JP4246795B2 - β型トランスフォーミング増殖因子の結晶 - Google Patents
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Description
本発明はβ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ-β）の結晶および遅延放出製剤に関するものである。
本発明の背景
ＴＧＦ-βは胚発生または組織の再生などの多くの生物学的な調節経路で中心的な役割を果たす。種々の異なる目的にも治療用として使用し得る非常に強力な生物学的因子である。
ＴＧＦ-βは当初、ヒト血小板、ヒト胎盤およびウシ肝臓から均質に精製され、約２５，０００Ｄａの分子量をもつ同質二量体タンパク質として同定された。ＴＧＦ-βは、初期にはＥＧＦまたはＴＧＦ-αと相乗的に作用し、非形質転換ＮＲＫ細胞の足場非依存性成長を誘導し得ることで特徴づけられたが、近年では、幅広い種類の正常細胞および腫瘍細胞の両方において数多くの調節効果を提示することが示され、このタンパク質が細胞活性の多機能性調節因子としての重要性を示唆するものとされている。細胞の型または組織の型および他の増殖因子の存在の有無に依存して、ＴＧＦ-βは有糸分裂誘発、細胞増殖および細胞成長を刺激するかまたは該工程を効果的に阻害し、または例えば脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成および免疫細胞機能の調節、ケモタキシスの刺激または分化の誘導または阻害などの他の作用を示し得る。ＴＧＦ-βの多くの作用は、ストレスまたは傷害に対する細胞または組織の応答および発生した損傷の修復に関連する。炎症後、ＴＧＦ-βは肉芽組織の形成において主要な役割を果たし、フィブロネクチン、コラーゲンおよびいくつかのプロテアーゼ阻害剤のように細胞外マトリックスの形成に関連する遺伝子の発現を増加させ、繊維芽細胞によるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、このことは結合組織の収縮に何らかの役割を果している可能性を示唆する。
ＴＧＦ-βなる用語は機能的および構造的に密接に関連したタンパク質のファミリーを意味する。今まで、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４およびＴＧＦ-β５と呼ばれる５つの異なる同質二量体ＴＧＦ-βが記載されている。
全てのＴＧＦ-βは３９０〜４１２アミノ酸の前駆体として合成され、これはタンパク質分解的開裂を受けてＣ末端の１１２アミノ酸からなる成熟形となる。その成熟した生物学的に活性な形では、ＴＧＦ-β１〜５は各１１２アミノ酸である２本のポリペプチド鎖の酸および熱に安定なジスルフィド結合形同質二量体である。ヒト（Derynck,R.et al.（1985）Nature 316、701-705）、ネズミ（Derynck,R.et al.（1986）J.Biol.Chem.261、4377-4379）およびサルのＴＧＦ-β１（Sharples,K.et al.（1987）DNA 6、239-244）の完全なアミノ酸配列は、１つのアミノ酸残基のみが異なる驚くべき配列相同性を示す。ヒトＴＧＦ-β１、ヒトＴＧＦ-β２（deMartin,R.et al.（1987）EMBO J.6、3673-3677;Marquardt,H.et al.（1987）J.Biol.Chem.262、12127-12131）およびヒトＴＧＦ-β３（Ten Dijke,P.et al.（1988）PNAS 85、4715-4719）のアミノ酸配列の比較により、成熟形の３つのタンパク質は約７０〜８０％の配列相同性を示すことが実証された。ヘテロ二量体ＴＧＦ-β１．２は、豚血小板から単離され、ＴＧＦ-β２の１つのサブユニットにジスルフィド結合するＴＧＦ-β１の１つのサブユニットからなる（Cheifetz,S.et al.（1987）Cell 48、409-415）。
近々、種々の治療態様で試験するために充分な量を得るために天然源（例えば血小板）からこれらの因子を単離するのではなく組換え技術を用いてＴＧＦ-βを産生する試みがなされてきた。しかしながら、生物学的に活性な組換えＴＧＦ-βを得ることは極めて困難であることが分かった。配列番号１〜６と題して配列表に記載した配列からも分かるように、１１２アミノ酸鎖長のＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３の成熟形は９個のシステイン残基を含む。ＴＧＦ-β２で９個のシステイン残基が４つの分子内および１つの分子間ジスルフィド結合を形成し、複雑なコア構造（『ジスルフィド結節』）を有することが示された［Schlunegger,M.P.およびGruetter,M.G.、Nature 358:430-434（1992）］。今日ＴＧＦ-β３のジスルフィド形態はＴＧＦ-β２と類似し、ＴＧＦ-β３は同じ複雑なコア構造を有することが知られている。
組換えＴＧＦ-βの発現は真核系で行い得るが、得られた生物学的に活性で正しくフォルドされた物質の収量は依然として満足のいくものではない。それ故、微生物宿主内で生物学的に活性なＴＧＦ-βを産生する試みがなされた。しかしながら、細菌内などの細胞内の状態は、活性に必須であると思われる正しいフォルディング、ジスルフィド結合形成およびジスルフィド安定化二量体化を誘導するものではない。従って、欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0 268 561に記載のように、ラムダ・プロモーターの制御下における大腸菌中でそれぞれの遺伝子を発現した後に、ほんのわずかの生物学的に活性なＴＧＦ-βしか得られない。他の報告でｔｒｐプロモーター制御下における大腸菌中のＴＧＦ-β ｃＤＮＡの発現が記載され、これはＳＤＳポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムによる写真像でおよそ１３，０００Ｄａの分子量をもつ放射活性標識タンパク質のバンドを示すが、活性は測定されていない（Urushizaki,Y.et al.（1987）Tumor Res.22、41-55）。しかしながら、例えば欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0 433 225等に生物学的に活性で二量体のＴＧＦ-β様タンパク質の産生の成功した方法が記載され、ここでは封入体から単離したＴＧＦ-βのフォルディングに緩和な洗浄剤を使用している。
しかしながら、医薬的に許容可能な製剤を調製する上で、ＴＧＦ-β３はいくつかの物質に非特異的に吸着するので厳密な量で投与するのは困難である。さらに、全てのタンパク質と同じように、ＴＧＦ-β３は空気中の酸素などの酸化剤に感受性である。
本発明で可溶性形のかわりにＴＧＦ-β３の結晶を使用すると不安定性および吸着の両方を阻止することがわかった。
Schlunegger et al.、FEBS Lett.303:91-93（1992）でＴＧＦ-β２の結晶化が
で記載された２５〜３５％ポリエチレングリコール４００溶液からの懸滴法が記載されている。同様に、米国特許５，３２２，９３３で、ＴＧＦ-β１およびＴＧＦ-β２結晶はそれぞれ２０％ＰＥＧ２００および６００を用いて懸滴法により調製した。
発明の目的
本発明の目的は、バイアル壁に全く吸着しないかまたは溶解したＴＧＦ-β３よりも少ない吸着を示す製剤を調製するために結晶形のＴＧＦ-β３を提供することである。また本発明の目的は、溶解した形よりも酸化剤に対してより安定である製剤を調製するために結晶形のＴＧＦ-βを提供することである。
別の本発明の目的は構造決定およびドラッグ・デザインに使用し得るＴＧＦ-β結晶を提供することである。
また別の本発明の目的はＴＧＦ-β結晶を含有し、遅延放出医薬製剤として、またはその調製に使用し得るＴＧＦ-βの医薬調製物を提供することである。
本発明の要約
驚くべきことに、ＴＧＦ-β３は水溶液中で安定な結晶を形成することがわかった。ＴＧＦ-β３結晶はガラス容器に付着せず、タンパク質は分解から保護されており、これは構造決定およびドラッグ・デザインに使用し得る。
さらに、驚くべきことにＴＧＦ-β結晶は、治療に使用するＴＧＦ-βの遅延放出製剤として、またはその調製に使用し得ることがわかった。結晶ＴＧＦ-βを患者に適用する場合、可溶性のすなわち利用可能なＴＧＦ-βの濃度は、異なる溶液特性をもつ結晶を選別することにより、または適当な結晶サイズにより変化し得る。
本発明の詳細な説明
本発明はＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密なる結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』に関するものである。六方晶の結晶中、Ｘ線を４Åよりも高い最大分解に分散するものが好ましい。
本発明はまた実質的にＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶系または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密な結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』からなる組成物に関するものである。
さらに本発明はＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶系または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密な結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』を含有する医薬組成物に関するものである。
タンパク質結晶は、通常、対称な関係にある分子間の表面にある荷電基および双極子の相互作用により保持されている。ＴＧＦ-β３の高分解能Ｘ線構造解析によりＴ型結晶についてはこのことは当てはまらないことがわかった。これらの結晶は極めて濃密に集積しているが、極性相互作用は結晶接触にはほんのわずかしか関与していない。これらの接触のほとんどは疎水性相互作用により成立している。比較的もろく生理学的条件下で容易に溶解し易い多くの他のタンパク質結晶と比較して、結晶形Ｔの驚くべき高い安定性がこの通常でない構造によりもたらされる：Ｔ形の結晶は機械的に安定である。壊れることなく取り扱われ得る。貯蔵緩衝液中、それらは少なくとも６カ月持続可能である。結晶はまた例えばＰＢＳ緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２）などの生理学的条件下で安定である。結晶は１００ｍＭ酢酸中にまたはイソプロパノールの存在下に溶解する。
結晶形Ｈは比較的もろく針で触れれば容易に壊れる。母液とは異なる溶液に移せば、直ちに崩壊する。
さらに、本発明はこれらの結晶の調製法に関する。
例えば天然源から単離、ＣＨＯ細胞などの組換え真核発現系で産生、または大腸菌などの原核発現系で産生した、あらゆる起源由来の純粋な二量体の生物学的に活性なＴＧＦ-β３が結晶化のための出発原料として使用され得る。例えば、大腸菌中で封入体として発現し、例えば緩和な洗浄剤であるＣＨＡＰＳおよび所望により有機溶媒のＤＭＳＯを用いる方法により可溶化し、再フォルドされ、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなどの適当なクロマトグラフィー法により精製したＴＧＦ-β３は出発原料として使用し得る。
結晶工程において、結晶形成に必要とされるよりも低い濃度の沈殿剤を用いて結晶化緩衝液を調製（例えばＴＧＦ-β３溶液を『貯蔵緩衝液』と混合することによる）する。結晶を形成させるために、例えば滴加することにより、または結晶化緩衝液と貯蔵緩衝液間で拡散することにより沈殿剤の濃度を変化させることにより、例えば沈殿剤を高濃度の沈殿剤をもつ貯蔵緩衝液から結晶化緩衝液に拡散するなどして、沈殿剤を加えることにより沈殿剤の濃度を増加させなければならない。例えば、拡散は蒸気拡散法によって行い得る。この方法では結晶化緩衝液中の状態は、例えば『懸滴法』または『シティング・ドロップ（sitting drop）法』（これはそれぞれ結晶化緩衝液の一滴を貯蔵緩衝液のずっと大きな貯蔵液の上から懸滴し、または並列的に保持する）、または実施例に記載したような蒸気拡散バッチ法などのように共通の気相中への拡散により変化する。沈澱剤の濃度変化はまた結晶化緩衝液を貯蔵緩衝液から隔離すると共にタンパク質が貯蔵緩衝液中に浸透するのを防ぐ半透膜を通して沈澱剤を拡散させることによりなし得る。
結晶化緩衝液中のＴＧＦ-β３は好ましくは１０mg/mlまで、より好ましくは０．５〜６mg/ml、よりさらに好ましくは１〜３mg/mlの濃度を有する。
ＴＧＦ-β３結晶の調製は様々な条件下で行い得る。好ましいｐＨは４〜８．５である。緩衝液の濃度および種類は重要ではないので、様々な緩衝液を使用し得る。好ましい緩衝系はリン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳである。緩衝液は、例えばイソプロパノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯまたは好ましくはジオキサンおよびポリエチレングリコールなどの好ましくは低い相対誘電率をもつ水と混和性の有機溶媒からなる群から選択され、好ましくは４００ないし８０００の分子量を有する沈殿剤を含有する。
ＴＧＦ-β３の三方晶系の結晶はいくつかの条件下で得られる。好ましいＰＨは４〜７．５である。Ｔ結晶を得る好ましい緩衝液系はＴｒｉｓであり、より好ましくはリン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはＨＥＰＥＳである。好ましい本発明の態様において、結晶化緩衝液は緩衝剤を３０ｍＭないし３００ｍＭ含有し、より好ましくは緩衝剤を５０〜１５０ｍＭ含有する。三方晶ＴＧＦ-β３結晶は、例えばイソプロパノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯまたは好ましくはジオキサンなどの好ましくは低い相対誘電率をもつ沈澱剤として水と混和性の有機溶媒の存在下で形成され、有機溶媒は６〜３０％、好ましくは６〜１５％の濃度で存在する。温度は好ましくは４℃ないし２０°である。
Ｔ型のＴＧＦ-β３結晶を得るための、結晶化緩衝液中の好ましいジオキサン濃度は７．５％である。すでに上記で定義したように、かくして得られるＴ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する。
ＴＧＦ-β３の六方晶の結晶はいくつかの条件下で成長する。好ましいｐＨはｐＨ５．０〜ｐＨ８．５である。好ましくは、分子量が４００〜８０００であり１０％〜３０％の濃度のポリエチレングリコールが結晶緩衝液中に存在する。好ましい温度は４℃ないし２０℃である。結晶は六方晶系二錐体として成長する。
本発明のＴＧＦ-β結晶は、タンパク質の結晶化の当分野でよく知られているバッチ結晶法または懸滴法のいずれかで形成し得る。両方の例を詳細に後述する。
本発明のＴＧＦ-β３結晶は、自然結晶化、またはより良好には実施例中で後述するように微小または大種晶添加のいずれかで調製し得る。特に種晶添加に際して微小結晶懸濁液を使用（『微小種晶添加』）することにより、結晶の大きさを調節する良い方法が提供される。例えば、Ｔ型結晶の場合、１００μｌの懸濁液中０．１ｍｍ3の均一化されたＴＧＧ-β３結晶を含有する貯蔵懸濁液の１／４3〜１／４5希釈により１０×１０×３０μｍ3付近の典型的な大きさの結晶が得られる。高希釈度（１／４6〜１／４9）においては、単一で大きな結晶（大きさ７０×７０×２５０μｍ3）が成長する。一定量のＴＧＦ-β３を含有する製剤において、結晶の大きさが小さくなるほど、結晶表面は広くなる。従って、結晶表面は結晶と平衡にある溶解ＴＧＦ-β３の量に影響を及ぼし、よって、遅延放出製剤中の有効なＴＧＦ-β３の量にも影響を及ぼす。
好ましくはＴ型の結晶の懸濁液としてＴＧＦ-β３を利用することは溶液で利用することよりも有利な点がいくつかある。例えば、好ましくはＨ型、より好ましくはＴ型の結晶状態では、容器の表面への非特異的吸着およびタンパク質分解が減少する。もう一つの利点は好ましくはＨ型、より好ましくはＴ型のＴＧＦ-β３結晶は治療適用する遅延放出製剤として、またはその製造用に使用し得ることである。
好ましくはＴ型のＴＧＦ-β３結晶はまた生理学的条件下でも安定であるので、遅延放出製剤として、またはその製造用に使用し得る。
本発明の別の態様はＴＧＦ-β結晶を含有する遅延放出製剤に関するものである。本発明の好ましい態様では、後述の遅延放出製剤に関連する『ＴＧＦ-β』はＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４およびＴＧＦ-β５、さらに好ましくはＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３、さらにより好ましくはＴＧＦ-β３からなる群から選択されるＴＧＦ-βを意味する。
ＴＧＦ-β１およびＴＧＦ-β２の結晶は、例えばDavied et al.、米国特許５，３２２，９３３に記載のようにすでに当分野で既知の方法により調製し得る。
ＴＧＦ-βの結晶は結晶のデポ効果により、遅延放出製剤としてまたはその製造用に適している。好ましい製剤はＴＧＦ-βの有効濃度が０．１〜５０μg/mlに到達し得るものである。
ＴＧＦ-βのデポ結晶製剤はゲル状、軟膏、懸濁液の形であり得る。結晶はセルロース誘導体、糖、ポリマー、塩、保存剤などの全ての医薬成分と混合し得る。ＴＧＦ-β結晶は凍結乾燥製剤の調製にも使用し得、例えば乾燥包帯および骨セメントなどに含まれ得る。ＴＧＦ-βのデポ製剤は、例えば創傷治癒、口粘膜炎、骨関節炎、骨疾患、骨修復、または腸粘膜炎などの全てのＴＧＦ治療域で使用し得る。
本発明の別の態様は構造決定およびドラッグ・デザインのための本発明のＴＧＦ-β３結晶の使用である。
合理的な薬物の設計のためには、標的タンパク質の３次元構造を知る必要がある。現在、この構造に関する情報は、溶液中でのＮＭＲで分光化学的に、タンパク質結晶のＸ線回折または相同モデリングのいずれかで得られる。相同構造に基づくモデリングにより得られる構造情報は充分に詳細ではなく、それ故実験的証拠に支持される構造が好ましい。薬物の合理的な設計を支持するのに有益な結晶は異なる特徴を有するべきである。まず第一に、分子を詳細に表現するために全ての構造は高度に分離されていなければならない。到達可能な最も高い分解が得られるかどうかはタンパク質の結晶の質に依存する。さらに、小さな分子は活性部位に到達するために結晶を浸透させることができなければならない。この活性部位が隣接する分子、阻害剤または結晶化に必要な物質といった他の化合物で阻害されているのであれば、異なる結晶形を使用しなければならない。
『Ｔ』型結晶は『Ｈ』型結晶よりも高い分解性を示し、それ故ドラッグ・デザインに好ましい。『Ｔ』型結晶が濃密にパックされているため、分子表面の大部分は薬物に近づけない。この理由により薬物が『Ｔ』型結晶形のＴＧＦ-β３に結合しない場合、『Ｈ』型結晶は『Ｔ』型結晶よりも好ましい。
以下の実施例は、本発明を制限する意図はなく説明するためのものである。
実施例１：大腸菌内でのＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３の発現
実施例１Ａ：一般的な方法
細菌株：
−大腸菌Ｋ１２／ＬＣ １３７：ｈｔｐＲam、ｌｏｎR9、ｌａｃam、ｍａｌam、ｔｒｐam、ｐＨＯam、ｒｓｐＬ、ｔｓｘ::Ｔｎ１０、ｓｕｐＣts（Goff,S.A.et al.（1984）PNAS 81、6647-6651）。
プラスミド：
−ｐＰＬＭｕ（Buell,G.et al.（1985）Nucleic Acids Res.13、1923-1938）：このプラスミドはファージＭｕ ｎｅｒ遺伝子リボソーム結合部位をもつバクテリオファージＩＰLプロモーターを有する（Van Leerdam,E.et al.（1982）Virology 123、19-28）。
−ｐｃＩ857：熱不安定性λｃＩ857リプレッサーをコードし、カナマイシンに耐性を有するプラスミド（Remault,E.et al.（1983）Gene 22、103-113）。
ＳＤＳゲル電気泳動：
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質染色はBIORADのMiniprotean II細胞および１mmの厚さの１８％ポリアクリルアミドゲルを用いて前記（Laemmli、U.K.（1970）Nature 227、680-685）のように行う。
熱誘導：
各々４０μｇのアンピシリンおよびカナマイシン（LB/amp/kan）を含有する２０ml培養チューブ中のＬＢ培地７ml（Maniatis et al.（1982）、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）に単一のコロニーを植え付け、一晩３０℃で振盪しながらインキュベートする。この一晩培養したもの５mlを１００mlのエーレンマイヤー・フラスコ中のLB/amp/kan １５mlに加えるこのフラスコを４２℃の水浴振盪機に移す。２mlのサンプルを移す前（非誘導条件）にとり、移した後（誘導条件）に１時間間隔で１mlのサンプルをとる。細胞を遠心（エッペンドルフ遠心機中で５分間、１０，０００ｒｐｍ）によりペレット化し、上清を廃棄する。ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に１００μｌのサンプル緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱する。５μｌの等分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにのせる。
コンピテント細胞の作製：
コンピテント大腸菌細胞はMiniatis et al.（1982）、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yorkに記載にように塩化カルシウム法により作製する。プラスミドｐｃＩ857を有する細胞を３０℃で成育させる。
実施例１Ｂ：発現ベクターｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３の構築およびＴＧＦ-β３の発現
ＴＧＦ-β３のコード配列（配列番号１として配列表に示す）を、ＮｃｏＩで消化したプラスミドＰＧｅｍ−５ＺＦ（＋）（Promega）にクローン化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー）で脱リン酸化し、クレノウポリメラーゼ（Gibco-BRL）で伸長する。得られた構築物をｐＧＫＭ１２６と呼び、コンピテント大腸菌Ｙ１０９０細胞を形質転換するのに使用する。ＴＧＦ-β３をコードする正しい挿入物をもつクローンを大腸菌Ｙ１０９０／ｐＧＫＭ１２６と呼ぶ。
大腸菌Ｙ１０９０／ｐＧＫＭ１２６細胞をＬＢ培地で成育させ、プラスミドＤＮＡをBirnboim,H.C.およびDoly,H.（1979）Nucleic Acids Research 7の方法で調整し、製造業者（ベーリンガー）の薦めに従って、プラスミドＤＮＡ１５１３．５μgを５０μlの制限緩衝液中でＮｃｏＩを用いて完全に切断する。ＤＮＡを５μlの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＭｇＣl2、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０μlエタノールを加えて沈降させる。７０℃で１５分間インキュベートした後、ＤＮＡをSorvall遠心機のＳＳ３４ローターで１３，０００ｇで１５分間遠心することによりペレット化する。上清を廃棄し、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび０．２５％キシレンシアノールを含有する８０μlの０．０８９Ｍ ＴＲＩＳホウ酸塩、０．０８９Ｍホウ酸および０．００２Ｍ ＥＤＴＡ（ＴＢＥ緩衝液）中に再懸濁する。４回２０μlのサンプルを、５０ボルトで０．５μg/ml臭化エチジウムを含有するＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲルを通して、１０ｃｍ長で０．８ｃｍの厚さのゲルの末端にブロモフェノールブルー・マーカーが達するまで電気泳動する。成熟ＴＧＦ-βをコードするＤＮＡ断片を短波長ＵＶ光で視覚化し、かみそりの刃で切り出し１．５時間２００ｍａｍｐを適用した
バイオトラップ装置中でゲル片から電気溶出する。溶出したＤＮＡ断片を沈降（上記参照）させ、２０μl ＴＥに再懸濁する。
プラスミドｐＰＬＭｕ ５μlをＮｃｏＩおよびＳａｌＩ、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶまたはＮｃｏＩ単独のいずれかで消化し線状とし、上記のＤＮＡ断片のようにゲル精製する。１００ngの線状で精製されたｐＰＬＭｕベクターＤＮＡおよび３モル等量のそれぞれの精製ＤＮＡ断片を１単位のＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を含有するライゲーション緩衝液２０μl（７０ｍＭ ＴＲＩＳ/ＨＣl、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭアデノシン三リン酸）中で４℃で１５時間インキュベートする。
１０μlのライゲーション混合物をプラスミドｐｃｌ857をもつ冷（４℃）コンピテント大腸菌ＬＣ１３７細胞２００μｌに加える。３０分後、細胞を４２℃の水浴で１．５時間インキュベートすることにより熱衝撃を与える。ＬＢ培地２mlを加え、培養物を６０分間３０℃で振盪する。２００μl等分をアンピシリンおよびカナマイシンを含有するＬＢプレート上にまき、２２時間３０℃でインキュベートする。単一のコロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを解析する。ｐＰＬＭｕ中のＴＧＦ-β３をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングすることによりプラスミドｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３が得られる。上記の構築物を含有するクローンを大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３と呼ぶ。
大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３細胞を熱誘導（実施例１Ａ参照）し、発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。熱誘導タンパク質が約１２，０００Ｄａの見かけの分子量で広がるにつれ、全てのＴＧＦ-β３は熱誘導の２時間後に現れる。
実施例１Ｃ：形質転換細胞の醗酵
４０mg/lのアンピシリンおよびカナマイシンと共に７５０mlのＬＢ培地を含有する２lのエーレンマイヤー・フラスコ中で大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈ．ＴＧＦ-β３を一晩培養した培養物を３０℃で成育させる。３００mlの一晩培養物を２lエーレンマイヤー・フラスコ中、上記した抗生物質を含有する７５０mlのＬＢ培地に加え、６５℃の水浴で約３．５分間振盪することで４２℃に加温する。次いでフラスコを４２℃の振盪機に移し、３時間インキュベートする。フラスコを氷水浴中で１２℃まで冷却し、細胞をＧＳＡローター（Sorvall）中、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後回収する。
実施例２
実施例２Ａ：大腸菌からの不溶性でモノマーのＴＧＦ-β３の回収
大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３細胞を実施例１Ｃに記載のように醗酵させる。細胞破砕および不溶性のＴＧＦ-β３の回収を４℃で行う。約１８ｇの湿潤細胞を６０mlの０．１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、ｐＨ８．３（破壊緩衝液）中に再懸濁する。製造業者の指示に従って細胞を２回フレンチプレス（SLM Instruments、Inc.）に通過させ、破砕緩衝液で容量を２００mlとする。懸濁液を１５，０００ｇで２０分間遠心する。得られたペレットを１Ｍ ＮａＣlを含有する破砕緩衝液１００mlに懸濁し、上記のように１０分間遠心する。ペレットを１％Ｔriton Ｘ−１００（Pierce）を含有する破砕緩衝液１００mlに懸濁し、上記のように再び１０分間遠心する。次いで洗浄したペレットを５０mlの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ/ＨＣl、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ＤＴＴ中に懸濁し、テフロン組織粉砕機でホモジナイズする。得られた懸濁液は不溶性形の粗モノマーであるＴＧＦ-β３を含有する。
実施例２Ｂ：モノマーＴＧＦ-β３の可溶化および精製
実施例２Ａに従って得られたＴＧＦ-β３懸濁液１０mlを１０％酢酸でｐＨ２．５に酸性化し、エッペンドルフ遠心機で１０分間室温で遠心する。上清を流速１．４ml/分で１０％酢酸中、セファクリルＳ−１００カラム（ファルマシア、２．６×７８cm）でクロマトグラフィーする。（別に、クロマトグラフィーはセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシア）で行い得、カラムはそれぞれ１％酢酸または５ｍＭ ＨＣl中で行い得る。）１９０分ないし２２０分に溶出するモノマーで変性したＴＧＦ-β３を含有する画分を集める。この物質は生物学的に活性で二量体のＴＧＦ-β３を得るためのフォルディングに使用する。
実施例３：インビトロにおけるＴＧＦ-β３のフォルディング
上記で得られたＴＧＦ-β３は、それぞれ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１Ｍ ＮａＣl、５ｍＭ還元グルタチオンおよび２０％（v/v）ＤＭＳＯからなる緩衝液中、４℃で折りたたまれる。必要であれば緩衝液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に調節する。ＴＧＦ-β３の最終濃度は０．１mg/mlである。７日後、４℃で溶液を濃酢酸でｐＨ３．５に酸性化し、ＹＭ１０膜（Amicon）のついたアミコン撹拌細胞中で約１０回、限外濾過することにより濃縮する。濃縮した溶液を０．１Ｍ酢酸で元容量まで希釈し再濃縮する。この操作を２回繰り返す。次いで溶液を実施例４に記載のように精製する。
実施例４：二量体の生物学的に活性なＴＧＦ-β３の精製
約１０ないし５０mgのＴＧＦ-β３を含有する実施例３で得られた溶液を５０ｍＭ酢酸、３５％エタノールを用いて透析濾過する。得られた溶液を６ml/分でハイロード（Hiload）２６/１０Ｓ−セファロース高速カラム（ファルマシア）にのせる。始めにカラムを５０ｍＭ酢酸、３５％エタノール（緩衝液Ａ）で５分間洗浄し、次いで０．２Ｍ ＮａＣlを含有する緩衝液Ａで始めて、０．５Ｍ ＮａＣlを含有する緩衝液Ａで終わる線形勾配で４５分間に及び溶出する。溶出物を２８０ｎｍでモニターし、手動で画分化する。画分を実施例５に従って、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより二量体ＴＧＦ-β３を、インビトロのバイオアッセイにより生物学的活性を確認する。
二量体の生物学的に活性のあるＴＧＦ-β３を含有する画分を集め、０．１Ｍ酢酸に対して透析するか、または水中０．１％ＴＦＡの同容量で希釈しVydac２１４ＴＰ５１０カラム（１cm×２５cm、The Separations Group、USA）のＲＰ−ＨＰＬＣを行う。カラムを７５％溶媒Ａ［水中ＴＦＡ０．１％］および２５％溶媒Ｂ［アセトニトリル中ＴＦＡ０．０８％］の混合物を用いて流速４．５ml/分で平衡化する。サンプルをのせた後、２３５nmでモニターされた吸収が基線に達するまでカラムを平衡条件下で洗浄する。次いでカラムを、平衡条件下で始めて４５％溶媒Ａと５５％溶媒Ｂとの混合物終わる線形勾配で３０分以内に溶出する。溶出物を手動で画分化し，実施例５に従って非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびインビトロのバイオアッセイにより解析する。
活性画分を集め、２０ｍＭ酢酸、２０％エタノールに対して透析濾過する。
実施例５：フォルディングしたＴＧＦ-βのインビトロ活性試験：ミンク肺上皮細胞（Ｍv-１-Ｌu）酸性ホスファターゼアッセイ
連続ミンク肺上皮細胞系Ｍv-１-Ｌu（ＡＴＣＣ/ＣＣＬ６４）の成長を阻害する化合物の効力を測定する細胞バイオアッセイにおいてインビトロでＴＧＦ-β３を選別する。Ｍv-１-Ｌu細胞系はＴＧＦ-βのバイオアッセイで感受性のあるリポーターであることが分かり、約１０〜５０pg/mlのすでに報告されているＥＣ５０でシグモイド形の濃度反応曲線を示す（Tucker et al.、Science 1984;226:705-707;Absher et al.、J.Immunol Methods 1991;138:301-303;Danielpour et al.、J Cell Physiol 1989;138:79-86）。ＴＧＦ-βにより強く増殖が阻害されるＭv-１-Ｌu細胞は現在、このサイトカインの解析的バイオアッセイの開発に最も適した細胞系であると考えられている（Kelley et al.、Exp Lung Res 1992;18:877-887;Meager、J Immunol Methods 1991;141:1-14）。アッセイは、元来American Type Culture Collection、Rockville MD、USAから得られた細胞を用いて９６穴のマイクロタイター・プレートで行う。
細胞をＴＧＦ-β３標準物質またはサンプルの連続希釈液を含有する成長培地（５％v/v仔ウシ血清を含む最小必須培地）中に低密度（１穴につき５０００個の細胞）でまく。次いでアッセイを加湿５％ＣＯ2インキュベーターで７２時間、３７℃でインキュベートする。細胞増殖の阻害は高感度酵素細胞染色法（これは各穴で産生された酸性ホスファターゼの量を比色定量的に見積もる）により測定し、染色の強度は各穴に存在する細胞数に対応している。各穴の吸光度Ｏ．Ｄ．は４０５nmで測定し、アッセイ・データをプロットし適当なＰＣソフトウェア・プログラムにより解析する。
実施例６：Ｔ型結晶（三方晶形）
実施例４で得られた二量体のＴＧＦ-β３を１７時間、冷（４℃）１０ｍＭ酢酸に対して透析（Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６〜８ｋＤａ）する。ＴＧＦ-β３溶液を限外濾過により濃縮し最終タンパク質濃度を３〜８mg/mlとする。
実施例６Ａ：自然結晶化
１０ｍＭ酢酸中のＴＧＦ−β３溶液２μlをシリコーン処理をしたカバーグラス上の２μlの貯蔵緩衝液（１５％（v/v）ジオキサンおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）と混合する。カバーグラスを逆にし６００μlの貯蔵緩衝液で満たした貯蔵容器の上におく。貯蔵容器およびカバーグラスをシリコン油で密閉する（『懸滴法』）。密封した容器の容量は２mlである。液滴と貯蔵液との距離は１２mmである。室温で２４時間後、最初の結晶（大きさ１０×１０×３０μm3）が光学顕微鏡で発見された。結晶は約１週間後に最大の大きさ（７０×７０×２５０μm3）に達する。これらの条件下での結晶の再現性は以下のようである：４８の同じ結晶実験中２４において、結晶が形成される。
実施例６Ｂ：微小種晶添加
結晶化を改善するためにタンパク質溶液に実施例６Ａの自然結晶化で得られた結晶で種晶添加する。
一片の種晶（大きさ３０×３０×１００μm3）を１０ｍＭ酢酸で洗浄し、１００μlの１０ｍＭ酢酸でホモジナイズする。この溶液２５μlを７５μlの１０ｍＭ酢酸で希釈する（全希釈度１/４1）。８回希釈を繰り返す（全希釈度１/４8）。各希釈液１μlを貯蔵容器をカバーグラスで密封する前に小滴に加える（上記実施例６Ａ参照）。一滴当たりに産生される結晶の大きさと数は微小結晶懸濁液の希釈度に依存する。非希釈の懸濁液では微小結晶沈殿物が発見される（本発明の目的のために、微小結晶は３μm以下の最も長い数値のサイズを有するものと定義する）。１/４3〜１/４5の希釈により、およそ１０×１０×３０μm3の典型的な大きさの微小結晶が得られる。より高希釈（１/４6〜１/４9）では、単一で大きな結晶が成長する（大きさ７０×７０×２５０μm3）。このように種晶添加に微小結晶懸濁液を使用することにより結晶の大きさを調節する良好な方法が提供される。
実施例６Ｃ：他の結晶化条件
結晶は以下の表に要約した条件を用いて自然結晶、微小または巨大種晶添加により得られる：
実施例６Ｄ：大種晶添加
単一の大結晶を微小結晶懸濁液の代わりに種晶添加に使用し得る。（本発明の目的において、大結晶は３μm以上の最も長い寸法のサイズを有するものとして定義する）
種晶（大きさ３０×３０×１００μm3）を１５分間、１０ｍＭ酢酸で洗浄し、直接小滴に移す（上記の実施例６Ａ参照）。新しい結晶が２４時間以内に形成されおよそ５０×５０×１５０μm3の大きさに達する。
実施例６Ｅ：透析による結晶化
１０ｍＭ酢酸中の１２μlＴＧＦ-β３溶液を貯蔵緩衝液１２μl（１５％（v/v）ジオキサンおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）および１０ｍＭ酢酸中の微小結晶懸濁液の１／４5希釈液１μlと混合する（実施例６Ｂ参照）。混合物を密封したビーカー中の貯蔵緩衝溶液５０ｍlに対して冷して透析（４℃、Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６−８ｋＤａ）する。
実施例６Ｆ：結晶の特徴
Ｔ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する。結晶は六角の断面をもつ棒状の形を呈する。そのように得られた結晶は最大分解２ÅまでＸ線を回折する。
Ｔ型の結晶は物理的に安定である。それらは崩壊することなく手で操作できる。貯蔵緩衝液中ではそれらは少なくとも６カ月は持続可能である。結晶はまた生理学的条件下でも安定である。目視試験で、ＰＢＳ緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣl、５ｍＭ ＫＣl、５ｍＭ ＭｇＣl2、２５ｍＭ Ｎa2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２）中で結晶は１週間以内には溶解しない。結晶は１００ｍＭ酢酸中またはイソプロパノールの存在下で溶解する。
上記で得られたＴＧＦ-β３ Ｔ結晶は、２つの対称に相関するＴＧＦ-β３分子間に埋もれていて、ＴＧＦ-β３サブユニット当たり１分子のジオキサン分子を含有する。
実施例６Ｇ：スケール・アップ
ＴＧＦ-β３を２０μgから１gに結晶化工程をスケール・アップするために、実験操作を懸滴法からバッチ結晶化へと変えた。バッチ結晶化実験を以下のように行う：ガラスのビーカーを２００mlの５mg/mlＴＧＦ-β３、７．５％（v/v）ジオキサン、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および１０ｍＭ酢酸中の微小結晶懸濁液１mlで満たす。このビーカーを２lの貯蔵緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５％（v/v）ジオキサン）で満たした４lのタンクに置く。結晶化の間、貯蔵緩衝液をわずかに撹拌する。タンクを密封した後、気相を介してビーカー中の溶液と貯蔵液の平衡化がおこる。
実施例７：Ｈ型結晶（六方晶形）
上記のように、実施例４で得られた二量体のＴＧＦ-β３溶液を１７時間冷（４℃）１０ｍＭ酢酸に対して透析（Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６−８ｋＤａ）する。ＴＧＦ-β３溶液を限外濾過により濃縮し、最終タンパク質濃度を３−８ｍｇ／ｍｌとする。
実施例７Ａ：結晶化
Ｈ型の結晶をＴ型結晶と同じ『懸滴法』実験操作を用いて成長させる。貯蔵緩衝液は３０％（v/v）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００および１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０から成る。ＴＧＦ-β３溶液４μlを貯蔵緩衝液２μlと混合する。結晶は室温で４８時間以内に自然にでき、４００×４００×３００μm3の大きさに達する。
実施例７Ｃ：他の結晶化条件
Ｈ型結晶は以下の表に要約した条件を用いて、自然結晶化、微小または巨大種晶添加により得られる：
実施例７Ｄ：特徴
Ｈ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する。個々の結晶条件に依存して単位セルサイズは４％まで変化し得る。結晶は六方の二錐体形として成長する。このようにして得られた結晶は３．３Åの最大分解でＸ線を回折する。
Ｈ型結晶は比較的もろく、針で触れれば容易に壊れる。もし母液とは異なる溶液に移せば直ちに崩壊する。
実施例８：ＴＧＦ-β結晶ＴおよびＨの遅延放出特性
Ｔ型ＴＧＦ-β３微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）を２分間、エッペンドルフ遠心機（×１０００ｒｐｍ）で遠心する。透明な上清（Ｓ０）を除去し、ＴＧＦ-β３の量を測定する。Ｔ微小結晶のペレットの上に２mlの水を加え、結晶を穏やかに振盪することにより再懸濁する。１時間の平衡時間の後、再可溶化ＴＧＦ結晶を含有する溶液を再度遠心する（反応条件は前述している）。この最初の再可溶化段階（Ｓ１）後に得られた上清中のＴＧＦ-β３の量を測定する。ＴＧＦ-β３の微小結晶のペレットを再度２mlの水に懸濁し、１時間インキュベートし、次いで再度遠心する；上清Ｓ１２中のＴＧＦ-β３の量を測定する。実験によりＴＧＦ-β３はＳ１、Ｓ２、Ｓ３に存在することが示され、Ｔ微小結晶の遅延放出特性が証明された。
Ｈ型のＴＧＦ-β３の微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）をエッペンドルフ遠心機（×１０００ｒｐｍ）中で２分間遠心する。透明な上清（Ｓ０）を除去し、ＴＧＦ-β３の量を測定する。Ｈ微小結晶のペレットの上に水２mlを加え、微小結晶を穏やかに振盪することにより再懸濁する。１時間の平衡時間の後、再可溶化したＴＧＦ-β３の微小結晶を含有する溶液を再度遠心する（反応条件は前述している）。この最初の再可溶化段階（Ｓ１）の後に得られた上清中のＴＧＦ-β３の量を測定する。ＴＧＦ-β３の微小結晶のペレットを再度水２mlに懸濁し、１時間インキュベートし、次いで再度遠心する；上清Ｓ２中のＴＧＦ-β３の量を測定する。実験によりＴＧＦ-β３はＳ１、Ｓ２、Ｓ３に存在することが示され、Ｈ微小結晶の遅延放出特性が証明される。しかしながら、上記のＴ微小結晶と比較して、Ｈ ＴＧＦ-β３の微小結晶を用いて行った実験より、より速い可溶化を示す。
実施例９：ＴＧＦ-β３結晶ＴおよびＨの化学的安定性
Ｔ型ＴＧＦ-β３微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）と１mg/mlのＴＧＦ-β３の水溶液２mlを５０℃で５日間インキュベートする。温度衝撃を与える前と後に毛細管等電点焦点電気泳動測定を行う。水中に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルでＴＧＦ-β３の主要なピークの減少を測定し、ＴＧＦ-β３Ｔ微小結晶の懸濁液ではＴＧＦ-β３の主要なピークのほんのわずかな減少が測定される。
Ｈ型のＴＧＦ-β３の微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）と水中の１mg/mlのＴＧＦ-β３の溶液２mlを５日間５０℃でインキュベートする。温度衝撃を与える前と後に毛細管等電点焦点電気泳動測定を行う。水中に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルでＴＧＦ-β３の主要なピークの減少を測定し、ＴＧＦ-β３Ｈ微小結晶の懸濁液ではＴＧＦ-β３の主要なピークのほんのわずかな減少が測定される。
これらの結果により結晶形のＴＧＦ-β３は溶液のＴＧＦ-β３よりも化学的な分解に対してより安定であることが示される。
実施例１０：ＴＧＦ-β３結晶ＴおよびＨの物理的安定性
ＴＧＦ-β３のＴ微小結晶の懸濁液（１０μg/mlＴＧＦ-β３）を５日間３７℃でガラスまたはプラスチックの容器中でインキュベートする。これらのサンプルのＴＧＦ-β３含量のＨＰＬＣ解析により、５日間３７℃でインキュベートした後、ＴＧＦ-β３の濃度には全く変化がないことが示される。同様の条件下での平行実験では、ＴＧＦ-β３がガラスまたはプラスチックの容器の壁に付着するために、水に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルは８０％ないし９０％のＴＧＦ-β３が遊離している。
ＴＧＦ-β３のＨ微小結晶の懸濁液（１０μg/mlＴＧＦ-β３）を５日間３７℃でガラスまたはプラスチックの容器中でインキュベートする。これらのサンプルのＴＧＦ-β３含量のＨＰＬＣ解析により、５日間３７℃でインキュベートした後、ＴＧＦ-β３の濃度には全く変化がないことが示される。同様の条件下での平行実験では、ＴＧＦ-β３がガラスまたはプラスチックの容器の壁に付着するために、水に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルは８０％ないし９０％のＴＧＦ-β３が遊離している。
微生物の寄託
以下の微生物はDeutshe Sammlung von Mikroorganismen（DSM）Mascheroder Weg 1b、D-3300 Braunschweig（FRG）に寄託した：
微生物 寄託日 受託番号
大腸菌ＬＣ137/pＰＬＭu.hＴＧＦ-β3 1989年11月28日 ＤＳＭ 5658
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：チバ−ガイギー ＡＧ
（Ｂ）通り：クライベック通り１４１
（Ｃ）市：バーゼル
（Ｅ）国名：スイス
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４００２
（Ｇ）電話番号：＋４１ ６１ ６９ １１ １１
（Ｈ）ファックス：＋４１ ６１ ６９６ ７９ ７６
（Ｉ）テレックス：９６２ ９９１
（ii）発明の名称：新規な結晶
（iii）配列の数：２
（v）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒介型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０、
バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前／特徴を示す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３３６
（Ｄ）その他の情報：／産物＝『ヒトＴＧＦ-β３』
（xi）配列：配列番号：１：
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（xi）トポロジー：配列番号：２：
本発明の背景
ＴＧＦ-βは胚発生または組織の再生などの多くの生物学的な調節経路で中心的な役割を果たす。種々の異なる目的にも治療用として使用し得る非常に強力な生物学的因子である。
ＴＧＦ-βは当初、ヒト血小板、ヒト胎盤およびウシ肝臓から均質に精製され、約２５，０００Ｄａの分子量をもつ同質二量体タンパク質として同定された。ＴＧＦ-βは、初期にはＥＧＦまたはＴＧＦ-αと相乗的に作用し、非形質転換ＮＲＫ細胞の足場非依存性成長を誘導し得ることで特徴づけられたが、近年では、幅広い種類の正常細胞および腫瘍細胞の両方において数多くの調節効果を提示することが示され、このタンパク質が細胞活性の多機能性調節因子としての重要性を示唆するものとされている。細胞の型または組織の型および他の増殖因子の存在の有無に依存して、ＴＧＦ-βは有糸分裂誘発、細胞増殖および細胞成長を刺激するかまたは該工程を効果的に阻害し、または例えば脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成および免疫細胞機能の調節、ケモタキシスの刺激または分化の誘導または阻害などの他の作用を示し得る。ＴＧＦ-βの多くの作用は、ストレスまたは傷害に対する細胞または組織の応答および発生した損傷の修復に関連する。炎症後、ＴＧＦ-βは肉芽組織の形成において主要な役割を果たし、フィブロネクチン、コラーゲンおよびいくつかのプロテアーゼ阻害剤のように細胞外マトリックスの形成に関連する遺伝子の発現を増加させ、繊維芽細胞によるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、このことは結合組織の収縮に何らかの役割を果している可能性を示唆する。
ＴＧＦ-βなる用語は機能的および構造的に密接に関連したタンパク質のファミリーを意味する。今まで、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４およびＴＧＦ-β５と呼ばれる５つの異なる同質二量体ＴＧＦ-βが記載されている。
全てのＴＧＦ-βは３９０〜４１２アミノ酸の前駆体として合成され、これはタンパク質分解的開裂を受けてＣ末端の１１２アミノ酸からなる成熟形となる。その成熟した生物学的に活性な形では、ＴＧＦ-β１〜５は各１１２アミノ酸である２本のポリペプチド鎖の酸および熱に安定なジスルフィド結合形同質二量体である。ヒト（Derynck,R.et al.（1985）Nature 316、701-705）、ネズミ（Derynck,R.et al.（1986）J.Biol.Chem.261、4377-4379）およびサルのＴＧＦ-β１（Sharples,K.et al.（1987）DNA 6、239-244）の完全なアミノ酸配列は、１つのアミノ酸残基のみが異なる驚くべき配列相同性を示す。ヒトＴＧＦ-β１、ヒトＴＧＦ-β２（deMartin,R.et al.（1987）EMBO J.6、3673-3677;Marquardt,H.et al.（1987）J.Biol.Chem.262、12127-12131）およびヒトＴＧＦ-β３（Ten Dijke,P.et al.（1988）PNAS 85、4715-4719）のアミノ酸配列の比較により、成熟形の３つのタンパク質は約７０〜８０％の配列相同性を示すことが実証された。ヘテロ二量体ＴＧＦ-β１．２は、豚血小板から単離され、ＴＧＦ-β２の１つのサブユニットにジスルフィド結合するＴＧＦ-β１の１つのサブユニットからなる（Cheifetz,S.et al.（1987）Cell 48、409-415）。
近々、種々の治療態様で試験するために充分な量を得るために天然源（例えば血小板）からこれらの因子を単離するのではなく組換え技術を用いてＴＧＦ-βを産生する試みがなされてきた。しかしながら、生物学的に活性な組換えＴＧＦ-βを得ることは極めて困難であることが分かった。配列番号１〜６と題して配列表に記載した配列からも分かるように、１１２アミノ酸鎖長のＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３の成熟形は９個のシステイン残基を含む。ＴＧＦ-β２で９個のシステイン残基が４つの分子内および１つの分子間ジスルフィド結合を形成し、複雑なコア構造（『ジスルフィド結節』）を有することが示された［Schlunegger,M.P.およびGruetter,M.G.、Nature 358:430-434（1992）］。今日ＴＧＦ-β３のジスルフィド形態はＴＧＦ-β２と類似し、ＴＧＦ-β３は同じ複雑なコア構造を有することが知られている。
組換えＴＧＦ-βの発現は真核系で行い得るが、得られた生物学的に活性で正しくフォルドされた物質の収量は依然として満足のいくものではない。それ故、微生物宿主内で生物学的に活性なＴＧＦ-βを産生する試みがなされた。しかしながら、細菌内などの細胞内の状態は、活性に必須であると思われる正しいフォルディング、ジスルフィド結合形成およびジスルフィド安定化二量体化を誘導するものではない。従って、欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0 268 561に記載のように、ラムダ・プロモーターの制御下における大腸菌中でそれぞれの遺伝子を発現した後に、ほんのわずかの生物学的に活性なＴＧＦ-βしか得られない。他の報告でｔｒｐプロモーター制御下における大腸菌中のＴＧＦ-β ｃＤＮＡの発現が記載され、これはＳＤＳポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムによる写真像でおよそ１３，０００Ｄａの分子量をもつ放射活性標識タンパク質のバンドを示すが、活性は測定されていない（Urushizaki,Y.et al.（1987）Tumor Res.22、41-55）。しかしながら、例えば欧州特許出願ＥＰ-Ａ-0 433 225等に生物学的に活性で二量体のＴＧＦ-β様タンパク質の産生の成功した方法が記載され、ここでは封入体から単離したＴＧＦ-βのフォルディングに緩和な洗浄剤を使用している。
しかしながら、医薬的に許容可能な製剤を調製する上で、ＴＧＦ-β３はいくつかの物質に非特異的に吸着するので厳密な量で投与するのは困難である。さらに、全てのタンパク質と同じように、ＴＧＦ-β３は空気中の酸素などの酸化剤に感受性である。
本発明で可溶性形のかわりにＴＧＦ-β３の結晶を使用すると不安定性および吸着の両方を阻止することがわかった。
Schlunegger et al.、FEBS Lett.303:91-93（1992）でＴＧＦ-β２の結晶化が
発明の目的
本発明の目的は、バイアル壁に全く吸着しないかまたは溶解したＴＧＦ-β３よりも少ない吸着を示す製剤を調製するために結晶形のＴＧＦ-β３を提供することである。また本発明の目的は、溶解した形よりも酸化剤に対してより安定である製剤を調製するために結晶形のＴＧＦ-βを提供することである。
別の本発明の目的は構造決定およびドラッグ・デザインに使用し得るＴＧＦ-β結晶を提供することである。
また別の本発明の目的はＴＧＦ-β結晶を含有し、遅延放出医薬製剤として、またはその調製に使用し得るＴＧＦ-βの医薬調製物を提供することである。
本発明の要約
驚くべきことに、ＴＧＦ-β３は水溶液中で安定な結晶を形成することがわかった。ＴＧＦ-β３結晶はガラス容器に付着せず、タンパク質は分解から保護されており、これは構造決定およびドラッグ・デザインに使用し得る。
さらに、驚くべきことにＴＧＦ-β結晶は、治療に使用するＴＧＦ-βの遅延放出製剤として、またはその調製に使用し得ることがわかった。結晶ＴＧＦ-βを患者に適用する場合、可溶性のすなわち利用可能なＴＧＦ-βの濃度は、異なる溶液特性をもつ結晶を選別することにより、または適当な結晶サイズにより変化し得る。
本発明の詳細な説明
本発明はＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密なる結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』に関するものである。六方晶の結晶中、Ｘ線を４Åよりも高い最大分解に分散するものが好ましい。
本発明はまた実質的にＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶系または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密な結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』からなる組成物に関するものである。
さらに本発明はＴＧＦ-β３の結晶、好ましくは六方晶系または三方晶系空間群に属する結晶からなる群から選択されたＴＧＦ-β３結晶、より好ましくは六方晶系空間群Ｐ６1２２または三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する結晶からなる群から選択された結晶、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（厳密な結晶化条件に依存して、この好ましい形の単位セルサイズは４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形『Ｈ』であり、よりさらに好ましくは単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形『Ｔ』を含有する医薬組成物に関するものである。
タンパク質結晶は、通常、対称な関係にある分子間の表面にある荷電基および双極子の相互作用により保持されている。ＴＧＦ-β３の高分解能Ｘ線構造解析によりＴ型結晶についてはこのことは当てはまらないことがわかった。これらの結晶は極めて濃密に集積しているが、極性相互作用は結晶接触にはほんのわずかしか関与していない。これらの接触のほとんどは疎水性相互作用により成立している。比較的もろく生理学的条件下で容易に溶解し易い多くの他のタンパク質結晶と比較して、結晶形Ｔの驚くべき高い安定性がこの通常でない構造によりもたらされる：Ｔ形の結晶は機械的に安定である。壊れることなく取り扱われ得る。貯蔵緩衝液中、それらは少なくとも６カ月持続可能である。結晶はまた例えばＰＢＳ緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２）などの生理学的条件下で安定である。結晶は１００ｍＭ酢酸中にまたはイソプロパノールの存在下に溶解する。
結晶形Ｈは比較的もろく針で触れれば容易に壊れる。母液とは異なる溶液に移せば、直ちに崩壊する。
さらに、本発明はこれらの結晶の調製法に関する。
例えば天然源から単離、ＣＨＯ細胞などの組換え真核発現系で産生、または大腸菌などの原核発現系で産生した、あらゆる起源由来の純粋な二量体の生物学的に活性なＴＧＦ-β３が結晶化のための出発原料として使用され得る。例えば、大腸菌中で封入体として発現し、例えば緩和な洗浄剤であるＣＨＡＰＳおよび所望により有機溶媒のＤＭＳＯを用いる方法により可溶化し、再フォルドされ、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなどの適当なクロマトグラフィー法により精製したＴＧＦ-β３は出発原料として使用し得る。
結晶工程において、結晶形成に必要とされるよりも低い濃度の沈殿剤を用いて結晶化緩衝液を調製（例えばＴＧＦ-β３溶液を『貯蔵緩衝液』と混合することによる）する。結晶を形成させるために、例えば滴加することにより、または結晶化緩衝液と貯蔵緩衝液間で拡散することにより沈殿剤の濃度を変化させることにより、例えば沈殿剤を高濃度の沈殿剤をもつ貯蔵緩衝液から結晶化緩衝液に拡散するなどして、沈殿剤を加えることにより沈殿剤の濃度を増加させなければならない。例えば、拡散は蒸気拡散法によって行い得る。この方法では結晶化緩衝液中の状態は、例えば『懸滴法』または『シティング・ドロップ（sitting drop）法』（これはそれぞれ結晶化緩衝液の一滴を貯蔵緩衝液のずっと大きな貯蔵液の上から懸滴し、または並列的に保持する）、または実施例に記載したような蒸気拡散バッチ法などのように共通の気相中への拡散により変化する。沈澱剤の濃度変化はまた結晶化緩衝液を貯蔵緩衝液から隔離すると共にタンパク質が貯蔵緩衝液中に浸透するのを防ぐ半透膜を通して沈澱剤を拡散させることによりなし得る。
結晶化緩衝液中のＴＧＦ-β３は好ましくは１０mg/mlまで、より好ましくは０．５〜６mg/ml、よりさらに好ましくは１〜３mg/mlの濃度を有する。
ＴＧＦ-β３結晶の調製は様々な条件下で行い得る。好ましいｐＨは４〜８．５である。緩衝液の濃度および種類は重要ではないので、様々な緩衝液を使用し得る。好ましい緩衝系はリン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳである。緩衝液は、例えばイソプロパノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯまたは好ましくはジオキサンおよびポリエチレングリコールなどの好ましくは低い相対誘電率をもつ水と混和性の有機溶媒からなる群から選択され、好ましくは４００ないし８０００の分子量を有する沈殿剤を含有する。
ＴＧＦ-β３の三方晶系の結晶はいくつかの条件下で得られる。好ましいＰＨは４〜７．５である。Ｔ結晶を得る好ましい緩衝液系はＴｒｉｓであり、より好ましくはリン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはＨＥＰＥＳである。好ましい本発明の態様において、結晶化緩衝液は緩衝剤を３０ｍＭないし３００ｍＭ含有し、より好ましくは緩衝剤を５０〜１５０ｍＭ含有する。三方晶ＴＧＦ-β３結晶は、例えばイソプロパノール、アセトニトリル、ＤＭＳＯまたは好ましくはジオキサンなどの好ましくは低い相対誘電率をもつ沈澱剤として水と混和性の有機溶媒の存在下で形成され、有機溶媒は６〜３０％、好ましくは６〜１５％の濃度で存在する。温度は好ましくは４℃ないし２０°である。
Ｔ型のＴＧＦ-β３結晶を得るための、結晶化緩衝液中の好ましいジオキサン濃度は７．５％である。すでに上記で定義したように、かくして得られるＴ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する。
ＴＧＦ-β３の六方晶の結晶はいくつかの条件下で成長する。好ましいｐＨはｐＨ５．０〜ｐＨ８．５である。好ましくは、分子量が４００〜８０００であり１０％〜３０％の濃度のポリエチレングリコールが結晶緩衝液中に存在する。好ましい温度は４℃ないし２０℃である。結晶は六方晶系二錐体として成長する。
本発明のＴＧＦ-β結晶は、タンパク質の結晶化の当分野でよく知られているバッチ結晶法または懸滴法のいずれかで形成し得る。両方の例を詳細に後述する。
本発明のＴＧＦ-β３結晶は、自然結晶化、またはより良好には実施例中で後述するように微小または大種晶添加のいずれかで調製し得る。特に種晶添加に際して微小結晶懸濁液を使用（『微小種晶添加』）することにより、結晶の大きさを調節する良い方法が提供される。例えば、Ｔ型結晶の場合、１００μｌの懸濁液中０．１ｍｍ3の均一化されたＴＧＧ-β３結晶を含有する貯蔵懸濁液の１／４3〜１／４5希釈により１０×１０×３０μｍ3付近の典型的な大きさの結晶が得られる。高希釈度（１／４6〜１／４9）においては、単一で大きな結晶（大きさ７０×７０×２５０μｍ3）が成長する。一定量のＴＧＦ-β３を含有する製剤において、結晶の大きさが小さくなるほど、結晶表面は広くなる。従って、結晶表面は結晶と平衡にある溶解ＴＧＦ-β３の量に影響を及ぼし、よって、遅延放出製剤中の有効なＴＧＦ-β３の量にも影響を及ぼす。
好ましくはＴ型の結晶の懸濁液としてＴＧＦ-β３を利用することは溶液で利用することよりも有利な点がいくつかある。例えば、好ましくはＨ型、より好ましくはＴ型の結晶状態では、容器の表面への非特異的吸着およびタンパク質分解が減少する。もう一つの利点は好ましくはＨ型、より好ましくはＴ型のＴＧＦ-β３結晶は治療適用する遅延放出製剤として、またはその製造用に使用し得ることである。
好ましくはＴ型のＴＧＦ-β３結晶はまた生理学的条件下でも安定であるので、遅延放出製剤として、またはその製造用に使用し得る。
本発明の別の態様はＴＧＦ-β結晶を含有する遅延放出製剤に関するものである。本発明の好ましい態様では、後述の遅延放出製剤に関連する『ＴＧＦ-β』はＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４およびＴＧＦ-β５、さらに好ましくはＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３、さらにより好ましくはＴＧＦ-β３からなる群から選択されるＴＧＦ-βを意味する。
ＴＧＦ-β１およびＴＧＦ-β２の結晶は、例えばDavied et al.、米国特許５，３２２，９３３に記載のようにすでに当分野で既知の方法により調製し得る。
ＴＧＦ-βの結晶は結晶のデポ効果により、遅延放出製剤としてまたはその製造用に適している。好ましい製剤はＴＧＦ-βの有効濃度が０．１〜５０μg/mlに到達し得るものである。
ＴＧＦ-βのデポ結晶製剤はゲル状、軟膏、懸濁液の形であり得る。結晶はセルロース誘導体、糖、ポリマー、塩、保存剤などの全ての医薬成分と混合し得る。ＴＧＦ-β結晶は凍結乾燥製剤の調製にも使用し得、例えば乾燥包帯および骨セメントなどに含まれ得る。ＴＧＦ-βのデポ製剤は、例えば創傷治癒、口粘膜炎、骨関節炎、骨疾患、骨修復、または腸粘膜炎などの全てのＴＧＦ治療域で使用し得る。
本発明の別の態様は構造決定およびドラッグ・デザインのための本発明のＴＧＦ-β３結晶の使用である。
合理的な薬物の設計のためには、標的タンパク質の３次元構造を知る必要がある。現在、この構造に関する情報は、溶液中でのＮＭＲで分光化学的に、タンパク質結晶のＸ線回折または相同モデリングのいずれかで得られる。相同構造に基づくモデリングにより得られる構造情報は充分に詳細ではなく、それ故実験的証拠に支持される構造が好ましい。薬物の合理的な設計を支持するのに有益な結晶は異なる特徴を有するべきである。まず第一に、分子を詳細に表現するために全ての構造は高度に分離されていなければならない。到達可能な最も高い分解が得られるかどうかはタンパク質の結晶の質に依存する。さらに、小さな分子は活性部位に到達するために結晶を浸透させることができなければならない。この活性部位が隣接する分子、阻害剤または結晶化に必要な物質といった他の化合物で阻害されているのであれば、異なる結晶形を使用しなければならない。
『Ｔ』型結晶は『Ｈ』型結晶よりも高い分解性を示し、それ故ドラッグ・デザインに好ましい。『Ｔ』型結晶が濃密にパックされているため、分子表面の大部分は薬物に近づけない。この理由により薬物が『Ｔ』型結晶形のＴＧＦ-β３に結合しない場合、『Ｈ』型結晶は『Ｔ』型結晶よりも好ましい。
以下の実施例は、本発明を制限する意図はなく説明するためのものである。
実施例１：大腸菌内でのＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３の発現
実施例１Ａ：一般的な方法
細菌株：
−大腸菌Ｋ１２／ＬＣ １３７：ｈｔｐＲam、ｌｏｎR9、ｌａｃam、ｍａｌam、ｔｒｐam、ｐＨＯam、ｒｓｐＬ、ｔｓｘ::Ｔｎ１０、ｓｕｐＣts（Goff,S.A.et al.（1984）PNAS 81、6647-6651）。
プラスミド：
−ｐＰＬＭｕ（Buell,G.et al.（1985）Nucleic Acids Res.13、1923-1938）：このプラスミドはファージＭｕ ｎｅｒ遺伝子リボソーム結合部位をもつバクテリオファージＩＰLプロモーターを有する（Van Leerdam,E.et al.（1982）Virology 123、19-28）。
−ｐｃＩ857：熱不安定性λｃＩ857リプレッサーをコードし、カナマイシンに耐性を有するプラスミド（Remault,E.et al.（1983）Gene 22、103-113）。
ＳＤＳゲル電気泳動：
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質染色はBIORADのMiniprotean II細胞および１mmの厚さの１８％ポリアクリルアミドゲルを用いて前記（Laemmli、U.K.（1970）Nature 227、680-685）のように行う。
熱誘導：
各々４０μｇのアンピシリンおよびカナマイシン（LB/amp/kan）を含有する２０ml培養チューブ中のＬＢ培地７ml（Maniatis et al.（1982）、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）に単一のコロニーを植え付け、一晩３０℃で振盪しながらインキュベートする。この一晩培養したもの５mlを１００mlのエーレンマイヤー・フラスコ中のLB/amp/kan １５mlに加えるこのフラスコを４２℃の水浴振盪機に移す。２mlのサンプルを移す前（非誘導条件）にとり、移した後（誘導条件）に１時間間隔で１mlのサンプルをとる。細胞を遠心（エッペンドルフ遠心機中で５分間、１０，０００ｒｐｍ）によりペレット化し、上清を廃棄する。ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に１００μｌのサンプル緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱する。５μｌの等分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにのせる。
コンピテント細胞の作製：
コンピテント大腸菌細胞はMiniatis et al.（1982）、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yorkに記載にように塩化カルシウム法により作製する。プラスミドｐｃＩ857を有する細胞を３０℃で成育させる。
実施例１Ｂ：発現ベクターｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３の構築およびＴＧＦ-β３の発現
ＴＧＦ-β３のコード配列（配列番号１として配列表に示す）を、ＮｃｏＩで消化したプラスミドＰＧｅｍ−５ＺＦ（＋）（Promega）にクローン化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー）で脱リン酸化し、クレノウポリメラーゼ（Gibco-BRL）で伸長する。得られた構築物をｐＧＫＭ１２６と呼び、コンピテント大腸菌Ｙ１０９０細胞を形質転換するのに使用する。ＴＧＦ-β３をコードする正しい挿入物をもつクローンを大腸菌Ｙ１０９０／ｐＧＫＭ１２６と呼ぶ。
大腸菌Ｙ１０９０／ｐＧＫＭ１２６細胞をＬＢ培地で成育させ、プラスミドＤＮＡをBirnboim,H.C.およびDoly,H.（1979）Nucleic Acids Research 7の方法で調整し、製造業者（ベーリンガー）の薦めに従って、プラスミドＤＮＡ１５１３．５μgを５０μlの制限緩衝液中でＮｃｏＩを用いて完全に切断する。ＤＮＡを５μlの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＭｇＣl2、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０μlエタノールを加えて沈降させる。７０℃で１５分間インキュベートした後、ＤＮＡをSorvall遠心機のＳＳ３４ローターで１３，０００ｇで１５分間遠心することによりペレット化する。上清を廃棄し、０．２５％ブロモフェノールブルーおよび０．２５％キシレンシアノールを含有する８０μlの０．０８９Ｍ ＴＲＩＳホウ酸塩、０．０８９Ｍホウ酸および０．００２Ｍ ＥＤＴＡ（ＴＢＥ緩衝液）中に再懸濁する。４回２０μlのサンプルを、５０ボルトで０．５μg/ml臭化エチジウムを含有するＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲルを通して、１０ｃｍ長で０．８ｃｍの厚さのゲルの末端にブロモフェノールブルー・マーカーが達するまで電気泳動する。成熟ＴＧＦ-βをコードするＤＮＡ断片を短波長ＵＶ光で視覚化し、かみそりの刃で切り出し１．５時間２００ｍａｍｐを適用した
プラスミドｐＰＬＭｕ ５μlをＮｃｏＩおよびＳａｌＩ、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶまたはＮｃｏＩ単独のいずれかで消化し線状とし、上記のＤＮＡ断片のようにゲル精製する。１００ngの線状で精製されたｐＰＬＭｕベクターＤＮＡおよび３モル等量のそれぞれの精製ＤＮＡ断片を１単位のＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を含有するライゲーション緩衝液２０μl（７０ｍＭ ＴＲＩＳ/ＨＣl、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭアデノシン三リン酸）中で４℃で１５時間インキュベートする。
１０μlのライゲーション混合物をプラスミドｐｃｌ857をもつ冷（４℃）コンピテント大腸菌ＬＣ１３７細胞２００μｌに加える。３０分後、細胞を４２℃の水浴で１．５時間インキュベートすることにより熱衝撃を与える。ＬＢ培地２mlを加え、培養物を６０分間３０℃で振盪する。２００μl等分をアンピシリンおよびカナマイシンを含有するＬＢプレート上にまき、２２時間３０℃でインキュベートする。単一のコロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを解析する。ｐＰＬＭｕ中のＴＧＦ-β３をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングすることによりプラスミドｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３が得られる。上記の構築物を含有するクローンを大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３と呼ぶ。
大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３細胞を熱誘導（実施例１Ａ参照）し、発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。熱誘導タンパク質が約１２，０００Ｄａの見かけの分子量で広がるにつれ、全てのＴＧＦ-β３は熱誘導の２時間後に現れる。
実施例１Ｃ：形質転換細胞の醗酵
４０mg/lのアンピシリンおよびカナマイシンと共に７５０mlのＬＢ培地を含有する２lのエーレンマイヤー・フラスコ中で大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈ．ＴＧＦ-β３を一晩培養した培養物を３０℃で成育させる。３００mlの一晩培養物を２lエーレンマイヤー・フラスコ中、上記した抗生物質を含有する７５０mlのＬＢ培地に加え、６５℃の水浴で約３．５分間振盪することで４２℃に加温する。次いでフラスコを４２℃の振盪機に移し、３時間インキュベートする。フラスコを氷水浴中で１２℃まで冷却し、細胞をＧＳＡローター（Sorvall）中、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後回収する。
実施例２
実施例２Ａ：大腸菌からの不溶性でモノマーのＴＧＦ-β３の回収
大腸菌ＬＣ１３７／ｐＰＬＭｕ．ｈＴＧＦ-β３細胞を実施例１Ｃに記載のように醗酵させる。細胞破砕および不溶性のＴＧＦ-β３の回収を４℃で行う。約１８ｇの湿潤細胞を６０mlの０．１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、ｐＨ８．３（破壊緩衝液）中に再懸濁する。製造業者の指示に従って細胞を２回フレンチプレス（SLM Instruments、Inc.）に通過させ、破砕緩衝液で容量を２００mlとする。懸濁液を１５，０００ｇで２０分間遠心する。得られたペレットを１Ｍ ＮａＣlを含有する破砕緩衝液１００mlに懸濁し、上記のように１０分間遠心する。ペレットを１％Ｔriton Ｘ−１００（Pierce）を含有する破砕緩衝液１００mlに懸濁し、上記のように再び１０分間遠心する。次いで洗浄したペレットを５０mlの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ/ＨＣl、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ＤＴＴ中に懸濁し、テフロン組織粉砕機でホモジナイズする。得られた懸濁液は不溶性形の粗モノマーであるＴＧＦ-β３を含有する。
実施例２Ｂ：モノマーＴＧＦ-β３の可溶化および精製
実施例２Ａに従って得られたＴＧＦ-β３懸濁液１０mlを１０％酢酸でｐＨ２．５に酸性化し、エッペンドルフ遠心機で１０分間室温で遠心する。上清を流速１．４ml/分で１０％酢酸中、セファクリルＳ−１００カラム（ファルマシア、２．６×７８cm）でクロマトグラフィーする。（別に、クロマトグラフィーはセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシア）で行い得、カラムはそれぞれ１％酢酸または５ｍＭ ＨＣl中で行い得る。）１９０分ないし２２０分に溶出するモノマーで変性したＴＧＦ-β３を含有する画分を集める。この物質は生物学的に活性で二量体のＴＧＦ-β３を得るためのフォルディングに使用する。
実施例３：インビトロにおけるＴＧＦ-β３のフォルディング
上記で得られたＴＧＦ-β３は、それぞれ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１Ｍ ＮａＣl、５ｍＭ還元グルタチオンおよび２０％（v/v）ＤＭＳＯからなる緩衝液中、４℃で折りたたまれる。必要であれば緩衝液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に調節する。ＴＧＦ-β３の最終濃度は０．１mg/mlである。７日後、４℃で溶液を濃酢酸でｐＨ３．５に酸性化し、ＹＭ１０膜（Amicon）のついたアミコン撹拌細胞中で約１０回、限外濾過することにより濃縮する。濃縮した溶液を０．１Ｍ酢酸で元容量まで希釈し再濃縮する。この操作を２回繰り返す。次いで溶液を実施例４に記載のように精製する。
実施例４：二量体の生物学的に活性なＴＧＦ-β３の精製
約１０ないし５０mgのＴＧＦ-β３を含有する実施例３で得られた溶液を５０ｍＭ酢酸、３５％エタノールを用いて透析濾過する。得られた溶液を６ml/分でハイロード（Hiload）２６/１０Ｓ−セファロース高速カラム（ファルマシア）にのせる。始めにカラムを５０ｍＭ酢酸、３５％エタノール（緩衝液Ａ）で５分間洗浄し、次いで０．２Ｍ ＮａＣlを含有する緩衝液Ａで始めて、０．５Ｍ ＮａＣlを含有する緩衝液Ａで終わる線形勾配で４５分間に及び溶出する。溶出物を２８０ｎｍでモニターし、手動で画分化する。画分を実施例５に従って、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより二量体ＴＧＦ-β３を、インビトロのバイオアッセイにより生物学的活性を確認する。
二量体の生物学的に活性のあるＴＧＦ-β３を含有する画分を集め、０．１Ｍ酢酸に対して透析するか、または水中０．１％ＴＦＡの同容量で希釈しVydac２１４ＴＰ５１０カラム（１cm×２５cm、The Separations Group、USA）のＲＰ−ＨＰＬＣを行う。カラムを７５％溶媒Ａ［水中ＴＦＡ０．１％］および２５％溶媒Ｂ［アセトニトリル中ＴＦＡ０．０８％］の混合物を用いて流速４．５ml/分で平衡化する。サンプルをのせた後、２３５nmでモニターされた吸収が基線に達するまでカラムを平衡条件下で洗浄する。次いでカラムを、平衡条件下で始めて４５％溶媒Ａと５５％溶媒Ｂとの混合物終わる線形勾配で３０分以内に溶出する。溶出物を手動で画分化し，実施例５に従って非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびインビトロのバイオアッセイにより解析する。
活性画分を集め、２０ｍＭ酢酸、２０％エタノールに対して透析濾過する。
実施例５：フォルディングしたＴＧＦ-βのインビトロ活性試験：ミンク肺上皮細胞（Ｍv-１-Ｌu）酸性ホスファターゼアッセイ
連続ミンク肺上皮細胞系Ｍv-１-Ｌu（ＡＴＣＣ/ＣＣＬ６４）の成長を阻害する化合物の効力を測定する細胞バイオアッセイにおいてインビトロでＴＧＦ-β３を選別する。Ｍv-１-Ｌu細胞系はＴＧＦ-βのバイオアッセイで感受性のあるリポーターであることが分かり、約１０〜５０pg/mlのすでに報告されているＥＣ５０でシグモイド形の濃度反応曲線を示す（Tucker et al.、Science 1984;226:705-707;Absher et al.、J.Immunol Methods 1991;138:301-303;Danielpour et al.、J Cell Physiol 1989;138:79-86）。ＴＧＦ-βにより強く増殖が阻害されるＭv-１-Ｌu細胞は現在、このサイトカインの解析的バイオアッセイの開発に最も適した細胞系であると考えられている（Kelley et al.、Exp Lung Res 1992;18:877-887;Meager、J Immunol Methods 1991;141:1-14）。アッセイは、元来American Type Culture Collection、Rockville MD、USAから得られた細胞を用いて９６穴のマイクロタイター・プレートで行う。
細胞をＴＧＦ-β３標準物質またはサンプルの連続希釈液を含有する成長培地（５％v/v仔ウシ血清を含む最小必須培地）中に低密度（１穴につき５０００個の細胞）でまく。次いでアッセイを加湿５％ＣＯ2インキュベーターで７２時間、３７℃でインキュベートする。細胞増殖の阻害は高感度酵素細胞染色法（これは各穴で産生された酸性ホスファターゼの量を比色定量的に見積もる）により測定し、染色の強度は各穴に存在する細胞数に対応している。各穴の吸光度Ｏ．Ｄ．は４０５nmで測定し、アッセイ・データをプロットし適当なＰＣソフトウェア・プログラムにより解析する。
実施例６：Ｔ型結晶（三方晶形）
実施例４で得られた二量体のＴＧＦ-β３を１７時間、冷（４℃）１０ｍＭ酢酸に対して透析（Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６〜８ｋＤａ）する。ＴＧＦ-β３溶液を限外濾過により濃縮し最終タンパク質濃度を３〜８mg/mlとする。
実施例６Ａ：自然結晶化
１０ｍＭ酢酸中のＴＧＦ−β３溶液２μlをシリコーン処理をしたカバーグラス上の２μlの貯蔵緩衝液（１５％（v/v）ジオキサンおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）と混合する。カバーグラスを逆にし６００μlの貯蔵緩衝液で満たした貯蔵容器の上におく。貯蔵容器およびカバーグラスをシリコン油で密閉する（『懸滴法』）。密封した容器の容量は２mlである。液滴と貯蔵液との距離は１２mmである。室温で２４時間後、最初の結晶（大きさ１０×１０×３０μm3）が光学顕微鏡で発見された。結晶は約１週間後に最大の大きさ（７０×７０×２５０μm3）に達する。これらの条件下での結晶の再現性は以下のようである：４８の同じ結晶実験中２４において、結晶が形成される。
実施例６Ｂ：微小種晶添加
結晶化を改善するためにタンパク質溶液に実施例６Ａの自然結晶化で得られた結晶で種晶添加する。
一片の種晶（大きさ３０×３０×１００μm3）を１０ｍＭ酢酸で洗浄し、１００μlの１０ｍＭ酢酸でホモジナイズする。この溶液２５μlを７５μlの１０ｍＭ酢酸で希釈する（全希釈度１/４1）。８回希釈を繰り返す（全希釈度１/４8）。各希釈液１μlを貯蔵容器をカバーグラスで密封する前に小滴に加える（上記実施例６Ａ参照）。一滴当たりに産生される結晶の大きさと数は微小結晶懸濁液の希釈度に依存する。非希釈の懸濁液では微小結晶沈殿物が発見される（本発明の目的のために、微小結晶は３μm以下の最も長い数値のサイズを有するものと定義する）。１/４3〜１/４5の希釈により、およそ１０×１０×３０μm3の典型的な大きさの微小結晶が得られる。より高希釈（１/４6〜１/４9）では、単一で大きな結晶が成長する（大きさ７０×７０×２５０μm3）。このように種晶添加に微小結晶懸濁液を使用することにより結晶の大きさを調節する良好な方法が提供される。
実施例６Ｃ：他の結晶化条件
結晶は以下の表に要約した条件を用いて自然結晶、微小または巨大種晶添加により得られる：
単一の大結晶を微小結晶懸濁液の代わりに種晶添加に使用し得る。（本発明の目的において、大結晶は３μm以上の最も長い寸法のサイズを有するものとして定義する）
種晶（大きさ３０×３０×１００μm3）を１５分間、１０ｍＭ酢酸で洗浄し、直接小滴に移す（上記の実施例６Ａ参照）。新しい結晶が２４時間以内に形成されおよそ５０×５０×１５０μm3の大きさに達する。
実施例６Ｅ：透析による結晶化
１０ｍＭ酢酸中の１２μlＴＧＦ-β３溶液を貯蔵緩衝液１２μl（１５％（v/v）ジオキサンおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）および１０ｍＭ酢酸中の微小結晶懸濁液の１／４5希釈液１μlと混合する（実施例６Ｂ参照）。混合物を密封したビーカー中の貯蔵緩衝溶液５０ｍlに対して冷して透析（４℃、Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６−８ｋＤａ）する。
実施例６Ｆ：結晶の特徴
Ｔ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する。結晶は六角の断面をもつ棒状の形を呈する。そのように得られた結晶は最大分解２ÅまでＸ線を回折する。
Ｔ型の結晶は物理的に安定である。それらは崩壊することなく手で操作できる。貯蔵緩衝液中ではそれらは少なくとも６カ月は持続可能である。結晶はまた生理学的条件下でも安定である。目視試験で、ＰＢＳ緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣl、５ｍＭ ＫＣl、５ｍＭ ＭｇＣl2、２５ｍＭ Ｎa2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２）中で結晶は１週間以内には溶解しない。結晶は１００ｍＭ酢酸中またはイソプロパノールの存在下で溶解する。
上記で得られたＴＧＦ-β３ Ｔ結晶は、２つの対称に相関するＴＧＦ-β３分子間に埋もれていて、ＴＧＦ-β３サブユニット当たり１分子のジオキサン分子を含有する。
実施例６Ｇ：スケール・アップ
ＴＧＦ-β３を２０μgから１gに結晶化工程をスケール・アップするために、実験操作を懸滴法からバッチ結晶化へと変えた。バッチ結晶化実験を以下のように行う：ガラスのビーカーを２００mlの５mg/mlＴＧＦ-β３、７．５％（v/v）ジオキサン、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および１０ｍＭ酢酸中の微小結晶懸濁液１mlで満たす。このビーカーを２lの貯蔵緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５％（v/v）ジオキサン）で満たした４lのタンクに置く。結晶化の間、貯蔵緩衝液をわずかに撹拌する。タンクを密封した後、気相を介してビーカー中の溶液と貯蔵液の平衡化がおこる。
実施例７：Ｈ型結晶（六方晶形）
上記のように、実施例４で得られた二量体のＴＧＦ-β３溶液を１７時間冷（４℃）１０ｍＭ酢酸に対して透析（Spectrapore膜 ＭｗＣＯ ６−８ｋＤａ）する。ＴＧＦ-β３溶液を限外濾過により濃縮し、最終タンパク質濃度を３−８ｍｇ／ｍｌとする。
実施例７Ａ：結晶化
Ｈ型の結晶をＴ型結晶と同じ『懸滴法』実験操作を用いて成長させる。貯蔵緩衝液は３０％（v/v）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００および１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０から成る。ＴＧＦ-β３溶液４μlを貯蔵緩衝液２μlと混合する。結晶は室温で４８時間以内に自然にでき、４００×４００×３００μm3の大きさに達する。
実施例７Ｃ：他の結晶化条件
Ｈ型結晶は以下の表に要約した条件を用いて、自然結晶化、微小または巨大種晶添加により得られる：
Ｈ型結晶は単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する。個々の結晶条件に依存して単位セルサイズは４％まで変化し得る。結晶は六方の二錐体形として成長する。このようにして得られた結晶は３．３Åの最大分解でＸ線を回折する。
Ｈ型結晶は比較的もろく、針で触れれば容易に壊れる。もし母液とは異なる溶液に移せば直ちに崩壊する。
実施例８：ＴＧＦ-β結晶ＴおよびＨの遅延放出特性
Ｔ型ＴＧＦ-β３微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）を２分間、エッペンドルフ遠心機（×１０００ｒｐｍ）で遠心する。透明な上清（Ｓ０）を除去し、ＴＧＦ-β３の量を測定する。Ｔ微小結晶のペレットの上に２mlの水を加え、結晶を穏やかに振盪することにより再懸濁する。１時間の平衡時間の後、再可溶化ＴＧＦ結晶を含有する溶液を再度遠心する（反応条件は前述している）。この最初の再可溶化段階（Ｓ１）後に得られた上清中のＴＧＦ-β３の量を測定する。ＴＧＦ-β３の微小結晶のペレットを再度２mlの水に懸濁し、１時間インキュベートし、次いで再度遠心する；上清Ｓ１２中のＴＧＦ-β３の量を測定する。実験によりＴＧＦ-β３はＳ１、Ｓ２、Ｓ３に存在することが示され、Ｔ微小結晶の遅延放出特性が証明された。
Ｈ型のＴＧＦ-β３の微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）をエッペンドルフ遠心機（×１０００ｒｐｍ）中で２分間遠心する。透明な上清（Ｓ０）を除去し、ＴＧＦ-β３の量を測定する。Ｈ微小結晶のペレットの上に水２mlを加え、微小結晶を穏やかに振盪することにより再懸濁する。１時間の平衡時間の後、再可溶化したＴＧＦ-β３の微小結晶を含有する溶液を再度遠心する（反応条件は前述している）。この最初の再可溶化段階（Ｓ１）の後に得られた上清中のＴＧＦ-β３の量を測定する。ＴＧＦ-β３の微小結晶のペレットを再度水２mlに懸濁し、１時間インキュベートし、次いで再度遠心する；上清Ｓ２中のＴＧＦ-β３の量を測定する。実験によりＴＧＦ-β３はＳ１、Ｓ２、Ｓ３に存在することが示され、Ｈ微小結晶の遅延放出特性が証明される。しかしながら、上記のＴ微小結晶と比較して、Ｈ ＴＧＦ-β３の微小結晶を用いて行った実験より、より速い可溶化を示す。
実施例９：ＴＧＦ-β３結晶ＴおよびＨの化学的安定性
Ｔ型ＴＧＦ-β３微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）と１mg/mlのＴＧＦ-β３の水溶液２mlを５０℃で５日間インキュベートする。温度衝撃を与える前と後に毛細管等電点焦点電気泳動測定を行う。水中に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルでＴＧＦ-β３の主要なピークの減少を測定し、ＴＧＦ-β３Ｔ微小結晶の懸濁液ではＴＧＦ-β３の主要なピークのほんのわずかな減少が測定される。
Ｈ型のＴＧＦ-β３の微小結晶の懸濁液２ml（１mg/ml）と水中の１mg/mlのＴＧＦ-β３の溶液２mlを５日間５０℃でインキュベートする。温度衝撃を与える前と後に毛細管等電点焦点電気泳動測定を行う。水中に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルでＴＧＦ-β３の主要なピークの減少を測定し、ＴＧＦ-β３Ｈ微小結晶の懸濁液ではＴＧＦ-β３の主要なピークのほんのわずかな減少が測定される。
これらの結果により結晶形のＴＧＦ-β３は溶液のＴＧＦ-β３よりも化学的な分解に対してより安定であることが示される。
実施例１０：ＴＧＦ-β３結晶ＴおよびＨの物理的安定性
ＴＧＦ-β３のＴ微小結晶の懸濁液（１０μg/mlＴＧＦ-β３）を５日間３７℃でガラスまたはプラスチックの容器中でインキュベートする。これらのサンプルのＴＧＦ-β３含量のＨＰＬＣ解析により、５日間３７℃でインキュベートした後、ＴＧＦ-β３の濃度には全く変化がないことが示される。同様の条件下での平行実験では、ＴＧＦ-β３がガラスまたはプラスチックの容器の壁に付着するために、水に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルは８０％ないし９０％のＴＧＦ-β３が遊離している。
ＴＧＦ-β３のＨ微小結晶の懸濁液（１０μg/mlＴＧＦ-β３）を５日間３７℃でガラスまたはプラスチックの容器中でインキュベートする。これらのサンプルのＴＧＦ-β３含量のＨＰＬＣ解析により、５日間３７℃でインキュベートした後、ＴＧＦ-β３の濃度には全く変化がないことが示される。同様の条件下での平行実験では、ＴＧＦ-β３がガラスまたはプラスチックの容器の壁に付着するために、水に溶解したＴＧＦ-β３のサンプルは８０％ないし９０％のＴＧＦ-β３が遊離している。
微生物の寄託
以下の微生物はDeutshe Sammlung von Mikroorganismen（DSM）Mascheroder Weg 1b、D-3300 Braunschweig（FRG）に寄託した：
微生物 寄託日 受託番号
大腸菌ＬＣ137/pＰＬＭu.hＴＧＦ-β3 1989年11月28日 ＤＳＭ 5658
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：チバ−ガイギー ＡＧ
（Ｂ）通り：クライベック通り１４１
（Ｃ）市：バーゼル
（Ｅ）国名：スイス
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４００２
（Ｇ）電話番号：＋４１ ６１ ６９ １１ １１
（Ｈ）ファックス：＋４１ ６１ ６９６ ７９ ７６
（Ｉ）テレックス：９６２ ９９１
（ii）発明の名称：新規な結晶
（iii）配列の数：２
（v）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒介型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０、
バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前／特徴を示す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３３６
（Ｄ）その他の情報：／産物＝『ヒトＴＧＦ-β３』
（xi）配列：配列番号：１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（xi）トポロジー：配列番号：２：
Claims (6)
- 単位セルサイズがａ＝ｂ＝７７．８Å、ｃ＝１４３．２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°（ただし、単位セルサイズは結晶化条件に依存して４％まで変化し得る）である六方晶系空間群Ｐ６1２２に属する六方晶形の結晶、または単位セルサイズがａ＝ｂ＝４９．３Å、ｃ＝７８．９Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°である三方晶系空間群Ｐ３2２１に属する三方晶形の結晶であることを特徴とする、ＴＧＦ-β３の結晶。
- 請求項１に記載のＴＧＦ−β３の結晶からなる組成物。
- 請求項１に記載のＴＧＦ-β３の結晶を含有する医薬組成物。
- 溶解したＴＧＦ-β３および沈殿剤を含有する緩衝液から結晶化させることを特徴とするＴＧＦ-β３の結晶の調製法であって、結晶化を（ｉ）ｐＨが４〜７．５であり、温度が４〜２０℃であり、ジオキサンが６〜３０％の濃度で存在する条件下で実施して三方晶系の結晶を得るか、または（ｉｉ）ｐＨが５．０〜８．５であり、温度が４〜２０℃であり、分子量４００〜８０００のポリエチレングリコールが１０〜３０％の濃度で存在する条件下で実施して六方晶系の結晶を得る方法。
- 緩衝液にＴＧＦ-β３の微小結晶（microcrystal）を種晶として添加する、請求項４に記載の方法。
- 緩衝液にＴＧＦ-β３の大結晶（microcrystal）を種晶として添加する、請求項４に記載の方法。
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