JP4181803B2 - ベロ毒素ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーおよびその取得法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得る一本鎖核酸分子（アプタマー）ならびにその取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベロ毒素(Verotoxin)は、腸管出血性大腸菌が産生する毒素であり、アミノ酸配列の違いからＩ型とＩＩ型とに類別される。これら毒素は１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットとから形成されており、Ｂサブユニットにより腸管上皮細胞上に存在するレセプターを認識して結合し、細胞内でＡサブユニットがｒＲＮＡに結合してタンパク合成阻害を起こすことが知られている。ベロ毒素Ｉ型とベロ毒素ＩＩ型とは、生物学的性状が非常に類似しているが、物理化学的性状および免疫学的性状を互いに異にするものであり、ベロ毒素Ｉ型は、志賀赤痢菌（Shigella dysenterae）１型菌の産生する志賀毒素(Shiga toxin)と同一の毒素であり、Shiga-like toxin(SLT)などとも呼ばれるものである。このようなベロ毒素Ｉ型を選択的に認識することができる高アフィニティーリガンドの開発は、ベロ毒素Ｉ型の検出や定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好適に使用できる点から、非常に重要である。
【０００３】
従来、高アフィニティーリガンドを取得する方法としては、抗原抗体反応の高い特異性を利用して抗体を作製する手法が一般に採られていた。しかし毒素に対する抗体作製の場合、感作動物への毒性から、ホルムアルデヒド処理や熱処理により無毒化した形で免疫を行うのが常法である。ただしこの場合、上記処理による構造変化から、親和性の高いアフィニティーリガンドの取得は困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、腸管出血性大腸菌が産生するベロ毒素のＩ型を標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフィニティーリガンドを取得する方法およびアフィニティーリガンドを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、近年の進化分子工学の発達により開発された、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする、インビトロセレクション法（in vitro selection method）、あるいはＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）などと呼ばれる技術を利用して上記のアフィニティーリガンドを取得し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）アフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した担体を用いることを特徴とする方法。
（２）ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドが、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドである、上記（１）記載の方法。
（３）該ペプチドを固定化した担体を充填してなるアフィニティーカラムを用いることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（４）該ペプチドが、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである、上記（１）記載の方法。
（５）該ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介して担体に固定化されてなることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（６）上記（１）記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（７）アフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いることを特徴とする方法。
（８）上記ペプチドが、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである、上記（７）記載の方法。
（９）上記ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介してアフィニティーカラムに固定化されていることを特徴とする、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（１１）ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｂ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｃ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号４０〜８８で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｄ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３９〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
（１２）核酸がＤＮＡである上記（１１）記載の一本鎖核酸分子。
【０００７】
本明細書において「インビトロセレクション法(in vitro selection method)」とは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の機能を有する（たとえば、標的物質に特異的に吸着する）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施することによって、特定の機能を有する核酸分子を取得する方法を指す。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の標的物質に特異的に吸着し得る核酸分子（アプタマー）を取得したい場合、上記吸着能を有する核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０００８】
また本明細書中における「アプタマー」とは、特定の標的物質に対する特異的な吸着能を有する一本鎖核酸分子を指すものとする。本明細書中におけるアプタマーは、上記のインビトロセレクション法によって取得されたものに限定されない。
【０００９】
本明細書において「アフィニティークロマトグラフィー」とは、生体物質の示す特異的な相互作用（親和性）を利用した分離法を指し、その分離手段は特に限定されず、通常当分野で実施される種々の手法が用いられる。具体的にはアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、当該方法は▲１▼標的物質を固定化した担体を充填したアフィニティーカラム（以下、便宜上標的物質を固定化したアフィニティーカラムということもある）に、該標的物質に特異的に吸着可能な物質および／または吸着できない物質をアプライする処理と、▲２▼アプライ後、洗浄用緩衝液にてカラムを洗浄して上記吸着可能物質と非吸着物質とを分離する処理（洗浄処理）と、▲３▼洗浄処理の後に溶出用緩衝液にて、吸着可能物質とカラムに固定化した標的物質との間の結合力を弱めて、吸着可能物質を溶出させる処理（溶出処理）とを少なくとも含有するものとする。ここで、標的物質を固定化する担体としては、アフィニティークロマトグラフィー、特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーで用いられる公知のものが挙げられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
まずステップｓ１では、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って約３０塩基〜約８０塩基の予め決められた長さのランダム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮｔという場合もある。）のライブラリーを作成する。該ライブラリーには１０13〜１０14種類もしくはそれ以上のｓｓＮｔが含まれていることが好ましい。
【００１１】
後述するステップｓ２、ｓ３におけるＰＣＲ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアンチセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設計することが好ましい（ここで「センス」および「アンチセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよびその相補鎖を増幅するためのプライマーである。）。このようなプライミング部位は、それぞれ約１５塩基〜約４０塩基、好ましくは約１５塩基〜約３０塩基で、それらに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一般的条件を満たすように設計することが好ましい。
【００１２】
また、選抜後のアプタマーを適当なベクターにサブクローニングする必要がある場合、当該クローニングを容易にするために、該プライミング部位は適当な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしながら、図１に示す例のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オリゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプタマーの配列を決定することができる。
【００１３】
続くステップｓ２では、得られたｓｓＮｔライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔという場合もある。）を増幅する。このｄｓＮｔの増幅は、常法に従ってＰＣＲにて実施できる。
【００１４】
図１に示す例では、続くステップｓ３において、上記ＰＣＲにより増幅ｄｓＮｔライブラリーについてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行い、センス鎖（すなわち元のｓｓＮｔ）のみが増幅されたｓｓＮｔのプールを調製する。これは、アプタマーが、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子であるという構造的、配列的特徴に基づいて、標的物質への特異的な吸着能を有すると考えられており、したがって後述するステップｓ４〜ｓ６におけるアフィニティークロマトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖の状態で存在しなければならないためである。
【００１５】
非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製することができる。所望により、電気泳動に先立ってＰＣＲ産物をエタノール沈殿して濃縮することもできる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次構造を形成させる。
【００１６】
なお本発明においては、上記例のステップｓ２のＰＣＲおよびステップｓ３の非対称ＰＣＲに換えて、センスプライマーをアンチセンスプライマーに対して大過剰（たとえば５０〜１００：１程度）に加えてＰＣＲを行うことによって、センス鎖のみが増幅されたｓｓＮｔプールを調製してもよい。
【００１７】
続くステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、特定のペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。本発明において重要なことは、このアフィニティーカラムに固定化するペプチドとして、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチド、特にベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸、好ましくは５個〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを使用することである。かかるペプチドは、高次構造下では外側に位置しアプタマ−の認識が可能な部分であることが好ましい。ベロ毒素Ｉ型は、１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットとから形成されるが、これらＡサブユニット、Ｂサブユニットともにそのアミノ酸配列は当分野において公知である（Ａサブユニットは２９３個のアミノ酸からなり、Ｂサブユニットは６９個のアミノ酸からなる。）。本発明においては、このベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドを担体に固定化する。当該ペプチドはその大きさや親和性の強さ等により好ましくはベロ毒素Ｉ型の部分アミノ酸配列であり、より好ましくは、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を有するペプチドをアフィニティーカラムに固定化する。本発明において使用されるペプチドは、当業者が通常行うように、ペプチド自動合成装置で合成できるが、天然由来のものであっても、また半合成のものであってもかまわず、任意の方法により入手可能である。上記ベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配列におけるアミノ酸が３個未満であると、アフィニティークロマトグラフィーによりアプタマーを選抜するためのアフィニティーを充分に発揮することができないというような不具合がある。またベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配列におけるアミノ酸が３０個を超えると、該ペプチドの合成が困難となってしまい、また非特異的な吸着が増加してアプタマーの選抜が困難となってしまう不具合がある。当該ペプチドのアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＡサブユニット、Ｂサブユニットのどちら由来のアミノ酸配列であってもよい。
【００１８】
なお本発明において使用するペプチドは、上記のベロ毒素Ｉ型由来でアフィニティーの呈示を阻害しないものであればよい。例えばベロ毒素Ｉ型由来の３個〜３０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列（以下、「高アフィニティー領域」ということがある。）によるアフィニティーの呈示を阻害しないものであれば、Ｎ側末端および／またはＣ側末端にさらにアミノ酸残基を有していてよい。但し、上記高アフィニティー領域によるアフィニティーの観点からは、上記アミノ酸残基が付加されているか否かに関わらず、ペプチドの総アミノ酸数が３個〜３０個のアミノ酸を有するものであるのが好ましく、５個〜２５個のアミノ酸を有するものであるのがより好ましい。
【００１９】
本発明において使用されるペプチドにおける高アフィニティー領域は、下記のアミノ酸配列であることが好ましい。
N-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-Lys-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号１）
上記配列番号１のアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＢサブユニットの一部のアミノ酸配列であるが、高次構造をとるベロ毒素Ｉ型において外側に位置し、抗原性を呈示する領域であると考えられる。
【００２０】
また本発明においては、上記ペプチドは、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）を有し、該ヒスチジンタグを介して固定化されているのが好ましい。言い換えると、ペプチドの高アフィニティー領域を除く残余のアミノ酸残基において、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域のＮ側末端にある場合にはそのＮ側末端が、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域のＣ側末端にある場合にはそのＣ側末端が、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域の両方の末端にある場合にはそのＮ側末端またはＣ側末端が、ヒスチジンタグを有するものであり、このヒスチジンタグを介してアフィニティーカラムに固定化されているのが好ましい。上記ヒスチジンタグをさらに有することによって、ヒスチジンのイミダゾール基がニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体と強く結合することができ、さらにイミダゾールの添加またはｐＨの低下によって容易にアフィニティーリガンドの溶出が行えるので、ニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体を安定に保持した支持体を用いたアフィニティーカラムにより、調整が容易で安定したアフィニティークロマトグラフィーが可能となる。上記ニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体としては、従来公知のものを好適に使用することができる。本発明において使用されるペプチドは、上記の配列番号１のアミノ酸配列のＮ側末端に６個のヒスチジンが付加した配列からなり（配列表配列番号２）、ヒスチジンタグを介して、ニッケルイオン錯体との結合によってアフィニティーカラムに固定化されるのが好ましい。
【００２１】
本発明においては、ステップｓ４〜ｓ６のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに、上記ペプチドを固定化したビーズやゲル固相を充填したアフィニティーカラムを使用する。カラム充填剤としては、シリカゲル、セファロースゲルなどが挙げられる。
【００２２】
上記のようにステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。すなわち、ステップｓ４ではステップｓ３で得られた適切な二次構造をとったｓｓＮｔを、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムへアプライする処理、ステップｓ５ではアフィニティーカラムを洗浄して上記ペプチドに吸着しなかった核酸分子（以下、「非吸着核酸分子」ということがある。）を分離させる処理（洗浄処理）、ステップｓ６では上記ペプチドに特異的に吸着した核酸分子（以下、「吸着核酸分子」ということがある。）をアフィニティーカラムから溶出させる処理（溶出処理）が行われる。このように本発明におけるインビトロセレクション法は、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーを利用して、吸着核酸分子と非吸着核酸分子とを分離する。上記洗浄処理に用いる洗浄用の緩衝液、ならびに上記溶出処理に用いる溶出用の緩衝液は、当分野において従来から広く用いられてきているものをそれぞれ用いればよい。溶出用緩衝液は、洗浄用緩衝液にイミダゾールを添加したものであってもよい。
【００２３】
上記のようなステップｓ４〜ｓ６を経て得られた吸着核酸分子について、上記のＰＣＲ増幅（ステップｓ２）、非対称ＰＣＲ（ステップｓ３）および上記ペプチドを固定化してなるアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ステップｓ４〜ｓ６）のサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜１５回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得ることができる。
【００２４】
得られたアプタマーは、常法にしたがって二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限酵素認識部位を用いて、また平滑末端化して、あるいはＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクローニングすることができ、マキサム・ギルバート法またはジデオキシ法によりその塩基配列を決定することができる。あるいは得られた一本鎖アプタマーをサブクローニングすることなくダイレクトにシークエンスすることもできる。
【００２５】
上記のような本発明の方法によれば、従来取得が困難であった、ベロ毒素Ｉ型を標的物質として特異的に認識して吸着し得るアフィニティーリガンドを効率よく取得することができる。
【００２６】
ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得る本発明のアプタマーは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは約３０塩基〜約１２０塩基である。
【００２７】
本発明のアプタマーは、その好ましい実施態様において、配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号４０〜８８で示される塩基配列、配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３９〜８２で示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである。）を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」とは、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、あるいは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つベロ毒素Ｉ型特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味する。
【００２８】
上記の塩基配列を実質的に含む一本鎖核酸分子（アプタマー）は、上述した本発明の方法によって調製されたものでなくてもよく、いかなる方法によっても調製することができるが、上述した本発明の方法によって調製されたものであるのが好ましい。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
実施例１
〔１〕増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの作製
（１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）プライマーおよびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成した（ステップｓ１）。
鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N59-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’（配列番号７）
Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3' （配列番号８）
Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3' （配列番号９）
（２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（ステップｓ２）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応条件
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 １０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
（３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライマーに用いて非対称ＰＣＲを行った（ステップｓ３）。最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応条件
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 ４０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
【００３１】
ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイクロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテックスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０２５％ ＳＴＳ，０．０２５％キシレンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％ ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。
【００３２】
〔２〕アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（１）上記〔１〕で得られたＤＮＡをエタノール沈殿させ、減圧乾燥後、蒸留水１００μｌに溶解し、２×結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０））１００μｌを加えてよく混合し、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと自然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により二次構造の形成を確認した。
（２）ベロ毒素Ｉ型Ｂサブユニット内のペプチドを、ペプチド自動合成装置を用いて合成した。Ｎ側末端に６個のヒスチジンを付加して合成を行い、以下のアミノ酸配列の合成ペプチドを得た。
N-His-His-His-His-His-His-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-Lys-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号２）
（３）カラム材への上記ペプチドの固定化は、以下のように行った。１０μｇの上記ペプチドを１×結合バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０））８００μｌに溶解し、ＮＴＡ−Ｎｉ2+アガロースゲル２００μｌを加え、室温で１時間振盪した。固定化したゲルを８ｍｍ×５ｍｍのカラムに充填し、約２０倍量の１×結合バッファーで洗浄し、平衡化した（このときに出てくる液をベースラインとして用いた。）。
（４）上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムにアプライした後、コックを開いて溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムにアプライした（ステップｓ４）。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分間放置した。１×結合バッファー５ｍｌを注いでコックを開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ５）。一度コックを閉じた後、溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０）＋２５０ｍＭイミダゾール）を注ぎコックを開いた。溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作を３回繰り返すことによりバッファーを溶出バッファーで置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ６）。該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれグリコーゲン２μｌを加えた後、エタノール沈殿させ、減圧乾燥させた。該沈殿を水１５μｌによく溶解させた。
【００３３】
〔３〕ベロ毒素Ｉ型特異的ＤＮＡアプタマーの同定
上記〔１〕（２）〜〔２〕（４）の各操作（ステップｓ２〜ｓ６）の各操作を１２回繰り返して行った。該操作により選抜された５種のベロ毒素Ｉ型特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定した。
決定された各クローンのランダム領域の塩基配列は、以下のとおりであった。
クローン１：5'-GACATTTGAAACCGTCCTATACGGGTCGGTGGGCTTAGACGTCTTCTTCGCCCTAAATT-3’（配列番号３の塩基番号３８〜９６）
クローン２：5'-GTGTTGGGAGTTGGCCTTGGGCGACCCATGCACAGTAGGGCATCACGCTTGGGCTAAAC-3’（配列番号４の塩基番号３８〜９６）
クローン３：5'-AGGGTTTCGGGAGGTCAACTAATGGGTTGTCGTTTACTGGGCCGCCCAA-3’（配列番号５の塩基番号４０〜８８）
クローン４：5'-TTTAATTAATTCAAGTAAATCGGGCACCTTCGTCTCTTATGTTT-3’（配列番号６の塩基番号３９〜８２）
【００３４】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、ベロ毒素Ｉ型を標的分子として認識して特異的に吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することができる。本発明のアプタマーは、ベロ毒素Ｉ型を特異的に認識して吸着できるので、ベロ毒素Ｉ型の検出、定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好適に使用でき、極めて有用である。
【００３５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号４：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号５：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号６：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号７：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ
ＰＣＲプライミング部位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号９：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
【００３６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得る一本鎖核酸分子（アプタマー）ならびにその取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベロ毒素(Verotoxin)は、腸管出血性大腸菌が産生する毒素であり、アミノ酸配列の違いからＩ型とＩＩ型とに類別される。これら毒素は１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットとから形成されており、Ｂサブユニットにより腸管上皮細胞上に存在するレセプターを認識して結合し、細胞内でＡサブユニットがｒＲＮＡに結合してタンパク合成阻害を起こすことが知られている。ベロ毒素Ｉ型とベロ毒素ＩＩ型とは、生物学的性状が非常に類似しているが、物理化学的性状および免疫学的性状を互いに異にするものであり、ベロ毒素Ｉ型は、志賀赤痢菌（Shigella dysenterae）１型菌の産生する志賀毒素(Shiga toxin)と同一の毒素であり、Shiga-like toxin(SLT)などとも呼ばれるものである。このようなベロ毒素Ｉ型を選択的に認識することができる高アフィニティーリガンドの開発は、ベロ毒素Ｉ型の検出や定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好適に使用できる点から、非常に重要である。
【０００３】
従来、高アフィニティーリガンドを取得する方法としては、抗原抗体反応の高い特異性を利用して抗体を作製する手法が一般に採られていた。しかし毒素に対する抗体作製の場合、感作動物への毒性から、ホルムアルデヒド処理や熱処理により無毒化した形で免疫を行うのが常法である。ただしこの場合、上記処理による構造変化から、親和性の高いアフィニティーリガンドの取得は困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、腸管出血性大腸菌が産生するベロ毒素のＩ型を標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフィニティーリガンドを取得する方法およびアフィニティーリガンドを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、近年の進化分子工学の発達により開発された、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする、インビトロセレクション法（in vitro selection method）、あるいはＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）などと呼ばれる技術を利用して上記のアフィニティーリガンドを取得し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）アフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した担体を用いることを特徴とする方法。
（２）ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドが、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドである、上記（１）記載の方法。
（３）該ペプチドを固定化した担体を充填してなるアフィニティーカラムを用いることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（４）該ペプチドが、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである、上記（１）記載の方法。
（５）該ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介して担体に固定化されてなることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（６）上記（１）記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（７）アフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いることを特徴とする方法。
（８）上記ペプチドが、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものである、上記（７）記載の方法。
（９）上記ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介してアフィニティーカラムに固定化されていることを特徴とする、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（１１）ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｂ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｃ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号４０〜８８で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｄ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３９〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
（１２）核酸がＤＮＡである上記（１１）記載の一本鎖核酸分子。
【０００７】
本明細書において「インビトロセレクション法(in vitro selection method)」とは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の機能を有する（たとえば、標的物質に特異的に吸着する）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施することによって、特定の機能を有する核酸分子を取得する方法を指す。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の標的物質に特異的に吸着し得る核酸分子（アプタマー）を取得したい場合、上記吸着能を有する核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０００８】
また本明細書中における「アプタマー」とは、特定の標的物質に対する特異的な吸着能を有する一本鎖核酸分子を指すものとする。本明細書中におけるアプタマーは、上記のインビトロセレクション法によって取得されたものに限定されない。
【０００９】
本明細書において「アフィニティークロマトグラフィー」とは、生体物質の示す特異的な相互作用（親和性）を利用した分離法を指し、その分離手段は特に限定されず、通常当分野で実施される種々の手法が用いられる。具体的にはアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、当該方法は▲１▼標的物質を固定化した担体を充填したアフィニティーカラム（以下、便宜上標的物質を固定化したアフィニティーカラムということもある）に、該標的物質に特異的に吸着可能な物質および／または吸着できない物質をアプライする処理と、▲２▼アプライ後、洗浄用緩衝液にてカラムを洗浄して上記吸着可能物質と非吸着物質とを分離する処理（洗浄処理）と、▲３▼洗浄処理の後に溶出用緩衝液にて、吸着可能物質とカラムに固定化した標的物質との間の結合力を弱めて、吸着可能物質を溶出させる処理（溶出処理）とを少なくとも含有するものとする。ここで、標的物質を固定化する担体としては、アフィニティークロマトグラフィー、特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーで用いられる公知のものが挙げられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
まずステップｓ１では、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って約３０塩基〜約８０塩基の予め決められた長さのランダム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮｔという場合もある。）のライブラリーを作成する。該ライブラリーには１０13〜１０14種類もしくはそれ以上のｓｓＮｔが含まれていることが好ましい。
【００１１】
後述するステップｓ２、ｓ３におけるＰＣＲ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアンチセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設計することが好ましい（ここで「センス」および「アンチセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよびその相補鎖を増幅するためのプライマーである。）。このようなプライミング部位は、それぞれ約１５塩基〜約４０塩基、好ましくは約１５塩基〜約３０塩基で、それらに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一般的条件を満たすように設計することが好ましい。
【００１２】
また、選抜後のアプタマーを適当なベクターにサブクローニングする必要がある場合、当該クローニングを容易にするために、該プライミング部位は適当な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしながら、図１に示す例のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オリゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプタマーの配列を決定することができる。
【００１３】
続くステップｓ２では、得られたｓｓＮｔライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔという場合もある。）を増幅する。このｄｓＮｔの増幅は、常法に従ってＰＣＲにて実施できる。
【００１４】
図１に示す例では、続くステップｓ３において、上記ＰＣＲにより増幅ｄｓＮｔライブラリーについてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行い、センス鎖（すなわち元のｓｓＮｔ）のみが増幅されたｓｓＮｔのプールを調製する。これは、アプタマーが、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子であるという構造的、配列的特徴に基づいて、標的物質への特異的な吸着能を有すると考えられており、したがって後述するステップｓ４〜ｓ６におけるアフィニティークロマトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖の状態で存在しなければならないためである。
【００１５】
非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製することができる。所望により、電気泳動に先立ってＰＣＲ産物をエタノール沈殿して濃縮することもできる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次構造を形成させる。
【００１６】
なお本発明においては、上記例のステップｓ２のＰＣＲおよびステップｓ３の非対称ＰＣＲに換えて、センスプライマーをアンチセンスプライマーに対して大過剰（たとえば５０〜１００：１程度）に加えてＰＣＲを行うことによって、センス鎖のみが増幅されたｓｓＮｔプールを調製してもよい。
【００１７】
続くステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、特定のペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。本発明において重要なことは、このアフィニティーカラムに固定化するペプチドとして、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチド、特にベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸、好ましくは５個〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを使用することである。かかるペプチドは、高次構造下では外側に位置しアプタマ−の認識が可能な部分であることが好ましい。ベロ毒素Ｉ型は、１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットとから形成されるが、これらＡサブユニット、Ｂサブユニットともにそのアミノ酸配列は当分野において公知である（Ａサブユニットは２９３個のアミノ酸からなり、Ｂサブユニットは６９個のアミノ酸からなる。）。本発明においては、このベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチドを担体に固定化する。当該ペプチドはその大きさや親和性の強さ等により好ましくはベロ毒素Ｉ型の部分アミノ酸配列であり、より好ましくは、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を選択し、このアミノ酸配列を有するペプチドをアフィニティーカラムに固定化する。本発明において使用されるペプチドは、当業者が通常行うように、ペプチド自動合成装置で合成できるが、天然由来のものであっても、また半合成のものであってもかまわず、任意の方法により入手可能である。上記ベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配列におけるアミノ酸が３個未満であると、アフィニティークロマトグラフィーによりアプタマーを選抜するためのアフィニティーを充分に発揮することができないというような不具合がある。またベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配列におけるアミノ酸が３０個を超えると、該ペプチドの合成が困難となってしまい、また非特異的な吸着が増加してアプタマーの選抜が困難となってしまう不具合がある。当該ペプチドのアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＡサブユニット、Ｂサブユニットのどちら由来のアミノ酸配列であってもよい。
【００１８】
なお本発明において使用するペプチドは、上記のベロ毒素Ｉ型由来でアフィニティーの呈示を阻害しないものであればよい。例えばベロ毒素Ｉ型由来の３個〜３０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列（以下、「高アフィニティー領域」ということがある。）によるアフィニティーの呈示を阻害しないものであれば、Ｎ側末端および／またはＣ側末端にさらにアミノ酸残基を有していてよい。但し、上記高アフィニティー領域によるアフィニティーの観点からは、上記アミノ酸残基が付加されているか否かに関わらず、ペプチドの総アミノ酸数が３個〜３０個のアミノ酸を有するものであるのが好ましく、５個〜２５個のアミノ酸を有するものであるのがより好ましい。
【００１９】
本発明において使用されるペプチドにおける高アフィニティー領域は、下記のアミノ酸配列であることが好ましい。
N-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-Lys-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号１）
上記配列番号１のアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＢサブユニットの一部のアミノ酸配列であるが、高次構造をとるベロ毒素Ｉ型において外側に位置し、抗原性を呈示する領域であると考えられる。
【００２０】
また本発明においては、上記ペプチドは、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）を有し、該ヒスチジンタグを介して固定化されているのが好ましい。言い換えると、ペプチドの高アフィニティー領域を除く残余のアミノ酸残基において、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域のＮ側末端にある場合にはそのＮ側末端が、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域のＣ側末端にある場合にはそのＣ側末端が、該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域の両方の末端にある場合にはそのＮ側末端またはＣ側末端が、ヒスチジンタグを有するものであり、このヒスチジンタグを介してアフィニティーカラムに固定化されているのが好ましい。上記ヒスチジンタグをさらに有することによって、ヒスチジンのイミダゾール基がニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体と強く結合することができ、さらにイミダゾールの添加またはｐＨの低下によって容易にアフィニティーリガンドの溶出が行えるので、ニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体を安定に保持した支持体を用いたアフィニティーカラムにより、調整が容易で安定したアフィニティークロマトグラフィーが可能となる。上記ニッケルイオン錯体またはコバルトイオン錯体としては、従来公知のものを好適に使用することができる。本発明において使用されるペプチドは、上記の配列番号１のアミノ酸配列のＮ側末端に６個のヒスチジンが付加した配列からなり（配列表配列番号２）、ヒスチジンタグを介して、ニッケルイオン錯体との結合によってアフィニティーカラムに固定化されるのが好ましい。
【００２１】
本発明においては、ステップｓ４〜ｓ６のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに、上記ペプチドを固定化したビーズやゲル固相を充填したアフィニティーカラムを使用する。カラム充填剤としては、シリカゲル、セファロースゲルなどが挙げられる。
【００２２】
上記のようにステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。すなわち、ステップｓ４ではステップｓ３で得られた適切な二次構造をとったｓｓＮｔを、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムへアプライする処理、ステップｓ５ではアフィニティーカラムを洗浄して上記ペプチドに吸着しなかった核酸分子（以下、「非吸着核酸分子」ということがある。）を分離させる処理（洗浄処理）、ステップｓ６では上記ペプチドに特異的に吸着した核酸分子（以下、「吸着核酸分子」ということがある。）をアフィニティーカラムから溶出させる処理（溶出処理）が行われる。このように本発明におけるインビトロセレクション法は、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーを利用して、吸着核酸分子と非吸着核酸分子とを分離する。上記洗浄処理に用いる洗浄用の緩衝液、ならびに上記溶出処理に用いる溶出用の緩衝液は、当分野において従来から広く用いられてきているものをそれぞれ用いればよい。溶出用緩衝液は、洗浄用緩衝液にイミダゾールを添加したものであってもよい。
【００２３】
上記のようなステップｓ４〜ｓ６を経て得られた吸着核酸分子について、上記のＰＣＲ増幅（ステップｓ２）、非対称ＰＣＲ（ステップｓ３）および上記ペプチドを固定化してなるアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ステップｓ４〜ｓ６）のサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜１５回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得ることができる。
【００２４】
得られたアプタマーは、常法にしたがって二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限酵素認識部位を用いて、また平滑末端化して、あるいはＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクローニングすることができ、マキサム・ギルバート法またはジデオキシ法によりその塩基配列を決定することができる。あるいは得られた一本鎖アプタマーをサブクローニングすることなくダイレクトにシークエンスすることもできる。
【００２５】
上記のような本発明の方法によれば、従来取得が困難であった、ベロ毒素Ｉ型を標的物質として特異的に認識して吸着し得るアフィニティーリガンドを効率よく取得することができる。
【００２６】
ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得る本発明のアプタマーは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは約３０塩基〜約１２０塩基である。
【００２７】
本発明のアプタマーは、その好ましい実施態様において、配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号４０〜８８で示される塩基配列、配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３９〜８２で示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである。）を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」とは、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、あるいは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つベロ毒素Ｉ型特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味する。
【００２８】
上記の塩基配列を実質的に含む一本鎖核酸分子（アプタマー）は、上述した本発明の方法によって調製されたものでなくてもよく、いかなる方法によっても調製することができるが、上述した本発明の方法によって調製されたものであるのが好ましい。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
実施例１
〔１〕増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの作製
（１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）プライマーおよびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成した（ステップｓ１）。
鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N59-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’（配列番号７）
Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3' （配列番号８）
Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3' （配列番号９）
（２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（ステップｓ２）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 １０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
（３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライマーに用いて非対称ＰＣＲを行った（ステップｓ３）。最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 ４０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
【００３１】
ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイクロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテックスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０２５％ ＳＴＳ，０．０２５％キシレンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％ ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。
【００３２】
〔２〕アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（１）上記〔１〕で得られたＤＮＡをエタノール沈殿させ、減圧乾燥後、蒸留水１００μｌに溶解し、２×結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０））１００μｌを加えてよく混合し、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと自然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により二次構造の形成を確認した。
（２）ベロ毒素Ｉ型Ｂサブユニット内のペプチドを、ペプチド自動合成装置を用いて合成した。Ｎ側末端に６個のヒスチジンを付加して合成を行い、以下のアミノ酸配列の合成ペプチドを得た。
N-His-His-His-His-His-His-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-Lys-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号２）
（３）カラム材への上記ペプチドの固定化は、以下のように行った。１０μｇの上記ペプチドを１×結合バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０））８００μｌに溶解し、ＮＴＡ−Ｎｉ2+アガロースゲル２００μｌを加え、室温で１時間振盪した。固定化したゲルを８ｍｍ×５ｍｍのカラムに充填し、約２０倍量の１×結合バッファーで洗浄し、平衡化した（このときに出てくる液をベースラインとして用いた。）。
（４）上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムにアプライした後、コックを開いて溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムにアプライした（ステップｓ４）。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分間放置した。１×結合バッファー５ｍｌを注いでコックを開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ５）。一度コックを閉じた後、溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０）＋２５０ｍＭイミダゾール）を注ぎコックを開いた。溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作を３回繰り返すことによりバッファーを溶出バッファーで置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ６）。該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれグリコーゲン２μｌを加えた後、エタノール沈殿させ、減圧乾燥させた。該沈殿を水１５μｌによく溶解させた。
【００３３】
〔３〕ベロ毒素Ｉ型特異的ＤＮＡアプタマーの同定
上記〔１〕（２）〜〔２〕（４）の各操作（ステップｓ２〜ｓ６）の各操作を１２回繰り返して行った。該操作により選抜された５種のベロ毒素Ｉ型特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定した。
決定された各クローンのランダム領域の塩基配列は、以下のとおりであった。
クローン１：5'-GACATTTGAAACCGTCCTATACGGGTCGGTGGGCTTAGACGTCTTCTTCGCCCTAAATT-3’（配列番号３の塩基番号３８〜９６）
クローン２：5'-GTGTTGGGAGTTGGCCTTGGGCGACCCATGCACAGTAGGGCATCACGCTTGGGCTAAAC-3’（配列番号４の塩基番号３８〜９６）
クローン３：5'-AGGGTTTCGGGAGGTCAACTAATGGGTTGTCGTTTACTGGGCCGCCCAA-3’（配列番号５の塩基番号４０〜８８）
クローン４：5'-TTTAATTAATTCAAGTAAATCGGGCACCTTCGTCTCTTATGTTT-3’（配列番号６の塩基番号３９〜８２）
【００３４】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、ベロ毒素Ｉ型を標的分子として認識して特異的に吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することができる。本発明のアプタマーは、ベロ毒素Ｉ型を特異的に認識して吸着できるので、ベロ毒素Ｉ型の検出、定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好適に使用でき、極めて有用である。
【００３５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号４：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号５：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号６：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号７：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ
ＰＣＲプライミング部位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号９：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
【００３６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
Claims (1)
- ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖ＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列
（ｂ）配列表配列番号４に示される塩基配列
（ｃ）配列表配列番号５に示される塩基配列
（ｄ）配列表配列番号６に示される塩基配列
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
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