CN1283242C - 冻干制剂 - Google Patents

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Abstract

为了临床应用顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(Ⅱ)(R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基)，本发明旨在提供一种制剂，其抑制层分离和粘度变化，显示优良的混悬性能并且在给药期间易于操作。本发明的制剂是注射用冻干制剂，其是通过将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(Ⅱ)溶解在2-甲基-2-丙醇中并冻干该溶液而获得的，所述制剂具有大约3-25μm的中心粒径分布和至多40μm的D90%值。

Description

冻干制剂
技术领域
本发明涉及一种冻干制剂。更具体地，本发明涉及一种冻干制剂，其包含顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)(其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基)作为主要成分。
背景技术
在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的铂复合物顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的混悬液，被认为是在肝癌，恶性淋巴瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或表面膀胱癌中显示优于常规药剂的效果的药剂。特别地，已知顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的混悬液显示优越的效果：
顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的混悬液是作为注射剂施用的。因此，需要灭菌步骤。作为灭菌步骤，典型的是包含溶解在溶剂中，接着过滤的方法。在顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的情况下，例如2-甲基-2-丙醇，氯仿等是用于溶解的溶剂。作为优选的溶剂，在JP-B-2886247中描述2-甲基-2-丙醇。然而，当将2-甲基-2-丙醇用于灭菌无菌过滤和制备注射剂的冻干制剂时，那么将制剂混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中，因为当长时间静置时，出现粘度随时间增加并且混悬液分离成两层问题。
发明内容
本发明的一个目的是为顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的临床应用开发一种制剂，其中上述问题不容易出现，并且制剂是稳定的，均匀的和易于操作。
本发明人已经进行深入的研究力图解决上述问题，并且发现通过将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的无水物或水合物溶解在2-甲基-2-丙醇中并冻干溶液获得颗粒，控制颗粒的粒径分布，在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后它变得稳定和易于操作，并完成本发明。
更具体地，本发明人已经发现，通过将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中，并调节溶液的含水量，或者通过调节含水量和迅速冷冻溶液，控制颗粒的粒径分布，在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后的制剂变得稳定，混悬性能优越并易于操作。
因此，本发明涉及
1.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，该制剂具有大约3-25μm的中心粒径分布和不超过40μm的D90％值；
2.1的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
3.1或2的冻干制剂，其中所述中心粒径分布是大约5-20μm；
4.1至3中任何一项的冻干制剂，其中所述D90％值不超过33μm；
5.1至3中任何一项的冻干制剂，其中所述D90％值不超过30μm；
6.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过40μm的D90％值；
7.6的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
8.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值；
9.8的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
10.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值；
11.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(4)冻干所述冷冻溶液的步骤；
12.11的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
13.11或12的冻干制剂，其中冷冻是在20分钟内完成；
14.11或12的冻干制剂，其中冷冻是在15分钟内完成；
15.11或12的冻干制剂，其中冷冻是在10分钟内完成；
16.11至15中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-5.0mg/mL；
17.11至15中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-4.0mg/mL；
18.11至15中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-3.0mg/mL；
19.11至18中任何一项的冻干制剂，其中所述冷冻在-40℃下完成；
20.11至19中任何一项的冻干制剂，其在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后使用；
21.11至19中任何一项的冻干制剂，其在小瓶中被冻干；
22.一种无菌冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)无菌过滤的步骤，
(4)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(5)冻干所述冷冻溶液的步骤；
23.22的无菌冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
24.22或23的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在20分钟内完成；
25.22或23的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在15分钟内完成；
26.22或23的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在10分钟内完成；
27.22至26中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-5.0mg/mL；
28.22至26中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-4.0mg/mL；
29.22至26中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-3.0mg/mL；
30.22至29中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在-40℃下完成；
31.22至30中任何一项的无菌冻干制剂，其在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后使用；
32.22至31中任何一项的无菌冻干制剂，其在小瓶中被冻干；
33.一种无菌冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)无菌过滤的步骤，
(4)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(5)在0.1-10托的减压下冻干所述冷冻溶液的步骤；
34.33的无菌冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
35.33或34的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在20分钟内完成；
36.33或34的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在15分钟内完成；
37.33或34的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在10分钟内完成；
38.33至37中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.0-5.0mg/mL；
39.33至38中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-4.0mg/mL；
40.33至39中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-3.0mg/mL；
41.33至40中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在-40℃下完成；
42.33至41中任何一项的无菌冻干制剂，其在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后使用；
43.33至42中任何一项的无菌冻干制剂，其在小瓶中被冻干；
44.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-3.5mg/mL的步骤，
(3)冷冻所述溶液的步骤，和
(4)冻干所述冷冻溶液的步骤；
45.44的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基；
46.44或45的冻干制剂，其中所述冷冻是在1小时内完成；
47.44或45的冻干制剂，其中所述冷冻是在40分钟内完成；
48.44至47中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-3.0mg/mL；
49.44至47中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-2.5mg/mL；
50.44至47中任何一项的冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-2.0mg/mL；
51.44至50中任何一项的冻干制剂，其在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后使用；
52.44至51中任何一项的冻干制剂，其在小瓶中被冻干；
53.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值，并通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(4)在减压下冻干所述冷冻溶液的步骤；
54.一种无菌冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值，并通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)无菌过滤的步骤，
(4)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(5)在减压下冻干所述冷冻溶液的步骤；
55.一种无菌冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值，并通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)无菌过滤的步骤，
(4)迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(5)在0.1-10托的减压下冻干所述冷冻溶液的步骤；
56.53至55中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻在20分钟内完成；
57.53至55中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻在15分钟内完成；
58.53至55中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻在10分钟内完成；
59.53至58中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.0-5.0mg/mL；
60.53至58中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-4.0mg/mL；
61.53至58中任何一项的无菌冻干制剂，其中将所述溶液的含水量调节至1.5-3.0mg/mL；
62.53至61中任何一项的无菌冻干制剂，其中所述冷冻是在-40℃下完成；
63.一种冻干制剂，其包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，具有大约3-20μm的中心粒径分布和不超过33μm的D90％值，并通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-3.5mg/mL的步骤，
(3)冷冻所述溶液的步骤，和
(4)冻干所述冷冻溶液的步骤；
等等。
附图说明
图1A是微分干涉显微镜观察1号制剂(实验实施例1)冻干制剂颗粒的输出(output)，图1B是微分干涉显微镜观察5号制剂(实验实施例1)冻干制剂颗粒的输出。
图2显示实验实施例1中每批冻干制剂颗粒的粒径(particle size)分布曲线。
图3包括显示在实验实施例1中在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中以后，冻干制剂的粘度随时间变化的绘图。
图4是显示在实验实施例2中在冷冻前药物溶液的含水量和在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中以后，冻干制剂的粘度随时间变化的绘图。
图5是在实验实施例2中在冻干后由于药物溶液的不同含水量导致的粒径分布曲线。
图6是显示实验实施例2中在冷冻前药物溶液的含水量和冻干制剂颗粒的D90％值之间关系的绘图。
图7B-D是微分干涉显微镜观察实验实施例2中的冻干制剂颗粒的输出。图7A是以图7B-D中放大率的比例(最小刻度10μm)显微镜观察的输出。图7B是在冻干前具有3.0mg/mL的药物溶液含水量的冻干制剂颗粒(球形)的输出，图7C是在冻干前具有5.0mg/mL的药物溶液含水量的冻干制剂颗粒(针状形)的输出，图7D是在冻干前具有0.5mg/mL的药物溶液含水量的冻干制剂颗粒(无定形)的输出。
图8包括显示20mg制剂药物溶液的含水量及冷冻条件和D90％值之间的关系的绘图。
图9包括显示80mg制剂药物溶液的含水量及冷冻条件和D90％值之间的关系的绘图。
图10A-F是微分干涉显微镜观察实验实施例3中的冻干制剂(20mg制剂，球形)颗粒的输出，其中图10A是冻干制剂(20mg制剂，球形)颗粒的输出，图10B是冻干制剂(20mg制剂，纤维)颗粒的输出，图10C是冻干制剂(20mg制剂，微纤维)颗粒的输出，图10D是冻干制剂(20mg制剂，球形)颗粒的输出，图10E是冻干制剂(80mg制剂，球形)颗粒的输出并且图10F是冻干制剂(80mg制剂，微纤维)颗粒的输出。
图11包括显示实验实施例3中在冷冻前药物溶液的冷冻条件，含水量和在将冻干制剂混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中后24小时的粘度的绘图。
图12显示在实验实施例3中D90％值和在将冻干制剂混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中后24小时的粘度之间的关系。
图13包括显示实验实施例4中冷冻条件、过滤处理的存在或不存在和冻干制剂的粒径分布之间关系的绘图。
图14是显示实验实施例4中主要成分沉淀粉末的加入和药物溶液含水量，和D90％值之间的关系的绘图。
图15包括显示实施例5中由于冷冻前药物溶液的不同温度导致对D90％值的影响的绘图。
图16包括显示实施例5中由于冷冻前药物溶液的不同温度导致对粒径分布的影响的绘图。
图17包括显示实施例6中经装载后贮存温度和冻干制剂的粒径分布之间的关系。
图18显示实施例6中经装载后在不同贮存温度下微分干涉显微镜观察冻干制剂的输出。
图19显示实施例6中微分干涉显微镜观察冻干制剂的输出，所述制剂在5℃下冷冻在架上。
图20是显示实施例9中70mg制剂的药物溶液含水量及冷冻条件和D90％值之间关系的绘图。
图21是显示实施例9中在冷冻前70mg制剂的药物溶液含水量，和在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中24小时后的粘度之间关系的绘图。
图22是显示在测试实施例中所用留置针状的导管部分的绘图，其中符号1表示植入肿瘤片段，符号2表示用于止血的海绵胶，符号3表示导管部分并且符号4表示聚乙烯管。
图23是冻干制剂的生产流程图的轮廓。
发明详述
本发明其特征在于冻干制剂的主要成分的粒径分布被控制在预定范围内。这具有可以生产易于操作的稳定的注射剂的结果，其中混悬性能优良，层分离不易发生，粘度不易改变等。即，为了获得稳定的注射剂，优选冻干制剂的粒径分布大约为3-25μm的中心粒径分布，更优选约3-20μm，特别优选约5-20μm。这里，例如“约3-25μm的中心粒径分布”是指最高频率的粒径级分(其中存在分布频率最高的粒径的粒径范围)，即，粒径曲线的峰在3-25μm内。另外，优选D90％值不大于40μm，更优选D90％值不大于33μm，D75％值不大于22μm和D50％值不大于15μm，特别优选D90％值不大于30μm，D75％值不大于20μm和D50％值不大于13μm。稍后将描述将冻干制剂的粒径分布控制在这些范围的方法。
粒径分布的指标“D值”是指它在有关领域通常所用的。即，“Dx％值是pμm”是指全部颗粒x％数量的颗粒不超过pμm并且(100-x)％数量的颗粒大于pμm。颗粒的“径”是所谓的球等量直径，其表示在例如使用激光衍生仪的测量中相当于具有相同尺寸的标准球粒的衍射性能。
本发明的冻干制剂包含作为主要成分的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其具有上述预定的粒径分布。如本文所用，“作为主要成分”是指前述化合物以不小于95重量％(优选97-100重量％，特别优选100重量％)的比例被包含在冻干制剂中。
本发明所用的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)中的R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，如己酰氧基，庚酰氧基，辛酰氧基，壬酰氧基，癸酰氧基，十一烷酰氧基，十二烷酰氧基，十三烷酰氧基，十四烷酰氧基，十五烷酰氧基，十六烷酰氧基，十七烷酰氧基，十八烷酰氧基，十九烷酰氧基，二十烷酰氧基等。优选的烷酰氧基包括含有10-16个碳原子的烷酰氧基，例如癸酰氧基，十一烷酰氧基，十二烷酰氧基，十三烷酰氧基，十四烷酰氧基，十五烷酰氧基，十六烷酰氧基等。更优选的烷酰氧基包括含有13-15个碳原子的烷酰氧基，例如十三烷酰氧基，十四烷酰氧基，十五烷酰氧基等。特别优选的烷酰氧基是十四烷酰氧基等。
本发明所用的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)可以是无水物或水合物。它们在下面被总称为“活性成分”。
可以如下生产本发明的注射用冻干制剂。
制备方法1
(1)溶解步骤
在室温下将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)加入2-甲基-2-丙醇并研磨和混悬。向混悬液加入2-甲基-2-丙醇以使溶解。备选地，将2-甲基-2-丙醇加入顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)并在30-50℃下实施超声处理等10分钟至1小时以使溶解。2-甲基-2-丙醇的量只需不少于溶解顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的量。
(2)调节含水量的步骤
使用Karl-Fischer湿度计等测量顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的2-甲基-2-丙醇溶液的含水量。基于测量的含水量，调节溶液的含水量。含水量根据溶液的冷冻方法(稍后提及)而变化。当迅速冷冻溶液时，含量选自1.0-6.0mg/mL，优选1.5-5.0mg/mL，更优选1.5-4.0mg/mL，还更优选1.5-3.5mg/mL，仍更优选1.5-3.0mg/mL。当不迅速冷冻溶液时，含量选自1.5-3.5mg/mL，优选1.5-3.0mg/mL，更优选1.5-2.5mg/mL，还更优选1.5-2.0mg/mL。
(3)过滤步骤
使用过滤器将溶液进行无菌过滤以灭菌。
(4)装载步骤
将预定量的无菌溶液装在小瓶中。
(5)冷冻步骤
将冷冻干燥机的架子温度(shelf temperature)设置在不高于溶液凝固温度的温度下，将小瓶放置其中并使冷冻。备选地，将温度设置在不低于溶液的凝固温度的温度下，将小瓶放置其中，并通过将温度以预定的冷却速率降低至溶液的凝固温度冷冻。优选在防止吸湿的条件下进行步骤(4)和(5)。优选迅速完成冷冻。在本说明书中，“迅速完成冷冻”是指在20分钟内完成冷冻。然而，更优选在15分钟内，进一步在10分钟内，特别优选在2-10分钟内完成冷冻。
(6)冷冻干燥步骤
将冷冻干燥机的内部减压以使冷冻干燥。
制备方法2
(1)溶解步骤
在室温下将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)一水合物加入2-甲基-2-丙醇并研磨和混悬。2-甲基-2-丙醇的量选自12.5ml±5％：1g(基于无水物)顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)。向混悬液加入2-甲基-2-丙醇以使2-甲基-2-丙醇为250mL/1g(基于无水物)顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)。将温度调节为大约30-40℃并溶解顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)。用于该步骤的2-甲基-2-丙醇可以是任意的只要它具有可以用于药物生产的质量。优选使用蒸馏过的2-甲基-2-丙醇。
(2)调节含水量的步骤
使用Karl-Fischer湿度计等测量顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)的2-甲基-2-丙醇溶液的含水量。基于测量的含水量，通过加入蒸馏水将溶液的含水量调节为约1.0-约5.0mg/mL。优选将该步所用蒸馏水灭菌，和注射用水。优选在无菌隔离装置中进行步骤(1)和(2)。
(3)过滤步骤
用氮给溶液加压(压力：通常不大于1.5kgf/cm2，优选0.1-0.9kgf/cm2)，并使用具有约0.2μm孔径的过滤器进行无菌过滤。优选所用过滤器适用于有机溶剂。
(4)装载步骤
将预定量的无菌溶液装入小瓶。在20mg制剂的情形中，装入5mL；在70mg制剂的情形中，装入17.5mL；80mg制剂的情形中，装入20mL。
(5)冷冻步骤
将冷冻干燥机的架子温度设置在-40℃，将部分塞好的小瓶放置其中。在20分钟内，优选在15分钟内(更优选2-10分钟)，冷冻小瓶中的溶液。优选在防止吸湿的条件下在低湿度环境(环境温度：28-35℃，相对湿度：5-40％)下进行步骤(4)和(5)。
(6)冻干步骤
将冷冻干燥机的内部减压以使冷冻干燥。优选如下进行冷冻干燥。初始冻干条件：shelf温度-20℃至10℃，真空度0.1-5托，次级冻干条件：shelf温度40℃至60℃，真空度0.1-1托。本发明注射用冻干制剂的剂量作为活性成分对于成年人通常为1-500mg/天。给药方法例如为局部动脉注射，特别优选肝动脉导管插入术。可以以在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的混悬液的形式等给药本发明的注射用冻干制剂。在该情形中，活性成分的浓度理想地为1-100mg/mL。已经阐明当将通过上述方法生产的冻干制剂混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中时，可以防止随着时间的推移粘度增加和混悬液的层分离(参见实验实施例)。
实施例
通过参考实施例详细解释本发明，所述实施例不应被认为是限制性的。
实验实施例1
将2-甲基-2-丙醇(1000ml)加入顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物(4g)并将混合物超声处理30分钟。在30-40℃下搅拌混合物以使溶解(在实验实施例2和以下中，该溶液被称为“药物溶液”)。将该溶液通过过滤器(孔径0.22μm)以灭菌。将5mL的该溶液装入小瓶。将小瓶放在设置为30℃的架上并在约2小时内逐渐冷却到-40℃以使冷冻。将它冻干以产生具有不同粒径(在下列“实验实施例1-1”中测量)的注射用冷冻干燥制剂(20mg)。
实验实施例1-1
向上述注射用冻干制剂(20mg)加入4mL肉豆蔻酸异丙酯以产生混悬液。使用由Olympus公司制备的垂直微分干涉显微镜，观察颗粒形状，使用由Shimadzu公司制备的激光衍射类型的粒径分布分析器SALD-3000测量粒径分布。结果在图1和图2中显示。
由Shimadzu公司制备的激光衍射类型的粒径分布分析器SALD-3000的粒径分布测量条件如下。
·混悬/稀释剂：IPM-EX(肉豆蔻酸异丙酯)
·测量时活性成分的浓度：大约0.03mg/mL
·折射率：2.40-0.20i
·分布基础：体积
·筛分：筛下物
·分布函数：非变换的
·光滑水平：0
·数据移位：0
·测量数：1次
·测量吸光度范围：最大值0.200，
                  最小值0.010
结果，颗粒形状的观察主要显示两种类型。一种是其中大部分颗粒是无定形的并且包含超过50-100μm的大的无定形颗粒一组，另外一种是主要包括5-20μm的球粒的一组。这些组的粒径分布可以分为两类：一类具有50-100μm的D90％值，另一类具有10-30μm的D90％值，如表1所示。粒径分布曲线如图2所示。其中，具有10-30μm的D90％值的组(制剂5和6)对应于本发明的实施例，其它组(制剂号1-4)对应于比较实施例(表1)。
                     表1
            冻干制剂颗粒的粒径分布
    制剂号     粒径分布[μm]
    D90％   D75％   D50％
    1     52.1   28.3   14.1
    2     51.1   26.2   12.6
    3     48.7   22.7   10.1
    4     50.3   28.6   14.4
    5     16.0   11.3   8.5
    6     19.8   13.1   9.1
实验实施例1-2
将1mL罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物(含水量0.4-0.7mg/mL)加入在实验实施例1中获得的注射用冻干制剂(20mg)以产生顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)的混悬液。混悬液中活性成分的浓度为20mg/mL。然后在室温下静置混悬液，测量随着时间的推移粘度的变化。
校准用于粘度测量的简易粘度计。从简易粘度计的流动孔吸取用于粘度校准(日本工业标准JIS Z8809)的标准溶液JS50，JS200，用秒表测量流动预定距离所需的时间两次并记录到第二个小数位(单位秒)。基于获得的两次流动时间的平均值(到第二个小数位(单位秒))，从式(1)确定每种标准溶液的K值直至第四个小数位。另外，求各种标准溶液的K值的平均值并确定到第四个小数位，并作为简易粘度计所用的K值。用于粘度校准的标准溶液被保持在20℃的液体温度下的恒温室等之中，并在取出后立即用于测量。
K值＝20℃的运动粘度[mm2/s]÷流动时间的平均值[秒]    式(1)
然后，在室温下测量每小瓶在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)，随着时间的推移的粘度。即，从校准的简易粘度计的流动孔吸取罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物的混悬液，用秒表两次测量流动预定距离所需的时间并记录到第二个小数位(单位秒)。基于获得的两次流动时间的平均值(到第一个小数位(单位秒))，从式(2)确定粘度直至第一个小数位。
粘度[mpa.s]＝流动时间的平均值[秒]×K值×罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物的密度1.281[g/cm2]    式(2)
粘度测量的结果在图3中显示。
从实验实施例1-1和实验实施例1-2的结果，提示粒径分布或颗粒形状与粘度增加的差异相关。
实验实施例2
然后，研究当在冷冻前药物溶液的含水量改变时冻干后制剂的性质如何变化。将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物溶解在2-甲基-2-丙醇中，并使用Karl-Fischer湿度计测量含水量。加入使含水量为0.5mg/mL-6.0mg/mL的计算量的注射用蒸馏用水，产生具有不同含水量的药物溶液。具有1-4mg/mL含水量的组对应于本发明的实施例，除了那些的组对应于比较实施例。通过滤器过滤(孔径：0.22μm)将每种药物溶液灭菌。将5mL各种药物溶液装入小瓶并部分塞住。将小瓶放置在设定为30℃的架上并在约2小时内逐渐冷却至-40℃以使冷冻。将它冷冻以产生注射用冻干制剂。
实验实施例2-1
通过与实验实施例1-2相同的方法评估在实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后粘度的变化。结果在图4中表示。发现在冷冻前含水量的增加与防止粘度随时间的推移而增加有关。
实验实施例2-2
通过与实验实施例1-1相同的方法测量在实验实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)的粒径分布。结果在图5，图6和表2中显示。
                             表2
                   图5的图表数据的粒径分布数据
    在冷冻干燥前药物溶液的含水量   粒径分布[μm]
  D50％   D75％     D90％
    0.3mg/mL   17.0   43.3     97.3
    1.0mg/mL   11.2   18.0     30.0
    1.5mg/mL   7.9   10.1     13.6
    3.0mg/mL   8.4   12.6     17.5
    4.4mg/mL   11.2   21.1     32.7
    5.3mg/mL   17.3   28.1     40.5
当冷冻干燥前的含水量小于0.5mg/mL时，粒径分布大。当含水量增加时，较大粒径级分的颗粒相对数量减少，在约1.5mg/mL的含水量下，发现具有比较窄的分布宽度的尖锐分布。随含水量增加，大的粒径级分增加并变宽，其中发现从约4.0mg/mL的含水量开始宽分布的峰顶(最高频率的粒径级分)移动至更大的粒径侧。当在D90％值方面比较粒径分布的变化时，在冷冻干燥前低于约0.5mg/mL的含水量显示不小于50μm的值，其随着含水量增加逐渐减少，在大约1.5mg/mL的含水量附近显示约20μm的值。另外，当含水量增加时，D90％值再次变大，在约4.0-约5.0mg/mL下，它显示大约35-大约50μm的值。
实验实施例2-3
向在实验实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)加入4mL肉豆蔻酸异丙酯以产生混悬液，通过与实验实施例1-1相同的方法使用由Olympus公司制备的微分干涉显微镜，观察颗粒形状。结果在图7中显示。当在冷冻干燥前的含水量小于约0.5mg/mL时，大部分颗粒是无定形的，包含超过大约50-大约100μm的无定形颗粒。颗粒表面不具有不均匀性的规律性。当在冷冻干燥前的含水量增加并达到大约1.5-大约3.0mg/mL时，大多数颗粒是约5-约30μm的球粒，几乎没有发现无定形颗粒。当含水量增加时，单独的颗粒变大并且球粒的表面开始长成针状。另外，当含水量变成大约5.0mg/mL时，大约30-大约50μm的球粒的表面变成针状(表3)。
                              表3
在冷冻前具有不同药物溶液含水量的冻干制剂颗粒的颗粒形状
冷冻干燥前的含水量(mg/mL) 颗粒形状
小于0.5 大约50-大约100μm的无定形颗粒的混合物
1.0 大约5-大约20μm的球粒。存在少量大约50的无定形颗粒。
1.5 大约5-大约20μm的球粒。
3.0 大约10-大约30μm的球粒。颗粒表面稍微变成针状。
5.3 大约30-大约50μm的球粒表面变成针状状。
实验实施例2-4
测量在实验实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)在混悬后能够作为均匀混悬液稳定保持而不分成两层的时间。向注射用冻干制剂(20mg)加入1mL罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物(含水量0.4-0.6mg/mL)以产生混悬液。观察随时间推移的混悬液的溶解状态。结果，当冷冻前含水量增加时，活性成分倾向于沉淀到混悬液的下层，在分成两层之前的时间倾向于变短(表4)。
                              表4
在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中以后，在冷冻前药物溶液的含水量不同的的冻干制剂的稳定性
    在冷冻干燥前药物溶液的含水量[mg/mL]   在混悬后混悬液的均匀性和时间的流逝
  1小时   3小时   6小时     24小时
    ＜0.5   均匀   均匀   均匀     均匀
    1.0   均匀   均匀   均匀     均匀
    1.5   均匀   均匀   均匀     均匀
    2.0   均匀   均匀   均匀     均匀
    3.0   均匀   均匀   均匀     均匀
    4.0   均匀   均匀   均匀   2层分离
    5.1   均匀   均匀   2层分离   2层分离
    6.2   均匀   均匀   2层分离   2层分离
实验实施例2-5
比较在实验实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的可操作性。向在实验实施例2中获得的注射用冻干制剂(20mg)加入1mL罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物(含水量0.4-0.6mg/mL)，评估其接下来的操作可以产生均匀的混悬液。加入罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物，在使它与活性成分混合后旋转小瓶，将仅通过用手轻轻摇动小瓶而均匀混悬的评估为“容易”，将通过上述操作未能变得足够均匀并且只有通过摇动小瓶同时用手击打底部而混悬的评估为“困难”。结果，当冷冻前的含水量增加时，混悬性能倾向于变难(表5)。
                         表5
在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中，在冷冻前药物溶液的含水量不同的冻干制剂的混悬性能
    在冷冻前药物溶液的含水量[mg/mL]     混悬性能
    0.5     容易
    1.5     容易
    3.5     容易
    5.0     容易
    6.0     困难
从上述结果，由于在冷冻前药物溶液含水量的变化，在冷冻干燥后制剂的性能显著改变，据阐明通过控制含水量可以获得易于操作的制剂。即，当将注射用冻干制剂(20mg)放置在冷冻干燥机的架上(温度30℃)，并通过在约2小时内逐渐冷却至-40℃使其冷冻，冻干，考虑到防止粘度增加优选含水量不小于1.5mg/mL，考虑到在混悬后的均匀性(在混悬后长时间不分成两层)和混悬操作的容易优选含水量不超过大约4.0mg/mL，其又提示最适范围为1.5-4.0mg/mL。另外，提示通过将冷冻干燥后的活性成分粉末的粒径分布控制在D90％值不超过33μm，或者作为球形颗粒可以获得易于操作的稳定的注射用冻干制剂(表6)。
                           表6
在冷冻前药物溶液含水量不同的冻干制剂的制剂性能比较表
  在冷冻前药物溶液的含水量[mg/mL] 粒径分布(D90％)[μm] 颗粒形状 粘度稳定性 在混悬后能够保持均匀状态而不分成两层的时间 混悬性能
  ＜0.5 大约40-大约100   无定形   ×     24小时＜ 容易
  1.0 大约20-大约30   大部分球粒 ○
  1.5 大约10-大约25
  2.0 大约20-大约25
  3.0 大约20-大约30
  4.0 大约30-大约35     6小时
  5.0 大约37-大约50   具有针状球粒表面的颗粒   ◎     3小时
6.0 大约50-大约60 3小时 困难
粘度稳定性是基于下列评估标准。
◎；在混悬24小时后的粘度小于在混悬后即刻粘度的两倍
○；在混悬3小时后的粘度小于在混悬后即刻粘度的两倍
×；在混悬3小时后的粘度不小于在混悬后即刻粘度的两倍
实验实施例3
在大约1.5-大约6mg/mL的范围内改变冷冻干燥前药物溶液的含水量，将溶液过滤灭菌，装入小瓶，在各种冷冻条件下冻干以产生20mg制剂和80mg制剂。评估获得的制剂的粒径分布(D90％值)，颗粒形状，在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中后的粘度变化，在混悬后的稳定性(能够保持均匀的混悬液而不分成两层的时间)和混悬性能。
实验实施例3-1
评估在实验实施例3中获得的20mg制剂和80mg制剂的粒径分布(D90％值)和颗粒形状。通过以与实验实施例1的方法相同的方式将制剂混悬在肉豆蔻酸异丙酯中并使用激光衍射类型的粒径分布分析器(SALD-3000，由Shimadzu公司制备)测量粒径分布。结果在图8和图9中显示。关于颗粒形状，以与实验实施例1的方法相同的方式将制剂混悬在肉豆蔻酸异丙酯中并在由Olympus公司制备的垂直微分干涉显微镜下观察混悬液中的颗粒的形状。结果在图10中显示。
结果，如实验实施例2所证实取决于在冷冻干燥前药物溶液的含水量，在任何冷冻条件下20mg制剂和80mg制剂的粒径分布(D90％值)和颗粒形状都变化。在20mg制剂中，通过将冷冻干燥前的药物溶液的含水量设置在大约2.0-大约3.0mg/mL的范围，在任何冷冻条件下D90％值不超过33μm，在颗粒形状观察中，证实大约10-大约20μm的球粒。在包括在-40℃下冷冻，在30℃下装料和在1小时内冷却至-40℃(此后表示为“30℃→-40℃/1小时条件”)的条件下，即使当冷冻干燥前的含水量最高时D90％值不超过33μm，通过颗粒形状观察证实大约10-大约20μm的球粒。在其它冷冻条件下，当含水量不小于大约3.0mg/mL时在各批和各小瓶之间D90％值很分散。
在80mg制剂中，在-40℃和30℃→-40℃/1小时冷冻的条件下在大约1.5-大约3.0mg/mL的冷冻干燥前药物溶液的含水量范围内，D90％值不超过33μm，其中特别是通过在-40℃下冷冻，在大约1.5-大约5.0mg/mL的冷冻干燥前药物溶液的含水量范围内，D90％值变得不超过33μm，通过颗粒形状观察证实大约10-大约20μm的球粒。在其它冷冻条件下，获得具有不超过33μm的D90％值的冻干制剂的药物溶液含水量范围变得窄至约0.5mg/mL，并且D90％值变得大于在-40℃下冷冻的值。从这些可看出，从控制D90％值和控制颗粒形状的观点，-40℃冷冻条件是最优越的(表7)。
                                        表7
通过不同的冷冻条件和冷冻前药物溶液的不同含水量形成冷冻干燥后的颗粒形状
  含水量[mg/mL]     冷冻条件
-40℃ 5℃   30℃ →-40℃/1小时   30℃→-40℃/4小时   30℃→-40℃/2.2小时
  20mg   80mg     20mg    80mg   20mg    80mg   20mg    80mg   20mg    80mg
  1.0   △     △     -       -   △      △   △      △   -       -
  1.5   ○     ○     ○      ○   ○      ○   ○      ○   -       -
  2.0   ○     ○     ●      ●   ○      ○   ○      ○   ○      -
  2.5   ○     ○     -       ●-◆   -       -   ○      ●-◆   -       -
  3.0   ○     ○     -       ◆   ○      ○   ○      ◆   ●      -
  3.6   ○     ●     ◆       -    -      -   ○      ◆   ◆      -
  4.0   ○     ●-◆     ◆       -    ◆     ◆   ◆      ◆    -      -
  5.0   ●     ●-◆     -        -    ◆     ◆   ◆      ◆    -      -
  6.0   ●     ●-◆     -        -    ◆     ◆   ◆      ◆    -      -
注释：表中的符号是指下列颗粒形状。-：未进行
△：无定形颗粒 ○：球形颗粒 ●：球粒的颗粒表而稍微变成针状，◆：球粒的颗粒表面变成针状
实验实施例3-2
评估在实验实施例3中获得的20mg制剂和80mg制剂在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后在室温下静置24小时后粘度的变化。将罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物(含水量0.4-0.7mg/mL)加入每种制剂以使活性成分的浓度大约为20mg/mL并均匀混悬在其中。按照实验实施例1-2中所述方法使用简易流动粘度计测量在室温下静置24小时后的粘度。结果如图11所示。在所有的冷冻条件下，在冷冻干燥前药物溶液的含水量越高，粘度变得越低。以相同的含水量，与其它冷冻条件相比-40℃冷冻倾向于显示更高的粘度，并且20mg制剂倾向于显示比80mg制剂更高的粘度。
此外，在图12中显示D90％值和在混悬后24小时的粘度。发现与冷冻条件和制剂剂量无关，在冷冻前含水量不小于1.5mg/mL的几乎不含无定形颗粒的制剂当D90％值增加时显示较低的混悬后24小时的粘度，并且粘度不易增大。
实验实施例3-3
通过与实验实施例2相同的方法评估在实验实施例3中获得的20mg制剂和80mg制剂在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后保持稳定的均匀混悬液而不分成两层的能力。结果，在任何条件下当冷冻前含水量增加时，当混悬后时间的流逝变长时，活性组分倾向于沉淀在混悬液下层，导致两层分离。在来自低含水量的80mg制剂中比在20mg制剂中更证实了该趋势。然而，在-40℃的冷冻条件下，与包含从30℃逐渐冷却到-40℃以使冷却的条件相比，即使当含水量高时，制剂也可稳定地作为不易分成两层的均匀混悬液存在。
研究混悬后的稳定性及D90％值和颗粒形状之间的关系，发现与制剂的剂量和冷冻条件无关，当D90％值增加到不小于40μm时和当随其一起颗粒形状从球粒表面变成针状时制剂容易分成两层(表8)。
                                表8
在混悬在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中之后，具有冷冻前不同药物溶液含水量的冻干制剂的稳定性
制剂 冷冻条件 在冷冻前药物溶液的含水量[mg/mL]   在混悬后的均匀性和时间流逝
1小时 3小时 6小时 24小时
  20mg制剂   -40℃冷冻   1.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  1.5   均匀   均匀   均匀   均匀
  2.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  3.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  4.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  5.1   均匀   均匀   均匀   均匀
  6.2   均匀   均匀   均匀   均匀
80mg制剂   1.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  1.5   均匀   均匀   均匀   均匀
  2.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  3.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  4.0   均匀   均匀   均匀   两层分离
  6.2   均匀   均匀   两层分离   两层分离
通过在4小时内逐渐从30℃冷却至-40℃冷冻   1.0   均匀   均匀   均匀   均匀
  1.5   均匀   均匀   均匀   均匀
  2.0   均匀   均匀   均匀   两层分离
  3.0   均匀   均匀   两层分离   两层分离
  4.0   均匀   两层分离   两层分离   两层分离
  6.2   均匀   两层分离   两层分离   两层分离
实验实施例3-4
通过与实验实施例2相同的方法比较在实验实施例3中获得的20mg制剂和80mg制剂在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的混悬性能。结果，当冷冻前含水量增加时，混悬性能变差，并且比20mg制剂中含水量更低的80mg制剂混悬性能变差。然而，与包含逐渐从30℃冷却至-40℃以使冷冻的条件相比，在-40℃冷冻条件下，即使当含水量高时混悬性能也优良(表9)。
                       表9
具有在冷冻前不同药物溶液含水量的冻干制剂在罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物中的混悬性能
制剂 冷冻条件   在冷冻前药物溶液的含水量[mg/mL] 混悬性能
20mg制剂 -40℃冷冻   1.5     容易
  3.5     容易
  5.0     容易
  6.0     容易
80mg制剂   1.6     容易
  3.6     容易
  5.0     容易
  6.2     稍微困难
通过在4小时内逐渐从30℃冷却至-40℃冷冻   1.6     容易
  3.6     稍微困难
  5.0     稍微困难
  6.2     稍微困难
从上述结果，对于在混悬后不显示粘度容易增大，在混悬后不易分成两层，显示优良混悬性能并易于操作的制剂，必须控制在冷冻干燥后活性成分颗粒的粒径分布和颗粒形状。控制的范围是不超过大约40μm的D90％值，最高频率的颗粒粒组为3-25μm，并且对于颗粒形状是除了无定形颗粒以外。对于颗粒形状，当球粒的表面开始变成针状时，两层分离的频率和混悬性能的困难增加。对于颗粒形状的针状水平，优选将90％值设置在不超过大约40μm。
实验实施例4
制备具有大约1.5-大约6mg/mL的含水量的药物溶液并将溶液滤过0.2μm滤器灭菌，在各种条件下将免于滤除的溶液冷冻和冻干以产生20mg制剂和80mg制剂。然后比较无菌过滤对粒径分布的影响。结果在图13中显示。无菌过滤前的药物溶液是无色和透明的。
由于无菌过滤导致D90％值改变。当含水量相同时，无菌过滤减少D90％值。发现该差别在30℃下装料和在大约2.2小时内冷却至-40℃(30℃→-40℃/2.2小时)或在30℃下装料和在4小时内冷却至-40℃(30℃→-40℃/4小时)的冷冻条件下更显著。
然后通过过滤将具有大约2-大约3.5mg/mL含水量的药物溶液灭菌，少量加入从药物溶液分离沉淀的活性成分粉末，在-40℃下冷冻混合物并使用由Kyowa Vacuum Engineering生产的冷冻干燥机制备20mg制剂和80mg制剂。研究获得的冻干制剂活性成分沉淀粉末的加入对粒径分布和颗粒形状的影响。结果在图14中显示。当加入活性成分粉末时，在任何含水量下20mg制剂和80mg制剂显示稍微增加的D90％值。尽管颗粒形状显示微量的无定形粉末，其似乎象活性成分粉末，颗粒是球状并相当于D90％值的水平并且未显示明显变化。
实施例5
在-40℃冷冻条件下，担心在装入冷冻干燥机期间药物溶液温度的变化可能导致冷冻速度改变，在各批之间或在批内粒径分布可能变得不一致。因此，在将含水量调节为大约1.5-大约4.0mg/mL和无菌过滤后，药物溶液的温度在大约28℃至大约40℃的范围内变化，冷冻至-40℃，研究对冷冻干燥后的粒径分布的影响。结果在图15和图16中显示。结果，当冷冻前药物溶液的温度增加时，D90％值变小并且粒径分布也变尖锐。因此，通过控制液体制剂的温度(大约35-大约40℃)和装填环境的温度(大约30℃)，并且防止在装载期间药物溶液温度的快速下降，对粒径分布的影响变小。
实施例6
当生产规模变大和将小瓶接连放置在冷冻干燥机的架上时，通过来自药物溶液的热设置为-40℃的架子温度升高。取决于冷冻干燥机的性能，-40℃的可控范围也变化。从优化生产条件和选择放大装置方面，研究在-40℃的冷冻条件下架子温度的可容忍范围。将药物溶液的含水量调节至大约1.5-大约4.0mg/mL，通过过滤将药物溶液灭菌，装料，冷冻并在5℃至-45℃的架子温度下冻干以产生20mg制剂和80mg制剂。通过上述方法评估获得的制剂的粒径分布和颗粒形状，并考虑由于不同架子温度导致对装料的影响。结果在图17，图18和图19中显示。当在装载时架子温度不低于-20℃时，当装料时的架子温度增加时，20mg制剂和80mg制剂都显示更大的D90％值。然而，当在-45℃至-20℃的架子温度下冷冻药物溶液时，可将D90％值控制在大约30μm。
当在装载时的架子温度为5℃时，D90％值变大并且可以将D90％值控制只在狭窄含水量范围内的大约40μm。还关于颗粒形状，与不超过-20℃的架子温度相比，证实即使在低含水量下颗粒表面已经变成针状。将具有大约4.0mg/mL的冷冻干燥前药物溶液含水量的20mg制剂分成在5℃下装料后数分钟内从小瓶底部开始冷冻的小瓶，和在装料后大约30分钟流逝后瞬时冷冻的小瓶。前者的D90％值(图17中的曲线×)是大约30μm并且颗粒具有针状表面。后者的D90％值(图17中的曲线◇)小至大约10μm并且它们是大约10μm的球粒。
实验实施例7
考虑将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物(此后也称为散装(bulk))溶解在2-甲基-2-丙醇中的方法。
考虑在匀浆器中制备高浓度细碎粒的散装混悬液，并通过将2-甲基-2-丙醇加至液体制剂浓度溶解它的方法。向顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物加入2-甲基-2-丙醇至大约80mg/mL的浓度(大约20倍的液体制剂温度)，使用由TOKUSHU KIKAKOGYO有限公司制备的T.K.ROBOMICS，在大约5000-大约10000rpm下研磨和混悬混合物大约10分钟。向其中加入2-甲基-2-丙醇至大约4.0mg/mL的液体制剂浓度，用磁搅拌器搅拌混合物。将在操作期间药物溶液的温度保持在大约35-大约40℃并证实散装的完全溶解。结果，证实通过该操作，可在比通过常规方法(在超声混悬后，用磁搅拌器搅拌)更短的时间内将活性组分溶解，未产生由于活性成分降解等导致的黑色杂质。
然后，考虑含量和类似物质是否受在均相混合器中搅拌的影响。向顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物加入2-甲基-2-丙醇至大约4.0mg/mL的液体制剂浓度。这是在2只锥形瓶中制备。在超声处理后在大约40℃的液体温度下用搅拌器搅拌一只锥形瓶。使用Polytron粉磨机(粉碎直径G8)在大约40℃的液体温度下在大约10000rpm下搅拌另一锥形瓶，所述粉磨机由IKA制备，通过与匀浆器相同的机理粉碎和溶解。以溶解bulk时的时刻作为0小时持续搅拌。随时间推移取样药物溶液，观察溶解状态，并测量含量和类似物质。结果，通过任何搅拌方法未发现黑色杂质等，含量和类似物质未显示变化，如表10中所总结。
                                 表10
通过Polytron搅拌和溶解与通过搅拌器搅拌和溶解之间的量的比较
    实验号   样品     含量[与0小时相比％]     杂质     其它杂质
溶解搅拌方法     搅拌时间     4.7min     7.6min     9.2min     10.1min     14.0min     16.6min     17.9min     23.6min     27.9min
1   Polytron 0     100     0.17     0.02     ＜0.01     0.05     0.04     0.05     0.03     0.01     ＜0.01
  搅拌器     100     0.17     0.02     ＜0.01     0.05     0.04     0.05     0.03     0.01     ＜0.01
  Polytron 0.5h     99.5     0.17     0.02     ＜0.01     0.04     0.04     0.04     0.04     ＜0.01     0.02
  搅拌器     100.9     0.18     0.03     ＜0.01     0.05     0.04     0.04     0.01     ＜0.01     0.01
  Polytron 1h     99.4     0.18     0.02     0.01     0.04     0.04     0.04     0.03     ＜0.01     0.02
  搅拌器     100.2     0.18     0.01     ＜0.01     0.05     0.04     0.04     0.02     ＜0.01     0.01
  Polytron 2h     100.9     0.17     0.03     0.01     0.04     0.05     0.03     0.02     ＜0.01     0.02
  搅拌器     103.1     0.17     0.02     ＜0.01     0.04     0.04     0.04     0.04     ＜0.01     0.01
    2   Polytron     0     NP     0.12     0.02     ＜0.01     0.04     0.04     0.04     0.04     0.01     0.01
    2h     NP     0.11     0.02     0.01     0.06     0.04     0.05     0.04     ＜0.01     0.01
    3h     NP     0.11     0.01     ＜0.01     0.05     0.04     0.04     0.02     0.01     0.01
  搅拌器     3h     NP     0.17     0.03     0.01     0.05     0.04     0.04     0.01     ＜0.01     0.02
NP：未进行                                     (单位％)
实施例8
考虑满足防止制剂在冷冻干燥期间散射和缩短冻干步骤两者的冻干条件。
将装有药物溶液(5mL)并部分密封的18mL小瓶(相当于20mg制剂)和装有药物溶液(20mL)并部分密封的30mL小瓶(相当于80mg制剂)放置在冷冻干燥机上，在各种真空度和架上温度下冷冻和初步干燥。同时，还以相同方式装入空白溶液(2-甲基-2-丙醇)并初步冻干，以便可以从冷冻干燥机的观察窗监视升华状态。在从冷冻干燥机的观察窗证实整个空白溶液缺乏升华后，进行次级冻干(在1小时内达到大约1.0托的真空度，其后在40℃的架上温度下冻干6小时)。在完成次级冻干后密封小瓶并观察散射状态。
在干燥步骤中影响升华速度的是产物温度。影响产物温度的是架上温度和真空度。在样品升华界面处的产物温度取决于真空度，从Antoine方程可以计算理论产物温度和理论蒸汽压。然而，在样品升华界面下的冷冻相受来自架上温度的热供应影响，当它更接近小瓶底部时变得更高。冷冻相之间的产物温度差异越大，升华速度变得越大。相反，倾向于发生散射，这是因为在小瓶底部的升华力碰撞增加在小瓶上部的升华面。因此，架上温度和真空度变化不同以致在升华界面处的理论产物温度和架上温度(类似于接近小瓶底部的产物温度)之间的差别不变得太大。然后用肉眼证实活性组分的升华速度和散射程度并在表11中总结评估结果。将“散射水平”分成“通过仔细观察，在小瓶肩部(shoulder)观察到散射”水平(水平A)，“比水平A在小瓶架上更大的散射”(水平B)，“由于确认散射不仅在小瓶肩部而且在部分施用的橡皮封口反面发生，导致活性组分的附着”(水平C)。
                                               表11
在每种初级干燥条件下的散射水平和需要的冻干时间
    初级干燥条件 在升华界面处的理论产物温度[℃]1) 差别[℃]2)(a-b) 散射水平     需要的初步干燥时间[hour]3)
    真空度[托]     架上温度[℃] 20mg制剂 80mg制剂
5     10 -1.8     11.8     C     NP     ＜24
    5     6.8     B     NP     ＜24
    0     1.8     A     (12＜)＜28     (40＜)＜58
    -1     0.8     A     (12＜)＜28     (40＜)＜58
    2     -10     -12.5     2.5     A     NP     NP
    1.5     -15.9     5.9     B     NP     NP
    1     -20.7     10.7     C     NP     NP
    0.85     -20     -22.6     2.6     A     73     140
1)：理论逼进线是来自3个点的逼进线，其显示下图中通过Antoine方程对2-甲基-2-丙醇计算的饱和蒸汽压和产物温度之间的关系。基于该线，将在每个真空度与理论逼进线的交叉点当作升华界面的理论产物温度。
2)：假定接近小瓶底部的产物温度类似于架上温度，计算升华界面处的理论产物温度的差异并当作升华速度的气压计。
3)：当小瓶中2-甲基-2-丙醇的残渣不在视觉上被观察到的时间。然而，当前条件基本上要求另外的冻干步骤。
结果显示在升华界面处的理论产物温度和架上温度之间差别越大，在肉眼观察水平上散射的量变得越大。特别是，散射倾向于更容易在高真空中发生并且散射在1托下比在5托下更容易发生。从上述结果和考虑到防止散射和缩短干燥时间之间的平衡，在“架上温度；-1℃，真空度；5托”下初步冻干是有效的并且允许冻干时间是“对于20mg制剂不少于35小时和对于80mg制剂不少于65小时”。关于转换到次级冻干，用不少于1小时逐渐达到0.1-1托的高真空并且架上温度升高至40℃，因为真空度的迅速变化导致活性组分由于湍流的散射。
实验实施例9
向顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)一水合物(散装)加入2-甲基-2-丙醇以使浓度大约为4.0mg/mL，在超声处理后，通过搅拌加热至大约30℃-大约40℃，将混合物完全溶解。通过逐步加水至溶液，制备几种具有大约1.5-大约6.0mg/mL范围的含水量的溶液，并搅拌每种溶液以产生均匀溶液。然后将溶液放置在压力槽中并通过在气密系统中使用具有0.2μm孔径的滤器过滤通过氮加压(压力：不大于1kg/cm2)灭菌。在低湿度环境下(环境温度：28-35℃，相对湿度：5-40％)同时防止吸湿将滤液(17.5mL)装在小瓶中。在将小瓶部分塞住后，立即将小瓶放置在架上温度为-40℃的冷冻干燥机的架上以使在10-20分钟内冷冻。进行冷冻干燥(初始抽空：架上温度-40℃，初级干燥条件：架上温度-1℃，真空度5托，次级干燥条件：架上温度40℃，真空度1托)以产生用于70mg注射剂的顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(十四烷酰氧基)]铂(II)冻干制剂。
通过在实验实施例1-1和实验实施例1-2中所述方法测量用于70mg注射剂的具有各种含水量的冻干制剂的粒径分布和粘度变化。结果在图20和图21中显示。
测试实施例
研究使用碘化油的本发明的冻干制剂(此后简称为冻干制剂)在大鼠肝癌的肝动脉内给药模型中的功效。
作为冻干制剂，使用按照实验实施例2的方法制备的20mg制剂(冷冻条件：缓慢冷却条件(冷却速度：30℃→-40℃/大约2小时)；当装载小瓶时的含水量：1.5-2mg/mL；粒径分布：不超过20μm的D90％)。
在该测试实施例中的缩写LPD表示罂粟子油的脂肪酸乙酯的碘加成物(碘化油超流体)。作为该LPD，使用Mitsui Pharmaceut.Inc.(当前NihonSchering K.K.)所提供的。
(测试系统)
1)细胞
按照在稍后提及的测试方法中的部分3)肿瘤植入的所述方法将由Kumamoto大学提供的大鼠腹水肝癌细胞系AH109A植入雄性Donryu大鼠的肝脏中，其通过体内传代维持并用于测试。
2)大鼠
使用购自Charles River Japan，Inc.的雄性Donryu大鼠。
(测试方法)
1)试剂，测试溶液和仪器
i)作为常规麻醉药，使用DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO.，LTD.提供的戊巴比妥钠注射剂。
ii)作为Hanks溶液，使用GIBCO BRL提供的Hanks平衡盐溶液。
iii)作为留置针，使用TERUMO CORPORATION提供的SurFlow Flash18G×2”。
iv)作为用于止血的海绵胶，使用Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd.提供的海绵胶。
v)作为聚乙烯管，使用Natume Seisakusyo Co.，Ltd.提供的聚乙烯管SP10。
vi)作为硫酸软骨素制剂，使用Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.提供的1％chondron肠胃外注射剂。
vii)作为包含肝素的生理盐水，使用通过将从GIBCO BRL可获得的来源于猪的肝素，加入Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.提供的OtsukaNormal Saline中至20U/ml的一种。
viii)作为测径器，使用由Nihon Sokutei Kougu K.K.制备的电子数字测径器MAX-CAL。
ix)作为注射器，使用由Hamilton制备的50μl微量注射器。
2)动物饲养
饲养室中的饲养环境是温度不低于20℃和不高于26℃，湿度不低于30％和不高于70％，在8am照明和在8pm熄灯的亮度和黑暗循环，其是12小时亮期和12小时暗期。所用饲料是由CLEA JAPAN，INC.提供的CL-2。从给水瓶喂水。
3)肿瘤植入
i)在常规麻醉药下，打开携带肿瘤的大鼠的腹部并从肝脏切除AH109A实体瘤块。以大约50mg/kg腹膜内给药常规麻醉药。在下列各项中，始终以相同方法给予常规麻醉药。
ii)在Hanks溶液中用剪刀将切除的实体瘤块切割成小块，以制备大约1mm正方形的植入肿瘤片段。
iii)在常规麻醉药下，用剪刀刮健康大鼠的腹部并在用碘化油灭菌后打开。
iv)使用留置针的导管部分，将在ii)中制备的植入肿瘤片段移植到肝脏左叶。用剪刀以锐角切除导管部分的尖端。如图22所示，将用于止血的海绵胶2切成类似于植入肿瘤片段1的大小，并以该顺序从导管部分3的尖端嵌入植入肿瘤片段1，将导管部分3的尖端大约1cm插入肝脏。使用聚乙烯管4从导管部分3的注射器连接端用海绵胶2将植入肿瘤碎片1推入肝脏。
v)为了防止肝粘附，将硫酸软骨素制剂和包含肝素的生理盐水腹膜内加入。加入硫酸软骨素制剂的量为每个0.1ml。加入包含肝素的生理盐水直至整个肝被浸透。
vi)在用Isodine将缝合部分灭菌后用丝线缝合腹部，然后将大鼠放回饲养笼。
4)给药液体制剂
以20mg/mL制备冻干制剂的LPD混悬液。
将LPD(1ml)加入冻干制剂(20mg)并混悬以产生均匀混悬液。在给药当天使用时制备给药液体，并且在配置后，保持在室温下直至给药。
5)功效评估
i)在将AH109A移植至肝脏后刮大鼠的腹部，并且在饲养19或20天后，用Isodine灭菌并在常规麻醉药下打开。
ii)证实肿瘤的存活并且对于含有活肿瘤的个体，使用电子侧径器测量肿瘤的长轴和短轴。
iii)从下式计算肿瘤面积。
肿瘤面积(mm2)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴(mm)。
使用具有100-250mm2肿瘤面积的肿瘤携带大鼠。
iv)测试组包括4组非处理组，伪操作(sham operation)组，LPD给药组，和冻干制剂/LPD给药组。
v)药剂的给药途径始终是肝动脉内给药。肝动脉内给药是使用与聚乙烯管如导管连接的50μl微量注射器进行的。将导管从胃十二指肠动脉插入并固定以使尖头到达肝总动脉和适合肝动脉的分枝，然后给药(20μl)。在给药药剂以后，将导管从胃十二指肠动脉抽出，在导管插入位点之前和之后用丝线连接胃十二指肠动脉。在非处理组中，打开腹部并只测量肿瘤直径，在伪操作组中，只用丝线连接胃十二指肠动脉。
vi)在处理/给药后，用丝线缝合腹部并用Isodine将缝合部分灭菌，然后将所有动物放回饲养笼。
viii)在饲养1周后，在常规麻醉后将动物的腹部打开。
viii)如上所述，使用电子测径器测量的长轴和短轴。
(结果评估方法，分析统计学方法)
(1)个体肿瘤生长速率的计算
从下式中，计算每个个体的肿瘤生长速率。肿瘤生长速率(％)＝100(％)×给药后1周肿瘤的长轴(mm)×短轴(mm)/在给药时肿瘤的长轴(mm)×短轴(mm)。
(2)多重比较的测试方法和功效评估方法
如下评估来自每组的七个测试受试者。对于每组，计算肿瘤生长速率的平均值和标准偏差。其后，进行以下所示的多重比较检验。
i)外科手术和LPD对肿瘤生长的影响
对于未处理组，伪操作组和LPD给药组的3组，以未处理组作为对照组进行测试的2-向类型改进的Dunnett多重比较检验。当伪操作组或LPD给药组从未处理组在肿瘤生长速率方面显示统计上显著性差异(p值＜0.05)，并且显示从未处理组的平均值不小于25％的肿瘤生长速率的平均值差异时，将外科手术本身和LPD评估为影响肿瘤生长。
ii)药剂的效力
将2组LPD给药组和冻干制剂/LPD给药组以与上述i)相同的方法进行2-向类型的改进Dunnett多重比较检验，以LPD给药组为对照组。对于显示显著低(p值＜0.05)的肿瘤生长速率，并且与LPD给药组相比肿瘤生长速率的平均值低不小于25％的药剂给药组，将该组药剂评估为有效。另外，对于显示小于100％肿瘤生长速率的平均值的药剂给药组，将该组药剂评估为具有肿瘤消退作用。
(结果和讨论)
(1)外科手术和LPD对肿瘤生长的影响
在伪操作组中，尽管与未处理组相比肿瘤生长速率的平均值低11％，在两组的肿瘤生长速率之间不存在显著性差异(p值；0.9285)。在LPD给药组中，与未处理组相比肿瘤生长速率的平均值低28％，但在两个肿瘤生长速率之间不存在显著性差异(p值；0.6686)。
因此，说明在使用大鼠腹水肝癌细胞系AH109A的大鼠肝癌肝动脉内给药模型中，连接给药位点的胃十二指肠动脉的外科手术本身，或者LPD(介质)的给药两者都不影响肿瘤的生长(表12)。
(2)本发明冻干制剂的效力
使给药液体的量恒定在每个个体20μl，使用制备至临床给药液体浓度的LPD混悬液，以在给药1周后的肿瘤生长速率为指标，在大鼠肝癌肝动脉内给药模型中研究冻干制剂的效力。
在所有的冻干制剂/LPD给药组的情形中，肿瘤生长率小于100％(表12)。在冻干制剂/LPD给药组中，与LPD给药组相比肿瘤生长速率的平均值低118％并且肿瘤生长速率显著低(p值＜0.0001)。
因此，在使用大鼠腹水肝癌细胞系AH109A的大鼠肝癌肝动脉内给药模型中，本发明的冻干制剂/LPD有效，显示肿瘤消退效果。
                      表12
Figure C0281852700401
每组n＝7
a)以未处理组作为对照组的2-向类型的改进的Dunnett多重比较检验
b)以LPD组作为对照组的2-向类型的改进的Dunnett多重比较检验图23显示冻干制剂的生产流程图。
工业实用性
按照本发明，已提供一种顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)冻干制剂，其不易显示层分离和粘度随时间推移而改变，显示优良的混悬性能，并且在给药期间易于操作。
本发明是基于在日本提出的专利申请290265/2001，其内容在此引用作为参考。

Claims (9)

1.一种注射用冻干制剂，其中的活性成分为顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，该制剂具有3-25μm的中心粒径分布和不超过40μm的D90％值，其中所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-6.0mg/mL的步骤，
(3)在20分钟内迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(4)冻干所述冷冻溶液的步骤。
2.权利要求1的冻干制剂，其中R1是十四烷酰氧基。
3.权利要求1或权利要求2的冻干制剂，其中所述中心粒径分布是5-20μm。
4.权利要求1至权利要求3中任何一项的冻干制剂，其中所述D90％值不超过33μm。
5.权利要求1至权利要求3中任何一项的冻干制剂，其中所述D90％值不超过30μm。
6.权利要求1的冻干制剂，其中所述冷冻是在15分钟内完成。
7.权利要求1或权利要求6的冻干制剂，其中在上述(2)中，将溶液的含水量调节为1.5-5.0mg/mL。
8.一种注射用冻干制剂，其中的活性成分为顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)，其中R1是含有6-20个碳原子的烷酰氧基，该制剂具有3-25μm的中心粒径分布和不超过40μm的D90％值，其中所述冻干制剂是通过包含下列步骤的方法生产：
(1)将顺[((1R，2R)-1，2-环己烷二胺-N，N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中的步骤，
(2)将所述溶液的含水量调节至1.0-3.5mg/mL的步骤，
(3)在1小时内迅速冷冻所述溶液的步骤，和
(4)冻干所述冷冻溶液的步骤。
9.权利要求8的冻干制剂，其中所述冷冻是在40分钟内完成。
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