JP4200537B2 - 高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉とそのオリゴ糖組成物及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリン酸カルシウムの沈澱形成を阻害する作用、すなわちＣａ可溶化作用に優れたリン酸結合糖質、特にリン酸結合オリゴ糖を含みＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるオリゴ糖組成物及びそれらの製造方法、並びに前記リン酸結合オリゴ糖を生成するリン酸結合澱粉及びそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、カルシウムの摂取不足による国民の健康問題がクローズアップされており、高齢化社会の出現に伴う骨粗鬆症などの罹患者が急増している。しかし、食品に含まれるカルシウムの腸内における吸収が低いこともよく知られている事実である。成人男子では牛乳、炭酸カルシウム、小魚、野菜のカルシウム吸収率は５３％，４２％，３４％，１８％と言われている。
カルシウムの吸収を高める物質としてカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が知られている。ＣＰＰはペプチドに結合したリン酸基がカルシウムと結合することにより、カルシウムを不溶性の塩に変えないで、腸内でのカルシウムの吸収を促進するとされている（特公平3-58718号公報，内藤博，化学と生物，18, 551-558, 1980）。
【０００３】
釜阪らは結合リンを含む馬鈴薯澱粉に注目し、酵素分解によってリン酸の結合したオリゴ糖を分取し、得られたリン酸結合オリゴ糖 (Phosphorylated Oligosaccharides，以下「ＰＯＳ」ともいう) がリン酸カルシウムの沈澱形成を阻害する作用のあることを見出した（Biosci. Biotech. Biochem., 59(8), 1412-1416, 1995；特開平8-104696号公報）。
【０００４】
馬鈴薯澱粉に結合リンが含まれていることは古くから知られており、檜作らは馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで分解して得たリミットデキストリンをＯＨ型アニオン交換樹脂に吸着させてから溶出し、ホスホデキストリン（Phosphodextrin）を調製している。得られたホスホデキストリンはさらにグルコアミラーゼで分解してからDEAE- Sephadex A-25 のカラムに吸着させ、洗浄によってブドウ糖を除去した後、リン酸オリゴ糖（Phosphooligosaccharide，Die Starke, 22, 338-343, 1970）を溶出して単離している。
【０００５】
ＰＯＳは馬鈴薯澱粉のα−アミラーゼなどによる酵素分解物から得られることは公知の事実である。しかし、従来のＰＯＳの生産法は実験室レベルの調製法であり、工業的な製造方法は全く確立されていなかった。本発明者らは安価で大量生産が可能なＰＯＳの製造方法について鋭意研究し、先にＰＯＳの工業的な製造方法を発明して特許出願を行なっている（特願平8-240827）。
【０００６】
本発明者らによる先願発明の製造法は、純度の極めて高いＰＯＳが工業的に安価で大量生産される利点を有している。しかしながら、植物原料から得られる天然の澱粉に含まれる結合リンは０．１％未満と少ないため、たとえば馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度である。従って、大量のＰＯＳを製造するには化学的に合成したリン含量の多いリン酸結合澱粉の方が収率を高くすることができる点で有利である。
本発明者らは各種ＰＯＳのＣａ可溶化作用について詳細に調べる中で、リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで分解処理して得られるオリゴ糖組成物が、先願発明の方法で得たＰＯＳに比べて極めて強いカルシウム可溶化活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが開発した先願発明の製造方法では、馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで分解処理して得られるオリゴ糖組成物を脱色処理、脱塩分離、膜処理、脱色処理して純度の高いＰＯＳの得られることが特徴である。
しかしながら、本発明者らによる先願発明の方法では馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％未満である。しかも、得られる純度の高いＰＯＳのＣａ可溶化活性を後に詳述する方法で測定すると、Ｃａ可溶化係数として１〜２であった。
【０００８】
一方、Ｃａ吸収促進剤として市販されているＣＰＰ II及びIII（明治製菓製）のＣａ可溶化活性は、Ｃａ可溶化係数としてそれぞれ１９及び７９である。
また、従来技術では、純度が高く、Ｃａ可溶化活性の高いＰＯＳを得るにはリン酸結合澱粉をα−アミラーゼで加水分解した後、さらにグルコアミラーゼやその他の澱粉分解酵素を加えて加水分解し、結合リンを含まないブドウ糖やオリゴ糖をイオン交換樹脂などで分離してＰＯＳの純度を高めることが必要であった。
【０００９】
本発明者らは、高いＣａ可溶化活性を持つＰＯＳのより簡便な製造方法を得るべく検討を進めた結果、リン酸結合澱粉を原料として、一つの酵素、即ちα−アミラーゼのみで分解処理するだけで、本発明者らによる先願発明の方法で得た純度の高いＰＯＳに比べて１０倍以上もＣａ可溶化活性の高いＰＯＳを含むオリゴ糖組成物が容易に得られることを見出した。
本発明は、リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで処理して得られ、かつＣＰＰ IIと同等以上のＣａ可溶化活性を示すＰＯＳを含むオリゴ糖組成物及びそれらの製造方法、並びに前記オリゴ糖組成物を生成するリン酸結合澱粉及びそれらの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) リン酸結合澱粉であって、該澱粉にα−アミラーゼのみを作用させて得られるオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるリン酸結合澱粉。
(2) 全固形分重量に対して結合リンを１重量％以上含むリン酸結合澱粉であって、該澱粉にα−アミラーゼのみを作用させて得られるオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるリン酸結合澱粉。
【００１１】
(3) リン酸結合澱粉がリン酸エステル澱粉または尿素リン酸エステル澱粉である(1)または(2)のリン酸結合澱粉。
(4) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してから乾燥し、焙焼して得られる(1)または(2)のリン酸結合澱粉。
(5) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し、その水分を１０重量％未満となるまで乾燥してから焙焼して得られる(1)〜(4)のリン酸結合澱粉。
【００１２】
(6) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してから乾燥し、焙焼する(4)のリン酸結合澱粉の製造方法。
(7) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し、その水分を１０重量％未満となるまで乾燥してから焙焼することを含む(5)のリン酸結合澱粉の製造方法。
(8) リン酸結合オリゴ糖を含み、Ｃａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるオリゴ糖組成物。
(9) 平均重合度が８〜５０である(8)のオリゴ糖組成物。
【００１３】
(10) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させて得られる(8)または(9)のオリゴ糖組成物。
(11) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させ、次いで澱粉分解酵素を少なくとも１種作用させて得られるリン酸結合オリゴ糖を含むオリゴ糖組成物。
(12) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させることを含む(8)
〜(10)のオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１４】
(13) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させ、次いで澱粉分解酵素を少なくとも１種作用させることを含む(11)のオリゴ糖組成物の製造方法。
(14)得られたオリゴ糖組成物を脱塩して全リンに対する結合リンの割合を８０％以上とすることをさらに含む(12)または(13)の方法。
(15) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉、及び／または(8)〜(11)のオリゴ糖組成物を含む食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料またはそれらの添加用組成物。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明者らはすでに、馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで１００℃以上の温度で分解した後、糖化酵素でリン酸が結合していないオリゴ糖を分解してＰＯＳを生成させてから、塩基性アニオン交換樹脂やルーズＲＯ膜、活性炭などの精製処理によって純度の高いＰＯＳ製品を製造する方法を開発し、特許出願している。
しかし、馬鈴薯澱粉に含まれる結合リンは０．０５〜０．１％（全固形分重量に対するリン重量Ｗ／Ｗ％，以下同じ）でしかなく、馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度である。従って、大量のＰＯＳを製造するには化学的にリン酸基を結合したリン含量の多いリン酸結合澱粉が有利である。
【００１６】
食品添加物として認可されているリン酸結合澱粉は、澱粉リン酸エステルナトリウムであり、結合リンとして０.２〜３重量％のリンを含み、遊離のリン、すなわち無機リンの含量は全体のリン（全リン）の２０％以下と規定されている。本発明では、原料及びその製造方法の如何を問わず、α−アミラーゼのみで分解処理するだけでＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物及び前記オリゴ糖組成物を生成させるリン酸結合澱粉が全て対象となる。本発明で対象となるリン酸結合澱粉はリン酸エステル澱粉及び尿素リン酸エステル澱粉である。
【００１７】
リン酸結合澱粉の原料となる澱粉はコーンスターチ、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉など広く一般に利用されている植物起源の澱粉だけでなく、いずれの起源の澱粉でも使用することができる。
リン酸結合澱粉の合成方法は特に限定されないが、リン酸結合澱粉の合成には通常、澱粉スラリーにリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）を混合してから脱水し、乾燥・焙焼する方法、澱粉の脱水ケーキにリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）溶液を噴霧して乾燥・焙焼する方法や澱粉乾粉にリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）溶液を混合して乾燥・焙焼する方法が用いられる。
【００１８】
澱粉のスラリー濃度は均一な流動性を維持する観点から、通常３０〜５０重量％、好ましくは３５〜４５重量％である。
リン酸及び／またはその塩としては、リン酸、及びリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、酸性ヘキサメタリン酸ナトリウムなどのリン酸ナトリウム塩やリン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸カリウム塩やリン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウムなどのリン酸アンモニウム塩など広くリン酸塩が使用できる。
【００１９】
リン酸及び／またはその塩の添加量はその種類によって異なるが、澱粉の重量に対して通常０.５〜２４０重量％であり、好ましくは５〜４０重量％である。なお、尿素リン酸エステル澱粉の合成にはリン酸塩の他に尿素の添加が必要である。尿素の添加量は澱粉の重量に対して通常０.５〜２４０重量％であり、好ましくは５〜６０重量％である。
ｐＨを調整するために、酸、アルカリを使用することができる。酸としては塩酸、硫酸、亜硫酸などの酸を、アルカリとしてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ(ＯＨ)2などを用いることができる。
【００２０】
澱粉とリン酸及び／またはその塩との混合物（尿素リン酸エステル澱粉の合成の場合には尿素も含む）は水分を除くため乾燥するのが望ましい。本発明者らは乾燥後の水分が重要であることを見出した。すなわち、乾燥後の水分が低い程、Ｃａ可溶化活性の高いリン酸結合澱粉が得られる。実際的には、乾燥後の水分は１０重量％未満であることが好ましい。
焙焼の条件としては、焙焼温度が高くなるほど、焙焼時間が長くなるほど結合リンは増加するが、焙焼品の色が赤褐色となり、Ｃａ可溶化活性は結合リンの増加に比例するとは限らない。従って、焙焼の条件は温度としては、通常１００〜２５０℃、好ましくは１３０〜２００℃の温度で、焙焼時間としては、通常５分〜４時間、好ましくは１０〜１２０分の範囲で加熱するのが好ましい。
【００２１】
上述の合成法以外にも、本発明者らはリン酸エステル澱粉の合成法を種々検討し、澱粉とリン酸及び／またはその塩とを混合した後、糊化・乾燥してから焙焼する方法を開発した。糊化・乾燥法としては、たとえば、澱粉スラリーにリン酸及び／またはその塩を加えて溶解した後、ドラムドライヤーで糊化・乾燥する方法や、澱粉乾粉にリン酸及び／またはその塩を加えて必要に応じて水を加えながらエクストルーダー処理して糊化・乾燥する方法などがある。
【００２２】
糊化・乾燥した澱粉のリン酸及び／またはその塩との混合物を焙焼したものと、糊化しない澱粉にリン酸及び／またはその塩を加えて乾燥し、同じ条件で焙焼したものを比較すると、糊化・乾燥後焙焼して得られるリン酸結合澱粉の方がα−アミラーゼ処理でより高いＣａ可溶化活性を示すことが認められた。
本発明のＣａ可溶化活性を示すＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は、上述のリン酸結合澱粉をα−アミラーゼで分解して低分子化することにより得られる。低分子化により粘度が低下するため、食品などへの利用用途が大きく拡大される。本来、分解に用いる酵素は澱粉をランダムに切断するα−アミラーゼであれば全て用いることができ、当然２種以上の酵素を混合して用いることもできる。
【００２３】
α−アミラーゼとしては、工業的な澱粉の分解（以下、「液化」ともいう）に多用されている耐熱性液化型α−アミラーゼ、中温性液化型α−アミラーゼ、糖化型α−アミラーゼ、糖転移酵素のＣＧＴａｓｅ（Cyclomaltodextrin glucanotransferase）やＴＶＡ（Thermoactinomyces vulgarisのα−アミラーゼ）などが使用できる。しかし、工業生産に適応した酵素としては、耐熱性の液化型α−アミラーゼが分解能力及び澱粉の溶解力において優れている。
リン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させる条件は、酵素の種類により大きく異なるが、通常用いられている条件で行うことができる。用いる酵素は８０〜１１０℃で有効に作用する耐熱性液化型α−アミラーゼが好ましく、いずれの起源のものでも使用できる。
【００２４】
具体的には、細菌起源の高耐熱性α−アミラーゼであるターマミル１２０Ｌ（ノボノルディスク バイオインダストリー製、Bacillus licheniformis由来）、ネオスピターゼＰＧ２（ナガセ生化学工業製、Bacillus subtilis 由来）、クライスターゼＴ（大和化成製、Bacillus subtilis 由来）などの市販酵素を用いることができる。
基質となるリン酸結合澱粉は１０〜４０重量％濃度のスラリーとし、水酸化カルシウム及び／または水酸化ナトリウムを加えて、通常ｐＨ６．０〜６．３に調整する。耐熱性α−アミラーゼは安定剤として５０ppm以上のカルシウムイオンを必要とするので、ｐＨ調整用アルカリとしては水酸化カルシウムが主に使用される。
【００２５】
酵素添加量は使用する酵素によって大きく異なるが、通常０.００１〜０.５重量％、好ましくは０.０１〜０.２重量％（対澱粉）である。反応のｐＨも使用する酵素によって異なるが、通常ｐＨ４〜７である。
工業生産における澱粉分解反応（液化反応）では、通常、澱粉の再結晶化を防ぐため、α−アミラーゼ添加後の反応開始温度を１００〜１１０℃に高めて２〜１５分、加圧条件で処理した後、９０〜１００℃の高温で３０分〜５時間程度酵素分解を進めて行なっている。
【００２６】
α−アミラーゼによるリン酸結合澱粉の分解は工業生産における分解反応と異なり、必ずしも１００〜１１０℃、加圧というような厳しい分解条件を必要とはしない。結合リンの多寡によって異なるものの、結合リンが澱粉の再結晶化を防ぐ役割を果たすことから、１００℃以上の厳しい反応条件は必ずしも必要ではない。しかしながら、分解反応の高温処理は分解液の濾過性を良くして操業を容易にするなどの面から好ましい。
具体的には、最終濃度として１０〜４０重量％となるようにリン酸結合澱粉を採取し、２.８重量％の塩化カルシウムを全量の１／１００量加え、１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨを６.３に調節する。これに、ターマミル１２０Ｌを０.１重量％（対リン酸結合澱粉）加えて耐圧容器に移す。１０５℃で５分間加熱後、９５℃で１時間液化反応を継続する。
【００２７】
なお、ターマミル１２０Ｌによる反応では酵素添加量０.１重量％で反応温度は９０〜１００℃、反応時間１０〜７０分の範囲ではＣａ可溶化活性値はほとんど同じ値を示すことが明らかとなった。さらに、この反応液の反応温度を６０℃に下げて、２４時間反応を継続しても、Ｃａ可溶化活性は元の活性の８０〜９０％を維持しており、ターマミル１２０Ｌを０.０５重量％追加添加して６０℃で２４時間追加反応すると７０％前後まで低下することが明らかとなった。
【００２８】
リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は極めて高いＣａ可溶化活性を有する混合液であり、そのまま濃縮して製品となる。しかし、リン酸結合澱粉のα−アミラーゼ処理のみで得られるオリゴ糖組成物の平均重合度は８〜５０であり、オリゴ糖よりもデキストリンの範疇に入る重合度を有している。通常のオリゴ糖より分子量がかなり大きいため、そのまま製品として濃縮すれば、製品の粘度が高くなって食品としての使用に制限が起こる場合もある。
【００２９】
製品の粘度をさらに下げるには、α−アミラーゼも含む各種澱粉分解酵素や糖転移酵素の１種または２種以上の酵素、さらにこれら各種酵素の１種以上の酵素にα−グルコシダーゼを加えた酵素群による追加分解反応（以下、「糖化反応」ともいう）を行うことができる。なかでも、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、糖化型α−アミラーゼなどの澱粉分解酵素がオリゴ糖組成物の重合度の低下に有効性の高い酵素として推奨される。
他に、単独では重合度低下作用が少ないものの、グルコアミラーゼなどとの組み合わせにより効果を示す酵素として、液化型α−アミラーゼ、ＣＧＴａｓｅ（Cyclomaltodextrin glucanotransferase）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ＴＶＡなどが挙げられる。
【００３０】
従来技術ではＰＯＳの低分子化を優先するため、追加分解にはグルコアミラーゼが主として使用され、さらに、枝切り酵素であるプルラナーゼやα−アミラーゼを同時に作用させている。本発明者らによる先願発明においても、耐熱性液化型α−アミラーゼで処理した後、グルコアミラーゼとプルラナーゼの混合酵素剤であるデキストロザイムを使用して低分子化を進めている。
合成したリン酸結合澱粉を液化型α−アミラーゼで分解処理して得られたオリゴ糖組成物をさらに各種澱粉分解酵素で追加分解する場合、グルコアミラーゼの市販酵素剤ＡＭＧ（ノボノルディスク バイオインダストリー社製、Aspergillus niger 由来）で処理すると、オリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は追加分解前の半分程度に減少した。
【００３１】
なお、試薬製剤のグルコアミラーゼ（Aspergillus niger 由来及びRhizopus niveus 由来）で処理したオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は液化型α−アミラーゼ処理のみで得られるオリゴ糖組成物の活性の８０％前後の値であった。
また、β−アミラーゼの市販酵素剤であるＢＢＡ（ジェネンコァ社製、大麦由来）や甘藷由来の試薬β−アミラーゼで処理したオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は元の８０％前後の活性が維持されていた。さらに、β−アミラーゼにα−アミラーゼを同時に作用させて低分子化反応を進めると、Ｃａ可溶化活性は元の５０％前後の活性に減少した。
【００３２】
なお、β−アミラーゼで追加分解して得たオリゴ糖組成物の平均重合度は４〜８であり、グルコアミラーゼ処理で得られるものの平均重合度１〜４より大きい傾向が認められた。
澱粉分解酵素による追加分解反応は液化型α−アミラーゼ処理で得られたオリゴ糖組成物に各種酵素を１種または２種以上加えて、各酵素の最適反応条件で行われる。反応条件は酵素の種類によって大きく異なるが、通常、反応温度は４０〜７０℃、ｐＨは４〜７、分解（糖化）時間は０.５〜９６時間、酵素添加量はオリゴ糖組成物の固形分に対して０.０００１〜1重量％である。なお、追加分解反応に用いる酵素は最初の分解で使用する液化型α−アミラーゼ処理と同時に用いることもできる。
【００３３】
リン酸結合澱粉の酵素分解物には、添加酵素や分解反応で生成する凝集タンパク質や未分解澱粉など不溶性物質が含まれ、さらに中和に用いた塩類や無機リンなども不純物として含まれている。不溶性物質は濾過や膜処理で除去されるが、塩類や無機リンを除くにはイオン交換樹脂処理、ナノフィルトレーション（ＮＦ）膜処理、イオン交換膜処理などによる脱塩処理が必要である。
リン酸結合澱粉を酵素分解して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物を脱塩処理することにより、全リンに対する無機リン比率を２０％以下に減少させることができる。これにより、食品添加物として規定されているリン酸結合澱粉と同等の結合リン、無機リン含量のＰＯＳを含むオリゴ糖組成物を得ることができる。
【００３４】
以下、本発明におけるＣａ可溶化係数の定義と測定方法を示す。
（１）Ｃａ可溶化活性測定試料液の調製
リン酸結合澱粉をα−アミラーゼなどの酵素で処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物溶液（ＰＯＳ溶液、未精製）（２重量％、ｐＨ２に調整したもの）１７．５ｇを試験管に採取し、水を加えて３０ｇとする。５重量％のＮａＯＨ溶液でｐＨ７．２〜７．３に合わせる。さらに、１重量％のＮａＯＨ溶液でｐＨ７．３６〜７．３７に微調節してから水を加えて全量を３５．０ｇとする。この時、ｐＨが７．４０±０．０２であることを確認し、ｐＨが外れている場合には再度、ｐＨ調整をやり直す。
【００３５】
得られた１重量％のＰＯＳ溶液をＣａ可溶化活性測定試料液とする。
（２）リン酸カルシウム沈澱形成阻害反応
（１）で得た測定試料液を必要に応じて水で希釈してリン酸カルシウム沈澱形成阻害反応を行う。３０℃の恒温槽で恒温にした１５mM−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１．５mlを試験管に採取し、適宜希釈した測定試料液０．３mlを加えて混合する。次いで、３０℃の恒温槽で恒温にした１２．５mM−ＣａＣｌ2を１．２ml加えて混合し、３０℃の恒温槽に入れて１時間保持する。１時間後、測定試料を１５０００rpmで１分間遠心分離して、上清のＣａ濃度を測定する。
Ｃａ濃度はＣａ測定キット（和光純薬製）で測定した。対照として、希釈測定試料液の代わりに水を加えたもののＣａ濃度を測定し、リン酸カルシウムのみの上清Ｃａ濃度を算出して対照１液とする。希釈測定試料液及びリン酸緩衝液の代わりに水を加えたもののＣａ濃度を測定して、全Ｃａ濃度を算出して対照２液とする。
【００３６】
（３）Ｃａ可溶化係数の算出
まず、各希釈試料液のＣａ可溶化率を次式によって求める。
【００３７】
【数１】
【００３８】
測定液中の試料濃度を横軸に取り、Ｃａ可溶化率を縦軸に取ってグラフを作成し、Ｃａ可溶化率が５０％となる試料濃度を求める。この試料濃度（％）値の逆数をＣａ可溶化係数とする。
例えば、Ｃａ可溶化活性測定時の試料の濃度が０．１％でＣａ可溶化率５０％になった場合、Ｃａ可溶化係数は１０である。なお、Ｃａ可溶化率は５０％を挟んで５０±３０％の範囲で測定した試料濃度２点の直線とＣａ可溶化率５０％の交点をＣａ可溶化係数算出の試料濃度とし、係数値は少数点１位以下を四捨五入して整数とする。
【００３９】
表１に、各種リン酸結合澱粉の結合リン含量とＣａ可溶化係数を示す。
α−アミラーゼによる分解処理で高いＣａ可溶化活性を示すようなリン酸エステル澱粉を得るため、コーンスターチ及び馬鈴薯澱粉を原料として、反応条件を変えて結合リンが馬鈴薯澱粉の結合リン含量より多い０．５〜４重量％となるようにリン酸エステル澱粉を合成した。
表１から明らかなように、結合リン含量が１重量％以上のリン酸結合澱粉を酵素処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物のＣａ可溶化係数は１０以上である。
【００４０】
【表１】
【００４１】
原料の澱粉がコーンスターチであれ、馬鈴薯澱粉であれ、結合リンが１重量％未満のリン酸エステル澱粉をα−アミラーゼで分解して生成したＰＯＳを含む溶液のＣａ可溶化活性は、Ｃａ可溶化係数として１０未満であり、明治製菓製のＣＰＰ IIのＣａ可溶化係数１９より低いものである。
結合リンの少ないリン酸エステル澱粉を原料としてα−アミラーゼ処理して得られるＰＯＳ溶液からＰＯＳ製品を得るには、生成したＰＯＳ以外の結合リン酸を持たないブドウ糖やオリゴ糖などの中性糖を除く精製操作を行わなければ、明治製菓製のＣＰＰ IIのようなＣａ可溶化活性の高いＰＯＳ製品を得ることはできない。
【００４２】
これに対して、１重量％以上の結合リンを含むリン酸エステル澱粉のα−アミラーゼ処理により得られるオリゴ糖組成物はなんら精製純化操作をしなくとも、１０〜５０の高いＣａ可溶化係数の得られることが明らかである。
すなわち、α−アミラーゼによる酵素処理だけでＣＰＰ IIと同等以上の高いＣａ可溶化活性を持つオリゴ糖組成物が得られたこととなり、極めて簡便なＰＯＳの製造方法が開発されたこととなる。
本発明で設定したＣａ可溶化活性測定法を用いてＣａ可溶化作用を有するとされる各種物質のＣａ可溶化係数を求めると表２のように算出された。
【００４３】
【表２】
【００４４】
Ｃａ可溶化活性の高いアルギン酸ナトリウムやペクチンは多糖であり、粘性物質であって食品としての使用に制限がある。単糖や二糖の一リン酸や二リン酸はＣＰＰ IIと同程度のＣａ可溶化活性を有するものの高価である。
これらに対して、リン酸エステル澱粉は食品添加物として認められており、そのまま食品に添加することができる。しかも、α−アミラーゼによって容易に低分子化されてＰＯＳを含むオリゴ糖組成物に変換されるので、リン酸エステル澱粉をそのまま食品に加えて使用しても、加工工程中にα−アミラーゼが存在すれば高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳを生成する。
【００４５】
また、食品にα−アミラーゼが存在しなくとも、食品として咀嚼中に唾液のα−アミラーゼの作用によりリン酸エステル澱粉から高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳが生成可能である。次いで、咀嚼だけでリン酸エステル澱粉の低分子化が不十分な場合でも、小腸では膵液のα−アミラーゼの作用により高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳが生成する。すなわち、リン酸エステル澱粉を高分子のままで食品に添加しても、体内でＰＯＳが生成し、高いＣａ可溶化活性を示すことが予想される。
【００４６】
さらに、リン酸エステル澱粉を耐熱性液化型α−アミラーゼによって低分子化すれば、粘度が低く、Ｃａ可溶化活性の高いＰＯＳが安価に大量に生産され、食品への利用が大きく広げられることとなる。 本発明の高い活性を有するリン酸結合澱粉は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料などの成分として混合することができる。また、同じくリン酸結合澱粉は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料への添加用組成物として利用することができる。
さらに、本発明の高い活性を有するリン酸結合澱粉から得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料などの成分として混合することができる。また、同じくＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料への添加用組成物として利用することができる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例により、その技術的範囲が限定されるものではない。なお、実施例中、結合リン含量の測定、Ｃａ可溶化係数の測定、及びオリゴ糖組成物の平均重合度の測定は、各々以下の方法によって行った。
【００４８】
［結合リン含量の測定］
リン含量は澱粉・関連糖質実験法（学会出版センター、中村道徳ら）に記載の方法に準じて測定した。リン酸結合澱粉のリン含量を測定するため、試料にターマミル１２０Ｌ（耐熱性液化型α−アミラーゼ）０．１重量％を加えて９５℃，１５分間加熱分解して均一な溶液を調製し、無機リンを全てオルトリン酸とするため塩酸を添加してｐＨ２に調整してからFiske-Subbarow法で無機リンを測定した。なお、これら一連の酵素分解反応では結合リンが無機リンとして遊離しないことを確認しており、元のリン酸結合澱粉も分解生成したオリゴ糖組成物も結合リンの含量に変化はない。また、発色時に濁りが認められるものは遠心分離（３０００rpm，３分間）して上清の吸光度を測定した。
全リン含量は無機リン測定時にｐＨ２に調整した試料を湿式灰化処理し、同様に測定した。結合リン含量（重量％，対試料固形分）は（全リン含量−無機リン含量）で算出した。
【００４９】
［Ｃａ可溶化係数の測定］
上述したように、Ｃａ可溶化活性測定試料液を調製し、リン酸カルシウム沈殿形成阻害反応を行って式（Ｉ）よりＣａ可溶化率を求め、Ｃａ可溶化係数を算出した。
【００５０】
［オリゴ糖組成物の平均重合度の測定］
糖含量は澱粉・関連糖質実験法（学会出版センター、中村道徳ら）に記載の方法に準じて測定し、オリゴ糖組成物の平均重合度は全糖／還元糖から求めた。リン含量測定の場合と同様にｐＨ２に調整した試料液を適宜希釈して、全糖はフェノール−硫酸法(Dubois ら,1956)で、還元糖は Somogyi-Nelson 法(Nelson, 1944)で測定した。測定値はブドウ糖換算重量％（対試料固形分）で表示し、平均重合度は全糖／還元糖で算出した。
【００５１】
実施例１
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウム２．２kgと無水リン酸二ナトリウム２．０kgを加えて溶解し（ｐＨ６．０）、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。この澱粉ケーキの全リンは３．８重量％であった。これを棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１〜３時間焙焼した。
次いで、得られたリン酸エステル澱粉をα−アミラーゼで分解してオリゴ糖組成物とするため、合成したリン酸エステル澱粉を３〜４ｇ採取し、１０５℃で４時間乾燥した。放冷後、乾燥試料２ｇを精秤して１００mlの耐圧ガラス容器に入れ、水を７０ｇ加えて、均一になるまで攪拌した。これに２．８重量％の塩化カルシウム溶液を１ml加え、１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨを６．３に調節した。α−アミラーゼとして、ターマミル１２０Ｌを水で１０倍に希釈した液を２０mg加え、耐圧ガラス容器をガス加熱した沸騰水中に置いて、時々攪拌しながら１５分間加熱した。加熱終了後、放冷してから１Ｎ−塩酸溶液を加えてｐＨを２に調節してから水を加えて全量を１００ｇとした（濃度２重量％）。
得られたＰＯＳを含むオリゴ糖組成物の結合リン含量とＣａ可溶化係数を測定した。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】
Ｃａ可溶化係数１８以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００５４】
実施例２
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えてｐＨ４．０及び２．５となるように溶解し、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。これらの澱粉ケーキの全リンは３．８重量％であった。次いで棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００５５】
【表４】
【００５６】
Ｃａ可溶化係数２０以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００５７】
実施例３
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムの添加量を変えて溶解し（ｐＨ６．０）、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。これらの澱粉ケーキの全リンは３．８，５．９，６．３重量％であった。次いで棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００５８】
【表５】
【００５９】
Ｃａ可溶化係数２４以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６０】
実施例４
馬鈴薯澱粉１２．３kg（乾燥重量１０．０kg）を混合機に入れ、無水リン酸一ナトリウム１．７kgと無水リン酸二ナトリウム１．２kgを溶解した液７．７kg（ｐＨ６．０）を加えて混合し、棚段乾燥機で水分１５重量％となるまで乾燥した。これを一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００６１】
【表６】
【００６２】
Ｃａ可溶化係数２８以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６３】
実施例５
▲１▼ コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）を１０kg/Hrの流速で混合機に導入し、同時にリン酸及び尿素の混合液（リン酸５重量％、尿素１８重量％）を４．３５kg/Hrの流速で添加して混合した。混合後、気流乾燥機で水分１０重量％となるまで乾燥した。これを１３０℃に設定したオーブンで３０分間焙焼した。
【００６４】
▲２▼ コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）を１０kg/Hrの流速で混合機に導入し、同時にリン酸及び尿素の混合液（リン酸１０重量％、尿素１６重量％）を４．３５kg/Hrの流速で添加して混合した。混合後、気流乾燥機で水分１０重量％となるまで乾燥した。これを１３０℃に設定したオーブンで６０分間焙焼した。
実施例１と同様に、合成した尿素リン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００６５】
【表７】
【００６６】
Ｃａ可溶化係数１５〜２５の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６７】
実施例６
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgに無水リン酸一ナトリウム１．３kgと無水リン酸二ナトリウム１．１kgを加えて混合機で混合した。これを水分５重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００６８】
【表８】
【００６９】
Ｃａ可溶化係数２３〜３３の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１７〜２１であった。
【００７０】
実施例７
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ、無水リン酸一ナトリウム０．９６kgと無水リン酸二ナトリウム０．８６kgを水に溶解した液を徐々に加えて混合した。これを水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７１】
【表９】
【００７２】
Ｃａ可溶化係数２７〜２８の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１０〜１８であった。
【００７３】
実施例８
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウム０．８８kgと無水リン酸二ナトリウム０．７９kgを加えて溶解混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
Ｃａ可溶化係数２７〜４０の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１１〜２３であった。
【００７６】
実施例９
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウム１．０kgと無水リン酸二ナトリウム０．９３kgを加えて溶解混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分５重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７７】
【表１１】
【００７８】
Ｃａ可溶化係数４２〜６１の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は２２〜３１であった。
【００７９】
実施例１０
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgと無水リン酸一ナトリウム０．９２kgと無水リン酸二ナトリウム０．８２kgを混合してエクストルーダーに投入し、水を加えて混練混合した。吐出した混練品をカットして送風乾燥機で水分１３重量％になるまで乾燥した。これを粉砕し、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００８０】
【表１２】
【００８１】
Ｃａ可溶化係数３６〜３９の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は２４〜３１であった。
【００８２】
実施例１１
コーンスターチ（乾粉、水分１３量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えて溶解（ｐＨ６．０，５．３）混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００８３】
【表１３】
【００８４】
Ｃａ可溶化係数３０〜５２の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００８５】
実施例１２
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えて溶解（ｐＨ６．０）混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥し、１７０℃に設定したオーブンで１時間焙焼してリン酸エステル澱粉を得た。合成したリン酸エステル澱粉１２０ｇにターマミル１２０Ｌを０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。液化液５０ｇに各種澱粉分解酵素を対澱粉０．１％加えて、６０℃（TVA IIのみ５０℃）で２４時間糖化処理し、得られたオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性、結合リン及び平均重合度を測定した。
【００８６】
用いた澱粉分解酵素は、▲１▼大麦β−アミラーゼ（ジェネンコア社製 ＢＢＡ，大麦由来）、▲２▼甘藷β−アミラーゼ（Sigma 製 試薬β−アミラーゼ，甘藷由来）、▲３▼大麦β−アミラーゼ対澱粉０．１％とプルラナーゼ（天野製薬製 プルラナーゼ「アマノ」，Klebsiella pneumoniae 由来）対澱粉０．０５％の組み合わせ、▲４▼グルコアミラーゼ（ノボノルディスク バイオインダストリー製 AMG, Aspergillus niger 由来グルコアミラーゼ）、▲５▼グルコアミラーゼ（Sigma 製試薬グルコアミラーゼ,Aspergillus niger由来）、▲６▼グルコアミラーゼ（Sigma 製試薬グルコアミラーゼ，Rhizopus niveus 由来）、▲７▼ TVA II （公特開平7-25891,Thermoactinomyces vulgaris R-47 由来α−アミラーゼ）、及び▲８▼ファンガミル（ノボノルディスク バイオインダストリー製 ファンガミル， Aspergillus
oryzae 由来糖化型α−アミラーゼ）である。
【００８７】
【表１４】
【００８８】
澱粉分解酵素処理により、平均重合度（リン酸基の結合していない単糖やオリゴ糖を含む）１〜１８に低分子化されたオリゴ糖組成物が得られ、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として２１〜４５であった。
【００８９】
実施例１３
実施例１２のリン酸エステル澱粉１２０ｇ（ドラムドライヤーで糊化し、１７０℃で１時間焙焼して合成した）に終濃度２０重量％となるように水、ターマミル１２０Ｌ０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。次いで、液化液に蓚酸を加えてｐＨを５．５に調節してからＢＢＡ０．１２ｇを加えて、６０℃で２４時間糖化処理し、オリゴ糖組成物溶液を得た。これに塩酸を加えてｐＨ２．５とし、不溶性物質を濾紙で除いてからＮＦ膜処理（ＮＴＲ−７４１０，日東電工製）で脱塩した。さらに活性炭を加えて６０℃で２時間放置後、濾紙で活性炭を除いて清澄液を得てからエバポレーターで濃縮した。得られた精製オリゴ糖組成物溶液の固形分は９０ｇであり、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として４６、結合リンは２．７重量％、無機リン比率１８％、平均重合度は１２であった。
【００９０】
実施例１４
実施例１２のリン酸エステル澱粉１２０ｇ（ドラムドライヤーで糊化し、１７０℃で１時間焙焼して合成した）に終濃度２０重量％となるように水、ターマミル１２０Ｌ０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。次いで、液化液に蓚酸を加えてｐＨを４．５に調節してからＡＭＧ０．１２ｇを加えて、６０℃で２４時間糖化処理し、オリゴ糖組成物溶液を得た。これに塩酸を加えてｐＨ２．５とし、不溶性物質を濾紙で除いてからＮＦ膜処理（ＮＴＲ−７４１０，日東電工製）で脱塩した。さらに活性炭を加えて６０℃で２時間放置後、濾紙で活性炭を除いて清澄液を得てからエバポレーターで濃縮した。得られた精製オリゴ糖組成物溶液の固形分は５６ｇであり、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として４１、結合リンは３．６重量％、無機リン比率２０％、平均重合度は２．６であった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明は日本人の栄養素の中で唯一不足するとして問題とされているカルシウムの吸収を促進するカルシウム可溶化作用を有する糖質の工業的な製造法を提供するものである。本発明者らによる先願発明の製造法では、純度の極めて高いＰＯＳが工業的に安価で大量生産される利点を有しているが、馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度でしかない。
本発明の方法によれば、澱粉をリン酸エステル化または尿素リン酸エステル化したリン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで酵素分解するだけで、なんらの精製操作を経なくとも、市販のカルシウム吸収促進剤と同等以上のＣａ可溶化活性を有するオリゴ糖組成物を得ることができる。
【発明の属する技術分野】
本発明はリン酸カルシウムの沈澱形成を阻害する作用、すなわちＣａ可溶化作用に優れたリン酸結合糖質、特にリン酸結合オリゴ糖を含みＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるオリゴ糖組成物及びそれらの製造方法、並びに前記リン酸結合オリゴ糖を生成するリン酸結合澱粉及びそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、カルシウムの摂取不足による国民の健康問題がクローズアップされており、高齢化社会の出現に伴う骨粗鬆症などの罹患者が急増している。しかし、食品に含まれるカルシウムの腸内における吸収が低いこともよく知られている事実である。成人男子では牛乳、炭酸カルシウム、小魚、野菜のカルシウム吸収率は５３％，４２％，３４％，１８％と言われている。
カルシウムの吸収を高める物質としてカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が知られている。ＣＰＰはペプチドに結合したリン酸基がカルシウムと結合することにより、カルシウムを不溶性の塩に変えないで、腸内でのカルシウムの吸収を促進するとされている（特公平3-58718号公報，内藤博，化学と生物，18, 551-558, 1980）。
【０００３】
釜阪らは結合リンを含む馬鈴薯澱粉に注目し、酵素分解によってリン酸の結合したオリゴ糖を分取し、得られたリン酸結合オリゴ糖 (Phosphorylated Oligosaccharides，以下「ＰＯＳ」ともいう) がリン酸カルシウムの沈澱形成を阻害する作用のあることを見出した（Biosci. Biotech. Biochem., 59(8), 1412-1416, 1995；特開平8-104696号公報）。
【０００４】
馬鈴薯澱粉に結合リンが含まれていることは古くから知られており、檜作らは馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで分解して得たリミットデキストリンをＯＨ型アニオン交換樹脂に吸着させてから溶出し、ホスホデキストリン（Phosphodextrin）を調製している。得られたホスホデキストリンはさらにグルコアミラーゼで分解してからDEAE- Sephadex A-25 のカラムに吸着させ、洗浄によってブドウ糖を除去した後、リン酸オリゴ糖（Phosphooligosaccharide，Die Starke, 22, 338-343, 1970）を溶出して単離している。
【０００５】
ＰＯＳは馬鈴薯澱粉のα−アミラーゼなどによる酵素分解物から得られることは公知の事実である。しかし、従来のＰＯＳの生産法は実験室レベルの調製法であり、工業的な製造方法は全く確立されていなかった。本発明者らは安価で大量生産が可能なＰＯＳの製造方法について鋭意研究し、先にＰＯＳの工業的な製造方法を発明して特許出願を行なっている（特願平8-240827）。
【０００６】
本発明者らによる先願発明の製造法は、純度の極めて高いＰＯＳが工業的に安価で大量生産される利点を有している。しかしながら、植物原料から得られる天然の澱粉に含まれる結合リンは０．１％未満と少ないため、たとえば馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度である。従って、大量のＰＯＳを製造するには化学的に合成したリン含量の多いリン酸結合澱粉の方が収率を高くすることができる点で有利である。
本発明者らは各種ＰＯＳのＣａ可溶化作用について詳細に調べる中で、リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで分解処理して得られるオリゴ糖組成物が、先願発明の方法で得たＰＯＳに比べて極めて強いカルシウム可溶化活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが開発した先願発明の製造方法では、馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで分解処理して得られるオリゴ糖組成物を脱色処理、脱塩分離、膜処理、脱色処理して純度の高いＰＯＳの得られることが特徴である。
しかしながら、本発明者らによる先願発明の方法では馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％未満である。しかも、得られる純度の高いＰＯＳのＣａ可溶化活性を後に詳述する方法で測定すると、Ｃａ可溶化係数として１〜２であった。
【０００８】
一方、Ｃａ吸収促進剤として市販されているＣＰＰ II及びIII（明治製菓製）のＣａ可溶化活性は、Ｃａ可溶化係数としてそれぞれ１９及び７９である。
また、従来技術では、純度が高く、Ｃａ可溶化活性の高いＰＯＳを得るにはリン酸結合澱粉をα−アミラーゼで加水分解した後、さらにグルコアミラーゼやその他の澱粉分解酵素を加えて加水分解し、結合リンを含まないブドウ糖やオリゴ糖をイオン交換樹脂などで分離してＰＯＳの純度を高めることが必要であった。
【０００９】
本発明者らは、高いＣａ可溶化活性を持つＰＯＳのより簡便な製造方法を得るべく検討を進めた結果、リン酸結合澱粉を原料として、一つの酵素、即ちα−アミラーゼのみで分解処理するだけで、本発明者らによる先願発明の方法で得た純度の高いＰＯＳに比べて１０倍以上もＣａ可溶化活性の高いＰＯＳを含むオリゴ糖組成物が容易に得られることを見出した。
本発明は、リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで処理して得られ、かつＣＰＰ IIと同等以上のＣａ可溶化活性を示すＰＯＳを含むオリゴ糖組成物及びそれらの製造方法、並びに前記オリゴ糖組成物を生成するリン酸結合澱粉及びそれらの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) リン酸結合澱粉であって、該澱粉にα−アミラーゼのみを作用させて得られるオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるリン酸結合澱粉。
(2) 全固形分重量に対して結合リンを１重量％以上含むリン酸結合澱粉であって、該澱粉にα−アミラーゼのみを作用させて得られるオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるリン酸結合澱粉。
【００１１】
(3) リン酸結合澱粉がリン酸エステル澱粉または尿素リン酸エステル澱粉である(1)または(2)のリン酸結合澱粉。
(4) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してから乾燥し、焙焼して得られる(1)または(2)のリン酸結合澱粉。
(5) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し、その水分を１０重量％未満となるまで乾燥してから焙焼して得られる(1)〜(4)のリン酸結合澱粉。
【００１２】
(6) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してから乾燥し、焙焼する(4)のリン酸結合澱粉の製造方法。
(7) 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し、その水分を１０重量％未満となるまで乾燥してから焙焼することを含む(5)のリン酸結合澱粉の製造方法。
(8) リン酸結合オリゴ糖を含み、Ｃａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるオリゴ糖組成物。
(9) 平均重合度が８〜５０である(8)のオリゴ糖組成物。
【００１３】
(10) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させて得られる(8)または(9)のオリゴ糖組成物。
(11) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させ、次いで澱粉分解酵素を少なくとも１種作用させて得られるリン酸結合オリゴ糖を含むオリゴ糖組成物。
(12) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させることを含む(8)
〜(10)のオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１４】
(13) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させ、次いで澱粉分解酵素を少なくとも１種作用させることを含む(11)のオリゴ糖組成物の製造方法。
(14)得られたオリゴ糖組成物を脱塩して全リンに対する結合リンの割合を８０％以上とすることをさらに含む(12)または(13)の方法。
(15) (1)〜(5)のリン酸結合澱粉、及び／または(8)〜(11)のオリゴ糖組成物を含む食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料またはそれらの添加用組成物。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明者らはすでに、馬鈴薯澱粉をα−アミラーゼで１００℃以上の温度で分解した後、糖化酵素でリン酸が結合していないオリゴ糖を分解してＰＯＳを生成させてから、塩基性アニオン交換樹脂やルーズＲＯ膜、活性炭などの精製処理によって純度の高いＰＯＳ製品を製造する方法を開発し、特許出願している。
しかし、馬鈴薯澱粉に含まれる結合リンは０．０５〜０．１％（全固形分重量に対するリン重量Ｗ／Ｗ％，以下同じ）でしかなく、馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度である。従って、大量のＰＯＳを製造するには化学的にリン酸基を結合したリン含量の多いリン酸結合澱粉が有利である。
【００１６】
食品添加物として認可されているリン酸結合澱粉は、澱粉リン酸エステルナトリウムであり、結合リンとして０.２〜３重量％のリンを含み、遊離のリン、すなわち無機リンの含量は全体のリン（全リン）の２０％以下と規定されている。本発明では、原料及びその製造方法の如何を問わず、α−アミラーゼのみで分解処理するだけでＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上であるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物及び前記オリゴ糖組成物を生成させるリン酸結合澱粉が全て対象となる。本発明で対象となるリン酸結合澱粉はリン酸エステル澱粉及び尿素リン酸エステル澱粉である。
【００１７】
リン酸結合澱粉の原料となる澱粉はコーンスターチ、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉など広く一般に利用されている植物起源の澱粉だけでなく、いずれの起源の澱粉でも使用することができる。
リン酸結合澱粉の合成方法は特に限定されないが、リン酸結合澱粉の合成には通常、澱粉スラリーにリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）を混合してから脱水し、乾燥・焙焼する方法、澱粉の脱水ケーキにリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）溶液を噴霧して乾燥・焙焼する方法や澱粉乾粉にリン酸及び／またはその塩、及び尿素（尿素リン酸エステル澱粉合成の場合）溶液を混合して乾燥・焙焼する方法が用いられる。
【００１８】
澱粉のスラリー濃度は均一な流動性を維持する観点から、通常３０〜５０重量％、好ましくは３５〜４５重量％である。
リン酸及び／またはその塩としては、リン酸、及びリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、酸性ヘキサメタリン酸ナトリウムなどのリン酸ナトリウム塩やリン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸カリウム塩やリン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウムなどのリン酸アンモニウム塩など広くリン酸塩が使用できる。
【００１９】
リン酸及び／またはその塩の添加量はその種類によって異なるが、澱粉の重量に対して通常０.５〜２４０重量％であり、好ましくは５〜４０重量％である。なお、尿素リン酸エステル澱粉の合成にはリン酸塩の他に尿素の添加が必要である。尿素の添加量は澱粉の重量に対して通常０.５〜２４０重量％であり、好ましくは５〜６０重量％である。
ｐＨを調整するために、酸、アルカリを使用することができる。酸としては塩酸、硫酸、亜硫酸などの酸を、アルカリとしてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ(ＯＨ)2などを用いることができる。
【００２０】
澱粉とリン酸及び／またはその塩との混合物（尿素リン酸エステル澱粉の合成の場合には尿素も含む）は水分を除くため乾燥するのが望ましい。本発明者らは乾燥後の水分が重要であることを見出した。すなわち、乾燥後の水分が低い程、Ｃａ可溶化活性の高いリン酸結合澱粉が得られる。実際的には、乾燥後の水分は１０重量％未満であることが好ましい。
焙焼の条件としては、焙焼温度が高くなるほど、焙焼時間が長くなるほど結合リンは増加するが、焙焼品の色が赤褐色となり、Ｃａ可溶化活性は結合リンの増加に比例するとは限らない。従って、焙焼の条件は温度としては、通常１００〜２５０℃、好ましくは１３０〜２００℃の温度で、焙焼時間としては、通常５分〜４時間、好ましくは１０〜１２０分の範囲で加熱するのが好ましい。
【００２１】
上述の合成法以外にも、本発明者らはリン酸エステル澱粉の合成法を種々検討し、澱粉とリン酸及び／またはその塩とを混合した後、糊化・乾燥してから焙焼する方法を開発した。糊化・乾燥法としては、たとえば、澱粉スラリーにリン酸及び／またはその塩を加えて溶解した後、ドラムドライヤーで糊化・乾燥する方法や、澱粉乾粉にリン酸及び／またはその塩を加えて必要に応じて水を加えながらエクストルーダー処理して糊化・乾燥する方法などがある。
【００２２】
糊化・乾燥した澱粉のリン酸及び／またはその塩との混合物を焙焼したものと、糊化しない澱粉にリン酸及び／またはその塩を加えて乾燥し、同じ条件で焙焼したものを比較すると、糊化・乾燥後焙焼して得られるリン酸結合澱粉の方がα−アミラーゼ処理でより高いＣａ可溶化活性を示すことが認められた。
本発明のＣａ可溶化活性を示すＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は、上述のリン酸結合澱粉をα−アミラーゼで分解して低分子化することにより得られる。低分子化により粘度が低下するため、食品などへの利用用途が大きく拡大される。本来、分解に用いる酵素は澱粉をランダムに切断するα−アミラーゼであれば全て用いることができ、当然２種以上の酵素を混合して用いることもできる。
【００２３】
α−アミラーゼとしては、工業的な澱粉の分解（以下、「液化」ともいう）に多用されている耐熱性液化型α−アミラーゼ、中温性液化型α−アミラーゼ、糖化型α−アミラーゼ、糖転移酵素のＣＧＴａｓｅ（Cyclomaltodextrin glucanotransferase）やＴＶＡ（Thermoactinomyces vulgarisのα−アミラーゼ）などが使用できる。しかし、工業生産に適応した酵素としては、耐熱性の液化型α−アミラーゼが分解能力及び澱粉の溶解力において優れている。
リン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させる条件は、酵素の種類により大きく異なるが、通常用いられている条件で行うことができる。用いる酵素は８０〜１１０℃で有効に作用する耐熱性液化型α−アミラーゼが好ましく、いずれの起源のものでも使用できる。
【００２４】
具体的には、細菌起源の高耐熱性α−アミラーゼであるターマミル１２０Ｌ（ノボノルディスク バイオインダストリー製、Bacillus licheniformis由来）、ネオスピターゼＰＧ２（ナガセ生化学工業製、Bacillus subtilis 由来）、クライスターゼＴ（大和化成製、Bacillus subtilis 由来）などの市販酵素を用いることができる。
基質となるリン酸結合澱粉は１０〜４０重量％濃度のスラリーとし、水酸化カルシウム及び／または水酸化ナトリウムを加えて、通常ｐＨ６．０〜６．３に調整する。耐熱性α−アミラーゼは安定剤として５０ppm以上のカルシウムイオンを必要とするので、ｐＨ調整用アルカリとしては水酸化カルシウムが主に使用される。
【００２５】
酵素添加量は使用する酵素によって大きく異なるが、通常０.００１〜０.５重量％、好ましくは０.０１〜０.２重量％（対澱粉）である。反応のｐＨも使用する酵素によって異なるが、通常ｐＨ４〜７である。
工業生産における澱粉分解反応（液化反応）では、通常、澱粉の再結晶化を防ぐため、α−アミラーゼ添加後の反応開始温度を１００〜１１０℃に高めて２〜１５分、加圧条件で処理した後、９０〜１００℃の高温で３０分〜５時間程度酵素分解を進めて行なっている。
【００２６】
α−アミラーゼによるリン酸結合澱粉の分解は工業生産における分解反応と異なり、必ずしも１００〜１１０℃、加圧というような厳しい分解条件を必要とはしない。結合リンの多寡によって異なるものの、結合リンが澱粉の再結晶化を防ぐ役割を果たすことから、１００℃以上の厳しい反応条件は必ずしも必要ではない。しかしながら、分解反応の高温処理は分解液の濾過性を良くして操業を容易にするなどの面から好ましい。
具体的には、最終濃度として１０〜４０重量％となるようにリン酸結合澱粉を採取し、２.８重量％の塩化カルシウムを全量の１／１００量加え、１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨを６.３に調節する。これに、ターマミル１２０Ｌを０.１重量％（対リン酸結合澱粉）加えて耐圧容器に移す。１０５℃で５分間加熱後、９５℃で１時間液化反応を継続する。
【００２７】
なお、ターマミル１２０Ｌによる反応では酵素添加量０.１重量％で反応温度は９０〜１００℃、反応時間１０〜７０分の範囲ではＣａ可溶化活性値はほとんど同じ値を示すことが明らかとなった。さらに、この反応液の反応温度を６０℃に下げて、２４時間反応を継続しても、Ｃａ可溶化活性は元の活性の８０〜９０％を維持しており、ターマミル１２０Ｌを０.０５重量％追加添加して６０℃で２４時間追加反応すると７０％前後まで低下することが明らかとなった。
【００２８】
リン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は極めて高いＣａ可溶化活性を有する混合液であり、そのまま濃縮して製品となる。しかし、リン酸結合澱粉のα−アミラーゼ処理のみで得られるオリゴ糖組成物の平均重合度は８〜５０であり、オリゴ糖よりもデキストリンの範疇に入る重合度を有している。通常のオリゴ糖より分子量がかなり大きいため、そのまま製品として濃縮すれば、製品の粘度が高くなって食品としての使用に制限が起こる場合もある。
【００２９】
製品の粘度をさらに下げるには、α−アミラーゼも含む各種澱粉分解酵素や糖転移酵素の１種または２種以上の酵素、さらにこれら各種酵素の１種以上の酵素にα−グルコシダーゼを加えた酵素群による追加分解反応（以下、「糖化反応」ともいう）を行うことができる。なかでも、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、糖化型α−アミラーゼなどの澱粉分解酵素がオリゴ糖組成物の重合度の低下に有効性の高い酵素として推奨される。
他に、単独では重合度低下作用が少ないものの、グルコアミラーゼなどとの組み合わせにより効果を示す酵素として、液化型α−アミラーゼ、ＣＧＴａｓｅ（Cyclomaltodextrin glucanotransferase）、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ＴＶＡなどが挙げられる。
【００３０】
従来技術ではＰＯＳの低分子化を優先するため、追加分解にはグルコアミラーゼが主として使用され、さらに、枝切り酵素であるプルラナーゼやα−アミラーゼを同時に作用させている。本発明者らによる先願発明においても、耐熱性液化型α−アミラーゼで処理した後、グルコアミラーゼとプルラナーゼの混合酵素剤であるデキストロザイムを使用して低分子化を進めている。
合成したリン酸結合澱粉を液化型α−アミラーゼで分解処理して得られたオリゴ糖組成物をさらに各種澱粉分解酵素で追加分解する場合、グルコアミラーゼの市販酵素剤ＡＭＧ（ノボノルディスク バイオインダストリー社製、Aspergillus niger 由来）で処理すると、オリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は追加分解前の半分程度に減少した。
【００３１】
なお、試薬製剤のグルコアミラーゼ（Aspergillus niger 由来及びRhizopus niveus 由来）で処理したオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は液化型α−アミラーゼ処理のみで得られるオリゴ糖組成物の活性の８０％前後の値であった。
また、β−アミラーゼの市販酵素剤であるＢＢＡ（ジェネンコァ社製、大麦由来）や甘藷由来の試薬β−アミラーゼで処理したオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性は元の８０％前後の活性が維持されていた。さらに、β−アミラーゼにα−アミラーゼを同時に作用させて低分子化反応を進めると、Ｃａ可溶化活性は元の５０％前後の活性に減少した。
【００３２】
なお、β−アミラーゼで追加分解して得たオリゴ糖組成物の平均重合度は４〜８であり、グルコアミラーゼ処理で得られるものの平均重合度１〜４より大きい傾向が認められた。
澱粉分解酵素による追加分解反応は液化型α−アミラーゼ処理で得られたオリゴ糖組成物に各種酵素を１種または２種以上加えて、各酵素の最適反応条件で行われる。反応条件は酵素の種類によって大きく異なるが、通常、反応温度は４０〜７０℃、ｐＨは４〜７、分解（糖化）時間は０.５〜９６時間、酵素添加量はオリゴ糖組成物の固形分に対して０.０００１〜1重量％である。なお、追加分解反応に用いる酵素は最初の分解で使用する液化型α−アミラーゼ処理と同時に用いることもできる。
【００３３】
リン酸結合澱粉の酵素分解物には、添加酵素や分解反応で生成する凝集タンパク質や未分解澱粉など不溶性物質が含まれ、さらに中和に用いた塩類や無機リンなども不純物として含まれている。不溶性物質は濾過や膜処理で除去されるが、塩類や無機リンを除くにはイオン交換樹脂処理、ナノフィルトレーション（ＮＦ）膜処理、イオン交換膜処理などによる脱塩処理が必要である。
リン酸結合澱粉を酵素分解して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物を脱塩処理することにより、全リンに対する無機リン比率を２０％以下に減少させることができる。これにより、食品添加物として規定されているリン酸結合澱粉と同等の結合リン、無機リン含量のＰＯＳを含むオリゴ糖組成物を得ることができる。
【００３４】
以下、本発明におけるＣａ可溶化係数の定義と測定方法を示す。
（１）Ｃａ可溶化活性測定試料液の調製
リン酸結合澱粉をα−アミラーゼなどの酵素で処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物溶液（ＰＯＳ溶液、未精製）（２重量％、ｐＨ２に調整したもの）１７．５ｇを試験管に採取し、水を加えて３０ｇとする。５重量％のＮａＯＨ溶液でｐＨ７．２〜７．３に合わせる。さらに、１重量％のＮａＯＨ溶液でｐＨ７．３６〜７．３７に微調節してから水を加えて全量を３５．０ｇとする。この時、ｐＨが７．４０±０．０２であることを確認し、ｐＨが外れている場合には再度、ｐＨ調整をやり直す。
【００３５】
得られた１重量％のＰＯＳ溶液をＣａ可溶化活性測定試料液とする。
（２）リン酸カルシウム沈澱形成阻害反応
（１）で得た測定試料液を必要に応じて水で希釈してリン酸カルシウム沈澱形成阻害反応を行う。３０℃の恒温槽で恒温にした１５mM−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１．５mlを試験管に採取し、適宜希釈した測定試料液０．３mlを加えて混合する。次いで、３０℃の恒温槽で恒温にした１２．５mM−ＣａＣｌ2を１．２ml加えて混合し、３０℃の恒温槽に入れて１時間保持する。１時間後、測定試料を１５０００rpmで１分間遠心分離して、上清のＣａ濃度を測定する。
Ｃａ濃度はＣａ測定キット（和光純薬製）で測定した。対照として、希釈測定試料液の代わりに水を加えたもののＣａ濃度を測定し、リン酸カルシウムのみの上清Ｃａ濃度を算出して対照１液とする。希釈測定試料液及びリン酸緩衝液の代わりに水を加えたもののＣａ濃度を測定して、全Ｃａ濃度を算出して対照２液とする。
【００３６】
（３）Ｃａ可溶化係数の算出
まず、各希釈試料液のＣａ可溶化率を次式によって求める。
【００３７】
【数１】
測定液中の試料濃度を横軸に取り、Ｃａ可溶化率を縦軸に取ってグラフを作成し、Ｃａ可溶化率が５０％となる試料濃度を求める。この試料濃度（％）値の逆数をＣａ可溶化係数とする。
例えば、Ｃａ可溶化活性測定時の試料の濃度が０．１％でＣａ可溶化率５０％になった場合、Ｃａ可溶化係数は１０である。なお、Ｃａ可溶化率は５０％を挟んで５０±３０％の範囲で測定した試料濃度２点の直線とＣａ可溶化率５０％の交点をＣａ可溶化係数算出の試料濃度とし、係数値は少数点１位以下を四捨五入して整数とする。
【００３９】
表１に、各種リン酸結合澱粉の結合リン含量とＣａ可溶化係数を示す。
α−アミラーゼによる分解処理で高いＣａ可溶化活性を示すようなリン酸エステル澱粉を得るため、コーンスターチ及び馬鈴薯澱粉を原料として、反応条件を変えて結合リンが馬鈴薯澱粉の結合リン含量より多い０．５〜４重量％となるようにリン酸エステル澱粉を合成した。
表１から明らかなように、結合リン含量が１重量％以上のリン酸結合澱粉を酵素処理して得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物のＣａ可溶化係数は１０以上である。
【００４０】
【表１】
原料の澱粉がコーンスターチであれ、馬鈴薯澱粉であれ、結合リンが１重量％未満のリン酸エステル澱粉をα−アミラーゼで分解して生成したＰＯＳを含む溶液のＣａ可溶化活性は、Ｃａ可溶化係数として１０未満であり、明治製菓製のＣＰＰ IIのＣａ可溶化係数１９より低いものである。
結合リンの少ないリン酸エステル澱粉を原料としてα−アミラーゼ処理して得られるＰＯＳ溶液からＰＯＳ製品を得るには、生成したＰＯＳ以外の結合リン酸を持たないブドウ糖やオリゴ糖などの中性糖を除く精製操作を行わなければ、明治製菓製のＣＰＰ IIのようなＣａ可溶化活性の高いＰＯＳ製品を得ることはできない。
【００４２】
これに対して、１重量％以上の結合リンを含むリン酸エステル澱粉のα−アミラーゼ処理により得られるオリゴ糖組成物はなんら精製純化操作をしなくとも、１０〜５０の高いＣａ可溶化係数の得られることが明らかである。
すなわち、α−アミラーゼによる酵素処理だけでＣＰＰ IIと同等以上の高いＣａ可溶化活性を持つオリゴ糖組成物が得られたこととなり、極めて簡便なＰＯＳの製造方法が開発されたこととなる。
本発明で設定したＣａ可溶化活性測定法を用いてＣａ可溶化作用を有するとされる各種物質のＣａ可溶化係数を求めると表２のように算出された。
【００４３】
【表２】
Ｃａ可溶化活性の高いアルギン酸ナトリウムやペクチンは多糖であり、粘性物質であって食品としての使用に制限がある。単糖や二糖の一リン酸や二リン酸はＣＰＰ IIと同程度のＣａ可溶化活性を有するものの高価である。
これらに対して、リン酸エステル澱粉は食品添加物として認められており、そのまま食品に添加することができる。しかも、α−アミラーゼによって容易に低分子化されてＰＯＳを含むオリゴ糖組成物に変換されるので、リン酸エステル澱粉をそのまま食品に加えて使用しても、加工工程中にα−アミラーゼが存在すれば高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳを生成する。
【００４５】
また、食品にα−アミラーゼが存在しなくとも、食品として咀嚼中に唾液のα−アミラーゼの作用によりリン酸エステル澱粉から高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳが生成可能である。次いで、咀嚼だけでリン酸エステル澱粉の低分子化が不十分な場合でも、小腸では膵液のα−アミラーゼの作用により高いＣａ可溶化活性を有するＰＯＳが生成する。すなわち、リン酸エステル澱粉を高分子のままで食品に添加しても、体内でＰＯＳが生成し、高いＣａ可溶化活性を示すことが予想される。
【００４６】
さらに、リン酸エステル澱粉を耐熱性液化型α−アミラーゼによって低分子化すれば、粘度が低く、Ｃａ可溶化活性の高いＰＯＳが安価に大量に生産され、食品への利用が大きく広げられることとなる。 本発明の高い活性を有するリン酸結合澱粉は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料などの成分として混合することができる。また、同じくリン酸結合澱粉は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料への添加用組成物として利用することができる。
さらに、本発明の高い活性を有するリン酸結合澱粉から得られるＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料などの成分として混合することができる。また、同じくＰＯＳを含むオリゴ糖組成物は食品、飲料、糊剤、混和剤、塗料、顔料、肥料への添加用組成物として利用することができる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例により、その技術的範囲が限定されるものではない。なお、実施例中、結合リン含量の測定、Ｃａ可溶化係数の測定、及びオリゴ糖組成物の平均重合度の測定は、各々以下の方法によって行った。
【００４８】
［結合リン含量の測定］
リン含量は澱粉・関連糖質実験法（学会出版センター、中村道徳ら）に記載の方法に準じて測定した。リン酸結合澱粉のリン含量を測定するため、試料にターマミル１２０Ｌ（耐熱性液化型α−アミラーゼ）０．１重量％を加えて９５℃，１５分間加熱分解して均一な溶液を調製し、無機リンを全てオルトリン酸とするため塩酸を添加してｐＨ２に調整してからFiske-Subbarow法で無機リンを測定した。なお、これら一連の酵素分解反応では結合リンが無機リンとして遊離しないことを確認しており、元のリン酸結合澱粉も分解生成したオリゴ糖組成物も結合リンの含量に変化はない。また、発色時に濁りが認められるものは遠心分離（３０００rpm，３分間）して上清の吸光度を測定した。
全リン含量は無機リン測定時にｐＨ２に調整した試料を湿式灰化処理し、同様に測定した。結合リン含量（重量％，対試料固形分）は（全リン含量−無機リン含量）で算出した。
【００４９】
［Ｃａ可溶化係数の測定］
上述したように、Ｃａ可溶化活性測定試料液を調製し、リン酸カルシウム沈殿形成阻害反応を行って式（Ｉ）よりＣａ可溶化率を求め、Ｃａ可溶化係数を算出した。
【００５０】
［オリゴ糖組成物の平均重合度の測定］
糖含量は澱粉・関連糖質実験法（学会出版センター、中村道徳ら）に記載の方法に準じて測定し、オリゴ糖組成物の平均重合度は全糖／還元糖から求めた。リン含量測定の場合と同様にｐＨ２に調整した試料液を適宜希釈して、全糖はフェノール−硫酸法(Dubois ら,1956)で、還元糖は Somogyi-Nelson 法(Nelson, 1944)で測定した。測定値はブドウ糖換算重量％（対試料固形分）で表示し、平均重合度は全糖／還元糖で算出した。
【００５１】
実施例１
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウム２．２kgと無水リン酸二ナトリウム２．０kgを加えて溶解し（ｐＨ６．０）、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。この澱粉ケーキの全リンは３．８重量％であった。これを棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１〜３時間焙焼した。
次いで、得られたリン酸エステル澱粉をα−アミラーゼで分解してオリゴ糖組成物とするため、合成したリン酸エステル澱粉を３〜４ｇ採取し、１０５℃で４時間乾燥した。放冷後、乾燥試料２ｇを精秤して１００mlの耐圧ガラス容器に入れ、水を７０ｇ加えて、均一になるまで攪拌した。これに２．８重量％の塩化カルシウム溶液を１ml加え、１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨを６．３に調節した。α−アミラーゼとして、ターマミル１２０Ｌを水で１０倍に希釈した液を２０mg加え、耐圧ガラス容器をガス加熱した沸騰水中に置いて、時々攪拌しながら１５分間加熱した。加熱終了後、放冷してから１Ｎ−塩酸溶液を加えてｐＨを２に調節してから水を加えて全量を１００ｇとした（濃度２重量％）。
得られたＰＯＳを含むオリゴ糖組成物の結合リン含量とＣａ可溶化係数を測定した。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
Ｃａ可溶化係数１８以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００５４】
実施例２
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えてｐＨ４．０及び２．５となるように溶解し、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。これらの澱粉ケーキの全リンは３．８重量％であった。次いで棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００５５】
【表４】
Ｃａ可溶化係数２０以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００５７】
実施例３
コーンスターチを含むスラリー（澱粉重量濃度４０％）１０kgに無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムの添加量を変えて溶解し（ｐＨ６．０）、濾紙で濾過して澱粉ケーキを回収した。これらの澱粉ケーキの全リンは３．８，５．９，６．３重量％であった。次いで棚段乾燥機で水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００５８】
【表５】
Ｃａ可溶化係数２４以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６０】
実施例４
馬鈴薯澱粉１２．３kg（乾燥重量１０．０kg）を混合機に入れ、無水リン酸一ナトリウム１．７kgと無水リン酸二ナトリウム１．２kgを溶解した液７．７kg（ｐＨ６．０）を加えて混合し、棚段乾燥機で水分１５重量％となるまで乾燥した。これを一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００６１】
【表６】
Ｃａ可溶化係数２８以上の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６３】
実施例５
▲１▼ コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）を１０kg/Hrの流速で混合機に導入し、同時にリン酸及び尿素の混合液（リン酸５重量％、尿素１８重量％）を４．３５kg/Hrの流速で添加して混合した。混合後、気流乾燥機で水分１０重量％となるまで乾燥した。これを１３０℃に設定したオーブンで３０分間焙焼した。
【００６４】
▲２▼ コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）を１０kg/Hrの流速で混合機に導入し、同時にリン酸及び尿素の混合液（リン酸１０重量％、尿素１６重量％）を４．３５kg/Hrの流速で添加して混合した。混合後、気流乾燥機で水分１０重量％となるまで乾燥した。これを１３０℃に設定したオーブンで６０分間焙焼した。
実施例１と同様に、合成した尿素リン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００６５】
【表７】
Ｃａ可溶化係数１５〜２５の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００６７】
実施例６
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgに無水リン酸一ナトリウム１．３kgと無水リン酸二ナトリウム１．１kgを加えて混合機で混合した。これを水分５重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００６８】
【表８】
Ｃａ可溶化係数２３〜３３の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１７〜２１であった。
【００７０】
実施例７
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ、無水リン酸一ナトリウム０．９６kgと無水リン酸二ナトリウム０．８６kgを水に溶解した液を徐々に加えて混合した。これを水分１３重量％となるまで乾燥してから一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７１】
【表９】
Ｃａ可溶化係数２７〜２８の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１０〜１８であった。
【００７３】
実施例８
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウム０．８８kgと無水リン酸二ナトリウム０．７９kgを加えて溶解混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７４】
【表１０】
Ｃａ可溶化係数２７〜４０の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は１１〜２３であった。
【００７６】
実施例９
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウム１．０kgと無水リン酸二ナトリウム０．９３kgを加えて溶解混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分５重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００７７】
【表１１】
Ｃａ可溶化係数４２〜６１の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は２２〜３１であった。
【００７９】
実施例１０
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgと無水リン酸一ナトリウム０．９２kgと無水リン酸二ナトリウム０．８２kgを混合してエクストルーダーに投入し、水を加えて混練混合した。吐出した混練品をカットして送風乾燥機で水分１３重量％になるまで乾燥した。これを粉砕し、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リン、Ｃａ可溶化係数と平均重合度を測定した。
【００８０】
【表１２】
Ｃａ可溶化係数３６〜３９の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られ、オリゴ糖組成物の平均重合度は２４〜３１であった。
【００８２】
実施例１１
コーンスターチ（乾粉、水分１３量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えて溶解（ｐＨ６．０，５．３）混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥した。次いで、一定温度に設定したオーブンで１時間焙焼した。
実施例１と同様に、合成したリン酸エステル澱粉からオリゴ糖組成物を調製し、全リン、結合リンとＣａ可溶化係数を測定した。
【００８３】
【表１３】
Ｃａ可溶化係数３０〜５２の高いＣａ可溶化活性を有するリン酸結合澱粉が得られた。
【００８５】
実施例１２
コーンスターチ（乾粉、水分１３重量％）１０kgを混合機に入れ水を加えてスラリーとし、無水リン酸一ナトリウムと無水リン酸二ナトリウムを適宜加えて溶解（ｐＨ６．０）混合した。これをドラムドライヤーにかけて糊化し、水分１３重量％となるまで乾燥し、１７０℃に設定したオーブンで１時間焙焼してリン酸エステル澱粉を得た。合成したリン酸エステル澱粉１２０ｇにターマミル１２０Ｌを０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。液化液５０ｇに各種澱粉分解酵素を対澱粉０．１％加えて、６０℃（TVA IIのみ５０℃）で２４時間糖化処理し、得られたオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性、結合リン及び平均重合度を測定した。
【００８６】
用いた澱粉分解酵素は、▲１▼大麦β−アミラーゼ（ジェネンコア社製 ＢＢＡ，大麦由来）、▲２▼甘藷β−アミラーゼ（Sigma 製 試薬β−アミラーゼ，甘藷由来）、▲３▼大麦β−アミラーゼ対澱粉０．１％とプルラナーゼ（天野製薬製 プルラナーゼ「アマノ」，Klebsiella pneumoniae 由来）対澱粉０．０５％の組み合わせ、▲４▼グルコアミラーゼ（ノボノルディスク バイオインダストリー製 AMG, Aspergillus niger 由来グルコアミラーゼ）、▲５▼グルコアミラーゼ（Sigma 製試薬グルコアミラーゼ,Aspergillus niger由来）、▲６▼グルコアミラーゼ（Sigma 製試薬グルコアミラーゼ，Rhizopus niveus 由来）、▲７▼ TVA II （公特開平7-25891,Thermoactinomyces vulgaris R-47 由来α−アミラーゼ）、及び▲８▼ファンガミル（ノボノルディスク バイオインダストリー製 ファンガミル， Aspergillus
oryzae 由来糖化型α−アミラーゼ）である。
【００８７】
【表１４】
澱粉分解酵素処理により、平均重合度（リン酸基の結合していない単糖やオリゴ糖を含む）１〜１８に低分子化されたオリゴ糖組成物が得られ、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として２１〜４５であった。
【００８９】
実施例１３
実施例１２のリン酸エステル澱粉１２０ｇ（ドラムドライヤーで糊化し、１７０℃で１時間焙焼して合成した）に終濃度２０重量％となるように水、ターマミル１２０Ｌ０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。次いで、液化液に蓚酸を加えてｐＨを５．５に調節してからＢＢＡ０．１２ｇを加えて、６０℃で２４時間糖化処理し、オリゴ糖組成物溶液を得た。これに塩酸を加えてｐＨ２．５とし、不溶性物質を濾紙で除いてからＮＦ膜処理（ＮＴＲ−７４１０，日東電工製）で脱塩した。さらに活性炭を加えて６０℃で２時間放置後、濾紙で活性炭を除いて清澄液を得てからエバポレーターで濃縮した。得られた精製オリゴ糖組成物溶液の固形分は９０ｇであり、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として４６、結合リンは２．７重量％、無機リン比率１８％、平均重合度は１２であった。
【００９０】
実施例１４
実施例１２のリン酸エステル澱粉１２０ｇ（ドラムドライヤーで糊化し、１７０℃で１時間焙焼して合成した）に終濃度２０重量％となるように水、ターマミル１２０Ｌ０．１２ｇを加え、さらに１０％Ｃａ(ＯＨ)2水溶液を加えてｐＨ６．３とした。これを１０５℃で５分間加圧加熱処理してから９５℃で１時間液化処理した。次いで、液化液に蓚酸を加えてｐＨを４．５に調節してからＡＭＧ０．１２ｇを加えて、６０℃で２４時間糖化処理し、オリゴ糖組成物溶液を得た。これに塩酸を加えてｐＨ２．５とし、不溶性物質を濾紙で除いてからＮＦ膜処理（ＮＴＲ−７４１０，日東電工製）で脱塩した。さらに活性炭を加えて６０℃で２時間放置後、濾紙で活性炭を除いて清澄液を得てからエバポレーターで濃縮した。得られた精製オリゴ糖組成物溶液の固形分は５６ｇであり、Ｃａ可溶化活性はＣａ可溶化係数として４１、結合リンは３．６重量％、無機リン比率２０％、平均重合度は２．６であった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明は日本人の栄養素の中で唯一不足するとして問題とされているカルシウムの吸収を促進するカルシウム可溶化作用を有する糖質の工業的な製造法を提供するものである。本発明者らによる先願発明の製造法では、純度の極めて高いＰＯＳが工業的に安価で大量生産される利点を有しているが、馬鈴薯澱粉から得られるＰＯＳの収率は１％程度でしかない。
本発明の方法によれば、澱粉をリン酸エステル化または尿素リン酸エステル化したリン酸結合澱粉をα−アミラーゼのみで酵素分解するだけで、なんらの精製操作を経なくとも、市販のカルシウム吸収促進剤と同等以上のＣａ可溶化活性を有するオリゴ糖組成物を得ることができる。
Claims (11)
- 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してからその水分を１０重量％未満となるまで乾燥し、焙焼して得られる、全固形分重量に対して結合リンを１重量％以上含むリン酸結合澱粉であって、該澱粉にα−アミラーゼのみを作用させて得られるオリゴ糖組成物のＣａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上である、リン酸結合澱粉。
- リン酸結合澱粉がリン酸エステル澱粉または尿素リン酸エステル澱粉である請求項１に記載のリン酸結合澱粉。
- 澱粉にリン酸及び／またはその塩を混合し糊化してからその水分を１０重量％未満となるまで乾燥し、焙焼することを含む請求項１に記載のリン酸結合澱粉の製造方法。
- 請求項１または２に記載のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させて得られるリン酸結合オリゴ糖を含み、Ｃａ可溶化活性がＣａ可溶化係数として１０以上である、カルシウムの吸収を促進するためのオリゴ糖組成物。
- リン酸結合澱粉に澱粉分解酵素としてα−アミラーゼのみを作用させる、請求項４に記載のオリゴ糖組成物。
- 平均重合度が８〜５０である請求項４または５に記載のオリゴ糖組成物。
- 請求項１または２に記載のリン酸結合澱粉にα−アミラーゼを作用させることを含む請求項４〜６のいずれか１項に記載のオリゴ糖組成物の製造方法。
- リン酸結合澱粉に澱粉分解酵素としてα−アミラーゼのみを作用させる、請求項７に記載の方法。
- 得られたオリゴ糖組成物を脱塩して全リンに対する結合リンの割合を８０％以上とすることをさらに含む請求項７または８に記載の方法。
- 請求項１または２に記載のリン酸結合澱粉、及び／または請求項４〜６のいずれか１項に記載のオリゴ糖組成物を含む食品。
- 請求項１または２に記載のリン酸結合澱粉、及び／または請求項４〜６のいずれか１項に記載のオリゴ糖組成物を含む飲料。
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