KR20040097250A - 신체 통로의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및방법 - Google Patents

신체 통로의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및방법 Download PDF

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KR20040097250A KR10-2004-7015554A KR20047015554A KR20040097250A KR 20040097250 A KR20040097250 A KR 20040097250A KR 20047015554 A KR20047015554 A KR 20047015554A KR 20040097250 A KR20040097250 A KR 20040097250A
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KR10-2004-7015554A
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헌터윌리암엘
맥찬린제이에스
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유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아
안지오테크 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신체 통로의 외부에 치료제를 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 치료제의 대표적인 예로는 혈관 형성 억제 인자, 증식억제제, 소염제 및 항생제를 들 수 있다.

Description

신체 통로의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for treating or preventing diseases of body passageways}
본 발명은 일반적으로 신체 통로의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 신체 통로의 외벽에 전달될 수 있는 치료제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
신체 내에는 필수 물질들을 순환시키는 많은 통로가 있다. 그 예로는 동맥 및 정맥, 식도, 위, 소장 및 대장, 담관, 수뇨관, 방광, 요도, 비도, 기관 및 기타 기도, 및 남성 및 여성 생식기를 들 수 있다. 상해, 각종 수술 절차 또는 질병은 이러한 신체 통로를 좁히고, 약화시키고/시키거나 폐색시킴으로써, 심한 합병증 및/또는 심지어 사망에 이르게 한다.
예를 들면, 많은 종류의 종양(양성이나 악성 모두)은 신체 통로의 벽에 손상을 초래하거나 또는 내강(lumen)을 폐색시킴으로써, 통로를 통한 물질의 흐름을 늦추거나 또는 방해한다. 1996년에만, 미국에서 식도암으로 인해 11,200명 이상이 사망하고, 대장암 및 소장암으로 인해 51,000명 이상이 사망하였으며, 직장암으로 인해 약 17,000명이 사망한 것으로 추정된다. 암이 침범한 신체 통로의 폐색은 그 자체로서 또는 저절로 생명을 위협할 뿐만 아니라, 환자의 삶의 질을 제한한다.
신생물 폐색을 유발하는 대부분의 종양에 대한 일차 치료는 수술에 의한 제거 및/또는 화학요법, 방사선요법 또는 레이저요법이다. 불행하게도, 종양이 신체 통로에서 폐색을 유발할 때까지는 종종 수술할 수 없고, 일반적으로 전통적인 치료법에 반응하지 않을 것이다. 이러한 문제에 대한 한가지 접근법은 내강내 스텐트의 삽입이다. 간단히 말해, 스텐트는 종양 또는 기타 조직/물질에 의해 봉쇄되어 있는 통로를 물리적으로 개방시키기 위해 신체 통로의 내강에 넣는 장치이다. 통상적으로 배치되는 스텐트의 대표적인 예로는 월(Wall) 스텐트, 스테커(Stecker) 스텐트, 자이언투르코(Gianturco) 스텐트 및 팔메즈(Palmaz) 스텐트(미합중국 특허 제5,102,417호, 동 제5,195,984호, 동 제5,176,626호, 동 제5,147,370호, 동 제141,516호 및 동 제4,776,337호)를 들 수 있다. 그러나, 신생물 폐색에 이들 스텐트를 사용하는 데 따른 중요한 결점은 종양이 종종 스텐트의 틈을 통해 내강으로 성장할 수 있다는 것이다. 또한, 내강 내에 스텐트가 존재함으로써, 스텐트의 표면 상으로 반응성 또는 염증성 조직(예: 혈관, 섬유아세포 및 백혈구)의 내부 성장을 유도할 수 있다. 이러한 내부 성장(종양 세포 및/또는 염증 세포로 구성됨)이 스텐트의 내표면에 도달하고, 내강을 손상시키는 경우, 그 결과는 스텐트가 치료를 위해 삽입된 신체 통로를 재봉쇄한다.
신생물을 형성하지 않지만은 증식과 연관된 다른 질병들은 신체 통로를 마찬가지로 폐색할 수 있다. 예를 들면, 양성 전립선 비대증으로 인한 전립선 요도의 협착은 60세 이상의 모든 남성의 60% 및 80세 이상의 모든 남성의 100%에 영향을 미치는 심각한 문제이다. 5-α-환원 효소 억제제(예: 피나스테라이드(Finasteride)) 또는 α-아드레날린성 봉쇄제(예: 테라조잔(Terazozan)) 등의 현재의 약물학적 치료는 일반적으로 제한된 수의 환자에게만 효과적이다.
더욱이, 수행될 수 있는 수술 절차(예: 전립선의 경요도 절제술(TURP); 개방성 전립샘 절제술, 또는 레이저 전립샘 절제술 등의 엔도-비뇨기과 수술, 마이크로파의 사용, 저체온법, 저온 수술 또는 스텐팅) 중에서, 출혈, 감염증, 실금, 성교 불능, 및 재발성 질병 등의 수많은 합병증이 전형적으로 초래될 수 있다.
신생물 질병 또는 증식성 질병 외에, 혈관 질병 등의 다른 질병들이 신체 통로의 협착, 약화 및/또는 폐색을 초래할 수 있다. 1993년도 견적서(출처-U.S. Heart and Stroke Foundation homepage)에 따르면, 6천만 이상의 미국인들이 1가지 이상의 형태의 심장 혈관계 질병을 갖고 있다. 이들 질병은 그 해에 954,138명의 목숨을 앗았다(미국내의 모든 사망의 41%).
기구 혈관형성술(balloon angioplasty)(스텐팅의 유무)은 혈관계 질병에 대해 가장 널리 사용되는 치료법들 중의 하나이고; 레이저 혈관 형성술 등의 다른 옵션 역시 이용할 수 있다. 이는 혈관 구조의 심한 협착이 일어난 많은 경우에 선택된 치료법이지만, 기구 혈관형성술(출처-Heart and Stroke Foundation homepage)을 시행한 환자들의 약 1/3이 최초 수술후 6개월 이내에 치료받은 동맥의 협착이 재발하였고(재협착증); 종종 또 다른 간섭을 필요로 하기에 충분히 심각하였다.
이러한 혈관계 질병(예를 들면, 재협착증을 포함함)은 적어도 부분적으로 혈관 평활근 세포(VSMC) 이동, VSMC 증식 및 세포외 매트릭스 침착에 부수적인 동맥 내막의 비대에 기인한다. 간단히 말해, 혈관의 내피는 혈액이 원활하게 흐를 수 있는 비트롬보겐성 표면으로서 및 혈관벽을 포함하는 조직으로부터 혈액 성분들을 분리하는 장벽으로서 작용한다. 내피 세포는 헤파린 황산염, 프로스타사이클린, EDRF, 및 혈소판, 백혈구 부착, VSMC 수축, VSMC 이동 및 VSMC 증식을 억제하는 다른 인자를 방출하기도 한다. 기구 혈관형성술, 죽종절제술, 또는 스텐트 삽입 중에 발생하는 바와 같은 내피에 대한 손실 또는 손상은 혈소판 부착, 혈소판 응집 및 혈전 형성을 초래할 수 있다. 활성화된 혈소판들은 혈관수축을 일으키는 물질(세로토닌 및 트롬복산) 및/또는 VSMC 이동 및 증식을 고무시키는 물질(PDGF, 상피 성장 인자, TGF-β 및 헤파리나제)을 방출할 수 있다. 동맥에 의해 방출된 조직 인자들은 평활근 세포들이 이동할 수 있고 증식할 수 있는 피브린 매트릭스를 초래하는 응혈 형성을 자극한다.
사건들의 이러한 캐스케이드는 분비 표현형에 대한 수축근으로부터 혈관의 평활근 세포들의 변환을 유도한다. 혈관형성술에 의해 유도된 세포 분해 및 매트릭스 파괴는 기본적인 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 지엽적 방출을 초래하고, 이는 또한 PDGF 생산의 유도를 통해 직간접적으로 VSMC 증식을 자극한다. PDGF 및 bFGF 외에, VSMC 증식은 혈소판 방출된 EGF 및 인슐린 성장 인자-1에 의해서도 자극받는다.
혈관의 평활근 세포들은 혈관의 동맥 내막 및 매질로 이동하도록 유도되었다. 이는 세포외 매트릭스 및 혈관벽의 내부 탄성층을 통해 VSMC에 대한 경로를 저해하는 매트릭스 메탈로프로테아제를 방출하고 활성화시킴으로써 기능한다. 이동 및 증식 후, 혈관의 평활근 세포는 동맥 내막 비대의 가장 큰 부분을 포함하는 글리코사미노글리칸, 엘라스틴 및 콜라겐으로 구성된 세포외 매트릭스를 침착시킨다. 재협착 과정의 주요 부분은 동맥의 전체적인 크기 변화를 유도하는 혈관 벽의 리모델링으로 인한 것일 수 있고; 적어도 그의 일부는 (매질 외에) 외막 내부 증식에 부수적이다. 이들 과정의 순수한 결과는 흔히 반복적인 개입을 요구하기에 충분히 심한 혈관 벽의 협착의 재발이다.
요약하자면, 혈관의 내강 내의 사실상의 임의의 강력한 조작으로 그의 내피 내층(lining)을 손상시키거나 노출시킬 것이다. 따라서, 혈관 질병 자체 및 치료 개입후 재협착에 대한 치료 옵션은 계속하여 이러한 증상들에 대한 장기적인 성과와 관련한 주요 문제점으로 대두될 것이다.
신생물 형성 폐색 및 혈관 질병 외에, 신체 통로의 폐색을 초래하는 많은 급성 및 만성 염증성 질병이 있다. 예를 들면, 혈관염, 위장관 질병(예: 크론병, 궤양성 대장염) 및 호흡기 질병(예: 천식, 만성 폐색성 폐병)이 있다.
이들 질병 각각은 소염제 또는 면역억제제 등을 투약함에 따라 가변적인 성공도로 치료될 수 있다. 그러나, 현재의 치료법은 질병의 진행을 완화시키는 데 종종 효과적이지 못하고, 전신 독성 및 바람직하지 못한 부작용을 초래할 수 있다. 수술 절차가 투약 요법 대신에 또는 그 이외에 이용될 수도 있다. 그러나, 이러한 수술 절차는 흉터 형성으로 인해 지엽적으로 재발할 확률이 높고, 특정 조건하에(예: 기구 카테터의 사용을 통해), 양성의 반응성 과잉 성장을 초래할 수 있다.
신체 통로를 또한 폐색시킬 수 있는 다른 질병으로는 전염성 질병을 들 수 있다. 간단히 말해, 신체 통로의 폐색을 초래할 수 있는 많은 급성 및 만성 전염성 과정, 예를 들면, 요도염, 전립선염 및 기타 남성 생식기의 질병, 여성 생식기의 여러 가지 질병, 방광염 및 요도염(요도의 질병), 만성 기관지염, 결핵 및 기타 미코박테리아 감염증 및 기타 호흡기 문제 및 특정 심장혈관계 질병이 있다.
이들 질병은 현재 여러 가지 상이한 치료 요법 및/또는 수술 절차에 의해 치료되고 있다. 그러나, 상기한 바와 같이, 이러한 치료 요법은 바람직하지 못한 부작용을 초래할 수 있는 연관된 전신 독성의 어려움을 갖는다. 또한, 상기한 바와 같이 수술 절차는 흉터 형성으로 인해 지엽적 재발을 초래할 수 있고, 특정 절차(예: 시판중인 스텐트의 삽입) 중에, 양성의 반응성 과잉 성장을 초래할 수 있다.
상기 질병에 대한 현재의 치료법 및 그 대부분에 대한 상태는 동일한 한계를 공유한다. 치료제의 사용은 이들 상태의 반전을 초래하지 않고, 이 상태를 치료하기 위해 개입이 이루어질 때마다 그 개입에 대한 신체 반응의 결과로서 환자에게 위험이 된다. 본 발명은 위에서 일반적으로 논의된 상태 및 질병을 치료하는 데 적절한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물 및 방법은 현재의 수술 절차와 연관된 문제점들을 제시하고, 현재의 수술 절차와 비교할 때 현저한 장점을 제공하고, 또한 다른 관련된 장점들을 제공한다.
간단히 말해, 본 발명은 신체 통로의 외부에 치료제를 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 관련된 면에서, 외막을 통해 상기 신체 통로의 평활근 세포에 치료제를 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 질병 부위에 치료제 화합물을 지엽적으로 전달함으로써, 전신의 불필요한 부작용을 피할 수 있고, 전체 투여량은 잠재적으로 감소될 수 있다. 병이난 통로 둘레에 4분원으로 또는 주변에 전달함으로써 조직의 상피 내층에 대한 손상을 포함하여, 내강 내 조작의 많은 단점을 피할 수도 있다. 예를 들면, 내피에 대한 손상은 혈전증, 층류 패턴의 변화 및/또는 내강 내 장치에 대한 이물질 반응을 초래할 수 있고, 이들 중 어느 것은 재협착 캐스케이드를 개시할 수 있다. 전립선 질병의 경우에, 요도의 기구 사용을 피함으로써 협착 가능성을 줄일 수 있고, 자제성 및 효능을 보존할 수 있다.
도 1은 PCL 미소구에 대한 뉴트로필(세포 0.5ml(진한 5x106 세포/ml) 중의 미소구 20mg/ml)의 화학루미네센스 반응에 대한 중합성 미소구의 혈장 옵소닌 작용(opsonization) 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 PCL 미소구에 대한 뉴트로필(5x106 세포/ml)의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 혈장 +/- 2% 플루로닉 F127의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 PMMA 미소구에 대한 뉴트로필(5x106 세포/ml)의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 혈장 +/- 2% 플루로닉 F127의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 PLA 미소구에 대한 뉴트로필(5x106 세포/ml)의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 혈장 +/- 2% 플루로닉 F127의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 EVA:PLA 미소구에 대한 뉴트로필(5x106 세포/ml)의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 혈장 +/- 2% 플루로닉 F127의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 PCL 미소구에 대한 뉴트로필의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 IgG(2mg/ml) 또는 2% 플루로닉 F127에 이어서 IgG(2mg/ml)의 효과를 나타내는그래프이다.
도 7은 PMMA 미소구에 대한 뉴트로필의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 IgG(2mg/ml) 또는 2% 플루로닉 F127에 이어서 IgG(2mg/ml)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 PVA 미소구에 대한 뉴트로필의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 IgG(2mg/ml) 또는 2% 플루로닉 F127에 이어서 IgG(2mg/ml)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 EVA:PLA 미소구에 대한 뉴트로필의 화학루미네센스 반응에 대한 미리코팅한 IgG(2mg/ml) 또는 2% 플루로닉 F127에 이어서 IgG(2mg/ml)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 미소구의 응집시 EVA:PLA 중합체 혼합비의 효과를 나타내는 도면이다. 도 10b는 "작은" 미소구의 크기를 나타내는 주사 전자 현미경 사진이다. 도 10c("10C-인셋"으로 표지된 확대된 인셋 포함)는 "큰" 미소구의 크기를 나타내는 주사 전자 현미경 사진이다. 도 10d는 시간 경과에 따른 0.6% w/v 파클리탁셀-부하된 50:50 EVA:PLA 중합체 혼합 미소구들로부터 37℃에서 인산염 완충 염수(pH 7.4)로의 파클리탁셀의 시험관내 방출을 나타내는 그래프이다. 개방된 원들은 "작은" 크기의 미소구이고, 폐쇄된 원들은 "큰" 크기의 미소구이다. 도 10e는 미소구("MS")에 의한 파클리탁셀 방출 결과를 나타내는 CAM의 사진이다. 도 10f는 증가된 배율에서의 10E의 사진과 유사한 사진이다.
도 11a는 1%, 2%, 5% 또는 10% 파클리탁셀을 함유하는 폴리카프로락톤 미소구들로부터 37℃에서 인산염 완충 염수로의 방출 속도 프로필을 나타내는 그래프이다. 도 11b는 대조용 미소구들로 처리한 CAM을 나타내는 사진이다. 도 11c는 5% 파클리탁셀 부하된 미소구들로 처리한 CAM을 나타내는 사진이다.
도 12a 및 12B는 각각 시간 경과에 따른 EVA 필름으로부터 파클리탁셀의 방출 및 동일한 필름내에 남아 있는 파클리탁셀의 비율을 나타내는 2개의 그래프이다. 도 12c는 파클리탁셀이 없는 EVA/F12' 필름의 경시적 팽윤을 나타내는 그래프이다. 도 12d는 파클리탁셀이 없는 EVA/스팬 80 필름의 경시적 팽윤을 나타내는 그래프이다. 도 12e는 여러 가지 EVA/F127 혼합물에 대한 응력 대 변형 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 13a 및 13B는 제형 중의 % MePEG의 함수로서 PCL/MePEG 중합체 혼합물의 융점(13A), 및 제형 중의 MePEG의 양의 함수로서 PCL 페이스트가 60℃에서 고화되는 데 필요한 시간의 증가율(%)(13B)을 나타내는 2개의 그래프이다. 도 13c는 변화하는 PCL/MePEG 중합체 혼합물의 연화도를 나타내는 그래프이다. 도 13d는 여러 가지 MePEG 농도의 중합체 혼합물에 대해 경시적 중량 변화율(%)을 나타내는 그래프이다. 도 13e는 1% 파클리탁셀이 부하된 여러 가지 중합체 혼합물로부터 파클리탁셀의 경시적 방출 속도를 나타내는 그래프이다. 도 13f 및 13G는 20% MePEG/PCL 혼합물로부터 방출된 파클리탁셀의 총량에 대한 변화하는 파클리탁셀의 양의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 13h는 MePEG/PCL 중합체의 인장 강도에 대한 MePEG의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 여러 가지 중합체 제형으로부터 파클리탁셀 방출을 나타내는 그래프이다.
도 15는 PCL 페이스트로부터 37℃에서 PBS로의 파클리탁셀의 방출을 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다. PCL 페이스트는 파클리탁셀의 미립자들 및 메쉬#140을 사용하여 제조한 여러 가지 첨가제를 함유한다. 오류 막대들은 3가지 시료의 표준 편차를 나타낸다.
도 16은 파클리탁셀-젤라틴-PCL 페이스트로부터 37℃에서 PBS로의 파클리탁셀의 방출을 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다. 이 그래프는 젤라틴 농도(메쉬#140)의 효과 및 메쉬 #140 또는 메쉬 #60을 사용하여 제조한 파클리탁셀-젤라틴(1:1) 미립자들의 크기를 나타낸다. 오류 막대들은 3가지 시료의 표준 편차를 나타낸다.
도 17a 및 17B는 첨가제들의 효과(17A; 메쉬 #140) 및 미립자들의 크기(17B; 메쉬 #140 또는 #60) 및 37℃ 증류수 중에 현탁된 후 20% 파클리탁셀을 함유하는 PCL 페이스트의 팽윤 거동에 대한 첨가제(메쉬 #140)의 비율을 나타내는 그래프이다. 파클리탁셀-젤라틴 중의 270㎛ 미립자들로 제조한 페이스트 및 30% 젤라틴 함유 페이스트에 대한 측정치는 매트릭스의 붕해로 인해 4시간 후 불연속되었다. 오류 막대들은 3가지 시료의 표준 편차를 나타낸다.
도 18a, 18B, 18C 및 18D는 37℃ 증류수 중에 6시간 동안 현탁되기 전(18A) 및 현탁 후(18B)의 파클리탁셀-젤라틴-PCL (20:20:60) 페이스트의 대표적인 주사 전자 현미경 사진이다. 현미경 사진 18C 및 18D는 18B보다 큰 배율이고, 파클리탁셀(막대 형상) 및 젤라틴 매트릭스의 치밀한 연관을 나타낸다.
도 19a 및 19B는 파클리탁셀로 처리된 CAM 중의 구혈(avascularity)의 영역을 나타내는 젤라틴-PCL(19A) 및 파클리탁셀-젤라틴-PCL(20:20:60: 19B)로 처리한 CAM의 대표적인 현미경 사진이다.
도 20은 확립된 종양을 갖는 쥐에게 파클리탁셀-젤라틴-PCL 페이스트를 종양 주위에 주입한 효과를 나타내는 표이다.
도 21은 PDLLA-PEG-PDLLA 조성물의 융점, 엔탈피, 분자량, 다분산성 및 고유 점도를 나타내는 표이다.
도 22는 PDLLA-PEG-PDLLA 및 PEG의 DSC 열분해 곡선을 나타내는 그래프이다. 가열 속도는 10℃/분이다. 융점 및 엔탈피에 대해서 도 21 참조.
도 23은 20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA 실린더로부터 37℃에서 PBS 알부민 완충액으로의 파클리탁셀의 점증적 방출을 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다. 오류 막대들은 4가지 시료의 표준 편차를 나타낸다. 40% PEG의 실린더들은 붕해로 인해 4일째에 불연속되었다.
도 24a, 24B 및 24C는 37℃에서 파클리탁셀의 시험관 내 방출 중에 20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA 실린더의 치수, 길이(A), 직경(B) 및 습윤 중량(C)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 25는 37℃에서 PBS 알부민 완충액 중에서 방출되는 동안 20% 파클리탁셀이 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA 실린더(20% PEG, 1mm 직경)의 겔 투과 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 26은 37℃에서 PBS 알부민 완충액으로 방출되는 동안 (20% 파클리탁셀 부하된) PDLLA-PEG-PDLLA 실린더의 질량 손실 및 중합체 조성 변화를 나타내는 표이다.
도 27a, 27B, 27C 및 27D는 파클리탁셀 방출 전 및 방출 동안 건조된 PDLLA-PEG-PDLLA 실린더(20% 파클리탁셀이 부하됨, 1mm 직경)의 SEM이다. A: 20% PEG, 일수 0; B: 30% PEG, 일수 0; C: 20% PEG, 일수 69; D: 30% PEG, 일수 69.
도 28은 20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA:PCL 혼합물 및 PCL로부터 37℃에서 PBS 알부민 완충액으로의 파클리탁셀의 점증적 방출을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 4개 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
도 29는 쥐의 피하 종양에 지엽적으로 도포된 파클리탁셀 부하된 수술용 페이스트 제형의 효능을 나타내는 표이다.
도 30은 파클리탁셀 방출에 대한 조사 효과를 나타내는 그래프이다.
도 31은 대조용 미소구(PLLA:GA-85:15)에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 32는 20% 파클리탁셀 부하된 미소구(PLLA:GA-85:15)에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 33은 대조용 미소구(PLLA:GA-85:15)에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 34는 20% 파클리탁셀 부하된 미소구(PLLA:GA-85:15)에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 35a, 35B 및 35C는 PLLA와 GA의 여러 가지 비율에 대한 입자 크기 범위를나타내는 그래프이다.
도 36a 및 36B는 PLLA와 GA의 여러 가지 비율에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 37a, 37B 및 37C는 PLLA와 GA의 여러 가지 비율에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 38a 및 38B는 PLLA와 GA의 여러 가지 비율에 대한 입자 크기 범위를 나타내는 그래프이다.
도 39는 선택된 디블록 공중합체의 분자량, CMC 및 최대 파클리탁셀 부하량을 나타내는 표이다.
도 40a 및 40B는 공중합체 및 크레모포어(Cremophor) EL에 의한 물(37℃) 속에서의 파클리탁셀 결정의 용해도를 나타내는 그래프로서, 도 40a는 크레모포어에 대한 공중합체의 농도의 영향(20시간 항온배양)을, 도 40b는 시간의 영향(공중합체 또는 크레모포어 농도 0.5%)을 나타낸다.
도 41a 및 41B는 실온(22℃)에서 미셀형 파클리탁셀 용액의 혼탁도(450㎚에서 UV-VIS 흡광도)를 나타내는 그래프이다. 파클리탁셀 농도는 물 속에서 2mg/ml였다. 파클리탁셀 부하량은, 부하량이 5%인 MePEG 5000-30/70을 제외하고는 10%였다.
도 42는 파클리탁셀-나일론 마이크로캡슐로부터 파클리탁셀 방출을 나타내는 그래프이다.
도 43a는 종양 성장에 대한 파클리탁셀/PCL의 효과를 나타내는 그래프이다.도 43b 및 43C는 종양 성장에 대한 대조용 10% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트 및 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트를 나타내는 2개의 사진이다.
도 44는 미소구의 크기 분포를 수(5% PVA 속에서 10mg 나트륨 수라민(suramin)을 갖는 5% 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트))로 나타낸 막대 그래프이다.
도 45는 미소구의 크기 분포를 중량(5% PVA 속에서 10mg 나트륨 수라민을 갖는 5% 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트))으로 나타낸 막대 그래프이다.
도 46은 50mg 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트) 중의 나트륨 수라민의 캡슐화 중량을 나타낸 그래프이다.
도 47은 50mg 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트) 중의 나트륨 수라민의 캡슐화율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 48은 10% NaCl을 함유하는 5% PVA 중에 제조된 10mg 나트륨 수라민을 함유하는 5% ELVAX 미소구 중량의 크기 분포를 나타내는 막대 그래프이다.
도 49는 10% NaCl을 함유하는 5% PVA 중에 제조된 10mg 나트륨 수라민을 함유하는 5% 미소구 중량의 크기 분포를 나타내는 막대 그래프이다.
도 50은 10% NaCl을 함유하는 5% PVA 중에 제조된 10mg 나트륨 수라민을 함유하는 5% 미소구 수에 의한 크기 분포를 나타내는 막대 그래프이다.
도 51a는 CAM에 대한 수라민 및 코르티손 아세테이트의 사진이다(Mag=8x). 간단히 말해, 이러한 화상은 0.5% 메틸 셀룰로스 중의 수라민 20㎍ 및 코르티손 아세테이트 70㎍으로 처리한 구혈 영역을 보여준다. 구혈 영역의 주변에 위치한 혈관은 약물 공급원으로부터 멀리 방향을 바꾼 것임에 주의하라. 도 51b는 영향받은영역의 혈관의 세부를 보다 큰 배율로 나타낸 사진이다(Mag=20x). 구혈 영역 및 이 구혈 영역과 경계인 혈관의 전형적인 "엘보우" 효과에 주의하라.
도 52a, B, C, D 및 E는 PCL로부터 경시적으로 MTX 방출 효과를 나타낸다.
도 53은 PLA:GA(50:50)로부터 제조된 10% 메토트렉세이트-부하된 미소구의 사진이다; 고유 점도 "IV"=0.78.
도 54는 PCL로부터 10% 부하된 바나딜 황산염의 방출을 나타낸 그래프이다.
도 55는 황산바나듐을 함유하는 히알루론산 미소구의 사진이다.
도 56a는 PCL로부터 유기 바나듐산염의 방출을 나타내는 그래프이다. 도 56b는 시간 경과에 따라 남아있는 유기 바나듐산염의 백분율을 나타낸다.
도 57은 유기 바나듐산염을 함유하는 폴리 D, L, 락트산 미소구를 나타내는 사진이다.
도 58a 및 58B는 PCL(150mg 슬래브)로부터 BMOV의 경시적 방출을 나타내는 그래프이다. (A) 방출된 약물㎍ 또는 (B) 슬래브 중에 남아있는 약물 %. PCL 중의 BMOV의 초기 부하량은 (○), 5%; (●), 10%; (△), 15%; (▲), 20%; ( ), 30% 및 (▽), 35%로 제공된다.
도 59a 및 59B는 (A) 방출된 약물 ㎍ 또는 (B) 슬래브 중에 남아있는 약물 %로서 표현한 PCL:MEPEG(80:20 w:w)의 150mg 슬래브로부터 BMOV의 경시적 방출을 나타내는 그래프이다. PCL:MEPEG 중의 BMOV의 초기 부하량은 (○), 5%; (●), 10%; (△), 15%; (▲), 20%로 제공된다.
도 60a, 60B 및 60C는 BMOV 결정(60A: 상단); 약물 방출 실험의 시작시에20% BMOV를 함유하는 PCL 슬래브의 표면 형태학(60B: 중단) 및 약물 방출 실험의 종료시(PBS 중에서 72일 동안)에 20% BMOV를 함유하는 PCL 슬래브의 표면 형태학(60C: 하단)의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 61a 및 61B는 BMOV에 대해 세포를 1시간 노출(61A)시키거나, 또는 BMOV에 연속적으로 노출시켜(61B) 생존한 세포에 대한 BMOV의 증가하는 농도의 효과를 나타내는 2개의 그래프이다. 세포들은 (○), HT-29 콜론 세포; (●), MCF-7 유방 세포; (△), 스킴(Skmes)-1 비소 폐 세포 및 (▲), 정상적인 골수 세포로 나타냈다.
도 62는 쥐에서 성장한 MDAY-D2 종양의 중량에 대한 BMOV 부하된 페이스트의 영향을 나타내는 표이다. 간단히 말해, 25%, 30% 또는 35% BMOV를 함유하는 PCL 페이스트(150mg)는 쥐의 MDAY-2 종양에 피하 주사되었다. 종양의 중량은 처리한지 10일 후에 측정하였다. 이러한 표는 25% BMOV(표 상단) 및 30% 또는 35% BMOV(표 하단)를 사용한 2가지 개별적인 실험으로부터 얻은 결과로 보인다. 대조용 데이터는 BMOV를 함유하지 않는 PCL로 처리한 쥐에 대해 기재한다.
도 63은 쥐에서 성장한 RIF-1 종양의 중량에 대한 BMOV 부하된 PCL:MePEG 페이스트의 영향을 나타내는 표이다. 간단히 말해, RIF-1 종양은 종양의 90%가 수술에 의해 제거된 시점에서 5일 동안 쥐에서 성장하였고, 절개 부위는 BMOV를 함유하지 않거나(대조용) 또는 5% BMOV를 함유하는 PCL:MePEG(80:20 w:w) 150mg으로 처리하였다. 종양의 재성장은 이러한 처리후 4, 5 및 6일째에 측정하였다.
도 64a 및 64B는 2개의 그래프이다. 도 64a는 PBS/ALB 15mL 중으로 BEMOV가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 BEMOV의 증가된 부하 효과를 보여준다. 도 64b는 PBS/ALB 15mL 중으로 BEMOV가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 BEMOV의 증가된 부하 효과를 역시 보여준다. 약물 방출은 펠릿내 잔류하는 BEMOV의 %로 나타낸다.
도 65a 및 65B는 2개의 그래프이다. 도 65a는 PBS/ALB 15mL 중으로 BEMOV가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 V5의 증가된 부하 효과를 보여준다. 도 65b는 PBS/ALB 15mL 중으로 V5가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 V5의 증가된 부하 효과를 역시 보여준다. 약물 방출은 펠릿 중에 남아있는 V5의 %로서 표현된다.
도 66a 및 66B는 2개의 그래프이다. 도 66a는 PBS/ALB 15mL 중으로 PRC-V가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 PRC-V의 증가된 부하 효과를 보여준다. 도 66b는 PBS/ALB 15mL 중으로 PRC-V가 방출되는 시간에 대한 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 PRC-V의 증가된 부하 효과를 역시 보여준다. 약물 방출은 펠릿 중에 남아있는 PRC-V의 %로서 표현된다.
도 67a, 67B, 67C 및 67D는 PBS/ALB 15mL 중으로 BMOV가 방출되는 시간에 대한 5% BMOV (67A), 10% BMOV (67B), 15% BMOV (67C) 및 20% BMOV (67D)를 갖는 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 MePEG의 상이한 부하 농도 효과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 68a, 68B, 68C 및 68D는 PBS/ALB 15mL 중으로 BMOV가 방출되는 시간에 대한 0% MePEG (68A), 5% MePEG (68B), 10% MePEG (68C) 및 15% MePEG (68D)를 갖는 PCL 써모페이스트(150mg 펠릿) 중의 MePEG의 상이한 부하 농도 효과를 보여주는 일련의 그래프이다. 약물 방출은 펠릿 중에 남아있는 BMOV의 %로서 표현된다.
도 69a 및 69B는 방광 조직 상의 피브로넥틴 코팅된 PLLA 미소구 및 방광 조직 상의 폴리(L-라이신) 미소구의 사진이다.
도 70a 및 70B는 대조용(부하되지 않은) 써모페이스트로 처리한 종양을 갖는 CAM의 2개의 사진이다. 간단히 말해, 도 70a에서, 중심의 백색 괴상이 종양 조직이다. CAM으로부터 종양을 모든 방향으로 도입한 풍부한 혈관에 주의하라. 종양은 "혈관형성 인자"의 생산을 통해 숙주 혈관 구조의 성장을 유발한다. 종양 조직은 그를 공급하는 혈관을 따라 멀리 팽창한다. 도 70b는 70A에 나타낸 CAM의 아래쪽 도면이다. 간단히 말해, 이 도면은 바퀴 살들과 같이 종양에 도입된 혈관의 방사상 외관을 입증한다. 혈관 밀도는 정상적인 CAM 조직 둘레에서보다 종양의 주변에서 더 큰 것에 주의하라. 도 70c 및 70D는 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트로 처리한 종양을 갖는 CAM의 2개의 사진이다. 간단히 말해, 도 70c에서, 중심의 괴상은 종양 조직이다. 종양 조직 주변의 혈관이 부족함에 주의하라. 혈관 형성 억제제의 서방출은 종양에 의해 생성된 혈관 형성 자극을 극복할 수 있다. 종양 자체는 충분하게 혈관화되지 않고, 크기가 점진적으로 감소한다. 도 70d는 도 70c에 나타낸 CAM 아래쪽으로부터 취하며, 대조용 종양 조직과 비교할 때 종양으로의 혈류의 붕괴를 나타낸다. 혈관 밀도는 종양 근처에서 감소하고, 정상적인 주변 CAM 조직보다 빈약하다.
본 발명의 범위에 속하는 광범위한 범위의 치료제, 예를 들면, 혈관 형성 방지제, 증식억제제, 소염제 및 항생제가 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 '보다 가벼운 d 기' 제제 등의 항미세관제(예: 바나듐산염 또는 바나딜 화합물), 또는 D2O 디스코데몰리드(discodermolide), 에피틸론(epithilone) 및 파클리탁셀(paclitaxel) 등의 미세관 안정화제 또는 이들의 동족체나 유도체이다.
본 발명의 특정 양태에서, 치료제는, 예를 들면, 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)(40% 가교됨), 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(락트산)과 폴리(카프로락톤)의 공중합체, 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐 매트릭스 및 알부민 등의 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 기타 담체(예: 리포좀)도 또한 하나 이상의 치료제를 함유하고/하거나 전달시키는데 사용할 수 있다.
이 치료제는, 예를 들면, 혈관계 질병, 신생물 폐색증, 염증성 질병 및 전염성 질병을 포함하는 광범위한 범위의 질병을 치료 또는 예방하기 위해 이용될 수있다. 치료될 수 있는 대표적인 신체 통로는, 예를 들면, 동맥, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장, 담도, 수뇨관, 방광, 요도, 전립선, 누관, 기관, 기관지, 세기관지, 코의 기도, 유스타키오관, 외귀의 도관, 자궁 및 나팔관을 포함한다.
본 발명의 하나의 특히 바람직한 양태에서, 치료제는 동맥의 외벽을 통해 외피로 직접 주입함으로써 동맥에 전달된다.
단지 설명할 목적으로, 본 발명의 특정 양태를 질병이 침범한 신체 통로에 본 명세서에 기재된 바와 같이 '보다 가벼운 d 기' 제제 등의 항미세관제(예: 바나듐산염 또는 바나딜 화합물), 또는 D2O 디스코데몰리드, 에피틸론 또는 파클리탁셀 등의 항미세관제 또는 이들의 동족체나 유도체를 투여함으로써, 혈관계 질병(예: 협착증), 위장관 질병, 비뇨생식기 질병(예: 양성 전립선 비대증 또는 전립선 암), 및 폐질환(상기 질병들 각각의 특정 예들은 아래 보다 상세히 논의함)의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 목적 및 다른 목적들은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함에 따라 명백해질 것이다. 또한, 특정 절차, 장치 또는 조성물을 보다 상세히 기재한 여러 가지 참고 문헌을 아래 기재하며, 따라서 전문이 참조로 인용된다.
발명을 설명하기 전에, 이후에 사용될 특정 용어의 정의를 기재하는 것이 이해하는 데 도움이 될 것이다.
본 명세서에 사용된 "신체 통로"는 내부 내강을 갖는 특정수의 통로, 튜브, 파이프, 로(tract), 관(canal), 부비동(sinuse) 또는 통롱(conduit)를 의미하고, 신체내로 물질들의 유동을 허용한다. 신체 통로의 대표적인 예로는 동맥 및 정맥,누관, 기관, 기관지, 세기관지, 비도(부비동 포함) 및 기타 기도, 유스타키오관, 외귀 도관, 구강, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장, 담도, 수뇨관, 방광, 요도, 나팔관, 자궁, 질 및 여성 생식기의 기타 통로, 정관 및 남성 생식기의 기타 통로, 및 뇌 및 척수의 실 시스템(뇌척수액)을 들 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료제"는 소정의 질병 또는 상태를 진정, 치료, 치유 또는 예방할 수 있는 제제들을 의미한다. 치료제의 대표적인 예로는 이후에 보다 상세하게 논의하게 되고, 예를 들면 혈관 형성 방지제, 증식억제제, 소염제 및 항생제를 들 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 치료제를 포함하는 조성물, 바람직한 양태에서는 치료제 및 중합성 담체를 포함하는 조성물을 신체 통로의 외부(즉, 내강 이외의 표면)에 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 간단히 말해, 치료제를 신체 통로의 외부에 (예: 4분원으로 또는 원주로) 전달함으로써 내피 조작을 포함하는 전통적인 접근법의 많은 단점을 피하게 된다. 또한, 상기한 바와 같은 치료제를 전달함으로써 전달될 용적에 대한 제약이 적은 치료제의 보다 많은 양을 투여할 수 있다.
아래 보다 상세히 논의하는 바와 같이, 광범위한 치료제들이 신체 통로와 연관된 질병을 치료 또는 예방하기 위해, 담체(예: 중합성)의 존재 또는 부재하에, 신체 통로의 외부에 전달될 수 있다. 이들 양태 각각을 하기에서 더욱 상세히 기술한다.
치료제
상기한 바와 같이, 본 발명은 광범위한 치료제를 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 한 국면에서, 치료제는 혈관 형성 억제 인자이다. 간단하게 말해, 본 발명에서, 혈관 형성 억제 인자들은 임의의 단백질, 펩티드, 화학 물질 또는 혈관 성장을 억제하는 작용을 하는 기타 분자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 병아리의 융모 요막(chorioallantoic) 멤브레인("CAM") 분석을 포함하는 소정의 인자의 혈관 형성 방지 활성을 측정하기 위해 각종 방법이 용이하게 이용될 수 있다. 간단히 말해, 신선하게 멸균된 계란으로부터 껍질의 일부가 제거되고, 시험될 혈관 형성 억제 인자의 시료를 함유하는 메틸 셀룰로오스 디스크를 멤브레인 상에 놓았다. 여러 날 후(예: 48시간), 시험될 시료에 의한 혈관 성장의 억제율은 메틸 셀룰로오스 디스크 주변 영역의 병아리 융모 요막 멤브레인의 구상화에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 혈관 성장 억제율은 정량적으로, 예를 들면 대조용 메틸 셀룰로오스 디스크와 비교한 바, 메틸 셀룰로오스 디스크 둘레의 혈관의 수 및 크기를 측정함으로써 이루어질 수도 있다. 상기한 바의 혈관 형성 억제 인자들은 대조용에 비해 단지 통계학적으로 유효한 방식으로 행하는 경우 새로운 혈관의 형성을 억제하는 것으로 고려되고, 바람직한 면에서, 이러한 혈관 형성 억제 인자들은 새로운 혈관의 형성을 완전히 억제할 뿐만 아니라, 이미 존재하는 혈관의 크기 및 수를 줄인다.
상기 CAM 분석 외에, 각종 다른 분석법 역시 예를 들면 이러한 목적으로 개발된 쥐 모델을 포함하여, 혈관 형성 억제 인자들의 생체내 효능을 측정하기 위해이용될 수 있다(참조: Roberston et al., Cancer Res. 51:1339-1344, 1991).
광범위한 범위의 혈관 형성 억제 인자들은 본 발명의 문맥상 용이하게 이용될 수 있다. 대표적인 예로는 침입 방지 인자, 레틴산 및 그의 유도체, 수라민, 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제, 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제제, 플라스미노겐 활성제 억제제-1, 플라스미노겐 활성제 억제제-2, 미소관 기능을 방해하는 화합물 및 보다 가벼운 "d 기" 전이 금속의 여러 가지 형태를 들 수 있다. 이들 및 기타 혈관 형성 억제 인자들은 아래 보다 상세히 논의할 것이다.
간단히 말해, 연골 조직의 추출물로부터 제조한 침입 방지 인자 또는 "AIF"는 새로운 혈관의 성장을 억제하는 책임이 있는 성분들을 함유한다. 이들 성분은 7개의 저분자량 단백질 족(<50,000 달톤)을 포함하고(참조: Kuettner 및 Pauli, "Inhibition of neovascularization by a cartilage factor" inDevelopment of the Vascular System, Pitman Books(CIBA Foundation Symposium 100), 163-173페이지, 1983년), 각종 프로테아제에 반하는 억제 효과를 갖는 여러 가지 단백질을 포함한다(참조: Eisentein et al.,Am. J. Pathol. 81:337-346, 1975; Langer et al.,Sceince 193: 70-72, 1976; 및 Horton et al.,Science 199: 1342-1345, 1978). 본 발명에 사용하기 적절한 AIF는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다(참조: Eisentein et al.,supra; Kuettner 및 Pauli,supra; Langer et al.,supra). 연골 조직 유도 억제제("CDI") et al.의 AIF의 정제된 성분들(참조: Moses et al., Science 248:1408-1410, 1990)은 용이하게 제조될 수 있고, 본 발명에 이용될 수 있다.
레틴산은 세포외 매트릭스 성분들의 대사를 변경시켜, 혈관 형성을 억제시킨다. 프롤린 동족체, 안지오스태틱 스테로이드 또는 헤파린의 첨가는 트랜스레틴산의 혈관 형성 방지 효과를 상승적으로 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 이용될 수도 있는 레틴산 뿐만 아니라 그의 유도체들은, 예를 들면 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)사(#R2625)를 포함하는 상업적 거래처로부터 용이하게 입수할 수 있다.
수라민은 전형적으로 트리파노소마 박멸제로서 사용되는 폴리설폰화 나프틸우레아 화합물이다. 간단히 말해, 수라민은 혈소판 유도된 성장 인자("PDGF"), 상피 성장 인자("EGF"), 변형 성장 인자("TGF-β"), 인슐린형 성장 인자("IGF-1"), 및 섬유아세포 성장 인자("βFGF") 등의 여러 가지 성장 인자들의 특정 세포 표면 결합을 봉쇄한다. 수라민은 공지된 기술에 따라 제조될 수 있고, 예를 들면 뉴욕 소재 모베이 케미칼 캄파니(Mobay Chemical Co.)사를 포함하는 여러 상업적 거래처로부터 용이하게 입수할 수 있다(참조: Gagliardi et al.,Cancer Res. 52: 5073-5075, 1992; 및 Coffey, Jr., et al.,J. of Cell Phys. 132: 143-148, 1987).
메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제("TIMP")는 MMP아제를 역시 분비하는 내피 세포에 의해 분비된다. TIMP는 글리코실화되고, 28.5kDa의 분자량을 갖는다. TIMP-1은 활성화된 메탈로프로테이나제에 결합시킴으로써 혈관 형성 작용을 조절하고, 이로 인해 세포외 매트릭스로의 혈관의 침입을 억제한다. 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제제("TIMP-2") 역시 혈관 형성 작용을 억제하기 위해 이용될 수 있다. 간단히 말해, TIMP-2는 활성형 및 잠복형 프로엔자임 형태의 메탈로프로테이나제에 결합된 21kDa의 비글리코실화된 단백질이다. TIMP-1 및 TIMP-2 모두는 콜로라도주 볼더 소재의 시너젠(Synergen) 등의 상업적 거래처로부터 입수할 수 있다.
플라스미노겐 활성제 억제제-1(PA)는 혈액 혈소판 중에 존재하는 50kDa 당단백질이고, 내피 세포 및 근육 세포들에 의해서 합성될 수도 있다. PAI-1은 내피의 염기측 부위에서 t-PA 및 유로키나제 플라스미노겐 활성제를 억제하고, 추가로 섬유소 용해 반응을 조절한다. 플라스미노겐 활성제 억제제-2(PAI-2)는 일반적으로 임신중 및 종양의 존재하에서와 같은 특정 상황하에 혈액에서 유일하게 발견된다. 간단히 말하자면, PAI-2는 단핵세포 및 대식세포에 의해 분비된 56kDa 단백질이다. 이는 섬유소 용해 활성을 조절하고, 특히 유로키나제 플라스미노겐 활성제 및 조직 플라스미노겐 활성제를 억제함으로써 섬유소 용해를 예방하는 것으로 믿어진다.
본 발명의 치료제는 미소관 기능을 방해하는 화합물들을 포함하기도 한다. 이러한 화합물들의 대표적인 예로는 에스트라무스틴[시그마(Sigma)사로부터 입수할 수 있음: Wang 및 StearnsCancer Res. 48: 6262-6271, 1988], 에포틸론, 쿠라신-A, 콜치신, 메토트렉세이트 및 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, D2O 및 4-3급 부틸-[3-(2-클로로에틸) 우레이도] 벤젠("tBCEU")을 들 수 있다. 간단히 말하자면, 이러한 화합물들은 여러 가지 다른 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 콜치신 및 빈블라스틴과 같은 화합물은 미소관을 분해시킴으로써 작용한다.
본 발명의 바람직한 양태내에서, 치료제는 튜불린에 결합하여 미소관의 형성을 파괴하여 비정상적인 유사분열 방추를 형성시키는 화합물인 파클리탁셀이다.요약하자면, 파클리탁셀은 텍서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)(Pacific Yew) 및 Pacific Yew의 탁소마이세스 앤드라나엔(Taxomyces Anderanaen) 및 엔도피틱 군구스(Endophytic Gungus)(참조: Stierle et al.,Science 60: 214-216, 1993)의 수확 및 건조된 껍질로부터 입수한 고도로 유도된 디터페노이드이다(Wani et al.,J. Am Chem. Soc 93: 2325, 1971). "파클리탁셀"(프로드럭, 동족체 및 유도체, 예를 들면 탁솔(TAXOLR), 탁소테르(TAXOTERER), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 동족체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시 카보닐 동족체를 포함하는 것으로 이해할 수 있음)은 당업계의 숙련자들에게 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있거나(참조: 국제 공개공보 제WO94/07882호, 제WO94/07881호, 제WO94/07880호, 제WO94/07876호, 제WO93/23555호, 제WO93/10076호, 제WO94/00156호, 제WO93/24476호, EP 제590267호, 국제 공개공보 제WO94/20089호; 미합중국 특허 제5,294,637호, 제5,283,253호, 제5,279,949호, 제5,274,137호, 제5,202,448호, 제5,200,534호, 제5,229,529호, 제5,254,580호, 제5,412,092호, 제5,395,850호, 제5,380,751호, 제5,350,866호, 제4,857,653호, 제5,272,171호, 제5,411,984호, 제5,248,796호, 제5,248,796호, 제5,422,364호, 제5,300,638호, 제5,294,637호, 제5,362,831호, 제5,440,056호, 제4,814,470호, 제5,278,324호, 제5,352,805호, 제5,411,984호, 제5,059,699호, 제4,942,184호;Tetrahedron Letters 35(52): 9709-9712, 1994;J. Med. Chem. 35:4230-4237, 1992;J. Med. Chem. 34:992-998, 1991;J. Natural Prod. 57(10): 1404-1410, 1994;J. Natural Prod. 57(11): 1580-1583, 1994;J. Am. Chem. Soc. 110:6558-6560, 1988), 또는 미조리주 세인트 루이스 소재 시그마케미칼 캄파니사를 포함하는 여러 상업적 거래처로부터 입수한다.
이러한 파클리탁셀 유도체 또는 동족체의 대표적인 예로는 7-데옥시-도세탁솔, 7,8-사이클로프로파탁산, N-치환된 2-아제티돈, 6,7-에폭시 파클리탁셀, 6,7-개질된 파클리탁셀, 10-데스아세톡시탁솔, 10-데아세틸탁솔(10-데아세틸박카틴 III으로부터), 탁솔의 포스포노옥시 및 탄산염 유도체, 탁솔 2',7-디(나트륨 1,2-벤젠디카복실레이트, 10-데스아세톡시-11,12-디하이드로탁솔-10,12(18)-디엔 유도체, 10-데스아세톡시탁솔, 프로탁솔(2'- 및/또는 7-O-에스테르 유도체), (2'- 및/또는 7-O-탄산염 유도체), 탁솔 측쇄의 비대칭 합성, 플루오로 탁솔, 9-데옥소탁산, (13-아세틸-9-데옥소박카틴 III), 9-데옥소탁솔, 7-데옥시-9-데옥소탁솔, 10-데스아세톡시-7-데옥시-9-데옥소탁솔, 수소 또는 아세틸기 및 하이드록시 및 3급 부톡시카보닐아미노를 함유하는 유도체, 설폰화된 2'-아크릴옥시탁솔 및 설폰화된 2'-O-아실산 탁솔 유도체, 석시닐탁솔 2'-γ-아미노부티릴탁솔 포르메이트, 2'-아세틸 탁솔, 7-아세틸 탁솔, 7-글리신 카바메이트 탁솔, 2'-OH-7-PEG(5000) 카바메이트 탁솔, 2'-벤조일 및 2',7-디벤조일 탁솔 유도체, 기타 프로드럭(2'-아세틸탁솔; 2',7-디아세틸탁솔; 2'-석시닐탁솔; 2'-(β-알라닐)-탁솔); 2'-γ-아미노부티릴탁솔 포르메이트; 2'-석시닐탁솔의 에틸렌 글리콜 유도체; 2'-글루타릴탁솔; 2'-(N,N-디메틸글리실)탁솔; 2'-[2-(N,N-디메틸아미노)프로피오닐]탁솔; 2-오르토카복시벤조일 탁솔; 탁솔의 2'-지방족 카복실산 유도체, 프로드럭2'-(N,N-디에틸아미노프로피오닐)탁솔, 2'-(N,N-디메틸글리실)탁솔, 7-(N,N-디메틸글리실)탁솔, 2',7-디-(N,N-디메틸글리실)탁솔, 7-(N,N-디에틸아미노프로피오닐)탁솔, 2',7-디-(N,N-디에틸아미노프로피오닐)탁솔, 2'-(L-글리실)탁솔, 7-(L-글리실)탁솔, 2',7-디-(L-글리실)탁솔, 2'-(L-알라닐)탁솔, 7-(L-알라닐)탁솔, 2',7-디-(L-알라닐)탁솔, 2'-(L-류실)탁솔, 7-(L-류실)탁솔, 2',7-디-(L-류실)탁솔, 2'-(L-이소류실)탁솔, 7-(L-이소류실)탁솔, 2',7-디-(L-이소류실)탁솔, 2'-(L-발릴)탁솔, 7-(L-발릴)탁솔, 2',7-디-(L-발릴)탁솔, 2'-(L-페닐알라닐)탁솔, 7-(L-페닐알라닐)탁솔, 2',7-디-(L-페닐알라닐)탁솔, 2'-(L-프로필)탁솔, 7-(L-프로필)탁솔, 2',7-디-(L-프로필)탁솔, 2'-(L-리실)탁솔, 7-(L-리실)탁솔, 2',7-디-(L-리실)탁솔, 2'-(L-글루타밀)탁솔, 7-(L-글루타밀)탁솔, 2',7-디-(L-글루타밀)탁솔, 2'-(L-아르기닐)탁솔, 7-(L-아르기닐)탁솔, 2',7-디-(L-아르기닐)탁솔, 개질된 페닐이소세린 측쇄를 갖는 탁솔 동족체, 탁소테르, (N-데벤조일-N-3급 (부톡시카보닐)-10-데아세틸탁솔 및 탁산(예: 바카틴 III, 세팔로만닌, 10-데아세틸바카틴 III, 브레비폴리올, 유난탁서신 및 탁서신)을 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 기타 치료제는 보다 가벼운 "d 기" 전이 금속, 예를 들면, 바나듐, 몰리브덴, 텅스텐, 티탄, 니오븀 및 탄탈 종을 포함한다. 이러한 전이 금속 종은 전이 금속 착물을 형성할 수 있다. 상기 전이 금속 종의 적절한 착물은 옥소 전이 금속 착물을 포함한다.
바나듐 착물의 대표적인 예로는 바나듐산염 및 바나딜 착물 등의 바나듐 착물을 들 수 있다. 적절한 바나듐산염 착물로는 메타바나듐산염(즉, VO3-) 착물 및 오르토바나듐산염(즉, VO43-) 착물, 예를 들면, 메타바나듐산암모늄(즉, NH4VO3), 메타바나듐산나트륨(즉, NaVO3), 및 오르토바나듐산나트륨(즉, Na3VO4)을 들 수 있다. 적절한 바나딜(즉, VO2+) 착물로는, 예를 들면, 바나딜 아세틸아세토네이트 및 바나딜 설페이트 일- 및 삼수화물 등의 바나딜 설페이트 수화물을 포함하는 바나딜 설페이트, 비스[말토레이토(옥소바나듐)](IV)("BMOV"), 비스[(에틸말토레이토)옥소바나듐] (IV)("BEOV"), 및 비스(시스테인, 아미드 N-옥틸)옥소바나듐(IV)("나글리반")을 들 수 있다.
텅스텐 및 몰리브덴 착물의 대표적인 예로는 또한 옥소 착물을 포함한다. 적절한 옥소 텅스텐 착물로는 텅스텐산염 및 텅스텐 산화물 착물을 들 수 있다. 적절한 텅스텐산염(즉, WO42-) 착물로는 텅스텐산암모늄(즉, (NH4)2WO4), 텅스텐산칼슘(즉, CaWO4), 텅스텐산나트륨 이수화물(즉, Na2WO4·2H20), 및 텅스텐산(즉, H2WO4)을 들 수 있다. 적절한 텅스텐 산화물로는 텅스텐(IV) 산화물(즉, WO2) 및 텅스텐(VI) 산화물(즉, WO3)을 들 수 있다. 적절한 옥소 몰리브덴 착물로는 몰리브덴산염, 몰리브덴 산화물 및 몰리브데닐 착물을 들 수 있다. 적절한 몰리브데산염(즉, MoO42-) 착물로는 몰리브덴산암모늄(즉, (NH4)2MoO4) 및 이의 수화물, 몰리브덴산나트륨(즉, Na2MoO4) 및 이의 수화물, 및 몰리브덴산칼륨(즉, K2MoO4) 및 이의 수화물을 들 수 있다. 적절한 몰리브덴 산화물로는 몰리브덴(VI) 산화물(즉, MoO2), 몰리브덴(VI) 산화물(즉, MoO3) 및 몰리브덴산을 들 수 있다. 적절한 몰리브데닐(즉, MoO22+) 착물로는, 예를 들면, 몰리브데닐 아세틸아세토네이트를 들 수 있다. 다른 적절한 텅스텐 및 몰리브덴 착물로는, 예를 들면, 글리세롤, 타르타르산 및 당으로부터 유도된 하이드록소 유도체를 들 수 있다.
광범위한 범위의 다른 혈관 형성 억제 인자들이 역시 본 발명에 이용될 수있다. 대표적인 예로는 혈소판 인자 4(시그마 케미칼 캄파니사, #F1385); 프로타민 설페이트(클루페인)(시그마 케미칼 캄파니사, #P4505); 황산화된 키틴 유도체(갑각류 껍질로부터 제조함)(시그마 케미칼 캄파니사, #C3641; Murata et al.,Cancer Res. 51:22-26, 1991); 황산화된 폴리사카라이드 펩티도글리칸 착물(SP-PG)(이러한 화합물의 기능은 에스트로겐 등의 스테로이드 및 타목시펜 시트르산염의 존재에 의해 증진될 수 있음); 스타우로스포린(시그마 케미칼 캄파니사, #S4400); 프롤린 동족체, [(L-아제티딘-2-카복실산(LACA)(시그마 케미칼 캄파니사, #A0760)), 시스하이드록시프롤린, d,L-3,4-데하이드로프롤린(시그마 케미칼 캄파니사, #D0265), 티아프롤린(시그마 케미칼 캄파니사, #T0631)], α,α-디피리딜(시그마 케미칼 캄파니사, #D7505), β-아미노프로피오니트릴 푸마레이트(시그마 케미칼 캄파니사, #A3134)를 포함하는 매트릭스 대사의 조절자; MDL 27032(4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸론(제조원: 메리온 메렐 다우 리서치 인스티튜트(Merion Merrel Dow Research Institute)); 메토트렉세이트(시그마 케미칼 컴퍼티사, #A6770; Hirata et al.,Arthritis and Rheumatism 32: 1065-1073, 1989); 미토크산트론(Polverini and Novak,Biochem. Biophys. Res. Comm. 140: 901-907); 헤파린(Folkman,Bio. Phar. 34: 905-909, 1985; 시그마 케미칼 캄파니사, #P8754); 인터페론(예: 시그마 케미칼 캄파니사, #13265); 2 마크로글로불린-혈청(시그마 케미칼 캄파니사, #M7151); ChIMP-3(Pavloff et al.,J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); 키모스타틴(시그마 케미칼 캄파니사, #C7268; Tomkinson et al.,Biochem J. 286:475-480, 1992); β-사이클로덱스트린 테트라데카설페이트(시그마 케미칼캄파니사, #C4767); 에폰마이신; 캠프토테신; 푸마길린 및 유도체(시그마 케미칼 캄파니사, #F6771; 캐나다 특허 제2,024,306호; Ingber et al.,Nature 348:555-557, 1990); 금 나트륨 티오말산염("GST"; 시그마, G4022; Matsubara 및 Ziff,J. Clin. Invest, 79: 1440-1446, 1987); (D-페니실아민("CCPT"; (시그마 케미칼 캄파니사, #P4875 또는 P5000(HCl)); β-1-안티콜라게나제-혈청; α2-안티플라스민(시그마 케미칼 캄파니사, A0914; Holmes et al.,J. Biol. Chem. 262(4):1659-1664, 1987); 비스안트렌(내셔널 캔서 인스티튜트(National Cancer Institute)); 로벤자리트 이나트륨(N-(2)-카복시페닐-4-클로로안트로닐산 이나트륨 또는 "CCA"; Takeuchi et al.,Agents Actions 36: 312-316, 1992); 탈리도미드; 안고스태틱 스테로이드; AGM-1470; 카복신아미놀이미다졸; 및 메탈로프로테이나제 억제제, 예를 들면 BB94, 에스트로겐 및 에스트로겐 동족체, 안티에스트로겐, 산화방지제, 바이오플라보노이드(Pycnogenol), 에테르 지질(s-포스포네이트, ET-18-OCH3), 티로신 키나제 억제제(게니스테인, 에르브스타틴, 헤르바마이신 A, 라벤더스틴-c, 하이드록시신나메이트), α케모킨[사람 인터페론-유도성 단백질 10(IP-10)], -C-X-C-케모킨(Gro-베타), 질산 산화물, 항진균제(라디시콜), 15-데옥시스퍼구알린, 금속 착물(티타노센 디클로라이드 - 사이클로펜타디에닐 티탄 디클로라이드), 트리페닐메탄 유도체(아우린트리카복실산), 리노마이드, 탈리도마이드, IL-12, 헤파리나제, 안지오스타틴, 항균제(미노사이클린), 혈장 단백질(아포지방단백질 E), 안트라사이클린(TAN-1120), 프롤리페린-관련 단백질, FR-111142, 파낙스 인삼의 사포닌(긴세노사이드-Rb2), 펜토산 폴리설페이트를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 광범위한 치료제, 예를 들면 α-아드레날린 봉쇄제, 안지오텐신 II 수용체 길항제 및 히스타민, 세로토닌, 엔도텔린에 대한 수용체 길항제; 나트륨/수소 역이동의 억제제(예: 아밀로라이드 및 이의 유도체); L-타입(예: 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀) 또는 T-타입 Ca2+ 채널 봉쇄제(예: 아밀로라이드), 칼모듈린 길항제(예: H7) 및 나트륨/칼슘 역이동의 억제제(예: 아밀로라이드) 등의 세포내 Ca2+ 수송을 조절하는 제제; ap-1 억제제(티로신 키나제, 단백질 키나제 C, 미오신 경쇄 키나제, Ca22+/칼모듈린 키나제 II, 카제인 키나제 II에 대한 것임); 항우울제(예: 아미트립틸린, 플루옥세틴, 루복스(LUVOXR) 및 팍실(PAXILR)); 사이토킨 및/또는 성장 인자, 뿐만 아니라 이들 각각의 수용체(예: 인터류킨, α, β 또는 γ-IFN, GM-CSF, G-CSF, 상피 성장 인자, 변환 성장 인자 알파 및 베타, TNF, 및 혈관 외피 성장 인자, 내피 성장 인자, 산성 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자, 및 혈소판 유도된 성장 인자의 길항제); IP3 수용체(예: 헤파린)의 억제제; 프로테아제 및 콜라게나제 억제제(예: TIMP, 위에서 논의됨); 니트로혈관확장제(예: 이소소르비드 디니트레이트); 항분열제(예: 콜치신, 안트라사이클린 및 기타 항생제, 엽산염 길항제 및 기타 대사방지제, 빈카 알칼로이드, 니트로소우레아, DNA 알킬화제, 토포아이소머라제 억제제, 푸린 길항제 및 동족체, 피리미딘 길항제 및 동족체, 알킬 설포네이트); 면역억제제(예: 아드레노코르티코스테로이드, 사이클로스포린); 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예: DNA, RNA, 핵산 유사체(예: 펩티드 핵산) 또는 이들의 임의의 조합물); 및 전사 인자 활성 억제제(예: 보다 가벼운 d 기 전이 금속)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 기타 치료제로는 항균제, 항미생물제, 항비루스제, 항원충제 및 항진균제를 포함하는 각종 항생제를 들 수 있다. 이러한 제제의 대표적인 예로는 아미노글리코시드(예: 스트렙토마이신, 아미카신, 젠타마이신, 네틸마이신, 토브라마이신); 제1, 제2 및 제3 세대 세팔로스포린(예: 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파클로르, 세파만돌, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 세포니시드, 세포라니드, 세폭시틴, 세포탁심, 세포테탄, 세프티족심, 세포페라존, 세프타지딤, 세프트라악손, 목살락탐, 기타 반합성 세팔로스포린, 예를 들면 세픽심 및 세프포독심 프록세틸); 페니실린(예: 페니실린 G(벤자틴 및 프로카인 염), 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 V, 암피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 사이클라실린, 카베니실린, 티카르실린, 메즈로실린, 피페라실린, 아즐로실린, 암디노실린, 및 클라불란산과 조합된 페니실린); 퀴놀론(예: 시녹사신, 시프로플록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 피페미드산, 퍼록사신, 플레록사신, 에녹사신, 오플록사신, 토서플록사신, 로메플록사신, 퀴놀론의 입체이성체); 설폰아미드(예: 설파사이틴, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 설피속사졸, 설파살라진 및 트리메토프림과 설파메톡사졸 조합물); 테트라사이클린(예: 독시사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린); 마크롤리드(예: 에리트로마이신, 기타 반합성 마크롤리드, 예를 들면 아지트로마이신 및 클라리트로마이신); 모노박탐(새로운 합성 부류)(예: 아즈트레오남, 로라카베프); 및 각종 제제, 예를 들면 액티노마이신 D, 독소루비신, 미토마이신 C, 노보비오신, 플리카마이신, 리팜핀, 블레오마이신, 클로람페니콜, 클린다마이신, 올레안도마이신, 카나마이신, 린코마이신, 네오마이신, 파로모마이신, 스펙티노마이신, 트롤레안도마이신, 암포테리신 B, 콜리스틴, 니스타틴, 폴리믹신 B, 그리세오풀빈, 아즈트레오남, 사이클로세린, 클린다마이신, 콜리스티메테이트, 이미페넴-실라스타틴, 메텐아민, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 리파부탄, 스펙티노마이신, 트리메토프림, 바시트라신, 반코마이신, 기타 β-락탐 항생제를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 바시트라신, 아연, 네오마이신, 무피로신, 클린담신 등의 국소 항생제; 세크로피오닌, 만가이닌 등의 항병원체성 폴리펩타이드; 및 설파디메톡신, 설피족사졸, 설피조미딘, 에탐부토르 하이드로클로라이드, 이소니아지드, 파라아미노살리실산 칼슘 등의 항결핵제를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 치료제로는 요오드, 포비돈 요오드, 붕산, 붕산나트륨, 옥시달, 과망간산 칼륨, 에탄올, 이소프로판올, 포르말린, 크레졸, 디마졸, 시카닌, 페닐요오도운데시노산염, 헥사클로로펜, 레조르신, 벤즈에토닌 염화물; 라우릴 황산나트륨, 염화수은, 머큐로크롬, 설파디아진 은 및 기타 무기 및 유기 은 및 아연 염, 일가 및 이가 양이온의 염, 클로르헥시딘 글루코네이트, 알킬폴리아미노에틸글리신 하이드로클로라이드, 벤즈알코늄 염화물, 니트로푸라존, 니스타틴, 아세설파민, 클로트리마졸, 설파메티졸, 설프아세트아미드, 디올아민, 톨나프테이트, 피롤니트린, 운데실렌산, 마이크로아졸, 바리오틴, 할로프로긴, 및 디마졸(메클로사이클린, 트리코마이신 및 펜타마이신), 페니실린 등의 항생제를 들 수 있다. 항진균제로는 플루사이토신, 플루코나졸, 그리세오플루빈, 케토코나졸 및미코나졸을 들 수 있다. 항비루스제 및 항AIDS제로는 어사이클로비르, 아만타딘, 디다노신(이전에는, ddI), 그리세오풀빈, 플루사이토신, 포스카넷, 간사이클로비르, 이독수리딘, 미코나졸, 클로트리마졸, 피리메타민, 리바비린, 리만타딘, 스타부딘(이전에는 d4T), 트리플루리딘, 트리설파피리미딘, 발라사이클로비르, 비다라빈, 잘시타빈(이전에는 ddC) 및 지도부딘(이전에는 AZT)을 들 수 있다. AIDS에 대한 보조 치료제(예: 에리트로포이에틴: 플루코나졸(항진균제); 인터페론 α-2a 및 -2b (카포시 육종); 아토바쿠온, 펜타미딘 및 트리메트렉세이트(안티프로토조알); 메게스트라올 아세테이트(식욕 증진제); 리파부틴(항결핵제)을 들 수 있다. 항원충제의 대표적인 예로는 펜타미딘 이세티오네이트, 퀴닌, 클로로퀸 및 메플로퀸을 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 기타 치료제로는 증식억제제, 신생물 형성 방지제 또는 화학적 치료제를 들 수 있다. 이러한 제제의 대표적인 예로는 안드로겐 억제제, 안티에스트로겐 및 호르몬, 예를 들면 플루타미드, 류프롤리드, 타목시펜, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 메게스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 테스토락톤, 고세렐린, 메드록시프로게스테론; 세포 독성제, 예를 들면 알트레타민, 블레오마이신, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴(BiCNU), 시스플란틴, 클라드리빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에스트라무스틴, 에토폽시드, 로무스틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 인터페론 α-2a 및 -2b, 이포스파미드, 미토크산트론, 미토마이신, 파클리탁셀, 스트렙토족신, 테니포시드, 티오테파, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈; 대사 방지제 및 항분열제, 예를 들면 플록수리딘, 5-플루오로우라실, 플루아라빈, 인터페론 α-2a 및 -2b, 류코보린, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 미토탄, 플리카마이신, 티오구아닌, 콜치신, 안트라사이클린 및 기타 항생제, 엽산염 길항제 및 기타 대사방지제, 빈카 알칼로이드, 니트로소우레아, DNA 알킬화제, 푸린 길항제 및 동족체, 피리미딘 길항제 및 동족체, 알킬 설폰산염; 효소, 예를 들면 아스파라기나제, 페가스파르가제; 방사선활성제(예: Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 및 Bi-212), 독소(예: 라이신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 미국자리공 항비루스 단백질, 트리틴, 쉬겔라 독소 및 슈도모나스 엑소톡신 A), 보조 치료제, 예를 들면 그라니세트론 및 온단세트론(오심방지제, 구토방지제), 덱스라족산(심근증), 질산갈륨(과칼슘혈증), GCSF 및 GMSCF(화학요법 및 BMT), IL-1 α, IL-2, IL-3, IL-4, 레바미졸, 필로카르핀(방사선 치료 고정시에 타액 생성), 스트론튬 89(골육종)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 심장혈관제; 항고혈압제; 아드레날린 봉쇄제 및 자극제(예: 독사조신, 구아나드렐, 구안에티딘, 퍼옥시벤즈아민, 프라조신+폴리티아지드, 테라조신, 메틸돕파, 클로니딘, 구아나벤즈, 구안파신); α-/β-아드레날린 봉쇄제(예: 라베탈롤); 안지오텐신 변환 효소(ACE) 억제제(예: 베나제프릴, 카토프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 및 칼슘 채널 봉쇄제와 이뇨제의 조합물; ACE-수용체 길항제(예: 로사르탄); β-봉쇄제(예: 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카르테올롤, 에스몰롤, 피몰롤, 핀돌롤, 프로파놀롤, 펜바톨롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 소탈롤); 칼슘 채널 봉쇄제(예: 아밀로리드, 암로디핀, 베프리딜, 딜티아젬, 이스라디핀, 니페디핀, 베라파밀, 펠로디핀, 니카르디핀, 니모디핀); 항부정맥제, 그룹 I 내지 IV(예: 브레틸륨, 디소피라미드, 엔카이니드, 플레카이니드, 리도카인, 멕실레틴, 모리시진, 프로파페논, 프로카인아미드, 퀴니딘, 토카이니드, 에스몰롤, 프로프라놀롤, 아세부톨롤, 아미오다론, 소탈롤, 베라파밀, 딜티아젬, 핀돌롤, 부프라놀롤 하이드로클로라이드, 트리클로르메티아지드, 푸로세미드, 프라조신 하이드로클로라이드, 메토프롤롤 타르트레이트, 카르테올롤 하이드로클로라이드, 옥스프레놀롤 하이드로클로라이드 및 프로프라놀롤 하이드로클로라이드); 및 잡다한 항부정맥제 및 강심제(예: 아데노신, 디곡신; 메틸디곡신, 카페인, 도파민 하이드로클로라이드, 도부타민 하이드로클로라이드, 옥도파민 하이드로클로라이드, 디프로필린, 유비데카레논, 디기탈리스)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 기타 치료제로는 이뇨제(예: 아세트아졸아미드, 아밀로라이드, 트리암테렌+하이드로클로로티아지드 조합물, 스피로놀락톤+하이드로클로로티아지드 조합물, 토르세미드, 푸로세미드, 에타크리네이트, 부메타니드, 트리암테렌, 메틸클로로티아지드, 하이드로클로로티아지드, 메트다존, 클로르탈리돈, 하이드로플루메티아지드, 메톨라존, 메틸클로티아지드, 폴리티아지드, 퀴니타존, 트리클로르메티아지드, 벤조플루에티아지드, 벤즈티아지드); 저혈압성 이뇨제(예: 메프루시드, 펜플루티지드, 부메타미드, 하이드로티아지드, 벤트로플루메티아지드, 레세르핀); 심근수축제(예: 디곡신, 디지톡신, 도부타민, 암리논, 밀리논); 혈관확장제(예: 파파베린, 이소소르비드 일- 및 이질산염, 니트로글리세린, 디족시드, 하이드랄라진, 미녹시딜, 니트로프루시드, 프라조신, 테트라조신, 1,2,3-프로판트리올모노니트레이트, 1,2,3-프로판트리올니트레이트 및 이들의 에스테르 유도체, 펜타에리트리톨 테트라니트레이트, 헤프로니케이트, 몰시도민, 니코몰, 심피브레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 신나리진, 디피리다몰, 트라피딜, 트리메타지딘 하이드로클로라이드, 카보크로멘, 프레닐아민 락테이트, 딜라제프 디하이드로클로라이드); 혈관수축제(예: 메타라미놀, 이소프로테레놀, 페닐에프린, 메탁사민); 항응고제 및 혈전용해제(예: 조직 플라스미노겐 활성제(TPA), 유로키나제, 스트렙토키나제, 프로-유로키나제, 유로키나제, 헤파린, 워파린); 칼모듈린 길항제(예: H7); 나트륨/칼슘 역이동 억제제(예: 아밀로라이드); 및 리아노딘 수용체의 억제제(예: 리아노딘); IP3 수용체의 억제제(예: 헤파린)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 치료제로는 소염제를 들 수 있다. 이러한 제제의 대표적인 예로는 비스테로이드제("NSAIDS"), 예를 들면 살리실산염(예: 살리실산염, 메살라민, 디플루니살, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트), 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 피록시캄, 페닐부타존, 케토프로펜, S-케토프로펜, 케토롤락, 트로메타민, 술린닥, 톨메틴을 들 수 있다. 기타 소염성 약물로는 스테로이드제, 예를 들면 베클로메타손, 베타메타손, 코르티손, 덱사메타손, 플루오시놀론, 플루니솔리드, 플루티카손 프로프리오네이트, 불소화 코르티코이드, 트리암시놀론-디아세테이트, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 프레드니손을 들 수 있다. 면역억제제(예: 아데노코르티코스테로이드, 사이클로스포린); 및 항히스타민제 및 충혈제거제(예: 아스테미졸(히드타민 HI-수용체 길항제), 아자티딘, 브롬페니라민, 클레마스틴, 클로르페니라민, 크로몰린, 시프로헵타딘, 디페닐이미다졸, 디페닐하이드라민 하이드로클로라이드, 하이드록시진, 글리시레트산, 호모클로로사이클리진 하이드로클로라이드, 케토티펜, 로라타딘, 나파졸린, 페닌다민, 페니라민, 프로메타진, 테르페나딘, 트리메프라진, 트리펠렌아민, 트라닐라스트 및 충혈제거제 페닐프로판올아민 슈도에페드린을 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 중추 신경계 제제를 들 수 있다. 이러한 제제의 대표적인 예로는 항우울제(예: 프로작, 팍실, 루복스, 만네렉스 및 에펙서); CNS 자극제(예: 페몰린, 메탐페타민, 덱스트로암페타민); 최면제(예: 펜토바르비탈, 에스타졸람, 에트클로리놀, 플루라제팜, 프로포폴, 세코바르비탈, 테마제팜, 트리아졸람, 쿠아제팜, 졸피뎀 타르트레이트); 조울방지제(예: 리튬); 진정제 및 진경성 바르비투르산염(예: 펜토바르비톨, 페노바르비탈, 세코바르비탈, 메포바르비탈, 부타바르비탈, 프리미돈, 아모바르비탈); 비바르비투르산염 진정제(예: 디페하이드라민, 독실아민, 미다졸람, 디아제팜, 프로메타진, 로라제팜, 테마제팜); 및 기타 잡다한 최면제 및 진정제(예: 메타쿠알론, 글루테티미드, 플루라제팜, 브로모발레릴우레아, 플루라제팜, 하이드로클로라이드, 할록사졸람, 트리아졸람, 페노바르비탈, 클로랄 수화물, 니메타제팜, 에스타졸람)을 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 알쯔하이머 약, 예를 들면 타크린(가역성 콜린에스테라제 억제제); 파킨슨병 약, 예를 들면 아만타딘, 브로모크립틴 메실레이트, 비페리덴, 벤즈트로핀, 메실레이트, 카비도파-레보도파, 디펜하이드라민, 히오스시아민, 레보도파, 페르골리드 메실레이트, 프로사이클리딘, 셀레길린 HCl, 트리헥시페니딜 HCl; 및 기타 잡다한 CNS 제제, 예를 들면, 플루페나진, 플루타졸람, 페노바르비탈, 메틸페노바르비탈, 티오리다진, 디아제팜, 벤즈브로마론, 클로카프라민 하이드로클로라이드, 클로티아제팜, 클로르프로마진, 할로페리돌, 탄산리튬을 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 항편두통제(예: 에르고타민, 메틸세르기드, 프로프라놀롤, 디하이드로에르고타민, 세르트롤린 및 이미트렉스); 후기-뇌색전증약(예: 니카르디핀 하이드로클로라이드, 시네파지드 말레에이트, 펜톡시필린, 이펜프로딜 타르트레이트); 국소 마취제(예: 리도카인, 벤조카인, 에틸 아미노벤조에이트, 프로카인 하이드로클로라이드, 디부카인, 프로카인; 항궤양/항환류제(예: 로섹(오메프라졸), 아세글루타미드, 알루미늄, 세트락세이트 하이드로클로라이드, 피렌제핀 하이드로클로라이드, 시메티딘, 파모티딘, 메토클로프라미드, 라니티딘, L-글루타민, 게파르네이트, 및 이들 화합물의 임의의 입체이성체, 및 단독으로 또는 적절히 선택된 1개 이상의 화합물과 조합된 이들 화합물의 약제학적으로 허용되는 염); 프로테아제 억제제(예: 세린 프로테아제, 메탈로엔도프로테아제 및 아스파틸 프로테아제(예를 들면, HIV 프로테아제, 레닌 및 카텝신) 및 티올 프로테아제 억제제(예: 벤질옥시카보닐-류(leu)-노르류시날(칼펩틴) 및 아세틸-류-류-노르류시날); 포스포디에스테라제 억제제(예: 이소부틸 메틸크산틴); 페노티아진; 성장 인자 수용체 길항제(예: 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 상피 성장 인자, 인터류킨, 변환 성장 인자 α 및 β, 및 산성 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자); 안티센스 올리고뉴클레오티드(예: DPGF 또는 다른 성장 인자를 암호화하는 mRNA 부분에 상보적인 서열); 및 단백질 키나제 억제제(예: 티로신 키나제, 단백질 키나제 C, 미오신 경쇄 키나제, Ca2+/칼모듈린 키나제 II, 카제인 키나제 II에 대해)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 조직 손상 방지제를 들 수 있다. 이러한 제제의 대표적인 예로는 슈퍼옥시드 디스뮤타제; 면역 조절제(예: 림포카인, 모노카인, 인터페론 α, β, τ-1b, α-n3, α-2b, α-2b; 성장조절제(예: IL-2, 종양 괴사 인자, 외피 성장 인자, 소마트렘, 피브로넥틴, GM-CSF, CSF, 혈소판-유도된 성장 인자, 소마토트로핀, rG-CSF, 상피 성장 인자, IGF-1)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 모노클로날 및 폴리클로날 항체(예: 베놈, 독소, 종양 괴사 인자, 박테리아에 활성인 것들); 호르몬(예: 에스트로겐, 프로게스틴, 테스토스테론, 사람 성장 호르몬, 에피네프린, 레바르테레놀, 티록신, 티로글로불린, 옥시토신, 바소프레신, ACTH, 소마트로핀, 티로트로핀, 인슐린, 파라티린, 칼시토닌); 비타민(예: 비타민, A, B 및 이의 서브비타민, C, D, E, F, G, J, K, N, P, PP, T, U 및 이들의 서브종); 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 히스티딘, 프롤린, 라이신, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 트레오닌, 트립토판, 글리신, 이소류신, 류신, 발린; 프로스타글란딘(예: E1, E2, F2α, I2); 효소, 예를 들면, 펩신, 판크레아틴, 레닌, 파파인, 트립신, 판크레리파제, 키모파파인, 브로멜라인, 키모트립신, 스트렙토키나제, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 피브리놀리신, 데스옥시리보뉴클레아제, 수틸라인, 콜라게나제, 아스파라기나제, 헤파리나제; 완충액 및 염(예: NaCl, Na+, K+, Ca2+,Mg++, Zn++, NH4+ 트리에탄올아민 등의 양이온, 포스페이트, 설페이트, 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트 이온 등의 음이온); 보존제(예: 벤즈알코늄 클로라이드, Na 또는 K 중황산염, Na 또는 K 티오황산염, 파라반); 항통풍제(예: 알로푸리놀, 코치신, 프로베니시드, 설핀피라존); 항우울제, 예를 들면 아미트립틸린, 아목사핀, 데시프라민, 독세핀, 이미프라민, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 트리미프라민; 피임약(예: 에티닐 에스트라디올 또는 메스트라놀과의 노르에틴드론 조합물); 및 항오심제/구토 방지제(예: 디멘하이드리네이트, 하이드록시진, 메클리진, 메토클로프라미드, 프로클로페라진, 프로메타진, 스코폴아민, 티에틸페라진, 트리에토벤즈아미드)를 들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 치료제로는 항천식제, 항정신병제, 기관지확장제, 금 화합물, 저혈당제, 저지질제, 마취약, 백신, 골 대사에 영향을 미치는 제제, 항설사제, 수정제, 근육 이완제, 식욕 억제제, 호르몬, 예를 들면, 갑상선 호르몬, 에스트로겐, 프로게스테론, 코르티손 및/또는 성장 호르몬, 기타 생물학적 활성 분자, 예를 들면 인슐린 뿐만 아니라 TH1(예: 인터류킨 -2, -12 및 -15, γ인터페론) 또는 TH2(예: 인터류킨 -4 및 -10) 사이토카인을 들 수 있다.
상기 치료제들은 설명할 목적으로 제공되었지만, 본 발명을 그렇게 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 예를 들면, 이러한 제제들을 상기한 바와 같이 구체적으로 기재하였지만, 본 발명은 이러한 제제의 동족체, 유도체 및 공액체를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 예시한 바와 같이, 파클리탁셀은 파클리탁셀의 통상 화학적으로 이용가능한 형태 뿐만 아니라, 동족체(예: 상기한 바와 같은 탁소테르) 및 파클리탁셀 공액체(예: 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로스)를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 당업계의 숙련자들에게 명백한 바와 같이, 상기 제제들은 1군 내에서 주목될 수 있지만, 열거된 많은 제제들은 사실상 다수의 생물학적 활성을 갖는다. 또한, 1개 이상의 치료제들이 한 번에(즉, 조합물로) 이용될 수 있거나, 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
중합체
상기한 바와 같이, 본 발명의 치료제 조성물은 추가로 중합체를 포함할 수 있다. 광범위한 중합체들은, 예를 들면, 생분해성 조성물 및 비생분해성 조성물 모두를 포함하여, 상기 논의한 1개 이상의 치료제를 함유하고/하거나 전달하기 위해 이용될 수 있다. 생분해성 조성물의 대표적인 예로는 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 전분, 셀룰로스(메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트, 석시네이트, 하이드록시프로필메틸셀루로스 프탈레이트), 카제인, 덱스트란, 다당류, 피브리노겐, 폴리(D,L 락티드), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(글리콜리드), 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(알킬카보네이트) 및 폴리(오르토에스테르), 폴리에스테르, 폴리(하이드록시발레산), 폴리디옥사논, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(말산), 폴리(타르트론산), 폴리언하이드라이드, 폴리포스파젠, 폴리아미노산 및 이들의 공중합체를 들 수 있다(참조: 일반적으로 Illum, L. Davids. S.S(eds.) "Polymers in controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady,J. Controlled Release 17:1-22, 1991, Pitt. Int.J. Phar. 59: 173-196, 1990; Holland et al.,J. Controlled Release 4:155-0180, 1986). 비분해성 중합체의 대표적인 예로는 EVA 공중합체, 실리콘 고무, 아크릴산 중합체(폴리아크릴산, 폴리메틸아크릴산, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드(나일론 6,6), 폴리우레탄, 폴리(에스테르 우레탄), 폴리(에테르 우레탄), 폴리(에스테르-우레아), 폴리에테르(폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 옥사이드), 플루로닉, 폴리(테트라메틸렌 글리콜)), 실리콘 고무 및 비닐 중합체[폴리비닐피롤리돈, 폴리(비닐 알콜, 폴리(비닐 아세테이트 프탈레이트)]를 들 수 있다. 음이온성(예: 알기네이트, 카라기닌, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리(아크릴산), 또는 양이온성(예: 키토산, 폴리-1-라이신, 폴리에틸렌이민 및 폴리(알킬 아민))인 중합체도 역시 개발될 수 있다(참조: Dunn et al.,J. applied Polymer Sci. 50: 353-365, 1993; Cascone et al.,J. Materials Sci.: Materials in Medicine 5:770-774, 1994; Shiraishi et al.,Biol. Pharm. Bull,16(11): 1164-1168, 1993; Thacharodi 및 Rao,Int't J. Pharm 120:115-118, 1995; Miyazaki et al.,Int'l J. Pharm. 118: 257-263, 1995). 특히 바람직한 중합성 담체로는 폴리(에틸렌비닐 아세테이트)(40% 가교됨), 폴리(D,L-락트산) 올리고머 및 중합체, 폴리(l-락트산) 올리고머 및 중합체, 폴리(글리콜산), 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리언하이드라이드, 폴리(카프로락톤) 또는 폴리(락트산)과 폴리에틸렌 글리콜과의 공중합체 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
중합성 담체는 다양한 형태로 형성될 수 있고, 바람직한 방출 특성 및/또는 특이적인 바람직한 특성을 갖는다. 예를 들면, 중합성 담체는 pH 등의 특정 자극 사건에 노출시 치료제를 방출하도록 형성될 수 있다(참조: 예를 들면, Heller et al., :"Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems",Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers, B.V. Amsterdam, 1988, pp 175-188; Kang et al.,J. Applied Polymer Sci. 48:343-354, 1993: Dong et al.,J. Controlled Release 19: 171-178, 1992; Dong 및 Hoffman,J. Controlled Release 15: 141-152, 1991; Kim et al.,J. Controlled Release 28: 143-152, 1994; Cornejo-Bravo et al.,J. Controlled Release 33: 223-229, 1995; Wu 및 Lee,Pharm. Res. 10(10): 1544-1547, 1993; Serres et al..,Pharm. Res. 13(2): 196-201, 1996: Peppas. "Fundamentals of pH- and Temperature-Sensitive Delivery Systems", Gurny et al., (eds.),Pulsatile Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, 41-55; Doelker, "Cellulose Derivatives", 1993, Peppas 및 Langer(eds.),Biopolymers 1, Springer-Verlag, Berlin). pH-감응성 중합체의 대표적인 예로는 폴리(아크릴산) 및 이의 유도체(예를 들면, 폴리(아미노카복실산); 폴리(아크릴산); 폴리(메틸아크릴산) 등의 단독중합체, 이러한 단독중합체들의 공중합체 및 상기한 바와 같은 폴리(아크릴산)과 아크릴단량체의 공중합체를 포함함)를 들 수 있다. 다른 pH 감응성 중합체로는 폴리사카라이드, 예를 들면, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트; 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트; 하이드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트; 셀룰로스 아세테이트 트리멜릴레이트; 및 키토산을 들 수 있다. 또한, 다른 pH 감응성 중합체는 pH 감응성 중합체와 수용성 중합체의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다.
마찬가지로, 온도 감응성인 중합성 담체가 형성될 수 있다(참조: 예를 들면, Chen et al., "Novel Hydroges of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery,"Proceed Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22: 167-168, Controlled Release Society. Inc., 1995; Okano, "Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery",Proceed Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:111-112, Controlled Release Society, Inc., 1995; Johnston et al.,Pharm. Res. 9(3): 425-433, 1992; Tung, Int'l J. Pharm. 107: 85-90, 1994; Harsh 및 Gehrke,J. Controlled Release 17: 175-186, 1991; Bae et al.,Pharm. Res. 8(4): 531-537, 1991: Dinarvand and D'Emanuele,J. Controlled Release 36: 221-227, 1995; Yu 및 Grainger, "Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels: Poly N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Physicochemical Characterization," Dept. of Chemical & Bioligal Sci., Oregon Graduate Institute of Science &Technology, Beaverton, OR, pp 820-821; Zhou 및 Smid, "Physical Hydrogels of Associative Star Polymers", Polymer Research Institute, Dept. of Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822-823; Hoffman et al., "Characterizing Pore Sizes and Water 'Structure' in Stimuli-Responsive Hydrogels" Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p. 828; Yu 및 Grainger, "Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 829-830; Kim et al.,Pharm. Res 9(3):283-290, 1992; Bae et al.,Pharm. Res. 8(5): 624-628, 1992; Kono et al.,J. Controlled Release 30: 69-75, 1994; Yoshida et al.,J. Controlled Release 32: 97-102, 1994; Okano et al.,J. Controlled Release 36:125-133, 1995; Chun 및 Kim,J. Controlled Release 38:39-47, 1996; D'Emanuele 및 Dinarvand, Int'l J. Pharm. 118: 237-242, 1995; Katono et al.,J. Controlled Release 16:215-228, 1991; Hoffman, "Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species," Migliaresi et al., (eds.),Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, pp. 161-167; Hoffman, "Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Disgnostics,"Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, UT, Feb. 24-27,1987, pp. 297-305; Gutowska et al.,J. Controlled Release 22:95-104, 1992; Palasis 및 Gehrke,J. Controlled Release 18:1-12, 1992; Paavola et al.,Pharm. Res. 12(12); 1997-2002, 1995).
열 겔화 중합체의 대표적인 예 및 이들의 젤라틴 온도(LCST(℃))는 단독 중합체, 예를 들면 폴리(N-메틸-N-n-프로필아크릴아미드), 19.8; 폴리(N-n-프로필아크릴아미드), 21.5; 폴리(N-메틸-N-이소프로필아크릴아미드), 22.3; 폴리(N-n-프로필메타크릴아미드), 28.0; 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 30.9; 폴리(N, n-디에틸아크릴아미드), 32.0; 폴리(N-이소프로필메타크릴아미드), 44.0; 폴리(N-사이클로프로필아크릴아미드), 45.5; 폴리(N-에틸메틸아크릴아미드), 50.0; 폴리(N-메틸-N-에틸아크릴아미드), 56.0; 폴리(N-사이클로프로필메타크릴아미드), 59.0; 폴리(N-에틸아크릴아미드), 72.0을 들 수 있다. 더욱이, 열 겔화 중합체는 상기 단량체들 사이의 공중합체를 제조함으로써, 또는 이러한 단독중합체를 아크릴단량체들(예: 아크릴산 및 이의 유도체, 예를 들면 메틸아크릴산, 아크릴레이트 및 이의 유도체, 예를 들면 부틸 메타크릴레이트, 아크릴아미드 및 N-n-부틸 아크릴아미드) 등의 다른 수용성 중합체와 조합함으로써 제조할 수 있다.
열 겔화 중합체의 다른 대표적인 예로는 셀룰로스 에테르 유도체, 예를 들면 하이드록시프로필 셀룰로오스, 41℃, 메틸 셀룰로스, 55℃; 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 66℃; 및 에틸하이드록시에틸 셀룰로스 및 플루로닉, 예를 들면 F-127, 10-15℃; L-122, 19℃; L-92, 26℃; L-81, 20℃; 및 L-61, 24℃를 들 수 있다.
광범위한 형태는 본 발명의 중합성 담체, 예를 들면 막대형 장치, 펠릿, 슬래브 또는 캡슐에 의해 형성될 수 있다(참조: 예를 들면, Goodell et al., Am. J. Hosp. Pharm. 43:1454-1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", Biomedical polymers, Polymeric materials and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E.P.. Nakagim, A. (eds.) Academic Press, pp. 113-137, 1980; Rhine et al., J. Pharma. Sci. 69:265-270, 1980: Brown et al., J. Pharm. Sci. 72:1181-1185, 1983; 및 Bawa et al., J. Controlled Release1:259-267, 1985). 치료제들은 중합체의 매트릭스 내에 폐색시킴으로써 연결될 수 있거나, 공유결합에 의해 결합되거나, 또는 마이크로캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특정 양태에서, 치료제 조성물은 미소구(㎚에서 ㎛에 이르는 크기 범위), 페이스트, 각종 크기의 트레드, 필름 및 스프레이 등의 비캡슐형 제형으로 제공된다.
바람직하게는, 본 발명의 치료 조성물은 의도된 목적에 적절한 방식으로 형성된다. 본 발명의 특정 국면에서, 치료제 조성물은 생체적합성이고, 수일 내지 수개월의 기간에 걸쳐 1개 이상의 치료제를 방출한다. 예를 들면, 7일 내지 10일에 걸쳐 10%, 20% 또는 25%(w/v) 이상의 치료제(예: 파클리탁셀)를 방출하는 "신속 방출형" 또는 "폭발적" 치료제 조성물이 제공된다. 이러한 "신속 방출형" 조성물은 특정 양태에서 목적한 제제를 화학적 치료 수준(적용될 수 있는 경우)으로 방출할 수 있다. 다른 양태에서, 7일 내지 10일에 걸쳐 1%(w/v) 미만의 치료제를 방출하는 "느린 방출형" 치료제 조성물이 제공된다. 더욱이, 본 발명의 치료제 조성물은 바람직하게는 수개월 동안 안정해야 하고, 멸균 상태로 생산 및 유지될 수 있어야 한다.
본 발명의 특정 국면에서, 치료제 조성물은 특정 용도에 따라 50㎚ 내지 500㎛ 범위내의 임의의 크기로 형성될 수 있다. 대안으로, 이러한 조성물은 또한 필름 또는 제피로 고화되는 "스프레이"로서 용이하게 도포될 수도 있다. 이러한 스프레이는 광범위한 크기 배열, 예를 들면 0.1㎛ 내지 3㎛, 10㎛ 내지 30㎛, 및 30㎛ 내지 100㎛의 미소구들로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 치료제 조성물은 또한 다양한 "페이스트" 또는 겔 형태로 제조될 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 양태에서, 특정 온도(예: 37℃ 이상의 온도, 예를 들면 40℃, 45℃, 50℃, 55℃ 또는 60℃)에서 액체이고, 다른 온도(예: 상온 또는 37℃ 미만의 임의의 온도)에서 고체 또는 반고체인 치료제 조성물이 제공된다. 이러한 "써모페이스트"는 본 명세서에 제공된 개시 내용에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 치료제 조성물은 필름으로서 형성될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 필름은 일반적으로 5, 4, 3, 2 또는 1mm 미만의 두께, 보다 바람직하게는 0.75 mm 또는 0.5mm 미만의 두께, 가장 바람직하게는 500㎛ 내지 100㎛ 두께를 갖는다. 이러한 필름은 양호한 인장 강도(예: 50N/cm2 이상, 바람직하게는 100N/cm2 이상, 보다 바람직하게는 150 또는 200N/cm2 이상), 양호한 접착 특성(즉, 습하거나 또는 젖은 표면에 용이하게 접착됨)과 함께 가요성인 것이 바람직하고, 조절된 투과성을 갖는다.
본 발명의 특정 양태에서, 치료제 조성물은 계면활성제(예: 플루로닉, 예를들면 F-127, L-122, L-92, L-81 및 L-61) 등의 추가 성분을 포함할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 면에서, 소수성 화합물을 함유하고 방출하도록 채택된 중합성 담체가 제공되고, 이 담체는 탄수화물, 단백질 또는 폴리펩티드와 조합된 소수성 화합물을 함유한다. 특정 양태에서, 중합성 담체는 1개 이상의 소수성 화합물의 영역, 포켓 또는 과립을 함유하거나 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 양태에서, 소수성 화합물은 소수성 화합물을 함유하는 매트릭스 내에 혼입한 다음, 중합성 담체 내에 매트릭스를 혼입할 수 있다. 각종 매트릭스가 이러한 점에서 이용될 수 있고, 그 예로는 탄수화물 및 폴리사카라이드, 예를 들면 전분, 셀룰로스, 덱스트란, 메틸셀룰로스 및 히알루론산, 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면 알부민, 콜라겐 및 젤라틴을 들 수 있다. 다른 양태에서, 소수성 화합물들은 소수성 코어 내에 함유될 수 있고, 이러한 코어는 친수성 쉘 내에 함유된다. 예를 들면, 실시예에 기재한 바와 같이, 파클리탁셀은 친수성 쉘을 갖는 소수성 코어(예: 폴리 D,L 락트산-PEG 또는 MePEG 응집체)에 혼입될 수 있다.
광범위한 소수성 화합물들이 상기 중합성 담체로부터 방출될 수 있고, 그 예로는 미소관 기능을 방해하는 특정 소수성 화합물, 예를 들면 파클리탁셀 및 에스트라무스틴; 소수성 단백질, 예를 들면 미엘린 염기성 단백질, CNS 미엘린의 프로테올리피드 단백질, 소수성 세포벽 단백질, 구멍단백, 멤브레인 단백질(EMBO J. 12(9):3409-3415, 1993), 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질("MOG")(Biochem and Mol. Biol. Int. 30(5): 945-958, 1993, P27Cancer Res. 53(17):4096-4101, 1913), 박테리오옵신, 사람 계면활성제 단백질("HSB";J. Biol. Chem.268(15):11160-11166, 1993) 및 SP-B 또는 SP-C(Biochimica et Biophysica Acta 1105(1):161-169, 1992)를 들 수 있다.
치료제 조성물을 형성하기 위해 중합성 담체에 상기한 바와 같은 치료제를 혼입한 대표적인 예는 실시예에서 보다 상세히 기재한다.
다른 담체
본 명세서에 기재한 치료제를 함유하고/하거나 전달하기 위해 마찬가지로 이용될 수 있는 다른 담체들로는 하이드록시프로필 β사이클로덱스트린(Cserhati 및 Hollo,Int. J. Pharm. 108:69-75, 1994), 리포좀(참조: Sharma et al.,Cancer Res. 53:5877-5881, 1993: Sharma 및 Straubinger,Pharm. Res. 11(60): 889-896, 1994: 국제 공개공보 제WO93/18751호; 미합중국 특허 제5,242,073호), 리포좀/겔(국제 공개공보 제WO 94/26254호), 나노캡슐(Bartoli et al.,J. Microencapsulation 7(2): 191-197, 1990), 미쉘(Alkan-Onyuksel et al.,Pharm. Res. 11(2): 206-212, 1994), 이식체(Jampel et al.,Invest, Ophthalm, Vis. Science 34(11): 3076-3083, 1993; Walter et al.,Cancer Res. 54:22017-2212, 1994), 나노입자들(비올란트(Violante) 및 란자페임(Lanzafame) PAACR), 나노입자들-개질됨(미합중국 특허 제5,145,684호), 나노입자들(표면 개질됨)(미합중국 특허 제5,399,363호), 탁솔 에멀전/용액(미합중국 특허 제5,407,683호), 미쉘(계면활성제)(미합중국 특허 제5,403,858호), 합성 인지질 화합물(미합중국 특허 제4,534,899호), 가스 분산액(미합중국 특허 제5,301,664호), 액체 에멀젼, 발포체스프레이, 겔 로션 크림, 연고, 분산된 소낭, 입자들 또는 소적 고체- 또는 액체- 에어로졸, 마이크로에멀젼(미합중국 특허 제5,330,756호), 중합성 쉘(나노- 및 마이크로캡슐)(미합중국 특허 제5,439,686호), 표면 활성제 중의 탁소이드계 조성물(미합중국 특허 제5,438,072호), 에멀전(Tarr et al.,Pharm Res. 4: 62-165, 1987), 나노스피어(Hagan et al.,Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 22, 1995; Kwon et al.,Pharm Res. 12(2): 192-195; Kwon et al., Pharm Res. 10(7):970-974; Yokoyama et al.,J. Contr. Rel. 32: 269-277, 1994; Gref et al.,Science 263: 1600-1603, 1994; Bazile et al.,J. Pharm. Sci. 84: 493-498, 1994) 및 이식체(미합중국 특허 제4,882,168호)를 들 수 있다.
아래 보다 상세히 논의하는 바와 같이, 치료제 조성물을 형성하기 위해 본 명세서에 기재된 담체들중의 하나에 임의로 혼입된 본 발명의 치료제들은 각종 질병을 치료하거나 또는 예방하기 위해 제조되어 이용될 수 있다.
질병의 치료 또는 예방
상기한 바와 같이, 본 발명은 혈관계 질병, 신생물 페색증, 염증성 질병 및 전염성 질병을 포함하는 신체 통로의 폐색과 관련된 각종 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
예를 들면, 본 발명의 한 국면에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 각종 치료제 조성물은 혈관계의 폐색을 유발하는 혈관계 질병을 치료하는 데 이용될 수 있다. 이러한 질병의 대표적인 예로는 모든 혈관(임의의 동맥, 정맥 또는 이식 조직둘레)의 아테롬성 동맥경화증, 예를 들면 관상 동맥, 대동맥, 장골 동맥, 경동맥, 공용 대퇴부 동맥, 표면상의 대퇴 동맥, 슬와 동맥 및 이식 부위의 문합, 혈관경련(예: 관상 혈관 경련 및 레이노병); 재협착증(기구 혈관형성술, 우회 수술, 스텐트 삽입 및 이식 조직 삽입 등의 사전 개입 부위에서 혈관의 폐색); 염증 및 자가 면역 상태(예: 일시적 동맥염, 혈관염)를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
간단히 말해, 아테롬성동맥경화증 등의 혈관계 질병에서, 백혈구, 특히 단핵 세포 및 T 림포구는 내피 세포, 특히 동맥 가지의 위치에 부착된다. 내피에 부착된 후, 백혈구는 화학정적 자극에 반응하여 내피 세포 라이닝을 가로질러 이동하고, 평활근 세포를 따라 동맥벽의 내막에 누적된다. 이러한 아테롬성동맥경화증 전개의 초기 병변은 "지방 선조(fatty streak)"로서 공지되어 있다. 지방 선조 내의 단핵 세포들은 대식세포로 분화되고; 대식세포 및 평활근 세포들은 포말 세포가 되도록 지질 및 지단백질을 공격적으로 취한다.
대식세포가 누적됨에 따라 중첩된 내피는 산화된 지질, 산소 유도된 유리 라디칼 및 대식세포에 의해 방출된 프로테아제에 의해 기계적으로 붕괴되고, 화학적으로 변경된다. 포말 세포들은 혈관벽의 마이크로궤양화를 유발하는 내피 표면을 통해 부식된다. 혈전형성성 내피하 조직(콜라겐 및 다른 단밸질 등)을 혈류 성분들에 잠재적으로 노출시킴으로써 붕괴된 내피 영역에 대한 혈소판 부착을 초래한다. 혈소판 접착 및 기타 사건들은 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 혈소판 활성화 인자(RAF), 및 인터류킨 1 및 6(IL-1, IL-6)을 포함하는 성장 인자들의 이러한 환경으로 동화 및 방출을 일으킨다. 이들 파라크린 인자들은 혈관의 평활근 세포(VSMC) 이동 및 증식을 자극하기 위한 것으로 생각된다.
정상적인(논의하지 않은) 혈관 벽에서, 혈관의 평활근 세포들은 수축성 표현형을 갖고, 유사 분열 활성 지수가 낮다. 그러나, 사이토킨 및 혈소판, 대식세포 및 내피 세포에 의해 방출된 성장 인자의 영향하에, VSMC는 성숙한 수축성 세포로부터 미숙한 분비 세포로의 표현형을 변경한다. 변환된 VSMC는 혈관벽의 매질 중에서 증식하고, 동맥 내막으로 이동하고, 동맥 내막에서 계속 증식하고, 대량의 세포외 매트릭스를 생성한다. 이는 진화하는 혈관 병변을 섬유질 플라크로 변환시킨다. 분비 VSMC에 의해 동화된 세포외 매트릭스는 콜라겐, 엘라스틴, 당단백질 및 글리코사미노글리칸을 포함하지만, 콜라겐은 아테롬성동맥경화증 플라크의 주요 세포외 매트릭스 성분을 포함한다. 엘라스틴 및 글리코사미노글리칸은 지단백질을 결합시키고, 또한 병변 성장에 기여한다. 섬유질 플라크는 평활근 세포를 함유하고, 대식세포, T 세포 및 세포외 물질 위에 놓인 다양한 두께의 치밀한 연결 조직의 섬유질 캡으로 구성된다.
PDGF, IL-1 및 IL-6 외에, 다른 유사분열 인자들은 성장 인자 β(TGF-β), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 트롬보스폰딘, 세로토닌, 트롬복산 A2, 노레펜에프린 및 안지오텐신 II를 변형시키는 단계를 포함하여, 혈관 벽에 스며든 세포들에 의해 생산된다. 이는 많은 세포들의 보충, 추가의 세포외 매트릭스의 동화 및 추가의 지질의 축적을 초래한다. 이는 혈관 내강 상에 현저하게 잠식할 때까지 아테롬성동맥경화증 병변을 점진적으로 확대시킨다. 초기에, 혈관을 통해 폐색된 혈류는 증가된 혈류가 요구될 때만 아테롬성동맥경화증 플라크에서 먼 조직의 허혈을 유발하고, 후기에는 병변이 추가로 동맥을 봉쇄함에 따라, 허혈이 휴지기에 발생한다.
확대된 아테롬성 동맥경화증 플라크에서 대식세포는 인접 조직의 세포 부상 및 괴사를 유발하는 산화된 지질, 유리 라디칼, 엘라스타제 및 콜라게나제를 방출한다. 이 병변은 괴사성 코어를 발현시키고, 복합 플라크로 변환된다. 복합 플라크는 색전증 유발; 국소 출혈(병변의 신속한 확장으로 인해 내강 폐색을 초래하는 플라크를 공급하는 맥관 혈관의 파열에 부수적임); 또는 궤양화 및 열창 형성(이는 국소 혈전증 또는 말단 색전증을 유발하는 혈류에 혈전형성성 괴사성 코어를 노출시킨다)을 차단할 수 있는 불안정한 병변이다. 상기 후유증 중 어느 것도 발생하지 않더라도, 점착성 혈전이 조직화되어, 플라크 내에 삽입됨으로써 이의 성장을 가속화시킬 수 있다. 더욱이, 피브리노겐 및 트롬빈의 국소 농도가 증가함에 따라, 매질 및 동맥 내막의 혈관의 평활근 세포의 증식이 자극되고, 이 과정은 또한 궁극적으로 혈관의 추가 협착을 유발한다.
정상적인 동맥의 동맥 내막 및 매질은 산화되고, 동맥 내강으로부터 또는 외막의 맥관벽 혈관으로부터 양분을 공급받는다. 아테롬성동맥경화성 플라크의 발현에 따라, 외막의 맥관벽 혈관으로부터 발생하는 미세혈관은 비대된 동맥 내막 및 매질로 확장한다. 이러한 혈관 네트워크는 플라크 퇴화로 플라크가 약화되고 감소됨에 따라 보다 광대해진다.
이들 미세혈관으로부터의 출혈은 동맥 절개, 궤양화 또는 혈전증과 관련된 플라크의 돌발적인 팽창 및 파열을 촉진시킬 수 있다. 이들 미세관으로부터의 혈장 단백질의 누출은 영역내에서의 염증성 침윤물을 끌어들일 수 있고, 이들 염증세포들은 아테롬성동맥경화성 플라크의 신속한 성장 및 연관된 합병증에 기여할 수 있다(국소 부종 및 염증을 통해서).
혈관계 질병을 치료하기 위해, 상기한 바와 같이, 광범위한 치료제들(담체의 존재 또는 부재하)이 신체 통로의 외부, 또는 신체 통로의 외막을 통해 평활근 세포에 전달될 수 있다. 이러한 점에서 특히 바람직한 치료제로는 혈관 형성 억제 인자, 혈소판 접착/응집의 억제제(예: 아스피린, 디피리다몰, 트롬복산 합성 억제제, 보다 강력한 트롬복산 A2보다 오히려 트롬복산 AE의 생산을 초래하는 어유, 피브리노겐 및 프로스타사이클린을 결합시키는 혈소판 IIb/IIIa 수용체에 반하는 항체), 혈관확장제(예: 칼슘 도입 봉쇄제, 및 질산 산화물 공여체인 니트로글리세린, 니트로프루시드 및 몰시도민) 및 항혈전제 및 트롬빈 길항제(예: 헤파린(저분자량 헤파린, 와파린 언듀딘(warfarin andudin))을 들 수 있다. 이용될 수 있는 기타 치료제로는 소염제(예: 글루코르티코이드, 덱사메타손 및 메틸프레드니솔론), 성장 인자 억제제(예: 트라피딜; 티로신 키나제의 억제제 및 티로신 포스파타제의 촉진제를 포함하는 수용체 억제제(예: FGF, VEGF, PDGF 및 TNF에 대한 수용체의 억제제); 안지오펙틴을 포함하는 소마토스타틴 동족체; 안지오텐신 변환 효소 억제제; 및 케탄세린 등의 5HT2 세로토닌성 수용체 길항제 등의 PDGF 길항제)를 들 수 있다. 또 다른 치료제로는 증식방지제(예: 콜치신, 헤파린, β(예: P-32) 또는 γ 이미터(예: Ir-192), 칼슘-도입 봉쇄제, 예를 들면 베라파밀, 딜티아젬 및 니페디핀, 콜레스테롤-저하 HMB Co-A 환원 효소 억제제, 예를 들면 로바스타틴, 미소관 기능을 방해하는 화합물, 예를 들면 파클리탁셀 및 상기한 바의 질소 산화물 공여체), 및 재내피화의 촉진제(예: bFGF 및 혈관의 내피 세포 성장 인자)를 들 수 있다.
본 발명의 다른 면에서, 본 명세서에 기재된 치료제 또는 조성물들이 신생물 폐색증을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 간단히 말해, 본원에 이용되는 바의 "신생물 폐색증"은 악성의 조직학적 타입 또는 관의 위치와 무관하게 신체의 관의 임의의 신생물(양성 또는 악성) 폐색을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 대표적인 예로는 위장관 질병(예: 구강-식도암(선암, 식도암(비늘모양 세포, 선암, 임파종, 흑색종), 위암(선암, 증생성 위벽염, 임파종, 평활근육종), 소장암(선종, 평활근종, 지방종, 선암, 임파종, 카르시노이드 종양), 결장암(선암) 및 항문직장암); 담도 질병(예: 췌장 암종 등의 담도 폐색을 초래하는 신생물(혈관 선암, 섬 세포 종양, 낭종암), 담관암 및 간세포 암); 폐 질병(예: 폐 및/또는 기관/기관지 통로의 암(소 세포 폐암, 비소 세포 폐암)); 여성 생식기 질병(예: 나팔관의 악성, 자궁암, 경부암, 질암); 남성 생식기 질병(예: 고환암, 부고환암, 정관암, 전립선암, 양성 전립선 비대증); 및 요도 질병(예: 신장암, 신장 골반암, 뇨수집 시스템의 종양, 예를 들면 과도기 세포 종양, 방광암, 및 양성 협착 또는 악성으로 인한 요도 폐색)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
예를 들면, 양성 전립선 비대(BPH)는 전립선, 특히 연장된 안드로겐성 자극에 반응하여 발생하는 요도 주위선의 중심부의 확대이다. 이는 50세 이상의 남성의 80% 이상에 영향을 미친다. 이러한 확대는 전립선을 통해 흐르는 요도의 일부를 압축시켜 방광 유출로 폐색을 초래하고, 즉, 소변을 생성하기 위해 비정상적으로 큰 방광압을 필요로 한다. 1980년에, BPH에 대한 치료로서 미국에서만 367,000명이 경요도적 전립선 절개술을 감행했다. 다른 치료로는 투약, 경요도적 괄약근절제술, 경요도 레이저 또는 마이크로파, 경요도 온열요법, 경요도 초음파, 경직장 온열요법, 경직장 초음파 및 수술 제거법을 들 수 있다. 이들 모든 치료법은 실금 및 협착 형성을 초래하는 괄약근 메카니즘의 방해를 포함하는 단점을 갖는다.
신생물 질병을 치료하기 위해, 상기 논의한 바와 같은 각종 치료제(중합성 담체의 존재 또는 부재하)가 신체 통로의 외부 또는 신체 통로 외막을 통해 평활근 세포에 전달될 수 있다. 이러한 점에서 특히 바람직한 치료제로는 파클리탁셀 및 이의 유도체 또는 동족체 등의, 미소관 기능을 방해하는 화합물을 포함하여 혈관형성방지제, 증식억제제 또는 신생물 형성 방지제를 들 수 있다.
예를 들면, 바람직한 하나의 양태에서, 바늘 또는 카테터가 초음파 안내하에 경직장 경로(또는 대안으로 경괄약근으로)를 통해 요도에 인접한 전립선으로 안내되고, 이를 통해 전립선의 여러개의 사분원, 특히 요도 둘레로 치료제를 전달한다. 바늘 또는 카테터는 내시경, 형광 투시경, CT 또는 MRI 안내하에 또는 직접적인 촉진하에 놓여질 수 있고, 일정 간격으로 투여된다. 대안으로서, 카테터 또는 투관침을 통한 펠릿의 배치가 수행될 수도 있다. 상기 절차는 단독으로 또는 전립선 요도에 넣은 스텐트와 합동으로 수행될 수 있다. 요도의 기구 사용 또는 요도에 대한 손상을 피함으로써, 괄약근 메카니즘은 손상되지 않을 수 있고, 실금을 피하고, 협착은 거의 일어나지 않는다.
본 발명의 다른 국면에서, 신체 통로의 폐색에 영향을 미치거나 또는 이를유발하는 염증성 질병의 예방 또는 치료 방법이 제공된다. 염증성 질병은 각종 신체 관의 폐색을 초래하는 급성 염증 또는 만성 염증 모두를 포함한다. 대표적인 예로는 혈관염(예: 거대 세포 동맥(일시적 동맥염, 다카야스 동맥염), 결절성 다발동맥염, 알러지성 혈관염 및 육아종증(처그-스트라우스(Churg-Strauss) 질병), 다발성혈관염 중첩 증후군, 과민성 혈관염[헨노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein Purpura)], 혈청병, 약물-유도 혈관병, 전염성 혈관병, 신생물 형성 혈관염, 결합 조직 질환과 연관된 혈관염, 상보 시스템의 선천성 결함과 연관된 혈관염), 베게너의 육아종증, 가와사키병, 중추 신경계의 혈관염, 버거씨병 및 전신 경화증); 위장관병(예: 췌장염, 크론병, 궤양성 대장염, 궤양성 직장항문염, 일차 경화성 담관염, 특발성을 포함한 임의의 원인의 양성 협착증(예: 담도, 식도, 십이지장, 소장 또는 결장의 협착)); 호흡기 질병(예: 천식, 과민성 폐렴, 석면침착증, 규폐증, 및 진폐증, 만성 기관지염 및 만성 폐색성 기도 질병의 기타 형태); 비루 도관 질병(예: 특발성을 포함한 모든 원인의 협착); 및 유스타키오관 질병(예: 특발성을 포함한 모든 원인의 협착)을 들 수 있다.
염증성 질병을 치료하기 위해, 상기한 바의 각종 치료제(담체의 존재하 또는 부재하)는 신체 통로의 외부, 또는 신체 통로의 외막을 통해 평활근 세포에 전달될 수 있다. 이러한 점에서 특히 바람직한 치료제로는 비스테로이드제("NSAIDS") 및 스테로이드제 뿐만 아니라 상기한 바의 혈관 형성 억제 인자들을 들 수 있다. 이용될 수 있는 다른 제제는 파클리탁셀 등의 미소관 기능을 방해하는 화합물 및 가벼운 "d"기 전이 금속을 포함하는 광범위한 혈관 형성 방지 사실을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면에서, 신체의 폐색과 관련되거나 또는 그 원인이 되는 전염성 질병의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 간단히 말해, 전염성 질병으로는 신체 통로의 폐색, 예를 들면 남성 생식기의 폐색(예: 요도염, 부고환염, 전립선염으로 인한 폐색); 여성 생식기 폐색(예: 질염, 자궁경관염, 골반 염증성 질병(예: 폐결핵, 임균, 클라미디아, 장내구균속 및 매독); 요도 폐색증(예: 방광염, 요도염); 호흡기 폐색(예: 만성 기관지염, 폐결핵, 기타 미코박테리아 감염증(MAI 등), 혐기성 감염, 진균 감염 및 기생충 감염) 및 심장혈관 폐색(예: 진균속 동맥류 및 전염성 심장 내막염)을 들 수 있다.
전염성 질병을 치료하기 위해, 상기한 바의 각종 치료제(담체의 존재 또는 부재하)는 신체 통로의 외부 또는 신체 통로의 외막을 통해 평활근에 전달될 수 있다. 이러한 점에서 특히 바람직한 치료제는 상기 논의한 바의 각종 항생제를 포함한다.
제형 및 투여
상기한 바와 같이, 본 발명의 치료제 조성물은 여러 가지 형태(예: 미소구, 페이스트, 필름 또는 스프레이)로 제형화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 1개 이상의 치료제를 함유하고, 여러 가지 부가 화합물을 함유하고, 특정 물리적 특성(예: 탄성, 특정 융점 또는 특정 방출률)을 갖도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 조성물은 바람직한 효과를 얻도록 조합될 수 있다(예: 미소구들의 여러 가지 제제는 1개 이상의 혈관 형성 억제 인자의 신속한 방출 및 서방출또는 연장된 방출을 달성하도록 조합될 수 있다).
본 발명의 치료제 및 조성물은 단독으로, 또는 약제학상 또는 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석액과 조합되어 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 담체들은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이어야 한다. 통상적으로, 이러한 조성물의 제제는 완충액, 아스코르브산과 같은 산화방지제, 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예를 들면 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트린, 킬레이트제, 예를 들면, EDTA, 글루타티온 및 기타 안정제 및 부형제와 치료제의 조합을 수반한다. 중성 완충액 염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 염수는 전형적으로 적절한 희석액이다.
상기한 바와 같이, 본 명세서에 제공된 치료제, 치료 조성물 또는 약제학적 조성물은 여러 가지 상이한 경로에 의해, 예를 들면 직접적으로 보이는(예: 수술시에 또는 내시경 수술) 신체 통로에 직접적으로, 또는 피하로 약물 전달을 통해 신체 통로의 외부(외막) 표면(예: 혈관 주변으로 전달)에 투여하도록 제조될 수 있다. 다른 대표적인 투여 경로로는 완전한 수술 과정 및 입원을 요하지 않지만, 의료인의 참석을 필요로 하는 위경검사법, ECRP 및 결장 검사법을 들 수 있다.
간단히 말해, 혈관 주변의 약물 전달은 초음파, CT, 형광 투시경, MRI 또는 내시경 가이드를 통해 바늘 또는 카테터를 사용하여 편재된(종종 서방출된) 치료 제형을 질병 부위로 피하 투여하는 것을 포함한다. 대안으로, 그 과정은 직접시 하에 도는 추가의 화상 가이드 하에 수술중에 수행될 수 있다. 이러한 수술은 혈관형성술, 죽상반절제술, 또는 스텐팅 등의 혈관내 수술 또는 동맥 내막, 혈관 또는 이식편 수선 또는 이식편 삽입 등의 동맥 수술과 연관되도록 수행될 수 있다.
예를 들면, 하나의 양태에서, 중합성 파클리탁셀 제형은 혈관벽에 주입될 수 있거나 또는 약물 농도가 생물학적 활성이 가장 필요한 영역에서 가장 높도록 하는 외막 표면에 도포된다. 이는 혈관내 약물 전달 장치(예: 약물-코팅된 스텐트)의 표면 위의 연속적인 혈류에 의해 강조될 수 있는 약물의 지엽적 "유실"을 감소시킬 가능성을 갖는다. 혈관의 외표면으로 유효한 치료제를 투여함으로써 관의 폐색을 감소시키고, 세포내 조작(재협착, 색전증, 혈전증, 플라크 파열, 및 전신 약물 독성)과 연관된 합병증의 위험을 감소시킬 수 있다.
예를 들면, 표피 대퇴부 동맥이 협착된 환자에서, 기구 혈관 형성술은 통상적인 방식(즉, 가이드 위 동맥 아래로 기구 혈관 형성 카테터를 통과시키고, 병변을 가로질러 기구를 부풀림)으로 수행될 수 있다. 혈관 형성술의 시행 전, 시술시 또는 시술 후에 바늘은 초음파, 형광 투시경 또는 CT 가이드하에 피부로 삽입될 수 있고, 치료제(예: 서방출 중합체 내에 함침된 파클리탁셀)는 동맥의 협착 영역 둘레에 직접적으로 원주 방식으로 바늘 또는 카테터를 통해 침윤될 수 있다. 이는 임의의 동맥, 정맥 또는 이식 조직 둘레에서 수행될 수 있지만, 본 발명에 대한 이상적인 후보는 경동맥, 관상 동맥, 장골, 공통 대퇴부, 표피 대퇴부 동맥 및 슬와 동맥 및 이식 조직 문합 부위의 질병을 포함한다. 논리적 정맥 부위로는 내재하는 카테터가 삽입된 정맥 둘레의 침윤을 포함한다.
본 명세서에 제공된 치료제, 치료 조성물 및 약제학적 조성물은 이러한 물질들의 용도에 관한 지침을 제공하는 포장재와 함께 용기 내에 넣을 수 있다. 일반적으로, 이러한 지침은 시약 농도, 뿐만 아니라 특정 양태에서, 혈관 형성 억제 인자, 혈관 형성 방지 조성물, 또는 약제학적 조성물을 재구성하는 데 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석액(예: 물, 염수 또는 PBS)의 상대적인 양들을 기재한 명확한 표현을 포함한다.
하기 실시예들은 설명의 목적으로 제공되는 것으로 제한하고자 함이 아니다.
실시예
실시예 1
"페이스트"의 제조
상기한 바와 같이, 본 발명은 여러 가지 임상 상황에 이용될 수 있는 여러 가지 중합체 함유 약물 조성물을 제공한다. 예를 들면, 조성물은 (1) 유체로서 목적 부위에 도포되고, 특정 온도(예: 체온)에서 목적하는 형상의 고체로 경화되는 "써모페이스트"로서; (2) 직접적으로 또는 특정 장치(예: 내시경)를 통해 목적하는 부위에 전달할 수 있고, 순차로 도포된 조직에 점착되는 고체로 경화되는 스프레이(즉, "나노스프레이")로서; (3) 직접적으로 또는 특정 장치를 통해 목적하는 부위에 도포되고, 바람직하게는 도포된 조직에 점착되는 점착성의 유연한 탄성 약물-부하된 중합체 필름으로서; 및 (4) 적절한 담체 매질 중의 미소구의 현탁액으로 구성되고, 직접적으로 또는 특정 장치를 통해 목적하는 부위에 도포되고, 도포 부위에 미소구층을 남기는 유체로서 생산될 수 있다. 상기 양태 각각의 대표적인 예는 아래에 보다 상세히 기재한다.
A.써모페이스트의 제조 공정
하기 실험에 이용될 수 있는 시약 및 장비로는 멸균 유리 주사기(1ml), 코닝 열판/교반기, 20ml 유리 섬광 바이알, 금형(예: 50㎕ DSC 팬 또는 50ml 원심분리관 캡 내부), 외과용 메스 및 핀셋, 폴리카프로락톤("PCL"-몰중량: 10,000 내지 20,000; 폴리사이언시즈, 미국, 펜실베니아주, 워링턴), 및 파클리탁셀(시그마 등급 95% 순도 최소)을 들 수 있다.
20ml 유리 섬광 바이알에 폴리카프로락톤 5.00g을 직접 칭량한다. 바이알을 물 50ml를 함유하는 600ml 비이커에 넣는다. 비이커를 65℃로 완만하게 가열하고, 그 온도에서 20분 동안 이를 유지시킨다. 이는 중합체를 용융시킨다. 공지된 중량의 파클리탁셀 또는 다른 혈관 형성 억제제를 65℃에서 용융된 중합체에 철저히 혼합한다. 용융된 중합체를 미리 예열한(60℃ 오븐) 금형에 붓는다. 유출 과정을 보조하기 위해 약숟가락을 사용한다. 중합체가 고화되도록 금형을 냉각시킨다. 중합체를 작은 조각(약 2mm x 2mm 크기)으로 절단 또는 파괴한다. 이들 조각은 1ml 유리 주사기에 적합하여야 한다. 플런저를 1ml 유리 주사기(선단으로부터 캡을 제거하지 않음)로부터 제거하고, 이를 천칭(balance) 상에 놓는다. 천칭의 0점을 조정한다.
0.5 g의 조각들을 칭량하여 주사기의 개방 말단부에 직접 넣는다. 유리 주사기(코닝 열판)를 더 이상의 물이 배럴에 유입되지 않도록 65℃에서 증류수를 함유하는 500ml 유리 비이커에 수직으로 넣는다. 중합체는 이 장치에서 10분내에 완전히 용융된다. 중합체 조각들이 용융될 때, 수조로부터 배럴을 제거하고, 이를 수평으로 유지하고, 캡을 제거한다. 플런저를 배럴 내에 삽입하고, 용융된 중합체를 배럴의 선단부에서 점착성 괴상으로 압축한다. 주사기에 캡을 씌어 실온으로 냉각시킨다.
도포하기 위해, 주사기를 60℃로 재가열하고, 체온으로 냉각될 때 고화되는 액체로서 투여한다.
B.나노스프레이 제조 공정
나노스프레이는 염수 중의 작은 미소구들의 현탁액이다. 미소구들이 매우 작은 경우(즉, 1㎛ 미만의 직경), 이들 미소구는 현탁액이 중력에 의해 침전되지 않도록 콜로이드를 형성한다. 아래 상세히 기재하는 바와 같이, 수동 펌프된 에어로졸을 통해 조직상에 침착되기에 적합한 0.1㎛ 내지 1㎛ 미립자들의 현탁액이 생성될 수 있다. 나노스프레이를 생산하기 위해 이용될 수 있는 장비 및 물질들은 200ml 수 자켓팅된 비이커(키멕스(Kimax) 또는 피렉스(Pyrex)), 하케(하케) 순환 수조, 오버헤드 교반기 및 2인치 직경의 제어기(4개의 날, 프로펠러 타입 스테인레스강 교반기; 피셔 브랜드), 500ml 유리 비이커, 열판/교반기(코닝 브랜드), 4X50ml 폴리프로필렌 원심분리관(날젠(Nalgene)), 플라스틱 삽입 캡이 달린 유리 섬광 바이알, 테이블 톱 원심 분리(벡크만(Beckman)), 고속 원심 분리-플로어 모델(JS 21 벡크만), 메틀러 분석 천칭(AJ 100, 0.1mg), 메틀러 디지탈 톱 로딩 천칭(AE 163, 0.01mg), 자동 피펫(길슨(Gilson)), 멸균 피펫 팁, 펌프 작용 에어로졸(파이퍼 파마슈티칼스(Pfeiffer pharmaceuticals)) 20ml, 층류 후드, 폴리카프로락톤("PCL"-몰중량 10,000 내지 20,000; 폴리사이언시즈(Polysciences), 미국 펜실베니아주 워링톤 소재), "세척된"(이전 참조) 에틸렌 비닐 아세테이트("EVA"), 폴리(DL)락트산("PLA", 몰중량 15,000 내지 25,000; 폴리사이언시즈), 폴리비닐 알콜("PVA"-몰중량 124,000 내지 186,000; 99% 가수분해됨; 알드리히 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Co.), 미국 위스콘신주 밀워키 소재), 디클로로메탄("DCM" 또는 "메틸렌 클로라이드", HPLC 등급, 피셔 사이언티픽(피셔 사이언티픽)), 증류수, 멸균 염수(벡톤 및 디켄슨 또는 등가물)를 들 수 있다.
1. 5%(w/v) 중합체 용액의 제조
제조된 중합체 용액에 따라, PCL 또는 PLA 1.00g 또는 PLA 및 세척된 EVA 각각 0.50g을 칭량하여 20ml 유리 섬광 바이알에 직접적으로 넣었다. 측량 실린더를 사용하여, DCM 20ml를 부가하고, 바이알에 캡을 단단히 씌웠다. 바이알을 실온(25℃)에서 1시간 동안 또는 모든 중합체가 용해될 때까지(때때로 수동 진탕이 사용될 수 있음) 방치하였다. 중합체의 용해는 육안으로 측정할 수 있으며; 용액은 투명해야 한다. 바이알에 용액 명칭 및 제조 일자를 라벨링하였다. 용액을 실온에서 저장하고 2주 이내에 사용하였다.
2. PVA의 3.5%(w/v) 원료 용액의 제조
이 용액은 아래 주어진 방법에 따라, 미소구의 생산(실시예 2 참조)을 위해제조된 5%(w/v) PVA 원료 용액을 희석함으로써 제조할 수 있다. 간단히 말해, PVA 17.5g을 칭량하여 600ml 유리 비이커에 직접 넣고, 증류수 500ml를 가하였다. 3인치 테플론 코팅된 교반 막대를 비이커에 넣었다. 비이커를 커버 유리로 덮어 증발 손실을 감소시켰다. 비이커를 물 300ml를 함유하는 2000ml 들이 유리 비이커 내에 놓았다. 이는 수조로서 작용할 것이다. PVA를 85℃(코닝 열판/교반기)에서 300rpm으로 2시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. PVA의 용해는 육안으로 측정할 수 있고; 용액은 투명해야 한다. 피펫을 사용하여 용액을 유리 스크류 톱 저장 용기로 옮기고, 4℃에서 최대로 2개월 동안 저장한다. 이 용액은 사용전 또는 희석 전에 실온으로 가온시켜야 한다.
3. 나노스프레이 제조 공정
교반 어셈블리를 발연 후드에 넣는다. 3.5% PVA 용액 100ml를 수 자켓팅된 비이커에 넣는다. 하케 수조를 이 비이커에 연결시키고, 내용물을 27℃(+/- 1℃)에서 10분 동안 평형에 이르게 한다. 오버헤드 교반기의 시작 속도를 3000rpm(+/- 200rpm)으로 설정한다. 오버헤드 교반기 날을 PVA 용액의 중간 아래 부분에 넣고 교반을 시작한다. 중합체 용액(생산된 나노스프레이의 타입에 기초하여 사용된 중합체 용액) 10ml를 5ml 자동 피펫을 사용하여 2분에 걸쳐 교반되는 PVA에 적가한다. 3분 후, 교반 속도를 2500rpm(+/- 200rpm)으로 조정하고, 어셈블리를 2.5시간 동안 방치한다. 2.5시간 후, 나노스프레이 제제로부터 교반 날을 제거하고, 증류수 10ml로 세정한다. 세정 용액을 나노스프레이 제제에 넣는다.
미소구 제제를 500ml 비이커에 넣는다. 자켓팅된 수조를 증류수 70ml로 세척한다. 세정 용액 70ml를 미소구 제제에 넣는다. 미소구 제제 180ml를 유리 막대로 교반시키고, 이의 동량을 4개의 50ml들이 폴리프로필렌 원심 분리관에 붓는다. 관들에 캡을 씌운다. 캡핑된 관들을 10,000g(+/-1000g)으로 10분 동안 원심분리한다. 5ml 자동 피펫 또는 진공 흡인관을 사용하여, PVA 용액 45ml를 각각의 미소구 펠릿에서 빼내고, 이를 폐기한다. 증류수 5ml를 각각의 원심 분리관에 가하고, 와동을 이용하여 각각의 관내의 미소구들을 재현탁시킨다. 증류수 20ml를 사용하여, 4개의 미소구 현탁액을 1개의 원심 분리관에 채운다. 미소구를 세척하기 위해, 나노스프레이 제제를 10분 동안 10,000g(+/- 1000g)으로 원심분리한다. 미소구 펠릿의 상청액을 빼낸다. 증류수 40ml를 가하고, 와동을 사용하여 미소구들을 재현탁시킨다. 전체적으로 3회 세척하도록 2회 이상 이 과정을 반복한다. 4번째 세척은 미소구들을 재현탁할 때 증류수 10ml(40ml가 아님)만을 사용하여 행한다. 4번째 세척 후, 미소구 제제를 미리 칭량한 유리 섬광 바이알로 옮긴다.
바이알에 캡을 씌우고, 이를 1시간 동안 실온(25℃)에 두어 2㎛ 및 3㎛ 직경의 미소구들을 중력하에 침전되게 한다. 1시간 후, 5ml 자동 피펫을 사용하여 현탁액의 상부 9ml를 빼낸다. 9ml를 멸균 캡이 씌워진 50ml 원심분리관에 넣는다. 현탁액을 10,000g(+/- 1000g)으로 10분 동안 원심분리시킨다. 상청액을 폐기하고, 멸균 염수 20ml 중에 펠릿을 재현탁한다. 현탁액을 10,000g(+/- 1000g)으로 10분 동안 원심분리시킨다. 상청액을 폐기하고, 멸균 염수 중에 펠릿을 재현탁한다. 사용된 염수의 양은 최종적으로 요구되는 현탁액 농도(통상적으로 10% w/v)에 의존한다. 멸균 염수로 에어로졸 장치를 철저하게 세정하고, 나노스프레이 현탁액을 에어로졸에 가한다.
C.파클리탁셀 부하된 나노스프레이의 제조
파클리탁셀을 함유하는 나노스프레이를 제조하기 위해, 파클리탁셀(시그마 등급 95% 순도)을 사용한다. 중합체 약물 원료 용액을 제조하기 위해, 적절한 양의 파클리탁셀을 20ml 유리 섬광 바이알에 직접 칭량한다. 적절한 양은 나노스프레이 중에 존재하는 파클리탁셀의 백분율에 기초하여 결정한다. 예를 들면, 5% 파클리탁셀을 함유하는 나노스프레이가 요구된 경우, 첨가된 중합체의 양이 DCM 용액 중의 5% 중합체 10ml이기 때문에, 칭량된 파클리탁셀의 양은 25mg일 수 있다(다음 단계 참조).
적절한 5% 중합체 용액 10ml를 파클리탁셀 함유 바이알에 첨가한다. 바이알에 캡을 씌우고, 와동 또는 수동 소용돌이에 의해 파클리탁셀을 용해시킨다(파클리탁셀이 용해되는 것을 보장하기 위해 육안으로 검사). 바이알에 제조 일자를 라벨링한다. 이는 제조된 날짜까지 사용되어야 한다.
중합체/약물(예: 파클리탁셀) 원료 용액이 중합체 용액을 치환하는 것을 제외하고는, 상기한 바의 공정에 따른다.
D.필름의 제조 공정
필름이라는 용어는 다수의 기하학적 형상 중의 하나로 형성된 중합체를 의미한다. 이 필름은 중합체의 얇은 탄성 시이트 또는 중합체의 2mm 두께 디스크일 수 있다. 이러한 필름은 임의의 캡슐화된 약물이 조직 부위에서 장기간에 걸쳐 중합체로부터 방출되도록 노출된 조직 상에 위치하도록 고안된다. 필름은, 예를 들어 주조 및 분무를 포함하는 여러 공정에 의해 제조될 수 있다.
주조 기술에서, 중합체는 용융시켜 틀에 붓거나 또는 디클로로메탄 중에 용해시켜 틀에 붓는다. 이어서, 중합체는 각각 냉각시 고화되거나 용매가 증발할 때 고화된다. 분무 기술에서, 중합체는 용매 중에 용해되고, 유리 상으로 분무되고, 용매가 증발함에 따라 중합체는 유리 상에서 고화된다. 분무를 반복함으로써 중합체를 축적시켜 유리로부터 박리시킬 수 있는 필름으로 한다.
이들 실험에 이용된 시약 및 장비로는 소형 비이커, 코닝 열판 교반기, 주조 금형(예: 50ml 원심분리관 캡) 및 금형 지지 장치, 캡이 달린 20ml 유리 섬광 바이알(플라스틱 삽입형), TLC 분무기, 질소 가스 탱크, 폴리카프로락톤("PCL" - 몰중량: 10,000 내지 20,000; 폴리사이언시즈), 파클리탁셀(시그마 95% 순도), 에탄올, "세척된"(이전 참조) 에틸렌 비닐 아세테이트("EVA"), 폴리(DL)락트산 ("PLA"-몰중량: 15,000 내지 25,000; 폴리사이언시즈), 디클로로메탄(HPLC 등급, 피셔 사이언티픽)을 들 수 있다.
1. 필름의 제조 공정-용융 주조
소형 유리 비이커에 공지된 중량의 PCL을 직접 칭량 도입한다. 비이커를 물을 함유하는 대형 비이커(수조로서 작용함)에 넣고, 이를 70℃에서 15분 동안 또는중합체가 완전히 용융될 때까지 열판 상에 놓았다. 공지된 중량의 약물을 용융 중합체에 가하고, 혼합물을 철저히 교반하였다. 용융된 PCL 중에 약물이 분산되는 것을 돕기 위해, 약물을 적은 용적(용융된 PCL의 용적의 10% 미만)의 100% 에탄올 내에 현탁/용해시킬 수 있다. 이어서, 이 에탄올 현탁액을 용융된 중합체에 혼합한다. 용융된 중합체를 금형에 붓고, 이를 냉각시키기 위해 방치한다. 냉각 후, 필름을 용기 내에 저장한다.
2. 필름의 제조 공정-용매 주조
20ml 유리 섬광 바이알에 공지된 중량의 PCL을 직접 칭량 도입하고, 10%w/v 용액을 얻기 위해 충분한 DCM을 가한다. 바이알에 캡을 씌우고, 용액을 혼합한다. 목적하는 최종 파클리탁셀 농도를 얻기 위해 용액에 충분한 파클리탁셀을 가한다. 수동 진탕 또는 와동을 사용하여 파클리탁셀을 용액 내에서 용해시킨다. 용액을 1시간 동안 방치하고(기포의 존재를 감소시키기 위함), 이어서 이를 금형 내에 서서히 붓는다. 사용되는 금형은 요구되는 형상에 기초한다. 금형을 발연 후드 내에 밤새 둔다. 이는 DCM이 증발되게 한다. 필름을 금형 내에 방치하여 이를 저장하거나 또는 이를 박리시켜 밀봉된 용기 내에 이를 저장한다.
3. 필름의 제조 공정-분무됨
20ml 유리 섬광 바이알에 충분한 중합체를 직접 칭량 도입하고, 2%w/v 용액을 얻기 위해 충분한 DCM을 가한다. 바이알에 캡을 씌우고, 용액을 혼합하여 중합체를 용해시킨다(수동 진탕). 금형을 발연 후드 내의 적절한 금형 지지 장치 내에 수직 방향으로 어셈블링시킨다. 수평 분무가 가능하도록 적절한 지지체(예: 역전된 2000ml 유리 비이커) 상의 발연 후드 플로어의 6 내지 12 인치 위에 이러한 금형 지지 장치를 위치시킨다. 자동 피펫을 사용하여, 적절한 용적(최소 5ml)의 2% 중합체 용액을 별개의 20ml 유리 섬광 바이알로 옮긴다. 용액에 충분한 파클리탁셀을 가하고, 캡으로 덮인 바이알을 수동 진탕함으로써 이를 용해시킨다. 분무용으로 제조하기 위해, 이 바이알의 캡을 제거하고, TLC 분무기의 배럴(만)을 중합체 용액에 침지시킨다. 주의: 분무기의 저장기는 이 공정에서 사용되지 않는다 - 20ml 유리 바이알이 저장기로서 작용한다.
질소 탱크를 분무기의 가스 유입구에 접속시킨다. 분무가 시작될 때까지 압력을 점진적으로 증가시킨다. 이 압력에 주의하고, 이 압력을 공정 전반에 걸쳐 사용한다. 금형을 분무하기 위해, 분무사이에 15초의 건조 시간을 갖고 5초의 진동 분무를 사용한다. 건조 시간 동안, 손가락으로 가스 라인을 잡아 스프레이의 소모를 피한다. 적절한 두께의 중합체가 금형 상에 침착될 때까지 분무를 계속한다. 두께는 요청에 따른다. 금형에 부착된 분무된 필름을 박리시켜, 밀봉 용기 내에 저장한다.
E.나노페이스트의 제조 공정
나토페이스트는 친수성 겔 중에 현탁된 미소구들의 현탁액이다. 본 발명의 한 국면에서, 겔 또는 페이스트는 표적 조직에 근접하게 약물 부하된 미소구들을위치시키는 방법으로서 조직 위에 발라질 수 있다. 물에 기초하여, 페이스트는 페이스트 점성을 감소시키고 미소구가 조직 근처에 침착되는 경향을 유발하는 체액에 의해 곧 희석될 것이다. 이에 의해, 미소구 캡슐화된 약물의 푸울(pool)은 표적 조직에 근접하게 위치된다.
이들 실험에 이용될 수 있는 시약 및 장비로는 유리 비이커, 카보폴 925(약제학적 등급, 굿이어 케미칼 캄파니(Goodyear Chemical Co.)), 증류수, 수용액 중의 수산화나트륨(1M), 수용액 중의 수산화나트륨 용액(5M), 20% w/v로 물에 현탁된 0.1 lm 내지 3 lm 크기 범위의 미소구를 들 수 있다(상기 참조).
1. 5% w/v 카보폴 겔의 제조
5% w/v 용액을 얻기 위해 충분한 양의 카보폴을 1M 수산화나트륨에 가한다. 카보폴을 1M 수산화나트륨으로 용해시키기 위해, 혼합물을 약 1시간 동안 정치시킨다. 이시간 동안, 유리 막대를 사용하여 혼합물을 교반시킨다. 1시간 후, 혼합물의 pH를 취한다. 낮은 pH는 카보폴이 완전히 용해되지 않음을 의미한다. 얻고자 하는 pH는 7.4이다. 5M 수산화나트륨을 사용하여 pH를 조정한다. 이는 5M 수산화나트륨 소적을 혼합물에 서서히 가하고, 혼합물을 교반하고, 혼합물의 pH를 취함으로써 달성된다. 통상적으로, pH를 7.4로 조정하는데는 일반적으로 약 1시간이 소요된다. 일단 pH 7.4가 얻어지면, 겔을 코팅시키고, 이를 2 내지 3시간 동안 방치한다. 이 기간 후, pH가 여전히 7.4인지 확인하기 위해 pH를 체크한다. pH가 변한 경우, 5M 수산화나트륨을 사용하여 다시 pH 7.4로 조절한다. 겔을 수시간 동안방치하여 pH가 7.4에서 안정한지 확인한다. 목적하는 pH가 얻어지고 안정할 때까지 이 공정을 반복한다. 용기에 겔의 명칭 및 제조 일자를 라벨링한다. 이 겔은 다음주 내에 나노페이스트를 제조하기 위해 사용된다.
2. 나노페이스트의 제조 공정
충분한 0.1㎛ 내지 3㎛ 미소구를 물에 가하여 미소구의 20% 현탁액을 제조한다. 유리 비이커에 5% w/v 카보폴 겔 8ml를 넣는다. 비이커에 20% 미소구 현탁액 2ml를 가한다. 유리 막대 또는 혼합 약숟가락을 사용하여 겔 전체에 미소구들이 철저히 분산되도록 혼합물을 교반한다. 이는 통상적으로 30분 걸린다. 일단 미소구들이 겔 내에 분산되면, 혼합물을 저장 단지(jar)에 넣는다. 이 단지를 4℃에서 저장한다. 이것은 1개월 내에 사용되어야 한다.
실시예 2
미소구의 제조
하기 미소구의 제조에 바람직한 장비로는 200ml 수 자켓팅된 비이커(키막스 또는 피렉스), 하케 순환 수조, 오버헤드 교반기 및 2인치 직경의 제어기(4개의 날, 프로펠러 타입 스테인레스강 교반기; 피셔 브랜드), 500ml 유리 비이커, 열판/교반기(코닝 브랜드), 4 x 50ml 폴리프로필렌 원심분리관(날젠), 플라스틱 삽입 캡이 달린 유리 섬광 바이알, 테이블 톱 원심 분리(GRP 벡크만), 고속 원심 분리-플로어 모델(JS 21 벡크만), 메틀러 분석 천칭(AJ 100, 0.1mg), 메틀러 디지탈 톱 로딩 천칭(AE 163, 0.01mg), 자동 피펫(길슨)을 들 수 있다. 시약으로는 폴리카프로락톤("PCL"-몰중량: 10,000 내지 20,000; 폴리사이언시즈, 미국 펜실베니아주 워링톤 소재), "세척된"(이후의 "세척" 방법 참조) 에틸렌 비닐 아세테이트("EVA"), 폴리(DL)락트산 ("PLA" 몰중량: 15,000 내지 25,000; 폴리사이언시즈), 폴리비닐알콜("PVA"-몰중량: 124,000 내지 186,000; 99% 가수분해됨; 알드리히 케미칼 캄파니, 미국 위스콘신주 밀워키 소재), 디클로로메탄("DCM" 또는 "메틸렌 클로라이드", HPLC 등급, 피셔 사이언티픽) 및 증류수를 들 수 있다.
A.5%(w/v) 중합체 용액의 제조
제조된 중합체 용액에 따라, PCL 또는 PLA 1.00g 또는 PLA 및 세척된 EVA 각각 0.50g을 20ml 유리 섬광 바이알에 직접 칭량 도입하였다. 이어서, DCM 20ml를 부가하고, 바이알에 캡을 단단히 씌웠다. 바이알을 실온(25℃)에서 1시간 동안(수시로 진탕이 사용될 수 있음) 또는 모든 중합체가 용해될 때까지 저장하였다(용액은 투명해야 한다). 이 용액은 적어도 2주 동안 실온에서 저장될 수 있다.
B.PVA의 5%(w/v) 원료 용액의 제조
PVA 25g을 600ml 유리 비이커에 직접 칭량 도입한다. 3인치 테플론 코팅된 교반 막대를 따라 증류수 500ml를 가하였다. 비이커를 유리로 덮어 증발 손실을 감소시키고, 물 300ml를 함유하는 2000ml 유리 비이커(수조로서 작용함) 내에 놓았다. PVA를 85℃(코닝 열판/교반기)에서 300rpm으로 2시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지 교반시킨다. PVA의 용해는 육안으로 측정할 수 있고; 용액은 투명해야 한다. 이어서, 용액을 유리 스크류 톱 저장 용기로 옮기고, 4℃에서 최대로 2개월 동안 저장한다. 그러나, 이 용액은 사용 전 또는 희석 전에 실온으로 가온시켜야 한다.
C.미소구의 제조 공정
제조된 미소구들의 크기에 기초하여(표 1 참조), PVA 용액(표 1에 주어진 농도) 100ml를 200ml 수 자켓팅된 비이커에 넣는다. 하케 순환 수조를 이 비이커에 접속시키고, 내용물을 27℃(+/- 1℃)에서 10분 동안 평형에 이르게 한다. 제조된 미소구들의 크기에 기초하여(표 1 참조), 오버헤드 교반기의 시작 속도를 설정하고, 오버헤드 교반기 날을 PVA 용액의 중간 아래 부분에 넣는다. 이어서, 교반을 시작하고, 중합체 용액(생산된 미소구의 타입에 기초하여 사용된 중합체 용액) 10ml를 5ml 자동 피펫을 사용하여 2분에 걸쳐 교반되는 PVA에 적가한다. 3분 후, 교반 속도를 조정하고(표 1 참조), 이 용액을 추가로 2.5시간 동안 교반한다. 이어서, 미소구 제제로부터 교반 날을 제거하고, 증류수 10ml로 세정함으로써 세정액을 미소구 제제로 빼낸다. 이어서, 미소구 제제를 500ml 비이커에 붓고, 자켓팅된 수조를 증류수 70ml로 세척하고, 이를 또한 미소구 제제로 배수되게 할 수도 있다. 이어서, 미소구 제제 180ml를 유리 막대로 교반시키고, 동량을 4개의 50ml들이 폴리프로필렌 원심 분리관에 붓는다. 이어서, 관들에 캡을 씌우고, 10분 동안 원심분리한다(표 1에 제공된 힘). 5ml 자동 피펫 또는 진공 흡인관을 사용하여, PVA용액 45ml를 각각의 미소구 펠릿에서 빼낸다.
이어서, 증류수 5ml를 각각의 원심분리관에 첨가하고, 이어서 와동시켜 미소구들을 재현탁시킨다. 이어서, 4개의 미소구 현탁액을 증류수 20ml와 함께 1개의 원심분리관에 채우고, 추가로 10분 동안 원심분리한다(표 1에 나타낸 힘). 이러한 공정은 총 3개의 세척물에 대해 추가로 2회 반복된다. 이어서, 미소구들은 마지막으로 원심분리되고, 증류수 10ml 중에서 재현탁된다. 최종 세척 후, 미소구 제제는 미리 칭량한 유리 섬광 바이알 내로 옮겨진다. 이 바이알은 캡이 씌워지고, 미소구들이 중력하에 침전되도록 실온(25℃)에서 밤새 방치한다. 0.1㎛ 내지 3㎛ 크기 범위로 하강한 미소구들은 중력하에 침전되지 않음으로써, 이들은 현탁액 10ml 중에 잔류한다.
D.10㎛ 내지 30㎛ 또는 30㎛ 내지 100㎛ 직경의 미소구의 건조
미소구를 실온에서 밤새 방치한 후, 5ml 자동 피펫 또는 진공 흡인관을 사용하여 침전된 미소구들 위의 상청액을 빼내었다. 미소구들은 서랍 내의 캡으로 덮이지 않은 바이알 내에서 1주일 동안 또는 이들이 완전히 건조될 때까지(일정 중량의 바이알) 건조시킨다. 신속한 건조는 발연 후드 내에 느린 질소 가스 흐름(약 10ml/분의 흐름) 하에 캡으로 덮이지 않은 바이알을 남김으로써 수행될 수 있다. 완전히 건조될 때(일정한 중량의 바이알), 바이알을 칭량하고 캡을 씌운다. 라벨링되고, 캡이 씌워진 바이알을 서랍 내에서 실온 저장한다. 미소구들은 통상적으로 3개월 미만 저장한다.
E.0.1㎛ 내지 3㎛ 직경의 미소구들의 건조
이러한 크기 범위의 미소구들은 침전되지 않음으로써, 이들 미소구는 최대로 4주 동안 4℃에서 현탁액 중에 방치한다. 현탁액 10ml 중의 미소구들의 농도를 측정하기 위해, 현탁액의 시료 200㎕를 미리 칭량된 1.5ml 마이크로퓨즈 관에 피펫으로 넣었다. 이어서, 이 관을 10,000g(에펜도르프 테이블 톱 마이크로퓨즈)으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 관을 50℃에서 밤새 건조시킨다. 이어서, 관 내에서 건조된 미소구의 중량을 측정하기 위해 이 관을 재칭량한다.
F.파클리탁셀 부하된 미소구의 제조
파클리탁셀 함유 미소구를 제조하기 위해, 적절한 양의 칭량된 파클리탁셀(캡슐화된 파클리탁셀의 백분율에 기초함)을 20ml 유리 섬광 바이알에 직접 넣는다. 이어서, 적절한 중합체 용액 10ml를 파클리탁셀 함유 바이알에 첨가하고, 이어서, 파클리탁셀이 용해될 때까지 와동시킨다.
이어서, 파클리탁셀 함유 미소구들은 본질적으로 단계(C) 내지 (E)에서 상기한 바와 같이 생산될 수 있다.
실시예 3
계면활성제 코팅된 미소구
A.물질 및 방법
미소구는 실시예 2에서 기재한 바와 같이 본질적으로 폴리(DL)락트산(PLA), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 50:50 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA):PLA로부터 제조하였다. 크기는 평균 직경 45㎛와 함께 10 내지 100㎛ 범위였다.
인간의 혈액은 건강한 지원자들로부터 얻었다. 뉴트로필(백혈구)은 덱스트란 침전 및 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) 원심분리 기술을 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. 뉴트로필은 행크스 완충 염 용액("HBSS") 중에서 ml당 5백만개 세포로 현탁되었다.
뉴트로필 활성화 레벨은 화학루미네센스에 의해 측정한 바의 반응성 산소 종류의 발생에 의해 측정하였다. 특히, 화학루미네센스는 1㎛ 루미놀 강화제를 갖는LKB 발광계를 사용함으로써 측정하였다. 미소구의 혈장 예비코팅(또는 옵소닌 작용)은 혈장 0.5ml 중에 미소구 10mg을 현탁시키고, 37℃에서 30분 동안 회전시켜 수행하였다.
이어서, 미소구들을 HBSS 1ml 중에서 세척하고, 원심분리된 미소구 펠릿을 뉴트로필 현탁액에 37℃에서, t=0 시점에서 첨가하였다. 미소구 표면은 미소구 10mg을 37℃에서 30분 동안 HBSS 중의 F127의 2% w/w 용액 0.5ml 중에 현탁시킴으로써 플루로닉 F127(바스프(BASF))이라 칭명되는 계면활성제를 사용하여 개질시켰다. 이어서, 미소구를 추가로 예비 코팅하기 위한 뉴트로필 또는 혈장에 첨가하기 전에 HBSS 1ml 중에서 2회 세척하였다.
B.결과
도 1은 50 mV 미만의 화학 발광 값을 제공하는 미처리된 미소구들을 나타낸다. 이들 값은 낮은 수준의 뉴트로필 활성을 나타낸다. 비교를 위해, 염증성 미소 결정은 1000 mV에 가까운 값을 제공하고, 가용성 화학 활성제는 5000 mV에 가까운 값들을 제공할 것이다. 그러나, 미소구들이 혈장으로 예비코팅될 때, 모든 화학 발광 값들은 100 내지 300 mV 범위로 증대된다(도 1 참조). 뉴트로필 반응 또는 활성화에 대한 이들 레벨은 완만하게 염증성인 것으로 생각될 수 있다. PMMA는 가장 큰 반응을 제공하고, 가장 염증성인 것으로 간주될 수 있다. PLA 및 PCL 모두는 혈장 처리(또는 옵소닌 작용)후 뉴트로필을 활성화하는 데 3 내지 4배 이상 강력해지지만, 이러한 점에서 2개의 중합체들 사이에는 거의 차이가 없다. 미소구들은 건조시키기 곤란하고, 수성 완충액 내에 재현탁시키기가 곤란하기 때문에 EVA:PLA는 혈관 형성 제형 중에 사용되기 쉽지 않다. 혈장의 이러한 효과는 옵소닌 작용이라고 하며, 표면 상의 항체 또는 상보적 분자들의 흡착에 기인한다. 이들 흡착된 종류는 백혈구 세포 상의 수용체와 상호 작용하고, 세포 활성화를 증대시킨다.
도 2 내지 5는 PCL, PMMA, PLA 및 EVA:PLA 각각의 혈장 예비코팅 효과 뿐만 아니라 미소구의 혈장 예비 코팅 전의 플루로닉 F127 예비 코팅 효과를 보여준다. 이들 도면은 모두 동일한 효과를 보여준다: 즉, (1) 혈장 예비코팅은 반응을 증대시키고; (2) 플루로닉 F127 예비 코팅은 그 자신에 대한 효과가 거의 없고; (3) 혈장 예비 코팅에 의해 유발된 증대된 뉴트로필 반응은 2% 플루로닉 F127로 미소구 표면을 예비처리함으로써 강력하게 억제될 수 있다.
혈장으로부터 흡착된 단백질 종류의 특성은 전기 영동에 의해서 역시 연구되었다. 이러한 방법을 사용함으로써, 플루로닉 F127에 의한 중합체 표면의 예비 처리가 중합체 표면에 대한 항체의 흡착을 억제한다는 것을 나타냈다.
도 6 내지 9는 마찬가지로 IgG(2mg/ml) 또는 2% 플루로닉 F127 이어서 IgG(2mg/ml)로 PCL, PMMA, PLA 또는 EVA:PLA 미소구(각각)를 예비 코팅한 효과를 나타낸다. 이들 도면으로부터 알 수 있듯이, IgG로 미소구들을 예비 코팅함으로써 유발된 증대된 반응은 플루로닉 F127로 처리함으로써 억제될 수 있다.
이러한 결과는 모두 4가지 유형의 미소구의 중합체 표면을 플루로닉 F127로 예비처리함으로써, 미소구에 대한 뉴트로필의 "염증성" 반응이 억제될 수 있음을보여준다.
실시예 4
파클리탁셀의 캡슐화
파클리탁셀 또는 바카틴[인플라자임 파마슈티칼스 인코포레이티드(Inflazyme Pharmaceuticals Inc.)]사로부터 입수할 수 있는 파클리탁셀 동족체, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아 밴쿠버 소재) 500㎍을 50:50 ELVAX:폴리-1-락트산 혼합물 1ml 중에 용해시킨다. 이어서, 미소구들을 분해 기계(6-스핀들 분해 시험기, VanderKanp, 미국, 반 켈 인더스트리즈 인코포레이티드(Van Kell Industries Inc.))에서 200rpm으로 42℃에서 3시간 동안 3중으로 제조한다. 이와 같이 제조된 미소구들은 물로 2회 세척하고, 현미경으로 크기를 측정한다.
파클리탁셀 캡슐화의 측정은 uv/vis 분석으로 착수한다(uv/vis λmax, 237㎚, 형광 분석, 여기 상태 237㎚, 방출 325㎚; 형광 분석 결과는 꺽쇠 괄호[]로 나타낸다). 상기 공정을 이용함으로써, 파클리탁셀 58㎍(+/- 12㎍)[75㎍(+/- 25㎍)]을 전체 500㎍의 시작 물질로부터 캡슐화할 수 있다. 이는 원래 중량의 12%(+/-2.4%)[15%(+/-5%)], 또는 중합체 1.2%(+/-0.25%)[1.5%(+/-0.5%)] 중량을 나타낸다. 37℃의 오븐에서 18시간 동안 회전시킨 후, 전체 파클리탁셀의 10.3%(+/-10%)[6%(+/-5.6%)]가 미소구로부터 방출되었다.
바카틴에 대해, 바카틴 100 +/- 15㎍[83 +/- 23㎍]을 전체 500㎍의 출발 물질로부터 캡슐화할 수 있다. 이는 바카틴의 원래 중량의 20%(+/-3%) [17%(+/-5%)]및 중합체의 2%(+/-0.3%)[1.7%(+/-0.5%)] 중량을 나타낸다. 37℃의 오븐에서 18시간 동안 회전시킨 후, 바카틴의 55%(+/-13%)[60%(+/-23%)]가 미소구로부터 방출되었다.
실시예 5
에틸렌-비닐-아세테이트 공중합체 및 폴리(D,L 락트산)의 혼합물로 구성된 미소구로부터 파클리탁셀의 제어된 전달. CAM 분석에 대한 미소구의 생체내 시험
이 실시예는 생분해성 폴리(d,l-락트산)(PLA) 중합체와 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA) 공중합체의 혼합물로 구성된 파클리탁셀-부하된 미소구의 제제를 기재한다. 또한, CAM 상에 위치한 미소구로부터 방출된 파클리탁셀의 시험관내 방출 속도 및 혈관 형성 방지 활성을 나타낸다.
이들 실험에 이용된 사약으로는 시그마 케미칼 캄파니(미조리주, 세인트 루이스)로부터 구입된 파클리탁셀; PLA(분자량 15,000-25,000) 및 EVA(60% 비닐 아세테이트)(폴리사이언시즈(펜실베니아주, 워링톤)로부터 구입함); 폴리비닐 알콜(PVA)(분자량 124,000-186,000, 99% 가수분해됨, 알드리히 케미칼 캄파니(위스콘신주, 밀워키)로부터 구입함) 및 디클로로메탄(DCM)(HPLC 등급, 피셔 사이언티픽 캄파니로부터 입수함)을 들 수 있다. 증류수가 전체적으로 사용된다.
A.미소구의 제조
미소구들은 용매 증발법을 이용하여 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조한다. 간단히, DCM 20ml 중의 5% w/v 중합체 용액을 EVA:PLA 35:65 내지 90:10의 혼합물을 사용하여 제조한다. 20ml 유리 바이알 내의 수중 2.5% w/v PVA 5ml에 중합체 용액 1ml를 교반하에 적가한다. 6개의 유사한 바이알을 6개 위치의 오버헤드 교반기, 분해 시험 장치(반데르캄프) 내에 어셈블링시키고, 200rpm으로 교반시켰다. 바이알의 온도는 15분에 걸쳐 실온에서 40℃로 증가하였으며, 40℃에서 2시간 동안 유지시켰다. 바이알을 500 xg로 원심분리하고, 미소구를 물속에서 3회 세척한다. 일부 EVA:PLA 중합체 혼합물에서, 미소구 시료들은 분산제 또는 유화제, PVA의 제거로 인해 세척 단계 동안 응집된다. 응집된 미소구들은 융합되고, 융합된 중합체 괴상은 세척수의 표면 상에 부유하기 때문에, 이러한 응집 효과는 반정량적으로 분석될 수 있다. 이러한 표면 중합체층은 세척 처리 중에 폐기되고, 나머지 펠릿화된 미소구들이 칭량된다. % 응집률은 아래와 같이 측정하였다.
파클리탁셀 부하된 미소구(0.6% w/w 파클리탁셀)는 DCM 중의 5% w/v 중합체 용액 중에 파클리탁셀을 용해시킴으로써 제조한다. 사용된 중합체 혼합물은 50:50 EVA:PLA이다. 미소구의 "큰" 크기의 분획 및 "작은" 크기의 분획은 파클리탁셀/중합체 용액을 2.5% w/v PVA 및 5% w/v PVA 각각에 적가함으로써 생산된다. 분산액을 40℃에서 200rpm으로 2시간 동안 교반시키고, 원심분리하고, 상기한 바와 같이 물속에서 3회 세척한다. 미소구는 통풍 건조시키고, 시료는 단계 마이크로미터를 갖는 광학현미경을 사용하여 크기를 측정한다. 시료당 300개 이상의 미소구가 계수되었다. 대조용 미소구(파클리탁셀 부재)가 제조되었고 상기한 바와 같이 크기가 측정되었다.
B.캡슐화 효율
공지된 중량의 파클리탁셀-부하된 미소구를 DCM 1ml에 용해시키고, 50℃에서 수중 40% 아세토니트릴 20ml를 첨가하고, DCM이 증발할 때까지 와동시킨다. 40% 아세토니트릴 중의 파클리탁셀의 농도는 1ml/분의 유속(벡크만 아이소크래틱 펌프), C8 역상 칼럼(벡크만) 및 232㎚에서 UV 검출로 물:메탄올:아세토니트릴(37:5:58)의 이동상을 사용하여 HPLC에 의해 측정한다. 이러한 추출 공정의 회수 효율을 측정하기 위해, 100 내지 1000㎍의 공지된 중량의 파클리탁셀을 DCM 1ml에 용해시키고, 상기한 바와 같이 동일한 추출 공정에 3회 적용한다. 회수율은 항상 85% 이상이고, 캡슐화 효율 값은 적절히 정정된다.
C.약물 방출 연구
15ml 유리 스크류 캡으로 덮인 관에 pH 7.4의 10mM 인산염 완충 염수(PBS) 10ml 및 파클리탁셀-부하된 미소구 35mg을 넣는다. 이 관을 37℃에서 회전시키고, 주어진 간격으로, 1500 xg로 5분 동안 원심분리하고, 다음 분석을 위해 상청액을 저장한다. 미소구 펠릿은 신선한 PBS(10ml) 중에 37℃에서 재현탁시키고, 다시 항온배양한다. 파클리탁셀 농도는 DCM 1ml로 추출하고, 이어서 질소 스트림하의 건고 증발시키고, 수중 40% 아세토니트릴 1ml에서 재구성하고 상기한 바와 같이 HPLC를 사용하는 분석에 의해 측정한다.
D.주사 전자 현미경 사진(SEM)
미소구를 동일한 홀더 상에 놓고, 스퍼터는 금으로 코팅하고, 15kV에서 작동하는 필립스 501B SEM을 사용하여 현미경 사진을 얻었다.
E.CAM 연구
수정된, 가금류 병아리 배를 껍질 없는 배양 전에 4일 동안 항온배양시킨다. 난 내용물을 90% 상대 습도 및 3% CO2로 2일 동안 항온배양시킨다. 항온배양시킨지 6일 째에, 0.6% 파클리탁셀 부하된 미소구 또는 대조용 미소구(파클리탁셀 없음) 1mg 분량을 CAM 표면 상에 직접 놓는다. 노출시킨지 2일 후, 혈관 구조는 비디오 카메라와 결부된 입체 현미경을 사용하여 조사하고, 비디오 신호는 컴퓨터 상에 디스플레이하고 비디오 프린트한다.
F.결과
100% EVA로부터 제조한 미소구를 PVA 용액 중에 자유롭게 현탁시키지만, PVA를 제거하기 위해 수중 세척액 상에서 응집시키고, 합체시키거나 또는 광범위하게 융합한다. 증가된 비율의 PLA와 EVA를 혼합함으로써 도 10a에 기재한 바와 같이 물속에서 세척될 때 응집되어 합체되는 경향의 감소를 나타낸다. EVA:PLA의 50:50 혼합물은 우수한 물리적 안정성을 갖는 미소구로 형성되고, 이는 불연속으로 잔류하고, 무시할 정도의 응집 및 합체와 함께 잘 현탁되는 미소구이다.
"작은" 크기 분획 미소구에 대한 크기 범위는 미소구 시료의 95%(중량)를 초과하는 것이 10 내지 30mm 내이고, "큰" 크기의 분획에 대해 시료의 95%(중량)를 초과하는 것이 30 내지 100mm 내인 것으로 측정된다. "작은" 크기 범위 및 "큰" 크기 범위의 파클리탁셀 부하된 50:50 EVA:PLA 미소구의 대표적인 주사 전자 현미경 사진은 도 10b 및 10C에 각각 나타낸다. 이 미소구는 평활한 표면의 구형이고, 미소구 표면 상에 고체 약물의 증거가 없다. 파클리탁셀과 함께 50:50 EVA:PLA 미소구의 부하 효율은 중합체 50mg당 파클리탁셀 100 내지 1000mg 사이의 초기 파클리탁셀 농도에서 95 내지 100%이다. "작은" 또는 "큰" 미소구에 대한 캡슐화 효율 사이에 현저한 차이는 없다(스튜던트 t-테스트, p<0.05).
0.6% w/v 부하된 50:50 EVA:PLA 미소구로부터 경시적으로 파클리탁셀이 방출되는 과정은 "작은" 크기(개방된 원) 및 "큰" 크기(폐쇄된 원) 미소구에 대해 도 10d에 나타낸다. 방출 속도 연구는 3개의 별개의 실험으로 3중 시험관에서 수행하였다. 방출 프로필은 파클리탁셀의 초기 신속한 방출 또는 두 크기 범위의 미소구로부터 처음 4일에 걸쳐 발생하는 "폭발적" 상을 갖는 2상(biphasic)이다. 이에 훨씬 느린 방출 상이 뒤따른다. "작은" 또는 "큰" 미소구들로부터 방출 속도들 간에 현저한 차이는 없다. 미소구의 전체 파클리탁셀 함량의 10 내지 13%가 50일 내에 방출된다.
파클리탁셀 부하된 미소구(0.6% w/v 부하됨)는 CAM 분석을 사용하여 시험되고, 그 결과는 도 10e에 나타낸다. 파클리탁셀 미소구는 주변 조직 내의 구혈 영역을 생산하기에 충분한 약물을 방출하였다. 미소구에 바로 인접하여(도 10e 및 10F에서 "MS") 혈관이 완전히 없는 영역(구역 1)이 존재하고; 추가로 미소구로부터 분열된 비기능성 모세관 영역(구역 2)이 존재하며; 이는 단지 모세관이 정상으로 복귀하는 미소구로부터 약 6mm 거리에 있음을 주의한다. 대조용 미소구(파클리탁셀 부재)로 처리한 CAM에서, 정상적인 모세관 네트워크 구조(도시하지 않음)가 존재한다.
논의
관 주변의 약물 투여는 약간 침략적인 수술 기술이다. 따라서, 이상적으로는, 파클리탁셀 등의 항증식성 약물의 혈관 주변 제형은 수 개월 정도로 연장된시간 동안 활성에 충분한 농도로 종양 또는 질병 부위에 약물을 방출할 수 있다. EVA는 장기간(>100일)에 걸쳐 거대 분자의 조절 전달용으로 널리 사용되는 조직 적합성의 비분해성 중합체이다.
EVA는 중합체 매트릭스 내에 분산된 파클리탁셀을 갖는 미소구를 제조하기 위한 중합성 생물질로서 초기에 선택된다. 그러나, 미소구는 세척 과정 동안 거의 완전히 응집되고 합체된 100% EVA로 제조된다.
락트산 및 글리콜산계 중합체 및 공중합체는 생리학적으로 불활성이고, 생체 적합성이고, 가수분해에 의해 분해되어 독물학적으로 허용되는 산물을 생산한다. 락트산과 글리콜산의 공중합체는 PLA보다 신속한 분해 속도를 갖고, 이들 공중합체를 사용하여 제조한 약물 부하된 미소구는 수개월에 걸친 지연된 조절 방출에 부적합하다.
도 10a는 EVA:PLA 혼합물 중의 PLA의 비율 증가가 미소구 현탁액의 응집 정도를 감소시킴을 나타낸다. EVA:PLA 매트릭스 중의 50% 미만의 EVA의 혼합물은 물 또는 PBS 중의 물리적으로 안정한 미소구 현탁액을 생산한다. 50:50 EVA:PLA의 혼합물은 모든 후속 연구에 대해 선택된다.
상이한 크기 범위 분획의 미소구가 수성상 중의 유화제, PVA의 농도를 변화시킴으로써 제조될 수 있다. "작은" 미소구는 5% w/v의 보다 큰 PVA 농도에서 생산되는 한편, "큰" 미소구는 2.5% w/v PVA에서 생산된다. 모든 다른 생산 변수는 두 미소구 크기 분획에 대해서와 동일하다. 보다 고농도의 유화제는 보다 점성의 수성 분산 매질을 제공하고, 수성 상중에 유화된 소적의 중합체/파클리탁셀/DCM과 그에 따른 작은 미소구를 생산한다. 95 내지 100%의 초기 파클리탁셀을 함유하는 파클리탁셀 부하된 미소구는 고체 미소구 내에 캡슐화된 유기상에 첨가한다. 파클리탁셀의 낮은 수용해도는 유기상 함유 중합체를 분할한다.
50:50 EVA:PLA로부터 파클리탁셀의 방출 속도는 50일 내에 방출되는 15% 미만 부하된 파클리탁셀과 함께 매우 느리다. 약물 방출의 초기 폭발적 상은 미소구의 표피 영역(미소구 표면에 근접함)으로부터 약물의 확산에 기인할 수 있다.
EVA 등의 비분해성 중합체성 매트릭스로부터 약물 방출의 메카니즘은 중합체 내에 분산된 약물 상을 통한 물의 확산, 약물의 분해 및 일련의 상호 접속된 유체 충전 공극을 통한 용질의 확산을 포함하는 것으로 생각된다. EVA와 PLA의 혼합물은 PLA 중에서 30 내지 70% 범위의 EVA에 걸쳐 불혼화성 또는 이연속적인 것으로보인다. 유도 또는 지연 기간에 이어, 37℃ PBS 완충액에서의 분해 연구에 있어서, PLA는 가수분해적으로 분해되고, EVA:PLA 중합체 혼합물 매트릭스로부터 침식되어 불활성 스폰지형 골자를 남긴다. 유도 기간 및 PLA 분해 속도 및 혼합된 매트릭스로부터 침식은 매트릭스 내위 PLA의 비율 및 공정의 내력에 의존하지만, 40 내지 50일 후까지 일관되게 PLA의 손실이 거의 없거나 또는 전혀 없다.
50:50 EVA:PLA 미소구로부터 PLA의 일부 침식은 시험관내 방출 속도 연구의 50일 이내에 발생할 수 있지만(도 10c), 중합체 혼합물로부터 약물 방출의 일차 메카니즘은 중합체 매트릭스 내의 공극 네트워크를 통한 용질의 확산일 것이다.
방출 속도 연구의 결론으로서, 미소구들은 남아있는 약물의 양으로부터 분석된다. 50일 항온배양된 미소구 시료에 남아있는 파클리탁셀의 백분율 값은 "큰" 크기 분획 및 "작은" 크기 분획 미소구 각각에 대해 94% +/- 9% 및 89% +/- 12%이다.
중합체mg 당 6mg 부하된 미소구(6%)는 병아리 배의 CAM 상에 놓일 때 혈관 형성의 과도한 억제를 제공한다(도 10e 및 10F).
실시예 6
폴리(Ε-카프로락톤) 미소구 내에 치료제의 캡슐화, 파클리탁셀 부하된 미소구에 의한 CAM 분석에 대한 혈관 형성의 억제
이 실시예는 폴리(ε-카프로락톤)의 생분해성 미소구로부터 파클리탁셀의 시험관내 방출 속도 프로필을 평가하고, CAM 상에 놓일 때 이들 미소구로부터 방출된파클리탁셀의 생체내 혈관 형성 억제 활성을 나타낸다.
이들 실험에 이용된 시약으로는 폴리(ε-카프로락톤)("PCL")(분자량 35,000 내지 45,000; 폴리사이언시즈(미국 펜실베니아주 워링톤 소재)로부터 구매함); 디클로로메탄("DCM")(피셔 사이언티픽 캄파니(캐나다)로부터 구매함); 폴리비닐 알콜(PVP)(분자량 12,000 내지 18,000, 99% 가수분해됨)(알드리히 케미칼 캄파니(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 구매함), 및 시그마 케미칼 캄파니(미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수한 파클리탁셀을 들 수 있다. 달리 지적하지 않는 한, 모든 화학 약품 및 시약은 공급 상태로 사용되고, 증류수는 전체에 사용된다.
A.미소구의 제조
미소구들은 용매 증발법을 이용하여 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조한다. 간단히 말해, 5% w/v 파클리탁셀 부하된 미소구는 DCM 2ml 중에 파클리탁셀 10mg 및 PCL 190mg을 용해시키고, 1% PVP 수용액 100ml에 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 1000rpm으로 교반시킴으로써 제조한다. 미소구의 현탁액은 1000 xg으로 10분(벡크만 GPR) 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 미소구를 물로 3회 세척하였다. 세척된 미소구들은 밤새 통풍 건조시키고, 실온에서 밤새 저장한다. 대조용 미소구(파클리탁셀 부재)를 상기한 바와 같이 제조한다. 1% 및 2% 파클리탁셀을 함유하는 미소구들 역시 제조된다. 미소구들은 단계 마이크로미터를 갖는 광학현미경을 사용하여 크기를 측정한다.
B.캡슐화 효율
공지된 중량의 약물-부하된 미소구들(약 5mg)을 아세토니트릴 8ml에 용해시키고, 증류수를 가하여 중합체를 침전시킨다. 혼합물을 1000g으로 10분 동안 원심분리시키고, 캡슐화된 파클리탁셀의 양은 232㎚로 UV 분광분석계(휴렛-팩커드 8452A 다이오드 어레이 분광광도계)에서 측정된 상청액의 흡광도로부터 산출된다.
C.약물 방출 연구
파클리탁셀-부하된 미소구 약 10mg을 유리 스크류 캡으로 덮인 관에 pH 7.4의 10 mM 인산염 완충 염수(PBS) 20ml에 현탁시킨다. 이 관을 37℃에서 끝에서 끝으로 회전시키고, 주어진 간격으로, 상청액 19.5ml를 제거하고(미소구들을 바닥에 침전시킨 후), 0.45㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과시키고, 파클리탁셀 분석을 위해 보유한다. 동일 용적의 PBS를 각각의 관내에 위치시키고, 연구 전반에 걸쳐 싱크 상태를 유지한다. 여액은 3 x 1ml DCM으로 추출하고, DCM 추출물은 질소 기류하에 증발 건조시키고, 1ml 아세토니트릴에 용해시키고, 1ml/분의 유속(벡크만 아이소크래틱 펌프)으로 물:메탄올:아세토니트릴(37:5:58)의 이동상을 사용하는 HPLC, C8 역상 칼럼(벡크만), 232㎚에서 UV 검출(시마즈 SPD A)에 의해 분석한다.
D.CAM 연구
수정된, 가금류 병아리 배를 껍질 없는 배양 전에 4일 동안 항온배양시킨다. 항온배양시킨지 6일 째에, 5% 파클리탁셀 부하된 미소구 또는 대조용 미소구(파클리탁셀 없음) 1mg 분량을 CAM 표면 상에 직접 놓는다. 노출시킨지 2일 후, 혈관 구조는 비디오 카메라와 결부된 입체 현미경을 사용하여 조사하고, 비디오 신호는 컴퓨터 상에 디스플레이하고 비디오 프린트한다.
E.주사 전자 현미경 사진
미소구를 동일한 홀더 상에 놓고, 금으로 스퍼터 코팅한 다음, 15kV에서 작동하는 필립스 501B 주사 전자 현미경에 놓는다.
F.결과
미소구 시료에 대한 크기 범위는 30 내지 100㎛이지만, 일부 미소구의 모든 파클리탁셀-부하된 미소구 또는 대조용 미소구 배치가 이 범위 밖에 속한다는 증거가 있다. 파클리탁셀과 함께 PCL 미소구의 부하 효율은 연구되는 모든 약물 부하물에 대해 항상 95% 이상이다. 주사 전자 현미경 사진은 미소구들이 모두 구형이고, 많은 수가 거칠거나 또는 얽은 자국이 있는 표면 형태학을 보이는 것으로 나타났다. 미소구의 표면 상에 고체 약물이 남아있다는 증거는 없다.
1%, 2% 및 5% 부하된 PCL 미소구로부터 파클리탁셀의 경시적 방출 경로는 도 11a에 나타낸다. 방출 속도 프로필은 2상이다. 파클리탁셀의 초기 신속한 방출 또는 모든 약물 부하물에서 "폭발적 상"이 존재한다. 폭발적 상은 1% 및 2% 파클리탁셀 부하에서 1 내지 2일에 걸쳐 발생하고, 5% 부하된 미소구에 대해 3 내지 4일에 걸쳐 발생한다. 신속한 방출의 초기 상은 현저하게 더 느린 약물 방출 상에따른다. 1% 또는 2% 파클리탁셀을 함유하는 미소구에 대해, 21일 후 더 이상의 약물 방출이 없다. 5% 파클리탁셀 부하시에, 미소구는 21일 후 전체 약물 함량의 약 20%를 방출한다.
도 11b는 대조용 PCL 미소구로 처리한 CAM을 나타내고, 도 11c는 5% 파클리탁셀 부하된 미소구에 의한 처리를 보여준다. 대조용 미소구에 의한 CAM은 정상적인 모세관 네트워크 구조를 보여준다. 파클리탁셀-PCL 미소구로 처리한 CAM은 현저한 혈관 퇴화를 보여주고, 그의 영역에는 모세관 네트워크가 결여되어 있다.
논의
파클리탁셀-부하된 미소구를 제조하기 위한 용매 증발법은 95 내지 100%의 매우 큰 파클리탁셀 캡슐화 효율을 제공한다. 이는 파클리탁셀의 불량한 수용해도 및 중합체를 함유하는 유기 용매 상 내에서 분배하는데 바람직한 그의 소수성 특성에 기인한다.
파클리탁셀에 대한 2상 방출 프로필은 생분해성 중합체 매트릭스로부터 많은 약물에 대한 전형적인 방출 패턴이다. 폴리(ε-카프로락톤)은 생리적 조건하에 가수분해로 분해될 수 있는 지방족 폴리에스테르이고, 이는 비독성이며 조직 적합성이다. PCL의 분해는 광범위하게 연구되는 중합체 및 락트산과 글리콜산의 공중합체보다 현저히 느리고, 따라서 장기간의 관주위 약물 전달 시스템의 도안으로 적절하다. 파클리탁셀 방출의 초기 신속하거나 또는 폭발적인 상은 미소구의 표피 영역(미소구 표면에 근접함)으로부터 약물의 확산 방출에 기인하는 것으로 생각된다.방출 프로필의 제2(느린) 상에서 파클리탁셀의 방출은 PCL의 분해 또는 침식으로 인해 일어나기 쉽지 않은데, 그 이유는 수중 시험관 내 조건하의 연구가 7.5주에 걸쳐 PCL의 현저한 중량 손실 또는 표면 침식이 없었음을 보여주기 때문이다. 파클리탁셀 방출의 느린 상은 아마도 중합체 매트릭스 내의 유체-충전된 공극 내의 약물의 분해 및 공극을 통한 확산에 기인하는 것이다. 보다 큰 파클리탁셀 부하시에 더 큰 방출 속도는 아마도 중합체 매트릭스 내의 보다 광범위한 공극 네트워크의 결과이다.
5% 부하된 파클리탁셀 미소구는 CAM 상에 놓일 때 혈관 형성을 과도하게 억제하기에 충분한 약물을 방출하는 것으로 보인다. 혈관 성장의 억제는 도 11c에 나타낸 바의 구혈 영역을 초래한다.
실시예 7
에틸렌 비닐 아세테이트 및 계면활성제로 구성된 관주위에 치료제-부하된 중합체 필름
2가지 유형의 필름이 이 실시예에서 연구된다: 파클리탁셀이 부하된 순수한 EVA 필름 및 파클리탁셀이 부하된 EVA/계면활성제 혼합 필름.
조사된 계면활성제는 2개의 소수성 계면활성제(스팬 80 및 플루로닉 L101) 및 1개의 친수성 계면활성제(플루로닉 F127)이다. 플루로닉 계면활성제는 자체로 중합체이고, 이들은 EVA와 혼합되어 여러 가지 약물 전달 특성을 최적화시키기 대문에 흥미있는 특성이다. 스팬 80은 중합체 매트릭스 내에 몇몇 방식으로 분산되는 작은 분자이고, 혼합물을 형성하지 않는다.
계면활성제는 필름으로부터 파클리탁셀의 방출 속도를 조절하고, 필름의 특정 물리적 파라메터를 최적화하는 데 유용한다. 약물 방출 속도가 조절될 수 있음을 나타내는 계면활성제 혼합물 필름의 한 국면은 화합물이 물속에서 팽윤되는 속도 및 정도를 변화시키는 능력이다. 중합체-약물 매트릭스로의 물의 확산은 담체로부터 약물을 방출하는 데 중요하다. 도 12c 및 도 12d는 혼합물 중의 계면활성제 레벨이 변경됨에 따르는 필름의 팽윤 정도를 나타낸다. 순수한 EVA 필름은 2개월에 걸쳐 현저한 정도로 팽윤되지 않는다. 그러나, EVA에 첨가된 계면활성제의 레벨을 증가시킴으로써, 화합물의 팽윤도가 증가할 수 있고, 소수성을 증가시킴으로써 팽윤도가 역시 증가될 수 있다.
이들 필름의 실험 결과는 이하 도 12a 내지 E에서 나타낸다. 간단히 말해, 도 12a는 순수한 EVA로부터 시간 경과에 따른 파클리탁셀 방출(mg)을 보여준다. 도 12b는 동일한 필름내에 남아 있는 약물의 백분율을 나타낸다. 이들 2개의 도면으로부터 알 수 있듯이, 파클리탁셀 부하가 증가함에 따라(즉, 파클리탁셀 중량 백분율이 증가할 때), 약물 방출 속도가 증가하고, 기대되는 농도 의존도를 보인다. 파클리탁셀 부하가 증가함에 따라, 필름에 남아있는 파클리탁셀의 백분율 역시 증가하고, 이는 보다 큰 부하가 장기간의 방출 제형에 대해 보다 더 매력적일 수 있음을 보여준다.
필름의 물리적 강도 및 탄성은 도 12e에서 평가한다. 간단히 말해, 도 12e는 순수한 EVA 및 EVA-계면활성제 혼합물 필름에 대한 응력/변형 곡선을 나타낸다.이러한 응력의 조악한 측정은 필름의 탄성이 플루로닉 F127을 첨가함에 따라 증가하고, 인장 강도(파단시 응력)는 플루로닉 F127을 첨가함에 따라 농도 의존적 방식으로 증가된다는 것을 입증한다. 탄성 및 강도는 화합물의 영구적인 변형을 유발하지 않고 특정 관주위 임상 용도로 조작될 수 있는 필름을 고안하는데 중요한 고려 사항이다.
상기 데이터는 약물 방출 속도를 조절하고, 부형제의 물리적 특성을 변경시키는 특정 계면활성제 첨가제의 능력을 나타낸다.
실시예 8
페이스트로부터 치료제를 조절 전달하는 제형을 개발하기 위해 폴리(Ε-카프로락톤)으로 메톡시폴리에틸렌 글리콜 350(MePEG) 혼입
이들 실험에 이용된 시약 및 장비로는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 350("MePEG"-코네티컷주 댄버리 소재 유니온 카바이드사 제품)을 들 수 있다. MePEG는 실온에서 액체이고, 10℃ 내지 -5℃의 동결점을 갖는다.
A.MePEG/PCL 파클리탁셀-함유 페이스트의 제조
MePEG/PCL 페이스트는 먼저 일정량의 파클리탁셀을 MePEG에 용해시키고, 이어서 이를 용융된 PCL에 혼입함으로써 제조한다. 이러한 방법의 한가지 장점은 DCM이 전혀 요구되지 않는다는 것이다.
B.융점의 분석
PCL/MePEG 중합체 혼합물의 융점은 분당 2.5℃의 가열 속도로 30℃ 내지 70℃로 시차 주사 열량계에 의해 측정할 수 있다. 이러한 실험의 결과는 도 13a 및 13B에 나타낸다. 간단히 말해, 도 13a에 나타낸 바와 같이, 중합체 혼합물의 융점(열분석에 의해 측정함)은 농도 의존 방식으로 MePEG에 의해 감소된다. MePEG 농도 함수로서의 중합체 혼합물의 융점은 도 13a에 나타낸다. 이러한 낮은 융점은 도 13b에 나타낸 바의 융점으로부터 고화되도록 중합체 혼합물에 대해 증가된 시간으로 변형된다. MePEG/PCL의 30:70 혼합물은 PCL 단독으로 행하는 것보다 유체 용융물로부터 고화되는 데 2배 이상 걸린다.
C.취성의 측정
MePEG를 PCL에 혼입함으로써 PCL 단독인 경우와 비교한 바, 보다 덜 취성인 고체를 생산하는 것으로 보인다. 이를 정량화하는 "거친" 방식으로서, 칭량된 바늘을 동일한 높이로부터 PCL 중에 0% 내지 30% MePEG를 함유하는 중합체 혼합물에 떨어뜨리고, 이어서, 바늘이 고체로 침투한 거리를 측정한다. 결과의 그래프를 도 13c에 나타낸다. 점들은 4개의 측정치 +/- 1 S.D.의 평균으로서 제공된다.
비교의 목적상, 파라핀 왁스의 시료를 역시 시험하고, 이에 침투된 바늘의 거리는 7.25mm +/- 0.3 mm이다.
D.파클리탁셀 방출의 측정
중합체의 펠릿(0%, 5%, 10% 또는 20% MePEG를 함유하는 PCL)을 37℃에서 인산염 완충 염수(PBS, pH 7.4)에서 항온배양시키고, 중합체 중량의 변화율(%)을 경시적으로 측정한다. 도 13d에서 알 수 있듯이, 손실된 중량은 혼합물 중에 원래 존재하는 MePEG의 농도에 따라 증가한다. 이러한 중량 손실은 중합체 매트릭스로부터 항온배양된 유체로의 MePEG의 방출에 기인하기 쉽다. 이는 파클리탁셀이 PCL로 혼입되기 전에 MePEG에 먼저 용해되기 때문에 MePEG/PCL 혼합물로부터 파클리탁셀이 용이하게 방출될 것임을 나타낸다.
E.파클리탁셀 방출에 대한 변화하는 양의 MePEG의 효과
써모페이스트는 PCL 중의 0.8% 내지 20% MePEG를 함유하여 구성된다. 이들은 1% 파클리탁셀로 부하된다. 37℃에서 PBS 완충액 중의 펠릿 10mg으로부터 파클리탁셀의 경시적 방출은 HPLC를 사용하여 모니터한다. 도 13e에 나타낸 바와 같이, 제형 중의 MePEG의 양은 방출되는 파클리탁셀의 양에 영향을 미치지 않는다.
F.20% MePEG/PCL 혼합물로부터 방출된 파클리탁셀의 총량에 대한 변화하는 양의 파클리탁셀의 효과
써모페이스트는 PCL 중의 20% MePEG를 함유하여 구성되고, 0.2% 내지 10% 파클리탁셀로 부하된다. 시간 경과에 따른 파클리탁셀의 방출은 상기한 바와 같이 측정된다. 도 13f에 나타낸 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 방출된 파클리탁셀의 양은 증가된 파클리탁셀 부하량에 따라 증가한다. 그러나, 방출된 전체 파클리탁셀의 백분율로서 작도될 때, 그 순서는 역전된다(도 13g). 이는 페이스트 내에 남아있는 잔류 파클리탁셀에 대한 정보를 제공하고, 파클리탁셀이 20% MePEG 써모페이스트로부터 방출될 수 있는 시간의 경과를 투영한다.
G.여러 가지 MePEG/PCL 혼합물의 강도 분석
ACT-40 기계적 강도 시험기는 직경 0.88cm 및 0.560 cm의 평균 두께를 갖는 고체 중합체 "정제"의 강도를 측정하기 위해 사용된다. 중합체 정제는 PCL 중의 0%, 5%, 10% 또는 20%의 농도의 MePEG의 혼합물이다.
이러한 시험의 결과를 도 13h에 나타내며, 여기서 인장 강도 및 실패 시간을 혼합물 중의 %MePEG의 함수로서 작도된다. 한가지 변화하는 ANOVA는 각각의 그룹 내의 정제 두께들이 상이하지 않음을 나타낸다. 도 13h에 나타낸 바와 같이, PCL에 MePEG를 첨가함으로써 생성된 고체의 경도를 감소시킨다.
H.파클리탁셀의 방출에 대한 γ-조사의 영향
20% 파클리탁셀로 부하된 PCL:MePEG(80:20) 상은 γ-조사되고, 시간이 경과함에 따라 파클리탁셀 방출을 위해 분석된다. 그 결과를 도 30에 나타낸다.
요약하자면, 상기 실험에 기초하여, MePEG를 첨가함으로써 중합체를 덜 취성이도록 하고, 보다 왁스형으로 만들고, 융점을 감소시키고, 중합체의 고화 시간을 증가시키는 것으로 결론지을 수 있다. 이들 모든 인자는 페이스트의 도포 특성을 개선시킨다. 저 농도(20%)에서, MePEG는 PCL로부터 파클리탁셀의 방출에 대한 영향이 없다. γ-조사는 파클리탁셀 방출에 대한 효과는 거의 없는 것으로 보인다.
실시예 9
저분자량 폴리(D,L, 락트산)을 사용한 써모페이스트로부터 치료제 방출의 변경
상기 논의한 바와 같이, 목적하는 치료 효과에 따라, 신속히 방출하거나 느리게 방출하는 중합성 담체가 바람직할 수 있다. 예를 들면, 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 PCL의 혼합물은 수 개월의 기간에 걸쳐 파클리탁셀을 방출하는 조성물을 생산한다. 특히, 중합체 중의 파클리탁셀의 확산은 이의 큰 분자 크기 및 극도의 소수성으로 인해 매우 느리다.
다른 한편, 저분자량 폴리(DL-락트산)(PDLLA)은 이의 초기 분자량에 의존하여 1일 내지 수개월에 걸쳐 신속히 분해된다. 이러한 경우에 파클리탁셀의 방출은 중합체 분해에 의해 지배적이다. 저분자량 PDLLA의 다른 특징은 낮은 융점(즉, 40℃ 내지 60℃)이고, 이는 이를 써모페이스트를 만들기에 적절한 물질이 되게 한다. 이하 보다 상세히 기재한 바와 같이, 여러 가지 상이한 방법이 예를 들면 PDLLA의 분자량을 변화시키고/시키거나, 이는 큰 몰중량의 PCL, PDLLA 또는 폴리(락티드-코-글리코시드)(PLGA)와 혼합함으로써 중합체 분해률을 조절하는 데 이용될 수 있다.
A.실험 물질
D,L-락트산은 시그마 케미칼 캄파니사(미조리주, 세인트 루이스 소재)로부터 구매하였다. PCL(분자량 10,000 내지 20,000)은 폴리사이언시즈사(펜실베니아주워링톤 소재)로부터 입수하였다. 고분자량 PDLLA(고유 점도 0.60dl/g) 및 PLGA(50:50 조성, 점도 0.58dl/g)는 버밍험 폴리머사로부터 입수하였다.
B.저분자량 PDLLA의 합성
저분자량 PDLLA는 중축합을 통해 DL-락트산으로부터 합성하였다. 간단히 말하자면, DL-락트산은 목적하는 시간 동안 질소 퍼지 및 자기 교반하에 200℃, 유리 비이커에서 가열하였다. 점도는 분자량의 증가로 인해 중합하는 동안 증가되었다. 3개의 배치가 상이한 중합 시간, 즉, 40분(분자량 800), 120분, 160분에 따라 얻어졌다.
C.파클리탁셀 써모페이스트의 제형
파클리탁셀은 약 60℃에서 수동 혼합함으로써 하기 물질에 20% 부하되었다.
1. 중합 시간 40분의 저분자량 PDLLA
2. 중합 시간 120분의 저분자량 PDLLA
3. 중합 시간 160분의 저몰중량 PDLLA
4. 40분에 고분자량 PDLLA 및 저분자량 PDLLA의 50:50 혼합물
5. 40분에 고분자량 PLGA 및 저분자량 PDLLA의 50:50 혼합물
6. 10:90, 20:80, 40:60, 60:40 및 20:80의 PCL:PDLLA와 40분에 고분자량 PCL 및 저분자량 PDLLA의 혼합물
저분자량 PDLLA와 고분자량 PDLLA 또는 PLGA의 혼합물은 아세톤에 이들 물질을 용해시키고 이어서 건조시킴으로써 얻었다.
D.방출 연구
37℃에서 PBS 알부민 완충액으로의 파클리탁셀의 방출은 HPLC에 의해 여러 시간에 상기한 바와 같이 측정하였다.
E.결과
저 분자량 PDLLA(40분)는 담황색의 연질 물질이었다. 색채는 아마도 중축합시 동안 산화로 인한 것이다. 저 분자량 PDLLA(120분(황색) 및 160분(갈색))는 실온에서 취성인 고체였다. 이들 모두는 60℃에서 용융된다. 고 분자량 PDLLA 또는 PLGA와 저 분자량 PDLLA(40분)의 50:50 혼합물도 또한 약 60℃에서 용융된다.
방출 중에, 저 분자량 PDLLA(40분 및 120분)는 1일 내에 단편들로 파괴되고, 다른 물질들은 이러한 기록에 이르기까지 손상되지 않았다(3일).
제형 2 내지 5로부터 파클리탁셀의 방출은 도 14에 나타낸다. 저 분자량 PDLLA(40분 및 120분)는 페이스트의 붕괴로 인해 가장 신속한 방출을 제공한다. 저 분자량 PDLLA(160분)는 손상되지 않은 상태로 남아있는 펠릿으로 신속한 방출을 제공한다. 예를 들면, 10% 부하된 파클리탁셀이 1일 내에 방출되었다. 고 분자량 PDLLA 또는 PGLA와 저 분자량 PDLLA(40분)의 50:50 혼합물은 1일 내에 느리게, 즉, 3.4% 및 2.2% 방출되었다.
위에 구체적으로 기재하지 않았지만, 광범위한 다른 중합성 담체, 예를 들면(1) 저분자량(500 내지 10,000) 폴리(D,L-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(6-하이드록시카프로산), 폴리(5-하이드록시발레산), 폴리(4-하이드록시부티르산), 및 이들의 공중합체; (2) 상기 (1)번 화합물과의 혼합물; (3) 상기 (1)과 고분자량 폴리(D,L-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(6-하이드록시카프르산), 폴리(5-하이드록시발레산), 폴리(4-하이드록시부티르산), 및 이들의 공중합체와의 혼합물; 및 (4) 폴리(에틸렌 글리콜) 및 플루로닉과 폴리(D,L-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(6-하이드록시카프르산), 폴리(5-하이드록시발레산), 폴리(4-하이드록시부티르산), 및 이들의 공중합체의 혼합물을 제조할 수 있다.
실시예 10
수용성 첨가제 및 파클리탁셀을 함유하는 중합성 조성물의 제조
A.중합성 조성물의 제조
파클리탁셀/첨가제의 공-침전물의 미립자들을 제조하여 순차로 PCL에 첨가하여 페이스트를 형성하였다. 간단히 말해, 파클리탁셀 100mg을 95% 에탄올 0.5ml에 용해시키고, 증류수 1.0ml에 이미 용해 또는 분산된 첨가제 100mg과 혼합한다. 혼합물을 원활한 페이스트가 형성될 때까지 연마한다. 페이스트는 페트리 접시위에 살포하고, 37℃에서 밤새 통풍 건조시켰다. 건조된 괴상은 모르타르 및 막자를 사용하여 분쇄하여 메쉬 #140(160㎛) 체(엔드콧츠 테스트 시브즈 리미티드(EndecottsTest Sieves Ltd), 영국 런던)를 통해 통과시켰다. 이어서, 미립자(40%)를 65℃에서 20% 부하된 파클리탁셀에 상응하는 용융된 PCL(60%)에 혼입시켰다. 이 연구에 사용된 첨가제는 젤라틴(타입 B, 100 블룸, 피셔 사이언티픽), 메틸셀룰로스(브리티쉬 드러그 하우지즈(British Drug Houses)), 덱스트란, T500(파마시아, 스웨덴), 알부민(피셔 사이언티픽), 및 염화나트륨(피셔 사이언티픽)이다. 파클리탁셀 및 젤라틴 또는 알부민의 미립자들은 상기한 바와 같이 제조하지만, 메쉬#60(270㎛) 체(엔드콧츠 테스트 시브즈 리미티드, 영국 런던)를 통해 통과시켜 페이스트로부터 파클리탁셀의 방출에 대한 미립자 크기의 영향을 평가한다. 페이스트는 또한 PCL 중에 10, 20, 30% 젤라틴 및 20% 파클리탁셀을 함유하도록 제조함으로써, 약물 방출시 첨가제 비율의 효과를 연구한다. 달리 지적하지 않는 한, PCL 중에 분산된 20% 파클리탁셀을 함유하는 페이스트가 방출률 연구를 위한 대조용으로서 작용하도록 제조되었다.
B.약물 방출 연구
파클리탁셀 부하된 페이스트의 약 2.5mg 펠릿을 스크류-캡으로 덮인 관 내의 pH 7.4(PBS)의 10mM 인산염 완충 염수 50ml에 현탁하였다. 이 관을 37℃에서 끝에서 끝으로 회전시키고, 주어진 시간 간격으로 상청액 49.5ml를 제거하고, 0.45㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과되고, 파클리탁셀 분석을 위해 유지시켰다. 동일한 용적의 PBS를 각각의 관에 넣어 연구 내내 싱크 상태를 유지하였다. 분석을 위해, 여액을 3 x 1ml 디클로로메탄(DCM)으로 추출하고, DCM 추출물은 질소 기류 하에 증발 건조시키고, 아세토니트릴 1ml에 다시 용해시켰다. 이 분석은 1ml/분의 유속(벡크만 아이소크래틱 펌프), C18 역상 칼럼(벡크만) 및 232㎚에서 UV 검출(시마즈 SPD A)로 물:메탄올:아세토니트릴(37:5:58)의 이동상을 사용하여 HPLC에 의해 측정하였다.
C.팽윤 연구
메쉬 크기#140(및 젤라틴에 대해서만 #60)의 파클리탁셀-첨가제 미립자를 사용하여 제조한 파클리탁셀/첨가제/PCL 페이스트를 압출시켜 실린더를 형성하고, 조각들을 절단하고, 칭량하고, 각 조각의 직경 및 길이는 마이크로미터(미투토요 다이지메틱(Mitutoyo Digimatic))를 사용하여 측정하였다. 조각들을 37℃에서 증류수 10ml에 현탁시키고, 소정의 간격으로 물을 폐기하고, 원통형 조각의 직경 및 길이를 측정하고, 시료를 칭량하였다. 시료의 형태학(물에 현탁되기 전후)은 주사 전자 현미경(SEM)(히타치 F-2300)을 사용하여 조사하였다. 이들 시료는 험머 기구(테크닉스사, 미국)를 사용하여 60% Au 40% Pd(두께 10 내지 15㎚)로 코팅하였다.
D.병아리 배의 융모 요막(CAM) 연구
수정된, 가금류 병아리 배를 껍질 없는 배양 전에 4일 동안 항온배양시킨다. 계란 내용물을 90% 상대 습도 및 3% CO2에서 항온배양시키고, 항온배양시킨지 6일 째에, 6% 파클리탁셀, 25% 젤라틴 및 70% PCL을 함유하는 파클리탁셀 부하된 페이스트 또는 대조용 페이스트(PCL 중의 30% 젤라틴) 1mg 조각들을 CAM 표면상에 직접놓는다. 노출시킨지 2일 후, 혈관 구조는 비디오 카메라와 결부된 입체 현미경을 사용하여 조사하고, 비디오 신호는 컴퓨터 상에 디스플레이하고 비디오 프린트한다.
E.생체내 항종양 활성
20% 파클리탁셀, 20% 젤라틴 및 60% PCL을 함유하는 상기한 바와 같이 제조한 페이스트(파클리탁셀-젤라틴 미립자들의 메쉬 크기 140 분획을 사용함)를 각각의 주사기가 페이스트 150mg(파클리탁셀 30mg과 등가)을 함유하는 8 x 1ml 주사기(BD 인슐린 주사기, 1/2cc)에 충전시켰다. 18 내지 20g의 체중을 갖는 10주령의 DBA/2j 쥐 암컷(16)을 도착 후 4일 동안 적응시키고, 각각의 쥐에게 1일 째에 인산염 완충 염수 100㎕ 중의 MDAY-D2 종양 세포(10 x 106ml-1)를 후측면 옆구리에 주사하였다. 6일 째에, 쥐들을 8마리씩 2개의 군으로 나누고, 종양 부위를 마취하에 개방시켜 약 60℃로 이미 가열된 페이스트 150mg을 종양 부위에서 압출시키고, 상처를 닫았다. 한 군은 파클리탁셀-부하된 페이스트를 이식받고, 다른 군은 젤라틴 및 PCL 만을 함유하는 대조용 페이스트를 이식받았다. 16일 째에, 쥐들을 희생시키고, 쥐들의 체중 및 절개된 종양을 측정하였다.
F.결과 및 논의
공동-침전된 파클리탁셀 및 젤라틴 또는 알부민의 미립자들은 경질 및 취성이고, PCL에 삽입하기 용이한 한편, 다른 첨가제들은 페이스트의 제조 동안 파괴되는 경향을 보이는 연질 입자들을 생산하였다.
도 15는 PCL 중의 20% 파클리탁셀 또는 20% 파클리탁셀, 20% 첨가제 및 60% PCL을 함유하는 페이스트로부터 경시적으로 파클리탁셀 방출을 나타낸다. 첨가제의 존재 또는 부재하에 PCL로부터 파클리탁셀의 방출은 2상 방출 패턴에 따른다: 즉, 초기에 약물의 느린 방출이 뒤따르는 신속한 약물 방출 속도가 있다. 페이스트로부터 파클리탁셀의 신속한 방출 속도의 초기 기간은 페이스트의 표피 영역으로부터 파클리탁셀의 확산 또는 표면상에 위치하는 파클리탁셀의 용해에 기인하는 것으로 생각된다. 방출 프로필의 후속하는 느린 페이스는 용매와 접촉하는 약물 입자들의 유효 표면적 감소, 용매의 중합체 매트릭스로의 느린 진입 또는 중합체 매트릭스를 통한 약물의 평균 확산 경로의 증가에 기여할 수 있다.
PCL로부터 파클리탁셀의 방출 프로필의 2가지 상은 약물 방출 속도를 크게 증가시키는 젤라틴, 알부민 및 메틸셀룰로스를 갖는 친수성 첨가제의 존재하에 증가하였다(도 15). 작은 파클리탁셀-첨가제 입자들(106㎛)이 사용되는 것에 비해 페이스트를 제조하기 위해 보다 큰 파클리탁셀-첨가제 임자들(270㎛)이 사용될 때, 중합체 매트릭스로부터 파클리탁셀의 방출이 추가로 증가된다. 첨가제(예: 젤라틴)의 양이 증가함에 따라 약물 방출이 상응하여 증가한다(도 16). 도 17a는 20% 파클리탁셀, 20% 첨가제 및 60% PCL을 함유하는 페이스트의 팽윤 거동을 나타낸다. 팽윤 속도는 젤라틴>알부민>메틸셀룰로스>덱스트란>염화나트륨 순이다. 또한, 팽윤 속도는 높은 비율의 수용성 중합체가 페이스트에 첨가될 때 증가한다(도 17b). 젤라틴 또는 알부민을 함유하는 페이스트가 먼저 8 내지 10시간 내에 신속히 팽윤되고, 이어서, 시료의 용적 변화가 40% 이상일 때 팽윤 속도가 감소되었다. 보다 큰(270㎛) 파클리탁셀-젤라틴 입자들을 사용하여 제조한 페이스트는 작은(106㎛) 파클리탁셀-젤라틴 입자들로 제조한 것들보다 신속한 속도로 팽윤된다. 모든 페이스트는 용적 증가가 50% 이상일 경우 분해된다. SEM 연구는 페이스트의 팽윤이 매트릭스의 열분해에 의해 수행되었음을 보여준다(도 18). 큰 배율에서(도 18c 및 18D), 페이스트의 표면상에 바늘 또는 막대 형상의 파클리탁셀 결정이 존재하고, 팽윤 후 젤라틴과 치밀해진다는 증거가 있다(도 18c 및 18D).
소수성 중합체 중에 불연속 입자들로서 내포된 삼투제 또는 팽윤제, 친수성제는 매트릭스의 침식, 중합체 매트릭스를 통한 약물의 확산, 및/또는 가용성 첨가제의 용해에 의해 매트릭스 내에 생성된 공극을 통한 확산 및/또는 대류의 조합에 의해 약물 방출을 초래한다. 소수성 중합체 중에 분산된 삼투제 및 팽윤성 중합체는 물을 흡수하고(심지제(wicking agent)로서 작용), 용해 또는 팽윤되고, 인접한 입자들 사이의 격막(중합체 층)을 파열시킬 수 있고, 마이크로채널을 생성하고, 확산 또는 대류에 의해 주변 매질로 약물 분자의 새어나옴을 조장할 수 있도록 팽압을 사용한다. 페이스트 매트릭스(도 18)의 팽윤 및 열분해가 매트릭스 내부 전체에 마이크로채널을 형성하기 쉽다. 중합체 팽윤의 상이한 속도 및 정도(도 17)는 관찰된 파클리탁셀 방출 속도(도 15 및 도 16)에서의 차이를 설명할 수 있다.
도 19는 대조용 젤라틴-PCL 페이스트(도 19a) 및 20% 파클리탁셀-젤라틴-PCL 페이스트(도 19b)로 처리한 CAM을 나타낸다. CAM의 표면상의 페이스트는 도면에서 화살표로 나타낸다. 대조용 페이스트를 갖는 CAM은 정상적인 모세관 네트워크 구조를 보여준다. 파클리탁셀-PCL 페이스트로 처리한 CAM은 모세관 네트워크가 결여된 영역 및 혈관 퇴화를 일관되게 보여준다. 페이스트 내로 첨가제의 혼입은 구혈 영역의 직경을 현저하게 증가시킨다(도 19).
생체내 연구 결과를 도 20에 나타낸다. 간단히 말하자면, 파클리탁셀-젤라탄-PCL 페이스트를 확인되고 촉진된 종양을 갖는 쥐에게 종양 주위에 주사함으로써 이러한 제제가 대조용에 비해 종양 괴상을 평균적으로 63% 감소시킴을 보여준다. 또한, 치료 후 쥐에 체중에 대한 현저한 영향을 없었다. 파클리탁셀-PCL 페이스트(첨가제 없음)는 종양 괴상의 현저한 감소를 가져오지 못한다.
이러한 연구는 PCL로부터 파클리탁셀의 시험관내 방출이 파클리탁셀/친수성 중합체 미립자를 PCL 매트릭스에 혼입함으로써 증가될 수 있음을 보여준다. 쥐에서 피하 종양을 치료하는 데 있어서 제형의 효율을 평가하는 생체내 연구 역시 파클리탁셀/젤라틴/PCL 페이스트가 종양 괴상을 현저하게 감소시킴을 보여준다. 수용성 제제의 유형, 미립자 크기 및 첨가제 비율 등의 인자는 약물의 방출 특성에 영향을 미치는 것으로 보였다.
악성 과잉 성장에 의해 폐색된 관의 외막으로의 화학치료제 페이스트의 관 주변 주입은 국소적 종양 성장을 감소시킬 수 있고, 침입적인 수술 과정 없이 폐색 증상을 이완시킬 수 있다.
실시예 11
PDLLA-PEG-PDLLA 및 저 분자량 폴리(D,L 락트산)을 사용한 써모페이스트로부터 파클리탁셀 방출의 변형
A.PDLLA-PEG-PDLLA 및 저 분자량 PDLLA의 제조
DL-락트산은 알드리히사로부터 구매하였다. 분자량 8,000의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 옥토산 주석, 및 DL-락트산은 시그마사로부터 입수하였다. 분자량 20,000의 폴리-ε-카프로락톤(PCL)은 버밍햄 폴리머스사로부터 입수하였다(알라바마주 버밍햄 소재). 파클리탁셀은 하우저 케미칼스사(코네티컷주 볼더 소재)로부터 구입하였다. 좁은 분자량 분포를 갖는 폴리스티렌 표준은 폴리사이언시즈사(펜실베니아주 워링톤 소재)로부터 구입하였다. 아세토니트릴 및 염화메틸렌은 HPLC 등급(피셔 사이언티픽사 제품)이다.
PDLLA-PEG-PDLLA의 트리블록 공중합체를 개환 중합에 의해 합성하였다. 상이한 비율의 DL-락티드 및 PEG의 단량체들을 혼합하고, 0.5 중량% 옥토산 주석을 첨가하였다. 중합은 150℃에서 3.5시간 동안 수행하였다. 저 분자량 PDLLA는 DL-락트산의 중축합을 통해 합성하였다. 반응은 원활한 질소 퍼지, 기계적 교반, 및 180℃에서 1.5시간 동안 가열하는 조건하에 유리 플라스크에서 수행하였다. PDLLA의 분자량은 카복실산 말단기를 적정함으로써 측정한 바 약 800이었다.
B.페이스트 제형의 제조
20% 또는 30% 부하된 파클리탁셀을 PDLLA-PEG-PDLLA 공중합체 또는 약 60℃에서 용융된 PDLLA:PCL 90:10, 80:20 및 70:30의 혼합물에 철저히 혼합하였다. 파클리탁셀 부하된 페이스트를 칭량하여 1ml 주사기에 넣고, 4℃에서 저장하였다.
C.PDLLA-PEG-PDLLA 및 페이스트 혼합물의 특성화
PDLLA-PEG-PDLLA 공중합체의 분자량 및 분포는 104Å 휴렛 팩커드 플겔 칼럼에 결합된 시마즈 RID-6-A 굴절률 검출기(일본 교토) 및 시마즈 LC-10AD HPLC 펌프를 사용하는 GPC에 의해 상온에서 측정하였다. 이동상은 유속 1ml/분인 클로로포름이었다. 시료의 주입 용적은 0.2%(w/v)의 중합체 농도에서 20㎕였다. 중합체의 분자량은 폴리스티렌 표준에 대해 측정하였다. 25℃에서 CHCl3 중의 PDLLA-PEG-PDLLA의 고유 점도는 캐논-펜스케 점도계로 측정하였다.
공중합체들의 열 분석은 TA 기구 2000 조절기 및 듀퐁 910S DSC(델라웨어주 뉴캐슬 소재)를 사용하는 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 수행하였다. 가열 속도는 10℃/분이고, 공중합체 및 파클리탁셀/공중합체 매트릭스 시료를 칭량하여(3 내지 5mg) 크림프된 개방된 알루미늄 시료 팬에 넣었다.
1H 핵 자기 공명(NMR)은 중합체의 화학 조성을 측정하기 위해 사용하였다. 파클리탁셀 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA의 1H NMR 스펙트럼은 200MHz에서 NMR 기구(브루커, AC-200E)를 사용하여 CDCl3 중에서 얻었다. 중합체의 농도는 1 내지 2%였다.
파클리탁셀/PDLLA-PEG-PDLLA 페이스트의 형태학은 주사 전자 형미경(SEM)(히타치 F-2300)을 사용하여 연구하였다. 시료는 험머 기구(테크닉스사, 미국)를 사용하여 60% Au 및 40% Pd(두께 10 내지 15㎚)로 코팅하였다.
D.파클리탁셀의 시험관내 방출
20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA:PCL 페이스트의 적은 펠릿(약 2mg) 또는 20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA 페이스트의 실린더(바늘이 없는 주사기를 통해 용융된 페이스트를 압출시켜 제조함)를 알부민 0.4g/L와 인산염 완충 염수(PBS, pH 7.4) 10ml를 함유하는 캡이 덮인 14ml 유리관에 넣었다. 이 관을 원활하게 회전 혼합하면서 37℃에서 항온배양시켰다. 상청액을 파클리탁셀 분석을 위해 주기적으로 회수하고, 신선한 PBS/알부민 완충액으로 대체하였다. 상청액 10ml를 염화메틸렌 1ml로 추출하였다. 수상을 기울여 따라내고, 염화메틸렌 상을 60℃에서 질소 기류하에 건조시켰다. 건조된 잔기를 40:60 물:아세토니트릴 혼합물 중에서 재구성하고, 약 1분 동안 10,000g으로 원심분리시켰다. 이어서, 상청액 중의 파클리탁셀의 양은 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 110A 펌프 및 C-8 초음파 칼럼(베크만), 및 232㎚로 설정된 SPD-6A 자외선 검출기, SIL-9A 자동주입기 및 C-R3A 적분기(시마즈)를 사용하여 수행하였다. 주입 용적은 20㎕이고 유속은 1ml/분이었다. 이동상은 58% 아세토니트릴, 5% 메탄올 및 37% 증류수였다.
E.생체내 동물 연구
10주령의 DBA/2j 쥐 암컷을 도착 후 3 내지 4일 동안 적응시켰다. 각각의 쥐에게 1일 째에 PBS 100㎕ 중의 10 x 105 MDAY-D2 종양 세포를 후측면 옆구리에 피하로 주사하였다. 6일 째에, 쥐들을 무작위로 2개의 군으로 나누었다. 군 1에페이스트만을 이식하고(대조용), 군 2에 파클리탁셀 부하된 페이스트를 이식하였다. 종양 근처의 피하 포켓은 마취하에 수술로 형성하고, 용융된 페이스트 약 100mg(50 내지 60℃로 가온됨)을 포켓에 놓고, 상처를 닫았다. 16일 째에, 쥐들을 희생시키고, 종양을 제거하고, 칭량하였다. 소정의 기한 내에서 용이하게 측정할 수 있는 크기로 종양 성장을 허용하도록 16일이 선택되었다.
F.결과 및 논의
PDLLA-PEG-PDLLA의 분자량 및 분자량 분포는 폴리스티렌 표준에 상대적으로, GPC에 의해 측정하였다(도 21). 25℃에서 CHCl3 중의 공중합체의 고유 점도는 캐논-펜스케 점도계를 사용하여 측정하였다. 분자량 및 고유 점도는 PEG 함량이 증가함에 따라 감소되었다. PEG 함량이 10% 내지 40%인 PDLLA-PEG-PDLLA의 다분산도는 2.4 내지 3.5였다. 그러나, 70% PEG를 갖는 공중합체는 1.21의 다분산도를 갖는 좁은 분자량 분포를 가졌다. 이는 높은 PEG 함량이 중합체 분자량의 광범위한 분포를 초래하는 에스테르 교환 반응 등의 부반응 기회를 감소시키기 때문일 것이다. 대안으로, 소수성-친수성 블록 공중합체의 코일 구조는 인공적으로 낮은 다분산도 값을 초래할 수 있다.
순수한 PEG 및 PDLLA-PEG-PDLLA 공중합체의 DSC 스캔은 도 21 및 22에 제공된다. 70% 및 40%의 PEG 함량을 갖는 PEG 및 PDLLA-PEG-PDLLA는 공중합체의 PEG 함량이 감소됨에 따라 감소하는 엔탈피 및 온도를 갖는 흡열 피크를 보여주었다. 40% 및 70% PEG의 공중합체의 흡열 피크는 아마도 상분리의 발생을 지시하는 PEG영역의 용융에 기인한다. 순수한 PEG는 예리한 용융 피크를 갖는 한편, 70% 및 40% PEG 모두의 공중합체는 70% PEG의 경우에 뚜렷한 숄더를 갖는 폭이 넓은 피크를 보여주었다. 폭넓은 용융 피크는 PEG 결정화에 대한 PDLLA의 간섭으로 기인할 수 있다. 70% PEG의 경우에 숄더는 PDLLA 영역의 유리 전이를 나타낼 수 있다. 10 내지 250℃의 온도 범위에서 10%, 20% 및 30%의 PEG 함량을 갖는 공중합체에서 열 변화는 발생하지 않는다는 것은 현저한 결정화(따라서 상 분리일 수 있음)가 발생하지 않음을 나타낸다.
파클리탁셀의 부재하 또는 20% 파클리탁셀의 존재하의 PDLLA:PCL(70:30, 80:20, 90:10) 혼합물의 DSC 온도기록도는 PCL의 용융에 기인하여, 약 60℃에서 흡열 피크를 보여주고 있다. PDLLA의 무정형 특성 및 그의 낮은 분자량(800)으로 인해, PDLLA의 용융 및 유리 전이가 관찰되지 않았다. 파클리탁셀의 재결정화 또는 용융으로 인한 어떠한 열 변화도 관찰되지 않았다.
20% 및 30% PEG 함량의 PDLLA-PEG-PDLLA 공중합체는 하기 이유에서 페이스트에 대한 최적 제형 물질로서 선택되었다. 10% PEG의 PDLLA-PEG-PDLLA는 약 60℃의 온도에서 용융될 수 없다. 40% 및 70% PEG의 공중합체들은 60℃에서 용이하게 용융되고, 20% 및 30% PEG 중합체는 50℃ 내지 60℃에서 점성 액체로 된다. 수중 40% 및 70% PEG 공중합체의 팽윤이 매우 높아 수중 페이스트의 신속한 분산을 초래하였다.
PDLLA-PEG-PDLLA 실린더로부터 파클리탁셀의 시험관내 방출 프로필은 도 23에 나타낸다. 40% PEG 실린더로부터 방출을 측정하는 실험은 실린더가 매우 고도로 팽윤되고(1일 내에 약 200%의 물 흡수), 수일 내에 분해되기 때문에 종료되었다. 30% PEG 실린더로부터 파클리탁셀의 방출된 분획은 70일에 걸쳐 점진적으로 증가하였다. 20% PEG 실린더로부터 방출된 분획은 30일에 이르기까지 서서히 증가하고, 이어서 갑자기 증가하고, 또 다른 점진적인 증가 기간이 이어졌다. 개개의 실린더 각각(20% PEG 함량)이 파클리탁셀 방출에 있어서 갑작스런 변화를 보여주는 정도로 현저한 차이가 존재한다. 돌발적인 증가 전에, 파클리탁셀의 방출 분획은 동일한 실린더 직경(1mm)에서 낮은 PEG 함량의 공중합체에 대해 보다 적었다. 40% 및 30% PEG 실린더는 20% PEG 실린더보다 훨씬 더 큰 파클리탁셀 방출 속도를 보여주었다. 예를 들면, 30% PEG의 실린더는 20% PEG 실린더로부터의 2% 방출에 비해 30일 내에 17% 파클리탁셀을 방출하였다. 보다 작은 직경을 갖는 실린더는 신속한 방출 속도를 초래하였고, 예를 들면, 30일 이내에 0.65mm 및 1mm 직경을 갖는 30% PEG 실린더는 각각 26% 및 17%의 파클리탁셀을 방출하였다(도 23).
상기 관찰은 실린더로부터 파클리탁셀의 방출 메카니즘에 의해 설명될 수 있다. 파클리탁셀은 광학 현미경으로 관찰한 바 결정으로서 중합체 내에 분산되었다. 결정은 고온 단계 현미경으로 관찰한 바, 170℃에서 공중합체 매트릭스 내에 용해되기 시작하고, 180℃에서 완전히 용해되었다. 20% 파클리탁셀 부하된 PDLLA-PEG-PDLLA(30% PEG) 페이스트의 DSC 온도기록도는 180℃ 이후 공중합체 용융물로부터 파클리탁셀의 재결정화를 나타내는 파클리탁셀에 대한 작은 재결정화 발열(16J/g, 190℃) 및 용융 흡열(6J/g, 212℃)을 나타냈다(도 21). 이러한 유형의 약물/중합체 매트릭스에서, 파클리탁셀은 확산 및/또는 중합체 침식을 통해 방출될수 있다.
확산 조절된 경우, 약물은 접속된 약물 입자들에 의해 형성된 개방 채널을 통해서 및/또는 중합체 중의 분자 확산에 의해 방출될 수 있다. 따라서, 20% 부하에서 파클리탁셀의 일부 입자들이 단리되고, 파클리탁셀은 공중합체 중에 용해되고 이어서 확산됨으로써 방출될 수 있다. 파클리탁셀의 다른 입자들은 표면에 접속하는 클러스터를 형성하고, 채널 확산을 통해 방출될 수 있다. 모든 경우, 작은 치수의 실린더는 보다 짧은 확산 경로로 인해 약물을 보다 신속히 방출한다(도 23).
실린더의 치수 변화 및 수분 흡수율은 방출 동안 기록하였다(도 24). 30% PEG 실린더의 길이, 직경 및 습윤 중량의 변화는 20일 이내에 신속히 최대로 증가하고, 약 15일 동안은 변화되지 않고, 이어서 점차로 감소하였다. 실린더의 초기 직경은 팽윤 거동에 영향을 미치지 않았다. 20% PEG의 실린더에 대해, 길이는 1일 내에 10%로 감소되고, 안정해지고, 그 동안 직경 및 수분 흡수율은 시간이 경과함에 따라 점차로 증가하였다. 중합체 중에 보다 많은 PEG가 파클리탁셀의 확산을 고무시키기 위해 보다 많은 수분을 흡수하기 때문에, 보다 신속한 방출이 관찰되었다(도 23).
PDLLA-PEG-PDLLA 페이스트의 공중합체 분자량 저하는 GPC로 모니터링했다. 20% PEG 실린더에 대해, 피크 위치에서 용출 용적은 방출 실험 동안 감소된 중합체 분자량을 나타내는 시간에 따라 증가하였다(도 25). 2상 분자량 분포는 69일 째에 관찰되었다. 중합체 분자량은 30% PEG 실린더(1 mm 및 0.65mm)에 대해 역시 감소되었다. 그러나, 2상 분포는 관찰되지 않았다.
NMR 스펙트럼은 3.6 ppm에서 PEG 피크 및 1.65 ppm 및 5.1 ppm에서 PDLLA 피크를 나타낸다. 공중합체 중의 PDLLA에 대한 PEG의 피크 영역은 69일 후에 현저히 감소되고(도 26), 이는 PDLLA로부터 이의 해리 후 PEG의 분해를 나타낸다. 실린더의 건조 질량 손실 역시 기록하고(도 26), 저하 속도 감소는 30% PEG-0.65 mm>30% PEG-1mm>20% PEG-1mm 순으로 나타낸다.
파클리탁셀 방출 전 및 방출 동안의 건조된 실린더의 형태학적 변화는 SEM을 사용하여 관찰하였다(도 27). 간단히 말해, 고체 파클리탁셀 결정 및 비다공성 중합체 매트릭스는 방출 전에 나타났다(도 27a 및 27B). 방출된지 69일 후, 파클리탁셀 결정은 관찰되지 않았고, 매트릭스는 중합체 분해 및 수분 흡수로 인해 많은 공극을 함유하였다(도 27c 및 27D).
30% PEG 실린더는 물속에서 단지 2일 후 과도한 팽윤을 보였고(도 24), 따라서, 분리된 수용성 PEG 블록 및 분해된 PDLLA(즉, DL-락트산 올리고머)의 확산에 대한 장애는 감소되었다. 30% PEG 실린더의 질량 손실 및 분해는 계속되기 때문에, 침식 방출의 기여도가 점진적으로 증가하여 임의의 갑작스런 변화없이 파클리탁셀의 지속적인 방출을 초래한다(도 23). 20% PEG 실린더에 대해, 팽윤은 초기에는 낮아(도 24) 분해된 생성물들의 느린 확산을 초래하였다(도 24). 따라서, 내부 영역의 분해된 생성물들이 짧은 확산 경로로 인해 외부 영역에 훨씬 적은 분해 생성물이 존재하고 주로 보유된다. 올리고머의 카복실산 말단기는 가수분해성 분해를 촉매작용하기 때문에, 분해 생성물은 분해율을 가속화시킨다. 이는 2상 공중합체 분자량 분포로 나타낸 바와 같이 고분자량 껍질 및 저분자량 내부를 초래한다.(도 25, 69일째). 껍질 파열은 껍질의 강도, 두께 및 결함 및 내부 분해 생성물 등의 인자에 의존적이기 때문에, 내부 분해 생성물의 손실의 개시 및 그 정도는 매우 가변적이다. 껍질 파열은 일관적이지 않고, 중합체 중의 약물은 현미경으로 볼 때 균질하지 않기 때문에, 폭발적 방출의 시작점 및 폭발적 방출 정도는 시험된 4개의 시료에 대해 상이하였다(도 23).
PDLLA 및 PCL 혼합물 및 순수한 PCL로부터 파클리탁셀의 방출은 도 28에 나타낸다. 간단히 말해, 방출된 분획은 혼합물 중의 PDLLA 함량에 따라 증가하였다. 예를 들면, 10일 이내에, 80:20, 70:30, 및 1:100 PDLLA:PCL로부터 방출된 파클리탁셀은 각각 17%, 11% 및 6%였다. 1일 이내의 폭발적 방출 후, 80:20 PDLLA:PCL 페이스트로부터 거의 일정한 방출이 얻어졌다. 방출되는 중에 현저한 정도의 팽윤은 관찰되지 않았다. PDLLA:PCL 혼합물에 대해, PDLLA는 약 800의 매우 작은 분자량을 갖기 때문에, 질량 손실의 긴 지연 없이 수용성 생성물에 신속히 가수분해되었다. PCL은 페이스트가 신속히 분해되는 것을 방지하기 위한 "지지(holding)" 물질로서 작용하였다. 따라서, 방출 속도는 증가된 분해에 기인하는 혼합물 중의 PDLLA 함량에 따라 증가하였다. PDLLA의 연속적인 침식은 파클리탁셀의 방출을 조절하고, 일정한 방출을 초래하였다. 순수한 PCL로부터 파클리탁셀의 방출은 아마도 PCL의 느린 분해 속도(1 내지 2년)로 인해 조절된 확산이다.
항온배양된지 24시간 이내의 페이스트 펠릿들의 분해로 인해 20% 파클리탁셀 부하된 90:10 PDLLA:PCL에 대한 방출 연구에 있어서 어려움이 있었다. 간단히 말해, 최초로 12시간 동안 항온배양하는 동안, 파클리탁셀 방출에 대한 싱크 조건을확인하기 위해 시료들을 매시간 취하였다. 90:10 페이스트로부터 방출된 파클리탁셀은 10시간 이내에 25 내지 35%였다.
쥐에서 종양 성장을 퇴화시키는 페이스트 제형의 효율을 평가하였다(도 29). 간단히 말해, 조사된 페이스트들은 PCL±20% 파클리탁셀, 80:20 PDLLA:PCL±20% 파클리탁셀, 90:10 PDLLA:PCL±20% 파클리탁셀 및 PDLLA-PEG-PDLLA(30% PEG)±20% 파클리탁셀이었다. 파클리탁셀을 함유하는 페이스트 제형, 90:10 PDLLA:PCL 및 PDLLA-PEG-PDLLA는 생체내 종양 성장을 각각 54% 및 40%로 감소시켰다. 이와는 대조적으로, 파클리탁셀을 함유하는 페이스트 제형, PCL 및 80:20 PDLLA:PCL은 종양 성장에 대해 거의 영향을 미치지 않거나 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 모든 대조용 페이스트(약물 부재)는 종양 성장에 대해 현저한 영향을 미치지 않았다. 파클리탁셀의 신속한 방출 속도를 갖는 페이스 제형들(90:10 PDLLA:PCL 및 PDLLA-PEG-PDLLA)은 종양 성장을 감소시키는 데 보다 효과적이고, 파클리탁셀의 임계 국소 농도가 종양 성장을 억제하기 위한 종양 부위에 요구된다는 것을 제안하고 있다. PCL 및 80:20 PDLLA:PCL 등의 파클리탁셀을 서서히 방출하는 페이스트 제형들은 효과적이지 못하다. 조사된 모든 페이스트 제형들은 쥐의 체중에 대해 현저한 영향을 전혀 미치지 않으므로, 파클리탁셀 부하된 페이스트가 생체 내에서 매우 내성이 있음을 나타낸다.
이들 데이터는 종양 부위에 파클리탁셀을 국소 도포하는 것이 전신 독성을 증가시키지 않고, 국소적 종양 성장을 억제하기에 효과적인 치료술임을 제안한다. 파클리탁셀 부하된 제형이 종양 성장을 완전히 억제하는 데 있어서의 무능은 대부분 중합체로부터 파클리탁셀의 불충분한 방출 및 MDAY-D2 종양의 신속한 종양 성장으로 인한 것이다. 20% 파클리탁셀을 함유하는 90:10 PDLLA:PCL 페이스트보다 많은 파클리탁셀을 방출하고 종양 성장을 보다 효과적으로 억제하는 30% 파클리탁셀을 함유하는 90:10 PDLLA:PCL 페이스트의 능력은 이러한 점에서 일치한다. 따라서, 투여 부위 뿐만 아니라 중합체 및 화학치료제의 특성에 의해 조절되는 파클리탁셀의 방출 속도의 조절은 종양 성장을 억제하기 위한 국소 치료법을 개발하는 데 있어서 중요한 단계이다.
실시예 12
PCL 미소구의 제조: 저울 연구
미소구 50g을 하기 용매 증발법을 사용하여 PCL(공칭 분자량 80,000)을 사용하여 제조하였다.
A.방법
염화메틸렌 중의 10% PCL 500ml의 제제 및 1% PVA(몰중량: 13,000 내지 23,000; 99% 가수분해됨)의 용액 4000ml를 40으로 설정된 가감 저항기(rheostat)로 조절된 호모 믹서를 사용하여 10시간 동안 유화시켰다. 미소구들이 바닥에 침전될 때까지 혼합물을 체#140을 사용하여 변형시키고, 상청액을 기우려 따라냈다. 이어서 제제를 증류수로 3회 세척하고(침전에 이어 기우려 따라내기 방법을 사용함), 증류수 250ml 중에 재현탁시키고, 여과시켰다. 이어서, 미소구들을 37℃에서 밤새통풍 건조시켰다.
B.결과
미소구 수율은 다음과 같다:
PCL의 초기 중량 = 50.1g
얻어진 미소구의 중량 = 41.2g
수율% = (43.2/50.0) x 100
= 86.4
수율(10 내지 50㎛) 약 72%
평균 크기 21.4㎛, 중간 22.0㎛ 모드 24.7㎛
보다 좁은 크기 범위(20 내지 40㎛)는 체질하고, 침전 방법을 사용하여 분리함으로써 얻을 수 있다.
실시예 13
PLGA 미소구의 제조
미소구는 (PLLA)락트산-글리콜산(GA) 공중합체로부터 제조하였다.
A.방법
미소구들은 표준 방법을 사용하여 0.5 내지 10㎛, 10 내지 20㎛ 및 30 내지 100㎛의 크기 범위로 제조하였다(중합체는 디클로메탄에 용해시키고, PCL 및 PDLLA미소구 제조법에 이미 기재된 바와 같이 교반하에 폴리비닐 알콜 용액 중에서 유화시켰다). PDLLA의 GA에 대한 다양한 비율은 상이한 분자량을 갖는 중합체로서 사용되었다[고유 점도(I.V.)로 주어짐].
B.결과
미소구들은 하기 출발 중합체로부터 성공적으로 제조하였다:
PLLA : GA I.V.
50 : 50 0.74
50 : 50 0.78
50 : 50 1.06
65 : 35 0.55
75 : 25 0.55
85 : 15 0.56
10% 또는 20% 부하된 파클리탁셀을 이들 모든 미소구에 성공적으로 혼입하였다. 하나의 출발 중합체(85:15, IV=0.56)에 대한 크기 분포의 예는 도 31 내지 34에 제공된다. 파클리탁셀 방출 실험은 여러 가지 크기 및 여러 가지 조성물의 미소구들을 사용하여 수행하였다. 방출 속도는 도 35 내지 38에 나타낸다.
실시예 14
디-블록 공중합체
폴리(DL-락티드)-블록-메톡시 폴리에틸렌 글리콜(PDLLA-MePEG), 폴리카프로락톤-블록-메톡시 폴리에틸렌 글리콜(PCL-MePEG) 및 폴리(DL-락티드-코-카프로락톤)-블록-메톡시 폴리에틸렌 글리콜(PDLLACL-MePEG)의 디블록 공중합체는 벌크 용융 중합 공정을 사용하여 합성하였다. 간단히 말해, 상이한 분자량을 갖는 주어진 양의 단량체 DL-락티드, 카프로락톤 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 질소 기포 및 교반하에 용융되도록 가열하였다(130℃). 옥토산 주석 촉매(0.2% w/w)를 용융된 단량체들에 첨가하였다. 중합은 4시간 동안 수행하였다. 분자량, 임계 미셀 농도 및 최대 파클리탁셀 부하량은 GPC, 형광, 및 용해 시험 각각에 의해 측정하였다(도 39). 큰 파클리탁셀 운반 용량이 얻어졌다. 파클리탁셀의 용해 능력은 공중합체의 조성 및 농도에 의존한다(도 39 및 40). PDLLA-MePEG는 가장 안정한 용해된 파클리탁셀을 제공한다(도 40 및 41).
실시예 15
나일론 마이크로캡슐 내의 파클리탁셀의 캡슐화
A.파클리탁셀-부하된 마이크로캡슐의 제조
파클리탁셀을 계면 중합 기술을 사용하여 나일론 마이크로캡슐 내로 캡슐화하였다. 간단히 말해, 파클리탁셀 100mg 및 플루로닉 F-127 100mg을 디클로로메탄(DCM) 1ml에 용해시키고, 아디포일 클로라이드(ADC) 0.4ml(약 500mg)를 첨가하였다. 이 용액을 폴리트론 균질화기(1로 설정)를 사용하여 15초 동안 2% PVA 용액내로 균질화하였다. 증류수 5ml 중의 1,6-헥산-디아민(HMD)의 용액을 균질화하면서 적가하였다. HMD 용액을 첨가한 후 혼합물을 추가로 10초 동안 균질화시켰다. 혼합물을 비이커로 옮기고, 자기 교반기로 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원심분리하고, 수집하여 증류수 1ml에 재현탁시켰다.
B.캡슐화 효율/파클리탁셀-부하
현탁액 약 0.5ml를 여과시키고, 미소구들을 건조시켰다. 마이크로캡슐 약 2.5mg을 칭량하고, 아세토니트릴 10ml에 24시간 동안 현탁시켰다. 상청액을 파클리탁셀에 대해 분석하고, 결과를 파클리탁셀의 백분율로서 표현하였다. 예비 연구는 파클리탁셀이 고부하율(60% 이하) 및 고캡슐화 효율(80% 초과)로 나일론 마이크로캡슐 내에 캡슐화될 수 있음을 나타냈다.
C.파클리탁셀 방출 연구
파클리탁셀-나일론 미소구 약 2.5mg을 염화나트륨 및 우레아 각각을 1M 함유하는 물 50ml에 현탁시키고, 주기적으로 분석하였다. 마이크로캡슐로부터 파클리탁셀의 방출은 72시간 후 95% 이상의 약물이 방출됨과 함께 신속하였다(도 42).
실시예 16
중합성 미셀형 파클리탁셀
PDLLA-MePEG는 소수성(PDLLA) 영역 및 친수성(MePEG) 영역을 갖는 블록 공중합체이다. 적절한 분자량 및 화학적 조성에서, 이들은 소수성 PDLLA 코어 및 친수성 MePEG 껍질의 미셀을 형성한다. 파클리탁셀은 소수성 코어에 부하될 수 있고, 이에 의해 증가된 "용해도"를 갖는 파클리탁셀을 제공한다.
A.PDLLA-MePEG의 디블록 공중합체의 합성
메톡시 폴리에틸렌 글리콜(예: 분자량 2000, 150g) 및 DL-락티드 100g의 단량체들을 환저 플라스크에 첨가하고, 온도를 130 내지 150℃로 증가시켰다. 단량체들의 용융 후, 옥토산 주석 촉매 0.6g을 첨가하였다. 중합은 0시간 내에 완료되었다. 반응은 N2의 보호 및 교반하에 진행되었다.
B.미셀형 파클리탁셀의 제조
PDLLA-MePEG 공중합체를 아세토니트릴 또는 50:50 에탄올:아세톤(중합체 농도 <40%)에 용해시킨다. 중합체 용액을 5분 동안 원심분리한다(14000rpm). 상청액(불용성 중합체를 버림)을 유리 시험관에 옮겼다. 파클리탁셀을 아세토니트릴 또는 50:50 에탄올:아세톤에 용해시키고, 정제된 중합체 용액에 첨가했다. 와동 혼합 후, 용매를 60℃에서 질소 기류 하에 증발시킨다(전형적인 40mg 파클리탁셀 배치에 대해 일반적으로 2시간 소요). 잔류 용매는 진공 및 열을 가함으로써 제거될 수 있다. 매트릭스는 투명한 겔로 될 때까지 약 60℃에서 가열한다. 이어서, 특정 용적의 물(매트릭스 중량의 4배 초과)을 매트릭스에 첨가한다. 이는 파클리탁셀/중합체 매트릭스가 용해될 때까지 와동 혼합 직후에 행한다. 제형은 표 2에제공된다.
C.미셀형 파클리탁셀/써모겔화 중합체의 전달 시스템의 제조
폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 등의 써모겔화 중합체를 증류수에 용해시켰다. 별개로, 물을 미셀형 파클리탁셀/중합체 매트릭스, 예를 들면 10% 파클리탁셀 부하된 PDLLA-MePEG 2000-40/60에 첨가하여 미셀형 파클리탁셀 용액을 형성한다. 모든 용액을 냉각시키고(예: 4℃), 혼합시켜 열 겔화 전달 시스템을 형성한다.
실시예 17
약물 방출의 분석
공지된 중량의 중합체(전형적으로 2.5mg 펠릿)를 10 mm Na2HPO4·NaH2PO4, 0.145 m NaCl 및 0.4g/l 소 혈청 알부민을 함유하는 완충액 14ml를 함유하는 15ml 들이 시험관에 첨가하였다. 관에 캡을 씌우고, 37℃에서 회전시켰다. 특정 시점에서, 액체 완충액 14ml 전부를 제거하고, 신선한 액체 완충액으로 대체하였다.
액체 완충액은 염화메틸렌 1ml에 첨가되고, 1분 동안 진탕되어 모든 파클리탁셀을 염화메틸렌 중으로 추출한다. 이어서, 수성 상을 제거하고, 염화메틸렌상을 질소하에 건조시킨다. 이어서, 잔류물을 60% 아세토니트릴:40% 물에 용해시키고, 용액을 하기 조건: C8 칼럼(벡크만 기구, 미국), 58%:5%:37% 아세토니트릴:메탄올:물의 이동상을 사용하여 1ml/분의 유속으로 HPLC 시스템 상에 주입한다.
이어서, 파클리탁셀에 대해 수집된 완충액을 232㎚에서 분석한다. MTX에 대해, 수집된 완충액은 염화메틸렌 중에서 추출할 필요가 없는 HPLC 칼럼에 직접 도포한다. MTX는 302㎚에서 분석된다. 바나듐 함유 화합물에 대해, 액체 완충액은 200 내지 300㎚ 범위의 UV/VIS 분광분석계를 사용하여 직접 분석한다.
실시예 18
종양 성장 및 생체내 종양 혈관 형성에 대한 파클리탁셀-부하된 써모페이스트의 효과
수정된 가금류 병아리 배를 이들의 껍질을 제거하기 전 3일 동안 항온배양시킨다. 계란 내용물은 기실 둘레에 위치하는 껍질을 제거하고, 내부 껍질 멤브레인을 분리하고, 껍질의 반대쪽 말단을 천공시키고, 계란 내용물을 무뎌진 단부로부터 원활하게 미끌어지게 한다. 이 내용물을 멸균시킨 환저 유리 용기에 넣고 페트리 디쉬 커버로 덮어 90% 상대 습도 및 3% 이산화탄소에서 항온배양시킨다.
MDAY-D2 세포(쥐의 임파종)를 쥐에 주사하고, 종양이 0.5 내지 1.0g으로 칭량될 때까지 성장시켰다. 쥐를 희생시키고, 종양 부위를 알콜로 닦고, 절개하고, 멸균 조직 배양 배지에 넣고, 층류 후드하에 1 mm 조각으로 자른다. 절개된 종양을 9일령 병아리 배에 넣기 전에, CAM 표면을 30 게이지 바늘로 원활하게 스크랩하여 종양 이식을 보장한다. 이어서, 종양을 항온배양한지 8일 후(껍질 제거한지 4일후) CAM 상에 놓고, CAM 상에서 4일 동안 성장시켜 혈관 공급을 확인한다. 4개의 배는 이러한 방법을 사용하여 제조하고, 각각의 배는 3개의 종양을 수용한다. 이들 배에 대해, 1개의 종양은 20% 파클리탁셀 부하된 써모페이스트를 수용하고, 제2 종양은 부하되지 않은 써모페이스트를 수용하고, 제3 종양은 처리되지 않는다. 치료는 결과가 기록되기 전 2일 동안 계속된다.
외식(外植)된 MDAY-D2 종양은 이 종양 괴상에 모세관 내부성장(CAM으로부터 유도됨)을 유도하고, 크기 성장을 계속하게 하는 혈관 형성 인자를 분비한다. 종양의 모든 혈관은 CAM으로부터 유도되기 때문에, 모든 종양 세포들이 외식편으로부터 유도되는 동안, 이들 2개의 공정에 대한 치료 개입의 효과를 독립적으로 평가할 수 있다. 이러한 분석은 (a) 종양의 혈관화 억제 및 (b) 종양 세포 자체의 성장 억제에 대한 파클리탁셀-부하된 써모페이스트의 유효성을 측정하는데 사용되었다.
이 연구로부터 고정된 조직의 조직학적 조사 및 직접적인 생체내 입체 현미경 평가는 다음과 같이 나타냈다. 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트로 처리한 종양에서, 종양을 공급하는 혈관 수의 감소(도 70c 및 70D 참조), 종양 내의 혈관 수의 감소, 및 대조용 종양에 비교할 때(도 70a 및 70B) 종양(전형적으로 충실성 종양에서 가장 고도로 혈관화된 영역) 주변의 혈관 수의 감소를 가져왔다. 종양은연구를 수행한 2일 동안 크기 및 질량이 감소되기 시작하였다. 또한, 수많은 내피 세포들이 세포 분할에서 정지되는 것으로 보이고, 이는 내피 세포 증식이 영향받음을 나타낸다. 종양 세포들은 유사 분열에서 빈번하게 정지되는 것으로 보였다. 모두 4개의 배는 부하되지 않은 써모페이스트가 영향을 받지 않으면서 종양 혈관질을 억제하는 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트와 일치하는 패턴을 보여준다.
비교하자면, 부하되지 않은 써모페이스트로 처리한 CAM에서, 종양은 정상적인 주변 조직과 비교할 때 혈관의 수 및 밀도가 증가함에 따라 잘 혈관화되고, 파클리탁셀-부하된 페이스트로 처리한 종양에서 관찰된 것보다 극적으로 더 많은 혈관이 존재한다. 새롭게 형성된 혈관들은 휠 중심에 부착된 스포크 같이 보이는 모든 각도로부터 종양을 도입하였다(도 70a 및 70B). 대조용 종양은 연구 과정에서 크기 및 질량이 계속 증가하였다. 조직학적으로, 수많은 팽창된 박벽의 모세관이 종양 주변에 나타나고, 소수의 내피가 세포 분할되는 것으로 보였다. 종양 조직은 잘 혈관화되고, 시종 가시적이다.
예로써, 동일한 CAM 상에 놓인 2개의 유사한 크기의(초기에, 0 외식시) 종양에서 다음 데이터가 얻어졌다. 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트로 처리한 종양에 대해, 종양은 330mm x 597mm로 측정되었고; 종양 바로 주변은 14개의 혈관을 갖고, 종양 괴상은 단지 3 내지 4개의 작은 모세관을 갖는다. 부하되지 않은 써모페이스트로 처리한 종양에 대해, 종양 크기는 623mm x 678mm이었고; 종양 바로 주변은 54개의 혈관을 갖고, 종양 괴상은 단지 12 내지 14개의 작은 혈관을 갖는다. 또한, 주변 CAM 자체는 파클리탁셀-처리된 종양 주변 영역에 비해 많은 혈관을 함유하였다.
이러한 연구는 써모페이스트가 충분한 양의 증식억제제(이 경우 파클리탁셀)를 방출함으로써 종양 성장 및 진전을 수반하는 병리학적 혈관 형성을 억제한다는 것을 나타낸다. 이들 조건하에, 혈관 형성은 주변 조직으로부터 종양 괴상로의 모세관 내부성장을 유발할 수 있는 혈관 형성 인자를 생산하는 종양 세포에 의해 최대로 자극된다. 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트는 이러한 공정을 봉쇄할 수 있고, 적절한 혈액 공급을 유지하는 종양 조직의 능력을 제한한다. 이는 종양 세포 자체에 대한 약물의 세포 독성 효과를 통해서 및 성장 및 팽창에 필요한 영양 조직을 박탈함으로써 종양 괴상의 감소를 초래한다.
실시예 19
쥐의 종양 모델에서 생체내 종양 성장에 대한 치료제-부하된 써모페이스트의 효과
쥐의 MDAY-D2 종양 모델을 사용하여 종양 성장, 종양 전이 및 동물 생존에 대한 파클리탁셀 등의 항증식성 화합물의 국소 서방출 효과를 조사할 수 있다. 간단히 말하자면, MDAY-D2 종양 세포주는 α-mem 매질 중의 5% 소의 태아 혈청으로 구성된 세포 현탁액 중에서 성장한다. 세포들은 5% 이산화탄소로 보충된 가습 대기 중에서 37℃에서 항온배양시키고, 충분한 수의 세포들이 얻어질 때까지 3일 마다 15배로 희석한다. 항온배양 기간에 이어, 세포들은 생존력에 대해 광 현미경에 의해 조사하고, 이어서 5분 동안 1500rpm을 원심분리하였다. PBS를 세포에 첨가하여 1,000,000개 세포/ml의 희석도를 얻었다.
10주령의 DBA/2j 쥐 암컷을 도착 후 3 내지 4일 동안 적응시켰다. 각각의 쥐에게 PBS 100ml 중의 100,000 MDAY-D2 세포를 후측면 옆구리에 피하로 주사하였다. 선행 연구들은 이러한 절차가 3 내지 4일 내에 주사 부위에서 눈에 보이는 종양을 생성하고, 크기가 14일까지는 1.0 내지 1.7g에 달하고, 주사 후 19 내지 25일 째에 간에서 눈에 보이는 전이를 생성한다는 것을 나타냈다. 연구 목적에 따라, 치료제 개입은 질병이 진전되는 임의의 시점에서 시작될 수 있다.
상기 동물 모델을 사용하여, 20마리 쥐에게 140,000 MDAY-D2 세포를 피하로 주입하고, 종양을 성장시켰다. 5일 째에, 쥐들을 5개의 군으로 나누었다. 종양 부위는 마취하에 수술로 개방시키고, 존재하는 종양 조직을 저해하지 않고 국소 영역을 약물-부하된 써모페이스트 또는 대조용 써모페이스트로 처리하고, 상처를 닫았다. 5개의 군은 처리하지 않음(상처가 단지 폐쇄됨), 중합체(PCL) 단독, 10% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트, 또는 종양 부위에 인접하여 이식된 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트(단지 4마리의 동물에게 주사됨)를 수용한다. 16일 째에, 쥐들을 희생시키고, 종양을 절단하고, 종양 성장, 종양 전이, 치료로부터 기인하는 국소 또는 전신 독성, 상처 치유에 대한 효과, 종양 혈관화에 대한 효과, 및 절개 부위에 남아있는 페이스트의 상태에 대해 (총체적으로 그리고 조직학적으로) 조사하였다.
각각의 동물에 대한 종양의 중량은 아래 표 3에 나타낸다:
20% 파클리탁셀로 부하된 써모페이스트는 대조용 동물(평균 체중 0.681)에 비교한 바 종양 성장을 85% 이상(평균 중량 0.105)까지 감소시켰다. 써모페이스트 단독 또는 10% 파클리탁셀을 함유하는 써모페이스트로 처리한 동물들은 종양 성장에 대해 크지 않은 효과를 갖고; 종양 중량은 각각 단지 10% 및 25%까지 감소시켰다(도 43a). 따라서, 20% 파클리탁셀을 함유하는 써모페이스트는 10% 파클리탁셀을 함유하는 써모페이스트보다 종양 성장을 감소시키는 데 더 효과적이었다(도 43c; 도 43b 참조).
써모페이스트는 일부 동물의 투여 부위에서 검출되었다. 0.026g 내지 0.078g의 변화하는 중량의 중합체는 15마리의 쥐들중 8마리에서 검출되었다. 20% 파클리탁셀-부하된 써모페이스트를 함유하는 군의 모든 동물은 일부 잔류 중합체를 함유함으로써 용해되기 쉽지 않다는 것을 제안한다. 조직학적으로, 파클리탁셀-부하된 써모페이스트로 처리된 종양은 대조용 종양보다 적은 세포질 및 많은 조직 괴사를 함유하였다. 혈관 구조는 감소되고, 내피 세포들은 빈번히 세포 분열로 저지되는 것으로 보였다. 파클리탁셀-부하된 써모페이스트는 종양 주변의 피부 또는 조직의 보전성 또는 세포질에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다. 총체적으로, 상처치유는 영향받지 않는다.
실시예 20
쥐에서 부분적으로 절개된 RIF-1 종양의 재성장을 지연시키기 위한 파클리탁셀-부하된 수술용 페이스트의 사용
C3H/HeJ 쥐에서 부분적으로 절개된 RIF-1 종양의 재성장을 지연시키는 데 있어서 파클리탁셀의 수술용 페이스트 제형의 생분해성 중합성 서방출 효과를 조사하였다.
A.방법
파클리탁셀(20%)을 폴리(ε-카프로락톤) 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 4:1 혼합물에 혼입하였다. 37℃에서 알부민을 함유하는 인산염 완충 염수(0.4mg/mL) 중의 이러한 제형에 대한 시험관내 방출 프로필은 파클리탁셀에 대한 HPLC 분석을 사용하여 조사하였다. 간단히 말하자면, 17마리의 쥐들에게 행크스 완충액 중의 RIF-1 세포 현탁액(1.0 x 106 세포) 100㎕를 우측 옆구리에 주입하였다. 종양을 5일 동안 성장시킨 후 각각의 종양의 70% 이상을 수술에 의해 절개하고, 나머지 종양 괴상은 미처리한 채 방치하거나, 또는 20 내지 30㎕의 수술용 페이스트 중의 20% 파클리탁셀 또는 수술용 페이스트 단독(약물 없음)으로 코팅시킨다. 이 때가 0일 째이다. 피부 아래에 보이는 종양 괴상의 치수는 4 내지 7일 및 9일 째에 측정하였다. 이와 같이 가시되는 원통형 종양 표면적은 종양 용적(r=0.812)과 연관되는 것으로 보인다.
B.결과
파클리탁셀의 시험관내 방출 곡선은 초기 1일 째에 폭발적 상에 이어 장기간의 느린 서방출을 특징으로 한다. 4 내지 9일째에 각각의 쥐로부터 눈에 보이는 원통형 종양 표면적을 표 4에 나타낸다. 파클리탁셀을 수용하지 않은 2개의 군 각각에서 1마리를 제외한 모든 쥐는 4일까지 과도한 종양 재성장을 보였다. 중합체 만을 수용한 1마리의 쥐는 지연된 종양 재성장을 보여주는 한편, 처리하지 않은 한 마리 쥐는 재성장되지 않음을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 파클리탁셀 수술용 페이스트로 처리한 모든 쥐들 중 하나 이외에는 적어도 5일째까지 종양 재성장을 보이지 않았고, 2마리 쥐는 6일째까지 재성장을 보이지 않았다.
C.결론
파클리탁셀-부하된 페이스트는 1일 내지 5일 사이에 종양 재성장을 현저하게 억제하였다. 재성장은 세포주의 침략성으로 인해 6일 후에 발생하였다.
실시예 21
수라민의 캡슐화
디클로로메탄("DCM") 중의 5% ELVAX(5% 비닐 아세테이트로 가교된 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)) 1ml를 서브-미크론 미분된 나트륨 수라민의 고정량과 혼합한다. 이러한 혼합물은 30ml 들이 편평한 바닥의 시험관에서 수중 5% 폴리비닐 알콜("PVA") 5ml에 주입한다. 이어서, 상이한 중량의 약물을 함유하는 시험관을 자동 교반과 함께 90분 동안 40℃에서 다중-시료 수조에 현탁시킨다. 혼합물을 제거하고, 미소구 시료를 크기 분석을 위해 취하였다. 시험관을 5분 동안 1000g으로 원심분리시켰다. PVA 상청액을 분리하여, 분석용으로 저장했다(캡슐화되지 않은 약물). 이어서, 미소구들을 물 5ml 중에서 세척하고(와동), 다시 원심분리하였다. 세척액 5ml를 분석을 위해 모아두었다(표면 결합 약물). 이어서, 미소구들을 메탄올 50㎕로 습윤시키고, DCM 1ml 중에 와동시켜 ELVAX를 용해시킨다. 이어서, 미소구들을 40℃로 가온시키고, 50℃의 물 5ml를 교반하에 서서히 적가하였다. 이러한 공정은 DCM의 즉각적인 증발을 초래함으로써, 물 5ml로의 나트륨 수라민의 방출을 유발한다.
모든 시료는 형광의 정량화에 의해 약물 함량에 대해 분석하였다. 간단히 말하자면, 나트륨 수라민은 312㎚의 λmax에 따라 UV/VIS를 흡수한다. 이러한 흡수는 물 및 5% PVA 둘 다에서 0 내지 100㎍/ml로 선형이다. 나트륨 수라민은 또한 312㎚에서 최대 여기 상태이고, 400㎚에서 최대 방출 상태인 강한 형광을 낸다. 이러한 형광은 0 내지 25㎍/ml 범위로 정량화될 수 있다.
이들 실험 결과는 도 44 내지 50에 나타낸다. 간단히 말하자면, 수 단위(도 44) 또는 중량 단위(도 45)의 미소구의 크기 분포는 DCM에 약물을 포함시킴으로써 변하지 않는 것으로 보인다. 20 내지 60㎛ 범위의 미소구의 양호한 수율이 얻어질수 있다.
수라민의 캡슐화는 매우 낮다(<1%)(도 47 참조). 그러나, 약물의 중량이 DCM에서 증가함에 따라, 캡슐화된 약물의 전체 양은 캡슐화율(%)이 감소되더라도 증가하였다. 도 46에 나타낸 바와 같이, 약물 50㎍은 ELVAX 50mg 중에 캡슐화될 수 있다. 10% NaCl을 함유하는 2.5% PVA 중에 나트륨 수라민의 캡슐화는 도 48에 나타낸다(중량 단위의 크기 분포). 10% NaCl을 함유하는 5% PVA 중에 나트륨 수라민의 캡슐화는 도 49 및 50에 나타낸다(각각 중량 단위 및 수 단위 크기 분포).
잠재적인 혈관 형성 방지제로서 코르티손 아세테이트 및 수라민을 평가하기 위해, 각각의 제제는 0.5% 메틸셀룰로오스와 혼합하고, 제제를 함유하는 건조된 디스크를 6일령의 CAM의 전개 혈관 상에 도포하였다. 코르티손 아세테이트 20㎍과 수라민 70㎍의 병용 치료는 48시간 동안 CAM에 대해 시험될 때 혈관 형성을 억제하는 데 성공적이었다. 생성된 구혈 영역은 6 mm 직경으로 측정되었고, 혈류의 부재 및 빈약한 혈액 섬의 출현을 나타냈다(도 51a 및 51B).
실시예 22
메토트렉세이트-부하된 페이스트
A.메토트렉세이트-부하된 페이스트의 제조
메토트랙세이트("MTX"; 시그마 케미칼 캄파니사)를 막자 및 약절구로 분쇄하여 입자 크기를 5μ 이하로 감소시킨다. 이어서, 이를 건조 분말로서 폴리카프로락톤(분자량 18000, 버밍햄 폴리머스, 미국 알라바마주)과 혼합한다. 혼합물을 65℃까지 5분 동안 가열하고, 용융된 중합체/메토트렉세이트 혼합물을 원활한 페이스트가 되도록 5분 동안 교반시킨다. 이어서, 용융된 페이스트는 1ml 주사기에 넣고, 목적하는 바와 같이 압출시킨다.
B.결과
결과는 도 52a 내지 E에 나타낸다. 간단히 말해, 도 52a는 20% MePEG 및 여러 가지 농도의 MTX를 함유하는 PCL 디스크로부터 MTX 방출을 보여준다. 도 52b는 MePEG를 함유하지 않는 페이스트에 대한 유사한 실험을 보여준다. 도 52c, D 및 E는 디스크에 남아있는 MTX의 양을 보여준다.
상기 결과로부터 알 수 있듯이, 고농도의 MePEG가 이용될 때 상당량의 MTX가 중합체로부터 방출될 수 있다.
실시예 23
메토트렉세이트 함유 미소구의 제조
A.MTX만을 갖는 미소구
메토트렉세이트(시그마)를 막자 및 약절구로 분쇄하여 입자 크기를 5μ 이하로 감소시킨다. 수중 2.5% PVA(w/v)(알드리히 또는 시그마) 100ml를 25℃에서 분쇄되지 않은 MTX 500mg과 15분 동안 교반시켜, 용액을 MTX로 포화시킨다. 이어서,이 용액을 2000rpm으로 원심분리시켜 용해되지 않은 MTX를 제거하고, 상청액을 미소구의 제조에 사용하였다.
간단히 말하자면, 10:90 w/w MTX(분쇄됨):중합체를 함유하는 폴리(DL)락트산(분자량 500,000; 폴리사이언시즈사 제품), 폴리락트산:글리콜산(50:50 IV 0.78 폴리사이언시즈사 제품) 또는 폴리카프로락톤(분자량 18,000, BPI)의 5% w/v 용액 10ml를 PVA(알드리히 또는 시그마)의 2.5% w/v 용액으로 포화된 MTX 100ml에 600rpm으로 교반하에 서서히 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 교반시키고, 생성된 미소구들을 세척 및 건조시켰다.
이러한 방법을 사용하여 MTX 부하된 미소구들을 30 내지 160 μ 범위에서 재생가능하게 제조할 수 있다(도 53 참조).
B.MTX 및 히알루론산을 갖는 미소구
MTX 부하된 미소구들은 유중수 에멀젼 제조법에 의해 담체로서 히알루론산("HA")을 사용하여, 본질적으로 아래 기재하는 바와 같이 제조할 수 있다. 간단히 말하자면, 파라핀 오일(경유; 피셔 사이언티픽스사제) 50ml를 200rpm으로 교반하에 60℃로 가온시켰다. 다양한 양의 MTX를 함유하는 수중 히알루론산 나트륨(20/mL)(출처-루스터 콤; 시그마)의 용액 5ml를 파라핀 오일에 적가한다. 혼합물을 5시간 동안 200rpm으로 교반하고, 5분 동안 500 xg으로 원심분리하였다. 생성된 미소구들을 헥산중에서 4회 세척하고, 건조시켰다.
실시예 24
바나듐 화합물을 함유하는 중합성 조성물의 제조
A.황산바나딜을 함유하는 중합성 페이스트
황산바나딜(피셔 사이언티픽사제)을 먼저 막자 및 약절구로 분쇄하여 입자 크기를 감소시키고, 이어서, MTX에 대해 상기한 바와 같이 용융된 PCL에 분산시킨다. 이어서, 이를 주사기에 넣어 고화시키고, 즉시 사용할 수 있도록 한다.
약물 방출은 10% w/w VOSO4:PCL의 펠릿 65mg을 물 10ml에 현탁시키고, 상청액을 200 내지 300㎚ 범위에서 피크의 UV/VIS 흡착 분광 분석을 사용하여 방출된 황산바나딜에 대해 분석하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 31에서 상기한 바와 같이 측정하였다.
결과를 도 54에 나타낸다. 간단히 말하자면, 10% VOSO4을 함유하는 중합성 조성물로부터, VOSO4 1mg이 6시간 내에, 2일 후에 3mg이, 6일까지 5mg이 방출되었다.
B.황산바나딜을 함유하는 중합성 미소구
황산바나딜을 본질적으로 실시예 23에 기재한 바와 같이 폴리락트산 또는 히알루론산의 미소구에 혼입하였다. 결과는 도 55에 나타낸다.
C.유기 바나듐산염을 함유하는 중합성 페이스트
유기 바나듐산염을 본질적으로 실시예 22에 기재한 바와 같이 PCL 페이스트에 부하시켰다. 미소구로부터 바나듐산염 방출은 상기한 바와 같이 측정하였다. 결과는 도 56a 및 56B에 나타낸다.
D.유기 바나듐산염 함유 미소구
유기 바나듐산염은 본질적으로 실시예 23에 기재한 바와 같이 미소구에 부하될 수도 있다. 이러한 미소구들은 폴리 D,L 락트산(분자량 500,000; 폴리사이언시즈사제)에 대해 도 57에 나타낸다.
실시예 25
비스(말토레이토)옥소바나듐(BMOV)을 함유하는 중합성 조성물
A.비스(말토레이토)옥소바나듐 부하된 페이스트의 제조
폴리(ε-카프로락톤)(분자량 20000)(BPI 버밍햄 AL) 및 BMOV를 유리 비이커에 적절한 비율로 직접 칭량하여 넣었다. 일부 제형에서, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG)(분자량 350)(유니온 카바이드사제, 코네티컷주 댄버리 소재)을 또한 PCL 및 BMOV에 첨가하였다. BMOV가 용융된 중합체에 철저히 분산될 때까지 비이커 및 내용물을 5분 동안 완만한 교반하에 55℃로 가온시켰다. 이어서, 용융된 혼합물을 예열된 주사기에 넣고, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
B.약물 방출 연구
10 mM 인산염 완충 염수(PBS pH 7.4) 15ml 및 소의 혈청 알부민(분획 5, 베링거 만하임사, 독일) 100㎍/ml를 함유하는 관에 PCL-BMOV 페이스트의 디스크-형상 슬래브 150mg을 첨가하였다. 관을 밀봉하고, 37℃에서 30rpm으로 끝에서 끝으로 회전시켰다. 적절한 시점에서, PCL-BMOV 슬래브를 5분 동안 중력하에 침전시키고, 모든 상청액을 제거하였다. BMOV 농도는 256㎚(A256) 및 276nm(A276)에서 흡광도를 측정함으로써 상청액 중에서 측정하였다. 상청액을 신선한 PBS 15ml로 대체하고 관을 다시 회전시켰다. BMOV 농도 대 A256 또는 A276의 선형 측정 곡선은 0 내지 25㎍/ml 범위로 BMOV 표준을 사용하여 얻었다. 이들 표준의 256㎚ 또는 276㎚에서 흡광도 값은 37℃의 밀봉된 관에 2 내지 3일 동안 저장함으로써 영향을 받지 않는 것으로 보였다(약물 방출 연구에 대해 사용된 동일한 조건).
약물 방출 실험의 종료시에, PCL-BMOV 매트릭스 시료는 디클로로메탄(DCM)(피셔) 0.5ml 중에 공지된 건조 중량의 매트릭스를 용해시킴으로써 잔류하는 약물 함량에 대해 분석하였다. 이러한 용액에 혼합 하에 온수(50℃) 50ml를 첨가하여 DCM을 증발시켜 분광광도 분석을 위해 BMOV를 물속에 남긴다(A256).
C.주사 전자 현미경법(SEM)
2개월 동안 약물 방출 실험에 사용된 PCL-BMOV 매트릭스의 시료를 SEM을 사용하여 조사하였다. 이들 시료는 신선하게 제조된 대조용 시료들과 비교하였다. 중합체 시료들은 (60:40)(금:팔라듐)(험머 인스트루먼츠 테크닉스사, 미국)으로 코팅시키고, IBM 데이터 수집 시스템을 갖는 히타치(모델 F-2300) 주사 전자 현미경을 사용하여 조사하였다.
D.결과
PCL 매트릭스로부터 BMOV의 방출은 도 58a 및 58B에 나타낸다. PCL 매트릭스 중의 BMOV의 부하량을 5% 내지 35%로 증가시킴으로써 2개월의 기간에 걸쳐 약물 방출 속도가 증가되었다(도 58a). 35% BMOV 부하시에, 방출 속도는 극적으로 증가하였다. 20% 내지 30% BMOV 부하에 대한 방출 프로필은 먼저 2일 내의 보다 신속한 상의 약물 방출에 이어, 조절된, 거의 0차수의 방출이 다음 2개월에 걸쳐 이루어지는 것을 보여준다.
약물 방출 프로필은 또한 펠릿 내에 남아있는 약물%로 표현된다(도 58b). 간단히 말하자면, PCL 매트릭스 내에 남아있는 BMOV %는 30% 미만(및 이하)의 모든 BMOV 부하에 대한 모든 시점에서 거의 동일함으로써, 원래 BMOV의 65% 내지 80%가 2개월 후에 매트릭스 내에 여전히 존재하였다(25% 및 30% BMOV 부하에 대한 데이터만이 58B에 분명히 나타난다). 매트릭스 내에 남아있는 약물의 백분율은 35% BMOV 부하시에 보다 신속히 감소됨으로써 원래 BMOV의 50%를 약간 초과하는 양이 1개월 후에 매트릭스 내에 존재하였다. 누진적인 약물 방출 데이터를 확증하기 위해, PCL-BMOV 매트릭스의 시료를 각각의 약물 방출 실험의 종료시에 잔류하는 약물 함량에 대해 분석하였다. 이러한 잔류 분석에 의해 측정한 바 70일 째에 남아있는 약물%는 다음과 같다: 67% +/- 10%(5% BMOV), 56% +/- 10%(10% BMOV), 80% +/-20%(15% BMOV), 84% +/- 20%(20% BMOV), 85% +/- 12%(25% BMOV), 77% +/- 14%(30% BMOV) 및 57% +/- 15%(35% BMOV).
도 59a 및 59B는 BMOV의 여러 가지 부하 농도를 위한 약물 방출 프로필에 대해 PCL 매트릭스에 20% MEPEG를 첨가한 효과를 보여준다. 매트릭스에 MEPEG를 첨가함으로써 PCL 단독으로부터 BMOV의 방출과 비교한 바 BMOV의 방출 속도를 극적으로 증가시킨다(도 58). 50%를 초과하는 BMOV가 모든 BMOV 부하 농도에서 일주 7일 이내에 중합체 매트릭스로부터 방출되었다. PCL-BMOV-MEPEG 펠릿의 잔류 분석은 펠릿 내에 7일째에 남아있는 BMOV의 %에 대해 하기 값들을 수득한다: 24% (+/- 9%), 5% BMOV; 25% (+/- 8%), 10% BMOV; 22% (+/- 4%), 15% BMOV; 27% (+/- 7%), 20% BMOV.
도 60a는 큰 배율로 BMOV 결정의 형태학을 보여준다. 도 60b 및 60C는 수성 완충액 중에서의 2개월의 약물 방출 연구 전후의 중합체-약물 매트릭스의 형태학을 보여준다. 15%, 20% 및 30% BMOV 부하에 대한 PCL-BMOV 매트릭스는 방출 연구 전에 이들의 외부 대향면 상에서 전형적으로 원활하고, 대표적인 SEM은 도 60b에 나타낸다. 수성 완충액내에서 2개월 동안 항온배양시킨 후, 외부 표면은 거칠어지고 흠집이 생겼다.
E.논의
이 화합물은 바나듐의 지속적인 농도를 유지하는 거의 이상적인 방출 특성을 갖는 PCL 매트릭스로부터 매우 서서히 방출되는 것으로 밝혀졌다. 이들 특성은 초기 며칠내에 약물 방출의 단지 작은 폭발적 효과에 이어 최대한의 약물 부하에서 거의 0차 방출 키네틱을 포함한다(도 58). BMOV는 황산바나딜 또는 오르토바나듐산 나트륨보다 덜 수용성이고, 분자의 소수성은 아마도 소수성 PCL 매트릭스에 대한 BMOV 분자의 친화도를 증가시키고, 수성 항온배양 매질로의 약물 방출 속도를 감소시킨다.
PCL에 20% MEPEG를 첨가하면 매트릭스의 점도 및 중합체가 고화되는 온도를 감소시킴으로써 페이스트의 열 유동 특성을 개선시키는 것으로 보였다. 이들 특성은 종양 부위의 양호한 커버가 이들 조건하에 얻어지기 때문에 관주변의 종양 부위에 페이스트를 도포하는데 중요하다. BMOV-PCL에 MEPEG를 첨가하면 BMOV-PCL(MEPEG 없음)로부터 방출 속도(도 58)에 대한 모든 BMOV 부하 농도(5% 내지 20%)에서 BMOV의 시험관내 방출 속도(도 59)를 증진시키는 것으로 보였다. 5% BMOV 부하된 PCL-MEPEG 페이스트는 1일당 500 내지 1000㎍의 BMOV를 방출시키는 것으로 보였다(이는 35% BMOV 부하된 PCL로부터의 방출 속도와 유사함).
실시예 26
비스(말토레이토)옥소 바나듐 부하된 써모페이스트의 시험관내 및 생체내 효율
BMOV 부하된 중합성 PCL 써모페이스트는 상기한 바와 같이 제조하고, 종양 세포주에 대한 이의 시험관내 및 생체내 효율에 대해 시험하였다.
A.인체 종양 세포주
HT-29 결장, MCF-7 유방 및 SKMESI 작지않은 세포 폐의 인체 종양 세포주를 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)사로부터 얻었다. HT-29 결장 세포주를 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청(HIFBS)을 사용하여 RPMI 1640에서 배양하고, MCF-7 유방 세포주는 5% HIFBS + 10 내지 9M 인슐린을 사용하여 이스코베(Iscove) 개질된 이글 배지 중에서 배양하고, SKMESI 폐 세포주는 10% 비열 불활성화된 FBS를 사용하여 이글 최소 필수 배지 중에서 배양하였다.
B.정상적인 인체 골수 세포
정상적인 인체 골수(종양 세포에 대해 조직학적으로 음성)는 충실성 종양에 대해 골수 이식체를 가졌지만 골수가 사용되기 전에 사망한 환자로부터 입수하였다. 원심분리 후, 담황갈색 외피를 제거하고, 세포들을 분해 완충액으로 처리하고, 2회 세척하고 이어서, 20% HIFBS와 함께 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 세포들은 25g 바늘을 통해 인출되고 계수되었다.
C.방사선 분석 박텍(Bactec) 시스템
박텍 시스템(존슨 러버러토리즈, Towson, MD)은 혈액 배양액중에서 세균을 검출하기 위해 개발되고, 새로운 항신생물제를 스크리닝하기 위해 사용된 임상 기구에 기초한다. 이러한 방사선 분석 시스템은 세포독성의 지수로서 14C 글루코스의 14CO2로의 전환 억제를 이용하는 신속한 반자동화 시스템이다. 박텍 기기는 14CO2를 이온 챔버 내로 자동으로 쏟아내고 여기서 방사선 표지된 CO2의 신호는 비례하는 전기 신호 또는 1 내지 1000 등급에 스케일에 대한 성장 지수값으로 변화된다. 계속적인 노출에 대해, 종양 세포 또는 정상적인 골수 세포를 0.01, 0.1, 1, 10, 25 및 50㎛의 최종 농도로 14C 글루코스 + BMOV 2 uCi를 함유하는 적절한 성장 배지 2ml에 첨가하고, 5% CO2와 공기의 혼합물을 함유하는 20ml 고무 스토퍼가 달린 혈청 바이알에 주입하고, 37℃에서 24일 동안 항온배양시켰다. 1시간 이상 노출시키는 동안, 동일한 최종 농도에서 세포들 및 BMOV를 37℃ 수조 중의 15ml 폴리프로필렌 원뿔 중에서 1시간 동안 항온배양시켰다. 이어서, 세포들을 원심분리하고, 배지 중에서 세척하고, 14C 글루코스 2 uCi를 함유하는 적절한 성장 배지 2ml에 재현탁시키고, 5% CO2와 공기의 혼합물을 함유하는 20ml 고무 스토퍼가 달린 혈청 바이알에 주입하고, 37℃에서 24일 동안 항온배양시키고, 종양 세포주를 6일, 9일 및 12일째에, 골수 세포들을 6일, 15일 및 24일째에, 바이알을 제거하고, 14C 글루코스 물질 대사시 세포들에 의해 생산된 14CO2의 양을 측정하기 위해 박텍 기구에 삽입하였다. BMOV 처리된 세포들의 성장 지수 값을 미처리된 세포들의 성장 지수값에 비교하고, 미처리된 대조군에 대한 생존율(%)을 계산하였다.
D.절개된 종양 연구
7주령의 C3H/HeJ 쥐 수컷을 이 연구에 사용하였다. RIF-1(쥐의 방사선 유도된 섬유육종) 세포들을 10% FBS(기브코사제, 캐나다)를 함유하는 α-MEM 배지에서 배양하였다. 세포들을 1% 행크스 완충액 염 용액(HBSS pH 7.4)(기브코사제, 캐나다)을 1 x 107 세포/ml 농도로 현탁시켰다. 이들 세포(1 x 106 세포) 100㎕를 각각의 쥐의 우측 옆구리에 주입하였다. 종양을 5일 동안 성장시켰다(종양의 직경이 6 내지 8mm인 시점). 5일째에 쥐들을 케타민:롬폼(70mg/kg:10mg/kg) 조합물 (0.02ml/g)로 마취시켰다. 종양 가장자리로부터 5mm 절개하고, 각각의 종양의 약 90%를 제거하고, 용융된(50℃) PCL-BMOV 또는 PCL 단독(대조용) 150mg을 절개된 종양 부위의 전체 표면 상에서 500㎕ 주사기로부터 압출하였다. PCL은 30초 내에 고화되고, 영역은 5 내지 0 프롤렌 봉합선으로 폐쇄되었다. 쥐들은 4, 5, 6 및 7일 째에 조사하였다. 각각의 날짜에 종양들을 측정하고(길고 짧은 직경), 사진을 찍었다. 종양이 최대 직경 9mm에 달하였을 때, 쥐들을 희생시키고, 종양 영역을 추가의 조직학적 연구를 위해 절개하였다. 결과는 도 63에 나타낸다.
E.종양 억제 연구
MDAY-D2 조혈 세포주(토론토 소재 마운트 시나이 병원의 J. 데니스 박사로부터 입수함)를 5% FBS(기브코사제, 캐나다)를 함유하는 DMEM 중의 현탁액에서 평판 배양하거나 성장시켰다. 각각의 쥐들에게 PBS 100㎕ 중의 세포 4x105개를 후측부 옆구리로 피하 주입하였다. 종양이 성장한지 5일 후, PCL 또는 PCL-BMOV 용융 페이스트 150mg을 각각의 쥐의 종양 부위와 인접한 영역에 이식하였다. 15일 후 쥐들을 희생시키고, 칭량하고, 종양을 절개하여 칭량하였다. 결과를 도 62에 나타낸다.
F.결과 및 논의
정상적인 인체 골수 세포에 대항하여, 1시간 노출된 BMOV는 50㎛의 농도에서 조차 거의 영향을 미치지 않았다. 연속적인 노출을 사용함으로써, 골수 세포에 대한 BMOV의 효과는 여전히 거의 밝혀지지 않았고, 단, 50㎛ 농도에서만 감도(49% 생존)가 관찰되었다. 따라서, BMOV 화합물은 시험된 농도 및 노출에서 매우 척수억압적인 것으로 보이지 않았다.
이 연구에서, BMOV의 항신생물 효과는 약물에 대한 연속적인 노출을 보장하는 상황하에 3개의 인체 암 세포주들에 대항하여 시험관 내에서 나타났다. 그러나, 생체 내에서, 이 효율은 BMOV에 대한 종양 세포들의 연속적인 노출에 의존할 수 있다. 본 연구의 주 목적은 낮은 농도에서 바나듐(BMOV 형태)을 연속적으로 공급할 수 있는 생분해성 중합성 전달 시스템을 고안하고, 시험(생체 내)하는 것이다.
생체 내 실험은 PCL-BMOV 페이스트의 단일 피하 투여가 MDAY D2 종양 성장을 억제함을 나타낸다. 도 62는 대조용 쥐(BMOV 없는 PCL) 및 25%, 30% 및 35% BMOV 부하된 PCL로 처리된 쥐로부터 종양 중량에 대한 데이터를 나타낸다. 25% BMOV 부하된 PCL에 대한 종양 성장이 54% 억제되는 것으로 보였다(p<0.05에서 유효함). 30% 및 35% BMOV 부하는 종양 성장을 각각 76% 및 80% 억제하고, 35% BMOV 군에서 6마리의 쥐중 한 마리가 종양의 완전한 근절을 보였다.
흥미롭게도, 생체 내 약물 방출 프로필은 25% 및 30% BMOV으로 구성된 페이스트가 이미 나타낸 효율로 1일당 BMOV 약 500㎍을 방출하는 것으로 보였다. 그러나, 종양 성장을 감소시키는 데 가장 효과적인 35% BMOV 부하된 PCL 페이스트는 이러한 양의 약물의 거의 2배를 시험관 내 방출하였다. 이들 데이터는 적은 양의 바나듐 화합물의 지속적인 방출이 1일 바나듐산염 투여 섭생과 비교한 바 동일하거나 또는 더 효과적인 항신생물 섭생이 될 수 있다.
PCL-BMOV 페이스트가 종양 성장을 억제하는 데 동일하게 효과적이지만, 쥐들은 응력이나 중량 손실 신호를 나타내지 않았다. 많은 투여량의 바나듐산염의 1일 주입에 따라 공통적으로 관찰된 증가된 응력 및 중량 손실은 거의 투여 직후 혈장에서 고농도의 바나듐산염에 의해 유도된 독성과 관련되기 쉽다. 장기간 동안 바나듐산염을 지속적으로 방출하기 위해 PCL-BMOV 페이스트를 사용함으로써, 혈장 바나듐산염 농도의 큰 변동을 줄일 수 있고, 바나듐산염 유도 독성을 방지할 수 있다. 이들 데이터는 BMOV의 느린 지속적 방출이 종양 성장을 감소시키는 데 동일하거나 또는 보다 효율적이고, 바나듐산염 유도 독성을 방지한다는 우리의 가설과 일치한다.
실시예 27
쥐에서 종양 성장에 대한 BMOV 미소구의 효과
이 연구의 목적은 쥐에서 종양의 성장을 억제시키는 BMOV-부하된 PLLA 미소구(20%)의 능력을 시험하는 것이다.
24주령의 쥐 20마리에 10x106/ml 밀도를 갖는 MDAY-D2 세포들 100ml를 피하 주입하였다. 6일 째에, 쥐들을 6개의 군으로 분할하였다. 1군, 대조군 없는 2군, 종양 대조군인 3군에 0.25mg/100㎕ BMOV로 1일 2회 피하로 주입하였다. 4군은BMOV 5mg을 함유하는 PLLA 미소구 20mg을 복강내 주입하였다. 5군은 6일째 및 9일째에 각각 BMOV 미소구 10mg을 복강내 주입하였다. 6군은 6일째 및 9일째에 BMOV 미소구 10mg을 근육내 주사하였다. 16일 째에, 쥐들을 희생시키고, 종양을 절개하였다.
이들 실험의 결과를 아래 표 5 및 표 6에 나타낸다.
실시예 28
조절-방출형 중합성 약물 전달 시스템: 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 써모페이스트 및 PCL-메톡시폴리에틸렌글리콜(PCL-MEPEG) 써모페이스트로부터 유기 바나듐 착물의 시험관내 약물 방출 프로필의 비교 연구
이 연구는 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 써모페이스트 및/또는 PCL-메톡시폴리에틸렌글리콜(PCL-MePEG) 써모페이스트 중의 바나듐의 4개의 유기 착물 형태(BMOV, BEMOV, V5, PRC-V)의 캡슐화 및 시험관내 방출 키네틱을 조사하기 위해 수행되었다.
A.방법
정량적 분석(UV/VIS 분광광도적 분석)은 흡수 피크의 파장 및 교정 방정식을 얻기 위해 상이한 농도의 바나듐 용액으로 행하였다. 바나듐의 용해도는 알부민을 갖는 10mM 인산염 완충 염수(PBS/ALB)(pH 7.4) 중에서 연구하였다. 바나듐의 각각의 유기 착물 형태의 1%, 5%, 10% 및 20%(PCL 중의 바나듐 착물%)를 생분해성 중합체 PLC 중에서 및/또는 MePEG(분자량 350)와 PLC의 혼합물 중에서 캡슐화하여 "써모페이스트"라 칭명되는 중합성 약물 전달 생성물을 생산한다. 써모페이스트로부터 바나듐의 여러 가지 형태에 대한 시험관내 방출 연구는 37℃에서 PBS/ALB 중에서 바나듐 방출을 UV/VIS 흡수 분광학에 의해 측정하면서 수행하였다.
B.결과
결과는 도 64 내지 68에 나타낸다. 간단히 말하자면, BMOV, BEMOV 및 V5의 피크 흡수는 276㎚에서 발생하였고, PRC-V의 피크 흡수는 266㎚에서 발생했다. 바나듐의 각각의 형태의 용해 속도 및 용해 정도는 V5>BMOV & BEMOV>PRC-V의 순서였다. 시험관내 방출 연구는 써모페이스트로부터의 약물 방출 속도가 (1) 약물 용해도가 증가하고, (2) 약물 농도가 증가하고, (3) 쎄모페이스트에 혼입된 MePEG의 양이 증가되었음을 보여준다.
C.결론
바나듐의 조절된 투여량은 상이한 형태의 바나듐(약물로서)을 사용하거나, PCL 중의 바나듐의 특정 형태의 부하율%을 변경시키거나 또는 MePEG를 PCL에 삽입함으로써 PCL 써모페이스트로부터 방출될 수 있다. 특정 형태의 바나듐의 부하율%의 변화는 단기간의 방출 속도를 조절할 수 있는 한편, 조절된 투여량의 전달은 동물에 약물(PCL 중)의 거대한(잠재적으로 독성인) 데포(depot)를 이식하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 다른 형태의 바나듐을 사용하거나 또는 MePEG를 PCL에 포함시킴으로써 바나듐의 조절된 투여량을 전달하는 다른 방법을 제공할 수 있다.
실시예 29
PCL 써모페이스트로 캠프토세신의 캡슐화 및 혈관 형성 방지성 분석
A.캠프토테신의 PCL로의 혼입
캠프토테신을 막자 및 약절구로 분쇄시켜 입자 크기를 5μ 미만으로 감소시켰다. 이어서, 이를 무수 분말로서 폴리카프로락톤(분자량 18,000, 버밍햄 폴리머스사, 미국 앨라배마주)과 혼합하였다. 이 혼합물을 65℃로 5분 동안 가열하고, 용융된 중합체/제제 혼합물을 원활한 페이스트가 되도록 5분 동안 교반시킨다. 이어서, 용융된 페이스트를 1ml 주사기에 넣고, 압출시켜 3mg 펠릿을 형성한다. 이어서, 이들 펠릿을 CAM 상에 놓고 이들의 혈관 형성 방지성을 평가하였다.
B.결과
캠프토테신-부하된 써모페이스트는 대조용 PCL 펠릿과 비교할 때 혈관 형성을 억제하는 데 효과적이었다. 5% 약물 부하시, 시험된 CAM의 4/5가 강력한 혈관 형성 억제성을 나타냈다. 또한, 1% 및 0.25% 부하시에, CAM의 2/3 및 3/4은 혈관 형성 억제성을 각각 보였다. 따라서, 이들 결과로부터 캠프토테신은 PCL 써모페이스트로부터 충분히 방출되고, 치료학적인 혈관 형성 방지 효능을 갖는 것이 명백하다.
실시예 30
S-포스포네이트-부하된 써모페이스트의 제조
이 연구에서, 본 발명자들은 항신생물 활성을 갖는 에테르 지질인 s-포스포네이트가 PCL 써모페이스트에 성공적으로 혼입되고, CAM 분석에서 효능을 나타냄을 입증했다.
A.S-포스포네이트 부하된 페이스트의 제조
폴리카프로락톤(버밍햄 폴리머스사, 버밍햄, 앨라배마주) 및 s-포스포네이트를 55℃에서 2분 동안 적절한 비율로 선별하였다. 이어서, 용융된 혼합물을 3mg 반구형 펠릿으로 피펫팅하여 4℃에서 정치시켰다.
B.CAM 생물학적 검사
수정된 가금류 병아리 배(피치먼스 컨설팅 & 리서치 서비시즈 리미티드, B.C.)를 4일 동안 항온배양시키고 창을 내었다. 간단히 말하자면, 계란의 무딘 단부(기실 부위)로부터 껍질 및 내부 껍질 막을 제거함으로써 작은 구멍(약 2 cm 직경으로 측정됨)을 형성하고, 노출된 영역을 멸균된 파라필름 왁스로 밀봉하였다. 이어서, 계란은 37℃에서 창을 위로하여 추가로 2일 동안 항온배양기에 넣었다. 항온배양한지 6일 째에, s-포스포네이트-부하된 중합체 또는 대조용(약물 없음) 중합체의 3mg 펠릿을 성장하는 CAM 용기의 표면 상에 놓았다. 노출시킨지 2일 후(항온배양한지 8일째), 혈관 구조는 콘택스 카메라 시스템이 장착된 입체 현미경을 사용하여 조사하였다. 혈관의 콘트라스트를 증가시키고, 임의의 배경 정보를 은폐시키기 위해, CAM에 영상화 전에 지질내 용액(애보트 러버러토리즈제) 1ml를 주입하였다.
C.결과
0%, 1%, 2%, 4% 및 8%로 s-포스포네이트 부하된 PCL 펠릿은 CAM 중에서 투여량 의존형 혈관 형성 방지 반응을 유도하였다. 혈관 형성 방지 반응은 s-포스포네이트 부하된 펠릿 바로 아래 영역 내에서의 혈관의 부재를 특징으로 한다. 대조용 CAM에서 보이는 치밀한 모세관 네트워크의 정상적인 성장은 s-포스포네이트 처리된 CAM에서 분명히 억제되었다. 고농도(4% 및 8%)에서, 처리된 CAM은 약물/중합체 펠릿 근처에서 구조적으로 변경되었다. 이러한 변경은 s-포스포네이트/중합체 펠릿에 바로 인접한 CAM의 명백한 비대 및 펠릿 아래의 멤브레인 박층화를 포함한다. s-포스포네이트로 처리된 모든 CAM에서, 구혈 영역은 노출된지 2일 후에 나타났다. 이는 약 3mm2 면적을 측정하는 모세관 네트워크가 결여된 영역으로서 정의된다.
실시예 31
티로신 키나제 억제제의 PCL 써모페이스트로의 캡슐화 및 CAM 검정을 사용한 분석
티로신 키나제 억제제를 막자 및 약절구로 분쇄시켜 입자 크기를 5μ 미만으로 감소시켰다. 이어서, 이들을 무수 분말로서 폴리카프로락톤(분자량 18,000, 버밍햄 폴리머스사, 미국 앨라배마주)과 혼합하였다. 이 혼합물을 65℃로 5분 동안 가열하고, 용융된 중합체/제제 혼합물을 원활한 페이스트가 되도록 5분 동안 교반시킨다. 이어서, 용융된 페이스트를 1ml 주사기에 넣고, 3mg 펠릿을 형성하도록 압출시킨다. 이어서, 이들 펠릿을 CAM 검정으로 시험하였다. CAM 검정으로 시험되는 티로신 키나제 억제제는 라벤더스틴-c, 에르브스타틴, 헤르비마이신 및 게니스테인을 포함한다. 이들 제제의 혈관 형성 방지 억제 효과와 비교할 때, 헤르비마이신(PCL 중에서 2%)이 시험된 CAM의 4/4의 구혈 영역을 유도하는데 가장 강력하다.
실시예 32
빈카 알칼로이드의 PCL 써모페이스트로의 캡슐화 및 CAM 검정을 사용한 분석
A.억제제의 PCL 써모페이스트로의 혼입
빈카 알칼로이드(빈블라스틴 및 빈크리스틴)를 막자 및 약절구로 분쇄시켜 입자 크기를 5μ 미만으로 감소시켰다. 이어서, 이들을 무수 분말로서 폴리카프로락톤(분자량 18,000, 버밍햄 폴리머스사, 미국 앨라배마주)과 혼합하였다. 이 혼합물을 65℃로 5분 동안 가열하고, 용융된 중합체/제제 혼합물을 원활한 페이스트가 되도록 5분 동안 교반시킨다. 이어서, 용융된 페이스트를 1ml 주사기에 넣고, 3mg 펠릿을 형성하도록 압출시킨다. 이어서, 이들 펠릿을 CAM 검정으로 시험하였다.
B.결과
CAM 상의 제형을 시험할 때, 제제는 생물학적 효과를 유도하기에 충분한 양으로 PCL 펠릿으로부터 방출되었음이 명백하다. 빈블라스틴 및 빈크리스틴 모두는 대조용 PCL 써모페이스트 펠릿과 비교할 때 CAM 검정에서 혈관 형성 방지 효과를 유발하였다.
0.5% 및 0.1% 약물 부하 농도에서, 빈크리스틴은 시험된 모든 CAM에서 혈관 형성 억제성을 유도하였다. 2%를 초과하는 농도가 시험되었을 때, 독성 약물 농도가 얻어졌고, 예상 밖의 배의 사망이 발생하였다.
빈블라스틴은 0.25%, 0.5% 및 1% 농도의 CAM에서 혈관 형성을 억제하는 데 있어서 효과적이다. 그러나, 2%를 초과하는 농도에서, 빈블라스틴은 배에 독성이기도 하다.
실시예 33
생체 접합성 미소구
A.생체 접합성 미소구의 제조
미소구들은 입자 직경이 10 내지 60㎛인 100 kg/몰 PLLA로부터 제조하였다. 미소구들을 수산화나트륨 용액 중에서 항온배양시켜 폴리에스테르를 가수분해시킴으로써 표면 상에 카복실기를 생산한다. 이 반응은 표면 전하를 측정함으로써 항온배양시간 및 수산화나트륨 농도를 특징으로 한다. 반응은 0.1 M 수산화나트륨 중에서 45분 동안 항온배양시킨 후 완료되었다. 염기로 처리한 후, 미소구들은 디메틸아미노프로필카보이미드(DEC)의 알콜성 용액에 미소구들을 현탁시키고, 혼합물을 분산성 분말로 건조시킴으로써, 가교제 DEC로 코팅되었다. DEC에 대한 미소구의 중량비는 9:1이었다. 미소구들이 건조된 후, 이들을 교반하에 폴리(아크릴산)의 2% w/v 용액으로 분산시키고, DEC를 PAA와 반응시켜 미소구 표면 상에 가교된PAA의 수용성 네트워크를 생산한다. 주사 전자 현미경법을 사용하여 미소구들의 표면 상의 PAA의 존재를 확인하였다.
염기 처리 전후에 미소구의 시차 주사 열량계는 벌크 열 특성(Tg, 융점, 결정화 정도)에 있어서 주사 전자 현미경으로 어떠한 변화되지 관찰되지 않음을 보여준다.
B.시험관내 파클리탁셀 방출 속도
동일한 입자 직경 크기 범위를 갖는 파클리탁셀 부하된 미소구(10% 및 30% w/w 부하됨)를 제조하여, 10일 동안 시험관 내 방출 프로필이 인산염 완충 염수에서 방출되었다. 방출은 약물 부하량에 비례하며, 400㎍의 파클리탁셀은 10일 이내에 30% 부하된 미소구 5mg으로부터 방출되고, 150㎍의 파클리탁셀은 동일한 기간에 10% 부하된 미소구로부터 방출되었다. 캡슐화 효율은 80%였다. 파클리탁셀 부하된 미소구들은 0.1 M 수산화나트륨 중에서 45분 동안 항온배양시키고, 제타 전위는 수산화나트륨의 항온배양 전후에 측정하였다. 파클리탁셀 부하된 미소구들의 표면 전하는 염기로 처리되기 전후에 파클리탁셀이 없는 미소구들보다 더 낮았다.
C.폴리-라이신 또는 피브로넥틴으로 코팅된 PLLA의 제조 및 시험관 내 평가
1% 수단 블랙(sudan black)(미소구들을 착색하기 위함)을 함유하는 PLLA 미소구들을 제조하였다. 이들 구는 폴리-라이신(시그마 케미컬스-하이드로브로멜 형태) 또는 피브로넥틴(시그마)의 2% (w/v) 용액 중에 10분 동안 현탁시켰다. 이들미소구는 완충액 중에 1회 폐기하고, 쥐로부터 신선하게 준비한 방광의 내표면에 놓았다. 방광을 10분 동안 방치하고, 완충액으로 3회 세척하였다. 잔류하는(결합된) 미소구들은 공정 후에 방광 벽상에 존재함으로써 생체 접착이 피브리넥틴 및 폴리-1-라이신 코팅된 미소구 모두에 대해 발생하였음을 보여준다(도 69a 및 69B).
실시예 34
폴리(N-이소프로필아크릴아미드의 합성)
폴리아크릴아미드 및 그의 유도체들은 유리 라디칼 중합 및 광조사 유도 중합을 통해 용이하게 합성될 수 있다. 다음은 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 합성예이며, 여기서, 단량체 N-이소프로필아크릴아미드는 헥산 및 톨루엔 등의 유기 용매로부터 재결정화에 의해 정제한다.
간단히 말하자면, N-이소프로필아크릴아미드는 60℃ 등의 온도에서 톨루엔 중에 용해된다. 이러한 용액은 단량체의 재결정화를 허용하는 온도로 냉각된다(예: 4℃). 이어서, 단량체는 여과 수집하고, 진공하에 건조시킨다. 합성을 위해, 정제된 단량체(20g)를 환저 유리 플라스크내의 증류수 180ml에 용해시킨다. 용존 산소를 대체하기 위해 용액을 30분 동안 질소로 퍼지하였다. 이어서, 온도를 65℃로 상승시키고, 중합을 개시하기 위해 과황산암모늄 및 2,2'-아조비스-이소부티로니트릴 등의 개시제 소량(0.1g)을 첨가한다. 중합은 10시간 이내 및 질소의 보호 및 교반하에 완료된다. 마지막으로, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 에탄올을 첨가함으로써 침전된다. 중합체는 건조시켜 저장한다.
실시예 35
폴리(아크릴산) 유도체의 합성
폴리(아크릴산) 및 그의 유도체는 자유 라디칼 중합 및 광조사 유도된 중합을 통해 합성할 수 있다. 다음은 폴리(아크릴산)을 합성하는 예이며, 여기서, 단량체 아크릴산은 감압하(예: 10mmHg)에 증류시킴으로써(40℃) 정제한다.
간단히 말하자면, 정제된 단량체(20g)를 환저 유리 플라스크 내의 디옥산 180ml에 용해시킨다. 용존 산소를 대체하기 위해 용액을 30분 동안 질소로 퍼지한다. 이어서, 온도를 65℃로 상승시키고, 중합을 개시하기 위해 개시제 2,2'-아조비스-이소부티로니트릴 소량(0.1g)을 첨가한다. 중합은 24시간 이내에 및 질소의 보호 및 교반하에 완료된다. 마지막으로, 폴리(아크릴산)은 n-헥산을 첨가함으로써 침전된다. 중합체는 건조시켜 저장한다.
실시예 36
파클리탁셀의 혈관 주변 투여
체중 250 내지 300g의 위스타 쥐를 이노바(Innovar)(0.33ml/kg)를 근육내 주사함으로써 마취시킨다. 일단 진정되면, 이들을 핼로세인(Halothane) 마취약 하에 둔다. 일반적인 마취약이 확정된 후, 목 영역 위의 털을 면도하고, 피부를 클램핑하고, 베타딘을 칠한다. 노출된 좌측 경동맥 및 외부 경동맥 위에 수직 절개를 행한다. 외부 경동맥 둘레에 2개의 결찰선이 놓이고, 횡단 동맥 절개술을 행한다.제2호 프렌치 포가트(French Fogart) 기구 카테터를 경동맥에 도입시키고, 좌측 공통 경동맥으로 통과시키고, 기구를 염수에 의해 팽창시킨다. 카테터는 경동맥의 위아래로 3회 통과된다. 이어서, 카테터를 제거하고, 결찰선을 좌측 외부 경동맥 상에서 조인다.
이어서, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA) 중의 파클리탁셀(33%)을 10마리 쥐의 공통 경동맥 둘레에 원주 방향으로 주입한다. EVA 만을 다른 10마리의 쥐의 공통 경동맥 주위에 주입한다. 각각의 군으로부터 5마리의 쥐들을 14일 째에 희생시키고 최종적으로 5마리를 28일 째에 희생시켰다. 쥐들을 중량 손실 및 다른 전신 질병의 징후에 대해 관찰하였다. 14일 또는 28일 후, 동물들을 마취시키고, 좌측 경동맥을 초기 실험 방식으로 노출시킨다. 경동맥을 단리시키고, 10% 완충 포름알데히드에 고정시키고, 조직학에 대해 조사한다.
실시예 37
아테롬성 동맥경화증의 치료
A.아테롬성 동맥경화증
아테롬성 동맥경화증 병변은 식이 요법 만으로 뉴질랜드산 백색 토끼에서 생성하였다. 간단히 말하자면, 체중이 약 1.6 kg인 뉴질랜드산 백색 토기를 콜레스테롤 0.25중량%로 보충한 분말상 음식에 놓았다. 전체 혈장 콜레스테롤은 혈관을 팽창시키기 위해 이노바르 0.1ml/kg을 주입한 후 귀바퀴 정맥으로부터 1주일 단위로 시료를 취하여 측정하였다. 시료를 EDTA와 혼합하여 0.15%의 시료 농도를 얻고, 저속 원심분리에 의해 혈장 분리가 이루어질 때까지 어름 위에 두었다.
완전 콜레스테롤 식이요법을 시작한지 1주일 후, 동물들을 무작위로 10마리씩 3군으로 나누었다. 케타민 35mg/kg 및 크실라진 7mg/kg으로 마취한 후, 항온배양을 통해 일반적인 마취를 행하고, 털을 면도하고, 복부위의 피부를 멸균시켰다. 개복을 시행하고, 복부 대동맥을 단리시킨다. 22g 바늘을 사용하여, 에틸렌 비닐 아세테이트 페이스트, 5% 파클리탁셀을 함유하는 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 33% 파클리탁셀을 함유하는 에틸렌 비닐 아세테이트 페이스트를 신장 아래쪽 복부 대동맥에 인접하는 절반부 둘레의 원부 방향으로 놓는다. 대동맥 분기점으로 확장하는 대동맥의 말단 절반부는 처리하지 않는다. 10마리의 대조군 토끼에서, 신장 아래쪽 복부 대동맥을 단리시키지만 그 둘레에 아무것도 주입하지 않는다.
아테롬 발생 식사는 24주 동안 계속된다. 그 때, 동물들은 케타민 350mg/kg 및 크실라진 7mg/kg을 근육내로 주사하여 마취한 후, 과량의 유타놀(Euthanol)(240mg/ml; 2ml/4.5 kg)을 정맥내로 주입함으로써 희생시킨다. 이어서, 동물들을 헤파린 1 IU/ml를 함유하는 0.15mmol/l N-2-하이드록시에틸파파라진-N'-2-에탄설폰산(pH 7.4)과 함께 행크스 균형 염 용역을 10분 동안 살포하고, 이어서 묽은 카르노브스키 정착제를 15분 동안 살포함으로써 좌심실을 통해 100 mmHg에 관류 고정시킨다. 흉부 및 복부 대동맥 및 장골 동맥은 총괄적으로 제거하고, 추가로 30분 동안 유사한 용액 내에 둔다.
이어서, 일련의 박층 단편은 흉부 대동맥, 특히 신장 아래쪽 복부 대동맥을통해 시행한다. Movat, H&E 및 Masson 염색을 시행하고, 조직학적 분석을 행하여 내강의 절충 정도, 아테롬성 동맥경화증 병변의 전개 정도, 및 동맥 주위 투약에 대한 임의의 내강 주위 반응을 조사하였다.
실시예 38
재협착증의 치료
체중 250 내지 300g의 위스타 쥐에 이노바(Innovar)(0.33ml/kg)를 근육내 주사함으로써 마취시킨다. 일단 진정되면, 이들을 핼로세인(Halothane) 마취약 하에 둔다. 일반적인 마취약이 확정된 후, 목 영역 위의 털을 면도하고, 피부를 베타딘으로 소독한다. 노출된 좌측 경동맥 및 외부 경동맥 위에 수직 절개를 행한다. 외부 경동맥 둘레에 2개의 결찰선을 놓고, 횡단 동맥 절개술을 행한다. 2 Fr 포가트 기구 카테터를 경동맥에 도입시키고, 좌측 공통 경동맥으로 통과시키고, 기구를 염수에 의해 팽창시킨다. 카테터를 경동맥의 위아래로 3회 통과시킴으로써 내강을 드러낸다. 카테터를 제거하고, 결찰선을 좌측 외부 경동맥 상에서 조인다.
동물들을 무작위로 5개의 군으로 나눈다. 5마리의 서브그룹 쥐들은 대조군이고, 담체 중합체 단독, 담체 중합체+1, 5, 10, 20 및 33% 파클리탁셀이 전달된다. 2가지 담체 중합체: 즉, EVA 및 EVA/PLA 혼합물이 연구된다. 중합체 혼합물을 경동맥 둘레에 원주 방향으로 넣는다. 이어서, 상처 부위를 폐쇄시킨다. 각 군의 쥐들을 14일째 및 28일째에 희생시킨다. 그 사이에, 쥐들을 중량 손실 및 다른 전신 질병의 징후에 대해 관찰한다. 14일 또는 28일 후, 동물들을 이노바0.33ml/kg을 근육내 주사하여 초기 침착시킴으로써 희생시킨다. 이어서, 동맥은 조직학에 대해 조사한다.
실시예 39
이식체 협착증을 유발하는 초기 비대증(HYPERPLASIA)
A.동물 연구
일반적인 마취를 가금류 돼지에서 유도한다. 목 영역을 면도하고, 피부는 세정액으로 멸균시킨다. 목의 각 측면을 수직 절개하고, 경동맥을 노출시키고, 8mm PTFE 이식체는 2개의 말단에서 측면으로의 문합, 즉, 공통 경동맥 상의 근접 문합 및 내부 경동맥 상의 양측으로의 말단 문합에 의해 삽입된다. 개입하여 우회하는 정맥은 결찰된다. 동물들은 담체 중합체 만을 수용하는 10마리 돼지, 담체 중합체+5%파클리탁셀을 수용하는 10마리 돼지 및 담체 중합체+35%파클리탁셀을 수용하는 10마리 돼지 군으로 무작위로 나누고, 각각의 수술 부위에 인접하여 좌측에만 문합을 생성하였다. 우측 이식체는 각각의 돼지에서 대조용으로 작용할 것이다. 상처 부위를 폐쇄시켜 돼지를 회복시킨다.
제2 군의 돼지를 연구하였다. 이식체는 유사한 방식으로 생성된다. 수술시에 문합 부위 옆에 혈관 활성제는 넣지 않았다. 동물들은 회복되었다. 이식이 시행된지 2주후, 제2의 일반적인 마취제를 투여하고, 좌측 경동맥을 다시 조사하였다. 근접 문합 및 말단 문합에 인접하여, 10마리 돼지 각각은 담체 단독, 담체 중합체+5%파클리탁셀 및 담체 중합체+35%파클리탁셀을 근접 문합 및 말단 문합에 인접하여 원주 방식으로 수용한다. 상처 부위를 폐쇄시켜 돼지를 회복시킨다. 반대쪽 우측 이식체는 대조용으로서 작용한다.
3개월 째에, 모든 돼지에게 일반적인 마취를 수행한다. 대퇴부 정맥에 정맥 절개가 이루어지고, 피그테일 카테터가 형광 가이드 하에 흉부 대동맥 위를 향하여 삽입된다. 경동맥 혈관구조의 영상화에 따른 아치 주입이 시행된다. 특히, 근접 이식체 및 말단 이식체 및 이식체의 말단 문합에서 먼 동맥의 협착 정도가 측정되고 협착률(%)이 산출된다. 필요할 경우, 공통 경동맥의 선택적 주입이 시행된다.
각각의 군에서 5마리 돼지를 희생시킨다. 이어서, 동물들을 헤파린 1 IU/ml를 함유하는 0.15mmol/l N-2-하이드록시에틸파파라진-N'-2-에탄설폰산(pH 7.4)과 함께 행크스의 균형된 염 용역을 10분 동안 살포하고, 이어서 묽은 카르노브스키 정착제를 15분 동안 살포함으로써 좌심실을 통해 100 mmHg에 관류 고정시킨다. 흉부 및 복부 대동맥 및 경동맥을 총괄적으로 제거하고, 추가로 30분 동안 유사한 용액 내에 둔다.
근접 문합에 대해 바로 근접한 경동맥을 통해, 근접 문합에서, 말단 문합에서 및 말단 문합에서 먼 경동맥을 통해 조직학적 단편들을 얻는다. 단편들은 Movat, H&E 및 Masson 염색약으로 염색한다. 동맥 내막 및 외막 반응 뿐만 아니라 혈관 주변 반응에 대한 조직학적 분석 역시 주의해야 한다. 내강 협착 정도에 따른 형태학적 분석을 산출한다.
나머지 돼지들은 6개월 째에 연구하고, 유사한 혈관 형성 희생 수술을 시행한다.
상기한 바로부터, 본 발명의 특정 양태들을 예시의 목적으로 본 명세서에 기재하였지만, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않는 다양한 변형태가 일어날 수 있음을 인식해야 한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허 청구의 범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.
본 발명에 따르는 신체 통로의 외벽에 전달될 수 있는 치료제를 포함하는 조성물 및 방법에 의해 신체 통로의 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.

Claims (19)

  1. 신체 통로의 외부에 치료제를 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법.
  2. 외막을 통해 신체 통로의 평활근 세포에 치료제를 전달하는 단계를 포함하는, 신체 통로와 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제가 혈관 형성 억제 인자인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제가 중합체를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 중합체성 담체가 (40% 가교결합된) 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 중합체성 담체가 락트산과 글리콜산의 공중합체인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 중합체성 담체가 폴리(카프로락톤)인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 중합체성 담체가 폴리(락트산)인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 중합체성 담체가 폴리(락트산)과 폴리(카프로락톤)의 공중합체인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제가 항미세관제인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항미세관제가 미세관을 안정화시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항미세관제가 파클리탁셀, 또는 이의 동족체 또는 유도체인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신체 통로가 동맥, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장, 담관, 수뇨관, 방광, 요도, 누관, 기관, 기관지, 세기관지, 코의 기도, 유스타키오관, 외귀의 도관 및 나팔관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 치료제가 동맥의 외벽을 통해 외막으로 직접 주입함에 의해 동맥에 전달되는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 질병이 혈관계 질병, 위장관계 질병, 비뇨 생식기계 질병 및 폐계 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 치료제가 항미세관제인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 항미세관제가 미세관을 안정화시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항미세관제가 파클리탁셀, 또는 이의 동족체 또는 유도체인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 항미세관제가 바나듐산염 또는 바나딜 화합물, 또는 이의 동족체 또는 유도체인 방법.
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