ES2248847T3 - Composiciones y metodos para tratar o prevenir enfermedades de las vias de conduccion del cuerpo. - Google Patents

Composiciones y metodos para tratar o prevenir enfermedades de las vias de conduccion del cuerpo.

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ES2248847T3 ES97921563T ES97921563T ES2248847T3 ES 2248847 T3 ES2248847 T3 ES 2248847T3 ES 97921563 T ES97921563 T ES 97921563T ES 97921563 T ES97921563 T ES 97921563T ES 2248847 T3 ES2248847 T3 ES 2248847T3
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William L. Hunter
Lindsay S. Machan
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University of British Columbia
Angiotech Pharmaceuticals Inc
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR O PREVENIR ENFERMEDADES ASOCIADAS A PASOS DEL CUERPO, QUE COMPRENDEN LA ETAPA DE ADMINISTRAR UN AGENTE TERAPEUTICO A UNA PORCION EXTERIOR DEL PASO DEL CUERPO. ENTRE EJEMPLOS REPRESENTATIVOS DE AGENTES TERAPEUTICOS SE INCLUYEN FACTORES ANTI - ANGIOGENICOS, AGENTES ANTI - PROLIFERATIVOS, AGENTES ANTI - INFLAMATORIOS Y ANTIBIOTICOS.

Description

Composiciones y métodos para tratar o prevenir enfermedades de las vías de conducción del cuerpo.
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente a composiciones y métodos para tratar o prevenir enfermedades de las vías de conducción del cuerpo, y más específicamente, a composiciones que comprenden agentes terapéuticos que se pueden suministrar a las paredes exteriores de vías de conducción del cuerpo.
Antecedentes de la invención
Existen muchas vías de conducción dentro del cuerpo que permiten el flujo de materiales esenciales. Éstas incluyen, por ejemplo, arterias y venas, el esófago, estómago, intestino delgado y grueso, tracto biliar, uréter, vejiga, uretra, vías nasales, tráquea y otras vías de conducción, y el tracto reproductor masculino y femenino. Lesiones, diversos procesos quirúrgicos, o enfermedad pueden dar lugar a estrechamiento, debilitamiento y/o obstrucción de tales vías de conducción del cuerpo, que dan lugar a serias complicaciones y/o incluso la muerte.
Por ejemplo, muchos tipos de tumores (tanto benignos como malignos) pueden dar lugar a daños en la pared de una vía de conducción del cuerpo o a la obstrucción del lumen, disminuyendo o impidiendo por ello el flujo de materiales a través de la conducción. Sólo en 1996, se ha estimado que más de 11.200 muertes tendrán lugar en Estados Unidos debidas a cáncer de esófago, más de 51.000 muertes debidas a cáncer de intestino delgado y grueso y aproximadamente 17.000 muertes debidas a cáncer del recto. La obstrucción en las vías de conducción del cuerpo que son afectadas por cáncer no es solamente en sí misma amenazadora de muerte, también limita la calidad de vida del paciente.
El tratamiento principal para la mayoría de tumores que causan obstrucción neoplástica es la extirpación quirúrgica y/o quimioterapia, radioterapia o terapia con láser. Desafortunadamente, en el tiempo en que un tumor causa una obstrucción en una vía de conducción del cuerpo es, con frecuencia, inoperable y generalmente no responderá a terapias tradicionales. Un enfoque para este problema ha sido la inserción de lo que en inglés se denomina "stents", en lo sucesivo traducido por "tubos de malla metálica" endoluminales. En resumen, los tubos de malla metálica son dispositivos colocados en el lumen de una vía de conducción del cuerpo que ha sido bloqueada por un tumor u otros tejidos/sustancias. Ejemplos representativos de tubos de malla metálica corrientemente desplegados incluyen el Wallstent, tubo de malla metálica de Stecker, tubo de malla metálica de Gianturco y tubo de malla metálica de Palmaz (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 5.102.417, 5.195.984, 5.176.626, 5,147.370, 5.141.516, 4.776.337). Un inconveniente importante, sin embargo, para el uso de tubos de malla metálica en obstrucción neoplástica es que el tumor es capaz, con frecuencia, de crecer en el lumen a través de los intersticios del tubo de malla metálica. Además, la presencia de un tubo de malla metálica en el lumen puede inducir el crecimiento hacia adentro de tejido reactivo o inflamatorio (por ejemplo, vasos sanguíneos, fibroblastos, y glóbulos blancos) sobre la superficie del tubo de malla metálica. Si este crecimiento hacia adentro (compuesto de células tumorales y/o células inflamatorias) alcanza la superficie interna del tubo de malla metálica y compromete al lumen, el resultado es un re-bloqueo de la vía de conducción del cuerpo que la inserción del tubo de malla metálica pretendía corregir.
Otras enfermedades, que aunque no neoplásticas, sin embargo suponen proliferación, pueden asimismo obstruir las vías de conducción del cuerpo. Por ejemplo, el estrechamiento de la uretra prostática debido a hiperplasia prostática benigna es un serio problema que afecta al 60% de todos los hombres de más de 65 años de edad y al 100% de los hombres con más de 80 años de edad. Los tratamientos farmacológicos actuales, tales como inhibidores de 5-alfa-reductasa (por ejemplo, Finasteride) o bloqueadores alfa-adrenérgicos (por ejemplo, Terazozan) generalmente sólo son eficaces en una población limitada de pacientes.
Por tanto, de los procedimientos quirúrgicos que se pueden realizar [por ejemplo, resección trans-uretral de la próstata (TURPs), prostatectomía abierta o procedimientos endo-urológicos tales como prostatectomía de láser, uso de microondas, hipotermia, criocirugía o uso de tubos de malla metálica), típicamente dan lugar a numerosas complicaciones tales como sangría, infección, incontinencia, impotencia y enfermedad recurrente.
Además de enfermedades neoplásticas o proliferantes, otras enfermedades tales como enfermedad vascular pueden resultar en el estrechamiento, debilitamiento y/o obstrucción de las vías de conducción del cuerpo. De acuerdo con estimaciones de 1993 (fuente - Hoja interna de U.S. Heart and Stroke Foundation) por encima de 60 millones de americanos tienen una o más formas de enfermedad cardiovascular. Estas enfermedades reclamaron 954.138 vidas en el mismo año (41% de todas las muertes en los EE.UU.).
La angioplastia con globo (con o sin tubo de malla metálica) es uno de los tratamientos más usados para enfermedad vascular; también están disponibles otras opciones tales como angioplastia con láser. Aunque éste es el tratamiento de elección en muchos casos de estrechamiento severo de la vasculatura, aproximadamente un tercio de pacientes que experimentan angioplastia con globo (fuente: hoja interna de Heart and Stroke Foundation) han renovado el estrechamiento de las arterias tratadas (reestenosis) dentro de los 6 meses del procedimiento inicial; a veces suficientemente grave como para necesitar posteriores intervenciones.
Tales enfermedades vasculares (que incluyen, por ejemplo reestenosis) se deben, al menos en parte, al engrosamiento íntimo resultante de la migración de células vasculares de músculos lisos (denominadas en lo sucesivo VSMC), proliferación de VSMC, y deposición extra-celular de matriz. Brevemente, el endotelio vascular actúa como una superficie no trombogénica sobre la cual, la sangre puede fluir suavemente y como una barrera que separa los componentes de la sangre de los tejidos que comprenden la pared de los vasos. Células epiteliales también desprenden sulfato de heparina, prostaciclina, EDRF y otros factores que inhiben la adhesión de plaquetas y leucocitos, contracción de VSMC, migración de VSMC y proliferación de VSMC. Cualquier pérdida o daño al endotelio, tal como ocurre durante angioplastia con globo, aterectomía, o inserción de tubos de malla metálica, puede resultar en adhesión de plaquetas, agregación de plaquetas y formación de trombos. Plaquetas activadas pueden liberar sustancias que producen vasoconstricción (serotonina y tromboxano) y/o promover la migración y proliferación de VSMC (PDGF, factor epidérmico del crecimiento derivado de plaquetas, TGF-\beta y heparinasa). Factores del tejido desprendidos por las arterias estimulan la formación de coágulos que resulta en una matriz de fibrina en la que células de músculo liso pueden migrar y proliferar.
Esta cascada de acontecimientos conduce a la transformación de células de músculos vasculares lisos de fenotipo contráctil a uno secretorio. La lisis celular inducida por angioplastia y la destrucción de matriz resulta en desprendimiento local del factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) que, a su vez, estimula la proliferación de VSMC directamente e indirectamente a través la inducción de producción de PDGF. Además de PDGF y bFGF, la proliferación de VSMC es estimulada, también, por EGF desprendido de plaquetas y factor-1 de desarrollo de insulina.
Células de músculos lisos vasculares son, también, inducidas a migrar a la túnica media y túnica íntima del vaso. Esto es facilitado por desprendimiento y activación de metaloproteasas de matriz que degradan un camino para las VSMC a través de la matriz extra-celular y lámina elástica interna de la pared del vaso. Después de migración y proliferación, las células de músculos lisos vasculares depositan una matriz extra-celular que consiste en glicosaminoglicanos, elastina y colágeno que comprende la parte más extensa del engrosamiento de la túnica íntima. Una porción importante del proceso de reestenosis puede ser debida a la reconstrucción de la pared muscular que conduce a cambios en el tamaño general de la arteria; al menos algo de lo cual es secundario para la proliferación dentro de la adventicia (además de la túnica media). El resultado neto de estos procesos es una recidiva del estrechamiento de la pared vascular que, con frecuencia, es suficientemente severa para requerir una nueva intervención.
En resumen, virtualmente cualquier manipulación enérgica en el lumen de un vaso sanguíneo dañará o desgastará su revestimiento endotelial. Por tanto, opciones de tratamiento para las propias enfermedades vasculares y para reestenosis después de intervenciones terapéuticas continúan siendo problemas importantes con respecto a resultados a largo plazo para tales condiciones.
Además de las obstrucciones neoplásticas y enfermedad vascular existe también un número de enfermedades inflamatorias crónicas y agudas que dan lugar a obstrucciones de las vías de paso del cuerpo. Éstas incluyen, por ejemplo, vasculitis, enfermedades del tracto intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa) y enfermedades del tracto respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar opilativa crónica).
Cada una de estas enfermedades se puede tratar, con varios grados de éxito, con medicaciones tales como anti-inflamatorios o inmunosupresores. Sin embargo, los tratamientos corrientes, con frecuencia son ineficaces en retardar la progresión de la enfermedad y pueden dar lugar a toxicidad sistémica y efectos secundarios indeseables. También pueden utilizarse procedimientos quirúrgicos en lugar de, o además de tratamientos médicos. Tales procedimientos quirúrgicos, sin embargo, tienen una alta proporción de recidiva local debida a la formación de cicatrices y pueden, en ciertas
condiciones (por ejemplo, a través del uso de catéteres de globo) dar lugar a un crecimiento excesivo reactivo benigno.
Otras enfermedades que pueden obstruir, también, las vías de conducción del cuerpo incluyen enfermedades infecciosas. Brevemente, existe un número de procesos infecciosos crónicos y agudos que pueden dar lugar a la obstrucción de vías de conducción del cuerpo que incluyen, por ejemplo, uretritis, prostatitis, y otras enfermedades del tracto reproductor masculino, diversas enfermedades del tracto reproductor femenino, cistitis y uretritis (enfermedades del tracto urinario), bronquitis crónica, tuberculosis y otras infecciones por micobacterias y otros problemas respiratorios y ciertas enfermedades cardiovasculares.
Tales enfermedades se tratan actualmente con una variedad de diferentes tratamientos terapéuticos y/o por procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, tal como se describe más arriba, tales tratamientos terapéuticos tienen la dificultad de toxicidad sistémica asociada, que puede dar lugar a efectos secundarios indeseables. Además, tal como se describe más arriba, procedimientos quirúrgicos pueden dar lugar a recidiva local debida a la formación de cicatrices, y en ciertos procedimientos (por ejemplo, inserción de tubos de malla metálica, disponibles comercialmente), pueden dar lugar a un crecimiento excesivo reactivo benigno.
Los tratamientos existentes para las enfermedades y condiciones de más arriba en la mayor parte participan las mismas limitaciones. El uso de agentes terapéuticos no han dado lugar a la inversión de estas condiciones y cada vez que una intervención se usa para tratar las condiciones, existe un peligro para el paciente como resultado de la respuesta del cuerpo a la intervención. La presente invención proporciona composiciones y métodos apropiados para tratar las condiciones y enfermedades que se describen generalmente más arriba. Estas composiciones y métodos se dirigen a los problemas asociados con los procedimientos existentes, ofrecen importantes ventajas si se comparan con los procedimientos existentes y, además, proporcionan otras ventajas afines.
El documento WOA/9319739 se refiere a excipientes polímeros para fármacos. El documento USA/3797485 se refiere a la administración de fármacos a la sangre en circulación.
Reimer Riessen et al., J. Am. Coll. Vol 23, No. 5, 1994, 1234-1244 es una revisión de los mecanismos de administración de fármacos.
El documento WOA/9503036 se refiere al uso de paclitaxel para tratar reestenosis.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al uso de paclitaxel o uno de sus análogos o derivados, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades de las vías de conducción del cuerpo o enfermedades asociadas con la obstrucción o estrechamiento de vías de conducción del cuerpo, en la que el medicamento se ha de administrar a una porción de dicha vía de conducción.
Realizaciones adicionales de la invención se especifican en las reivindicaciones.
Los métodos para tratar o prevenir las enfermedades de vías de conducción del cuerpo para los que la invención es útil, comprenden la etapa de administrar a las células del músculo liso de dichas vías de conducción del cuerpo, vía el órgano adventicio, el agente terapéutico. Al administrar el compuesto terapéutico localmente al sitio de la enfermedad, efectos secundarios sistémicos e indeseables se pueden evitar y las dosis totales se pueden reducir potencialmente. La administración por cuadrantes o periféricamente alrededor de la vía de conducción enferma evita también muchas de las desventajas de manipulación endoluminal, que incluye daño al revestimiento epitelial del tejido. Por ejemplo, el daño al endotelio puede dar lugar a trombosis, cambios en las formas de flujo laminar y/o a una reacción extraña del cuerpo a un dispositivo endoluminal, cualquiera de los cuales puede iniciar la cascada de reestenosis. En el caso de enfermedad prostática, evitar la instrumentación de la uretra puede reducir la posibilidad de estrechuras y preservar la continencia y potencia.
En ciertas realizaciones de la invención, los agentes terapéuticos pueden comprender, también, un polímero tal como, por ejemplo poli(etileno-acetato de vinilo) (reticulado en un 40%), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), copolímeros de poli(ácido láctico) (PLA) y poli(caprolactona), gelatina, ácido hialurónico, matrices de colágeno y albumen. Otros excipientes (por ejemplo liposomas) pueden utilizarse, asimismo, para contener y/o administrar uno o más agentes terapéuticos.
Los agentes terapéuticos se pueden utilizar para tratar o prevenir una amplia variedad de enfermedades, que incluyen por ejemplo, enfermedades vasculares, obstrucciones neoplásticas, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas. Vías de conducción del cuerpo representativas que se pueden tratar incluyen, por ejemplo, arterias, el esófago, el estómago, el duodeno, el intestino delgado, el intestino grueso, tractos biliares, el uréter, vejiga, la uretra, la próstata, conductos lagrimales, la tráquea, bronquios, bronquiolos, vías nasales, trompas de Eustaquio, el canal auditivo externo, útero y trompas de Falopio.
En una realización particularmente preferida de la invención, el agente terapéutico se administra a una arteria por inyección directa, vía una pared exterior de la arteria, en la parte adventicia.
Con fines simplemente de información, ciertas realizaciones para las que la invención es útil son métodos para tratar enfermedades vasculares (por ejemplo, estenosis), enfermedades gastrointestinales, enfermedades genitourinarias (por ejemplo, hipertrofia prostática benigna o cáncer de próstata) y enfermedades pulmonares (ejemplos específicos de cada una de las de más arriba se describen más abajo con más detalle) administrando a las vías de conducción del cuerpo afectadas por la enfermedad, paclitaxel o sus análogos o derivados.
Estos y otros aspectos de la presente invención quedarán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos anexos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una gráfica que representa el efecto de opsonización de plasma de microesferas polímeras, sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos [20 mg/mL de microesferas en 0,5 mL de células (conc. 5 x 10^{6} células/mL) a microesferas de PCL.
La figura 2 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir plasma \pm 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos 5 x 10^{6} células/mL) a microesferas de PCL.
La figura 3 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir plasma \pm 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos (5 x 10^{6} células/mL) a microesferas de PMMA.
La figura 4 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir plasma \pm2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos (5 x 10^{6} células/mL) a microesferas de PLA.
La figura 5 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir plasma \pm2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos (5 x 10^{6} células/mL) a microesferas de EVA-PLA.
La figura 6 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir lgG (2 mg/mL) ó 2% de Pluronic F127 sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos a microesferas de PCL.
La figura 7 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir lgG (2 mg/mL) ó 2% de Pluronic F127, luego lgG (2 mg/mL) sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos a microesferas de PMMA.
La figura 8 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir lgG (2 mg/mL) ó 2% de pluronic F127 y luego lgG (2 mg/mL) sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos a microesferas de PVA.
La figura 9 es una gráfica que representa el efecto de pre-revestir lgG (2 mg/mL) ó 2% de Pluronic F127, luego lgG (2 mg/mL) sobre la respuesta de quimiluminiscencia de neutrófilos a microesferas de EVA:PLA.
La figura 10A es una gráfica que representa el efecto de la relación de la mezcla de polímeros EVA:PLA sobre la agregación de microesferas.
La figura 10B es una micrografía electrónica de barrido que presenta el tamaño de microesferas "pequeñas". La figura 10C (que incluye una inserción - marcada "inserción 10C") es una micrografía electrónica de barrido que presenta el tamaño de microesferas "grandes". La figura 10D es una gráfica que representa el transcurso del tiempo de desprendimiento de paclitaxel in vitro de microesferas de mezcla de polímeros de EVA:PLA cargadas con paclitaxel al 0,6% peso/volumen, en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) a 37ºC. Los círculos blancos son microesferas de tamaño "pequeño" y los círculos negros son microesferas de tamaño "grande". La figura 10E es una fotografía de una CAM que presenta los resultados de desprendimiento de paclitaxel por microesferas ("MS"). La figura 10F es una fotografía similar a la de 10E con mayor aumento.
La figura 11A es una gráfica que representa perfiles de velocidad de desprendimiento de microesferas de policaprolactona que contienen 1%, 2%, 5% ó 10% de paclitaxel en disolución salina tamponada con fosfato a 37ºC. La figura 11B es una fotografía que presenta una CAM tratada con microesferas de control. La figura 11C es una fotografía que presenta una CAM tratada con microesferas cargadas con 5% de paclitaxel.
Las figuras 12A y 12B son dos gráficas que presentan respectivamente el desprendimiento de paclitaxel de películas de EVA, y el porcentaje de paclitaxel que permanece en esas mismas películas con respecto al tiempo. La figura 12C es una gráfica que presenta el hinchamiento de películas de EVA/F127 sin nada de paclitaxel a lo largo del tiempo. La figura 12D es una gráfica que presenta el hinchamiento de películas de EVA/Span 80 sin nada de paclitaxel a lo largo del tiempo. La figura 12E es una gráfica que presenta una curva de esfuerzo versus deformación para diversas mezclas de EVA/F127.
Las figuras 13A y 13B son dos gráficas que representan el punto de fusión de mezclas de polímeros de PCL/MePEG en función del % de MePEG en la formulación (13A) y el incremento, en porcentaje, del tiempo necesario para que la pasta de PCL a 60ºC esté sólida, en función de la cantidad de MePEG en la formulación (13B). La figura 13C es una gráfica que representa la blandura de mezclas variables de polímeros de PCL/MePEG. La figura 13D es una gráfica que representa el cambio de peso en tanto por ciento, con respecto al tiempo, de mezclas de polímeros de diversas concentraciones de MePEG. La figura 13E es una gráfica que representa la velocidad de desprendimiento de paclitaxel con respecto el tiempo, en diversas mezclas de polímeros cargadas con 1% de paclitaxel. Las figuras 13F y 13G son gráficas que representan el efecto de cantidades variables de paclitaxel sobre la cantidad total de paclitaxel desprendido de una mezcla al 20% de MePEG/PCL. La figura 13H es una gráfica que representa el efecto de MePEG sobre la resistencia a la tracción de un polímero de MePEG/PCL.
La figura 14 es una gráfica que representa el desprendimiento de paclitaxel de diversas formulaciones polímeras.
La figura 15 es una gráfica que representa, a lo largo del tiempo, el desprendimiento de de paclitaxel de pastas de PCL en PBS a 37ºC. Las pastas de PCL contienen micropartículas de paclitaxel y diversos aditivos preparados usando malla # 140. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 muestras.
La figura 16 es una gráfica que representa el transcurso del tiempo de desprendimiento de paclitaxel a partir de pastas de paclitaxel-gelatina-PCL en PBS a 37ºC. La gráfica presenta los efectos de la concentración de gelatina (malla # 140) y el tamaño de las partículas de paclitaxel:gelatina (1:1) preparadas usando malla # 140 ó malla # 60. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 muestras.
Las figuras 17 A y 17 B son gráficas que representan el efecto de aditivos (17A; malla # 140) y el tamaño de micropartículas (17B; malla # 140 ó malla # 60) y la proporción del aditivo (malla # 140) sobre el comportamiento de hinchamiento de pastas de PCL que contienen 20% de paclitaxel después de suspensión en agua destilada a 37ºC. Las medidas para la pasta preparada con micropartículas de 270 \mum en paclitaxel-gelatina y pasta que contenía 30% de gelatina se interrumpieron después de 4 horas debido a la desintegración de la matriz. Las barras de errores representan la desviación estándar de 3 muestras.
Las figuras 18A, 18B, 18 C y 18D son microfotografías electrónicas de barrido representativas de pastas de paclitaxel-gelatina-PCL (20:20:60) antes (18A) y después (18B) de suspensión en agua destilada a 37ºC durante 6 horas. Las micrografías 18C y 18D son mayores ampliaciones de 18B, que presentan la íntima asociación de paclitaxel (con forma de bastoncitos) y matriz de gelatina. Las figuras 19A y 19B son fotomicrografías representativas de CAMs tratadas con pastas de gelatina-PCL (19A) y paclitaxel-gelatina-PCL (20:20:60; 19B) que presentan zonas sin vascularidad en la CAM tratada con paclitaxel.
La figura 20 es una tabla que presenta el efecto de inyección peri-tumoral de pasta de paclitaxel-gelatina-PCL en ratones con tumores establecidos.
La figura 21 es una tabla que presenta la temperatura de fusión, entalpía, peso molecular, polidispersidad y viscosidad intrínseca de composiciones de PDLLA-PEG-DLLA.
La figura 22 es una gráfica que representa termogramas de DSC de PDLLA-PEG-PDLLA y PEG. La velocidad de calentamiento fue de 10ºC/min. Véase figura 21 para temperaturas de fusión y entalpías.
La figura 23 es una gráfica que representa el desprendimiento acumulativo de paclitaxel a partir de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA cargados con 20% de paclitaxel en tampón de PBS albúmina a 37ºC. Las barras de errores representan la desviación estándar de 4 muestras. Los cilindros de 40% de PEG se interrumpieron a los 4 días por causa de desintegración.
Las figuras 24A, 24B y 24C son gráficas que representan el cambio de dimensiones, longitud (A), diámetro (B) y peso en húmedo (C) de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA cargados con 20% de paclitaxel, durante el desprendimiento in vivo de paclitaxel a 37ºC.
La figura 25 es una gráfica que representa cromatogramas de permeabilidad de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA (20% de PEG, 1 mm de diámetro) cargados con 20% de paclitaxel durante el desprendimiento en tampón de PBS albúmina a 37ºC.
La figura 26 es una tabla que presenta la pérdida de masa y el cambio de composición de polímeros de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA (cargados con 20% de paclitaxel) durante el desprendimiento en tampón de PBS albúmina a 37ºC.
Las figuras 27A, 27B, 27C y 27D son SEMs de cilindros secos de PDLLA-PEG-PDLLA (cargados con 20% de paclitaxel, 1 mm de diámetro), antes y durante el desprendimiento de paclitaxel. A: 20% de PEG, día 0; B: 30% de PEG, día 0; C: 20% de PEG, día 69; D: 30% de PEG, día 69.
La figura 28 es una gráfica que representa el desprendimiento acumulativo de paclitaxel a partir de mezclas de PDLLA-PCL cargadas con 20% de paclitaxel y PCL en tampón de PBS albúmina a 37ºC. Las barras de errores representan las desviaciones estándar de 4 muestras.
La figura 29 es una tabla que presenta la eficacia de formulaciones de pasta quirúrgica cargadas con paclitaxel aplicadas localmente a tumor subcutáneo en ratón.
La figura 30 es una gráfica que representa el efecto de irradiación en el desprendimiento de paclitaxel.
La figura 31 es una gráfica que representa el intervalo de tamaños de partículas para microesferas de control (PLLA:GA - 85:15).
La figura 32 es una gráfica que representa el intervalo de tamaños de partículas de microesferas cargadas con 20% de paclitaxel (PLLA:GA - 85:15).
La figura 33 es una gráfica que representa el intervalo de tamaños de partículas de microesferas de control (PLLA:GA - 85:15).
La figura 34 es una gráfica que representa el intervalo de tamaños de partículas de microesferas cargadas con 20% de paclitaxel (PLLA:GA -85:15).
Las figuras 35A, 35B y 35C son gráficas que representan el intervalo de tamaños de partículas para diversas proporciones de PLLA y GA.
Las figuras 36A y 36B son gráficas que representan el intervalo de tamaños de partículas con diversas proporciones de PLLA y GA.
Las figuras 37A, 37 B y 37C son gráficas que representan el intervalo de tamaños de partículas para diversas proporciones de PLLA y GA.
\newpage
Las figuras 38A y 38B son gráficas que representan el intervalo de tamaños de partículas para diversas proporciones de PLLA y GA.
La figura 39 es una tabla que presenta los pesos moleculares, valores de CMC y cargas máximas de paclitaxel de copolímeros de dibloques seleccionados.
Las figuras 40A y 40B son gráficas que representan la disolución de cristales de paclitaxel en agua (37ºC) por los copolímeros y Cremophor El. 40A: efecto de la concentración de copolímero en Cremophor (20 horas de incubación); 40B: efecto del tiempo (concentración de 5% de de copolímero o Cremophor).
Las figuras 41A y 41B son gráficas que representan la turbiedad (absorbancia de UV-VIs a 450 nm) de disoluciones de paclitaxel micelar a temperatura ambiente (22ºC). La concentración de paclitaxel era de 2 mg/mL en agua. La carga de paclitaxel era de 10%, excepto que la carga de MePEG 5000-30/70 era de 5%.
La figura 42 es una gráfica que representa el desprendimiento de paclitaxel a partir de microcápsulas de paclitaxel-nailon.
La figura 43A es una gráfica que presenta el efecto de paclitaxel/PCL sobre el crecimiento de tumores. Las figuras 43B y 43C son dos fotografías que presentan el efecto del control, y termopasta cargada con 10% y 20% de paclitaxel sobre el crecimiento de tumores.
La figura 44 es una gráfica de barras que representa la distribución de tamaños de microesferas en número [5% de poli(etileno-acetato de vinilo) con 10 mg de suramina sodio en 5% de PVA].
La figura 45 es una gráfica de barras que representa la distribución de tamaños de microesferas en peso [5% de poli(etileno-acetato de vinilo) con 10 mg de suramina sodio en 5% de PVA].
La figura 46 es una gráfica que representa el peso de encapsulado de suramina sodio en 50 mg de poli(etileno-acetato de vinilo).
La figura 47 es una gráfica que representa el porcentaje de encapsulado de suramina sodio en 50 mg de poli(etileno-acetato de vinilo).
La figura 48 es una gráfica de barras que representa la distribución de tamaños en peso de microesferas con 5% de ELVAX que contienen 10 mg de suramina sodio fabricadas en 5% de PVA que contiene 10% de NaCl.
La figura 49 es una gráfica de barras que representa la distribución de tamaños en peso de 5% de microesferas que contienen 10 mg de suramina sodio fabricadas en 5% de PVA que contiene 10% de NaCl.
La figura 50 es una gráfica de barras que representa la distribución de tamaños, en número, de 5% de microesferas que contienen 10 mg de suramina sodio fabricadas en 5% de PVA que contiene 10% de NaCl.
La figura 51A es una fotografía de suramina y acetato de cortisona en una CAM (Mag = Bx). Brevemente, esta imagen presenta una zona no vascular tratada con 20 mg de suramina y 70 mg de acetato de cortisona en 0,5% de metilcelulosa. Obsérvense los vasos sanguíneos situados en la periferia de la zona no vascular que están siendo redirigidos lejos de la fuente del medicamento.
La figura 51B es una fotografía que presenta el detalle vascular de la región afectada, con mayor aumento (Mag = 20x). Obsérvense las regiones no vasculares y el típico efecto de "codo" de los vasos sanguíneos que bordean la zona no vascular.
Las figuras 52A, B, C, D y E presentan el efecto de desprendimiento de MTX (metotrexato) de PCL a lo largo del tiempo.
La figura 53 es una fotografía de microesferas cargadas con 10% de metotrexato, fabricadas a partir de PLA:GA (50:50); número de viscosidad logarítmica "\eta_{Ln}" = 0,78.
La figura 54 es una gráfica que representa el desprendimiento de vanadil-sulfato con carga del 10%, a partir de PCL.
La figura 55 es una fotografía de microesferas de ácido hialurónico que contienen sulfato de vanadio.
La figura 56A es una gráfica que representa el desprendimiento de vanadato orgánico a partir de PCL. La figura 58B representa el porcentaje de vanadato orgánico que permanece en el transcurso del tiempo.
La figura 57 es una fotografía que representa microesferas de poli(ácido D,L-láctico) que contiene vanadato orgánico.
Las figuras 58A y 58B son gráficas que representan el transcurso del tiempo de desprendimiento de BMOV del PCL (lámina de150 mg. (A) \mug de medicamento desprendido ó (B) % de medicamento que permanece en la lámina. Carga inicial de BMOV en PCL dada por (o), 5%; (\bullet), 10%; (\Delta), 15%; (\blacktriangle), 20%; (\sqbullet), 30% y (v), 35%.
Las figuras 59A y 59B son gráficas que presentan el transcurso del tiempo de desprendimiento de BMOV a partir de láminas de 150 mg de PCL:MePEG(80:20, en peso) expresado como: (A) mg de medicamento desprendido o (B) % de medicamento que permanece en la lámina. Carga inicial de BMOV en PCL: MePEG dado por (O), 5%; (\bullet), 10%; \Delta; 15%; \blacktriangle, 20%.
Las figuras 60A, 60B y 60C son microfotografías electrónicas de barrido de (60A): arriba), cristales de BMOV; (60B: en medio), morfología superficial de la lámina de PCL que contiene 20% de BMOV al comienzo del experimento de desprendimiento del medicamento y (60C: abajo), morfología superficial de la lámina de PCL que contiene 20% de BMOV al final del experimento de desprendimiento del medicamento (72 días en PBS).
Las figuras 61A y 61B son dos gráficas que presentan el efecto de incrementar la concentración de VMOV, en la supervivencia de células usando una exposición de 1 hora de células a BMOV (61A) o exposición continua a BMOV (61B). Células descritas por (O), células de colon HT-29; (\bullet), células de mama MCF-7; (\Delta), células de pulmón no pequeñas Skmes-1 y (\blacktriangle) células de tuétano de hueso normal.
La figura 62 es una tabla que presenta el efecto de pasta cargada de BMOV en los pesos de tumores MDAY-D2 desarrollados en ratones. Brevemente, pasta de PCL (150 mg) que contenía 25%, 30%, ó 35% de BMOV se inyectó subcutáneamente en un ratón que tenía tumores MDAY-2. Los pesos del tumor se determinaron después del tratamiento de 10 días. Esta tabla presenta los resultados de dos experimentos separados, que usaron (parte superior de la tabla) 25% de BMOV y (parte inferior de la tabla) 30% ó 35% de BMOV. Los datos de control describen el ratón tratado con PCL que no contenía BMOV.
La figura 63 es una tabla que establece los efectos de pasta de PCL:MePEG cargada con BMOV sobre los pesos de tumores RIF-1 desarrollados en ratón. Brevemente, tumores RIF-1 se desarrollaron en ratón durante 5 días, en cuyo tiempo 90% del tumor se separó quirúrgicamente y el sitio de recesión se trató con 150 mg de pasta de PCL:MePEG (80:20, peso/peso) que o bien no contenía BMOV (control) o contenía 5% de BMOV. El nuevo desarrollo del tumor se determinó en los días 4, 5 y 6 siguientes a este tratamiento.
Las figuras 64A y 64B son dos gráficas. La figura 64A presenta el efecto del incremento de carga de BEMOV en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg), en el transcurso del tiempo, de BEMOV desprendido en 15 mL de PBS/ALB. La figura 64B presenta, también, el efecto del aumento de carga de BEMOV en termopasta de PCL (gránulo de150 mg), en el transcurso del tiempo, de BEMOV desprendido en 15 mL de PBS/ALB. El desprendimiento de medicamento se expresa en forma de % de BEMOV que permanece en el gránulo.
Las figuras 65A y 65B son dos gráficas. La figura 66A presenta el efecto del incremento de carga de V5 en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg), en el transcurso del tiempo, de V5 desprendido en 15 mL de PBS/ALB. La figura 65B presenta, también, el efecto del incremento de carga de V5 en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg), en el transcurso del tiempo, de V5 desprendido en 15 mL de PBS/ALB. El desprendimiento de medicamento se expresa en forma de % de V5 que permanece en el gránulo.
Las figuras 66A y 66B son dos gráficas. La figura 66A presenta el efecto de incremento de carga de PRC-V en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg), en el transcurso del tiempo, de PRC-V desprendido en 15 mL de PBS/ALB. La figura 66B presenta, también, el efecto del incremento de carga de PRC-L en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg), en el transcurso del tiempo, de PRC-V desprendido en 15 mL de PBS/ALB. El desprendimiento de medicamento se expresa en forma de % de PRC-V que permanece en el gránulo.
Las figuras 67A, 67B, 67C y7 67D son una serie de gráficas que presentan el efecto de diferentes concentraciones de carga de MePEG en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg) con 5% de BMOV (67A), 10% de BMOV (67B), 15% de BMOV (67C) y 20% de BMOV (67D) en el transcurso de tiempo de BMOV desprendido en 15 mL de PBS/ALB.
Las figuras 68A, 68B, 68C y 68D son una serie de gráficas que presentan el efecto de diferentes concentraciones de cargas de MePEG en termopasta de PCL (gránulo de 150 mg) con 0% de MePEG (68A), 5% de MePEG (68B), 10% de MePEG (68C), y 15% de MePEG (68D) en el transcurso del tiempo de BMOV desprendido en 15 mL de PBS/ALB. El desprendimiento de fármaco se expresa en forma de % de BMOV que permanece en el gránulo.
Las figuras 69A y 69B son fotografías de microesferas de PLLA revestidas de fibronectina en tejido de vejiga (69A) y microesferas de poli((L-lisina) en tejido de vejiga.
Las figuras 70A y 70B son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta (no cargada) de control. Brevemente, en la figura 70A la masa blanca central es el tejido tumoral. Obsérvese la abundancia de vasos sanguíneos que penetran desde la CAM en todas direcciones. El tumor induce el crecimiento hacia dentro de la vasculatura huésped a través de la producción de "factores angiogénicos". El tejido tumoral se expande de forma distal a lo largo de los vasos sanguíneos que lo abastecen. La figura 70B es una vista desde debajo de la CAM presentada en 70A. Brevemente, esta vista presenta el aspecto radial de los vasos sanguíneos que penetran en el tumor de manera semejante a los radios de una rueda. Obsérvese que la densidad de vasos sanguíneos es mayor en la proximidad del tumor que lo es en el tejido de CAM normal circundante. Las figuras 70C y 70D son dos fotografías de una CAM que tiene un tumor tratado con termopasta cargada con 20% de paclitaxel. Brevemente, en la figura 70C, la masa blanca central es el tejido tumoral. Obsérvese el pequeño número de vasos sanguíneos en la vecindad del tejido tumoral. El desprendimiento sostenido del inhibidor de angiogénesis es capaz de vencer el estímulo angiogénico producido por el tumor. El propio tumor está pobremente vascularizado y está bajando progresivamente de tamaño. La figura 70D está tomada desde debajo de la CAM presentada en 70C y presenta la interrupción de flujo sanguíneo en el tumor, si se compara con el tejido tumoral de control. Obsérvese que la densidad de vasos sanguíneos es reducida en la vecindad del tumor y está más esparcida que la del tejido de CAM normal circundante.
Descripción detallada de la invención
Antes de exponer la invención, puede ser útil para su comprensión, establecer definiciones de ciertas expresiones que se usarán a continuación.
Vía de conducción del cuerpo
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a cualquiera de un número de vías de conducción, tubos, tuberías, tractos, canales, senos, o conductos que tienen un lumen interior y permiten el flujo de materiales dentro del cuerpo. Ejemplos representativos de vías de conducción del cuerpo incluyen arterias y venas, conductos lagrimales, la tráquea, bronquios, bronquiolos, fosas nasales (que incluyen los senos) y otras vías respiratorias, trompas de Eustaquio, canales auditivos externos, cavidades bucales, el esófago, el estómago, el duodeno, el intestino delgado, el intestino grueso, tractos biliares, el uréter, la vejiga, la uretra, las trompas de Falopio, útero, vagina y otras vías de conducción del tracto reproductor femenino, los conductos deferentes y otras vías de conducción del tracto reproductor masculino y el sistema ventricular (fluido cerebroespinal) del cerebro y médula espinal.
Agente terapéutico
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a paclitaxel o sus análogos o derivados.
Tal como se sugiere más arriba, la presente invención proporciona el uso de paclitaxel para la fabricación de un medicamento para métodos de tratar o prevenir enfermedades de vías de conducción del cuerpo, que comprende la etapa de suministrar a una porción externa de la vía de conducción del cuerpo (es decir, una superficie no luminal), un medicamento que comprende paclitaxel o su análogo o derivado, y en realizaciones preferidas, una composición comprende paclitaxel o sus análogos o derivados y un excipiente polímero. Brevemente, la administración de un agente terapéutico a una porción externa de una vía de conducción del cuerpo (es decir, por cuadrantes o circunferencialmente) evita muchas de las desventajas de planteamientos tradicionales que llevan consigo manipulación endoluminal. Además, la administración de un agente terapéutico, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, permite la administración de mayores cantidades del agente terapéutico con menos restricción para el volumen a suministrar.
Tal como se discute más abajo con más detalle, los agentes terapéuticos se pueden suministrar a porciones externas de vías de conducción del cuerpo, con excipiente o sin excipiente (por ejemplo, polímero), con el fin de tratar o prevenir una enfermedad asociada con la vía de conducción del cuerpo. Cada uno de estos aspectos se discute más abajo con más detalle.
Agentes terapéuticos
En la invención, el agente terapéutico es paclitaxel, compuesto que interrumpe la formación de microtúbulos por unión a tubulina para formar agujas mitóticas anormales. Brevemente, paclitaxel es un diterpenoide altamente derivado (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93:2325, 1971) que se ha obtenido a partir de la corteza recolectada y seca de Taxus brevifolia (Pacific Yew.) y Taxomyces Andreanae y Endophytic Fungusdey Pacific Yew (Stierle et al., Science 60214-216, 1993). "Paclitaxel" (que se debe entender que en la presente memoria descriptiva incluye profármacos, análogos y derivados tales como, por ejemplo, TAXOL^{R}, TAXOTERE^{R}, 10-desacetil-análogos de paclitaxel y 3'N-t-butoxi-carbonil-análogos de paclitaxel) se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas conocidas por los especialistas en la técnica (véase WO 94/07882, WO94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, WO 94/00156, WO 93/24476, EP 590267, WO 94/20089, patentes de EE.UU. Nos. 5.294.637, 5.283.253, 5.279.949, 5.274.137, 5.202.448, 5.200.534, 5.229.529, 5.254.580, 5.412.092, 5.395.850, 5.380.751, 5.350.866, 4.857.653, 5.272.171,
5.411.984, 2.248.796, 5.422.364, 5.300.638, 5.294.637, 5.362.831, 5.440.056, 4.814.470, 5.278.324, 5.352.805,
5.411.984, 5.059.699, 4.942.184; Tetrahedron Letters 35(52):9709-9712, 1994; J. Med. Chem. 35:4230-4237, 1992; J. Med. Chem. 34:992-998, 1991; J. Natural Prod 57(10):1404-1410, 1994; J. Natural Prod. 57(11):1580-1583, 1994; J. Am. Chem. Soc. 110:6558-6560, 1988) u obtenido a partir de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 - de Taxus brevifolia).
Ejemplos representativos de tales derivados o análogos de paclitaxel incluyen 7-desoxi-docetaxol, 7,8-ciclo-propataxanos, 2-azetidonas N-sustituidas, 6,7-epoxi-paclitaxeles, 6,7-paclitaxeles modificados, 10-desacetoxitaxol, 10-desacetiltaxol (a partir de 10-desacetilbaccatin III), fosfonooxi y derivados carbonato de taxol, taxol 2',7-di(1,2-bencenodicarboxilato de sodio), derivados de 10-desacetoxi-11,12-dihidrotaxol-10,12(18)-dieno, 10-desacetoxitaxol, protaxol (derivados de 2'-y/o-7-O-éster), (derivados de 2'-y/o 7-O-carbonato), síntesis asimétrica de cadenas laterales de taxol, fluoro-taxoles, 9-desoxotaxano, 13-acetil-9-desoxobaccatin III, 9-desoxotaxol, 7-desoxi-9-desoxotaxol, 10-desacetoxi-7-desoxi-9-desoxotaxol, derivados que contienen hidrógeno o grupo acetilo y un grupo hidroxi y terc-butoxicarbonilamino, 2'-acriloiltaxol sulfonado, y derivados sulfonados de 2'-O-acil-ácido-taxol, succiniltaxol, formiato de 2'-\gamma-aminobutiriltaxol, 2'-acetiltaxol, 7-acetiltaxol, 7-glicina-carbamato-taxol, 2'-OH-7-PEG(5000)-carbamato-taxol, derivados de 2'-bonzoil- y 2'.7-dibenzoil-taxol, otros pro-fármacos (2'-acetiltaxol; 2',7-diacetiltaxol; 2'-succiniltaxol; 2'-(beta-alanil)-taxol); formiato de 2'-gamma-aminobutiriltaxol, etilenglicol-derivados de 2'-succiniltaxol; 2'-glutariltaxol, 2'-(N,N-dimetilglicil)taxol; 2'-[2-(N,N-dietilamino)propionil]taxol; 2'-ortocarboxilbenzoiltaxol; derivados de ácidos 2'-carboxílicos alifáticos de taxol; pro-fármacos [2'(N,N-dietilaminopropionil)taxol; 2'(N,N-dimetilglicil)taxol; 7(N,N-dimetilglicil)taxol; 2',7-di-(N,N-dimetilglicil)taxol; 7(N,N-dietilaminopropionil)taxol; 2',7-di(N,N-dietilaminopropionil)taxol; 2'-(L-glicil)taxol; 7-(L-glicil)taxol; 2',7-di(L-glicil)taxol, 2'-(L-alanil)taxol, 7-(L-alanil)taxol, 2',7-di(L-alanil)taxol; 2'-(L-leucil)taxol; 7-(L-leucil)taxol; 2',7-di(L-leucil)taxol; 2'-(L-isoleucil)taxol; 7-(L-isoleucil)taxol; 2',7-di(L-isoleucil)taxol; 2'-(L-valil)taxol; 7-(L-valil)taxol; 2',7-di(L-valil)taxol; 2'-(L-fenilalanil)taxol; 7-(L-fenilalanil)taxol; 2',7-di(L-fenilalanil)taxol, 2'-(L-prolil)taxol; 7-(L-prolil)taxol; 2',7-di(L-prolil)taxol; 2'-(L-lisil)taxol; 7-(L-lisil)taxol; 2',7-di(L-lisil)taxol; 2'-(L-glutamil)taxol; 7-(L-glutamil)taxol; 2',7-di(L-glutamil)taxol, 2'-(L-arginil)taxol; 7-(L-arginil)taxol; 2',7-di(L-arginil)taxol; análogos de taxol con cadenas laterales de fenil-isoserina modificada, taxotere, N-desbenzoil-N-terc-(butoxicaronil)-10-desacetiltaxol, y taxanos (por ejemplo, baccatin III, cefalomanina, 10-desacetilbaccatin III, brevifoliol, yunantaxusina y taxusina).
Se deberá entender que paclitaxel se refiere no sólo a la forma corriente químicamente disponible de paclitaxel, sino a análogos (por ejemplo, taxotere, tal como se sugiere más arriba) y a conjugados de paclitaxel (por ejemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano, o paclitaxel-xilos). Además, más de un agente terapéutico se puede utilizar a la vez (es decir, en combinación) o administrar secuencialmente.
Polímeros
Tal como se sugiere más arriba, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un compuesto polímero. Una amplia variedad de compuestos polímeros se pueden utilizar para contener y/o administrar uno o más de los agentes terapéuticos tratados más arriba, que incluyen, por ejemplo, composiciones biodegradables y no degradables. Ejemplos representativos de composiciones biodegradables incluyen albúmina, colágeno, gelatina, almidón, celulosa (metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, acetato-ftalato de celulosa, acetato-succinato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), caseína, dextranos, polisacáridos, fibrinógeno, poli(D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-glicolida), poli(glicolida), poli(hidroxibutirato), poli(alquilcarbonato), y poli(ortoésteres), poliésteres, poli(ácido hidroxivalérico), polidioxanona, poli(tereftalato de etileno), poli(ácido málico), poli(ácido tartrónico), polianhídridos, polifosfazenos, poli(aminoácidos) y sus copolímeros (véase generalmente lllum, L, Davids, S.S. (eds.) "Polymers in controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17:1-22, 1991; Pitt. Int. J. Phar. 59:173-196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4:155-0180, 1986). Ejemplos representativos de polímeros no degradables incluyen copolímeros EVA, caucho de silicona, polímeros acrílicos [poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), polimetilmetacrilato, polialquilcianoacrilato], polietileno, polipropileno, poliamidas (nailon 6,6), poliuretano, poli(éster-uretanos), poli(éter-uretanos), poli(éster-urea), poliéteres, poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno), compuestos plurónicos, poli(tetrametilenglicol), cauchos de silicona y polímeros vinílicos poli(pirrolidona de vinilo), poli(alcohol vinílico), poli(acetato-ftalato de vinilo). También se pueden desarrollar polímeros que son aniónicos (por ejemplo, alginato, carragenina, carboximetilcelulosa, y poli(ácido acrílico), o catiónicos (por ejemplo, quitosano, poli-1-lisina, polietilenimina y poli(alil-amina) (véase generalmente, Duna et al., J. Applied Polymer Sci. 50:353-365, 1993; Cascote et al., J. Materials Sci.:Materials in Medicine 5:770-774, 1994; Shiraishi et al., Biol. Pharm. Bull. 16(11):1164-1168, 1993; Thacharodi y Rao, Int'l J. Pharm. 120:115-118, 1995; Miyazaki et al.,Int'l J. Pharm. 118:257-263, 1995). Excipientes polímeros particularmente preferidos incluyen poli(etileno-acetato de vinilo) (reticulado en un 40%), oligómeros y polímeros de poli(ácido D,L-láctico), oligómeros y polímeros de poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, y poli(caprolactona), poli(valerolactona), polianhídridos, copolímeros de poli(caprolactona) o poli(ácido láctico) con polietilenglicol, y sus mezclas.
Los excipientes polímeros se pueden adaptar a una variedad de formas, con características de desprendimiento deseadas y/o con propiedades específicas deseadas. Por ejemplo, excipientes polímeros se pueden adaptar para desprender un agente terapéutico por exposición a un caso específico de activación, tal como pH (véase, por ejemplo Heller et al., "Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems" en Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam,1988, pp.175-178; Kang et al., J. Applied Polymer Sci. 48:343-354, 1993; Dong et al., J. Controlled Release 19:171-178, 1992; Dong y Hoffman, J. Controlled Release 15:141-152, 1991; Kim et al., J. Controlled Release 28:143-152, 1994; Cornejo-Bravo et al., J. Controlled Release 33:223-229, 1995; Wu y Lee, Pharm. Res. 10(10):1544-1547, 1993; Serres et al., Pharm. Res. 13(2):196-201, 1996; Peppas, "Fundamentals of pH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems", en Gruñí et al. (ads.), Pulsatile Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pp. 41-55; Doelker, "Cellulose Derivatives", 1993, en Peppas y Langer (ads.). Biopolymers 1, Springer-Verlag, Berlin). Ejemplos representativos de polímeros sensibles al pH incluyen poli(ácido acrílico) y sus derivados (que incluyen, por ejemplo, homopolímeros tales como poli(ácido aminocarboxílico); poli(ácido acrílico); poli(ácido metil-acrílico); copolímeros de tales homopolímeros, y copolímeros de poli(ácido acrílico) y monómeros acrílicos, tales como los sugeridos más arriba. Otros polímeros sensibles al pH incluyen polisacáridos tales como acetato-ftalato de celulosa; ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato-trimelilato de celulosa; y quitosano. Todavía otros polímeros sensibles al pH incluyen cualquier mezcla de un polímero sensible al pH y un polímero soluble en agua.
Asimismo, se pueden adaptar excipientes polímeros que son sensibles a la temperatura (véase, por ejemplo, Chen et al., "Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrilic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery", en Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22:167-168. Controled Release Society, Inc., 1995; Okano, "Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery", en Proceed Intern.Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22.111-112, Controlled Release Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9(3):425-433, 1992; Tung, Int'l J. Pharm. 107:85:90, 1994; hasrsh y Gehrke, J. Controlled Release 17:175-186, 1991; Bae et al., Pherm. Res. 8(4):531-537, 1991; Dinarvand y D'Emanuele, J. Controlled Release 36:221-227, 1995; Yu y Grainger, ``Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels: Poli-N-isopropilacrilamida-co-sodio acrilato-co-n-N-alquilacrilamida Network Synthesis and Physicochemical Characterization, ``Dept. of Chemical & Bioligal Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 820-821; Zhou y Smid, ``Physical Hydrogels of Associative Star Polymers, ``Polymer Research Institute, Dept. of Chemistry, college of Environmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822-823; Hoffman et al., ``Characterizing Pore Sizes and Water "Structure" in Stimuli-Responsive Hydrogels, ``Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p.828; Yu y Grainger, "Thermo-sensitive Swelling Behavior in crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels", Dept. of Chemical & Biological Sci, Oregon Graduate Institute of Science & technology, Beaverton, OR, pp.829-830; Kim et al., Pharm. Res. 9(3):283-290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8(5):624-628, 1991; Kono et al., J. Controlled Released 30 :69-75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Release 32 :97-102, 1994; Okano et al., J.Controlled Release 36 :125-133, 1995; Chun y Kim, J. Controlled Release 38 :39-47, 1996; D'Emanuele y Dinarvand, Int'l J. Pharm. 118:237-242, 1995; Katono et al., J. Controlled Release 16:215-228, 1991; Hoffman "Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species" en Migliaresi et al., (eds.), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, pp. 161-167; H, "Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics", en Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, UT, feb. 24-27, 1987, pp. 297-305; Gutowska et al., J. Controlled Release 22:95-104, 1992; Palasis y Gehrke, J. Controlled Release 18:1-12, 1992; Paavola et al., Pharm. Res. 12(12):1997-2002, 1995.
Ejemplos representativos de polímeros termogelificantes y su temperatura de de gelatinización [LCST (ºC)] incluyen homopolímeros tales como poli(N-metil-N-n-propilacrilamida), 19,8; poli(N-n-propilacrilamida), 21,5; poli(N-metil-N-isopropilacrilamida), 22,3; poli(n-n-propilmetacrilamida), 28,0; poli(N-isopropilacrilamida), 30,9; poli(N-n-dietilacrilamida), 32,0; poli(N-isopropilmetacrilamida), 44,0; poli(N-ciclopropilacrilamida), 45,5; poli(N-etilmetilacrilamida), 50,0; poli(N-metil-N-etilacrilamida), 56,0; poli(N-ciclopropilmetacrilamida), 59,0; poli(N-etilacrilamida), 72,0; además, polímeros termogelificantes se pueden fabricar preparando copolímeros entre monómeros de los de más arriba, o combinando tales homopolímeros con otros polímeros solubles en agua, tales como monómeros acrílicos (por ejemplo, ácido acrílico y sus derivados tales como ácido metacrílico, acrilato y sus derivados tales como butil-metacrilato, acrilamida y N-n-butil-acrilamida).
Otros ejemplos representativos de polímeros termogelificantes incluyen derivados de éter de celulosa, tales como hidroxipropilcelulosa, 41ºC; metilcelulosa, 55ºC; hidroxipropilmetilcelulosa, 66ºC; y etilhidroxietilcelulosa, y plurónicos tales como F-127, 10-15ºC; L-122, 19ºC; L-92, 26ºC; L-81, 20ºC; y L-61, 24ºC.
Una amplia variedad de formas se pueden elaborar por los excipientes polímeros usados en la presente invención, que incluyen, por ejemplo, dispositivos en forma de varilla, gránulos, placas gruesas o cápsulas (véase, por ejemplo Goodell et al., Am. J. Hosp. Pharm. 43:1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", en Biomedical polymers, Polymeric materials and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E.P., Nakagim, A. (eds.) Academic Press, pp.113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69:265-270, 1980; Brown et al., J. Pharm. Sci. 72:1181-1185, 1983; y Bawa et al., J. Controlled Release 1 :259-267, 1985). Agentes terapéuticos se pueden unir por oclusión en las matrices del polímero, fijados por enlaces covalentes, o encapsulados en microcápsulas. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, composiciones terapéuticas se proporcionan en formulaciones no encapsuladas tales como microcápsulas (con tamaños que varían entre nanómetros y micrómetros), pastas, hilos de diversos tamaños, películas y pulverizaciones.
Preferiblemente, las composiciones terapéuticas se proporcionan de manera apropiada para el uso pretendido. En ciertos aspectos de la presente invención, la composición terapéutica deberá ser biocompatible y desprender uno o más agentes terapéuticos a lo largo de un período de varios días a meses. Por ejemplo, se proporcionan composiciones terapéuticas de "desprendimiento rápido" o de "explosión" que desprenden más de 10%, 20% ó 25% (peso/volumen) de un agente terapéutico (por ejemplo, paclitaxel) a lo largo de un período de 7 a 10 días. Tales composiciones de "desprendimiento rápido" deben ser capaces, en ciertas realizaciones, de desprender niveles quimioterapéuticos (donde sea aplicable) de un agente deseado. En otras realizaciones, se proporcionan composiciones terapéuticas de "bajo desprendimiento" que desprenden menos de 1% (peso/volumen) de un agente terapéutico a lo largo de un período de tiempo de 7 a 10 días. Además, las composiciones terapéuticas preferiblemente deberán ser estables durante varios meses y susceptibles de producirse y conservarse en condiciones estériles.
En ciertos aspectos de la presente invención, se pueden preparar composiciones terapéuticas de cualquier tamaño que oscila entre 50 y 500 \mum, según el uso particular. Alternativamente, tales composiciones se deben aplicar fácilmente en forma de "pulverización", que solidifica en forma de película o de revestimiento. Tales pulverizaciones se deben preparar a partir de microesferas de una amplia serie de tamaños, que incluyen, por ejemplo, de 0,1 \mum a 3 \mum, de 10 \mum a 30 \mum y de 30 \mum a 100 \mum.
Composiciones terapéuticas proporcionadas por la presente invención se pueden preparar, también, en una variedad de formas de "pasta" o de gel. Por ejemplo, en una realización del de la invención, se proporcionan composiciones terapéuticas que son líquidas a una temperatura (por ejemplo, temperatura superior a 37ºC, tal como 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC ó 60ºC) y sólidas o semi-sólidas a otra temperatura (por ejemplo, temperatura ambiente del cuerpo, o cualquier temperatura inferior a 37ºC). Tales "termopastas" se pueden fabricar fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente memoria descriptiva.
Según aún otros aspectos de la invención, las composiciones terapéuticas se pueden conformar en forma de película. Preferiblemente, tales películas son inferiores generalmente a 5, 4, 3, 2 ó 1 mm de espesor, más preferiblemente inferior a 0,75 mm de espesor, o inferior a 0,5 mm de espesor, y lo más preferiblemente inferior a entre 500 \mum y 100 \mum de espesor. Tales películas son, preferiblemente, flexibles con una buena resistencia a la tracción (por ejemplo, superior a 50, preferiblemente superior a 100, y más preferiblemente superior a 150 ó 200 N/cm^{2}), buenas propiedades adhesivas (es decir, se adhiere fácilmente a superficies mojadas o húmedas), y tienen una permeabilidad controlada.
En ciertas realizaciones de la invención, las composiciones terapéuticas pueden comprender, también, ingredientes adicionales tales como tensioactivos (por ejemplo, compuestos plurónicos tales como F-127, L-122, L-92, L-81 y L-61).
En aspectos adicionales de la presente invención, se usan excipientes polímeros que están adaptados para contener y desprender un compuesto hidrófobo, conteniendo el excipiente el compuesto hidrófobo en combinación con un carbohidrato, proteína o polipéptido. En ciertas realizaciones, el excipiente polímero contiene o comprende regiones, áreas o gránulos de uno o más compuestos hidrófobos. Por ejemplo, en una realización de la invención, compuestos hidrófobos se pueden incorporar en el interior de una matriz que contiene el compuesto hidrófobo, seguido por incorporación de la matriz dentro del excipiente polímero. Una variedad de matices se pueden utilizar para este fin, que incluye, por ejemplo, carbohidratos y polisacáridos tales como almidón, celulosa, dextrano, metilcelulosa, y ácido hialurónico, proteínas o polipéptidos tales como albúmina, colágeno y gelatina. En realizaciones alternativas, compuestos hidrófobos se pueden contener dentro de un núcleo hidrófobo, y este núcleo contenido en el interior de una vaina hidrófila. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos, paclitaxel se puede incorporar en el interior de una vaina hidrófobo (por ejemplo, del agregado de poli(ácido D,L-láctico)-PEG ó MePEG) que es una vaina hidrófila.
Una amplia variedad de compuestos hidrófobos se puede desprender de los excipientes polímeros descritos más arriba, que incluye, por ejemplo, ciertos compuestos hidrófobos que interrumpen la función de microtúbulos tales como paclitaxel y estramustina; proteínas hidrófobas tales como proteína básica de mielina, proteínas proteolipídicas de mielina CNS, proteína de pared celular hidrófoba, purinas, proteínas de membrana (EMBO J. 12(9):3409-3415, 1993), glicoproteína de oligodendrocitos mielínicos ("MOG") (Biochem. And Mol. Biol. Int. 30(5):945-958, 1993, P27 Cancer Res. 53(17):4096-4101, 1913, bacterioopsina, proteína tensioactiva humana ("HSB"; J. Biol. Chem. 268(15):11160-11166, 1993), y SP-B o SP-C (Biochimica et Biophysica Acta 1105(1):161-169, 1992).
Ejemplos representativos de la incorporación de agentes terapéuticos, tales como los descritos más arriba en vehículos polímeros para formar una composición terapéutica, se describen más abajo, con más detalle, en los Ejemplos.
Otros excipientes
Otros excipientes que también se pueden utilizar para contener y/o administrar los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen: hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (Caserhati and Hollo, Int. J. Pharm. 108:69-75, 1994), liposomas (véase, por ejemplo, Shanna et al., Cancer Res. 53:5877-5881, 1993; Sharma and Straubinger, Pharm. Res. 11(60):889-896, 1994; WO 93/18751; Patente de EE.UU. No. 5.242.073), liposoma/gel (WO 94/26254), nanocápsulas (Bartola et al., J. Microencapsulation 7(2):191-197, 1990), micelas (Akan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11(2):206-212, 1994), injertos (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34(11):3076-3083, 1993; Walter et al., Cancer Res. 54 :22017-2212, 1994), nanopartículas (Violante and Lanzafame PAACR), nanopartículas -
modificadas (Patente de EE.UU. No. 5.145.684), nanopartículas (modificadas superficialmente) (Patente de EE.UU. No. 5.399.363), emulsión/disolución de taxol (Patente de EE.UU. No. 5.407.683), micela (tensioactivo) (Patente de EE.UU. 5.403.858), compuestos de fosfolípidos sintéticos (Patente de EE.UU. No. 4.534.899), dispersión de origen gaseoso (Patente de EE.UU. No. 5.301.664), emulsiones líquidas, pulverización de espumas, crema loción en forma de gel, pomadas, vesículas dispersas, aerosoles de partículas o gotitas sólidas o líquidas, microemulsiones (Patente de EE.UU. No. 5.330.756), cápsula polímera (nano- y micro-cápsula) (Patente de EE.UU. No. 5.439.686), composiciones de base taxoidea en un agente tensioactivo (Patente de EE.UU. No. 5.438.072), emulsión (Tarr et al., Pharm. Res. 4:62-165, 1987), nanoesferas (Hagan et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 22, 1995; Kwon et al., Pharm Res. 12(2):192-195; Kwon et al., Pharm. Res. 10(7) :970-974; Yokoyama et al., J. Contr. Rel. 32 :269-277, 1994; Gref et al., Science 263:1600-1603, 1994; Bazile et al., J. Pharm. Sci. 84 :493-498, 1994) e implantes (Patente de EE.UU. No. 4.882.168).
Tratamiento o prevención de enfermedad
Tal como se sugiere más arriba, la presente invención se refiere al uso de paclitaxel y análogos y derivados para la fabricación de un medicamento para métodos de tratar o prevenir una amplia variedad de enfermedades asociadas con la obstrucción de vías de conducción del cuerpo, que incluyen, por ejemplo, enfermedades vasculares, obstrucciones neoplásticas, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas.
Por ejemplo, en un aspecto de la presente invención, las composiciones terapéuticas tal como se describen en la presente memoria descriptiva se pueden utilizar para tratar enfermedades vasculares que causan obstrucción del sistema vascular. Ejemplos representativos de tales enfermedades incluyen arteriosclerosis de todos los vasos (en torno a cualquier arteria, vena o injerto) que incluyen, pero no restringidas a ellas, las arterias coronarias, aorta, arterias ilíacas, arterias carótidas, arterias femorales corrientes, arterias femorales superficiales, arterias poplíteas, y en el sitio de anastomosis de injerto; espasmos vasculares (por ejemplo, vasospasmos de las coronarias y enfermedad de Raynaud); reestenosis (obstrucción de un vaso en el sitio de una intervención previa tal como angioplastia de globo, cirugía de derivación, inserción de tubo de malla metálica e inserción de injertos); condiciones inflamatorias y autoinmunes (por ejemplo, arteritis temporal, vasculitis).
Brevemente, en enfermedades vasculares tales como arteriosclerosis, células blancas, específicamente monocitos y linfocitos T se adhieren a células endoteliales, especialmente en sitios de ramificación arterial. Después de adherirse al endotelio, leucocitos migran a través del revestimiento celular endotelial, en respuesta a estímulos quimioestáticos y se acumulan en la túnica íntima de la pared arterial, junto con células de músculo liso. Esta lesión inicial de desarrollo de arteriosclerosis es conocida como "veta adiposa". Los monocitos en la veta adiposa se diferencian en macrófagos; y los macrófagos y células de músculo liso progresivamente recogen lípidos y lipoproteínas para convertirse en células esponjosas.
Si los macrófagos se acumulan, el endotelio de cubrimiento se rompe mecánicamente y se altera químicamente por lípido oxidado, radicales libres con derivación de oxígeno y proteasas que son desprendidas por macrófagos. Las células esponjosas corroen a través de la superficie endotelial causando micro-ulceraciones de la pared vascular. La exposición de tejidos sub-endoteliales potencialmente trombogénicos (tales como colágeno y otras proteínas) a componentes de la corriente sanguínea da lugar a adherencia de plaquetas a regiones de endotelio roto. La adherencia de plaquetas y otros incidentes provoca la elaboración y desprendimiento de factores de crecimiento en este medio, que incluye factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor activador de plaquetas (PAF) e interleuquinas 1 y 6 (IL-1, IL-6). Estos factores paracrinos se piensa que estimulan la migración y proliferación de células del músculo vascular liso (VSMC).
En la pared de vasos sanguíneos normales (no enfermos) las células de músculo vascular liso tienen un fenotipo contráctil y bajo índice de actividad mitótica. Sin embargo, bajo la influencia de citocinesis y factores de crecimiento desprendidos por plaquetas, macrófagos y células epiteliales, las VSMC experimentan alteración fenotípica desde células contráctiles maduras a células secretoras inmaduras. Las VSMC transformadas proliferan en el medio de la pared de los vasos sanguíneos, migran a la media de la pared de los vasos sanguíneos, migran a la túnica íntima, siguen proliferando en la túnica media y generan grandes cantidades de matriz extracelular. Esto transforma la lesión vascular en desarrollo, en una placa fibrosa. La matriz extracelular elaborada por VSMC secretoras incluye colágeno, elastina, glicoproteína y glicosaminoglicanos, comprendiendo el colágeno el principal componente de la matriz extracelular de la placa arteriosclerótica. Elastina y glicosaminoglicanos unen lipoproteínas y contribuyen, también, al crecimiento de la lesión. La placa fibrosa consiste en una capa de tejido conectivo denso de espesor variable, que contiene células de músculo liso y macrófagos cubrientes, células T y material extracelular.
Además de PDGF, IL-1, e IL-6, otros factores mitogénicos son producidos por las células que infiltran la pared de los vasos, que incluyen: transformación del factor de crecimiento \beta (TGF-\beta), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), trombospondina, serotonina, tromboxano A_{2}, norepinefrina, y angiotensina II. Esto da lugar a reclutamiento de más células, elaboración de matriz extracelular adicional y a la acumulación de lípido adicional. Esto agranda progresivamente la lesión arteriosclerótica hasta que invade significativamente el lumen vascular. Inicialmente, el flujo sanguíneo obstruido a través del tubo vascular causa isquemia de los tejidos distales de la placa arteriosclerótica solamente cuando se requiere mayor flujo - más tarde cuando la lesión bloquea, también, la arteria, se produce isquemia en reposo.
Macrófagos en la placa arteriosclerótica que se agranda, desprenden lípidos oxidados, radicales libres, elastasas, y colagenasas que causan lesión de las células y necrosis de los tejidos próximos. La lesión desarrolla un núcleo necrótico y se transforma en una placa compleja. Las placas complejas son lesiones que pueden: romperse, causando embolia; hemorragia local (subsiguiente a la rotura del vasa vasórum que abastece la placa, lo cual resulta en la obstrucción del lumen debida a la rápida expansión de la lesión); o ulceración y formación de fisuras (esto expone el núcleo trombogénico necrótico a la corriente sanguínea, que produce trombosis local o embolia distal. Aunque no ocurriera ninguna de las secuelas de más arriba, el trombo adherente puede llegar a organizarse e incorporarse en la placa, acelerando, por ello, su crecimiento. Además, si las concentraciones locales de fibrinógeno y trombina aumentan, se estimula la proliferación de células de músculo vascular liso en el interior de la media y túnica íntima; proceso que finalmente conduce, también, al estrechamiento adicional de los vasos.
La media y la túnica íntima de arterias normales se oxigenan y aprovisionan con nutrición desde el lumen de la arteria o desde el vasa vasórum en el órgano adventicio. Con el desarrollo de placa arteriosclerótica, los microvasos que proceden del vasa vasórum adventicio se extiende a la media y túnica íntima engrosadas. Esta red vascular se hace más extensiva cuando la placa empeora y disminuya con la regresión de la placa.
La hemorragia de estos microvasos puede precipitar súbitamente la expansión y rotura de la placa, en asociación con disección arterial, ulceración, o trombosis. Se ha propuesto, también, que la pérdida de proteínas del plasma de estos microvasos puede atraer infiltrados inflamatorios a la región y estas células inflamatorias pueden contribuir al rápido crecimiento de placa arteriosclerótica y a complicaciones asociadas (por edema e inflamación locales).
Según otro aspecto de la invención, paclitaxel y análogos o derivados se han de utilizar para tratar obstrucciones neoplásticas. Brevemente, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una "\cdotobstrucción neoplástica" se deberá entender que incluye cualquier obstrucción neoplástica (benigna o maligna) de un tubo corporal independientemente de la situación del tubo o del tipo histológico de malignidad presente. Ejemplos representativos incluyen enfermedades gastrointestinales [por ejemplo, carcinoma bucal-faríngeo (adenocarcinoma, carcinoma esofágico (célula escamosa, adenocarcinoma, linfoma, melanoma), carcinoma gástrico (adenocarcinoma, linitis plástica, linfoma, leiomicosarcoma), tumores de intestino delgado (adenomas, leiomiomas, lipomas, adenocarcinomas, linfomas, tumores carcinoides), cáncer de colon (adenocarcinoma) y cáncer anorrectal]; enfermedades del tracto biliar [por ejemplo, neoplasma que resulta en obstrucción biliar tal como carcinoma pancreático (adenocarcinoma ductal, tumores de células de islotes, cistadenocarcinoma), colangiocarcinoma y carcinoma hepatocelular]; enfermedades pulmonares [por ejemplo, carcinoma de pulmón y/o vías de conducción traqueales/bronquiales (cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas); enfermedades reproductoras femeninas (por ejemplo, malignidad de los tubos de Falopio, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer vaginal); enfermedades reproductoras masculinas (por ejemplo, cáncer testicular, cáncer del epidídimo, tumores del conducto deferente, cáncer prostático, hipertrofia prostática benigna); y enfermedades de las vías urinarias (por ejemplo, carcinoma de células renales, tumores de la pelvis renal, tumores del sistema de acumulación de orina tal como carcinoma de células de transición, carcinoma de vejiga, y obstrucción uretral debida e estrechamientos benignos o malignos.
Por ejemplo, hiperplasia prostática benigna (BPH) es el agrandamiento de la próstata, particularmente la porción central de la glándula que circunda la uretra, que ocurre en respuesta a estimulación andrógena prolongada. Afecta a más del 80% de los hombres de más de 50 años de edad. Este agrandamiento puede resultar en compresión de la porción de la uretra que atraviesa la próstata, que resulta en la obstrucción de las vías de flujo de la vejiga, es decir, se requiere una presión de la vejiga anormalmente alta para generar flujo urinario; en 1980, 367.000 recesiones transuretrales de la próstata se llevaron a cabo en los Estados Unidos como tratamiento por BPH. Otros tratamientos incluyen medicación, esfinterotomía transuretral, láser o microondas transuretrales, hipertermia transuretral, ultrasonidos transuretrales, microondas transrrectal, hipertermia transrrectal, ultrasonidos transrrectales y extirpación quirúrgica. Todos tienen desventajas que incluyen interrupción del mecanismo del esfínter que resulta en incontinencia y formación de estrechamientos.
Con el fin de tratar enfermedades neoplásticas, tales como las enumeradas más arriba, una amplia variedad de agentes terapéuticos (con o sin excipiente polímero) se pueden administrar a la porción externa de la vía de conducción del cuerpo, o a las células del músculo liso, vía la parte adventicia de la vía de conducción del cuerpo. Agentes terapéuticos particularmente preferidos a este respecto incluyen agentes anti-angiogénicos, anti-proliferantes o anti-neoplásticos tratados más arriba, que incluyen, por ejemplo, compuesto que interrumpen la función de microtubos, tales como paclitaxel y sus derivados o análogos.
Por ejemplo, en una realización preferida, una aguja o catéter es guiado dentro de la glándula prostática adyacente a la uretra, vía la ruta transuretral (o alternativamente, por vía transperineal) con ayuda de ultrasonidos y a través de esto administrar un agente terapéutico, preferiblemente en varios cuadrantes del glande, y particularmente alrededor de la uretra. La aguja o catéter se puede situar, también, por palpación directa o mediante guía endoscópica, fluoroscópica, de CT o MRI y administrada a intervalos. Como alternativa, la colocación de gránulos también se puede realizar vía un catéter o trocar. Los procedimientos de más arriba se pueden conseguir solos o en conjunción con un tubo de malla metálica, colocado en la uretra prostática. Evitando la instrumentación uretral o lesión a la uretra, el mecanismo del esfínter permanecerá intacto, evitando la incontinencia, y un estrechamiento es menos probable.
De acuerdo con otros aspectos de la invención es útil prevenir o tratar las enfermedades inflamatorias que causan la obstrucción de una vía de conducción del cuerpo. Las enfermedades inflamatorias incluyen la inflamación aguda y la inflamación crónica, que resulta en la obstrucción de una variedad de conductos del cuerpo. Ejemplos representativos incluyen vasculitis [(por ejemplo, arteritis de células gigantes (arteritis temporal, arteritis de Takayasu), poliarteritis nudosa, angitis alérgica y granulomatosis (enfermedad de Churg-Strauss), síndrome de superposición por poliangiitis, vasculitis de hipersensibilidad (púrpura de Henoch-Schonlein), enfermedad del suero, vasculitis inducida por fármacos, vasculitis infecciosa, vasculitis neoplástica; vasculitis asociada con trastornos del tejido conectivo, vasculitis asociada con deficiencias congénitas del sistema complementario], granulomatosis de Wegener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis del sistema nervioso central, enfermedad de Buerger y esclerosis sistémica); enfermedades del tracto gastrointestinal (por ejemplo, pancreatitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, proctitis ulcerosa, colangitis esclerósica primaria, estrechuras benignas de cualquier causa que incluyen ideopáticas (por ejemplo, estrechuras de los conductos biliares, esófago, duodeno, intestino delgado o colon); enfermedades del sistema respiratorio (por ejemplo, asma, neumonitis de hipersensibilidad, asbestosis, silicosis, y otras formas de neumoconiosis, bronquitis crónica y enfermedad crónica obstructiva de las vías respiratorias; enfermedades de los órganos lagrimales (por ejemplo, estrechamiento de todas las causas que incluyen ideopáticas); y enfermedades de la trompa de Eustaquio (por ejemplo, estrechamiento de todas las causas que incluyen ideopáticas).
Según todavía otros aspectos, la invención se proporciona útil para tratar o prevenir enfermedades infecciosas que están asociadas con, o son causantes de, la obstrucción de una vía de conducción del cuerpo. Brevemente, las enfermedades infeccionas incluyen diversos procesos infecciosos crónicos y agudos que pueden resultar en obstrucción de las vías de conducción del cuerpo, que incluyen por ejemplo, obstrucciones del sistema reproductor masculino (por ejemplo, estrechuras debidas a uretritis, epididimitis, prostatitis); obstrucciones del sistema reproductor femenino (por ejemplo, vaginitis, cervicitis, enfermedad inflamatoria pélvica (por ejemplo, tuberculosis, gonococos, clamidia, enterococos y sífilis); obstrucciones de las vías urinarias (por ejemplo, cistitis, uretritis); obstrucciones de las vías respiratorias (por ejemplo, bronquitis crónica, tuberculosis, otras infecciones micobacterianas (MAI, etc), infecciones anaeróbicas, infecciones por hongos e infecciones parasitarias) y obstrucciones cardiovasculares (por ejemplo, aneurismas micóticos y endocarditis infectiva).
Con el fin de tratar enfermedades infecciosas, tales como las descritas más arriba, una amplia variedad de agentes terapéuticos (con o sin un excipiente) se puede administrar a la porción externa de la vía de conducción del cuerpo o a la células del músculo liso vía la adventicia de la vía de conducción del cuerpo.
Formulación y administración
Tal como se describe más arriba, composiciones terapéuticas proporcionadas por la invención se pueden formular en una variedad de formas (por ejemplo, microesferas, pastas, películas o pulverizaciones). Además, las composiciones se pueden formular para contener más de un agente terapéutico, para contener una variedad de compuestos adicionales, para tener ciertas propiedades físicas (por ejemplo, elasticidad, un punto de fusión particular, o una velocidad de desprendimiento especificada). En ciertas realizaciones, las composiciones se pueden combinar con el fin de conseguir un efecto deseado (por ejemplo, diversas preparaciones de microesferas se pueden combinar con el fin de conseguir un desprendimiento rápido o lento o prolongado de uno más factores anti-angiogénicos).
Agentes y composiciones terapéuticos proporcionadas por la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con vehículos farmacéutica o fisiológicamente aceptables, excipientes o diluyentes. Generalmente, tales vehículos deberán ser no tóxicos para receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tales composiciones supone combinar el agente terapéutico con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa, y otros estabilizantes y excipientes. Disoluciones salinas tamponadas neutras o disoluciones salinas mezcladas con seroalbúmina no específica son diluyentes ejemplares apropiados.
Tal como se propone más arriba, agentes terapéuticos, composiciones terapéuticas o composiciones terapéuticas proporcionadas en la presente memoria descriptiva, se pueden preparar para administración por una variedad de rutas diferentes, que incluyen, por ejemplo, directamente a una vía de conducción del cuerpo bajo visión directa (por ejemplo, en el momento de la cirugía o vía procedimientos endoscópicos) o vía administración percutánea de fármacos a la superficie (adventicial) exterior de la vía de conducción del cuerpo (por ejemplo, administración perivascular). Otras rutas representativas de administración incluyen gastroscopia, ECRP y colonoscopia, que no requieren procedimientos de operación completos y hospitalización, pero pueden requerir la presencia de personal médico.
Brevemente, la administración de fármacos perivasculares supone la administración percutánea de formulaciones terapéuticas localizadas (con frecuencia desprendimiento sostenido, usando una aguja o catéter dirigidos vía una guía por ultrasonidos, CT, fluoroscópica, MRI o endoscópica al sitio de la enfermedad. Alternativamente, el procedimiento se puede llevar a cabo intra-operativamente bajo visión directa o con guía de formación de imagen adicional. Tal procedimiento se puede llevar a cabo, también, en conjunción con procedimientos endovasculares tales como angioplastia, aterectomía, o por implantación de un tubo de malla metálica o en asociación con un procedimiento arterial operativo, tales como endarterectomía, restauración de vasos o injertos o inserción de un injerto.
Por ejemplo, en una realización, formulaciones polímeras de paclitaxel se pueden inyectar en la pared vascular o aplicarse la superficie adventicial, que permite concentraciones de fármacos para permanecer las más altas en regiones en las que más se necesita actividad biológica. Esto tiene el potencial de reducir el "fracaso" local del fármaco que puede acentuarse por el continuo flujo de sangre sobre la superficie de un dispositivo de administración de fármaco endovascular (tal como un tubo de malla metálica con revestimiento de fármaco). La administración de agentes terapéuticos eficaces a la superficie externa del tubo vascular puede reducir la obstrucción del tubo y reducir el peligro de complicaciones asociadas con manipulaciones intravasculares (tales como reestenosis, embolización, trombosis, rotura de placas y toxicidad sistémica por fármacos).
Por ejemplo, en un paciente con estrechamiento de la arteria femoral superficial, angioplastia con globo se llevará a cabo de la manera normal (es decir, hacer pasar un catéter para angioplastia con globo bajo la arteria por encima de un alambre de guía e inflar el globo a través de la lesión). Antes de, al tiempo que, o después de la angioplastia, una aguja se deberá insertar a través de la piel con guía de ultrasonido, fluoroscopia, o CT y un agente terapéutico (por ejemplo, paclitaxel impregnado en un polímero de desprendimiento lento) se infiltrará a través de la aguja o catéter, de manera circunferencial, directamente alrededor del área de estrechamiento de la arteria. Esto se podría llevar a cabo alrededor de cualquier arteria, vena o injerto, pero candidatos ideales para esta intervención incluyen enfermedades de las arterias carótida, coronaria, ilíaca, femoral corriente, femoral superficial y poplítea y en el sitio de anastomosis de injerto. Sitios venosos lógicos incluyen infiltración alrededor de venas en las que están insertados catéteres residentes.
Los agentes terapéuticos, composiciones terapéuticas y composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria descriptiva se pueden depositar en recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones referentes al uso de tales materiales. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como en ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes de excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, disolución salina o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir el factor anti-angiogénico, composición anti-angiogénica o composición farmacéutica.
Los ejemplos que siguen se ofrecen a modo de ilustración y no en forma de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1
Fabricación de "pastas"
Tal como se propone más arriba, la presente invención usa una variedad de composiciones de fármacos que contienen polímeros, que se pueden utilizar en una variedad de situaciones clínicas. Por ejemplo, las composiciones se pueden producir:
(1) en forma de "termopasta" que se aplica, en un sitio deseado, en forma de fluido y endurece para formar un sólido con la forma deseada, a una temperatura especificada (por ejemplo, la temperatura del cuerpo);
(2) en forma de pulverización (es decir, "nanopulverización") que se puede administrar en un sitio deseado directamente o mediante un aparato especializado (por ejemplo, endoscopia), y que subsiguientemente endurece para formar un sólido que se adhiere al tejido al que se aplica;
(3) en forma de película polímera cargada con fármaco, adherente, flexible y elástica, aplicada a un sitio deseado directamente o mediante un aparato especializado, y que preferiblemente se adhiere al sitio en el que se aplica; y
(4) en forma de fluido compuesto con una suspensión de microesferas en un medio de vehículo apropiado, que se aplica en un sitio deseado directamente o vía un aparato especializado, y que deja una capa de microesferas en el sitio de aplicación.
Ejemplos representativos de cada una de las realizaciones de más arriba se exponen más abajo con más detalle.
A. Procedimiento para producir termopastas
Los reactivos y equipos que se utilizan en los siguientes experimentos incluyen una jeringa de vidrio estéril (1 mL), placa/agitador caliente de Corning, vial de centelleo de vidrio de 20 mL, moldes (por ejemplo, bandeja de DSC de 50 \muL o porción interior de tapa de tubo de centrífuga de 50 mL), escalpelo y pinzas, policaprolactona ("PCL" - peso molecular de 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA), y paclitaxel (calidad Sigma 95% de pureza como mínimo).
Se colocan 5,00 g de policaprolactona directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. Se introduce el vial en un vaso de precipitados de 600 mL que contiene 50 mL de agua. Se calienta suavemente el vaso de precipitados a 65ºC y se mantiene a esa temperatura durante 20 minutos. Esto permite que el polímero funda. Se mezcla completamente un peso conocido de paclitaxel u otro inhibidor de angiogénesis en el polímero fundido a 65ºC. Se vierte el polímero fundido en molde pre-calentado (en estufa a 60ºC). Se usa una espátula para ayudar en el proceso de vertido. Se permite que el molde se enfríe, de modo que el polímero solidifica. Cortar o romper el polímero en trozos pequeños (aproximadamente un tamaño de 2 mm por 2 mm). Estos trozos se colocan en una jeringa de vidrio de 1 mL. Se separa el émbolo de la jeringa de vidrio de 1 mL (no separar la tapa del extremo) y se le coloca en una balanza. Se pone a cero la balanza.
Se pesan 0,5 g de los trozos directamente en el extremo abierto de la jeringa. Se coloca la jeringa de vidrio en posición vertical (extremo tapado hacia abajo) en un vaso de precipitados de 500 mL que contiene agua destilada a 65ºC (que viene de la placa caliente), de manera que no penetre agua en el tubo. El polímero funde completamente en 10 minutos, en este aparato. Cuando los trozos de polímero han fundido, se separa el tubo del baño de agua, se le mantiene horizontalmente y se separa la tapa. Se inserta el émbolo en el tubo y se comprime el polímero fundido para dar una masa viscosa en el extremo superior del tubo. Se tapa la jeringa y se deja enfriar a temperatura ambiente.
Para aplicación, la jeringa se puede volver a calentar a 60ºC y administrar en forma líquida que solidifica cuando se enfría a la temperatura del cuerpo.
B. Procedimiento para producir nanopulverización.
Nanopulverización es una suspensión de pequeñas microesferas en disolución salina. Si las microesferas son muy pequeñas (es decir, diámetro inferior a 1 \mum) forman un coloide, de manera que la suspensión no sedimentará por gravedad. Tal como se describe más abajo con más detalle, una suspensión de microesferas de 0,1 \mum a 1 \mum se puede preparar apropiada para deposición sobre tejido mediante un aerosol accionado a mano. El equipo y materiales que se deben utilizar para producir nanopulverización incluye un vaso de precipitados de 200 mL con camisa calefactora de agua (Kimax o Pirex), baño Haake con circulación de agua, agitador superior y regulador con 50,8 mm de diámetro (agitador de acero inoxidable de tipo hélice de 4 álabes; marca Fisher), vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, placa/agitador caliente (marca Corning), tubos de centrífuga de polipropileno de 4 x 50 mL (Nalgene), viales de centelleo de vidrio con tapas de plástico, centrífuga de mesa (Beckman), centrífuga de alta velocidad - modelo de suelo (JS 21 Beckman), balanza analítica Mettler (AJ 100, o,1 mg), balanza digital de carga superior Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipeta automática (Wilson), extremos de la pipeta estériles, 20 mL de aerosol accionado con bomba (Pfeiffer pharmaceuticals), campana de flujo laminar, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000-20.000; Polisciences, Warrington, Pennsylvania USA), etileno-acetato de vinilo (EVA) "lavado" (véase más arriba), ácido poli(DL)láctico ("PLA" peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), poli(alcohol vinílico), peso molecular 124.000 a 186.000, 99% hidrolizado; Aldrich Chemical Co., Milwauke, WI USA), diclorometano ("DCM" o "cloruro de metileno", calidad HPLC de Fisher scientific), agua destilada, disolución salina esterilizada (Becton y Dikeson o equivalente).
1. Preparación de disoluciones polímeras al 5% (peso/volumen)
Según sea la disolución de polímero a preparar, se pesan 1,00 g de PCL ó 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavada, directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. Usando un cilindro graduado, se añaden 20 mL de DCM y el vial se tapa ajustadamente. El vial se deja a temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora o hasta que todo el polímero se ha disuelto (ocasionalmente se puede usar agitación manual). La disolución del polímero se puede verificar visualmente; la disolución deberá estar transparente. Etiquetar el vial con el nombre de la disolución y la fecha en que fue preparada. Las disoluciones se almacenan a temperatura ambiente y se usan en el espacio de dos semanas.
2. Preparación de disolución de reserva al 3% (peso/volumen) de PVA
La disolución se puede preparar según el procedimiento dado más abajo, o diluyendo la disolución de reserva de PVA al 5% (peso/volumen) preparada para la producción de microesferas (véase Ejemplo 2). Brevemente, 17,5 g de PVA se pesan directamente en un vaso de precipitados de vidrio de 600 mL y se añaden 500 mL de agua destilada. En el vaso de precipitados se introduce una barra de agitación revestida de Teflón de 76,2 mm. Se tapa el vaso de precipitados con una cubierta de vidrio para reducir las pérdidas por evaporación. Se introduce el vaso de precipitados en otro vaso de precipitados de 2.000 mL que contiene 300 mL de agua. Éste actuará como baño de agua. Se agita el PVA a 300 rpm a 85ºC (que viene de una placa/agitador caliente) durante 2 horas hasta que está completamente disuelto. La disolución del PVA se puede determinar mediante verificación visual; la disolución deberá estar transparente. Se usa una pipeta para transferir la disolución a un recipiente de almacenamiento de vidrio con tapa con rosca y se almacena a 4ºC durante un máximo de dos meses. La disolución se deberá calentar a temperatura ambiente antes de uso o dilución.
3. Procedimiento para producir nanopulverización
Se introduce el montaje de agitación en una campana de humos. Se vierten 100 mL de la disolución de PVA al 3,5% en el vaso de precipitados de 200 mL con camisa de agua. Se conecta el baño de agua Haake a este vaso de precipitados y se permite que los contenidos se equilibren a 27ºC (\pm1ºC) durante 10 minutos. Se regula la velocidad del agitador superior a 3.000 rpm (\pm200 rpm). Se sitúa el álabe del agitador superior del medio hacia abajo de la disolución de PVA y se comienza la agitación. Se vierten, gota a gota, 10 mL de la disolución de polímero (disolución de polímero usada basada en el tipo de nanopulverización a producir) en el PVA en agitación a lo largo de un período de 2 minutos usando una pipeta automática de 5 mL. Después de 3 minutos, se ajusta la velocidad del agitador a 2.500 rpm (\pm200 rpm) y se deja el montaje durante 2,5 horas. Después de 2,5 horas, se retira el álabe de agitación de la preparación de nanopulverización y se lava con 10 mL de agua destilada. Se permite que la disolución de lavado vaya a la disolución de nanopulverización.
Se vierte la preparación de microesferas en un vaso de precipitados de 500 mL. Se lava el baño, con camisa de agua, con 70 mL de agua destilada. Se permite que la disolución de lavado de 70 mL vaya a la preparación de microesferas. Se agita la preparación de microesferas de 180 mL con una varilla de vidrio y se vierten cantidades iguales de ella en cuatro tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Se tapan los tubos. Se centrifugan los tubos tapados a 10.000 g (\pm1.000 g) durante 10 minutos. Usar una pipeta automática de 5 mL o succión a vacío, extraer 45 mL de la disolución de PVA de cada gránulo de microesferas y desecharla. Añadir 5 mL de agua destilada a cada tubo de centrífuga y usar un torbellino para volver a poner en suspensión las microesferas en cada tubo. Usando 20 mL de agua destilada, combinar las cuatro suspensiones de microesferas en un solo tubo de centrífuga. Para lavar las microesferas, centrifugar la preparación de nanopulverización durante 10 minutos a 10.000 g (\pm1.000 g). Extraer el material que sobrenada del gránulo de microesferas. Añadir 40 mL de agua destilada y usar un torbellino para volver a poner en suspensión las microesferas. Repetir este proceso dos veces más para un total de tres lavados. Realizar un cuarto lavado, pero usar solamente 10 mL (no 40 mL) de agua destilada cuando se vuelvan a poner en suspensión los microesferas. Después del cuarto lavado, transferir la preparación de microesferas a un vial de vidrio de centelleo previamente pesado.
Tapar el vial y dejarlo estar durante 1 hora a temperatura ambiente (25ºC) para permitir que las microesferas de 2 \mum y 3 \mum de diámetro sedimenten por gravedad. Después de 1 hora, extraer de la parte superior 9 mL de suspensión usando una pipeta automática de 5 mL. Introducir los 9 mL en un tubo de centrífuga de 50 mL estéril y tapado. Centrifugar la suspensión a 10.000 g (\pm1.000 g) durante 10 minutos. Desechar el material que sobrenada y volver a poner en suspensión la píldora en disolución salina estéril. La cantidad de disolución salina usada depende de la concentración de suspensión requerida final (usualmente 10% peso/volumen). Lavar completamente el aparato de aerosol en suspensión salina estéril y añadir la suspensión de nanopulverización al aerosol.
C. Fabricación de nanopulverización con carga de paclitaxel
Para fabricar nanopulverización que contiene paclitaxel, usar Paclitaxel (calidad Sigma, 955 de pureza). Para preparar la disolución de reserva de fármaco polímero, pesar las cantidad apropiada de paclitaxel directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. La cantidad apropiada se determina sobre la base del porcentaje de paclitaxel a estar en la nanopulverización. Por ejemplo, si se requería nanopulverización que contenga 5% de paclitaxel, entonces la cantidad de paclitaxel pesada sería 25 mg, ya que la cantidad de polímero añadido es 10 mL de un polímero al 5% en disolución de DCM (véase el paso próximo).
Añadir 10 mL de la disolución apropiada de polímero al 5%, al vial que contiene el paclitaxel. Tapar el vial y agitar en forma de torbellino o remolinearlo a mano para disolver el paclitaxel (comprobación visual para asegurarse de que el paclitaxel está disuelto). Etiquetar el vial con la fecha en que se produjo. Esto se ha de usar el día en que se produjo.
D. Procedimiento para producir películas
La expresión película se refiere a un polímero conformado en una de muchas formas geométricas. La película debe ser una hoja delgada y elástica de polímero o un disco de 2 mm de espesor de polímero. Esta película está diseñada para ser colocada sobre tejido expuesto, de manera que cualquier fármaco encapsulado se desprende del polímero a lo largo de un largo período de tiempo en el sitio del tejido. Las películas se pueden fabricar por varios procedimientos, que incluyen, por ejemplo, colada y pulverización.
En la técnica de colada, el polímero se funde y se vierte en un molde o se disuelve en diclorometano y se vierte en un molde. Luego, el polímero solidifica cuando se enfría o solidifica cuando se evapora el disolvente, respectivamente. En la técnica de pulverización, el polímero se disuelve en un disolvente y se pulveriza sobre un vidrio; cuando el disolvente se evapora, el polímero solidifica sobre el vidrio. Pulverización repetida hace posible la transformación de polímero en forma de película que se puede desprender del vidrio por pelado.
Los reactivos y equipamiento que se utilizaron en estos experimentos incluyen un pequeño vaso de precipitados, agitador de placa caliente de Corning, moldes para colada (por ejemplo, tapas de tubos de centrífuga, de 50 mL) y aparato para sujetar el molde, vial de de centelleo de vidrio de 20 mL (tipo de inserción de plástico), vaporizador de TLC, depósito de gas que contiene nitrógeno, policaprolactona ("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences), paclitaxel (de Sigma, 95% de pureza), etanol, etileno-acetato de vinilo (EVA) "lavado" (véase previamente), poli(ácido (DL)-láctico) ("PLA" - peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), diclorometano (calidad de HPLC, Fisher Scientific).
1. Procedimiento para producir películas - Colada de masa fundida
Pesar un peso conocido de PCL directamente en un vaso de precipitados de vidrio pequeño. Colocar el vaso de precipitados en un vaso de precipitados más grande que contiene agua (para que actúe como baño de agua) y colocarlo sobre la placa caliente a 70ºC durante 15 minutos o hasta que el polímero haya fundido completamente. Añadir un peso conocido de fármaco al polímero fundido y agitar la mezcla totalmente. Para ayudar a la dispersión del fármaco en el PCL fundido, el fármaco se puede poner en suspensión/disolución en un volumen pequeño (<10% del volumen del PCL fundido) de etanol de 100%. Esta suspensión en etanol se mezcla, luego, con el polímero fundido. Verter el polímero fundido en un molde y dejarlo enfriar. Después del enfriamiento, almacenar la película en un
recipiente.
2. Procedimiento para producir películas - Colada en disolución
Pesar un peso conocido de PCL directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL y añadir suficiente DCM para obtener una disolución de 10% peso/volumen. Tapar el vial y mezclar la disolución. Añadir paclitaxel suficiente a la disolución para conseguir la concentración de paclitaxel final deseada. Usar agitación a mano o formando torbellino para disolver el paclitaxel en la disolución. Dejar la disolución en reposo durante una hora (para disminuir la presencia de burbujas de aire) y, luego, verterla lentamente en el molde. El molde usado se basa en la forma requerida. Colocar el molde en la campana de humos toda la noche. Esto permitirá evaporar el DCM. Dejar la película en el molde para almacenarla o desprenderla y almacenarla en un recipiente cerrado herméticamente.
3. Procedimiento para producir películas - pulverizadas
Pesar suficiente polímero directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL y añadir suficiente DCM para alcanzar una disolución al 2% peso/volumen. Taponar el vial y mezclar la disolución para disolver el polímero (agitar a mano). Instalar los moldes en posición vertical en un aparato apropiado para sujeción de los moldes en la campana de humos. Situar este aparato de sujeción del molde de 152 mm a 305 mm por encima del suelo de la vitrina de humos en un soporte apropiado (por ejemplo, vaso de precipitados de vidrio de 200 mL invertido) para facilitar la pulverización horizontal. Usar una pipeta automática, transferir un volumen apropiado (5 mL mínimo) de la disolución de polímero al 2% a un vial de centelleo de vidrio de 20 mL separado. Añadir suficiente paclitaxel a la disolución y disolverlo agitando a mano el vial taponado. Para preparar la pulverización, retirar el tapón de este vial y sumergir el cuerpo (solamente) de un pulverizador de TLC en la disolución de polímero.
Observación. El depósito del pulverizador no se usa en este procedimiento - el vial de vidrio de 20 mL actúa como depósito.
Conectar el depósito de nitrógeno a la entrada de nitrógeno del pulverizador.
Gradualmente aumentar la presión hasta que comienza la pulverización. Tomar nota de la presión y usar esta presión en todo el procedimiento. Para pulverizar los moldes, usar pulverizaciones oscilantes durante 5 segundos con un tiempo de secado de 15 segundos entre pulverizaciones. Durante el tiempo de secado, doblar con los dedos la tubería del gas para evitar la pérdida de pulverización. La pulverización continúa hasta que un espesor adecuado de polímero se deposita sobre el molde. El espesor se basa en la demanda. Dejar las películas pulverizadas unidas a los moldes y almacenar en recipiente cerrados herméticamente.
E. Procedimiento para producir nanopastas
Nanopasta es una suspensión de microesferas suspendidas en un gel hidrófilo. De acuerdo con un aspecto de la invención, el gel o pasta se puede untar sobre un tejido como método de situar microesferas cargadas de fármaco próximo al tejido objetivo. Al ser a base de agua, la pasta pronto se diluye con los fluidos corporales causando una disminución de la pegajosidad de la pasta y la tendencia de las microesferas a depositarse en el tejido cercano. Un pozo de fármaco encapsulado en microesferas se sitúa, por ello, próximo al tejido objetivo.
Los reactivos y equipamiento que se utilizaron en estos experimentos incluyen vasos de precipitados de vidrio, Carbopol 925 (calidad farmacéutica, Goodyear Chemical Co.), agua destilada, hidróxido sódico (1M) en disolución en agua, disolución de hidróxido sódico (5 M) en disolución en agua, microesferas en el intervalo de tamaños de 0,1 a 3 \mum suspendidas en agua al 20% peso/volumen (véase precedentemente).
1. Preparación de gel de Carbopol al 5% peso/volumen
Añadir una cantidad suficiente de Carbopol a hidróxido sódico 1 M para obtener una disolución al 5%. Para disolver el Carbopol en el hidróxido sódico 1 M, dejar reposar la mezcla durante una hora aproximadamente. Durante este período de tiempo, remover la mezcla usando una varilla de vidrio. Después de una hora, medir el pH de la mezcla. Un pH bajo, indica que el Carbopol no está completamente disuelto. El pH que se debe conseguir es 7,4. Usar hidróxido sódico 5 M para ajustar el pH. Esto se consigue añadiendo lentamente gotas de hidróxido sódico 5 M a la mezcla, agitando la mezcla y midiendo el pH de la mezcla. Usualmente se tarda aproximadamente una hora para ajustar el pH a 7,4. Una vez que se ha conseguido el pH de 7,4, tapar el gel y dejarlo reposar durante 2 a 3 horas. Después de este período de tiempo, comprobar el pH para asegurarse de que todavía está a 7,4. Si ha cambiado, repetir el proceso hasta que se consigue el pH deseado y es estable. Marcar el recipiente con el nombre del gel y la fecha. El gel se ha de usar para fabricar nanopasta dentro de la siguiente semana.
2. Procedimiento pata producir nanopasta
Añadir suficientes microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum a agua para producir una suspensión al 20% de microesferas. Introducir 8 mL del Carbopol al 5% peso/volumen en un vaso de precipitados de vidrio. Usando una varilla de vidrio o una espátula mezcladora, agitar la mezcla para dispersar completamente las microesferas por todo el gel. Usualmente, en esto se tarda 30 minutos. Una vez que las microesferas se han dispersado en el gel, introducir la mezcla en un tarro de almacenamiento. Almacenar el tarro a 4ºC. Se debe usar no más tarde de un mes.
Ejemplo 2
Fabricación de microesferas
El equipo que se prefiere para la fabricación de microesferas descritas más abajo incluye: una vaso de precipitados de 200 mL con camisa de agua (Kimax o Pyrex), baño con circulación de agua Haake, agitador elevado y regulador de 50,5 mm de diámetro (agitador de acero inoxidable del tipo de hélice de 4 aspas - marca Fisher), vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, placa de calefacción/agitador (marca Corning), tubos para centrífuga de polipropileno de 4 x 50 mL (Nalgene), viales de centelleo de vidrio con tapón de plástico, centrífuga de sobremesa (GPR Beckman), centrífuga de alta velocidad - modelo de suelo (JS 212 Beckman), balanza analítica Mettler (AJ 100, 0,1 mg), balanza digital de carga superior Mettler (AE 163, 0,01 mg), pipeta automática (Gilson). Los reactivos incluyen policaprolactona (("PCL" - peso molecular 10.000 a 20.000; Polysciences, Warrington Pennsylvania, USA), etileno-acetato de vinilo ("EVA") "lavado" (véase más adelante Método de "lavado"), poli(ácido (DL)láctico) ("PLA" - peso molecular 15.000 a 25.000; Polysciences), poli(alcohol vinílico) ("PVA" - peso molecular 124.000 a 186.000, hidrolizado al 99%; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, USA), diclorometano ("DCM" o "cloruro de metileno"; calidad HPLC Fisher scientific), y agua destilada.
A. Preparación de disoluciones de polímeros al 5% (peso/volumen)
Dependiendo de la disolución de polímero a preparar, 1,00 g de PCL o de PLA ó 0,50 g de cada uno de PLA y EVA lavado se pesan directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. A continuación se añaden 20 mL de DCM, y el vial se tapona herméticamente. El vial se almacena a temperatura ambiente (25ºC) durante una hora (ocasionalmente se puede usar agitación), o hasta que todo el polímero se ha disuelto (la disolución deberá ser transparente). La disolución se puede almacenar a temperatura ambiente durante, al menos dos semanas.
B. Preparación de disolución de reserva al 5% (peso/volumen) de PVA
25 g de PVA se pesan directamente en un vaso de precipitados de vidrio de 600 mL. Se añaden 500 mL de agua destilada, junto con una barra de agitación de 76 mm, revestida de Teflón. El vaso de precipitados se cubre con vidrio para disminuir las pérdidas por evaporación y se introduce en un vaso de precipitados de vidrio de 2.000 mL, que contiene 300 ml de agua (que actúa como baño de agua). El PVA se agita a 300 rpm a 85ºC (placa caliente/agitador de Corning) durante 2 horas o hasta que esté totalmente disuelto. La disolución del PVA se puede determinar por comprobación visual; la disolución debe estar transparente. La disolución se transfiere, luego, a un recipiente de almacenamiento de vidrio con tapa de rosca y se almacena a 4ºC durante un máximo de dos meses. Sin embargo, la disolución se debe calentar a temperatura ambiente antes de uso o de dilución.
C. Procedimiento para producir microesferas
Tomando como base el tamaño de las microesferas a fabricar (véase Tabla I), 100 mL de la disolución de PVA (concentraciones dadas en la Tabla I) se introducen en el vaso de precipitados de 200 mL, con camisa de agua, que contiene 300 mL de agua (que actúa como baño de agua). El baño con circulación de agua Haake se conecta con este vaso de precipitados y se permite que los contenidos se equilibren a 27ºC (\pm1ºC) durante 10 min. Tomando como base el tamaño de microesferas a producir (véase Tabla I), se fija la velocidad de partida del agitador elevado y el álabe del agitador elevado se sitúa en la parte media inferior en la disolución de PVA. A continuación se pone en marcha el agitador y 10 mL de la disolución de polímero (disolución de polímero usada basada en el tipo de microesferas a producir) se deja caer gota a gota, luego, en el PVA en agitación durante un período de 2 minutos, usando una pipeta automática de 5 mL. Después de 3 minutos, la velocidad del agitador se ajusta (véase Tabla I) y la disolución se agita durante 2,5 horas adicionales. El agitador de álabe se separa, luego, de la preparación de microesferas y se lava con 10 mL de aguas destilada de manera que la disolución de lavado escurra dentro de la preparación de microesferas. La preparación de microesferas se vierte, luego, en un vaso de precipitados de 500 mL y el baño de camisa de agua se lava con 70 mL de agua destilada, que también se deja escurrir en la preparación de microesferas. La preparación de microesferas de 180 mL se agita, luego, con una varilla de vidrio, y cantidades iguales se vierten en cuatro tubos de polipropileno de centrífuga de 50 mL. Los tubos se taponan, luego, y se centrifugan durante 10 minutos (fuerza dada en la Tabla I). Una pipeta automática de 5 mL o succión a vacío se utiliza, luego, para extraer 45 mL de la disolución de PVA de cada gránulo de microesferas.
TABLA I
Concentraciones de PVA, velocidades de agitación, requisitos de fuerzas para cada serie
de diámetros de microesferas
Fase de producción Series de diámetros de microesferas
30 \pm \mum a 100 \mum 10 \mum a 30 \mum 0,1 \mum a 3 \mum
Concentración de PVA 2,5% (peso/volumen), es 5% (peso/volumen) (es 3,5% (es decir, diluir la
decir, diluir la reserva de decir, reserva sin diluir) reserva de 5% con agua
5% con agua destilada destilada)
Velocidad de agitación 500 rpm \pm 50 rpm 500 rpm \pm 50 rpm 3.000 rpm \pm 200 rpm
de partida
Velocidad de agitación 500 rpm \pm 50 rpm 500 rpm \pm 50 rpm 2.500 rpm \pm 200 rpm
ajustada
Fuerza centrífuga 1.0 g \pm 100 g 1.0 \pm 100 g 10.000 g \pm 1.000 g
(modelo de mesa) (modelo de mesa) (modelo de alta velocidad)
5 mL de agua destilada se añaden, luego, a cada tubo de la centrífuga, que después se remolinea para volver a poner en suspensión las microesferas. Las cuatro suspensiones de microesferas se combinan, después, en un tubo de centrífuga junto con 20 mL de agua destilada y se centrifugan durante otros 10 minutos (fuerza dada en la Tabla I). Este proceso se repite dos veces más para un total de tres lavados. Las microesferas se centrifugan, luego, una última vez, y se vuelven a poner en suspensión en 10 mL de agua destilada. Después del lavado final, la preparación de microesferas se transfiere a un vial de centelleo de vidrio previamente pesado. Se tapona el vial y se deja toda la noche a temperatura ambiente (25ºC) con el fin de permitir que las microesferas sedimenten por gravedad. Las microesferas que caen dentro de la serie de tamaños de 0,1 \mum a 3 \mum no sedimentan por gravedad, y por tanto se dejan en la suspensión de 10 mL.
D. Secado de microesferas de 10 \mum a 30 \mum ó de 30\mum a 100 \mum de diámetro
Después de que las microesferas han permanecido a temperatura ambiente durante toda la noche, una pipeta automática de 5 mL o succión a vacío se usa para extraer las materias que sobrenadan por encima de las microesferas sedimentadas. Se permite que las microesferas se sequen en el vial destapado en un cajón durante un período de una semana o hasta que estén totalmente secas (hasta peso constante del vial). Un secado más rápido se puede conseguir dejando el vial destapado bajo una corriente suave de gas que contiene nitrógeno (flujo de aproximadamente 10 mL/min) en la vitrina de humos. Cuando esté totalmente seco (peso constante del vial), el vial se pesa y se tapona. El vial etiquetado y taponado se almacena a temperatura ambiente en un cajón. Las microesferas normalmente no están almacenadas más de 3 meses.
E. Secado de microesferas de 0,1 \mum a 3 \mum de diámetro
Esta serie de tamaños de microesferas no sedimentarán, así que permanecen en suspensión a 4ºC durante un máximo de cuatro semanas. Para determinar la concentración de microesferas en la suspensión de 10 mL, una muestra de 200 \muL de la suspensión se pipetea a un tubo de microcentrifugación, previamente pesado, de 1,5 mL. El tubo se centrifuga, luego, a 10.000 g (microcentrífuga de mesa Eppendorf), el material que sobrenada se separa y se deja secar el tubo a 50ºC durante toda la noche. Se vuelve a pesar el tubo con el fin de determinar el peso de microesferas secadas en el tubo.
F. Fabricación de microesferas cargadas con paclitaxel
Con el fin de preparar microesferas que contienen paclitaxel, una cantidad apropiada de paclitaxel pesado (basado en el porcentaje de paclitaxel a encapsular) se introduce directamente en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. 10 mL de una disolución de polímero apropiado se añade, luego, al vial que contiene el paclitaxel, el cual se remolinea, luego, hasta que el paclitaxel se ha disuelto.
Las microesferas que contienen paclitaxel se pueden producir, luego, esencialmente tal como se describe más arriba en las etapas de (C) a (E).
Ejemplo 3
Microesferas revestidas con tensioactivo A. Materiales y Métodos
Se fabricaron microesferas a partir de poli(ácido (DL) láctico), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policaprolactona (PCL) y etileno-acetato de vinilo (EVA):PLA al 50:50 esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 2. El tamaño oscilaba entre 10 y 100 \mum, con un diámetro medio de 45 \mum.
Sangre humana se obtuvo de voluntarios sanos. Los neutrófilos (glóbulos blancos de la sangre) se separaron de la sangre usando sedimentación con dextrano y técnicas de centrifugación de Ficoll Hypaque. Los neutrófilos se pusieron en suspensión a 5 millones de células por mL en disolución salina tamponada de Hanks ("HBSS").
Los niveles de activación de neutrófilos se determinaron por la generación de especies de oxígeno reactivo tal como se determina por quimiluminiscencia. En particular, la quimiluminiscencia se determinó usando un luminómetro LKB con un mejorador de luminal de 1uM. El pre-revestimiento de plasma (u opsonización) de microesferas se llevó a cabo poniendo en suspensión 10 mg de microesferas en 0,5 mL de plasma y revolviendo a 37ºC durante 30 minutos.
Las microesferas se lavaron, luego, en 1 ml de HBSS y los gránulos de microesferas centrifugadas se añadió a la suspensión de neutrófilos a 37ºC en el tiempo t=0. Las superficies de las microesferas se modificaron usando un tensioactivo denominado Pluronic F 127 (BASF) poniendo en suspensión 10 mg de microesferas en 0,5 mL de disolución al 2% peso/peso de F 127 en HBSS durante 30 min a 37ºC. Las microesferas se lavaron, luego, dos veces en 1 mL de HBSS antes de añadir a neutrófilos o al plasma para posterior pre-revestimiento.
B. Resultados
La figura 1 presenta que las microesferas no tratadas dan valores de quimiluminiscencia inferiores a 50 mV. Estos valores representan niveles bajos de activación de neutrófilos. A título de información, microcristales inflamatorios pueden dar valores próximos a 1.000 mV, y activadores químicos solubles pueden dar valores próximos a 5.000 mV. Sin embargo, cuando las microesferas están pre-revestidas con plasma, todos los valores de quimiluminiscencia se amplían al intervalo de 100 a 300 mV (véase figura 1). Estos valores de respuesta o activación de neutrófilos se pueden considerar ligeramente inflamatorios. El PMMA dio la respuesta más grande y se podría mirar como la más inflamatoria. PLA y PCL se llegan a ser tres a cuatro veces más potentes en la activación de neutrófilos después del pre-tratamiento de plasma (u opsonización), pero hay poca diferencia entre los dos polímeros a este respecto. EVA:PLA no es probable que se usen en formulaciones de angiogénesis, ya que las microesferas son difíciles de secar y volver a suspender en amortiguador acuoso. Este efecto de plasma se denomina opsonización y resulta de la adsorción de anticuerpos o moléculas de complementos sobre la superficie. Estas especies adsorbidas interactúan con receptores sobre glóbulos blancos de la sangre y causan una activación ampliada de las células.
Las figuras 2-5 describen los efectos del pre-revestimiento con plasma de PCL, y EVA:PLA respectivamente así como muestra el efecto del pre-revestimiento con Pluronic F127 antes del pre-revestimiento con plasma de microesferas. Todas estas figuras presentan el mismo efecto: (1) el pre-revestimiento con plasma amplía la respuesta; (2) el pre-revestimiento con Pluronic F127 no tiene ningún efecto por sí mismo; (3) la respuesta ampliada de neutrófilos causada por pre-revestimiento con plasma se puede inhibir fuertemente pre-tratando la superficie de las microesferas con 2% de Pluronic F127.
La naturaleza de las especies de proteína adsorbidas del plasma se estudió por electroforesis. Usando este método, se demostró que pre-tratar la superficie polímera con Pluronic F127 inhibía la adsorción de anticuerpos a la superficie polímera.
Las figuras 6-9 muestra, asimismo, el efecto de pre-revestir microesferas de PCL, PMMA, PLA ó EVA:PLA (respectivamente) con IgG (2 mg/mL) ó 2% de Pluronic F127 y luego IgG (2 mg/mL). Según se puede comprobar en estas figuras, la respuesta ampliada causada por pre-revestir microesferas con IgG se puede inhibir por tratamiento con Pluronic F127.
Este resultado demuestra que pre-tratando la superficie polímera de los cuatro tipos de microesferas con Pluronic F127, se puede inhibir la respuesta "inflamatoria" de neutrófilos a microesferas.
Ejemplo 4
Encapsulación de paclitaxel
500 microgramos de paclitaxel o de baccatin (un análogo de paclitaxel, disponible de Inflazyme Pharmaceuticals Inc., Vancouver, British Columbia, Canada) se disuelven en 1 mL de una mezcla 50:50, en dcm, de ELVAX:poli(ácido 1-láctico). Las microesferas se preparan, luego, en un aparato de disolución (aparato de pruebas de disolución de seis husillos, Vanderkanp, Van Kell Industries Inc., USA) en triplicado a 200 rpm, 42ºC, durante 3 horas. Las microesferas así preparadas se lavan dos veces en agua y se clasifican por tamaños en el microscopio.
La determinación de la encapsulación de paclitaxel es emprendida en un análisis de UV/VIS a 237 nm de excitación, emisión a 325 nm; los resultados de fluorescencia se presentan entre corchetes [ ]. Utilizando los procedimientos descritos más arriba, 58 \mug (\pm12 \mug [75 \mug] (\pm25 \mug) de paclitaxel se pueden encapsular de un total de 500 \mug de material de partida. Esto representa 12% (\pm2,4%) [15% (\pm5%)] del peso original, ó 1,2% (\pm0,25%) [1,5% (\pm0,5%)] en peso del polímero. Después de 18 horas de volteo, en una estufa a 37ºC, 10,3% (\pm10%) [6% (\pm5,6%)] del paclitaxel total se había desprendido de las microesferas.
Para baccatin, 100 \pm15 \mug [83 \pm23 \mug] de baccatin se pueden encapsular de un total de 500 \mug de material de partida. Esto representa un 20% (\pm3%) [17% (\pm5%)] del peso original de baccatin, y 2% (\pm 0,3%) [1,7% (\pm0,5%)] en peso del polímero. Después de 18 horas de volteo en una estufa a 37ºC, 55% (\pm 13%) [60% (\pm 23%)] del baccatin se desprende de las microesferas.
Ejemplo 5
Administración controlada de paclitaxel a partir de microesferas compuestas por una mezcla de copolímero de etileno-acetato de vinilo y poli(ácido D,L-láctico) Ensayo in vivo de las microesferas en el ensayo de CAM
Este ejemplo describe la preparación de microesferas con carga de paclitaxel compuestas con una mezcla de poli(ácido d,l-láctico) biodegradable y copolímero de etileno-acetato de vinilo no biodegradable. Además, se prueba la velocidad de desprendimiento in vitro y la actividad anti-angiogénica de paclitaxel desprendido de microesferas situadas en una CAM.
Los reactivos que se utilizan en estos experimentos incluyen paclitaxel, que está disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); PLA (peso molecular 15.000-25.000) y EVA (60% de acetato de vinilo) (disponible de Polysciences, Warrington,PA); poli(alcohol vinílico (PVA) (peso molecular 24.000-186.000, 99% hidrolizado, disponible de Aldrich Chemical Co.,Milwauke, WI) y diclorometano (DCM) (calidad HPLC, disponible de Fisher Scientific Co.). Agua destilada se usó en todo.
A. Preparación de microesferas
Las microesferas se preparan esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 utilizando el método de evaporación de disolvente. En resumen, disoluciones al 5% peso/volumen en 20 mL de DCM se preparan usando mezclas de EVA:PLA entre 35:65 y 90:10. A 5 mL de 2,5% peso/volumen de PVA en agua en un vial de vidrio de 20 mL se añade 1 mL de la disolución de polímero, gota a gota, con agitación. Seis viales similares se montan en un aparato de ensayo de disoluciones, con agitador superior de seis posiciones ((Vanderkamp) y se agitó a 200 rpm. La temperatura de los viales se incrementa desde la temperatura ambiente hasta 40ºC a lo largo de 15 minutos y se mantienen los 40ºC durante 2 horas. Los viales se centrifugan a 500xg y las microesferas se lavan tres veces con agua. En algunas mezclas de polímeros de EVA:PLA, las muestras de microesferas se agregaron durante la etapa de lavado debido a la separación del agente dispersante o emulsionante, PVA. Este efecto de agregación se podría analizar semi-cuantitativamente, ya que las microesferas agregadas fundían y la masa de polímero fundido flotaba en la superficie del agua de lavado. Esta capa de polímero superficial se desecha durante los tratamientos de lavado y se pesan las restantes microesferas granuladas.
El % de agregación se determina a partir de:
% de agregación = \frac{\text{1 - (peso de microesferas granuladas) x 100}}{\text{ Peso inicial del polímero}}
Microesferas con carga de paclitaxel (0,6% peso/peso) se preparan disolviendo el paclitaxel en la disolución de polímero al 5% peso/volumen en DCM. La mezcla de polímero usada es EVA:PLA a 50:50. Una fracción de tamaños "grandes" y una fracción de tamaños "pequeños" de microesferas se producen añadiendo la disolución de paclitaxel/polímero, gota a gota, en PVA al 2,5% y PVA al 5%, respectivamente. Las dispersiones se agitan a 40ºC y 200 rpm durante 2 horas, se centrifugan y se lavan 3 veces en agua tal como se describe más arriba. Las microesferas se secan con aire y se miden los tamaños de las muestras usando un microscopio óptico con un micrómetro de platina. Más de 300 microesferas se cuentan por muestra. Microesferas de control (sin paclitaxel) se preparan y se miden sus tamaños tal como se describe previamente.
B. Eficiencia de la encapsulación
Pesos conocidos de microesferas con carga de paclitaxel se disuelven en 1 mL de DCM, y 20 mL de acetonitrilo al 4% en agua a 50ºC se añaden y se remolinean hasta que el DCM se ha evaporado. La concentración de paclitaxel en el 40% de acetonitrilo se determina por HCL usando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) con un caudal de 1 mL/min (bomba isocrática Beckman), una columna de fase inversa C8 (Beckman) y detección de UV a 232 nm. Para determinar la eficiencia de recuperación de este procedimiento de extracción, pesos conocidos de paclitaxel de 100-1.000 \mug se disuelven en 1 mL de DCM y se someten al mismo procedimiento de extracción por triplicado, tal como se describe previamente. Las recuperaciones son siempre superiores al 85% y los valores de la eficiencia de encapsulación se corrigen adecuadamente.
C. Estudios de desprendimiento de fármacos
En tubos de vidrio de 15 mL, con tapones de rosca, se introducen 10 mL de disolución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS) y 35 mg de microesferas con carga de paclitaxel. Los tubos se voltean a 37ºC y a intervalos de tiempo dados, se centrifugan a 1500xg durante 5 minutos y la materia que sobrenada se guarda para análisis. Los gránulos de microesferas se vuelven a poner en suspensión en PBS de nueva aportación (10 mL) a 37ºC y se vuelve a incubar. Las concentraciones de paclitaxel se determinan por extracción en 1 mL de DCM seguido por evaporación a sequedad bajo corriente de nitrógeno, reconstitución en 1 mL de acetonitrilo al 40% en agua y análisis usando HCL tal como se describe previamente.
D. Microscopia electrónica de barrido (SEM)
Microesferas se introducen en porta-muestras, revestidas por pulverización iónica con oro y micrografías se obtienen usando un SEM 501B de Philips que opera a 15kV.
E. Estudios de CAM
Embriones de pollos fecundados domésticos se incuban durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. Los contenidos de los huevos se incuban a una humedad relativa de 90% y 3% de CO_{2} durante 2 días. El sexto día de incubación, alícuotas de 1 mg de microesferas con carga de 0,6% de paclitaxel o control (exentas de paclitaxel) se colocan directamente en la superficie de la CAM. Después de exposición de 2 días, se examina la vasculatura usando estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales del vídeo se exponen, luego, en ordenador y se imprimen en vídeo.
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F. Resultados
Microesferas preparadas a partir de 100% de EVA se ponen libremente en suspensión en disoluciones de PVA, pero se agregan y coalescen o fusionan extensamente por subsiguiente lavado en agua para separar el PVA. Mezclar EVA con una proporción creciente de PLA producía microesferas que presentaban tendencia a agregarse y coalescer cuando se lavan en agua, tal como se describe en la figura 10A. Una mezcla 50:50 de EVA:PLA formó microesferas con buena estabilidad física, es decir, las microesferas permanecían discretas y bien suspendidas con escasa agregación y coalescencia.
El intervalo de tamaños para las microesferas de fracción de tamaños "pequeños" se determina que es >95% de la muestra de microesferas (en peso) entre 10 y 30 mm y para la fracción de tamaños "grandes", >95% de la muestra (en peso) entre 30 y 100 mm. Micrografías electrónicas de barrido representativas de microesferas de EVA:PLA 50:50 con carga de paclitaxel en los intervalos de tamaños "pequeños" y "grandes" están representadas en las figuras 10B y 10C respectivamente. Las microesferas son esféricas, con una superficie lisa y sin ninguna evidencia de fármaco sólido sobre la superficie de las microesferas. La eficiencia de carga de microesferas de EVA:PLA 50:50, con paclitaxel es entre 95 y 100% a concentraciones de paclitaxel iniciales de entre 100 y 1.000 mg de paclitaxel por 50 mg de polímero. No hay diferencia significativa (t-ensayo de Student, p <0,05) entre las eficiencias de encapsulación tanto para microesferas "pequeñas" como para las "grandes".
El transcurso del tiempo de desprendimiento de paclitaxel de microesferas de EVA:PLA 50:50 con carga de 0,6% peso/volumen se presenta en la figura 10D para microesferas de tamaño "pequeño" (círculos blancos) y tamaños "grandes" (círculos negros). Los estudios de velocidad de desprendimiento se realizan en tubos por triplicado en 3 experimentos separados. Los perfiles de desprendimiento son bifásicos con un desprendimiento rápido inicial de paclitaxel o fase de "explosión", que ocurre a lo largo de los primeros 4 días a partir de microesferas de ambos intervalos de tamaños. Esto es seguido por una fase de desprendimiento mucho más lento. No hay ninguna diferencia significativa entre las velocidades de desprendimiento a partir de microesferas "pequeñas" o "grandes". Entre 10 y 13% del contenido total de paclitaxel de las microesferas se desprende en 50 días.
Las microesferas con carga de paclitaxel (carga de 0.6% peso/volumen) se someten a ensayo usando el ensayo de la CAM y los resultados se presentan en la figura 10E. Las microesferas de paclitaxel desprendieron suficiente fármaco para producir una zona sin vascularidad en el tejido circundante (figura 10F). Anotar que inmediatamente adyacente a las microesferas ("MS" en las figuras 10E y 10F) hay una área en la que los vasos sanguíneos están completamente ausentes (Zona 1); además, a partir de las microesferas hay un área de capilares interrumpidos, que no funcionan (Zona 2); es solamente a una distancia de aproximadamente 6 mm de las microesferas que los capilares vuelven al estado normal. En CAM tratadas con microesferas de control (ausencia de paclitaxel) hay una arquitectura de red capilar normal (figura no mostrada).
Discusión
La administración de fármacos peritubulares es una técnica quirúrgica ligeramente agresiva. Por tanto, idealmente, una formulación perivascular de un fármaco anti-proliferante, tal como paclitaxel, desprendería el fármaco en el tumor o sitio de la enfermedad en concentraciones suficientes para actividad, durante un prolongado período de tiempo, del orden de varios meses. EVA es un polímero no degradable, compatible con tejidos, que se ha usado ampliamente para la administración controlada de macromoléculas a lo largo de prolongados períodos de tiempo (> 100 días).
EVA se elige inicialmente como biomaterial polímero para preparar microesferas con paclitaxel dispersado en la matriz de polímero. Sin embargo, microesferas preparadas con 100% de EVA, se agregaron y coalescieron casi completamente durante el proceso de lavado.
Polímeros y copolímeros basados en ácido láctico y ácido glicólico son fisiológicamente inertes y biocompatibles y se degradan por hidrólisis a productos toxicológicamente aceptables. Los copolímeros de ácido láctico y de ácido glicólico tienen velocidades de degradación más rápidas que PLA y microesferas con carga de fármacos preparadas usando
estos copolímeros son inapropiados para un desprendimiento prolongado y controlado a lo largo de varios meses.
La figura 10A demuestra que aumentar la proporción de PLA en una mezcla de EVA:PLA disminuye la extensión de agregación de las suspensiones de microesferas. Mezclas de 50% o menos de EVA en la matriz de EVA:PLA producía suspensiones de microesferas, físicamente estables, en agua o PBS. Para los estudios que siguen se elige una mezcla de 50:50 de EVA:PLA.
Fracciones de diferentes intervalos de tamaños de microesferas se podrían preparar cambiando la concentración del emulgente, PVA, en la fase acuosa. Microesferas "pequeñas" se producen con la concentración más alta de PVA de 5% peso/volumen, en tanto que microesferas "grandes" se producen con 2,5% peso/volumen de PVA. Todas las otras variables de producción son las mismas para ambas fracciones de tamaños de microesferas. La concentración más alta de emulgente dio un medio de dispersión acuoso más viscoso y produjo gotitas más pequeñas de polímero/paclitaxel/DCM emulsionadas en la fase acuosa y, por tanto, microesferas más pequeñas. Las microesferas con carga de paclitaxel contenían entre 95 y 100% del paclitaxel añadido a la fase orgánica encapsulada dentro de las microesferas sólidas. La baja solubilidad en agua de paclitaxel favoreció la separación en la fase orgánica que contiene el polímero.
Las velocidades de desprendimiento de paclitaxel de microesferas de EVA:PLA a 50:50 son muy lentas, desprendiéndose menos del 15% del paclitaxel cargado, en 50 días. La fase explosiva inicial de desprendimiento de fármaco puede ser debida a la difusión de fármaco desde la región superficial de las microesferas (próxima a la superficie de las microesferas).
El mecanismo de desprendimiento de fármaco a partir de matrices polímeras no degradables, tales como EVA, se piensa que supone la difusión de agua a través de la fase de fármaco dispersado dentro del polímero, disolución del fármaco y difusión de soluto a través de una serie de poros de interconexión llenos de fluido. Mezclas de EVA y PLA han demostrado ser inmiscibles o bicontinuos a lo largo de un intervalo de 30 a 70% de EVA en PLA. En estudios de degradación en tampón de PBS a 37ºC, después de un período de inducción o retardación, PLA se degradó hidrolíticamente y se erosionó a partir de la matriz de mezcla de polímeros EVA:PLA, dejando un esqueleto esponjoso inactivo. Aunque el período de inducción y velocidad de degradación y erosión de PLA de las matrices mezcladas dependía de la proporción de PLA en la matriz y de la historia del proceso, hay consistentemente poca o ninguna pérdida de PLA hasta después de 40-50 días.
Aunque alguna erosión de PLA a partir de microesferas de EVA:PLA 50:50`puede haber ocurrido dentro de los 50 días del estudio de la velocidad de desprendimiento in vitro (figura 10C), es probable que el mecanismo primario del desprendimiento de fármaco desde la mezcla de polímeros sea la difusión de soluto a través de la red de poros en la matriz de polímero.
En la conclusión del estudio de la velocidad de desprendimiento, las microesferas se analizan a partir de la cantidad de fármaco que permanece. Loa valores para el porcentaje de paclitaxel que permanece en las muestras de microesferas de incubación de 50 días son 94% \pm 9% y 89% \pm 12% para microesferas de fracciones de tamaños "grandes" y "pequeños" respectivamente.
Microesferas cargadas con 6 mg por mg de polímero (0,6%) proporcionaron amplia inhibición de angiogénesis cuando se situaron en la CAM del pollito embriónico. (figuras 10E y 10F).
Ejemplo 6
Encapsulación de agente terapéutico en microesferas de poli(\varepsilon-caprolactona). Inhibición de angiogénesis en el ensayo de CAM por microesferas con carga de paclitaxel
Este ejemplo evalúa el perfil de velocidad de desprendimiento in vitro de paclitaxel a partir de microesferas biodegradables de poli(\varepsilon-caprolactona) y presenta la actividad anti-angiogénica in vivo de paclitaxel desprendido de estas microesferas cuando se colocan sobre la CAM.
Los reactivos que se utilizaron en estos experimentos incluyen: poli(\varepsilon-caprolactona) ("PCL") (peso molecular 35.000-45-000; disponible de Polysciences (Warrington, PA); diclorometano ("DCM") disponible de Fisher Scientific Co., Canada; poli(alcohol vinílico) ("PVA") (peso molecular 12.000-18.000, 99% hidrolizado) (disponible de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) y paclitaxel disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A no ser que se indique de otra manera, todos los productos y reactivos químicos se usan tal como se reciben. Agua destilada se usa en todas partes.
A. Preparación de microesferas
Las microesferas se preparan esencialmente como se describe en el ejemplo 2, que utiliza el método de evaporación de disolvente. En resumen, microesferas con carga de 5% de paclitaxel se preparan disolviendo 10 mg de paclitaxel y 190 mg de PCL en 2 mL de DCM, se añade a 100 mL de disolución acuosa de PVA al 1% y se agita a 1.000 rpm a 25ºC durante 2 horas. La suspensión de microesferas se centrifuga a 1.000 x g durante 10 minutos (GPR Beckman), se separa la materia que sobrenada y las microesferas se lavan tres veces con agua. Las microesferas lavadas se secan al aire a lo largo de la noche y se almacenan a temperatura ambiente. Microesferas de control (exentas de paclitaxel) se preparan tal como se describe más arriba. También se preparan microesferas que contienen 1% y 2% de paclitaxel. La clasificación según tamaños de las microesferas se realiza usando un microscopio óptico con un micrómetro de platina.
B. Eficiencia de encapsulación
Un peso conocido de microesferas con carga de fármaco (aproximadamente 5 mg) se disuelve en 8 mL de acetonitrilo y 2 mL de agua destilada se añaden para precipitar el polímero. La mezcla se centrifuga a 1.000 g durante 10 minutos y la cantidad de paclitaxel encapsulada se calcula a partir de la absorbancia de la materia que sobrenada medida en un espectrofotómetro de UV (Hewlett-Packard 8452A Diode Array Spectrophotometer) a 232 nm.
C. Estudios de desprendimiento de fármaco
Aproximadamente 10 mg de microesferas con carga de paclitaxel se ponen en suspensión en 20 mL de disolución salina tamponada con fosfato 10 mM, pH 7,4 (PBS) en tubos con tapón roscado. Los tubos se agitan repetidamente a 37ºC y a intervalos de tiempo dados, se separan 19,5 mL de materia que sobrenada (después de permitir que las microesferas sedimenten en el fondo), se filtran a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum y se retienen para análisis de paclitaxel. Un volumen igual de PBS se vuelve a colocar en cada tubo para mantener condiciones de colector a lo largo del estudio. Los filtrados se extraen con 3 x 1 mL de DCM, los extractos de DCM se evaporan a sequedad mediante una corriente de nitrógeno, se redisuelve en 1 mL de acetonitrilo y se analiza por HPLC usando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58), con un caudal de 1 mL/min (Beckman Isocratic Puma), una columna de fase inversa C8 (Beckman) y detección de UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.
D. Estudios de CAM
Embriones de pollo fecundados domésticos se incuban durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. En el día 6 de incubación, alícuotas de microesferas con 5% de carga de paclitaxel o de control (exentas de paclitaxel) se sitúan directamente en la superficie de CAM. Después de exposición de 2 días, se examina la vasculatura usando estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales de vídeo se exponen, luego, en un ordenador y se imprimen en vídeo.
E. Microscopia electrónica de barrido
Microesferas se introducen en porta-muestras, revestidas por pulverización iónica con oro y, después, se colocan en un microscopio electrónico de barrido 501B de Philips que opera a 15 kV.
F. Resultados
El intervalo de tamaños para las muestras de microesferas está entre 30 y 100 \mum, aunque hay evidencia en todos los lotes de microesferas con carga de paclitaxel o de control de algunas microesferas que caen fuera de este intervalo. La eficiencia de cargar microesferas de PCL con paclitaxel es siempre superior a 95% para todas las cargas de fármacos estudiadas. La microscopia electrónica de barrido comprobó que todas las microesferas eran esféricas y muchas presentaban una morfología superficial rugosa o con hoyos. No había evidencia de fármaco sólido sobre la superficie de las microesferas.
El transcurso del tiempo de desprendimiento de paclitaxel a partir de microesferas con 1%, 2% y 5% de carga de paclitaxel se presenta en la figura 11A. Los perfiles de porcentajes de desprendimiento son bi-fásicos. Hay un desprendimiento inicial rápido de paclitaxel o "fase explosiva" en todas las cargas de fármaco. La fase de explosión ocurrió a lo largo de 1-2 días con 1% y 2% de carga de paclitaxel y a lo largo de 3-4 días para microesferas con carga del 5%. La fase inicial de desprendimiento rápido es seguida por una fase de desprendimiento de fármaco significativamente más larga. Para microesferas que contienen 1% ó 2% de paclitaxel no hay desprendimiento posterior de fármaco después de 21 días. Con carga de 5% de paclitaxel, las microesferas habían desprendido aproximadamente 20% del contenido total de fármaco después de 21 días.
La figura 11B presenta CAM tratada con microesferas de PCL de control, y la figura 11C presenta el tratamiento de microesferas con carga de 5% de paclitaxel. La CAM con las microesferas de control presenta una arquitectura normal de red de vasos capilares. La CAM tratada con microesferas de paclitaxel-PCL presenta una marcada regresión vascular y zonas que están faltas de una red de vasos capilares.
G. Discusión
El método de evaporación de disolvente para producir microesferas con carga de paclitaxel dio lugar a muy altas eficiencias de encapsulación de paclitaxel de entre 95 y 100%. Esto es debido a la mala solubilidad de paclitaxel en agua y a la naturaleza hidrófoba que favorece la separación en la fase de disolvente orgánico que contiene el polímero.
El perfil de desprendimiento bifásico para paclitaxel es típico de la forma de desprendimiento para muchos fármacos a partir de matrices de polímeros biodegradables. Poli(\varepsilon-caprolactona) es un poliéster alifático que se puede degradar por hidrólisis en condiciones fisiológicas, no es tóxico y es compatible con los tejidos. La degradación de PCL es significativamente más lenta que la de los polímeros y copolímeros extensamente investigados de los ácidos láctico y glicólico y es, por tanto, apropiado para el diseño de sistemas de administración peritubular a largo plazo de fármacos. La fase rápida o explosiva inicial de desprendimiento de paclitaxel se piensa que es debida al desprendimiento con difusión del fármaco desde la región superficial de las microesferas (próxima a la superficie de las esferas). El desprendimiento de paclitaxel en la segunda fase (más lenta) de los perfiles de desprendimiento no es debida probablemente a degradación o erosión de PCL, debido a que estudios han demostrado que en condiciones in vitro en agua, no hay pérdida significativa de peso o erosión superficial de PCL a lo largo de un período de 7,5 semanas. La fase más lenta de desprendimiento de paclitaxel se debe, probablemente, a la disolución del fármaco dentro de los poros llenos de fluido en la matriz polímera y difusión a través de los poros. La mayor velocidad de desprendimiento con cargas de paclitaxel más altas es probablemente resultado de una red de poros más extensa en la matriz polímera.
Las microesferas de paclitaxel con 5% de carga han demostrado que desprenden fármaco suficiente para producir una inhibición extensa de angiogénesis cuando están situadas sobre la CAM. La inhibición del desarrollo de vasos sanguíneos resultó en una zona no vascular, tal como se representa en la figura 11C.
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Ejemplo 7
Películas polímeras peritubulares con carga de agente terapéutico, compuestas con etileno-acetato de vinilo y un tensioactivo
Dos tipos de películas se investigan en este ejemplo: películas de EVA puro cargadas con paclitaxel y películas de mezcla de EVA/tensioactivo cargadas con paclitaxel.
Los tensioactivos a examinar son dos tensioactivos hidrófobos (Span 80 y Pluronic L101) y un tensioactivo hidrófilo (Pluronic F127). Los tensioactivos de Pluronic son polímeros ellos mismos, lo cual es una propiedad atractiva, ya que se pueden mezclar con EVA para optimizar diversas propiedades de administración de fármacos. Span 80 es una molécula más pequeña que, de alguna manera, se dispersa en la matriz polímera y no forma una mezcla.
Los tensioactivos son útiles para modular las velocidades de desprendimiento de paclitaxel a partir de películas y optimizar ciertos parámetros físicos de las películas. Un aspecto de las películas de mezclas de tensioactivos que indica que las velocidades de desprendimiento de fármacos se pueden controlar es la capacidad de variar la velocidad y extensión a la que el compuesto se hinchará en agua. La difusión de agua en una matriz de polímero-fármaco es crítica para el desprendimiento de fármaco desde el excipiente. Las figuras 12C y 12D presentan el grado de hinchamiento de las películas cuando se altera el nivel de tensioactivo en la mezcla. Películas de EVA puro no se hinchan en ninguna extensión significativa en más de 2 meses. Sin embargo, aumentando el nivel de tensioactivo añadido al EVA es posible incrementar el grado de hinchamiento del compuesto, e incrementando el carácter hidrófilo, también puede aumentar el hinchamiento.
Los resultados de los experimentos con estas películas se presentan más abajo en las figuras 12A-E. En resumen, la figura 12A representa el desprendimiento de paclitaxel (en mg) con el tiempo a partir de películas de EVA puro. La figura 12B representa el porcentaje de fármaco que permanece en las mismas películas. Según puede observarse en ambas figuras, cuando la carga de paclitaxel aumenta (es decir, aumenta el porcentaje de paclitaxel, en peso), la velocidad de desprendimiento de fármaco aumenta, que demuestra la esperada dependencia de la concentración. Cuando la carga de paclitaxel se incrementa, el porcentaje de paclitaxel restante en la película también aumenta, indicando que una carga más alta puede ser más atractiva para formulaciones de desprendimiento a largo plazo.
La resistencia física y la elasticidad de las películas se representan en la figura 12E. En resumen, la figura 12E presenta las curvas de esfuerzo/deformación para películas de EVA puro y de mezclas de EVA-tensioactivo. Esta medición tosca de esfuerzo demuestra que la elasticidad de películas se incrementa con la adición de Pluronic F127 y que la resistencia a la tracción (esfuerzo en el punto de rotura) se incrementa de una manera que depende de la concentración con la adición de Pluronic F127. La elasticidad y la resistencia física son consideraciones importantes para diseñar una película que se pueda manipular para aplicaciones clínicas peritubulares particulares sin causar deformación permanente del compuesto.
Los datos de más arriba demuestran la capacidad de ciertos aditivos tensioactivos para controlar las velocidades de desprendimiento de fármacos y para alterar las características físicas del excipiente.
Ejemplo 8
Incorporación de metoxipolietilenglicol 350 (MePEG) en poli(\varepsilon-caprolactona) para desarrollar una formulación para la administración controlada de agentes terapéuticos a partir de una pasta
Los reactivos y equipo que se utilizaron en estos experimentos incluyen metoxipolietilenglicol 350 ("MePEG" - Union Carbide, Danbury, CT). MePEG es líquido a temperatura ambiente y tiene un punto de congelación de 10ºC a -5ºC.
A. Preparación de una pasta de MePEG/PCL que contiene paclitaxel
Pasta de MePEG/PCL se prepara disolviendo, en primer lugar, una cantidad de paclitaxel en MePEG y, luego, incorporando esto en el PCL fundido. Una ventaja de este método es que no se requiere DCM.
B. Análisis del punto de fusión
El punto de fusión de mezclas polímeras de PCL/MePEG se puede determinar por calorimetría diferencial de barrido entre 30ºC y 70ºC, a una velocidad de calentamiento de 2,5ºC por minuto. Los resultados de este experimento se presentan en las figuras 13A y 13B. En resumen, tal como se presenta en la figura 13A, el punto de fusión de la mezcla polímera (determinado por análisis térmico) es disminuido por MePEG de una manera que depende de la concentración. El punto de fusión de las mezclas polímeras en función de la concentración de MePEG se presenta en la figura 13A. Este punto de fusión más bajo se traduce, también, en un incremento del tiempo para que las mezclas polímeras se solidifiquen desde la masa fundida, tal como se presenta en la figura 13.B Una mezcla de 30:70 de MePEG:PCL tarda más del doble de tiempo, para solidificar desde la masa fundida fluida, que el que tarda la PCL solo.
C. Medida de fragilidad
La incorporación de MePEG en PCL parece producir un sólido menos frágil, en comparación con PCL solo. Como manera "grosera" de cuantificar esto, una aguja pesada se hace caer desde una altura igual en mezclas polímeras que contienen de 0% a 30% de MePEG en PCL y, luego, se mide la distancia que penetra la aguja en el sólido. La gráfica resultante se presenta en la figura 13C. Los puntos se dan como media de cuatro medidas \pm 1 de desviación estándar.
Con fines de comparación, una muestra de cera de parafina se sometió también a ensayo y la aguja penetró en ella una distancia de 7,25 mm \pm 0,3 mm.
D. Medida del desprendimiento de paclitaxel
Gránulos de polímero (PCL que contiene 0%, 5%, 210% ó 20% de MePEG) se incuban en disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a 37ºC y se mide, con respecto al tiempo, el cambio en % del peso del polímero. Según se puede observar en la figura 13D, la cantidad de pérdida de peso aumenta con la concentración de MePEG originalmente presente en la mezcla. Es probable que esta pérdida de peso sea debida al desprendimiento de MePEG de la matriz polímera en el fluido de incubación. Esto indicaría que paclitaxel se desprenderá fácilmente de una mezcla de MePEG/PCL, ya que paclitaxel se disuelve primero en MePEG antes de la incorporación en PCL.
E. Efecto de cantidades variables de MePEG en el desprendimiento de paclitaxel
Se fabrican termopastas que contienen entre 0,8% y 20% de MePEG en PCL. Estos se cargan con 1% de paclitaxel. El desprendimiento de paclitaxel de gránulos de 10 mg en tampón de PBS a 37ºC se verifica usando HPLC. Tal como se presenta en la figura 13E, la cantidad de MePEG en la formulación no afecta la cantidad de paclitaxel que se desprende.
F. Efecto de las cantidades variables de paclitaxel en la cantidad total de paclitaxel desprendido de una mezcla de 20% de MePEG/PCL
Termopastas se fabrican que contienen 20% de MePEG en PCL y cargadas con 0,2% y 10% de paclitaxel. El desprendimiento de paclitaxel a lo largo del tiempo se mide tal como se describe más arriba. Tal como se representa en la figura 13F, la cantidad de paclitaxel desprendido a lo largo del tiempo aumenta cuando aumenta la carga de paclitaxel. Sin embargo, si se representa gráficamente en forma de porcentaje de paclitaxel total desprendido, el orden se invierte (figura 13G). Esto da información acerca del paclitaxel residual que permanece en la pasta y calcula una proyección del período de tiempo a lo largo del cual, paclitaxel se puede desprender de una termopasta de 20% de MePEG.
G. Análisis de resistencia mecánica de diversas mezclas de MePEG/PCL
Un aparato para ensayo de la resistencia mecánica CT-40 se usa para medir la resistencia de "pastillas" de polímeros sólidos de 0,88 cm de diámetro y un espesor medio de 0,560 cm. Las pastillas polímeras son mezclas de MEPEG a concentraciones de 0%, 5%, 10% ó 20% en PCL.
Los resultados de este ensayo se representan en la figura 13H, en la que la resistencia a la tracción y el tiempo para romper están representados gráficamente en función del % de MePEG en la mezcla. ANOVA de variable única indicaba que los espesores de las pastillas en cada grupo no eran diferentes. Como se puede comprobar en la figura 13H, la adición de MePEG a PCL disminuía la dureza del sólido resultante.
H. Efecto de radiación \gamma sobre el desprendimiento de paclitaxel
Pasta de PCL:MePEG (80:20) cargada con 20% de paclitaxel se irradió con radiación \gamma y se analizó el desprendimiento de paclitaxel con respecto al tiempo. Los resultados se representan en la figura 30.
En resumen, sobre la base de los experimentos de más arriba se puede concluir que la adición de MePEG transforma al polímero menos quebradizo más como una cera, reduce el punto de fusión e incrementa el tiempo de solidificación del polímero. Todos estos factores mejoran las propiedades de aplicación de la pasta. A concentraciones bajas (20%), MePEG no tiene ningún efecto sobre el desprendimiento de paclitaxel a partir de PCL. Radiación gamma parece tener poco efecto sobre el desprendimiento de paclitaxel.
Ejemplo 9
Alteración del desprendimiento de agente terapéutico de termopasta usando poli(ácido D, L-láctico)
Tal como se discute más arriba, dependiendo del efecto terapéutico deseado, se pueden desear excipientes polímeros de desprendimiento rápido o de desprendimiento lento. Por ejemplo, policaprolactona (PCL) y mezclas de PCL con polietilenglicol (PEG) producen composiciones que desprenden paclitaxel a lo largo de un período de varios meses. En particular, la difusión de paclitaxel en los polímeros es muy lenta debido a su gran tamaño molecular y extrema cualidad de hidrófobo.
Por otro lado, poli(ácido D,L-láctico) (PDLLA) de bajo peso molecular da una rápida degradación, que oscila entre 1 día y unos pocos meses, dependiendo de su peso molecular inicial. El desprendimiento de paclitaxel, en este caso, es dominado por la degradación del polímero. Otra característica de PDLLA de bajo peso molecular es su baja temperatura de fusión (es decir, 40ºC-60ºC), lo cual lo hace material apropiado para producir termopasta. Tal como se describe más abajo con más detalle, varios métodos diferentes se pueden utilizar con el fin de controlar la velocidad de degradación de polímeros, que incluye, por ejemplo, cambiar el peso molecular del PDLLA y/o mezclándolo con PCL, PCLLA o poli(lactida-co-gliocida) (PLGA).
A. Materiales experimentales
Ácido D,L-láctico se adquirió de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. PCL (peso molecular 10-20.000) se obtuvo de Polysciences, Warrington, PA. PDLLA de alto peso molecular (0,66 dL/g de viscosidad intrínseca) y PLGA (composición de 50:50, viscosidad 0,58 dL/g) eran de Birmingham Polymers.
B. Síntesis de PDLLA de bajo peso molecular
PDLLA de bajo peso molecular se sintetizó a partir de ácido D,L-láctico por policondensación. En resumen, ácido D,L-láctico se calentó en un vaso de precipitados de vidrio a 200ºC con purga de nitrógeno y agitación magnética durante un tiempo deseado. La viscosidad aumentó durante la polimerización, debido al incremento del peso molecular. Tres lotes se obtuvieron con diferentes tiempos de polimerización, es decir, 40 min (peso molecular 800), 120 min y 160 min.
C. Formulación de termopastas de paclitaxel
Paclitaxel se cargó, al 20%, en los siguientes materiales mezclando a mano, a una temperatura de aproximadamente 60ºC:
1.
PDLLA de bajo peso molecular con tiempo de polimerización de 40 min.
2.
PDLLA de bajo peso molecular con tiempo de polimerización de 20 min.
3.
PDLLA de bajo peso molecular con tiempo de polimerización de 160 min.
4.
una mezcla al 50:50 de PDLLA de alto peso molecular y PDLLA de bajo peso molecular 40 min.
5.
una mezcla al 50:50 de PLGA de alto peso molecular y PDLLA de bajo peso molecular 40 min.
6.
mezclas de PCL de alto peso molecular y PDLLA de bajo peso molecular PDLLA 40 min con PCL:PDLLA de 10:90.20:80,40:60,60:40 y 20:80. Las mezclas de PDLLA o PLGA de alto peso molecular, con PDLLA de bajo peso molecular se obtuvieron disolviendo los materiales en acetona seguidas de secado.
D. Estudio de desprendimiento
El desprendimiento de paclitaxel en tampón de PBS albúmina se midió tal como se describe más arriba con HPLC a tiempos diversos.
E. Resultados
PDLLA de bajo peso molecular 40 min era un material blando con color amarillo pálido. El color es, quizás, debido a la oxidación durante la policondensación. PDLLA de bajo peso molecular 120 min (amarillo) y 160 min (marrón) eran sólidos frágiles a temperatura ambiente. Todos ellos fundían a 60ºC. Mezclas de PDLLA o PLGA de alto peso molecular 50:50 con PDLLA de bajo peso molecular 40 min también fundían a aproximadamente 60ºC.
Durante el desprendimiento, PDLLA de bajo peso molecular 40 min y 120 min se rompen en fragmentos al cabo de un día; otros materiales estaban intactos hasta el momento de este escrito (3 días).
El desprendimiento de paclitaxel de las formulaciones 2-5 se presentan en la figura 14. PDLLA de bajo peso molecular 40 min y 120 min dieron el desprendimiento más rápido debido al despedazamiento de la pasta. El desprendimiento fue limitado, tal vez, por la solubilidad. PDLLA de bajo peso molecular 160 min también dio un desprendimiento rápido pero mantenía unos gránulos intactos. Por ejemplo, 10% de paclitaxel cargado se desprendió en un día. Las mezclas 50:50 de PDLLA o PLGA de alto peso molecular con PDLLA de bajo peso molecular 40 min eran más lentas, es decir, 3,4% y 2,2% de desprendimiento en un día.
Aunque no se establece específicamente más arriba, una amplia variedad de otros excipientes polímeros se pueden fabricar, que incluyen, por ejemplo, (1) poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido 6-hidroxicaproico), poli(ácido 5-hidroxivalérico), poli(ácido 4-hidroxibutírico) de bajo peso molecular (500-10.000) y sus copolímeros; (2) mezclas de más arriba (# 1); (3) mezclas de (# 1) de más arriba con poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido 6-hidroxicaproico), poli(ácido 5-hidroxivalérico), poli(ácido 4-hidroxibutírico) de alto peso molecular y sus copolímeros; y (4) copolímeros de polietilenglicol y Pluronics con poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido 6-hidroxicaproico), poli(ácido 5-hidroxivalérico), poli(ácido 4-hidroxibutírico) y sus copolímeros.
Ejemplo 10
Preparación de composiciones polímeras que contienen aditivos solubles en agua y paclitaxel A. Preparación de composiciones polímeras
Micropartículas de co-precipitados de paclitaxel/aditivo se prepararon y subsiguientemente se añadieron a PCL para formar pastas. En resumen, paclitaxel (100 mg) se disolvieron en 0,5 mL de etanol (95%) y se mezclaron con el aditivo (100 mg) previamente disueltos o dispersados en 1,0 mL de agua destilada. La mezcla se trituró hasta que se formó una pasta suave. La pasta se extendió sobre una cápsula de Petri y se secó al aire durante la noche a 37ºC. La masa seca se pulverizó usando un mortero y su mano y se hizo pasar a través de un tamiz de 140 mallas (106 \mum) (Endecotts Test Sieves Ltd., London, England). Las micropartículas (40%) se incorporaron luego al PLC fundido (60%) a 65ºC que corresponde a una carga de 20% de paclitaxel. Los aditivos usados en el estudio fueron gelatina (Tipo B, 100 BLOOM, Fisher Scientific), metilcelulosa (British Drug Houses), dextrano T500 (Pharmacia, Sweden), albúmina (Fisher Scientific), y cloruro sódico (Fisher Scientific). Micropartículas de paclitaxel y gelatina o albúmina se prepararon tal como se describe más arriba, pero se hicieron pasar a través de un tamiz de 60 mallas (270 \mum) (Endecotts Test Sieves Ltd., London, England) para evaluar el efecto del tamaño de micropartículas sobre el desprendimiento de paclitaxel a partir de la pasta. También se prepararon pastas para contener 10, 20 ó 30% de gelatina y 20% de paclitaxel en PCL para estudiar el efecto de la proporción del aditivo sobre el desprendimiento de fármaco. A no ser que se especifique de otra manera, pastas que contenían 20% de paclitaxel dispersadas en PCL se prepararon para servir de controles en los estudios de velocidad de desprendimiento.
B. Estudios de desprendimiento de fármacos
Gránulos de aproximadamente 2,5 mg de pasta con carga de paclitaxel se pusieron en suspensión en 50 mL de disolución salina tamponada con fosfato 10mM, pH 7,4 (PBS) en tubos con tapones de rosca. Los tubos se agitaron enérgicamente a 37ºC y a intervalos de tiempo dado, se separaron 49,5 mL de materia que sobrenadaba, se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum y se conservaron para el análisis de paclitaxel. Un volumen igual de PBS se repuso en cada tubo para mantener las condiciones de colector a lo largo del estudio. Para análisis, los filtrados se extrajeron con 3 x 1 mL de diclorometano (DCM), los extractos de DCM se evaporaron a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y se volvió a disolver en 1 mL de acetonitrilo. El análisis fue por HPCL usando una fase móvil de agua:metanol:acetonitrilo (37:5:58) con un caudal de 1 mL/min (Beckman Isocratic Puma), una columna de fase inversa C18 (Beckman) y detección de UV (Shimadzu SPD A) a 232 nm.
C. Estudios de hinchamiento
Pastas de paclitaxel/aditivo/PCL se prepararon usando micropartículas de aditivo con paclitaxel de tamaño de malla 140 (y 60 sólo para gelatina), se extrusionaron para formar cilindros, se cortaron en porciones, se pesaron y el diámetro y la longitud de cada porción se midieron usando un micrómetro (Mitutoyo Digimatic). Las porciones se pusieron en suspensión en agua destilada (10 mL) a 37ºC y a intervalos predeterminados se desechó el agua y se midieron el diámetro y la longitud de las porciones cilíndricas y se pesaron las muestras. La morfología de las muestras (antes y después de la suspensión en agua) se examinó usando microscopia electrónica de barrido (SEM) (Hitachi F-2300). Las muestras se revistieron con 60% de Au y 40% de Pd (espesor 10 - 15 nm) usando un Hummer Instrument (Technics, USA).
D. Estudios de membrana corioalantoica (CAM) de embrión de pollo
Embriones de pollo fecundados domésticos se incubaron durante 4 días antes del cultivo sin cáscara. Los contenidos de los huevos se incubaron a 90% de humedad relativa y 3% de CO_{2} y al sexto día de incubación, porciones de 1 mg de la pasta con carga de paclitaxel (que contenía 6% de paclitaxel, 24% de gelatina y 70% de PCL) o pastas de control (30% de gelatina en PCL) se situaron directamente sobre la superficie de CAM. Después de una exposición de 2 días, se examinó la vasculatura usando un estereomicroscopio en interfase con una cámara de vídeo; las señales del vídeo se llevaron a ordenador y se imprimió el vídeo.
E. Actividad anti-tumor in vivo
Con pastas, preparadas tal como se describe más arriba (usando fracciones de tamaño de malla 140 de las microesferas de paclitaxel-gelatina), que contenían 20% de paclitaxel, 20% de gelatina y 60% de PCL, se llenaron jeringas de 87 x 1 mL (BD Insulin Sirynge, ½ cc), conteniendo cada jeringa 150 mg de la pasta (equivalente a 30 mg de paclitaxel). Ratones hembras DBA/2j (16) de 10 semanas de edad, que pesaban 18-20 g se aclimataron durante 4 días después de la llegada y cada ratón se inyectó en el costado posteriolateral con células tumorales MDAY-D2 (10 x 10^{6} mL^{-1}) en 100 \muL de disolución salina tamponada con fosfato en el día 1. En el día 6, los ratones se dividieron en dos grupos de ocho, el sitio del tumor se abrió bajo anestesia y 150 mg de la pasta, previamente calentada a aproximadamente 60ºC, se extrusionó en el sitio del tumor y se cerró la herida. Un grupo se implantó con la pasta con carga de paclitaxel y el otro grupo con pasta de control que solamente contenía gelatina y PCL. En el día 16, los ratones se sacrificaron y se midieron el peso de los ratones y el tumor extirpado.
F. Resultados y discusión
Micropartículas de paclitaxel y gelatina o albúmina co-precipitados eran duros y frágiles y se incorporaron rápidamente en PCL, mientras que los otros aditivos producían partículas blandas que presentaban tendencia a desmenuzarse durante la preparación de la pasta.
La figura 15 representa el transcurso del tiempo de desprendimiento de paclitaxel a partir de pastas que contienen 20% de paclitaxel en PCL ó 20% de paclitaxel, 20% de aditivo y 60% de PCL. El desprendimiento de paclitaxel de PCL, con o sin aditivos, siguió un modelo de desprendimiento bi-fásico; inicialmente, había una velocidad de desprendimiento de fármaco rápida, seguida por un desprendimiento más lento de fármaco. El período inicial de velocidad de desprendimiento más rápido a partir de las pastas, se pensaba que era debido a la disolución del paclitaxel situado en la superficie o a la difusión de paclitaxel desde las regiones superficiales de la pasta. La fase subsiguiente más lenta de los perfiles de desprendimiento se puede atribuir al decrecimiento del área superficial eficaz de las partículas de fármaco en contacto con el disolvente, una ligera entrada del disolvente en la matriz polímera o un incremento en las trayectorias de difusión media del fármaco a través de la matriz polímera.
Ambas fases de los perfiles de desprendimiento de paclitaxel a partir de PCL aumentaron en presencia de los aditivos hidrófilos con gelatina, albúmina y metilcelulosa, que producían el mayor incremento en las velocidades de desprendimiento de fármaco (figura 15). Hubo incrementos posteriores en el desprendimiento de paclitaxel desde la matriz polímera cuando partículas de aditivos de paclitaxel más grandes (270 \mum) se usaron para preparar la pasta, en comparación con las partículas de aditivos de paclitaxel más pequeños (106 \mum) (figura 16). Incrementos en la cantidad del aditivo (por ejemplo, gelatina) producía el correspondiente aumento en el desprendimiento de fármaco (figura 16). La figura 17A presenta el comportamiento de hinchamiento de pastas que contienen 20% de paclitaxel, 20% de aditivo y 60% de PCL. La velocidad de hinchamiento siguió el orden gelatina > albúmina > metilcelulosa > dextrano > cloruro sódico. Además, la velocidad de hinchamiento aumentó cuando una proporción más alto de polímero soluble en agua se añadió a la pasta (Figura 17B). Las pastas que contenían gelatina o albúmina se hinchaban rápidamente dentro de las 8-10 horas primeras y subsiguientemente la velocidad de hinchamiento disminuyó cuando el cambio en el volumen de la muestra fue superior al 40%. La pasta preparada usando las partículas de paclitaxel-gelatina más grandes (270 \mum) se hinchaban a una velocidad más rápida que las preparadas con las partículas de paclitaxel-gelatina más pequeñas (106 \mum). Todas las pastas se desintegraban cuando los aumentos de volumen eran superiores al 50%. Los estudios de SEM demostraban que el hinchamiento de las pastas era acompañado por la figuración de la matriz (figura 18). Con grandes aumentos (figuras 18C y 18D) se tuvo la evidencia de cristales de paclitaxel con forma de agujas o varillas en la superficie de la pasta y en estrecha asociación con gelatina después de hinchamiento (figuras 18C
y 18D).
Agentes hidrófilos osmóticos o capaces de ser hinchados, incrustados en forma de partículas discretas en el polímero hidrófobo dan lugar a desprendimiento de fármaco por una combinación de la erosión de la matriz, difusión del fármaco a través de la matriz polímera, y/o difusión y/o flujo de convección a través de los poros creados en la matriz por la disolución de los aditivos solubles en agua. Agentes osmóticos y polímeros capaces de hincharse, dispersados en un polímero hidrófobo absorberían agua (actuando a modo de mecha), se disuelven o hinchan y ejercen una presión de turgencia que romperían el septo (capa de polímero) entre partículas adyacentes, que crean micro-canales y facilitan, así, el escape de las moléculas de fármaco al medio circundante por difusión o flujo de convección. El hinchamiento y formación de fisuras de la matriz de la pasta (figura 18) probablemente dio lugar a la formación de micro-canales a través del interior de la matriz. Las diferentes velocidades y extensión de hinchamiento de los polímeros (figura 17) pueden dar razón de las diferencias en las velocidades de desprendimiento de paclitaxel observadas (figuras
15 y 16).
La figura 19 presenta CAM tratadas con pasta de gelatina-PCL de control (figura 19A) y 20% de pasta de paclitaxel-gelatina-PCL (figura 19B). La pasta sobre la superficie de las CAM está representada por las flechas en las figuras. La CAM con la pasta de control muestra una arquitectura de red de capilares normal. Las CAM tratadas con pasta de paclitaxel-PCL consistentemente presentaba regresión vascular y zonas que estaban faltas de una red de capilares. La incorporación de aditivos en la pasta aumentó marcadamente el diámetro de la zona sin vascularidad (figura 19).
Los resultados del estudio in vivo se presentan en la figura 20. En resumen, la inyección peri-tumoral de pasta de paclitaxel-gelatina-PCL en ratones con tumores establecidos y palpables demostró que esta preparación producía una reducción media de 63% en la masa tumoral en comparación con los controles. Además, no había ningún efecto importante en los peso de los ratones después del tratamiento. Pastas de paclitaxel-PCL (sin aditivos) no produjeron ninguna reducción significativa en la masa de los tumores.
Este estudio demostró que el desprendimiento in vitro de paclitaxel a partir de PCL se podría incrementar por la incorporación de micropartículas de paclitaxel/polímero hidrófilo en matriz de PCL. Estudios in vivo que evalúan la eficacia de la formulación en el tratamiento de tumores subcutáneos en ratones, también demostraron que la pasta de paclitaxel/gelatina/PCL reducía significativamente la masa tumoral. Factores tales como el tipo de agente soluble en agua, el tamaño de partícula y la proporción de aditivos demostraron influir en las características del fármaco.
La inyección peritubular de una pasta quimioterapéutica en la adventicia de un tubo obstruido por un crecimiento excesivo maligno puede reducir el desarrollo local del tumor y podría aliviar síntomas de obstrucción sin procedimientos quirúrgicos agresivos.
Ejemplo 11
Modificación de desprendimiento de paclitaxel de termopasta usando PDLLA-PEG-PDLLA y poli(ácido D,L-Láctico) de bajo peso molecular A. Preparación de PDLLA-PEG-PDLLA y PDLLA de bajo peso molecular
DL-Lactida se adquirió de Aldrich. Polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de 8.000, octoato estannoso, y ácido DL-láctico se adquirieron de Sigma. Poli \varepsilon-caprolactona (PCL) con un peso molecular de 20.000 se obtuvo de Birmingham Polymers (Birmingham, AL). Paclitaxel se adquirió de Hauser Chemicals (Boulder, CO). Estándares de poliestireno con distribuciones de pesos moleculares estrechas se adquirieron de Polysciences (Warrington, PA). Acetonitrilo y cloruro de metileno eran de calidad HPLC (Fisher Scientific).
El copolímero tribloque de PDLLA-PEG-PDLLA se sintetizó por una polimerización con abertura de anillo. Monómeros de DL-lactida y PEG se mezclaron en diferentes proporciones y se añadió 0,5% en peso de octoato estannoso. La polimerización se llevó a cabo a 150ºC durante 3,5 horas. PDLLA de bajo peso molecular se sintetizó por policondensación de ácido DL-láctico. La reacción se realizó en un matraz de vidrio en condiciones de purga suave de nitrógeno, agitación mecánica y calentamiento a 180ºC durante 1,5 horas. El peso molecular de PDLLA era aproximadamente 800, medido por titulación de los grupos terminales del ácido carboxílico.
B. Fabricación de formulaciones de pastas
Paclitaxel en cargas de 20% ó 30% se mezcló totalmente en los copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA o mezclas de PDLLA:PCL 90:10, 80:20 y 70:30 fundido a aproximadamente 60ºC. Las pastas con carga de paclitaxel se pesaron en jeringas de 1 mL y se almacenaron a 4ºC.
C. Caracterización de PDLLA-PEG-PDLLA y mezclas de pastas
Los pesos y distribuciones moleculares de los copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA se determinaron a temperatura ambiente por GPC usando una bomba de HPLC LC-10AD de Shimadzu y un detector de índice de refracción RID-6A de Shimadzu (Kyoto, Japan) acoplado a una columna de 10^{4} \ring{A} de HEWLETT PACKARD PlGEL. La fase móvil era cloroformo con un caudal de 1 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue 20 \muL con una concentración de polímero de 0,2% (peso/volumen). Los pesos moleculares de los polímeros se determinaron en relación con estándares de poliestireno. La viscosidad intrínseca de PDLLA-PEG-PDLLA en CHCl_{3} a 25ºC se midió con un viscosímetro de Cannon-Fenske.
El análisis térmico de los copolímeros se llevó a cabo por calorimetría diferencial de barrido (DSC) usando un regulador TA Instruments 2000 y DSC 910S de DuPont (Newcastle, Delaware). La velocidad de calentamiento fue de 10ºC/min y las muestras de copolímero y matriz de paclitaxel/copolímero se pesaron (3-5 mg) en bandejas de aluminio para muestras, abiertas dobladas hacia dentro. Espectros de RMN de PDLLA-PEG-PDLLA con carga de paclitaxel se obtuvieron en CDCl_{3} usando un instrumento de RMN (Broker, AC-200E) de 200 MHz. La concentración del polímero fue de 1-2%.
La morfología de la pasta de paclitaxel-PEG-PDLLA se investigó usando microscopia electrónica de barrido (SEM) (Hitachi F-2300). La muestra se revistió con 60% de Au y 40% de Pd (espesor 10 - 15 nm) usando un instrumento de Hummer (Technics, USA).
D. Desprendimiento in vitro de paclitaxel
Un gránulo de pasta (aproximadamente 2 mg) de PDLLA-PCL con carga de 20% de paclitaxel o un cilindro (fabricado de pasta por extrusión de una pasta fundida a través de una jeringa sin aguja) de pasta de PDLLA-PEG-PDLLA con carga de 20% de paclitaxel se introdujeron en tubos de vidrio de 14 mL taponados que contenían 10 mL de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) con 0,4 g/L de albúmina. El tubo se incubó a 37ºC con mezcla rotacional suave. La masa que sobrenadaba se extraía periódicamente para análisis de paclitaxel y se reponía con tampón de PBS/albúmina de nueva aportación. La materia que sobrenadaba (10 mL) se extrajo con 1 mL de cloruro de metileno. La fase acuosa se decantó y la fase de cloruro de metileno se secó con corriente de nitrógeno a 60ºC. El residuo seco se reconstituyó en una mezcla 40:60 de agua:acetonitrilo y se centrifugó a 10.000 g durante aproximadamente 1 min. La cantidad de paclitaxel en la materia que sobrenadaba se analizó, luego, por HPLC. El análisis de HPLC se realizó usando una bomba 110A y columna de ultraesfera C-8 (Beckman) y un detector de UV SPD-6A ajustado a 232 nm, un autoinyector SIL-9A y un integrador C-R3A (Shimadzu). El volumen de inyección fue de 20 \muL y el caudal fue 1 mL/min. La fase móvil fue 58% de acetonitrilo, 5% de metanol y 37% de agua destilada.
E. Estudio de animales in vivo
Diez ratones DBA/2j de 10 semanas de edad se aclimataron durante 3-4 días después de su llegada. Cada ratón se inyectó subcutáneamente, en el costado lateral inferior, con 10 x 10^{5} células tumorales MDAY-D2 en 100 \muL de PBS en el día 1. En el día 6, los ratones se dividieron, al azar, en dos grupos. El grupo 1 se implantó con pasta sola (control) y el grupo 2 se implantó con pasta cargada con paclitaxel. Una bolsa subcutánea próxima al tumor se formó quirúrgicamente bajo anestesia y aproximadamente 100 mg de pasta fundida (calentada a 50ºC-60ºC) se introdujo en la bolsa y se cerró la herida. En el día 16, los ratones se sacrificaron, y los tumores se separaron y se pesaron. El día 16 se eligió para permitir el crecimiento del tumor en un tamaño fácilmente mensurable dentro del límite ético.
F. Resultados y discusión
El peso molecular y la distribución de pesos moleculares de PDLLA-PEG-PDLLA, en relación con estándares de poliestireno, se midieron por GPC (figura 21). La viscosidad intrínseca del copolímero en CHCl_{3} a 25ºC se determinó usando un viscosímetro de Canon-Fenske. El peso molecular y la viscosidad intrínseca disminuyeron cuando aumentaba el contenido de PEG. Las polidispersidades de PDLLA-PEG-PDLLA con contenidos de PEG de 10% - 40% fueron 2,4 a 3,5. Sin embargo, el copolímero con 70% de PEG tenía una distribución estrecha de pesos moleculares con una polidispersidad de 1,21. Esto puede ser porque un contenido alto de PEG reducía la posibilidad de reacciones secundarias tales como transesterificación, la cual da lugar a un distribución ancha del peso molecular del polímero. Alternativamente, una estructura enrollada de los copolímeros de bloques hidrófobos-hidrófilos puede dar lugar a un valor de polidispersidad artificialmente bajo.
Los resultados de DSC de copolímeros de PEG puro y PDLLA-PEG-PDLLA se dan en las figuras 21 y 22. Los PEG y PDLLA-PEG-PDLLA con contenidos de PEG de 70% y 40% presentaban picos endotérmicos con entalpía y temperatura decrecientes cuando disminuía el contenido de PEG del copolímero. Los picos endotérmicos en los copolímeros de 40% y 70% de PEG se debieron probablemente al estado de fusión de la región de PEG, que indica la ocurrencia de separación de fases. Aunque el PEG puro tenía un pico de fusión puntiagudo, los copolímeros de 70% y de 40% de PEG presentaban picos anchos con un hombro nítido en el caso de 70% de PEG. Los puntos de fusión anchos pueden haber resultado de la interferencia de PDLLA con la cristalización de PEG. El hombro en el caso de 70% de PEG puede representar la transición vítrea de la región de PDLLA. Ningún cambio térmico ocurrió en los copolímeros con contenidos de PEG de 10%, 20% y 30% en un intervalo de temperaturas de 10 - 250ºC, lo cual indica que no había ocurrido nada de cristalización significativa (por tanto, puede ser la fase de separación).
Termogramas de DSC de mezclas de PDLLA:PCL (70:30, 80:20, 90:10) sin paclitaxel o con 20% de paclitaxel presentaban un pico endotérmico a aproximadamente 60ºC, resultante de la fusión de PCL. Debido a la naturaleza amorfa de PDLLA y su bajo peso molecular (800), no se observaron ni fusión ni transiciones vítreas. No se observó ningún cambio térmico debido a la recristalización o fusión de paclitaxel.
Copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA de un contenido de 20% y 30% de PEG se eligieron como materiales de formulaciones óptimas para la pasta por las siguientes razones. PDLLA-PEG-PDLLA de 10% de PEG no podían fundirse a una temperatura de aproximadamente 60ºC. Los copolímeros de 40% y 70% de PEG fundían rápidamente a 60ºC y los copolímeros de 20% y 30% de PEG se transformaron en un líquido viscoso entre 50ºC y 60ºC. El hinchamiento de copolímeros de 40% y 70% de PEG en agua era muy alto, resultando en una rápida dispersión de las pastas en agua.
Los perfiles de desprendimiento in vitro de paclitaxel a partir de cilindros de PDLLA-PEG-PDLLA se presentan en la figura 23. El experimento que medía el desprendimiento en cilindros con 40% de PEG se terminó porque los cilindros tenían un grado de hinchamiento muy alto (aproximadamente 200% de absorción de agua en un día) y se desmenuzaban a los pocos días. La fracción desprendida de paclitaxel de cilindros con 30% de PEG aumentó gradualmente a lo largo de 70 días. La fracción desprendida de cilindros de 20% de PEG aumenta lentamente hasta los 30 días y, después, aumentaba bruscamente, seguido por otro período de incremento gradual. Una diferencia importante existía en la extensión en la que cada cilindro individual (contenido de 20% de PEG) presentaba el cambio brusco en el desprendimiento de paclitaxel. Antes del incremento brusco, la fracción de desprendimiento de paclitaxel era más bajo para copolímeros de contenido de PEG más bajo con el mismo diámetro del cilindro (1 mm). Cilindros de 30% y 40% de PEG presentaban proporciones de desprendimiento de paclitaxel mucho más altas que los cilindros de 20% de PEG. Por ejemplo, el cilindro de de 30% de PEG desprendió 17% de paclitaxel en 30 días en comparación con un desprendimiento del 2% por el cilindro con 20% de PEG. Los cilindros con diámetros más pequeños daban lugar a velocidades de desprendimiento más rápidas, por ejemplo, en 30 días, los cilindros de 30% de PEG con diámetros de 0,65 mm y 1 mm desprendieron 26% y 17% de paclitaxel respectivamente (figura 23).
Las observaciones de más arriba se pueden explicar por los mecanismos de desprendimiento de paclitaxel desde los cilindros. Paclitaxel se dispersó en el polímero en forma de cristales tal como se comprueba por microscopia óptica. Los cristales comenzaban disolviéndose en la matriz polímera a 170ºC y se disolvieron completamente a 180ºC, tal como se observa por microscopio de platina caliente. Termogramas de DSC de 20% de paclitaxel cargado con pasta de PDLLA-PEG-PDLLA (30% de PEG) revelaban una pequeña exoterma de recristalización (16 J/g, 190ºC) y una endoterma de fusión (6 J/g, 212ºC) para paclitaxel (figura 21) que demuestra la recristalización de paclitaxel de la masa fundida del copolímero, desde 180ºC. En este tipo de matriz de fármaco/polímero, paclitaxel se podría desprender vía difusión y/o erosión del polímero.
En el caso de difusión controlada, fármaco se puede desprender por difusión molecular en el polímero y/o a través de canales abiertos, formados por partículas de fármaco conectadas. Por tanto, con carga de 20%, algunas partículas de paclitaxel estaban aisladas y paclitaxel se puede desprender por disolución en el copolímero seguido de difusión. Otras partículas de paclitaxel podrían formar grupos que conectan con la superficie y ser desprendidas a través de canales de difusión. En ambos casos, los cilindros con dimensión más pequeña daban un desprendimiento de fármaco más rápido debido a la trayectoria de difusión más corta (figura 23).
Los cambios de dimensiones y la captación de agua de los cilindros se registraron durante el desprendimiento (figura 23). Los cambios de longitud, diámetro y peso en húmedo de los cilindros con 30% de PEG aumentó rápidamente a un máximo en 2 días, permaneció sin cambiar durante aproximadamente 15 días y, después, disminuyó gradualmente. El diámetro inicial del cilindro no afectó al comportamiento de hinchamiento. Para los cilindros de 20% de PEG, la longitud disminuyó un 10% en un día y se niveló, en tanto que el diámetro y la captación de agua aumentaban gradualmente con el tiempo. Puesto que más PEG en el copolímero captaba más agua para facilitar la difusión de paclitaxel, se observó un desprendimiento más rápido (Figura 23).
La degradación del peso molecular del copolímero de la pasta de PDLLA-PEG-PDLLA se verificó por GPC. Para el cilindro de 20% de PEG, el volumen de elución en la posición del pico aumentaba con el tiempo, indicando un reducido peso molecular del polímero durante el curso del experimento de desprendimiento (figura 25). Una distribución bifásica del peso molecular se comprobó el día 69. El peso molecular del polímero también decreció para cilindros de 30% de PEG (1 mm y 0,65 mm). Sin embargo, no se observó distribución bifásica.
El espectro de RMN reveló un pico de PEG con 3,6 ppm y picos de PDLLA con 1,65 ppm y 5,1 ppm. El área del pico de PEG en relación con el PDLLA en el copolímero disminuyó significativamente después de 69 días (figura 26), que demuestra la disolución de PEG después de su disociación de PDLLA. También se registró la pérdida de masa seca de los cilindros (figura 26) y demuestra una velocidad de degradación que disminuye en el orden 30% de PEG-0,65 mm > 30% de PEG-1 mm > 20% de PEG-1 mm.
Se observaron los cambios morfológicos de los cilindros secos, antes y durante el desprendimiento de paclitaxel, usando SEM (figura 27). En resumen, cristales sólidos de paclitaxel y matrices polímeras no porosas se observaron antes del desprendimiento (figuras 27A y 27B). Después de 69 días de desprendimiento, no se observaron cristales de paclitaxel y las matrices contenían muchos poros debidos a la degradación del polímero y absorción de agua (figuras 27C y 27D).
Los cilindros de 30% de PEG presentaban un hinchamiento extensivo después de sólo dos días en agua (figura 24) y, por tanto, se redujo el obstáculo a la difusión del bloque de PEG, soluble en agua, separado y de PDLLA degradado (es decir, oligómeros de ácido LD-láctico). Puesto que la pérdida de masa y la degradación de los cilindros de 30% de PEG eran continuas, la contribución de desprendimiento por erosión aumentó gradualmente, lo cual dio lugar a un desprendimiento sostenido de paclitaxel sin ningún cambio repentino (figura 23). Para los cilindros de 20% de PEG, el hinchamiento era bajo inicialmente (figura 24), que resultaba en una difusión lenta de los productos de degradación. Por tanto, los productos de degradación en la región interior son retenidos originalmente, mientras hay muchos menos productos de degradación en la región exterior debido a la trayectoria de difusión más corta. Los productos de degradación aceleraba la velocidad de degradación, ya que los grupos terminales de ácidos carboxílicos de los oligómeros catalizaban la degradación hidrolítica. Esto dio lugar a una corteza de alto peso molecular y una parte interior de peso molecular bajo tal como se comprobaba por la distribución de pesos moleculares de copolímero bifásico (figura 25, día 69). Puesto que la rotura de la corteza era dependiente de factores tales como resistencia mecánica, espesor y defectos de la cáscara y productos de degradación interior, el comienzo y extensión de la pérdida de productos por degradación interior eran muy variables. Debido a que la rotura de la cáscara no es consistente y el fármaco en el polímero no es microscópicamente homogéneo, el momento del tiempo para la explosión del desprendimiento y la extensión del desprendimiento eran diferentes para las 4 muestras sometidas a ensayo (figura 23).
El desprendimiento de paclitaxel de mezclas de PDLLA y PCL está representado en la figura 28. En resumen, la fracción de desprendimiento aumentaba con el contenido de PDLLA en la mezcla. Por ejemplo, en el espacio de 10 días, el paclitaxel desprendido de 80:20, 70:30 y 0:100 de PDLLA:PCL fue 17%, 11% y 16% respectivamente. Después de una explosión inicial en un día, aproximadamente se obtuvo un desprendimiento constante a partir de la pasta 80:20 de PDLLA:PCL. No se observó ningún grado de hinchamiento significativo durante el desprendimiento. Para las mezclas de PDLLA:PCL, puesto que PDLLA tenía un peso molecular muy bajo de aproximadamente 800, se hidrolizó rápidamente en productos solubles en agua sin una larga demora en pérdida de masa. PCL sirvió como material de "reserva" para proteger la pasta de una rápida desintegración. Por tanto, la velocidad de desprendimiento aumentó con el contenido de PDLLA en la mezcla, debido a la degradación incrementada. La continua erosión de PDLLA controlaba el desprendimiento de paclitaxel y daba lugar a un desprendimiento constante. El desprendimiento de paclitaxel de PCL pura era probablemente difusión controlada debida a la lenta velocidad de degradación (en 1-2 años) de PCL.
Se encontraron dificultades en el estudio de desprendimiento en pasta de PDLLA:PCL (90:10) con carga de 20% de paclitaxel, debido a la desintegración del gránulo de pasta dentro de las 24 horas de incubación. En resumen, durante las primeras 12 horas de incubación, se tomaron muestras cada hora con el fin de garantizar las condiciones de colector para el desprendimiento de paclitaxel. El paclitaxel desprendido de la pasta de 90:10 fue de 25-35% en 10 horas.
Se evaluó la eficacia de las formulaciones de pastas para la regresión del desarrollo de tumores en ratones (figura 29). En resumen, las pastas examinadas fueron PCL \pm 20% de paclitaxel, PDLLA:PCL (80:20) \pm 20% de paclitaxel, PDLLA:PCL (90:10) \pm 20% de paclitaxel y PDLLA:PCL (30% de PEG) \pm 20% de paclitaxel. Las formulaciones de pasta, PDLLA:PCL (90:10) y PDLLA-PEG-PDLLA que contenían paclitaxel reducían el crecimiento del tumor in vivo en un 54 y 40%, respectivamente. Por el contrario, las formulaciones de pastas PCL y PDLLA:PCL (80:20), que contenían paclitaxel, tuvieron poco o ningún efecto sobre el crecimiento del tumor. Todas las pastas de control (fármaco ausente) no tuvieron ningún efecto significativo sobre el crecimiento del tumor. Las formulaciones de pastas con velocidades de desprendimiento más rápidas de paclitaxel (PDLLA:PCL (90:10) y PDLLA:PCL:PDLLA) fueron también más eficaces en la reducción de del crecimiento del tumor, lo cual sugiere que una concentración local crítica de paclitaxel se requiere en el sitio del tumor pata la inhibición del crecimiento del tumor. Formulaciones de pastas que desprenden paclitaxel lentamente, tales como PCL y PDLLA:PCL (80:20) no eran eficaces. Todas las formulaciones de pastas examinadas no tenían ningún efecto sobre los pesos de los cuerpos de ratones, lo cual indica que la pasta con carga de paclitaxel era muy tolerada in vivo.
Estos datos sugieren que la aplicación local de paclitaxel en el sitio del tumor es una estrategia terapéutica eficaz para inhibir el crecimiento local del tumor sin aumentar la toxicidad sistémica. La incapacidad de las formulaciones con carga de paclitaxel para inhibir completamente el crecimiento de tumores es debida, lo más probablemente, al desprendimiento insuficiente de paclitaxel desde el polímero y al rápido crecimiento tumoral de tumores de MDAY-D2. La capacidad de pasta de PDLLA:PCL (90:10) que contenía 30% de paclitaxel, que desprendía más paclitaxel que la pasta de PDLLA:PCL (90:10) que contenía 20% de paclitaxel, y que inhibía el crecimiento de tumores más eficazmente es consistente a este respecto. Por tanto, la modulación de la velocidad de desprendimiento de paclitaxel, que es regulada por las propiedades del polímero y agentes quimioterapéuticos, así como por el sitio de administración, es una fase importante en el desarrollo de terapia local para inhibir el crecimiento de tumores.
Ejemplo 12
Preparación de microesferas de PCL : estudios de escalación
Microesferas (50 g) se prepararon usando PCL (peso molecular nominal 80.000) usando el método de evaporación de disolvente descrito más abajo.
A. Método
Una preparación de 500 mL de 10% de PCL en cloruro de metileno y 4.000 mL de disolución al 1% de PVA (peso molecular 13.000-23.000, 99% hidrolizado) se emulsionaron usando el Homo Mixer controlado con un reóstato con un ajuste de 40 durante 10 horas. La mezcla se filtró usando un tamiz # 140 hasta que las microesferas sedimentaban en el fondo y, luego, la materia que sobrenadaba se decantó. La preparación se lavó, después, 3x con agua destilada (usando el método de sedimentación seguido de decantación) y, después, se volvió a poner en suspensión en 250 mL de agua destilada y se filtró. Las microesferas se secaron con aire, luego, durante toda la noche a 37ºC.
B. Resultados
Los rendimientos de microesferas fueron como sigue
Peso inicial de PCL 50,1 g
Peso de microesferas obtenido 41,2 g
Rendimiento, % (43,2/50,0) x 100 = 86,4
Rendimiento (10 - 50 \mum) aproximadamente 72%.
Tamaño medio 21,4 \mum, mediano 22,0 \mum, modo 24,7 \mum.
Intervalos de tamaños más estrechos (20-40 \mum) se pueden obtener tamizando o por separación usando el método de sedimentación.
Ejemplo 13
Fabricación de microesferas de PLGA
Se fabricaron microesferas a partir de copolímeros de ácido láctico (PLLA)-ácido glicólico (GA).
A. Método
Se fabricaron microesferas en los intervalos de tamaños de 0,5 a 10 \mum, 10-20 \mum y 30-100 \mum, usando métodos estándar (el polímero se disolvió en diclorometano y se emulsionó en una disolución de poli(alcohol vinílico), con agitación tal como se describe previamente en métodos de fabricación de microesferas de PCL o PDLLA). Diversas relaciones de PLLA a GA se usaron como polímeros con diferentes pesos moleculares (dados en forma de viscosidad intrínseca (V.I.)
B. Resultados Las microesferas se fabricaron con éxito a partir de los siguientes polímeros de partida 
\vskip1.000000\baselineskip
PLLA GA V.I.
50 50 0,74
50 50 0,78
50 50 1,06
65 35 0,55
75 25 0,55
85 15 0,56 
\vskip1.000000\baselineskip
Paclitaxel en cargas de 10% ó 20% se incorporó con éxito en todas estas microesferas. Ejemplos de distribuciones de tamaños para un polímero de partida (85:15, VI = 0,56) se dan en las figuras 31-34. Los experimentos de desprendimiento de paclitaxel se llevaron a cabo usando microesferas de diversos tamaños y diversas composiciones. Las velocidades de desprendimiento se presentan en las figuras 35-38.
Ejemplo 14
Copolímeros de di-bloques
Copolímeros de di-bloques de poli(DL-lactida)-bloque-metoxi-polietilenglicol (PDLLA-MePEG), policaprolactona-bloque-metoxi-polietilenglicol (PCL-MePEG) y poli(DL-lactida-co-caprolactona)-bloque-metoxi-polietilenglicol (PDLLACL-MePEG) se sintetizaron usando un procedimiento de polimerización en masa en estado fundido. En resumen, cantidades dadas de monómeros de DL-lactida, caprolactona, y metoxi-polietilenglicoles, con diferentes pesos moleculares, se calentaron (130ºC) hasta fusión bajo burbujeo de nitrógeno y agitando. Catalizador de octoato estannoso (0,2%, peso/peso) se añadió a los monómeros fundidos. La polimerización se realizó durante 4 horas. Los pesos moleculares, concentraciones críticas de micelas, y las cargas máximas de paclitaxel se midieron con análisis de GPC, fluorescencia, y disolución respectivamente (figura 39). Se obtuvieron altas capacidades de transporte de paclitaxel. La capacidad de disolver paclitaxel depende de las composiciones y concentraciones de los copolímeros (figuras 39 y 40). PDLLA-MePEG dieron el paclitaxel disuelto más estable (figuras 40 y 41).
Ejemplo 15
Encapsulación de paclitaxel en microcápsulas de nailon A. Preparación de paclitaxel en microcápsulas de nailon
Paclitaxel se encapsuló en microcápsulas de nailon usando las técnicas de polimerización interfacial. En resumen, 100 mg de paclitaxel y 100 mg de Pluronic F-127 se disolvieron en 1 mL de diclorometano (DCM) y se añadieron 0,4 mL (aproximadamente 500 mg) de cloruro de adipoilo (ADC). Esta disolución se homogenizó en disolución al 2% de PVA usando el homogeneizador Polytron (regulación 1) durante 15 segundos. Una disolución de 1,6-hexano-diamina (HMD) en 5 mL de agua destilada se añadió gota a gota mientras se homogenizaba. La mezcla se homogenizó durante unos 10 segundos más después de la adición de la disolución de HMD. La mezcla se transfirió a un vaso de precipitados y se agitó con un agitador magnético durante 3 horas. La mezcla se centrifugó, se recogió y se volvió a poner en suspensión en 1 mL de agua destilada.
B. Eficiencia de encapsulación/carga de paclitaxel
Aproximadamente 0,5 mL de la suspensión se filtraron y las microesferas se secaron. Aproximadamente 2,5 mg de las microcápsulas se pesaron y se pusieron en suspensión en 10 mL de acetonitrilo durante 24 horas. En la materia que sobrenadaba se analizó el paclitaxel y el resultado se expresó en porcentaje de paclitaxel. Estudios preliminares han demostrado que paclitaxel se podría encapsular en microcápsulas de nailon con una carga alta (hasta 60%) y alta eficiencia de encapsulación (superior al 80%).
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C. Estudios de desprendimiento de paclitaxel
Aproximadamente 2,5 mg de microesferas de paclitaxel-nailon se pusieron en suspensión en 50 mL de agua que contenía 1M cada uno de cloruro sódico y urea y se analizaba periódicamente. El desprendimiento de paclitaxel de la microcápsula fue rápido con más del 95% del fármaco desprendido después de 72 horas (figura 42).
Ejemplo 16
Paclitaxel micelar polímero
PDLLA-MePEG es un copolímero de bloques con regiones hidrófobas (PDLLA) y regiones hidrófilas (MePEG). Con pesos moleculares y composición química apropiados, forman micelas de núcleo de PDLLA hidrófobo y cáscara de MePEG hidrófilo. Paclitaxel se puede cargar en el núcleo hidrófobo, proporcionando con ello paclitaxel con "solubilidad" aumentada.
A. Síntesis de copolímero de dibloques de PDLLA-MePEG
Monómeros de metoxi-polietilenglicol (por ejemplo, peso molecular 2.000, 150 g) y DL-lactida (100 g) se añaden a un matraz de fondo redondo y la temperatura se sube a 130-150ºC. Después de la fusión de los monómeros, se añadieron 0,6 g de catalizador octoato estannoso. La polimerización se termina en la hora 0. La reacción se lleva a cabo bajo protección de N_{2} y con agitación.
B. Preparación de paclitaxel micelar
El copolímero de PDLLA-MePEG se disuelve en acetonitrilo o en etano-acetona (50:50) (concentración de polímero < 40%). La disolución de polímero se centrifuga (14.000 rpm) durante 5 min. La materia que sobrenada (polímero insoluble desechado) se transfiere a un tubo de ensayo de vidrio. Paclitaxel se disuelve en acetonitrilo o etanol-acetona (50:50) y se añade a la disolución de polímero purificada. Después de la mezcla con remolino, el disolvente se evapora a 60ºC bajo corriente de nitrógeno (normalmente tarda 2 horas para un típico lote de paclitaxel de 40 mg). El disolvente residual se puede separar aplicando vacío y calor. La matriz se calienta a aproximadamente 60ºC hasta que se transforma en un gel transparente. Después, un cierto volumen de agua (> 4 veces el peso de la matriz). Esto es inmediatamente seguido por mezcla con remolino hasta la disolución de la matriz de paclitaxel/polímero. Las formulaciones se dan en la Tabla II.
TABLA II
Formulaciones de paclitaxel/PDLLA-MePEG*
2.000/50/50 Agua 10% (20 mg/mL)
2.000/40/60 Gua 10% (20 mg/mL)
2.000/50/50 disol. Salina 0,9% 5% (10 mg/mL)
2.000/50/50 Disol.salina 0,9% 10% (20 mg/mL)
2.000/50/50 % dextrosa 10% (10 mg/mL)
2.000/50/50 5% dextrosa 10% (20 mg(mL)/ 
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C. Preparación de sistemas de administración de polímeros micelares de paclitaxel/termogelificante
Un polímero termogelificante tal como poli(N-isopropilacrilamida) se disuelve en agua destilada. Separadamente, se añade agua a una matriz de paclitaxel/polímero micelar, por ejemplo, PDLLA-MePEG 2000-40/60 con carga de 10% de paclitaxel, para formar una disolución micelar de paclitaxel. Ambas disoluciones se enfrían (por ejemplo, 4ºC) y se mezclan para formar el sistema de administración termogelificante.
Ejemplo 17
Análisis de desprendimiento de fármacos
Un peso conocido de un polímero (típicamente un gránulo de 2,5 mg) se añade a un tubo de ensayo de 15 mL que contiene 14 mL de un tampón que contiene 10 mg de Na_{2}HPO_{4}-NaH_{2}PO_{4}, 0,145 m de de NaCl y 0,4 g/L de albúmina de suero bovino. Se taponan los tubos y se agitan a 37ºC. A tiempos específicos, todos los 14 ml del tampón líquido se separan y se sustituyen con tampón líquido de nueva aportación.
El tampón líquido se añade a 1 mL de cloruro de metileno y se agita durante 1 minuto para extraer todo el paclitaxel en el cloruro de metileno. La fase acuosa se separa, luego, y la fase de cloruro de metileno se seca bajo corriente de nitrógeno. A continuación, el residuo se disuelve en 60% de acetonitrilo, 40% de agua y la disolución se inyecta en un sistema de HPLC usando las condiciones siguientes: columna C8 (Beckman Instruments USA), fase móvil de acetonitrilo:metanol:agua (58%:5%:37%) con un caudal de 1 mL por minuto.
Para paclitaxel, el tampón recogido se analiza, luego, a 232 nm. Para MTX, el tampón recogido se aplica directamente a la columna de HPLC sin necesidad de extracción con cloruro de metileno. MTX se analiza a 302 nm. Para compuestos que contienen vanadio, el tampón líquido se analiza directamente usando un espectrómetro de UV/VIS en el intervalo de 200 a 300 nm.
Ejemplo 18
Efecto de termopasta con carga de paclitaxel en el crecimiento de tumores y angiogénesis de tumores in vivo
Embriones de pollo domésticos fecundados se incuban durante 3 días antes de tener separada sus cáscaras. Los contenidos de los huevos se vacían separando la cáscara alrededor del espacio de aire, rompiendo la membrana interior de la cáscara, perforando el extremo opuesto de la cáscara y permitiendo que el contenido del huevo salga suavemente por el extremo romo. Los contenidos se vacían en boles de vidrio esterilizados de fondo redondo, se cubren con tapas de cajas de Petri y se incuban a 90% de humedad relativa y 3% de dióxido de carbono.
Células MDAY-D2 (tumor linfoide de múrido) se inyectan en ratones y se les permite desarrollar en tumores que pesan 0,5-1,0 g. Se sacrifican los ratones, los sitios de los tumores se limpian frotando con alcohol, se extirpan, se colocan en un medio estéril de cultivo de tejidos y se cortan en piezas de 1 mm en una campana de flujo laminar. Antes de colocar los tumores diseccionados sobre los embriones de pollo de 9 días de edad, la superficie de CAM se raspa suavemente con una aguja de 0,76 mm para asegurar la implantación del tumor. Los tumores se colocan, luego, sobre las CAM después de 8 días de incubación (4 días después de DESHELLING) y se les permite desarrollar sobre la CAM durante 4 días para establecer una provisión vascular. Se preparan 4 embriones utilizando este método, recibiendo cada embrión 3 tumores. En estos embriones, un tumor recibe termopasta con carga de 20% de paclitaxel, el segundo tumor, una termopasta sin carga y el tercer tumor, sin tratamiento. Los tratamientos se continúan durante dos días antes de que se registraran los resultados.
Los tumores MDAY-D2 explantados secretan factores angiogénicos que inducen el desarrollo de capilares (derivados de la CAM) en la masa del tumor y le permite continuar creciendo de tamaño. Puesto que todos los vasos del tumor derivan de la CAM, aunque todas las células tumorales derivan de la explantación, es posible valorar el efecto de intervenciones quirúrgicas sobre estos dos procesos independientemente. Este examen se ha usado para determinar la efectividad de termopasta con carga de paclitaxel sobre: (a) inhibir la vascularización del tumor y (b) inhibir el crecimiento de las propias células del tumor.
La evaluación estereomicroscópica directa in vivo y el examen histológico de tejidos fijos de este estudio, demostraron lo siguiente. En los tumores tratados con termopasta con carga de 20% de paclitaxel, hubo una reducción del número de vasos sanguíneos que abastecían el tumor (véanse figuras 70C y 70D), una reducción del número de vasos sanguíneos dentro del tumor, y una reducción del número de vasos sanguíneos en la periferia del tumor (el área que está típicamente la más altamente vascularizada en un tumor sólido), si se compara con tumores de control (figuras 70A y 70B). Los tumores comenzaban a disminuir de tamaño y de masa durante los dos días en que se dirigió el estudio. Adicionalmente, numerosas células endoteliales se vieron impedidas en la división de células, lo cual indica que la proliferación de células endoteliales había sido afectada. Células tumorales se vieron también frecuentemente impedidas de mitosis. Los 4 embriones presentaban una estructura consistente con la termopasta con carga de paclitaxel que inhibía la vascularidad del tumor, en tanto que la termopasta no cargada no tenía ningún
efecto.
Por comparación, en CAM tratadas con termopasta sin carga, los tumores estaban bien vascularizados, con un aumento del número y densidad de vasos, si se compara con el tejido circundante normal, y dramáticamente más vasos que los que fueron observados en los tumores tratados con pasta con carga de paclitaxel. Los vasos nuevamente formados penetraron en el tumor desde todos los ángulos que parecían como rayos de ruedas unidos en centro de una rueda (véanse figuras 70A y 70B). Los tumores de control continuaron aumentando de tamaño y masa durante el transcurso del estudio. Histológicamente, numerosos capilares de pared delgada, dilatados se vieron en la periferia del tumor y pocos endoteliales se vieron que estaban en división celular. El tejido tumoral estaba bien vascularizado y viable en todas partes.
Como ejemplo, en dos tumores de tamaño similar (inicialmente, en el tiempo de explantación) situados en la misma CAM se obtuvieron los datos siguientes. Para el tumor tratado con termopasta con carga de 20% de paclitaxel, el tumor medía 330 mm x 597 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 14 vasos sanguíneos, en tanto que la masa del tumor tenía solamente 3-4 pequeños capilares. Para el tumor tratado con termopasta no cargada, el tamaño del tumor era de 623 mm x 678 mm; la periferia inmediata del tumor tenía 54 vasos sanguíneos, en tanto que la masa tumoral tenía 12-14 pequeños vasos sanguíneos. Además, la propia CAM circundante contenía muchos más vasos sanguíneos en comparación con el área que circundaba el tumor tratado con paclitaxel.
Este estudio demuestra que la termopasta desprende cantidades suficientes de agente anti-proliferante (en este caso paclitaxel) para inhibir la angiogénesis patológica que acompaña el crecimiento y desarrollo de tumores. En estas condiciones, la angiogénesis es máximamente estimulada por las células del tumor que producen factores angiogénicos capaces de inducir el desarrollo de capilares desde el tejido circundante al interior de la masa del tumor. La termopasta con carga de 20% de paclitaxel es capaz de bloquear este proceso y limitar la capacidad del tejido tumoral para mantener un adecuado suministro de sangre. Esto da lugar a una disminución de la masa del tumor por un efecto citotóxico del fármaco sobre las propias células tumorales y privando al tejido de los nutrientes requeridos para el crecimiento y la expansión.
Ejemplo 19
Efecto de la termopasta con carga de agente terapéutico sobre el crecimiento de tumores in vivo en un modelo de tumores de múridos
El modelo de tumores MDAY-D2 de múridos se puede usar para examinar el efecto de desprendimiento lento local de un compuesto anti-proliferante tal como paclitaxel sobre el crecimiento de tumores, metástasis de tumores, y supervivencia de animales. En resumen, la línea de célula tumoral MDAY-D2 se desarrolla en una suspensión de células que consiste en 5% de suero de ternero fetal en medios de alfa-MEM. Las células se incuban a 37ºC en atmósfera húmeda suplementada con 5% de dióxido de carbono, y se diluyen por un factor de 15 cada 3 días hasta que se obtiene un número de células suficiente. Después del período de incubación, las células se examinan por microscopia óptica para viabilidad y, luego, se centrifugan a 1.500 rpm durante 15 minutos. Se añade PBS a las células para alcanzar una dilución de 1.000.000 de células por mL.
Ratones hembra DBA/2j de diez semanas de edad se aclimatan durante 3-4 días después de la llegada. Cada ratón se inyecta, luego, subcutáneamente en el costado posteriolateral con 100.000 células MDAY-D2 de PBS. Estudios anteriores han demostrado que este procedimiento produce un tumor visible en el sitio de la inyección en 3-4 días, alcanza un tamaño de 1,0-1,7 g a los 14 días y produce metástasis visible en el hígado 19-25 días después de la inyección. Dependiendo del objetivo del estudio, una intervención quirúrgica se puede establecer en cualquier punto en la progresión de la enfermedad.
Usando el modelo animal de más arriba, 20 ratones se inyectaron con 140.000 células MDAY-D2 s.c. y se dejó desarrollar el tumor. El día 5, los ratones se dividieron en dos grupos de 5. El sitio del tumor se abrió quirúrgicamente con anestesia, la región local se trató con la termopasta con carga de fármaco o termopasta de control sin alterar el tejido tumoral existente, y se cerró la herida. Los grupos de 5 o bien no recibieron tratamiento (herida simplemente cerrada), o recibieron el polímero (PCL) solo, o termopasta con carga de 10% de paclitaxel, o termopasta con carga de 20% de paclitaxel (solamente 4 animales inyectados) se implantaron adyacentes al sitio del tumor. El día 16, los ratones se sacrificaron, los tumores se disecaron y se examinó (a simple vista e histológicamente) el crecimiento del tumor, metástasis tumoral, toxicidad local y sistémica resultante del tratamiento, efecto sobre la cicatrización de la herida, efecto sobre la vascularidad del tumor, y condición de la pasta que permanece en el sitio de la incisión.
Los pesos de los tumores para cada animal se presentan en la Tabla IV siguiente:
TABLA IV
Pesos de los tumores (g)
Animal No. Control Termopasta de Termopasta con 20% de paclitaxel
(EMPTY) (PCL) control 10% de paclitaxel
1 1,387 1,137 0,487 0,114
2 0,589 0,763 0,589 0,192
3 0,461 0,525 0,447 0,071
4 0,606 0,282 0,274 0,042
5 0,353 0,277 0,362
Media 0,6808 0,6040 0,4318 0,1048
Desv. Estánd. 0,4078 0,3761 0,1202 0,0653
Valor P 0,7647 0,358 0,036
La termopasta cargada con 20% de paclitaxel redujo el crecimiento del tumor en más del 85% (peso medio 0,105), en comparación con los animales de control (peso medio 0,681). Animales tratados solamente con termopasta o termopasta que contenía 10% de paclitaxel tenía solamente efectos modestos en el crecimiento del tumor; los pesos de tumores se redujeron solamente en 10% y 35% respectivamente (figura 43A). Por tanto, termopasta que contenía 20% de paclitaxel fue más eficaz en la reducción del crecimiento del tumor que termopasta que contenía 10% de paclitaxel (véase figura 43C; véase también figura 43B).
Termopasta se detectó en alguno de los animales en el sitio de la administración. Polímero que oscilaba en peso entre 0,026 g y 0,078 g se detectó en 8 de los 15 ratones. Cada animal en el grupo que contenía termopasta con carga de 20% de paclitaxel contenía algo de polímero residual, lo que sugiere que era menos susceptible a la disolución. Histológicamente, los tumores tratados con termopasta con carga de paclitaxel eran mucho menos celularios y más necrosis de tejidos que los tumores de control. La vascularidad se redujo y células endoteliales se veía frecuentemente que estaban impedidas en la división de células. La termopasta con carga de paclitaxel no parecía que afectaba a la integridad o al número de células de la piel o tejidos que circundaban el tumor. A simple vista, la cicatriz de la herida no estaba afectada.
Ejemplo 20
Uso de pasta quirúrgica con carga de paclitaxel para retardar el re-crecimiento de tumores RIF-1 resecados en ratones
Se investigó la efectividad de una formulación de pasta quirúrgica polímera biodegradable de desprendimiento sostenido, de paclitaxel en el re-crecimiento dilatorio de tumores RIF-1 parcialmente resecados en ratones C3H/HeJ.
A. Métodos
Paclitaxel (20%) se incorporó a una mezcla (4:19 de poli(\varepsilon-caprolactona) y metoxipolietilenglicol. El perfil de desprendimiento in vitro para esta formulación en disolución salina tamponada con fosfato que contenía albúmina (0,4 mg/mL) a 37ºC se investigó usando un ensayo de HPLC para paclitaxel. En resumen, 17 ratones se inyectaron en el costado derecho con 100 \muL de una suspensión de células RIF-1 (1,0 x 10^{6} células) en tampón de Hanks. Se permitió que los tumores se desarrollaran durante 5 días después de lo cual más del 70% de cada tumor se resecó quirúrgicamente y la masa tumoral restante se dejó sin tratar o se revistió con 20-30 \muL de 20% de paclitaxel en pasta quirúrgica o pasta quirúrgica sola (sin fármaco). Esto fue el día 0. Las dimensiones de la masa tumoral visible por debajo de la piel se midieron los días 4 a 7 y el día 9. El área de la superficie de este tumor cilíndrico visible se demostró que estaba correlacionado con el volumen del tumor (r = 0,812).
B. Resultados
La curva de desprendimiento in vitro de paclitaxel se caracterizaba por una fase explosiva inicial de 1 día seguida por un largo período de un desprendimiento lento sostenido. Las áreas de las superficies cilíndricas de los tumores visibles de cada ratón desde los días 4 a 9 se presentan en la Tabla V. Todos los ratones excepto 1 en cada uno de los dos grupos que no recibieron paclitaxel, presentaban un re-crecimiento extensivo del tumor en el día 4. Un ratón que recibió polímero, solamente presentaba un re-crecimiento retardado del tumor, en tanto que un ratón que no recibió tratamiento no presentaba re-crecimiento. En contraste, casi sólo uno de los ratones tratados con pasta quirúrgica de paclitaxel no presentaba re-crecimiento de tumor hasta al menos el día 5 y dos ratones aún no presentaban re-crecimiento hasta el día 6.
C. Conclusión
Pasta con carga de paclitaxel inhibía significativamente el re-crecimiento del tumor entre los días 1 a 5. El re-crecimiento ocurrió después del día 6 debido a la agresividad de la línea celular.
TABLA V
Tamaño de tumor de células RIF-1 (expresado como área de masa tumoral visible por debajo de la piel, en mm^{2})
medido los días siguientes a la cirugía de resección del tumor
Tamaños de los tumores (mm^{2})
Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 9
20% de paclitaxel en polímero 0,0 0,0 41,3 58,8 *
20% de paclitaxel en polímero 30,7 35,3 49,0 67,9 *
20% de paclitaxel en polímero 0,0 0,0 0,0 * 42,4
20% de paclitaxel en polímero 0,0 47,2 55,4 47,8 *
TABLA V (continuación)
Tamaño de tumor de células RIF-1 (expresado como área de masa tumoral visible por debajo de la piel, en mm^{2})
medido los días siguientes a la cirugía de resección del tumor
Tamaños de los tumores (mm^{2})
Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 9
20% de paclitaxel en polímero 0,0 25,5 41,9 57,1 *
20% de paclitaxel en polímero 0,0 0,0 0,0 * 46,6
Polímero sólo 44,2 52,8 * * *
Polímero sólo 36,3 39,0 32,7 * 38,5
Polímero sólo 36,9 44,2 51,5 42,7 *
Polímero sólo 0,0 12,9 14,9 * 29,2
Polímero sólo 37,4 39,6 40,7 54,1 *
Polímero sólo 40,7 24,2 40,7 * 36,9
Sin tratamiento 0,0 0,0 0,0 * *
Sin tratamiento 52,2 77,8 * * *
Sin tratamiento 39,0 45,4 43,6 * *
Sin tratamiento 22,1 21,2 31,2 * 26,9
Sin tratamiento 21,2 30,7 36,3 * *
* Tumor no medido o animal ya sacrificado
Ejemplo Comparativo 21
Encapsulación de suramina
Un mililitro de 5% de EVA [poli(polietileno-acetato de vinilo) reticulado con 5% de acetato de vinilo] en diclorometano ("DCM") se mezcló con un peso fijado de suramina sodio molida a tamaño sub-micrométrico. Esta mezcla se inyecta en 5 mL de 5% de poli(alcohol vinílico) ("PVA") en agua en un tubo de ensayo de fondo plano de 30 mL. Tubos que contienen pesos diferentes del fármaco se cuelgan, luego, en un baño de agua para muchas muestras, a 40ºC durante 90 minutos con agitación automatizada. Se separan las mezclas y se toman muestras de microesferas para análisis de tamaños. Los tubos se centrifugan a 1.000 g durante 5 minutos. El PVA que sobrenada se separa y se guarda para análisis (fármaco no encapsulado). Después, las microesferas se lavan (con remolino) en 5 mL de agua y se vuelven a centrifugar. El lavado de 5 mL se guarda para análisis (fármaco para heridas superficiales). A continuación, las microesferas se empapan con 50 \muL de metanol, y se remolinean en 1 mL de DCM para disolver el ELVAX. Las microesferas se calientan, luego, a 40ºC y 5 mL de agua a 50ºC se añaden lentamente con agitación. Este procedimiento da lugar a la inmediata evaporación de DCM, causando con ello el desprendimiento de suramina sodio en los 5 mL de agua.
El contenido de fármaco de todas las muestras se sometieron a ensayo mediante cuantificación por fluorescencia. En resumen, la suramina sodio absorbe UV/VIS con una lambda máxima de 312 nm. Esta absorción es lineal en el intervalo de 0 a 100 \mum/L.
Los resultados de estos experimentos se presentan en las figuras 44-50. En resumen, la distribución de tamaños de microesferas en número (figura 44) o en peso (figura 45) no aparece que es afectada por la inclusión del fármaco en el DCM. Se pueden obtener buenos rendimientos de microesferas en el intervalo de 20 a 60 \mum.
La encapsulación de suramina es muy baja (<1%) (véase figura 47). Sin embargo, cuando el peso de fármaco se incrementa en el DCM, la cantidad total de fármaco encapsulado aumenta, aunque el % de encapsulación disminuye. Tal como se presenta en la figura 46, 50 \mug de fármaco se pueden encapsular en 50 mg de ELVAX. La encapsulación de suramina sodio en 2,5% de PVA que contiene 10% de NaCl se presenta en la figuras 48 (distribución de tamaños en peso). La encapsulación de suramina sodio en 5% de PVA que contiene 10% de NaCl se presenta en las figuras 49 y 50 (distribución de tamaños en peso y en número, respectivamente).
Para valorar suramina y acetato de cortisona como agentes anti-angiogénicos potenciales, cada agente se mezcló con 0,5% de metilcelulosa y se aplicó el disco seco que contenía el agente sobre los vasos sanguíneos en desarrollo de la CAM de 6 días de edad. Un tratamiento de combinación de suramina (70 \mug) con acetato de cortisona (20 \mug) fue exitosa en la inhibición de angiogénesis cuando se sometió a ensayo sobre la CAM durante 48 horas. La región vascular resultante medía 6 mm de diámetro y reveló ausencia de flujo de sangre y aparición de islas de sangre dispersas (figuras 51A y 51B).
Ejemplo Comparativo 22
Pasta con carga de metotrexato A. Fabricación de pasta con carga de metotrexato
Metotrexato ("MTX", Sigma Chemical Co.) se tritura con un mortero y su mano para reducir el tamaño de partículas a menos de 5 micrómetros. Se mezcla, luego, en forma de polvo seco con policaprolactona (peso molecular 18.000 Birmingham Polymers, AL, USA). La mezcla se calienta a 65ºC durante 5 minutos y la mezcla de polímero/metotrexato fundida se agita durante 5 minutos para obtener una pasta uniforme. La pasta fundida se toma, luego, en una jeringa de 1 mL y se extruye como se desee.
B. Resultados
Los resultados se presentan en las figuras 52A-E. En resumen, la figura 52A presenta desprendimiento de MTX a partir de discos de PCL que contienen 20% de MePEG y diversas concentraciones de MTX. La figura 52B muestra un experimento similar para pasta que no contiene MaPEG. Las figuras 52C, D y E presentan la cantidad de MTX que permanece en el disco.
Tal como se puede ver por los resultados de más arriba, cantidades sustanciales de MTX se pueden desprender del polímero cuando se utilizan altas concentraciones de MePEG.
Ejemplo Comparativo 23
Fabricación de microesferas que contienen metotrexato A. Microesferas con metotrexato solo
Metotrexato (Sigma) se trituró en un mortero con mano para reducir el tamaño de partículas por debajo de 5 micrómetros. Cien mililitros de un EVA al 2,5% (peso/volumen) (Aldrich o Sigma) en agua se agitó durante 15 minutos con 500 mg de MTX no triturado a 25ºC para saturar la disolución con MTX. Esta disolución se centrifugó, luego, a 2.000 rpm para separar el MTX no disuelto y la materia que sobrenadaba se usó para la fabricación de microesferas.
En resumen, 10 mL de una disolución al 5% (peso/volumen) de poli(ácido DL-láctico) (peso molecular 500.000; Polysciences), poli(ácido láctico:glicólico) (50:50, VI 0,78, Polysciences) o policaprolactona (peso molecular 18.000, BPI) que contenía MTX (molido); los polímeros (10:90) (peso/peso) se empaparon lentamente en 100 mL de la disolución saturada al 2,5% (peso/volumen) de PVA (Aldrich o Sigma) con agitación a 600 rpm. La mezcla se agitó a 25ºC durante 2 horas y las microesferas resultantes se lavaron y secaron.
Usando este método, microesferas con carga de MTX se pueden fabricar reproduciblemente en el intervalo de 30 a 160 micrómetros (véase figura 53).
B. Microesferas con MTX y ácido hialurónico
Microesferas con carga de MTX se pueden fabricar usando ácido hialurónico ("HA") como excipiente mediante un método de fabricación de emulsión de agua en aceite, esencialmente tal como se describe más abajo. En resumen, 50 mL de aceite de parafina (aceite ligero; Fisher Scientific) se calienta a 60ºC con agitación a 200 rpm. Una disolución de 5 mL de hialuronato sódico (20/mL); (origen = cresta de gallo; Sigma) en agua que contenía diversas cantidades de MTX se añade gota a gota en el aceite de parafina. La mezcla se agita a 200 rpm durante 5 horas, y se centrifuga a 500 xg durante 5 minutos. Las microesferas resultantes se lavan en hexano 4 veces, y se dejan secar.
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Ejemplo Comparativo 24
Fabricación de composiciones polímeras que contienen compuestos de vanadio A. Pasta polímeras que contiene vanadil-sulfato
Vanadil-sulfato (Fisher Scientific) se tritura en primer lugar en un mortero y mano para reducir el tamaño de partículas, y luego se dispersa en PCL fundido tal como se describe más arriba para MTX. Después se recoge en una jeringa para solidificar y está listo para uso.
El desprendimiento de fármaco se determinó esencialmente tal como se describe más arriba en el Ejemplo 31, excepto que un gránulo de 65 mg de VOSO_{4} (10% peso/peso):PCL se dispersó en 10 mL de agua y se analizó el vanadil-sulfato desprendido en la materia que sobrenadaba usando espectroscopia de absorción de UV/VIS del pico en el intervalo de 200 a 300 nm.
Los resultados se presentan en la figura 54. En resumen, de una composición polímera que contenía 10% de VOSO_{4}, 1 mg de VOSO_{4} se desprendió en 6 horas, tres mg después de 2 días y 5 mg el día 6.
B. Microesferas polímeras que contienen vanadil-sulfato
Vanadil-sulfato se incorporó en microesferas de poli(ácido láctico) o ácido hialurónico, tal como se describe en el Ejemplo 23. Los resultados se presentan en la figura 55.
C. Pasta polímera que contiene vanadato orgánico
Vanadato orgánico se carga en una pasta de PLC esencialmente tal como se describe más arriba en el Ejemplo 22. El desprendimiento de vanadato de las microesferas se determinó tal como se describe más abajo. Los resultados se presentan en las figuras 56A y 56B.
D. Microesferas que contienen vanadato orgánico
Vanadato orgánico se puede cargar, también, en microesferas esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 23. Tales microesferas se presentan en la figura 57 para poli(ácido D,L-láctico) (peso molecular 500.000; Polysciences).
Ejemplo Comparativo 25
Composición polímera que contiene bis(maltolato)-oxovanadio (BMOV) A. Fabricación de pasta con carga de bis(maltolato)-oxovanadio
Poli(\varepsilon-caprolactona) (peso molecular 20.000) (BPI Birmingham AL) y BMOV se pesaron directamente en un vaso de precipitados de vidrio en las proporciones apropiadas. En algunas formulaciones metoxipolietilenglicol (MEPEG) (peso molecular 350) (Union carbide, Danbury CT.) se añadió, también, al PCL y BMOV. El vaso de precipitados y el contenido se calentaron a 55ºC con agitación suave durante 5 minutos hasta que el BMOV estaba totalmente disperso en el polímero fundido. La mezcla fundida se extrajo con una jeringa precalentada y se almacenó a 4ºC hasta uso.
B. Estudios de desprendimiento de fármaco
A tubos que contenían 15 mL de disolución salina con tampón de fosfato 10 mM (PBS pH 7,4) y 100 \mug/mL de albúmina de suero bovino (fracción 5 Boehringer Mannheim, Germany) se añadieron 150 mg de láminas, en forma de disco, de pasta de PCL-BMOV. Los tubos se cerraron y se agitaron a 30 rpm a 37ºC. En tiempos apropiados, la lámina de PCL-BMOV se dejó decantar por gravedad durante 5 minutos y se retiró toda la materia que sobrenadaba. La concentración de de BMOV se determinó en las materias que sobrenadaban midiendo la absorbancia a 256 nm (A256) y 276 nm (A276). La materia que sobrenadaba se reemplazó con 15 mL de PBS de nueva aportación y los tubos se volvieron a agitar. Una curva de calibración lineal de concentración de BMOV vs. A256 ó A276 se obtuvo usando estándares de BMOV en el intervalo de 0 a 25 \mug/mL. Los valores de absorbancia a 256 nm y 276 nm de estos estándares demostraron que no eran afectados por almacenamiento en tubos cerrados a 37ºC durante 2 ó 3 días (las mismas condiciones usadas en los estudios de desprendimiento de fármaco).
Al final de los experimentos de desprendimiento de fármaco, se analizó el contenido de fármaco residual en muestras de la matriz de PCL-BMOV, por disolución de un peso en seco conocido de la matriz en 0,5 mL de diclorometano (DCM) (Fisher). A esta disolución se añadieron 50 mL de agua caliente (50ºC), mezclando para evaporar el DCM que sale del BMOV en agua para el análisis espectrofotométrico (A256).
C. Microscopia electrónica de barrido (SEM)
Muestras de la matriz de PCL-BMOV que se había usado en los experimentos de desprendimiento de fármaco de 2 meses se examinaron usando SEM. Estas muestras se compararon con muestras de control recientemente preparadas. Muestras de polímero se revistieron (oro:paladio al 60:40) (Hummer Instruments, Technics, USA) y se examinaron usando un microscopio electrónico de barrido Hitachi (modelo F-2300) con un sistema de recogida de datos de IBM.
D. Resultados
El desprendimiento de BMOV de la matriz de PCL se presenta en las figuras 58A y 58B. Incrementar la carga de BMOV desde 5% a 35% en la matriz de PCL incrementó la velocidad de desprendimiento de fármaco a lo largo del período de dos meses (figura 58A). Con carga de 35% de BMOV, la velocidad de desprendimiento aumentó enormemente. Los perfiles de desprendimiento para cargas de 20% a 30% presentaban una fase inicial más rápida de desprendimiento de fármaco en los dos primeros días, seguido de un desprendimiento del orden de casi cero a lo largo de los 2 meses siguientes.
Los perfiles de desprendimiento de droga se expresan, también, en forma del % de fármaco que permanece en el gránulo (figura 58B). En resumen, el % de BMOV que permanecía en la matriz de PCL era casi idéntica en todos los valores del tiempo para todas las cargas de BMOV hasta (e incluyendo) 30%, de manera que entre 65% y 80% del BMOV original estaba aún presente en la matriz después de 2 meses. (Por cuestión de claridad, solamente los datos para 25% y 30% de cargas de BMOV se presentan en la figura 58B). El porcentaje de fármaco que permanecía en la matriz disminuía más rápidamente con una carga de 35% de BMOV, de manera que un poco más del 50% del BMOV original estaba presente en la matriz después de un mes. Con el fin de verificar los datos acumulativos de desprendimiento de fármaco, se analizó el contenido de fármaco que permanecía en muestras de la matriz de PCL-BMOV al final de cada experimento de desprendimiento de fármaco. El % de fármaco que permanecía a los 70 días, tal como se determinó por el ensayo residual, fue como sigue: 67% \pm 10% (5% de BMOV), 56% \pm 10% (10% de BMOV), 80% \pm 20% (15 de BMOV), 84% \pm 20% (20 de BMOV), 85% \pm 12% (25 de BMOV), 77% \pm 14% (305 de BMOV) y 57% \pm 15% (35% de BMOV).
Las figuras 59A y 59B presentan el efecto de añadir 20% de MePEG a la matriz de PCL, sobre los perfiles de desprendimiento de fármaco para varias concentraciones de carga de BMOV. La adición de MePEG a la matriz incrementa la velocidad de desprendimiento de BMOV enormemente en comparación con el desprendimiento de BMOV a partir de PCL solo (figura 58). Más del 50% del BMOV se desprendió de la matriz de polímero en 7 días (una semana) en todas las concentraciones de carga de BMOV. El análisis residual de los gránulos de PCL-BMOV-MePEG dieron los siguientes valores para el % de BMOV que permanece a los 7 días en los gránulos; 24% (\pm 9%), 5% de BMOV; 25% \pm (8%), 10% de BMOV; 22% (\pm 4%), 15% de BMOV; 27% (\pm7%), 20% de BMOV.
La figura 60A presenta la morfología de los cristales de BMOV con mucho aumento. Las figuras 60B y 60C presentan la morfología de las matrices de fármaco con polímero antes y después del estudio de dos meses del desprendimiento de fármaco en tampón acuoso. Las matrices de PCL-BMOV para cargas de 15%, 20% y 30% de BMOV eran típicamente suaves en sus caras externas antes del estudio de desprendimiento y un SEM representativo se presenta en la figura 60B. Después de incubación en el tampón acuoso durante dos meses, las superficies externas eran rugosas y llenas de hoyos.
E. Discusión
Se comprobó que este compuesto se desprendía muy lentamente de la matriz de PCL con características de desprendimiento casi ideales para el mantenimiento de concentraciones sostenidas de vanadio. Estas características incluían solamente un pequeño efecto de explosión de desprendimiento de fármaco en los primeros pocos días, seguido por una cinética de desprendimiento del orden de casi cero en la mayoría de las cargas de fármacos (figura 58). BMOV es menos soluble en agua que vanadil-sulfato u ortovanadato sódico y la característica de hidrofobia de la molécula probablemente incrementa la afinidad de las moléculas de BMOV con la matriz de PCL hidrófoba y disminuye la velocidad de desprendimiento de fármaco en un medio de incubación acuoso.
La adición de 20% de MePEG a PCL se ha comprobado que mejora las propiedades de flujo térmico de la pasta al reducir la viscosidad de la matriz y la temperatura a la que solidifica el polímero. Estas propiedades son importantes para aplicar la pasta en un sitio de tumor peritubular, ya que la mejor protección del sitio se obtiene en estas condiciones. La adición de MePEG a matriz de pasta de VMOV-PCL ha demostrado que incrementa las velocidades de desprendimiento de BMOV in vitro (figura 59) en todas las concentraciones de carga de BMOV (5% a 20%) en relación con las velocidades de desprendimiento a partir de BMOV-PCL (sin MePEG) (figura 58). La pasta de PCL-MePEG con carga de 5% de BMOV se comprobó que desprendía entre 500 y 1.000 \mug de BMOV al día (que era similar a la velocidad de desprendimiento a partir de PCL con carga de 35% de BMOV).
Ejemplo Comparativo 26
Eficacia in vitro e in vivo de termopasta con carga de bis(maltolato)oxovanadio
Termopasta de PCL polímero con carga de BMOV se preparó tal como se describe previamente y se sometió a ensayo su eficacia contra líneas de células tumorales in vitro e in vivo.
A. Líneas de células tumorales humanas
Las líneas de células de tumores humanos de colon HT-29, de mama MCF-7 y de pulmón de células no pequeñas SKMES1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. La línea de células de colon HT-29 se cultivó en RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (HIFBS), la línea de células de colon MCF-7 en medio de Eagles modificado por Iscove con 5% de HIFBS más insulina 10-9 M, y la línea de células pulmonares SKMES1 en medio esencial mínimo de Eagle con 10% de FBS no inactivado con calor.
B. Células de médula humana normal
Médula de hueso humano normal (histológicamente negativo para células tumorales) se obtuvo de pacientes que habían de tener transplantes de médula de hueso para sus tumores sólidos pero murieron antes de que se usara la médula. Después de centrifugación, la capa amarillenta se separó y las células se trataron con tampón de lisis y se lavó dos veces y, luego, se volvió a poner en suspensión en RPMI 1640 con 20% de HIFBS. Las células se extrajeron a través de una aguja de 25 g y se contaron.
C. Sistema radiométrico (Bactec)
El sistema Bactec (Johston Laboratories, Towson, MD) se basa en un instrumento clínico que se desarrolló para detectar bacterias en cultivos de sangre y se ha usado para investigar nuevos agentes antineoplásticos. Este sistema radiométrico es un sistema rápido y semiautomático que utiliza la inhibición de la conversión de ^{14}C de glucosa a ^{14}C de CO_{2}, como índice de citotoxicidad. La máquina Bactec automáticamente vierte el ^{14}CO_{2} en una cámara iónica en la que la señal del CO_{2} radiomarcado se transforma en una señal eléctrica proporcional o valor del índice de crecimiento en una escala de 1 a 1.000. Para la exposición continua, las células tumorales o células de médula normales se añadieron a 2 mL del medio de desarrollo apropiado que contenía 2 uCi de ^{14}C de glucosa más BMOV en concentraciones finales de 5% de 0,01, 0,1, 1, 10,25 y 50 uM y se inyectaron en viales de suero de 20 mL con tapón de caucho, que contenían una mezcla de 5% de CO_{2} y aire, y se incubaron a 37ºC durante 24 días. Para exposición de una hora más, células y BMOV con las mismas concentraciones se incubaron en matraces cónicos de polipropileno de 15 mL en un baño de agua a 37ºC durante una hora. Después, las células se centrifugaron y se lavaron en el medio, luego se pusieron de nuevo en suspensión en 2 mL del medio de desarrollo apropiado que contenía 2 uCi de ^{14}C de glucosa y se inyectaron en viales de suero de 20 mL con tapón de caucho, que contenía una mezcla de 5% de CO_{2} y aire, y se incubaron a 37ºC durante 24 días; los días 6, 9 y 12 para líneas de células tumorales y los días 6, 15 y 24 para células de médula, los viales se separaron y se insertaron en el instrumento Bactec para la determinación de la cantidad de ^{14}CO_{2} producido por las células por metabolizar el ^{14}C de glucosa. Los valores del índice de desarrollo de células tratadas con BMOV se compararon con los valores del índice de desarrollo de células no tratadas y se calculó el % de supervivencia en comparación con controles no tratados.
D. Estudios de tumores resecados
Ratones C3H/HeJ machos de siete semanas de edad, se usaron en estos estudios. Células RIF-1(fibrosarcoma inducido por radiación de múridos) se cultivaron en medios de alfa-MEM que contenía 10% de FBS (Gibco Canada). Las células se dispersaron en una disolución de sal tamponada de Hanks al 1% (HBSS, pH 7,4) (Gibco Canada) con una concentración de 1 x 10^{7} células /mL. 100 \muL de estas células (1 x 10^{6} células) se inyectaron en el costado derecho de cada ratón. Se permitió que los tumores se desarrollaran durante 5 días (en cuyo tiempo, los tumores oscilaban entre 6 y 8 mm de diámetro). El día 5, los ratones se anestesiaron con una combinación de 0,02 mL/g de Ketamine:Rompom (70 mg/kg:10 mg/kg). Una incisión se hizo 5 mm desde el borde del tumor y se separó aproximadamente el 90% de cada tumor y 150 mg de PCL:BMOV fundido (50ºC) o PCL solo (control) se extrusionaron desde una jeringa de 500 \mum sobre la superficie entera del sitio del tumor resecado. El PCL solidificó en 30 segundos y el área se cerró con suturas de proleno 5-0. Los ratones se examinaron los días 4, 5, 6 y 7. En cada uno de los días, los tumores se midieron (diámetros largo y corto) y se tomaron imágenes. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro máximo de 9 mm, se sacrificaron los ratones y el área del tumor se extirpó para futuros estudios histológicos.
Los resultados se presentan en la figura 63.
E. Estudios de inhibición de tumores
La línea de células hematopoyéticas MDAY-D2 (obtenida del Dr. J. Dennos, Mount Sinai Hospital, Toronto) se cultivó en placa o se desarrolló en suspensión en DMEM que contenía 5% de FBS (Gibco Canada). Cada ratón se inyectó subcutáneamente en el lado lateral posterior con 4 x 10^{5} células en 100 \muL de PBS. Después de 5 días de crecimiento del tumor, 150 mg de la pasta fundida de PCL o de PCL-BMOV se implantaron en un área adyacente al sitio del tumor de cada ratón. Después de 15 días, los ratones se sacrificaron, se pesaron y los tumores se disecaron y se pesaron. Los resultados se presentan en la figura 62.
F. Resultados y discusión
En contraste con las células de médulas óseas humanas normales, la exposición de una hora de BMOV también tenía muy poco efecto, incluso con una concentración de 50 \muM. Usando una exposición continua, tampoco fue muy pronunciado el efecto de BMOV sobre las células de médulas, con sensibilidad (49% de supervivencia) observada solamente con la concentración de 50 \muM. Por tanto, el compuesto BMOV no pareció que era muy mielosupresor y exposiciones en las concentraciones y exposiciones sometidas a ensayo.
En este estudio, el efecto antineoplástico de BMOV se había presentado in vitro frente a tres líneas de células cancerosas humanas en condiciones que asegurara una exposición continua al fármaco. Sin embargo, in vivo, la eficacia puede depender de la exposición continua de las células tumorales a BMOV. El objetivo principal de este estudio era diseñar y someter a ensayo (in vivo) un sistema de administración polímero biodegradable que pudiera proporcionar una administración continua de vanadio (en forma de BMOV) con bajas concentraciones.
Experimentos in vivo demostraron que la administración única de pasta de PCL-BMOV subcutáneamente, inhibía el desarrollo de tumores MDAY D2. La figura 62 presenta los datos sobre pesos de tumores a partir de ratones de control (PCL - no BMOV) y ratones tratados con 25%, 30% y 35% de PCL con carga de BMOV. Había una inhibición del 54% del crecimiento del tumor para PCL con carga de 25% de BMOV (significante a p<0,05). Las cargas de 30% y 35% de BMOV producían una inhibición del 76% y 80% del crecimiento del tumor respectivamente y uno de los seis ratones en el grupo de 35% de BMOV presentaba una completa erradicación del tumor.
Interesantemente, los perfiles de desprendimiento de fármaco in vivo demostraban que la pasta que consistía en 25% y 30% de BMOV desprendían aproximadamente 500 \mug de BMOV por día que previamente había demostrado eficacia. Sin embargo, pasta de PCL con carga de 35% de BMOV que era la más eficaz en la reducción del desarrollo de tumores, desprendía aproximadamente dos veces esta cantidad. Estos datos demuestran que el desprendimiento sostenido de cantidades pequeñas de compuestos de vanadio será un régimen antineoplástico igual o más eficaz, en comparación con un régimen de administración diaria de vanadato.
Aunque la pasta de PCL-BMOV era igualmente eficaz para inhibir el desarrollo de tumores, los ratones no presentaban signos de estrés y pérdida de peso. El incremento de estrés y pérdida de peso comúnmente observados con inyecciones diarias de dosis altas de vanadato está relacionado, los más probablemente, con la toxicidad inducida por los altos niveles de vanadato en el plasma que siguen inmediatamente a la administración. El uso de pasta de PLC-BMOV para proporcionar desprendimiento sostenido de vanadato durante largos períodos puede reducir grandes fluctuaciones de concentraciones de vanadato en el plasma y prevenir la toxicidad inducida por vanadato. Estos datos son consistentes con nuestra hipótesis de que un desprendimiento sostenido de BMOV es igual o más eficaz para reducir el desarrollo de tumores y evitar la toxicidad inducida por vanadato.
Ejemplo comparativo 27
Efecto de microesferas de BMOV en el desarrollo de tumores en ratones
El objetivo de este estudio fue someter a ensayo la capacidad de microesferas de PLLA con carga de BMOV (20%) para la regresión del desarrollo de tumores en ratones.
Veinte de los veinticuatro ratones se inyectaron subcutáneamente con 100 mL de células MDAY-D2 con densidad de 10 x 10^{6}/mL. El día 6, los ratones se dividieron en 6 grupos. El grupo 1, control vacío, grupo 2, control del tumor, grupo 3, se inyectaron subcutáneamente con 0,25 mg/100 \mul de BMOV, dos veces al día. El grupo 4 se inyectó IP con microesferas de 20 mg de PLLA que contenían 5 mg de BMOV. El grupo 5 se inyectó IP con 10 mg de microesferas de BMOV el día 6 y el día 9 respectivamente. El grupo 6 se inyectó intramuscularmente con 10 mg de BMOV el día 6 y el día 9. El día 16, los ratones se sacrificaron y se disecaron los tumores.
Los resultados de estos experimentos se presentan en las Tablas VI y VII más abajo.
TABLA VI
Pesos del cuerpo de ratones en grupos de control y tratados
Control Control Disolución Gránulos de Gránulos gránulos de
del tumor de BMOV BMOV, IP 5 de BMOV, BMOV,
0,25 mgx1 mg/una vez IP 2mgx2 IM 2 mgx2
1 19 23,9 18 18,8 19,2 18,2
2 20,2 21 17,8 19,3 18,9 22,6
3 18,4 20 18,4 21,6 17,2 20,1
4 22,2 24,1 17,3 19,1 22,2
Media 19,95 22,25 17,87 19,9 18,6 20,78
TABLA VII
Peso de tumores de grupos de control y tratados
Control de Disolución s. de Gránulos de Gránulos de Gránulos de
tumores BMOV c. BMOV, IP 5 BMOV, IP 2 BMOV, Im 2
mg/una vez Mg x2 Mg x2
1 3,8 0,4 0,2 0,12 2,0
2 1,2 0,12 0,9 0,4 3,3
3 1,3 0,07 0,26 0,3 1,1
4 1,5 0,04 muerto 1,2 1,6
Media 1,95 0,15 0,45 0,50 1,6
Ejemplo Comparativo 28
Sistema de administración de fármaco polímero de desprendimiento controlado: estudio comparativo de los perfiles de desprendimiento de fármaco in vitro de complejos orgánicos de vanadio a partir de termopastas de poli(\varepsilon-caprolactona) (PCL) y termopastas de PCL-metoxipoletilenglicol (PCL-MePEG)
Este estudio se llevó a cabo para investigar la encapsulación y cinéticas de desprendimiento in vitro de las cuatro formas de complejos orgánicos de vanadio (BMOV, BEMOV, V5, PRC-V) en termopastas de poli(\varepsilon-caprolactona) y/o termopastas de PCL-metoxipolietilenglicol (PCL-MePEG).
A. Método
Análisis cuantitativo (análisis espectrofotométrico de UV/VIS) se llevó a cabo con diferentes concentraciones de disoluciones de vanadio para obtener las longitudes de onda de absorbancia de picos y las ecuaciones de calibración. Se estudió la solubilidad de vanadio en disolución salina tamponada con fosfato 10 mM con albúmina (PBS/ALB) (pH 7,4). 1%, 5%, 10% y 20% (% de complejo de vanadio en PCL) de cada forma compleja orgánica de vanadio se encapsuló en un PCL de polímero biodegradable y/o en mezclas de PCL con MePEG (peso molecular 350) para producir un producto de administración de fármaco polímero denominado "termopasta". Estudios de desprendimiento in vitro de las diversas formas de vanadio a partir de termopastas se llevaron a cabo a 37ºC en PBS/ALB con desprendimiento de vanadio medido por espectroscopia de absorbancia de UV/VIS.
B. Resultados
Los resultados se presentan en las figuras 64 a 68. En resumen, los picos de absorbancia de BMOV, BEMOV, y V5 ocurrieron a 276 nm y el de PRC-V fue a 266 nm. La velocidad y extensión de solubilidad de cada forma de vanadio era del orden de V5 > BMOV & BEMOV > PRC-V. Los estudios de desprendimiento in vitro demostraron que la velocidad de fármaco desprendido de la termopasta aumentaba cuando (1) aumenta la solubilidad del fármaco, (2) aumenta la concentración de fármaco, y (3) aumenta la cantidad de MePEG incorporada en las termopastas.
C. Conclusión
Una dosis controlada de vanadio puede ser desprendida de termopastas de PCL usando una forma diferente de vanadio (como fármaco), cambiando el % de carga de la forma particular de vanadio en PCL o incluyendo MePEG en PCL. Mientras que cambiar el % de carga de una forma particular de vanadio puede controlar la velocidad de desprendimiento a corto plazo, la administración de una dosis controlada puede suponer la implantación de un muy grande (y potencialmente tóxico) depósito del fármaco (en PCL) en el animal. Por tanto, el uso de una forma alternativa de vanadio o
la inclusión de MePEG en PCL pueden ofrecer un método alternativo que administra una dosis controlada de vanadio.
Ejemplo Comparativo 29
Encapsulación de camptotecina en termopasta de PCL y análisis de anti-angiogénesis A. Incorporación de camptotecina en PCL
Camptotecina se trituró en un mortero con su mano para reducir el tamaño de partícula a menos de 5 \mum. A continuación se mezcló, en forma de polvo seco, con policaprolactona (peso molecular 18.000 Birmingham Polymers, AL USA). La mezcla se calienta a 65ºC durante 5 minutos y la mezcla fundida de polímero/agente se agita, para obtener una pasta uniforme, durante 5 minutos. La pasta fundida se introduce, luego, en una jeringa de 1 mL y se extruye para formar gránulos de 3 mg. Estos gránulos se colocaron, luego, en la CAM para analizar sus propiedades anti-angiogénicas.
B. Resultados
La termopasta con camptotecina fue eficaz en la inhibición de angiogénesis si se compara con los gránulos de PCL de control. Con carga de 5% de fármaco, 4/5 de las CAM sometidas a ensayo presentaban inhibición de angiogénesis. Además, con carga de 1% y 0,25%, 2/3 y ¾ de las CAM presentaban inhibición de angiogénesis respectivamente. Por tanto, es evidente, por los resultados, que camptotecina se desprendió suficientemente de la termopasta de PCL y tenía eficacia terapéutica anti-angiogénica.
Ejemplo Comparativo 30
Fabricación de termopasta con carga de s-fosfonato
Policaprolactona (Birmingham Polymers, Birmingham, AL) y s-fosfonato se pulverizaron en proporciones apropiadas a 55ºC durante 2 minutos. A continuación, la mezcla fundida, con ayuda de una pipeta, se transformó en gránulos semi-esféricos de 3 mg y se les dejó permanecer a 4ºC.
B. Bioensayo de CAM
Embriones de pollo fecundados domésticos (Fitzsimmons Consulting & Research Services Ltd., B.C.) se incubaron durante 4 días y, luego, se abrió una ventana. En resumen, un pequeño orificio (que mide aproximadamente 2 cm de diámetro) se formó separando la cáscara y la membrana interior de la cáscara del extremo romo del huevo (sitio de espacio de aire) y, luego, el área expuesta se selló con cera de Parafilm esterilizada. A continuación, se colocó el huevo en una incubadora a 37ºC durante 2 días adicionales con la ventana en posición vertical. El día 6 de incubación, gránulos de 3 mg de polímero con carga de s-fosfato o polímero de control (sin fármaco) se colocaron sobre la superficie de los vasos de CAM en crecimiento. Después de una exposición de 2 días (día 8 de incubación), la vasculatura se examinó usando un estereomicroscopio conectado con un sistema de cámara Contax. Para incrementar el contraste de los vasos y ocultar cualquier información de fondo, la CAM se inyectó con 1 ml de disolución intralípido (Abbott Laboratorios) antes de la formación de imágenes.
C. Resultados
Gránulos de PCL cargados con s-fosfonato con 0%, 1%, 2%, 4% y 8% inducían una reacción anti-angiogénica dependiente de la dosis, en la CAM. La reacción anti-angiogénica se caracteriza por la ausencia de vasos sanguíneos en la región directamente por debajo del gránulo con carga de s-fosfonato. El desarrollo normal de de la densa red de capilares vista en la CAM de control ha sido claramente inhibida en las CAM tratadas con s-fosfonato. A concentraciones más altas (4% y 8%), las CAM tratadas estaban estructuralmente alteradas en la vecindad del gránulo de fármaco/polímero. Esta alteración incluía un pronunciado engrosamiento de la CAM inmediatamente adyacente al gránulo de s-fosfonato/polímero y adelgazamiento de la membrana adyacente al gránulo. En todas las CAM tratadas con s-fosfonato, una zona no vascular estaba aparente después de una exposición de dos días; esto se definió como un área desprovista de una red capilar que medía aproximadamente 3 mm^{2} de área.
Ejemplo Comparativo 31
Encapsulación de inhibidores de tirosina quinasa en termopasta de PCL y análisis usando el ensayo de la CAM
Inhibidores de tirosina quinasa se trituraron con mortero y su mano para reducir el tamaño de partículas por debajo de 5 \mum. A continuación se mezclaron, en forma de polvo seco, con policaprolactona (peso molecular 18.000 Birmingham Polymers, AL USA). La mezcla se calentó a 65ºC durante 5 minutos y la mezcla fundida de polímero/agente se agitó, para dar una pasta uniforme, durante 5 minutos. La pasta fundida se introdujo, luego, en una jeringa de 1 m Ly se extrusionó para formar gránulos de 3 mg. Estos gránulos se sometieron a ensayo, luego, en el ensayo de la CAM. Los inhibidores de tirosina quinasa que se sometieron a ensayo en el ensayo de CAM, incluyen lavendustina-c, erbstatina, herbimisina, y genisteina. Cuando se comparan los efectos de inhibición anti-angiogénica de estos agentes, herbimisina (2% en PCL) fue el más potente induciendo una zona no vascular en 4/4 de las CAM sometidas a ensayo.
Ejemplo Comparativo 32
Encapsulación de alcaloides de vincapervinca en termopasta de PCL y análisis usando el ensayo de la CAM A. Incorporación de inhibidores en termopasta de PCL
Alcaloides de vincapervinca (vinblastina y vincristina) se molieron con un mortero y su mano para reducir el tamaño de partículas a menos de 5 \mum. Después se mezclaron en forma de polvo seco con policaprolactona (peso molecular 18.000 Birmingham Polymers, AL USA). La mezcla se calentó a 65ºC durante 5 minutos y la mezcla fundida de polímero/agente se agitó, para obtener una pasta uniforme, durante 5 minutos. La pasta fundida se introdujo, luego, en una jeringa de 1 mL y se extrusionó para formar gránulos de 3 mg. Estos gránulos se sometieron a ensayo, luego, en el ensayo de la CAM.
B. Resultados
Al ensayar las formulaciones sobre la CAM, fue evidente que los agentes estaban siendo desprendidos del gránulo de PCL en cantidades suficientes para inducir un efecto biológico. Vinblastina y vincristina inducían efectos anti-angiogénicos en el ensayo de CAM cuando se compara con gránulos de termopasta de PCL de control.
A concentraciones de 0,5% y 0,1% de carga de fármaco, vincristina inducía inhibición de angiogénesis en todas las CAM sometidas a ensayo. Cuando se sometieron a ensayo concentraciones que excedían del 2%, vinblastina era también tóxico para el embrión.
Ejemplo 33
Microesferas bioadhesivas A. Preparación de microesferas bioadhesivas
Se fabricaron microesferas a partir de 100 k g/mol de FLLA con un intervalo de diámetro de partículas que oscilaba de10 a 60 \mum. Las microesferas se incubaron en una disolución de hidróxido sódico para producir grupos de ácidos carboxílicos sobre la superficie por hidrólisis del poliéster. La reacción se caracterizó con respecto a la concentración de hidróxido sódico y el tiempo de incubación midiendo la carga superficial. La reacción alcanzó su terminación después de 45 minutos de incubación en hidróxido sódico 0,1 M. Después del tratamiento de base, las microesferas se revistieron con dimetilaminopropilcarbodiimida (DEC), un agente de reticulación dispersando las microesferas en una disolución alcohólica de DEC y dejando secar la mezcla en un polvo capaz de ser dispersado. La relación de pesos de microesferas a DEC fue 9,1. Después de que las microesferas estaban secas, se dispersaron, con agitación, en una disolución al 2% (peso/volumen) de poli(ácido acrílico) y la DEC se dejó reaccionar con PAA para producir una red insoluble en agua de PAA reticulado sobre la superficie de las esferas. La microscopia electrónica de barrido se usó para confirmar la presencia de PAA sobre la superficie de las microesferas.
Calorimetría diferencial de barrido de las microesferas, antes y después del tratamiento con base reveló que no se observaban cambios en las propiedades térmicas (Tg, punto de fusión, y grado de cristalinidad) por microscopia electrónica de barrido.
B. Velocidades de desprendimiento de paclitaxel in vitro
Se fabricaron microesferas con carga de paclitaxel (cargas de 10% y 30% peso/peso) con el mismo intervalo de tamaños de partículas y perfiles de desprendimiento in vitro durante 10 días en disolución salina tamponada con fosfato. El desprendimiento fue proporcional a la carga de fármaco, 400 \mum de paclitaxel desprendidos de 5 mg de microesferas con carga de 30% en 10 días y 150 \mug desprendidos de microesferas con carga de 10% en el mismo período. La eficiencia de encapsulación fue aproximadamente de 80%. Las microesferas con carga de paclitaxel se incubaron en hidróxido sódico 0,1 M durante 45 minutos y el potencial zeta se midió antes y después de incubación en hidróxido sódico. La carga superficial de microesferas con carga de paclitaxel era más baja que microesferas sin paclitaxel, ni antes ni después del tratamiento con base.
C. Preparación y evaluación in vitro de PLLA revestido con poli-lisina o con fibronectina
Microesferas de PLLA se prepararon conteniendo 1% de negro sudan (para colorear las microesferas). Estas esperas se dispersaron en una disolución al 2% (peso/volumen) de poli-lisina (Sigma Chemicals - forma de Hydrobromell) o fibronectina (Sigma) durante 10 minutos. Las microesferas se lavaron en tampón una vez y se colocaron sobre la superficie interna de vejigas recientemente preparadas de ratas. La vejiga se dejó durante 10 minutos y después se lavó tres veces con tampón. Microesferas residuales (unidas) estaban presentes sobre la pared de la vejiga después del proceso, comprobando, por tanto, que se había producido bioadhesión (figuras 69A y 69B) tanto para microesferas revestidas con fibronectina como para las revestidas con poli-1-lisina.
Ejemplo 34
Síntesis de poli(N-isopropilacrilamida)
Poliacrilamida y sus derivados se pueden sintetizar fácilmente por polimerización de radicales libres y polimerización inducida por irradiación. Lo siguiente es un ejemplo de síntesis de poli(N-isopropilacrilamida), en la que el monómero N-isopropilacrilamida se purifica por recristalización en un disolvente orgánico tal como hexano o tolueno.
En resumen, N-isopropilacrilamida se disuelve en tolueno a una temperatura tal como 60ºC. Esta disolución se enfría hasta una temperatura más baja (por ejemplo, 4ºC) para permitir la recristalización del monómero. El monómero se recoge, luego, por filtración y se seca a vacío. Para síntesis, el monómero purificado (20 g) se disuelve en agua destilada (180 mL) en un matraz de vidrio de fondo redondo. La disolución se purga con nitrógeno durante 30 minutos para reemplazar el oxígeno disuelto. A continuación se sube la temperatura a 65ºC y algo de iniciador (0,1 g) tal como persulfato amónico y 2,2'-azobis-isobutironitrilo se añade para iniciar la polimerización. La polimerización está completada en 10 horas y está bajo la protección de nitrógeno y agitación. Finalmente, poli(N-isopropilacrilamida) se precipita añadiendo etanol. El polímero se seca y se almacena.
Ejemplo 35
Síntesis de derivados de poli(ácido acrílico)
Poli(ácido acrílico) y sus derivados se pueden sintetizar por polimerización de radicales libres y por polimerización inducida por irradiación. Lo siguiente es un ejemplo de síntesis de poli(ácido acrílico), en la que ácido acrílico monómero se purifica por destilación (por ejemplo, 40ºC) bajo presión reducida (por ejemplo, 10 mmHg).
En resumen, el monómero purificado (20 g) se disuelve en dioxano (180 mL) en un matraz de vidrio de fondo redondo. La disolución se purga con nitrógeno durante 30 minutos para reemplazar el oxígeno disuelto. A continuación se sube la temperatura a 65ºC y algo de iniciador (0,1 g) de 2,2'-azobis-isobutironitrilo se añade para iniciar la polimerización. La polimerización está completada en 24 horas y está bajo la protección de nitrógeno y agitación. Finalmente, el poli(ácido acrílico) se precipita añadiendo n-hexano. El polímero se seca y se almacena.
Ejemplo 36
Administración pervascular de paclitaxel
Ratas WISTAR que pesan 250-300 g se anestesian mediante inyección intramuscular de Innovar (0,33 mL/kg). Una vez sedadas, se colocan, luego, bajo anestesia de halotano. Después de que se ha establecido la anestesia general, se afeita el pelo sobre la región cuello, la piel se sujeta y se limpia con betadina. Una incisión vertical se produce en la arteria carótida izquierda y la arteria carótida externa expuesta. Dos ligaduras se colocan alrededor de la arteria carótida externa y se realiza una arteriotomía transversa. Un catéter de globo FRENCH FOGART número 2 se introduce, luego, en la arteria carótida y se hace pasar a la arteria carótida común izquierda y el globo se infla con disolución salina. El catéter se hace pasar por encima y por debajo de la arteria carótida tres veces. Se retira, luego, el catéter y la ligadura se conecta sobre la arteria carótida externa izquierda.
Paclitaxel (33%) en etileno-acetato de vinilo (EVA) se inyecta, luego, de una manera circunferencial alrededor de la arteria carótida común en diez ratas. EVA solo se inyecta alrededor de la arteria carótida común en diez ratas adicionales. Cinco ratas de cada grupo se sacrifican a los 14 días y las cinco finales a los 28 días. En las ratas se observa la pérdida de peso u otros signos de dolencia sistémica. Después de 14 ó 28 días, los animales se anestesian y la arteria carótida izquierda de expone de la manera del experimento inicial. La arteria carótida se aísla, se fija en formaldehído tamponado de 10% y se examina histológicamente.
Ejemplo 37
Tratamiento de arteriosclerosis A. Arteriosclerosis
Lesiones arterioscleróticas se crean en conejos blancos de Nueva Zelanda mediante la dieta solamente. Brevemente, conejos blancos de Nueva Zelanda que pesan aproximadamente 1,6 kg se someten a una alimentación en polvo suplementada por 0,25% de colesterol en peso. El colesterol total del plasma se mide semanalmente tomando muestras de una vena marginal de un oído después de una inyección de Innovar (0,1 mL/kg) para dilatar los vasos sanguíneos. Las muestras se mezclan con EDTA para conseguir una concentración de 0,15% en la mezcla y se coloca sobre hielo hasta separación de plasma por centrifugación a baja velocidad.
Una semana después de la iniciación de la dieta completa de colesterol, los animales se dividen al azar en 3 grupos de 10. Después de una inducción anestésica con 35 mg/kg de cetamina y 7 mg/kg de xilazina y, luego, anestesia general con intubación, el pelaje se afeita y la piel se esteriliza en el abdomen. Se realiza una laparotomía y se aísla la arteria abdominal. Usando una aguja de 22 g, pasta de etileno-acetato de vinilo, pasta de etileno-acetato de vinilo que contenía 5% de paclitaxel, o pasta de etileno-acetato de vinilo que contenía 33% de paclitaxel, se coloca de una manera circunferencial alrededor de la mitad proximal de la arteria abdominal infrarrenal. La mitad distal de la aorta que se extiende a la bifurcación aórtica no se trata. En 10 conejos de control, la aorta abdominal infrarrenal se aísla pero no se inyecta nada alrededor de ella.
Los alimentos aterogénicos se continúan durante 24 semanas. En ese tiempo, los animales se anestesian con una inyección de cetamina (350 mg/kg) y xilazina (7 mg/kg) intramuscularmente y después se sacrifican con una sobredosis intravenosa de Euthanol (240 mg/mL; 2 mL/4,5 kg). Los animales se fijan, luego, por perfusión a 100 mm de mercurio vía el ventrículo izquierdo, por perfusión de disolución salina equilibrada de Hanks con 0,15 mmol/litro de ácido N-2-hidroxietilpaparazina-N'-2-etanosulfónico (pH 7,4) que contiene heparina (1 IU/mL) durante 10 minutos, seguido por fijador diluido de Kamovsky. Las arterias aorta torácica y abdominal y la ilíaca se separan en bloque y se colocan en una disolución similar, durante 30 minutos adicionales.
Secciones delgadas consecutivas se efectúan, luego, a través la aorta torácica y particularmente a través de la aorta abdominal infrarrenal. Tinciones de Movat, H&E, y Masson se llevan a cabo y se realiza el análisis histológico para examinar el grado de acomodo luminal, el grado de desarrollo de lesión aterosclerótica y cualquier reacción periluminal a las medicaciones arteriales circunferenciales.
Ejemplo 38
Tratamiento de reestenosis
Ratones WISTAR que pesan 250-300 g se anestesian por inyección intramuscular de Innovar (0,33 mL/kg). Una vez que están sosegados se colocan bajo anestesia de halotano. Después que se establece la anestesia general, el pelo sobre la región del cuello se afeita y la piel se limpia con betadina. Una incisión vertical se realiza sobre la arteria carótida izquierda y se expone la arteria carótida externa. Dos ligaduras se llevan a cabo alrededor de la arteria carótida externa y se realiza una arteriotomía transversa entre ellas. Un catéter de globo de 2Fr Fogarty se introduce en la arteria carótida externa y se hace pasar en la arteria carótida común y el globo se infla con disolución salina. El catéter se hace pasar por arriba y por debajo de la arteria carótida tres veces para desnudar el endotelio. El catéter se separa y las ligaduras se conectan con la arteria carótida externa izquierda.
Los animales se colocan al azar en grupos de 5. Subgrupos de 5 ratas son control, polímero de excipiente solo, polímero de excipiente más se suministra 1, 5, 10, 20 y 33% de paclitaxel. Existen dos polímeros de excipiente a investigar. EVA y mezcla de EVA/PLA. La mezcla de polímeros se sitúa de manera circunferencial alrededor de la arteria carótida. La herida se cierra después. Ratas de cada grupo se sacrifican a los 14 y 28 días. Entretanto, en las ratas se observan la pérdida de peso y otros signos sistémicos. Después de 14 ó 28 días, los animales se sacrifican por sedación inicial con Innovar intramuscular (0,33 mL/kg). Luego se examinan las arterias por histología.
Ejemplo 39
Hiperplasia intima que causa estenosis de injerto A. Estudios de animales
Anestesia general se induce en cerdo doméstico. Se afeita la región del cuello y la piel se esteriliza con disolución de limpieza. Se realizan incisiones verticales en cada lado del cuello y la arteria carótida está al descubierto y un injerto de PTFE de 8 mm se inserta por 2 extremos para anastomosis lateral, la anastomosis proximal sobre la arteria carótida común y la anastomosis distal en la arteria carótida interna bilateralmente. La arteria derivada interpuesta se ata con ligadura. Loa animales se dividen al azar en grupos de 10 cerdos que reciben polímero de excipiente solo, 10 cerdos que reciben polímero de excipiente más 5% de paclitaxel, y 10 cerdos que reciben polímero de excipiente más 33% de paclitaxel adyacente a cada anastomosis quirúrgica creada en el lado izquierdo solamente. Los injertos del lado derecho servirán como control en cada cerdo. Las heridas se cierran y los cerdos se recuperan.
Se estudia un segundo grupo de cerdos. Los injertos se crean de una manera similar. Ningún agente vasoactivo se coloca próximo a los sitios anastomóticos en el tiempo de la operación. Los animales se recuperan. Dos semanas después de que se ha llevado a cabo el injerto, se administra una segunda anestesia general y se vuelve a explorar la arteria carótida izquierda. Adyacente a las anastomosis proximal y distal, 10 cerdos cada uno recibe excipiente solo, excipiente polímero más 5% de paclitaxel y excipiente polímero más 33% de paclitaxel de una manera circunferencial adyacente a las anastomosis proximal y distal. Las heridas se cierran y los cerdos se recuperan. En el lado opuesto, el injerto del lado derecho sirve como control.
A los 3 meses, todos los cerdos experimentan anestesia general. Una reducción se realiza en la arteria femoral y un catéter de cola de puerco se inserta en la arteria torácica ascendente bajo guía fluoroscópica. Se lleva acabo una inyección de arco con formación de imagen de la vasculatura de la carótida. Específicamente, se mide el grado de estenosis de los injertos proximal y distal y la arteria inmediatamente distal a la anastomosis distal del injerto y se calcula el % de estenosis. Si es necesario, se llevan a cabo inyecciones selectivas de las arterias carótidas comunes.
5 cerdos de cada grupo se sacrifican. Los animales se fijan, luego, por perfusión a 100 mm de mercurio vía el ventrículo izquierdo por perfusión de la disolución salina equilibrada de Hanks con 0,15 mmol/L de ácido N-2-hidroxietilpaparazina-N'-2-etanosulfónico (pH 7,4) que contiene heparina (1U/mL) durante 10 minutos seguido por dilución fijadora de Karnovsky durante 15 minutos. La aorta torácica y abdominal y arterias carótidas se separan en bloque y se sitúan en una disolución similar durante 30 minutos adicionales.
Secciones histológicas se llevan a cabo a través de la arteria carótida inmediatamente próxima a la anastomosis proximal, en la anastomosis proximal, en la anastomosis distal y la arteria carótida inmediatamente distante de la anastomosis distal. Las secciones se tiñen con disolución colorante de Movat y H&E y Masson. Se toma nota del análisis histológico de la reacción íntima y adventicia así como la reacción perivascular. Se calcula el análisis morfométrico con grado de estrechamiento luminal.
Los cerdos restantes se estudian a los 6 meses y se lleva a cabo un procedimiento de sacrificio de angiografía.

Claims (20)

1. Uso de paclitaxel, o uno de sus análogos o derivados, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades de vías de conducción del cuerpo, o enfermedades asociadas con la obstrucción o estrechamiento de vías de conducción del cuerpo, en el que el medicamento se ha de administrar a una porción externa de dichas vías de conducción del cuerpo.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho medicamento comprende, además, un polímero.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es biodegradable.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es poli(etileno-acetato de vinilo) (40% reticulado).
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es un copolímero de ácido láctico y ácido glicólico.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es poli(caprolactona).
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es poli(ácido láctico).
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es un copolímero de poli(ácido láctico) y poli(caprolactona).
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es un poliéster.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polímero es un polianhídrido.
11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho medicamento esta en forma de hilo.
12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho medicamento está en forma de pulverización.
13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho medicamento está en forma de película.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichas vías de conducción del cuerpo se eligen en el grupo que consiste en arterias, el esófago, el estómago, el duodeno, el intestino delgado, el intestino grueso, el tracto biliar, el uréter, la vejiga, la uretra, los conductos lagrimales, la tráquea, bronquios, bronquiolos, vías nasales, trompas de Eustaquio, el canal auditivo externo y las trompas de Falopio.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha vía del cuerpo es una arteria.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha vía de conducción del cuerpo es una vena.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha vía de conducción del cuerpo es un sitio de una anastomosis de injerto.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho medicamento se administra a una arteria por inyección directa, vía una pared exterior de la arteria al interior del órgano adventicio.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad es una reacción a un dispositivo endoluminal.
20. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicha enfermedad se elige en el grupo que consiste en enfermedades vasculares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades genitourinarias y enfermedades pulmonares.
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