JP4223810B2 - リポペプチド抗生物質の抽出的精製 - Google Patents
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Description
本発明は、抗生物質および/または抗菌剤を抽出的に精製および/または単離する方法に関する。より詳細には、本発明は、リポペプチド抗生物質を精製または単離するための安価でかつ効率的な抽出的方法に関する。
グラム陽性細菌を阻害する抗生物質の重要なクラスは、酸性リポペプチド抗生物質である。一般に、酸性リポペプチド抗生物質は、親油性フラグメントでアシル化された環状デプシペプチドコアまたは環状デプシペプチドコアのいずれかからなり、そして約pH7.0未満の等電点を有する。この親油性フラグメント(代表的には、不飽和脂肪酸)は、種々の長さであり得る。頻繁には、リポペプチド抗生物質の抗生物質活性は、親油性フラグメントの長さに関連する。
これらのおよび他の必要性は、本発明によって取り組まれる。本発明は、大量のリポペプチド抗生物質を高収率で精製する迅速かつ安価な抽出的方法を提供する。全く驚くべきことに、酸性リポペプチド抗生物質(例えば、ラスパートマイシン、アンホマイシン、およびアスパートシン、これらは環状ペプチド核を有する)および抗生物質A−21978C(これは、環状デプシペプチド核を有する))は、リポペプチド抗生物質の等電点を上回るpHの条件下で、かつ二価金属カチオン(例えば、Ca+2)の存在下で、水不混合性有機溶媒(例えば、1−ブタノール)中に直接抽出され得ることが発見された。
ここで、本発明の好ましい実施形態に対して、詳細に言及する。本発明を好ましい実施形態と共に記載するが、本発明をこれらの好ましい実施形態に制限することを意図しない。逆に、添付の特許請求の範囲により定義されるように本発明の精神および範囲内に含まれ得るものとして代替、改変、および等価物を包含することを意図する。
記載された本発明、以下の実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、例示するために示される。これらの実施例は、本発明の種々の実施形態および特徴を例示する。
ラスパートマイシンの生化学的合成に使用される親培養物は、Streptomyces viridochromogenes ssp.komabensis(ATCC−29814、BSP−M728)であり、これを以下の手順によって選択した。Streptomyces viridochromogenes ssp.komabensis(ATCC−29814)の細胞懸濁物を、栄養培地上でのプレーティングが、約28℃でのインキュベーションの後、十分に分離したシングルコロニーを得るように、希釈した。いくつかのコロニーを単離し、そして形態学的観察(コロニーサイズ、表面構造、縁のプロフィールなど)に基づいて、ラスパートマイシン収率の改善について、発酵によって試験した。これらは、十分に、当業者の能力の範囲内である。コロニーBSP−M728/1は、より高くより再現性のある収率を提供し、そして発酵マッシュにおける菌糸体密度との優れた相関を得た。従って、少なくともこれらの理由のために、Streptomyces viridochromogenes ssp.komabensis(ATCC−29814、BSP−M728/1)を、ラスパートマイシンの生化学的合成のために選択した。
理想的には、ラスパートマイシンの生化学的合成を、Streptomyces viridochromogenes ssp.komabensis(ATCC−29814、BSP−M728/1)の傾斜培地からかき取った胞子および菌糸体を用いて、水道水中約3.0%のトリプティカーゼソイブロス、約1.0%のトウモロコシデキストリンおよび0.1%のCaCO3から構成される培地を接種することによって、実行する。1分当たり約200回転(「RPM」)の回転シェーカーでの、28℃で約48時間の接種培地約50mLのインキュベーションは、実質的かつ均一な栄養増殖を提供する。次いで、この増殖物を使用して、種々の発酵培地を接種し得る(例えば、実施例3を参照のこと)。好ましくは、この増殖物は、発酵培地を接種するために使用される場合、発酵培地の約2.0%〜約3.0%の間の範囲の濃度を構成する。
実施例2で生成された接種材料を使用して、以下のような多くの発酵培地を播種し得る:(1)水中、約2.0%のデキストロース、約0.5%の牛肉抽出物、約0.5%のペプトン、約0.5%のNaClおよび約0.35%のCaCO3を含有する培地;(2)水中に溶解した約0.5%のデキストロース、約1.5%のデキストリン、約0.1%の糖蜜、約1.0%のペプトンおよび約0.1%のCaCO3を含有する培地;ならびに(3)水中、約0.5%のデキストロース、約1.5%のグリセロール、約0.75%のペプトン、約0.2%のNaClおよび約0.1%のCaCO3を含有する培地。代表的なシェーカーフラスコ発酵において、約50mLの上記培地を、実施例2の接種材料で播種し、そして約4日と約7日との間の期間にわたって、約160RPMと約180RPMとの間の回転シェーカーで、約28℃の温度でインキュベートする。
ラスパートマイシンの生化学的合成を、水中、約0.5%のデキストロース、約1.5%のトウモロコシデキストリン、約0.75%のSoytone、0.3%のNaCl、約0.1%のMgSO4・7H2Oおよび約0.1%のCaCO3を含有する培養培地において実行し得る。この培地の未調整のpHは、一般に、約7.2と約7.3との間である。接種された培地を、約24℃と約34℃の間(好ましくは約27℃と約29℃との間、最も好ましくは約28℃)の温度で、約140RPMと約200RPMとの間(好ましくは約160RPMと約180RPMとの間)の回転シェーカーで、約4日と約7日の間(好ましくは、約5日と約6日の間)の期間にわたって、有意な量のラスパートマイシンが合成されるまで、インキュベートする。収集時の培地のpH読み取りは、約8.0と約8.6との間である。ラスパートマイシン錯体の収率は、発酵培地1リットル当たり約600mgであるが、C−15ラスパートマイシン成分の収率は、発酵培地1リットル当たり約400mgである。培地処方およびそのメンバーの定量的割合は、ラスパートマイシンの個々のリポペプチド成分の割合に対する直接的な影響を有する。
アスパートシンの生化学的合成を、Streptomyces griseus ssp.spiralis(NRRL B−3290;BSP−M707)の傾斜培地からかき取った胞子および菌糸体を用いて、100mLの水道水中、約1.0%のデキストロース、0.5%の糖蜜、1.0%のBacto Peptonおよび0.1%のCaCO3から構成される培地を接種することによって実行する。接種した培地を、1分当たり約140回転(「RPM」)の回転シェーカーで、約48時間、約28℃の温度でインキュベートして、実質的かつ均一な栄養増殖を提供する。次いで、後者を使用して、以下に示す種々の発酵培地を接種し得る;発酵培地を接種するために使用される場合、栄養増殖物の濃度は、発酵培地の2.0%と3.0%との間の範囲である。以下のような多くの発酵培地が、首尾よく使用される:(1)100mLの水道水中、約2.0%のデキストロース、1.0%の糖蜜、1.0%のBacto−Peptoneおよび0.1%のCaCO3を含有する培地;ならびに(2)約2.0%のデキストロース、0.5%のBacto−Peptone、1.0%のマルトースおよび0.1%のCaCO3を含有する培地。代表的なシェーカーフラスコ発酵において、上記の培地を、約140RPMの回転シェーカーで、約4日と約7日の間の期間にわたって、約28℃の温度でインキュベートする。収集時のpH読み取りは、7.8と8.2との間である。
抗生物質錯体A−21978の生化学的合成を、100mLの水道水中、約3.0%のトリプティカーゼソイブロスおよび1.0%のジャガイモデキストリンからなる播種培地において、Streptomyces roseosporus(NRRL−11379;BSP−M731)の培養物を接種し、その後約200RPMの回転シェーカーで、約48時間にわたって、約28℃〜30℃でインキュベートすることによって実施する。次いで、上記手順によって提供される実質的な栄養増殖物を使用して、発酵培地の約2.0%〜約3.0%の範囲で、発酵培地に接種し得る。多くの発酵培地が、首尾よく使用され得るが、好ましくは、100mLの水道水中に約0.75%のデキストロース、3.0%のジャガイモデキストリン、1.0%のSoytone、0.2%のNaCl、0.1%のMgSO4・7H2Oおよび0.25%の糖蜜を含有する発酵培地が使用される。代表的なシェーカーフラスコ発酵において、上記の接種された培地を、約200RPMの回転シェーカーで、4〜7日の期間にわたって、約28℃〜約30℃の温度でインキュベートする。収集時のpH読み取りは、約6.0〜約6.5の範囲である。
pH約8.5の、実施例4で調製されるように生成された約1.85リットルの発酵ブロス(例えば、Umezawaら、米国特許第3,639,582号を参照のこと)を、等容量の1−ブタノールと混合し、そしてこれらの相を分離させた。暗褐色の水相を廃棄し、そして僅かに着色した、ラスパートマイシンを含有する1−ブタノール相を等量の蒸留水と合わせて、攪拌し、そしてこの混合物のpHを1N HClを用いて約2.0に調整した。この1−ブタノール相を、その1/4容量の水で洗浄し、等量の水と混合し、そしてこの混合物のpHを、約7.0に調整した。これらの相を分離し、そしてラスパートマイシンを含有する水相のpHを約2.0に調整し、そしてラスパートマイシンを1−ブタノール中に抽出し、次いで水相のpHを約7.0に戻した。この水相は、部分的ナトリウム塩として、ラスパートマイシンを含有した。この溶液を、減圧下でエバポレートして、残留1−ブタノールを除去し、次いで凍結乾燥して、白色粉末としてラスパートマイシンのナトリウム塩約561mgを提供した。
約1.8リットルの、実施例4で調製された発酵ブロス(例えば、Umezawaら、米国特許第3,639,582号を参照のこと)を、pH約2.0に調整し、そして約4℃で3時間静置して、ラスパートマイシンを沈殿させた。細胞および沈殿物を、遠心分離によって単離し、そして約500mLの水に懸濁した。懸濁物のpHを、1N NaOHを用いて約7.0に調整し、そして得られた混合物を、室温で1時間攪拌した。塩化カルシウム(約500mg)をこの懸濁物に添加し、そしてこの混合物のpHを、1.0N NaOHを用いて、約8.6と約9.0との間に調整した。ラスパートマイシンを、約500mL、続いて約100mLの1−ブタノールでの2回の連続洗浄によって、水溶液から抽出した。合わせたブタノール抽出物を、等容量の蒸留水と混合し、1N HClを用いてpH約2.0に調整し、そしてpHを約2.0に維持した約200mLの蒸留水で2回リンスした。抗体物質を含有する1−ブタノール相を分離し、等容量の蒸留水と混合し、そしてこの混合物を、1N NaOHを用いてpH約7.0に調整して、水相中にラスパートマイシンを提供した。この水相を分離し、次いでラスパートマイシンを、pH約3.0で1−ブタノール中に抽出し、次いでpH約7.0で水相中に抽出した。透明なほぼ無色の水相を、減圧下でエバポレートして、残留1−ブタノールを除去し、そして凍結乾燥して、白色粉末としてラスパートマイシンのナトリウム塩668mgを得た。高分解能FAB−MS:C57H90N12O19+Na(M+Na)+についての計算値:1269.6343;実測値:1269.6289。
塩化カルシウム(2.5g)を、実施例4で調製したような2.65リットルの発酵ブロス(例えば、Umezawaら、米国特許第3,639,582号を参照のこと)に、pH8.7で添加した。ラスパートマイシン錯体のキレートを、600mLの1−ブタノールで抽出した(この相を、遠心分離によって分離した)。界面層中の細胞および他の材料を、別の100mLの1−ブタノールで再抽出した。この1−ブタノール相を、500mLの水と合わせ、そしてpH2.1に調整してカルシウムを除去した。ラスパートマイシンを含有するブタノール相を、100mLの水(pH2.0)で洗浄し、水相から分離し、次いで400mLの水と混合してpH7.5に調整して、この水相中にラスパートマイシンを提供した。この水相を分離し、pH2.3に調整し、そして400mLの1−ブタノールと混合した。ラスパートマイシンを含む1−ブタノール相を、100mLの水(pH2.0)で洗浄し、次いで500mLの水と合わせて、pH7.2に調整した。部分的ナトリウム塩としてラスパートマイシンを含む水相をエバポレートして、残留ブタノールを除去し、そして凍結乾燥して1.018gの白色粉末を得た。この白色粉末は、215nmでのHPLC面積の%に基づいて、約92%の純度であるようであった。9.81分の保持時間で、この錯体の約79%が、主要な成分C57H90N12O19であった。この主要な成分は、9.21分と10.46分の保持時間を有した。このHPLCシステムは、0.05Mリン酸緩衝液を含む、pH7.2の10%〜75%のアセトニトリルの、8分の勾配を用いて溶出する、Prodigy(登録商標)5μODS(2)カラムを使用した。
約100mgのナトリウム塩を、実施例8に記載のように調製した。次いで、このナトリウム塩を、約10mLの水に溶解し、そしてこの溶液のpHを、0.1N HClを用いて約2.0に調整した。次いで、ラスパートマイシンを、約10mLの1−ブタノール中に抽出した。この1−ブタノール相を、約5mLの水で洗浄し、約20mLの水と混合し、そして減圧下でエバポレートして、酸形態のラスパートマイシンの水溶液を得た。この溶液を凍結乾燥して、77mgの白色粉末を得た。FAB−MS m/z:1248(M+H)+、1270(M+Na)+および1286(M+K)+は、ラスパートマイシンのC−15成分についてのC57H90N12O19の分子式を示す。
アスパートシン66mg(約0.05mM)の部分的ナトリウム塩を、10mLの水に溶解させて、pH7.9を有する溶液を得た。0.11mLの水に溶解した塩化カルシウム5.5mg(0.05mM)を、10mLの1−ブタノールと共に添加した。2相系を、攪拌して平衡化した。1アリコートの1−ブタノール相(0.25mL)を、HPLC分析のために取り出した。0.11mLの水中のさらなる塩化カルシウム5.5mgを、2相系に添加し、これらの相系を、各添加後に平衡化し、そしてHPLCによって分析した。このHPLCシステムは、0.05リン酸緩衝液を含む、pH7.2の10%〜75%のアセトニトリルの、8分の勾配を用いて溶出する、Prodigy 5μ ODS(2)カラムを使用した。アスパートシン錯体の最大の抽出は、塩化カルシウム−/−錯体のおおよそのモル比が6に達した場合に生じた。
発酵ブロス(実施例5および8を参照のこと)の酸沈殿によって得られた約20gのアスパートシン粗製調製物(例えば、Shayら、1960、Antibiotics Annual、194を参照のこと)を、約125mLの水と混合し、そして不溶性の不純物を遠心分離によって分離した。約300mgのCaCl2を、褐色の液体に添加し、得られた溶液を約8.6と約9.0との間のpHに調整した。次いで、アスパートシンを、約100mLの1−ブタノール中に抽出した。約600mgのCaCl2を、この水相に添加し、次いで別部分の1−ブタノールを用いて抽出した。あわせたブタノール抽出物を、等量の水と混合し、そしてこの混合物のpHを約2.0に調整し、ブタノール相を、pH約2.0に調整した約160mLの水で洗浄した。次いで、アスパートシンを、pH約7.0で水中に抽出し、次いで約2.0と約3.0との間のpHでブタノール中に戻した。このブタノール相を、pH約2.0の水約100mLで洗浄し、等量の水と合わせて、pH約7.0に調整した。この水相を、減圧下でエバポレートして、残留ブタノールを除去する。非常に僅かに着色した透明な液体を凍結乾燥して、黄褐色〜白色の粉末として、アスパートシンのナトリウム塩803mgを得た。FAB−MS m/zによる主要成分のイオン:1340(M+Na)+、1384(M+2Na−H)+、1406(M+3Na−2H)+、1428(M+4Na−3H)+。
酸形態のアスパートシン錯体5〜7%を含有する暗色の粗製調製物68.3gを、500mLの蒸留水中に溶解させ、そしてpHをpH7.0に調整して攪拌した。いくらかの不溶性物質を遠心分離によって分離し、そしてデキャントした液体を、pH3.5に調整した。アスパートシンを、2回の連続1−ブタノール抽出(500mL、300mL)で抽出し、そして600mLの水を、合わせたブタノール抽出物に添加した。得られた2相系を攪拌し、そして1N NaOHを用いてpH8.0に調整して、水相中のナトリウム塩として、アスパートシン錯体を提供した。塩化カルシウム(2.642g)を、分離した水相に添加し、そしてアスパートシンを、1−ブタノールの2回の連続抽出(500mL、250mL)によって、キレートとして1−ブタノール中に抽出した。この1−ブタノール相を合わせて、900mLの水と混合し、pH3.0に調整し、水相から分離し、そして150mLの水で洗浄して、カルシウムを除去した。アスパートシンを含有する1−ブタノール相を、500mLの水と合わせ、そしてpH7.0に調整した。残留色素を除去するために、この抗生物質を含有する水相を、pH3.0に調整し、そして500mLの1−ブタノールと混合した。この1−ブタノール相を分離し、150mLの水(pH2〜3)で洗浄し、そして500mLの水と合わせて、この混合物をpH7.0に調整した。部分的ナトリウム塩としてアスパートシンを含有する水相を、減圧下でエバポレートして、残留1−ブタノールを除去し、そして凍結乾燥して3.6gの白色粉末を得た。精製した錯体ののHPLC分析は、このアスパートシン錯体が、9.4分〜10.6分の間の保持時間範囲の錯体ピークを有する、215nmでの面積%によって、約90%の純度であったことを示した。このHPLCシステムは、0.05Mリン酸緩衝液を含む、pH7.2の10%〜75%のアセトニトリルの、8分の勾配を用いて溶出する、Prodigy(登録商標)5μODS(2)カラムを使用した。精製したサンプルは、アスパートシン錯体の参照サンプルとのHPLC比較により、約98%の純度であるようであった。
1.9Lの発酵ブロス由来の細胞を、遠心分離によって除去した。HPLC分析によって決定されるように、約204mgのA21978Cを含有するデキャントした液体(1600mL)を、1N HClを用いてpH3.5に調整し、そして抗生物質を600mLのブタノール中に抽出した。このブタノールを、pH3.5に維持した100mLの蒸留水でリンスした。抗生物質を含有する1−ブタノール相を、300mLの蒸留水と合わせ、そしてpH7.3に調整して、水相中に抗生物質A−21978Cを提供した。塩化カルシウム(5g)をこの水相に添加し、そして抗生物質A−21978Cのキレートを、各々約250mLの1−ブタノールの2回の連続抽出によって、溶液から抽出した。合わせた1−ブタノール抽出物を、等容量の蒸留水と混合し、1N HClを用いてpH3.5に調整し、100mLの水(pH3.5)でリンスし、カルシウムを除去した。抗生物質を含有する1−ブタノール相を、水相から分離し、そして約300mLの蒸留水と混合した。このpHを、1N NaOHを用いて7.0に調整して、水相中の抗生物質A−21978Cの部分的ナトリウム塩を提供した。この水相を減圧下でエバポレートして、残留1−ブタノールを除去し、凍結乾燥して淡黄褐色の粉末176mgを得た。精製した錯体のHPLC分析は、A21978Cが、このアスパートシン錯体が、7.9分〜9.9分の間の保持時間範囲の錯体ピークを有する、215nmでの面積%によって、約83%の純度であったことを示した。このHPLCシステムは、0.05Mリン酸緩衝液を含む、pH7.2の10%〜75%のアセトニトリルの、8分の勾配を用いて溶出する、Prodigy(登録商標)5μODS(2)カラムを使用した。精製したサンプルは、A21978成分の報告されたE1% 1cm値とのUV比較により、約90%の純度であるようであった。実測E1% 1cm値=EtOH中262nmで57、280nmで41、290nmで36および364nmで26。
発酵ブロス(実施例6を参照のこと)の1−ブタノール抽出により得られた、約2.0gの、抗生物質A−21978Cの粗製褐色調製物(例えば、Debonoら、1988、J.Antibiotics、41、1093を参照のこと)を、約150mLの水に溶解させた。約1.0gの塩化カルシウムを添加し、そしてこの溶液をpH約8.7に調整した。次いで、このリポペプチド抗生物質を等容量の1−ブタノール中に抽出し、得られた水相を、約50mLのブタノールを用いて再抽出した。2つのブタノール抽出物を合わせて、等容量の水と混合し、酸を用いてpH約2.0に調整した。このブタノール相を、pH約2.0の約150mLの水で洗浄した。次いで、このリポペプチド抗生物質を、pH約7.0で水中に抽出し、次いで約2.0〜約3.0のpHで、ブタノール中に戻した。次いで、抗生物質A−21978Cを、pH約7.0で最後に1回水中に抽出し、そして減圧下でエバポレートして、残留ブタノールを除去した。透明な黄色溶液を凍結乾燥して、淡黄色/黄褐色の粉末として、160mgの抗生物質AA−21978Cの遊離酸を得た。元の水相を、上記の手順の後、さらに2回抽出して、類似の品質の淡黄褐色の粉末として、抗生物質A−21978Cをさらに260mg提供した。
Claims (26)
- カルボキシル基を含むリポペプチド抗生物質を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程を包含する、方法:
該リポペプチド抗生物質および二価カチオンの水溶液を有機溶媒と接触させ、それにより該リポペプチド抗生物質を該有機溶媒中に抽出する工程;および
該リポペプチド抗生物質の有機溶媒抽出物を酸と接触させる工程。 - 前記水溶液が発酵ブロスまたは培養物である、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質が環状デプシペプチドまたは環状ペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質が、ザオマイシン、クリスタロマイシン、グルママイシン、抗生物質A−1437、抗生物質A−54145、およびツシマイシンから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質がアンホマイシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質がアスパートシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質が、抗生物質A−21978Cまたはダプトマイシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質の水溶液のpHが塩基性pHに調整される、請求項1に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質中のカルボン酸基に対する二価カチオンのモル濃度が4:1と10:1との間である、請求項8に記載の方法。
- 初期酸沈殿工程をさらに包含し、ここで、前記pHが酸性pHに調整され、そして4℃に冷却される、請求項1に記載の方法。
- 前記水溶液が遠心分離され、そして該遠心分離物が第二の水溶液中に懸濁され、ここで、該第二の水溶液が、二価カチオンおよび前記リポペプチド抗生物質の等電点より上のpHを有する、請求項10に記載の方法。
- 前記pHが2.0に調整される、請求項10に記載の方法。
- 前記第二の水溶液中の前記リポペプチド抗生物質中のカルボン酸基に対する二価カチオンのモル濃度が4:1と10:1との間である、請求項11に記載の方法。
- 前記第二の水溶液のpHが塩基性pHに調整される、請求項13に記載の方法。
- 前記調整されたpHが、pH8.0〜pH9.0の範囲である、請求項8または14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二価カチオンが、Ca2+、Mg2+、およびZn2+からなる群から選択される、請求項9または14のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法:
前記リポペプチド抗生物質を第三の水溶液中に抽出する工程;
該リポペプチド抗生物質を第二の有機溶媒中に抽出する工程;
該リポペプチド抗生物質を第四の水溶液中に抽出する工程;および
該第四の水溶液を濃縮し、該リポペプチド抗生物質の塩を提供する工程。 - 前記リポペプチド抗生物質の有機抽出物が、水性塩基溶液で洗浄することにより、前記第三の水溶液中に抽出される、請求項17に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質の前記第三の水溶液が、前記第二の有機溶媒中に、該リポペプチド抗生物質の該第三の水溶液を酸性化し、そして該第二の有機溶媒と接触させることにより、抽出される、請求項17に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質の塩が、酸性化されて、該リポペプチド抗生物質の遊離酸を提供する、請求項17に記載の方法。
- 前記有機溶媒および前記第二の有機溶媒が、1−ブタノールである、請求項20に記載の方法。
- カルボキシル基を含む酸性リポペプチド抗生物質を単離する方法であって、以下の工程を包含する、方法:
(a)該リポペプチド抗生物質および二価金属カチオンを含む水性組成物を有機溶媒と接触させる工程であって、ここで該水性組成物が該リポペプチド抗生物質の等電点を上回るpHを有する、工程;
(b)工程(a)から得られる有機相を酸性化する工程;および
(c)工程(b)の該酸性化有機相を水性溶媒と接触させる工程。 - 前記工程(a)〜(c)が繰り返される、請求項22に記載の方法。
- 前記リポペプチド抗生物質の有機溶媒抽出物が、水性塩基溶液で抽出される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 前記水溶液が発酵ブロスであり、前記リポペプチド抗生物質がアンホマイシンである、請求項24に記載の方法。
- 前記水溶液が発酵ブロスである、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
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