近づくほど高くなる。この凍結相上下での品温差が大きいほど昇華速度は大きくなるが、逆に、バイアル底部の昇華力がバイアル上部の昇華面を押し上げるように突沸し、飛散が起こりやすくなる。そこで、昇華界面の理論品温と棚温（バイアル底部付近の品温に近似）の差が大きすぎないように、棚温と真空度を様々に変化させ、その際の昇華速度と主薬の飛散度合いを目視により確認し、その評価結果を表１１にまとめた。なお、「飛散レベル」は、“よく観察するとバイアル肩口に飛散がある”（レベルＡ）、“バイアル肩口への飛散がレベルＡより多め”（レベルＢ）、“バイアル肩口だけでなく半打栓ゴム栓の裏面に飛散による主薬付着を認める”（レベルＣ）の３段階に分類した。
その結果、昇華界面の理論品温と棚温の解離が大きい程、飛散量が目視レベルで多くなることがわかった。特に高真空度の方が飛散しやすい傾向にあり、５Ｔｏｒｒよりも１Ｔｏｒｒの方が飛散しやすかった。以上の結果から、飛散抑制と乾燥時間短縮化の両者のバランスを考え、一次乾燥は「棚温；−１℃、真空度；５Ｔｏｒｒ」が有効で、一次乾燥時間も余裕をとり「２０ｍｇ製剤で３５時間以上、８０ｍｇ製剤で６５時間以上」とした。また、二次乾燥への移行は、急激な真空度の変化は乱気流による主薬飛散を招くことから、１時間以上かけて徐々に０．１〜１Ｔｏｒｒまで高真空化した後に棚温を４０℃まで昇温することとした。
［実験例９］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（原薬）に対し、濃度が約４．０ｍｇ／ｍｌになるように２−メチル−２−プロパノールを加え、超音波処理後、約３０℃〜約４０℃に加温しながら攪拌し、完全に溶解させた。この溶液に水を段階的に添加することで水分含量が約１．５〜約６．０ｍｇ／ｍＬの範囲の数種類の溶液を調整し、それぞれ均一になるように攪拌した。その後、該溶液を加圧タンクに入れ、窒素加圧（圧力：１ｋｇ／ｃｍ２以下）による気密系にて孔径０．２μｍのフィルターを用いて無菌濾過を行った。濾液１７．５ｍＬを低湿度環境下（環境温度：２８〜３５℃、相対湿度：５〜４０％）にて吸湿を防止しながらバイアルに充填し、半打栓を施した後、直ちに棚温が−４０℃の凍結乾燥機の棚にバイアルを置き、１０〜２０分かけて凍結させた。凍結乾燥（初期排気：棚温度−４０℃、一次乾燥条件：棚温度−１℃、真空度５Ｔｏｒｒ、二次乾燥条件：棚温度４０℃、真空度１Ｔｏｒｒ）を行い、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）の７０ｍｇ注射用凍結乾燥製剤を得た。
各水分量の７０ｍｇ注射用凍結乾燥製剤を粒度と粘度変化を実験例１−１及び実験例１−２に記載の方法で測定した。その結果を図２０および図２１に示す。
［試験例］
本願発明の凍結乾燥製剤（以下、単に凍結乾燥製剤という。）のリピオドール懸濁液を用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルにおける薬効を検討した。
凍結乾燥製剤は実験例２の方法に従って作製した２０ｍｇ製剤、凍結条件は徐冷却条件（凍結速度：３０℃→−４０℃／約２時間）、仕込み時水分量は１．５〜２ｍｇ／ｍＬ、粒度はＤ９０％で２０μｍ以下のものを使用した。
本試験例の記載における略号ＬＰＤは、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（リピオドールウルトラフルイド）を表す。該ＬＰＤは、三井製薬株式会社（現 日本シエーリング）から入手したものを使用した。
（試験系）
１）細胞
熊本大学より分与されたラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを、後記実験方法の３）腫瘍移植の項に示した手順に従って、雄性Ｄｏｎｒｙｕラットの肝臓内移植によりｉｎ ｖｉｖｏ継代して維持したものを試験に使用した。
２）ラット
日本チャールス・リバー株式会社より購入した雄性Ｄｏｎｒｙｕラットを使用した。
（実験方法）
１）試薬、試液および器材
▲１▼全身麻酔剤は、大日本製薬株式会社のネンブタール注射液を使用した。
▲２▼Ｈａｎｋｓ液は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬのＨａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用した。
▲３▼留置針は、テルモ株式会社のサーフローフラッシュ１８Ｇ×２”を使用した。
▲４▼止血用ゼラチンスポンジは、山之内製薬株式会社のスポンゼルを使用した。
▲５▼ポリエチレンチューブは、株式会社夏目製作所のポリエチレンチューブＳＰ１０を使用した。
▲６▼コンドロイチン硫酸製剤は、科研製薬株式会社の１％コンドロン注を使用した。
▲７▼ヘパリン含有生理食塩水は、大塚製薬株式会社の大塚生食注に、ＧＩＢＣＯＢＲＬのブタ由来ヘパリンを２０Ｕ／ｍｌになるように添加したものを使用した。
▲８▼電子ノギスは、日本測定工具株式会社の電子デジタルノギスＭＡＸ−ＣＡＬを使用した。
▲９▼シリンジはハミルトン製の５０μｌ容マイクロシリンジを使用した。
２）動物飼育
飼育室の飼育環境は、温度が２０℃以上２６℃以下、湿度が３０％以上７０％以下、明暗サイクルが午前８時点灯、午後８時消灯の１２時間明期および１２時間暗期とした。使用する餌は日本クレア株式会社のＣＬ−２とした。給水は、給水ビンで行った。
３）腫瘍移植
▲１▼全身麻酔下で担癌ラットを開腹し、肝臓からＡＨ１０９Ａの固形腫瘍塊を摘出した。全身麻酔剤は腹腔内に約５０ｍｇ／ｋｇで投与した。以下すべて全身麻酔は同様に行った。
▲２▼摘出した腫瘍塊をＨａｎｋｓ液中でハサミを使って細断し、１ｍｍ角程度の移植腫瘍片を調製した。
▲３▼全身麻酔下で、正常ラットの腹部をバリカンで剃毛し、イソジンで消毒した後、開腹した。
▲４▼留置針のカテーテル部位を用いて、▲２▼で調製した移植腫瘍片を肝臓左葉内に移植した。カテーテル部位の先端は、ハサミで鋭角に切断しておいた。図２２のように、カテーテル部位３の先端から、移植腫瘍片１と同程度の大きさに細切した止血用ゼラチンスポンジ２、移植腫瘍片１の順に充填し、カテーテル部位３の先端から１ｃｍ程度までを肝臓内に刺入した。カテーテル部位３のシリンジ接続側から、移植腫瘍片１をゼラチンスポンジ２ごとポリエチレンチューブ４で押し込んだ後に、カテーテル部位３を抜去した。
▲５▼肝臓が癒着することを防止する目的で、コンドロイチン硫酸製剤とヘパリン含有生理食塩水を腹腔内に添加した。コンドロイチン硫酸製剤の添加量は、１個体あたり０．１ｍｌとした。また、ヘパリン含有生理食塩水は、肝臓全体が浸る程度まで添加した。
▲６▼腹部を絹糸で縫合し、縫合部分をイソジンで消毒した後、飼育ケージにもどした。
４）投与液の調製
凍結乾燥製剤のＬＰＤ懸濁液は、２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
凍結乾燥製剤２０ｍｇにＬＰＤを１ｍｌ添加し、均一になるまで懸濁した。この投与液は投与日毎に用時調製し、調製後は投与時まで室温で保存した。
５）薬効評価
▲１▼ＡＨ１０９Ａを肝臓内に移植して１９日または２０日間飼育したラットを、全身麻酔下で腹部を剃毛し、イソジンで消毒した後、開腹した。
▲２▼腫瘍生着の有無を確認し、腫瘍が生着していた個体については、腫瘍の長径と短径を電子ノギスを用いて計測した。
▲３▼次式により腫瘍面積を計算した。腫瘍面積（ｍｍ２）＝腫瘍の長径（ｍｍ）×腫瘍の短径（ｍｍ）。
腫瘍面積が１００〜２５０ｍｍ２の担癌ラットを使用した。
▲４▼実験群は、無処置群、擬手術群、ＬＰＤ投与群、凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群の４群とした。
▲５▼薬剤の投与経路はすべて肝動脈内投与とした。肝動脈内投与は、カテーテルとしてポリエチレンチューブを接続した５０μｌ容マイクロシリンジで行った。カテーテルを胃十二指腸動脈より挿入し、先端が総肝動脈と固有肝動脈の分岐部に達するように固定した後、薬剤を２０μｌ投与した。薬剤投与後、カテーテルを胃十二指腸動脈より抜去し、カテーテル挿入部位の前後で胃十二指腸動脈を絹糸で結紮した。ただし、無処置群は、開腹して腫瘍径を計測するのみとし、擬手術群は、胃十二指腸動脈を絹糸で結紮するのみとした。
▲６▼全群とも、処置・投与後に腹部を絹糸で縫合し、縫合部分をイソジンで消毒した後、飼育ケージにもどした。
▲７▼１週間飼育した後、全身麻酔下で開腹した。
▲８▼前述のように、電子ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を計測した。
（結果の評価方法、解析に使用する統計学的方法）
（１）個体の腫瘍増殖率の計算
次式により、個体毎に腫瘍増殖率を計算した。腫瘍増殖率（％）＝１００（％）×投与１週間後の腫瘍の長径（ｍｍ）×同短径（ｍｍ）／投与時の腫瘍の長径（ｍｍ）×同短径（ｍｍ）
（２）多重比較検定の方法および薬効の評価方法
各群７検体について、以下の評価を行った。各群について、腫瘍増殖率の平均値と標準偏差を計算した。その後、以下に示す多重比較検定を行った。
▲１▼手術操作およびＬＰＤの腫瘍増殖に対する影響
無処置群、擬手術群およびＬＰＤ投与群の３群について、無処置群をコントロール群として２元型に改変したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行った。擬手術群またはＬＰＤ投与群に、無処置群と比較して、腫瘍増殖率に統計学的な有意な差が有り（ｐ値＜０．０５）、かつ腫瘍増殖率の平均値に、無処置群の平均値との差が２５％以上ある場合、手術操作自体またはＬＰＤが腫瘍の増殖には影響すると評価することとした。
▲２▼薬剤の有効性
ＬＰＤ投与群、及び凍結乾燥製済／ＬＰＤ投与群の２群について、ＬＰＤ投与群をコントロール群として、上記▲１▼と同様に、２元型に改変したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行った。ＬＰＤ投与群に比べて、腫瘍増殖率が有意に低く（ｐ値＜０．０５）、かつ腫瘍増殖率の平均値が２５％以上低い薬剤投与群については、その群の薬剤が有効であると評価した。また、腫瘍増殖率の平均値が１００％未満であった薬剤投与群については、その群の薬剤には腫瘍退縮効果があると評価した。
（結果と考察）
（１）手術操作およびＬＰＤの腫瘍増殖に対する影響
擬手術群では、無処置群と比較して、腫瘍増殖率の平均値は１１％低かったが、２群間の腫瘍増殖率に有意な差はなかった（ｐ値；０．９２８５）。また、ＬＰＤ投与群では、無処置群と比較して、腫瘍増殖率の平均値は２８％低かったが、２群間の腫瘍増殖率に有意な差はなかった（ｐ値；０．６６８６）。
したがって、ラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルでは、投与部位である胃十二指腸動脈を結紮する手術操作自体、あるいは媒体であるＬＰＤの投与のいずれも、腫瘍の増殖には影響しないことが示された（表１２）。
（２）本願発明の凍結乾燥製剤の有効性
投与液量を個体あたり２０μｌで一定にして、臨床での投与液濃度に調製したＬＰＤ懸濁液を用い、投与１週間後の腫瘍増殖率を指標に、ラット肝癌肝動脈内投与モデルで、凍結乾燥製剤の有効性を検討した。
凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群では、全例とも腫瘍増殖率が１００％未満であった（表１２）。凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群では、ＬＰＤ投与群と比較して、腫瘍増殖率の平均値が１１８％低く、腫瘍増殖率が有意に低かった（ｐ値＜０．０００１）。
したがって、ラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルでは、本発明の凍結乾燥製剤／ＬＰＤは有効であり、腫瘍退縮効果を示した。
産業上の利用可能性
本発明により、経時による、層分離や粘度変動が生じ難く、懸濁性が良好な、投与時に取り扱いやすい、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の凍結乾燥製剤が提供されるようになった。
本出願は、日本で出願された特願２００１−２９０２６５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、製剤Ｎｏ．１（実験例１）の凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図であり、図１Ｂは、製剤Ｎｏ．５（実験例１）の凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図２は、実験例１における各ロットの凍結乾燥製剤粒子の粒度分布プロファイルである。
図３は、実験例１における、凍結乾燥製剤のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の経時的粘度変化を示す図である。
図４は、実験例２における、凍結前の薬液水分量とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の経時的粘度変化を示す図である。
図５は、実験例２における、薬液の水分量の違いによる凍結乾燥後の粒度分布プロファイルである。
図６は、実験例２における、凍結前の薬液水分量と凍結乾燥製剤粒子のＤ９０％値の関係を示す図である。
図７Ｂ〜Ｄは、実験例２における凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図であり、図７Ａは、図７Ｂ〜Ｄにおける倍率でのスケールの顕微鏡観察の出力図である（最小目盛りは１０μｍ）。図７Ｂは、凍結前の薬液水分量が３．０ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（球状）の出力図であり、図７Ｃは、凍結前の薬液水分量が５．０ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（針状）の出力図であり、図７Ｄは、凍結前の薬液水分量が０．５ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（不定形）の出力図である。
図８は、実験例３における、２０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図９は、実験例３における、８０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図１０Ａ〜Ｆは、実験例３における凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。図１０Ａは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｂは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、繊維状）の出力図であり、図１０Ｃは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、微繊維状）の出力図であり、図１０Ｄは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｅは、凍結乾燥製剤粒子（８０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｆは、凍結乾燥製剤粒子（８０ｍｇ製剤、微繊維状）の出力図である。
図１１は、実験例３における、凍結条件と凍結前の薬液水分量と凍結乾燥製剤のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度を示す図である。
図１２は、実験例３における、Ｄ９０％値とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度の関係を示す図である。
図１３は、実験例４における、凍結条件及びろ過処理の有無と凍結乾燥製剤の粒度の関係を示す図である。
図１４は、実験例４における、主薬析出粉末添加および薬液水分量とＤ９０％値の関係を示す図である。
図１５は、実施例５における、凍結前の薬液温度の違いによるＤ９０％値への影響を示す図である。
図１６は、実施例５における、凍結前の薬液温度の違いによる粒度分布プロファイルへの影響を示す図である。
図１７は、実施例６における、仕込み時の棚温度と凍結乾燥製剤の粒度の関係を示す図である。
図１８は、実施例６における、投入時の棚温度の異なる凍結乾燥製剤の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図１９は、実施例６における、５℃の棚で凍結した凍結乾燥製剤の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図２０は、実施例９における、７０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図２１は、実施例９における、７０ｍｇ製剤の凍結前の薬液水分量とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度を示す図である。
図２２は、試験例の留置針のカテーテル部位を示す図である。図２２中、符号１は移植腫瘍片を、符号２は止血用ゼラチンスポンジを、符号３はカテーテル部位を、符号４はポリエチレンチューブをそれぞれ表す。
図２３は、凍結乾燥製剤の製造フロー概略図である。
本発明は、凍結乾燥製剤に関する。詳細には、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤に関する。
背景技術
白金錯体であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁剤は、肝臓ガン、悪性リンパ腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、表在性膀胱ガンに対し、従来の薬剤より優れた効果を示す薬剤として知られている。特に下記構造を有するシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁剤は優れた効果を有することが知られている。
発明の開示
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を臨床に応用するために、上記の問題が発生し難く、安定で、均一かつ取り扱いやすい製剤を開発することが本発明の目的である。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の無水物あるいは水和物を２−メチル−２−プロパノールに溶解し、凍結乾燥した時の粒子径の分布をコントロールすることにより、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した後、安定でかつ取り扱いやすくなることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
詳しくは、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解し、該溶液の水分量を調整することにより、または、水分量を調整し、速やかに凍結させることによって、粒子径の分布をコントロールすることにより、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した後、安定でかつ懸濁性が良好で取り扱いやすくなることを見いだした。
すなわち本発明は、
１． 粒子径が３〜２５μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
２． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である１．記載の凍結乾燥製剤：
３． 粒子径が５〜２０μｍを中心に分布する、１．または２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４． Ｄ９０％値が３３μｍ以下である１．〜３．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５． Ｄ９０％値が３０μｍ以下である１．〜３．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
６． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
７． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である６．記載の凍結乾燥製剤：
８． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
９． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である８．記載の凍結乾燥製剤：
１０． 粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
１１． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
１２． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である１１．記載の凍結乾燥製剤：
１３． 凍結を２０分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１４． 凍結を１５分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１５． 凍結を１０分以内に行う１１．または１２．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１６． 溶液の水分量を１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１７． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１８． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する１１．〜１５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
１９． 凍結を−４０℃で行う１１．〜１８．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２０． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる１１．〜１９．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２１． バイアル中で凍結乾燥される１１．〜１９．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
２２． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
２３． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である２２．記載の無菌凍結乾燥製剤：
２４． 凍結を２０分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２５． 凍結を１５分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２６． 凍結を１０分以内に行う２２．または２３．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２７． 溶液の水分量を１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２８． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
２９． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する２２．〜２６．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３０． 凍結を−４０℃で行う２２．〜２９．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３１． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる２２．〜３０．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３２． バイアル中で凍結乾燥される２２．〜３１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３３． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を０．１から１０Ｔｏｒｒの範囲で減圧凍結乾燥する工程：
３４． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である３３．記載の無菌凍結乾燥製剤：
３５． 凍結を２０分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３６． 凍結を１５分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３７． 凍結を１０分以内に行う３３．または３４．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３８． 溶液の水分量を１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３７．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
３９． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤。
４０． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する３３．〜３９．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４１． 凍結を−４０℃で行う３３．〜４０．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４２． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる３３．〜４１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４３． バイアル中で凍結乾燥される３３．〜４２．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
４４． 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜３．５ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：
４５． Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である４４．記載の凍結乾燥製剤：
４６． 凍結を１時間以内に行う４４．または４５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４７． 凍結を４０分以内に行う４４．または４５．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４８． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
４９． 溶液の水分量を１．５〜２．５ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５０． 溶液の水分量を１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬに調整する４４．〜４７．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５１． ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁して用いる４４．〜５０．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５２． バイアル中で凍結乾燥される４４．〜５１．のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
５３． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を減圧凍結乾燥する工程：
５４． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を減圧凍結乾燥する工程：
５５． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする無菌凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）濾過し、無菌化する工程；
（４）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（５）該凍結溶液を０．１から１０Ｔｏｒｒの範囲で減圧凍結乾燥する工程：
５６． 凍結を２０分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５７． 凍結を１５分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５８． 凍結を１０分以内に行う５３．〜５５．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
５９． 溶液の水分量を１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６０． 溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤。
６１． 溶液の水分量を１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬに調整する５３．〜５８．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６２． 凍結を−４０℃で行う５３．〜６１．のいずれかに記載の無菌凍結乾燥製剤：
６３． 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２０μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜３．５ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程：等
に関する。
発明の詳細な説明
本発明の特徴は、凍結乾燥製剤の主成分の粒度分布を所定の範囲内に制御することである。このことにより、懸濁性が良好で層分離がしにくい、粘度が変化しにくいなどといった、取り扱いやすく安定な注射剤を製造することができる。すなわち、安定な注射剤を得るためには、凍結乾燥製剤の粒度分布について、粒子径が３〜２５μｍを中心に分布していることが好ましく、さらに３〜２０μｍを中心に分布していることが好ましく、特に５〜２０μｍを中心に分布していることが好ましい。ここで、例えば、「粒子径が３〜２５μｍを中心に分布する」とは、最頻度粒子径画分（最も分布頻度の多い粒子径が存在している粒子径範囲）つまり粒度分布プロファイルのピークが３〜２５μｍの範囲に含まれていることをいう。また、Ｄ９０％値が４０μｍ以下であることが好ましく、さらにＤ９０％値が３３μｍ以下、Ｄ７５％値が２２μｍ以下、Ｄ５０％値が１５μｍ以下であることがより好ましく、とりわけＤ９０％値が３０μｍ以下、Ｄ７５％値が２０μｍ以下、Ｄ５０％値が１３μｍ以下であることが好ましい。また、このように凍結乾燥製剤の粒度分布を制御する手段については後述する。
ここで、粒度分布の指標のＤ値は、当業界で一般的に用いられる通りの意味である。すなわち、「Ｄｘ％値がｐμｍである」というのは、粒子全体のｘ％の個数の粒子はｐμｍ以下で、（１００−ｘ）％の個数の粒子はｐμｍより大きい、ということを意味する。また、粒子の“大きさ”は、所謂球相当径であり、例えばレーザー回折計における測定では当該大きさの標準球状粒子と同等の回折挙動を示すことをいう。
本発明の凍結乾燥製剤は、上記所定の粒度分布を有するシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を主成分とするものである。ここで、「主成分とする」とは、前記化合物を凍結乾燥製剤中に９５重量％以上（好ましくは９７〜１００重量％、特に好ましくは１００重量％）含むことをいう。
本発明において使用する、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）におけるＲ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基であって、例えば、ヘキサノイルオキシ、ヘプタノイルオキシ、オクタノイルオキシ、ノナノイルオキシ、デカノイルオキシ、ウンデカノイルオキシ、ドデカノイルオキシ、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ、ヘキサデカノイルオキシ、ヘプタデカノイルオキシ、オクタデカノイルオキシ、ノナデカノイルオキシ、アイコサノイルオキシ等が挙げられる。好ましいアルカノイルオキシ基としては、炭素数１０から１６のアルカノイルオキシ基が挙げられ、具体的には例えば、デカノイルオキシ、ウンデカノイルオキシ、ドデカノイルオキシ、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ、ヘキサデカノイルオキシ等が挙げられる。更に好ましいアルカノイルオキシ基としては、炭素数１３から１５のアルカノイルオキシ基が挙げられ、具体的には例えば、トリデカノイルオキシ、テトラデカノイルオキシ、ペンタデカノイルオキシ等が挙げられる。特に好ましいアルカノイルオキシ基としては、テトラデカノイルオキシ等が挙げられる。
本発明に使用されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）としては、無水物でも水和物でもよい。これらを以下「主薬」と総称する。
本発明に係る注射用凍結乾燥製剤は、以下のように製造することができる。
製造方法１
（１）溶解工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに加え、室温で粉砕懸濁する。懸濁液に２−メチル−２−プロパノールを加え、溶解させる。または、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）に２−メチル−２−プロパノールを加え、３０℃から５０℃にして、超音波等を１０分から一時間照射し、溶解させる。２−メチル−２−プロパノールの量としては、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の溶解度以上の量であればよい。
（２）水分調整工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の２−メチル−２−プロパノール溶液の水分量をカールフィッシャー水分計等で測定する。測定した水分量をもとに、溶液の水分量を調整する。水分量は、該溶液の凍結の方法（後述）によって異なる。急速に溶液を凍結させる場合は、１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬの範囲から選択される。好ましくは１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられ、より好ましくは１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬの範囲が、更に好ましくは１．５〜３．５ｍｇ／ｍＬの範囲が、更により好ましくは１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられる。溶液を急速に凍結させない場合は、１．５〜３．５ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられ、好ましくは１．５〜３．０ｍｇ／ｍＬの範囲が、より好ましくは１．５〜２．５ｍｇ／ｍＬの範囲が、更に好ましくは１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲が挙げられる。
（３）濾過工程
溶液を、滅菌用のフィルターを用いて無菌濾過を行う。
（４）分注工程
無菌化した溶液の所定量をバイアルに充填する。
（５）凍結工程
凍結乾燥機の棚温度を溶液の凍結温度以下に設定し、バイアルを置き、凍結させる。或いは、溶液の凍結温度以上に設定し、バイアルを置き、一定の冷却速度で凍結温度まで冷却させて凍結させる。（４）および（５）の工程は、吸湿を防止しながら行うことが好ましい。凍結は急速に行うのが好ましい。本明細書において、「急速に凍結させる」とは、２０分以内に凍結させることをいうが、凍結は、１５分以内に行うことがより好ましく、さらに１０分以内、特に２〜１０分で行うことが特に好ましい。
（６）凍結乾燥工程
凍結乾燥機内を減圧し、凍結乾燥する。
製造方法２
（１）溶解工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）・一水和物を２−メチル−２−プロパノールに加え、室温で粉砕懸濁する。２−メチル−２−プロパノールの量はシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）１ｇ（無水物に換算して）に対し、１２．５ｍｌ±５％の範囲から選択される。懸濁液に２−メチル−２−プロパノールを加え、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）１ｇ（無水物に換算して）当たり、２−メチル−２−プロパノールが２５０ｍＬとなるように調整する。温度を約３０〜４０℃にし、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）・一水和物を溶解させる。本工程に使用される２−メチル−２−プロパノールは医薬品製造に用いることができる品質のものであればよく、好ましくは、蒸留した２−メチル−２−プロパノールを用いる。
（２）水分調整工程
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の２−メチル−２−プロパノール溶液の水分量を、カールフィッシャー水分計等を用いて測定する。測定した水分量をもとに、溶液の水分量が約１．０〜約５．０ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水を添加する。本工程に使用する蒸留水としては、無菌のものが望ましく、具体的には注射用蒸留水が挙げられる。（１）および（２）の工程はアイソレーター中で行うことが好ましい。
（３）濾過工程
溶液を、窒素加圧（圧力：通常、１．５ｋｇｆ／ｃｍ２以下、好ましくは０．１〜０．９ｋｇｆ／ｃｍ２）し、孔径約０．２μｍのフィルターを用いて無菌濾過を行う。使用するフィルターは有機溶媒用のものが好ましい。
（４）分注工程
無菌化した溶液の所定量をバイアルに充填する。例えば、２０ｍｇ製剤の場合は５ｍＬ、７０ｍｇ製剤の場合は１７．５ｍＬ、８０ｍｇ製剤の場合は２０ｍＬ充填する。
（５）凍結工程
凍結乾燥機の棚温度を−４０℃に設定し、その上に半打栓したバイアルを置く。２０分以内、好ましくは１５分以内（より好ましくは２〜１０分）でバイアル中の溶液を凍結させる。（４）および（５）の工程は、低湿度環境下（環境温度：２８〜３５℃、相対湿度：５〜４０％）にて吸湿を防止しながら行うことが好ましい。
（６）凍結乾燥工程
凍結乾燥機内を減圧し、凍結乾燥する。凍結乾燥は、以下のように行うことが好ましい。
一次乾燥条件：棚温度−２０〜１０℃、真空度０．１〜５Ｔｏｒｒ
二次乾燥条件：棚温度４０〜６０℃、真空度０．１〜１Ｔｏｒｒ。
本発明の注射用凍結乾燥製剤の投与量は、一般に成人に対して、主薬として、１〜５００ｍｇ／日である。投与方法としては、例えば局所動注が挙げられ、特に肝動注が好ましい。
本発明の注射用凍結乾燥製剤は、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル等に懸濁した状態で投与することができる。この場合、主薬の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍＬが望ましい。上述の方法により製造した凍結乾燥製剤をヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルに懸濁した場合には、時間の経過に伴う、粘度上昇および懸濁液の層分離を抑制できることが明らかになった（実験例参照）。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［実験例１］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（４ｇ）に２−メチル−２−プロパノール（１０００ｍｌ）を加え、超音波を３０分間照射し、３０〜４０℃で攪拌して溶解した（実験例２以下では、この溶液を「薬液」という）。この溶液をフィルター（孔径０．２２μｍ）でろ過し、無菌化した。この溶液を５ｍＬずつバイアルに充填した。３０℃に設定された棚にバイアルを置き、約２時間かけて徐々に−４０℃まで冷却しながら凍結させた。これを凍結乾燥し、様々の粒径（以下の「実験例１−１」にて測定する）の注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）を得た。
［実験例１−１］
前記注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに４ｍＬのミリスチン酸イソプロピルを加えて懸濁し、オリンパス製正立式微分干渉顕微鏡を用いて粒子形状を観察すると共に、島津製作所製レーザー回折式粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００を用いて粒度を測定した。結果を図１、図２に示す。
島津製作所製レーザー回折式粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００における粒度の測定条件としては以下の通りである。
・懸濁希釈溶媒 ：ＩＰＭ−ＥＸ（ミリスチン酸イソプロピル）
・測定時の主薬濃度 ：約０．０３ｍｇ／ｍＬ
・屈折率 ：２．４０−０．２０ｉ
・分布基準 ：体積
・ふるい上下 ：ふるい下
・分布関数 ：無変換
・スムージングレベル：０
・データシフト ：０
・測定回数 ：１回
・測定吸光度範囲 ：最大値０．２００、最小値０．０１０
その結果、粒子形状の観察結果からは２つのタイプに大別された。１つは、殆どの粒子が不定形で、中には５０〜１００μｍを超えるような大きい不定形粒子を含むロット、もう一つは、殆どの粒子が５〜２０μｍの球状粒子からなるロットであった。また、これらのロットの粒度は、表１に示すようにＤ９０％値が５０〜１００μｍ、１０〜３０μｍの２タイプに分類された。粒度分布プロファイルを図２に示す。このうち、Ｄ９０％値が１０〜３０μｍであるロット（製剤Ｎｏ．５および６）が本発明の実施例に相当し、それ以外のロット（製剤Ｎｏ．１〜４）が比較例に相当する（表１）。
実験例１で得られた注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．７ｍｇ／ｍＬ）を加えることで、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）の懸濁液を得た。懸濁液の主薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬである。その後、室温にて静置し、経時的粘度変化を測定した。
粘度測定に用いる簡易粘度計の校正を実施した。粘度校正用標準液（日本工業規格ＪＩＳ Ｚ８８０９）ＪＳ５０、ＪＳ２００を簡易粘度計の流下孔より吸い取り、規定距離の流下時間をストップウォッチにて２回計測し、秒単位で小数点以下２桁まで記録した。得られた２回の流下時間の平均値（秒単位で小数点以下２桁まで）をもとに、（１）式より各標準液でのＫ値を小数点以下４桁まで求めた。さらに、各標準液でのＫ値を平均して小数点以下４桁まで求め、使用する簡易粘度計のＫ値とした。粘度校正用標準液は恒温器等で液温を２０℃に保っておき、取り出した後直ちに測定した。
Ｋ値＝２０℃での動粘度［ｍｍ２／ｓ］÷流下時間の平均値［ｓｅｃ］
（１）式
次に、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁液の粘度を、バイアルごとに経時的に室温下で測定した。すなわち、検定された簡易粘度計の流下孔より、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁液を吸い取り、規定距離の流下時間をストップウォッチにて２回計測し、秒単位で小数点以下２桁まで記録した。得られた２回の流下時間の平均値（秒単位で小数点以下１桁まで）をもとに、粘度を（２）式より計算し、小数点以下１桁まで求めた。
粘度［ｍＰａ・ｓ］＝ 流下時間の平均値［ｓｅｃ］×Ｋ値×ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルの密度１．２８１［ｇ／ｃｍ２］ （２）式
粘度測定の結果を図３に示す。
実験例１−１及び実験例１−２の結果から、粘度上昇の違いに粒度或いは粒子形状が関与することが示唆された。
［実験例２］
次に凍結前の薬液の水分量を変化させた場合に、凍結乾燥後の製剤物性がどのように変化するか調べた。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物を２−メチル−２−プロパノールで溶解した後、カールフィッシャー水分計を用いて水分量を測定し、水分量が０．５ｍｇ／ｍＬ〜６．０ｍｇ／ｍＬとなるように計算量の注射用蒸留水を添加し、異なる水分量の薬液をそれぞれ調製した。水分量１〜４ｍｇ／ｍＬのロットが本発明の実施例に相当し、それ以外のロットが比較例に相当する。各薬液をフィルター（孔径：０．２２μｍ）で無菌ろ過した。この各薬液を５ｍＬずつバイアルに充填し、半打栓した。３０℃に設定された棚にバイアルを置き、約２時間かけて徐々に−４０℃まで冷却しながら凍結させた。これを凍結乾燥し、注射用凍結乾燥製剤を得た。
［実験例２−１］
実施例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、実験例１−２と同じ方法により、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の粘度変化を評価した。結果を図４に示す。凍結前の水分量が増加するに従い、経時的な粘度上昇は抑制されることが分かった。
［実験例２−２］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、実験例１−１と同じ方法で、粒度分布を測定した。結果を図５、図６、表２に示す。
［実験例２−３］
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤２０ｍｇに４ｍＬのミリスチン酸イソプロピルを加えて懸濁し、実験例１−１と同じ方法により懸濁液中の粒子形状を、オリンパス製微分干渉顕微鏡を用いて観察した。その結果を図７に示す。凍結乾燥前の水分量が約０．５ｍｇ／ｍＬ未満の場合は、殆どの粒子が不定形で、約５０〜約１００μｍを超える不定形粒子が含まれていた。粒子表面は凸凹としての規則性は認められなかった。凍結乾燥前の水分量が増加し、約１．５〜約３．０ｍｇ／ｍＬでは、殆どの粒子が約５〜約３０μｍの球状粒子で、不定形粒子は殆ど認められなかった。水分量の増加に従い、粒子個々が大きくなり球状粒子表面が針状化しだした。更に、水分量が約５．０ｍｇ／ｍＬになると、約３０〜約５０μｍの球状粒子表面が針状化した粒子となった（表３）。
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、懸濁後、二層に分離せず均一な懸濁液として安定に存在できる時間を測定した。注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）に１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ）を加えて懸濁し、経時的に懸濁液の溶状を観察した。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い、主薬が懸濁液下層に沈降し、二層に分離するまでの時間が短くなる傾向が認められた（表４）。
実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルによる懸濁操作性を比較した。実験例２で得られた注射用凍結乾燥製剤（２０ｍｇ）に１ｍＬのヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ）を加え、以下のいずれの操作で、均一な懸濁液が調製できるかを評価した。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルを添加し、バイアルを回しながら主薬と馴染ませた後、手で軽く振とう攪拌するたけで均一に懸濁するものを「容易」とし、以上の操作だけでは十分均一にならず、手でバイアル底を叩くように振動させないと懸濁できないものを「困難」とした。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い、懸濁性は困難となる傾向が認められた（表５）。
凍結乾燥前の薬液の水分量を約１．５〜約６ｍｇ／ｍＬの範囲で変化させ、無菌ろ過し、バイアル充填し、これを様々な凍結条件で凍結乾燥させて２０ｍｇ製剤および８０ｍｇ製剤を作製した。そして、得られた製剤について、粒度（Ｄ９０％値）、粒子形状、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の粘度変化と懸濁後の安定性（二層分離せずに均一な懸濁液として存在できる時間）及び懸濁性を評価した。
［実験例３−１］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、粒度（Ｄ９０％値）及び粒子形状を評価した。粒度は、実験例１の方法と同じく製剤をミリスチン酸イソプロピルに懸濁し、レーザー回折式粒度分布計（ＳＡＬＤ−３０００、島津製作所製）を用いて測定した。結果を図８及び図９に示す。粒子形状は、実験例１と同様に製剤をミリスチン酸イソプロピルに懸濁し、懸濁液中の粒子形状をオリンパス製正立式微分干渉顕微鏡により観察した。結果を図１０に示す。
その結果、２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤共に、いずれの凍結条件においても実験例２で認められたように凍結乾燥前の薬液の水分量によって、粒度（Ｄ９０％値）及び粒子形状が変化した。２０ｍｇ製剤では、いずれの凍結条件においても凍結乾燥前の薬液の水分量を約２．０〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲にすることで、Ｄ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍの球状粒子であることが確認された。−４０℃凍結及び３０℃に仕込み、１時間で−４０℃まで冷却する条件（以下、「３０℃→−４０℃／１ｈ条件」と表す）では、凍結乾燥前の薬液の水分量がもっと高い場合でもＤ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍ程度の球状粒子であることが確認された。他の凍結条件では水分量が約３．０ｍｇ／ｍＬ以上で、ロット間及びバイアル間でＤ９０％値が大きくばらついた。
８０ｍｇ製剤では、−４０℃凍結及び３０℃→−４０℃／１ｈ凍結条件において凍結乾燥前の薬液の水分量が約１．５〜約３．０ｍｇ／ｍＬまでの範囲でＤ９０％値は３３μｍ以下となり、特に−４０℃凍結においては凍結乾燥前の薬液の水分量が約１．５〜約５．０ｍｇ／ｍＬまでの範囲で、Ｄ９０％値は３３μｍ以下となり、粒子形状観察において約１０〜約２０μｍ程度の球状粒子であることが確認された。その他の凍結条件では、Ｄ９０％値が３３μｍ以下の凍結乾燥製剤を得るための薬液の水分量範囲が、約０．５ｍｇ／ｍＬ程度と狭くなり、−４０℃凍結に比べＤ９０％値が大きくなった。これらのことから、Ｄ９０％値の制御、粒子形状の制御の観点からは、−４０℃凍結条件が最も優れていた（表７）。
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の室温放置２４時間後の粘度変化を評価した。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（水分量０．４〜０．７ｍｇ／ｍＬ）を各製剤に主薬濃度約２０ｍｇ／ｍＬとなるように加え均一に懸濁し、室温で２４時間静置後の粘度を、実験例１−２に記載の方法に従い簡易式流下式粘度計にて測定した。その結果を図１１に示す。全ての凍結条件において凍結乾燥前の薬液の水分量が高い程粘度は低く、同じ水分量では他の凍結条件に比べ−４０℃凍結の方が、８０ｍｇ製剤よりも２０ｍｇ製剤の方が、粘度が高くなる傾向が認められた。
更に、Ｄ９０％値と懸濁２４時間後の粘度を図１２に示す。凍結条件、製剤用量に関わらず、凍結前の薬液水分量が１．５ｍｇ／ｍＬ以上での不定形粒子を殆ど含まない製剤については、Ｄ９０％値が大きくなるに従い懸濁２４時間後の粘度は低く、粘度上昇しにくいことがわかった。
［実験例３−３］
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、実験例２と同じ方法により、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後、二層に分離せず均一な懸濁液として安定に存在できるか検討した。その結果、いずれの条件でも凍結前の水分量の増加に伴い、懸濁後の経過時間が長くなると主薬が懸濁液下層に沈降し二層に分離する傾向が認められた。この傾向は２０ｍｇ製剤より８０ｍｇ製剤の方が少ない水分量から認められた。しかし、−４０℃凍結条件の場合は、３０℃から徐々に−４０℃に冷却して凍結させる条件に比べ、水分量が多い場合でも二層に分離しにくく均一な懸濁液として安定に存在できた。
懸濁後の安定性とＤ９０％値及び粒子形状の関係を調べたところ、製剤の用量及び凍結条件に関わらず、Ｄ９０％値が４０μｍ以上と大きくなり、それに伴い粒子形状も球状粒子表面から針状化してくるに従い二層分離しやすくなることがわかった（表８）。
実験例３で得られた２０ｍｇ製剤と８０ｍｇ製剤について、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルによる懸濁操作性を実験例２と同じ方法で比較した。その結果、凍結前の水分量の増加に伴い懸濁性は困難となり、２０ｍｇ製剤より８０ｍｇ製剤の場合の方が少ない水分量から懸濁性が困難となった。しかし、−４０℃凍結条件の場合は、３０℃から徐々に−４０℃に冷却して凍結させる条件に比べ、水分量が多い場合でも懸濁性は良好であった（表９）。
［実験例４］
水分量約１．５〜約６ｍｇ／ｍＬの薬液を調製後、０．２μｍフィルターで無菌ろ過した液としない液のそれぞれを様々な条件で凍結させて凍結乾燥し、２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。そして、無菌ろ過有無による粒度への影響について比較した。結果を図１３に示す。尚、無菌ろ過前の薬液は無色透明であった。
無菌ろ過の有無によりＤ９０％値に差が認められた。同じ水分量では無菌ろ過した方がＤ９０％値は小さくなった。この違いは、３０℃に仕込み後約２．２時間で−４０℃まで冷却する条件（３０℃→−４０℃／２．２ｈ）或いは３０℃に仕込み後４時間で−４０℃まで冷却する条件（３０℃→−４０℃／４ｈ）の凍結条件でより顕著な差として認められた。
次に、約２〜約３．５ｍｇ／ｍＬの水分量の薬液を無菌ろ過し、別途薬液から析出した主薬粉末を、微量添加し、−４０℃で凍結し、共和真空製凍結乾燥機を用いて２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。そして得られた凍結乾燥製剤について、主薬析出粉末の添加有無による粒度及び粒子形状への影響について調べた。結果を図１４に示す。２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤共に、何れの水分量においても主薬粉末を添加した場合は、Ｄ９０％値は僅かに大きくなった。粒子形状は、主薬粉末らしき不定形な粉末片が僅かに認められたが、Ｄ９０％値の大きさに応じた球状粒子を有しており、明らかな変化は認められなかった。
［実施例５］
−４０℃凍結条件では、凍乾機仕込み時の薬液温度が変動すると凍結速度が変化し、ロット間或いはロット内で粒度にバラツキが生じることが懸念された。そこで、約１．５〜約４．０ｍｇ／ｍＬの水分量に調整後無菌ろ過された薬液を、薬液温度を約２８℃〜約４０℃の範囲で変動させてから−４０℃にまで凍結させ、凍結乾燥後の粒度への影響を調べた。結果を図１５、図１６に示す。その結果、凍結前の薬液温度が上昇するに従いＤ９０％値は小さくなり粒度分布もシャープになった。従って、液調温度（約３５〜約４０℃）及び充填環境温度（約３０℃）を制御し、仕込み時の薬液温度の急激な低下を防止することで、粒度に与える影響は少なくなった。
［実施例６］
製造スケールが大きくなり凍結乾燥機の庫内棚上に次々にバイアルが仕込まれると、−４０℃に設定された棚温は、薬液からの熱により上昇する。又、凍結乾燥機の性能によっては、−４０℃の制御可能幅も異なる。スケールアップ時の、製造条件の至適化及び設備選定の観点から、−４０℃凍結条件における棚温の許容幅を調べた。薬液の水分量を約１．５〜約４．０ｍｇ／ｍＬに調整し、無菌ろ過し、５℃〜−４５℃の棚温で、仕込み、凍結させ、凍結乾燥し、２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤を作製した。得られた製剤の粒度及び粒子形状を上述の方法により評価し、仕込み時の棚温度の違いによる影響について検討した。その結果を図１７、図１８、及び図１９に示す。２０ｍｇ製剤及び８０ｍｇ製剤ともに、仕込み時の棚温が−２０℃以上の場合は、仕込み時の棚温度の上昇に伴いＤ９０％値は大きくなった。しかし、−４５℃〜−２０℃の棚温度で凍結した場合は、Ｄ９０％値を約３０μｍに制御することができた。
仕込み時棚温度が５℃の場合は、Ｄ９０％値は大きくなり、狭い範囲の水分量幅でしか約４０μｍのＤ９０％値に制御することができなかった。粒子形状についても−２０℃以下の棚温度の場合に比べ低い水分量でも粒子表面の針状化が確認された。凍結乾燥前の薬液水分量が約４．０ｍｇ／ｍＬの２０ｍｇ製剤において、５℃仕込み後数分でバイアル底面から凍結が始まるバイアルと、仕込み後約３０分経過してから一瞬で凍結したバイアルに分類した。前者（図１７の×プロット）のＤ９０％値は約３０μｍで、粒子表面が針状化していた。後者（図１７の◇プロット）のＤ９０％値は約１０μｍと小さく、１０μｍ程度の球状粒子であった。
［実験例７］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（以下、原薬ともいう）を、２−メチル−２−プロパノールに溶解する方法を検討した。
ホモジナイザーで原薬を細かく粉砕した高濃度懸濁液を調製し、これを液調濃度まで２−メチル−２−プロパノールを加えて溶かすことで溶解させる方法について検討した。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物に、濃度約８０ｍｇ／ｍＬ（液調濃度の約２０倍）となるように２−メチル−２−プロパノールを加え、特殊機化工業（株）社製ＴＫロボミックスを用いて約５０００〜約１００００ｒｐｍで約１０分間粉砕懸濁した。これを液調濃度約４．０ｍｇ／ｍＬとなるように２−メチル−２−プロパノールを加え、マグネットスターラーで攪拌した。作業中の薬液温度は約３５〜約４０℃に維持し、原薬が完全に溶解したことを確認した。その結果、本操作により主薬の溶解が従来の溶解方法（超音波懸濁後、マグネットスターラー攪拌）に比べ短時間で可能となり、主薬分解等による黒色異物も発生しないことがわかった。
次にホモミキサー攪拌により含量及び類縁物質に影響しないか検討した。シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物に、液調濃度約４．０ｍｇ／ｍＬとなるように２−メチル−２−プロパノールを加えた。これを２本の三角フラスコにそれぞれ調製した。１本の三角フラスコは、超音波照射後、液温約４０℃にてスターラー攪拌した。残りの１本の三角フラスコは、ホモジナイザーと同様の機構で粉砕溶解するＩＫＡ社製ポリトロン粉砕機（粉砕径Ｇ８）を用いて、液温約４０℃にて約１００００ｒｐｍで攪拌した。原薬が溶解した時点をそれぞれ０時間目として攪拌を継続し、経時的に薬液をサンプリングし、溶状の観察及び含量と類縁物質を測定した。その結果、いずれの攪拌方式とも、黒色異物等は認められず、表１０に示すように含量及び類縁物質についても変化は認められなかった。
凍結乾燥時の製剤の飛散抑制及び乾燥工程短縮化の両者を満たす乾燥条件の検討を行った。
薬液５ｍＬを充填し、半打栓した１８ｍＬバイアル（２０ｍｇ製剤に相当）及び薬液２０ｍＬを充填し半打栓した３０ｍＬバイアル（８０ｍｇ製剤に相当）を凍結乾燥機に仕込み、凍結し、様々な真空度及び棚温にて一次乾燥を行った。同時に、庫内のぞき窓から昇華状況が観察できるようにブランク溶液（２−メチル−２−プロパノール）も同様に充填して一次乾燥を行った。庫内のぞき窓からブランク溶液が全て昇華しなくなったことを確認後、二次乾燥（真空度約１．０Ｔｏｒｒまで１時間で到達させ、その後棚温４０℃で６時間乾燥）を実施した。二次乾燥終了後、打栓を行い飛散状況を観察した。
乾燥工程における昇華速度に影響するのは品温である。品温に影響するのは棚温と真空度である。サンプルの昇華界面の品温は真空度に依存し、アントワンの式より品温と蒸気圧の理論値を求めることができる。しかし、サンプルの昇華界面以下の凍結相は、棚温からの熱供給の影響を受けバイアル底部に近づくほど高くなる。この凍結相上下での品温差が大きいほど昇華速度は大きくなるが、逆に、バイアル底部の昇華力がバイアル上部の昇華面を押し上げるように突沸し、飛散が起こりやすくなる。そこで、昇華界面の理論品温と棚温（バイアル底部付近の品温に近似）の差が大きすぎないように、棚温と真空度を様々に変化させ、その際の昇華速度と主薬の飛散度合いを目視により確認し、その評価結果を表１１にまとめた。なお、「飛散レベル」は、“よく観察するとバイアル肩口に飛散がある”（レベルＡ）、“バイアル肩口への飛散がレベルＡより多め”（レベルＢ）、“バイアル肩口だけでなく半打栓ゴム栓の裏面に飛散による主薬付着を認める”（レベルＣ）の３段階に分類した。
［実験例９］
シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）・一水和物（原薬）に対し、濃度が約４．０ｍｇ／ｍｌになるように２−メチル−２−プロパノールを加え、超音波処理後、約３０℃〜約４０℃に加温しながら攪拌し、完全に溶解させた。この溶液に水を段階的に添加することで水分含量が約１．５〜約６．０ｍｇ／ｍＬの範囲の数種類の溶液を調整し、それぞれ均一になるように攪拌した。その後、該溶液を加圧タンクに入れ、窒素加圧（圧力：１ｋｇ／ｃｍ２以下）による気密系にて孔径０．２μｍのフィルターを用いて無菌濾過を行った。濾液１７．５ｍＬを低湿度環境下（環境温度：２８〜３５℃、相対湿度：５〜４０％）にて吸湿を防止しながらバイアルに充填し、半打栓を施した後、直ちに棚温が−４０℃の凍結乾燥機の棚にバイアルを置き、１０〜２０分かけて凍結させた。凍結乾燥（初期排気：棚温度−４０℃、一次乾燥条件：棚温度−１℃、真空度５Ｔｏｒｒ、二次乾燥条件：棚温度４０℃、真空度１Ｔｏｒｒ）を行い、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）の７０ｍｇ注射用凍結乾燥製剤を得た。
各水分量の７０ｍｇ注射用凍結乾燥製剤を粒度と粘度変化を実験例１−１及び実験例１−２に記載の方法で測定した。その結果を図２０および図２１に示す。
［試験例］
本願発明の凍結乾燥製剤（以下、単に凍結乾燥製剤という。）のリピオドール懸濁液を用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルにおける薬効を検討した。
凍結乾燥製剤は実験例２の方法に従って作製した２０ｍｇ製剤、凍結条件は徐冷却条件（凍結速度：３０℃→−４０℃／約２時間）、仕込み時水分量は１．５〜２ｍｇ／ｍＬ、粒度はＤ９０％で２０μｍ以下のものを使用した。
本試験例の記載における略号ＬＰＤは、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル（リピオドールウルトラフルイド）を表す。該ＬＰＤは、三井製薬株式会社（現 日本シエーリング）から入手したものを使用した。
（試験系）
１）細胞
熊本大学より分与されたラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを、後記実験方法の３）腫瘍移植の項に示した手順に従って、雄性Ｄｏｎｒｙｕラットの肝臓内移植によりｉｎ ｖｉｖｏ継代して維持したものを試験に使用した。
２）ラット
日本チャールス・リバー株式会社より購入した雄性Ｄｏｎｒｙｕラットを使用した。
（実験方法）
１）試薬、試液および器材
▲１▼全身麻酔剤は、大日本製薬株式会社のネンブタール注射液を使用した。
▲２▼Ｈａｎｋｓ液は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬのＨａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用した。
▲３▼留置針は、テルモ株式会社のサーフローフラッシュ１８Ｇ×２”を使用した。
▲４▼止血用ゼラチンスポンジは、山之内製薬株式会社のスポンゼルを使用した。
▲５▼ポリエチレンチューブは、株式会社夏目製作所のポリエチレンチューブＳＰ１０を使用した。
▲６▼コンドロイチン硫酸製剤は、科研製薬株式会社の１％コンドロン注を使用した。
▲７▼ヘパリン含有生理食塩水は、大塚製薬株式会社の大塚生食注に、ＧＩＢＣＯＢＲＬのブタ由来ヘパリンを２０Ｕ／ｍｌになるように添加したものを使用した。
▲８▼電子ノギスは、日本測定工具株式会社の電子デジタルノギスＭＡＸ−ＣＡＬを使用した。
▲９▼シリンジはハミルトン製の５０μｌ容マイクロシリンジを使用した。
２）動物飼育
飼育室の飼育環境は、温度が２０℃以上２６℃以下、湿度が３０％以上７０％以下、明暗サイクルが午前８時点灯、午後８時消灯の１２時間明期および１２時間暗期とした。使用する餌は日本クレア株式会社のＣＬ−２とした。給水は、給水ビンで行った。
３）腫瘍移植
▲１▼全身麻酔下で担癌ラットを開腹し、肝臓からＡＨ１０９Ａの固形腫瘍塊を摘出した。全身麻酔剤は腹腔内に約５０ｍｇ／ｋｇで投与した。以下すべて全身麻酔は同様に行った。
▲２▼摘出した腫瘍塊をＨａｎｋｓ液中でハサミを使って細断し、１ｍｍ角程度の移植腫瘍片を調製した。
▲３▼全身麻酔下で、正常ラットの腹部をバリカンで剃毛し、イソジンで消毒した後、開腹した。
▲４▼留置針のカテーテル部位を用いて、▲２▼で調製した移植腫瘍片を肝臓左葉内に移植した。カテーテル部位の先端は、ハサミで鋭角に切断しておいた。図２２のように、カテーテル部位３の先端から、移植腫瘍片１と同程度の大きさに細切した止血用ゼラチンスポンジ２、移植腫瘍片１の順に充填し、カテーテル部位３の先端から１ｃｍ程度までを肝臓内に刺入した。カテーテル部位３のシリンジ接続側から、移植腫瘍片１をゼラチンスポンジ２ごとポリエチレンチューブ４で押し込んだ後に、カテーテル部位３を抜去した。
▲５▼肝臓が癒着することを防止する目的で、コンドロイチン硫酸製剤とヘパリン含有生理食塩水を腹腔内に添加した。コンドロイチン硫酸製剤の添加量は、１個体あたり０．１ｍｌとした。また、ヘパリン含有生理食塩水は、肝臓全体が浸る程度まで添加した。
▲６▼腹部を絹糸で縫合し、縫合部分をイソジンで消毒した後、飼育ケージにもどした。
４）投与液の調製
凍結乾燥製剤のＬＰＤ懸濁液は、２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
凍結乾燥製剤２０ｍｇにＬＰＤを１ｍｌ添加し、均一になるまで懸濁した。この投与液は投与日毎に用時調製し、調製後は投与時まで室温で保存した。
５）薬効評価
▲１▼ＡＨ１０９Ａを肝臓内に移植して１９日または２０日間飼育したラットを、全身麻酔下で腹部を剃毛し、イソジンで消毒した後、開腹した。
▲２▼腫瘍生着の有無を確認し、腫瘍が生着していた個体については、腫瘍の長径と短径を電子ノギスを用いて計測した。
▲３▼次式により腫瘍面積を計算した。腫瘍面積（ｍｍ２）＝腫瘍の長径（ｍｍ）×腫瘍の短径（ｍｍ）。
腫瘍面積が１００〜２５０ｍｍ２の担癌ラットを使用した。
▲４▼実験群は、無処置群、擬手術群、ＬＰＤ投与群、凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群の４群とした。
▲５▼薬剤の投与経路はすべて肝動脈内投与とした。肝動脈内投与は、カテーテルとしてポリエチレンチューブを接続した５０μｌ容マイクロシリンジで行った。カテーテルを胃十二指腸動脈より挿入し、先端が総肝動脈と固有肝動脈の分岐部に達するように固定した後、薬剤を２０μｌ投与した。薬剤投与後、カテーテルを胃十二指腸動脈より抜去し、カテーテル挿入部位の前後で胃十二指腸動脈を絹糸で結紮した。ただし、無処置群は、開腹して腫瘍径を計測するのみとし、擬手術群は、胃十二指腸動脈を絹糸で結紮するのみとした。
▲６▼全群とも、処置・投与後に腹部を絹糸で縫合し、縫合部分をイソジンで消毒した後、飼育ケージにもどした。
▲７▼１週間飼育した後、全身麻酔下で開腹した。
▲８▼前述のように、電子ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を計測した。
（結果の評価方法、解析に使用する統計学的方法）
（１）個体の腫瘍増殖率の計算
次式により、個体毎に腫瘍増殖率を計算した。腫瘍増殖率（％）＝１００（％）×投与１週間後の腫瘍の長径（ｍｍ）×同短径（ｍｍ）／投与時の腫瘍の長径（ｍｍ）×同短径（ｍｍ）
（２）多重比較検定の方法および薬効の評価方法
各群７検体について、以下の評価を行った。各群について、腫瘍増殖率の平均値と標準偏差を計算した。その後、以下に示す多重比較検定を行った。
▲１▼手術操作およびＬＰＤの腫瘍増殖に対する影響
無処置群、擬手術群およびＬＰＤ投与群の３群について、無処置群をコントロール群として２元型に改変したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行った。擬手術群またはＬＰＤ投与群に、無処置群と比較して、腫瘍増殖率に統計学的な有意な差が有り（ｐ値＜０．０５）、かつ腫瘍増殖率の平均値に、無処置群の平均値との差が２５％以上ある場合、手術操作自体またはＬＰＤが腫瘍の増殖には影響すると評価することとした。
▲２▼薬剤の有効性
ＬＰＤ投与群、及び凍結乾燥製済／ＬＰＤ投与群の２群について、ＬＰＤ投与群をコントロール群として、上記▲１▼と同様に、２元型に改変したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行った。ＬＰＤ投与群に比べて、腫瘍増殖率が有意に低く（ｐ値＜０．０５）、かつ腫瘍増殖率の平均値が２５％以上低い薬剤投与群については、その群の薬剤が有効であると評価した。また、腫瘍増殖率の平均値が１００％未満であった薬剤投与群については、その群の薬剤には腫瘍退縮効果があると評価した。
（結果と考察）
（１）手術操作およびＬＰＤの腫瘍増殖に対する影響
擬手術群では、無処置群と比較して、腫瘍増殖率の平均値は１１％低かったが、２群間の腫瘍増殖率に有意な差はなかった（ｐ値；０．９２８５）。また、ＬＰＤ投与群では、無処置群と比較して、腫瘍増殖率の平均値は２８％低かったが、２群間の腫瘍増殖率に有意な差はなかった（ｐ値；０．６６８６）。
したがって、ラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルでは、投与部位である胃十二指腸動脈を結紮する手術操作自体、あるいは媒体であるＬＰＤの投与のいずれも、腫瘍の増殖には影響しないことが示された（表１２）。
（２）本願発明の凍結乾燥製剤の有効性
投与液量を個体あたり２０μｌで一定にして、臨床での投与液濃度に調製したＬＰＤ懸濁液を用い、投与１週間後の腫瘍増殖率を指標に、ラット肝癌肝動脈内投与モデルで、凍結乾燥製剤の有効性を検討した。
凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群では、全例とも腫瘍増殖率が１００％未満であった（表１２）。凍結乾燥製剤／ＬＰＤ投与群では、ＬＰＤ投与群と比較して、腫瘍増殖率の平均値が１１８％低く、腫瘍増殖率が有意に低かった（ｐ値＜０．０００１）。
したがって、ラット腹水肝癌細胞株ＡＨ１０９Ａを用いたラット肝癌肝動脈内投与モデルでは、本発明の凍結乾燥製剤／ＬＰＤは有効であり、腫瘍退縮効果を示した。
本発明により、経時による、層分離や粘度変動が生じ難く、懸濁性が良好な、投与時に取り扱いやすい、シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）の凍結乾燥製剤が提供されるようになった。
本出願は、日本で出願された特願２００１−２９０２６５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、製剤Ｎｏ．１（実験例１）の凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図であり、図１Ｂは、製剤Ｎｏ．５（実験例１）の凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図２は、実験例１における各ロットの凍結乾燥製剤粒子の粒度分布プロファイルである。
図３は、実験例１における、凍結乾燥製剤のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の経時的粘度変化を示す図である。
図４は、実験例２における、凍結前の薬液水分量とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁後の経時的粘度変化を示す図である。
図５は、実験例２における、薬液の水分量の違いによる凍結乾燥後の粒度分布プロファイルである。
図６は、実験例２における、凍結前の薬液水分量と凍結乾燥製剤粒子のＤ９０％値の関係を示す図である。
図７Ｂ〜Ｄは、実験例２における凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図であり、図７Ａは、図７Ｂ〜Ｄにおける倍率でのスケールの顕微鏡観察の出力図である（最小目盛りは１０μｍ）。図７Ｂは、凍結前の薬液水分量が３．０ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（球状）の出力図であり、図７Ｃは、凍結前の薬液水分量が５．０ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（針状）の出力図であり、図７Ｄは、凍結前の薬液水分量が０．５ｍｇ／ｍＬである凍結乾燥製剤粒子（不定形）の出力図である。
図８は、実験例３における、２０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図９は、実験例３における、８０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図１０Ａ〜Ｆは、実験例３における凍結乾燥製剤粒子の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。図１０Ａは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｂは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、繊維状）の出力図であり、図１０Ｃは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、微繊維状）の出力図であり、図１０Ｄは、凍結乾燥製剤粒子（２０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｅは、凍結乾燥製剤粒子（８０ｍｇ製剤、球状）の出力図であり、図１０Ｆは、凍結乾燥製剤粒子（８０ｍｇ製剤、微繊維状）の出力図である。
図１１は、実験例３における、凍結条件と凍結前の薬液水分量と凍結乾燥製剤のヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度を示す図である。
図１２は、実験例３における、Ｄ９０％値とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度の関係を示す図である。
図１３は、実験例４における、凍結条件及びろ過処理の有無と凍結乾燥製剤の粒度の関係を示す図である。
図１４は、実験例４における、主薬析出粉末添加および薬液水分量とＤ９０％値の関係を示す図である。
図１５は、実施例５における、凍結前の薬液温度の違いによるＤ９０％値への影響を示す図である。
図１６は、実施例５における、凍結前の薬液温度の違いによる粒度分布プロファイルへの影響を示す図である。
図１７は、実施例６における、仕込み時の棚温度と凍結乾燥製剤の粒度の関係を示す図である。
図１８は、実施例６における、投入時の棚温度の異なる凍結乾燥製剤の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図１９は、実施例６における、５℃の棚で凍結した凍結乾燥製剤の微分干渉顕微鏡観察の出力図である。
図２０は、実施例９における、７０ｍｇ製剤の薬液水分量及び凍結条件とＤ９０％値の関係を示す図である。
図２１は、実施例９における、７０ｍｇ製剤の凍結前の薬液水分量とヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステル懸濁２４時間後の粘度を示す図である。
図２２は、試験例の留置針のカテーテル部位を示す図である。図２２中、符号１は移植腫瘍片を、符号２は止血用ゼラチンスポンジを、符号３はカテーテル部位を、符号４はポリエチレンチューブをそれぞれ表す。
図２３は、凍結乾燥製剤の製造フロー概略図である。
Claims (10)
- 粒子径が３〜２５μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤。
- Ｒ１がテトラデカノイルオキシ基である請求の範囲第１項記載の凍結乾燥製剤。
- 粒子径が５〜２０μｍを中心に分布する、請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
- Ｄ９０％値が３３μｍ以下である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
- Ｄ９０％値が３０μｍ以下である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
- 下記工程を含む方法で製造されるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアルカノイルオキシ基を表す）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（Ｒ１）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程。 - 凍結を１５分以内に行う請求の範囲第６項記載の凍結乾燥製剤。
- 上記（２）において、溶液の水分量を１．５〜５．０ｍｇ／ｍＬに調整する請求の範囲第６項または第７項のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
- 上記（２）において、溶液の水分量を１．５〜４．０ｍｇ／ｍＬに調整する請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。
- 下記工程を含む方法で製造される、粒子径が３〜２５μｍを中心に分布し、Ｄ９０％値が４０μｍ以下の粒度分布であるシス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を主成分とする凍結乾燥製剤：
（１）シス［（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’）ビス（テトラデカノイルオキシ）］白金（ＩＩ）を２−メチル−２−プロパノールに溶解する工程；
（２）該溶液の水分量を１．０〜６．０ｍｇ／ｍＬに調整する工程；
（３）該溶液を急速に凍結させる工程；および
（４）該凍結溶液を凍結乾燥する工程。
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