JP4180315B2 - ビスフェノールａに特異的に吸着し得るアプタマーおよびその取得法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフェノールＡに特異的に吸着し得る一本鎖核酸分子（アプタマー）ならびにその取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある種の化学物質が環境中に放出されると、ヒトや野生動物の生殖に悪影響を及ぼすことが知られている。このような化学物質は、生体がもつホルモンと類似の作用を示し、これが野生動物やヒトの内分泌作用を撹乱すると考えられていることから、「内分泌撹乱物質」と呼ばれている（「環境ホルモン」とも通称される。）。この内分泌撹乱物質の疑いがある化学物質の中で、身近に使用されている代表的なものとして、ビスフェノールＡがある。
【０００３】
ビスフェノールＡは、酸性触媒の存在下でフェノールとアセトンとの縮合反応によって製造される対称型２価フェノールであり、ポリカーボネート樹脂やエポキシ樹脂などの汎用プラスチックの原料として広く用いられている。ポリカーボネート樹脂は、たとえば哺乳瓶や給食用の食器、コンパクトディスク（ＣＤ）、携帯電話、ＯＡ機器などに使用されている。エポキシ樹脂は、たとえば缶詰や水道配管などの腐食防止用被覆材、接着剤、電気製品の配線基板などに使用されている。
【０００４】
上記樹脂製品の中には未反応のビスフェノールＡが含まれているが、樹脂製品の使用状況によっては、ビスフェノールＡが環境中に溶出する。樹脂製品から溶出したレベルのビスフェノールＡが生体に及ぼす悪影響については現時点では不明であるが、内分泌撹乱物質との疑いが持たれている該ビスフェノールＡを研究するための道具として、異なる低分子量の有機化合物の中からビスフェノールＡを選択的に認識することができる高アフィニティーリガンドの開発は非常に重要である。
【０００５】
近年、進化分子工学の発達により、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする技術が開発された。この方法は、インビトロセレクション法（in vitro selection method）、あるいはＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）などと呼ばれ、この方法を用いた、抗体よりも迅速且つ容易な高アフィニティーリガンドの調製が数多く報告されている（例えば、Nature, 355: 564 (1992) 、国際特許出願WO92/14843号公報、特開平8-252100号公報(EP 0533838)、特開平9-216895号公報(US 5780449)等）。
【０００６】
しかし、低分子量の有機化合物の認識においては、分子量が小さくエピトープ部分が限られる事から、アフィニティーリガンドを取得する事は一般的に困難とされており、ビスフェノールＡについても、未だそれを選択的に認識し得る高アフィニティーアプタマーを得るに至っていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、内分泌撹乱物質の疑いが持たれているビスフェノールＡを標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。本発明は以下のとおりである。
（１）ビスフェノールＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によってビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出処理を行うことを特徴とする方法。
（２）両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける洗浄処理を行うことを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）ビスフェノールＡを固定化した担体を充填してなるアフィニティーカラムを用いることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（４）該両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液が、２％〜５０％の両性有機溶媒を含有するものである、上記（１）記載の方法。
（５）該両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液が、２％〜５０％の両性有機溶媒を含有するものである、上記（２）記載の方法。
（６）両性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランおよびエタノールのうちから選ばれる少なくともいずれかであることを特徴とする上記（１）または（２）記載の方法。
（７）上記（１）記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（８）ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によってビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
２％〜５０％の両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出処理を行うことを特徴とする方法。
（９）２％〜５０％の両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける洗浄処理を行うことを特徴とする上記（８）記載の方法。
（１０）上記両性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランおよびエタノールのうちから選ばれる少なくともいずれかであることを特徴とする上記（８）または（９）に記載の方法。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（１２）ビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｃ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９１で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｄ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｅ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号３８〜９４で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｆ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｇ）配列表配列番号７に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｈ）配列表配列番号８に示される塩基配列中塩基番号３８〜８７で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｉ）配列表配列番号９に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｊ）配列表配列番号１０に示される塩基配列中塩基番号３８〜８６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｋ）配列表配列番号１１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９７で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｌ）上記（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
（１３）核酸がＤＮＡである上記（１２）に記載の一本鎖核酸分子。
【０００９】
本明細書において「インビトロセレクション法(in vitro selection method)」とは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の機能を有する（たとえば、標的物質に特異的に吸着し得る）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施することによって、特定の機能を有する核酸分子を取得する方法を指す。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の標的物質に特異的に吸着し得る核酸分子（アプタマー）を取得したい場合、上記吸着能を有する核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
また本明細書中における「アプタマー」とは、特定の標的物質に対する特異的な吸着能を有する一本鎖核酸分子を指すものとする。本明細書中におけるアプタマーは、上記のインビトロセレクション法によって取得されたものに限定されない。
【００１０】
本明細書において「アフィニティークロマトグラフィー」とは、生体物質の示す特異的な相互作用（親和性）を利用した分離法を指し、その分離手段は特に限定されず、通常当分野で実施される種々の手法が用いられる。具体的にはアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、当該方法は▲１▼標的物質を固定化した担体を充填したアフィニティーカラム（以下、便宜上標的物質を固定化したアフィニティーカラムということもある）に、該標的物質に特異的に吸着可能な物質および／または吸着できない物質をアプライする処理と、▲２▼アプライ後、洗浄用緩衝液にてカラムを洗浄して上記吸着可能物質と非吸着物質とを分離する処理（洗浄処理）と、▲３▼洗浄処理の後に溶出用緩衝液にて、吸着可能物質とカラムに固定化した標的物質との間の結合力を弱めて、吸着可能物質を溶出させる処理（溶出処理）とを少なくとも含有するものとする。ここで、標的物質を固定化する担体としては、アフィニティークロマトグラフィー、特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーで用いられる公知のものが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
まずステップｓ１では、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って約３０塩基〜約８０塩基の予め決められた長さのランダム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮｔという場合もある。）のライブラリーを作成する。該ライブラリーには１０13〜１０14種類もしくはそれ以上のｓｓＮｔが含まれていることが好ましい。
【００１２】
後述するステップｓ２，ｓ３におけるＰＣＲ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアンチセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設計することが好ましい（ここで「センス」および「アンチセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよびその相補鎖を増幅するためのプライマーである。）。このようなプライミング部位は、それぞれ約１５塩基〜約４０塩基、好ましくは約１５塩基〜約３０塩基で、それらに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一般的条件を満たすように設計することが好ましい。
また、選抜後のアプタマーを適当なベクターにサブクローニングする必要がある場合、当該クローニングを容易にするために、該プライミング部位は適当な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしながら、図１に示す例のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オリゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプタマーの配列を決定することができる。
【００１３】
続くステップｓ２では、得られたｓｓＮｔライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔという場合もある。）を増幅する。このｄｓＮｔの増幅は、常法に従ってＰＣＲにて実施できる。
【００１４】
図１に示す例では、続くステップｓ３において、上記ＰＣＲにより増幅ｄｓＮｔライブラリーについてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行い、センス鎖（すなわち元のｓｓＮｔ）のみが増幅されたｓｓＮｔのプールを調製する。これは、アプタマーが、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子であるという構造的、配列的特徴に基づいて、標的物質への特異的な吸着能を有すると考えられており、したがって後述するステップｓ４〜ｓ６におけるビスフェノールＡカラムアフィニティークロマトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖の状態で存在しなければならないためである。
【００１５】
非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製することができる。所望により、電気泳動に先立ってＰＣＲ産物をエタノール沈殿して濃縮することもできる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次構造を形成させる。
【００１６】
なお本発明においては、上記例のステップｓ２のＰＣＲおよびステップｓ３の非対称ＰＣＲに換えて、センスプライマーをアンチセンスプライマーに対して大過剰（たとえば５０〜１００：１程度）に加えてＰＣＲを行うことによって、センス鎖のみが増幅されたｓｓＮｔプールを調製してもよい。
【００１７】
続くステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。すなわち、ステップｓ４ではステップｓ３で得られた適切な二次構造をとったｓｓＮｔを、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムへアプライする処理、ステップｓ５ではアフィニティーカラムを洗浄してビスフェノールＡに吸着しなかった核酸分子（以下、「非吸着核酸分子」ということがある。）を分離させる処理（洗浄処理）、ステップｓ６ではビスフェノールＡに特異的に吸着した核酸分子（以下、「吸着核酸分子」ということがある。）をアフィニティーカラムから溶出させる処理（溶出処理）が行われる。このように本発明におけるインビトロセレクション法は、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーを利用して、吸着核酸分子と非吸着核酸分子とを分離する。ステップｓ４でｓｓＮｔをアプライするアフィニティーカラムとしては、従来公知の方法によって、ビスフェノールＡを予め固定化したビーズやゲル固相を充填したカラムを用いればよい。
【００１８】
本発明において重要なことは、両性有機溶媒を含有する緩衝液を用いて、少なくともステップｓ６の溶出処理を行うことである。好ましくは、両性有機溶媒を２％〜５０％、好ましくは５％〜４０％含有する緩衝液を用いて、少なくともステップｓ６の溶出処理を行うことである。上記「両性有機溶媒」とは、活性溶媒のうちで、酸性と塩基性とを共に有し、かつそのいずれもが顕著ではないような有機溶媒をいう。本発明においては、たとえばジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール、メタノールなどを用いる。上記中でも、ビスフェノールＡの溶解性やカラムマトリックスの耐性などの観点から、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびエタノールから選ばれる両性有機溶媒を用いるのが好ましい。両性有機溶媒は、上記で例示した互いに異なる両性有機溶媒の混合物であってもよい。ここで、本発明において標的物質とされるビスフェノールＡは、芳香環を有する対称構造の化学物質であり、水に不溶な性質を有する。したがって、水も両性溶媒ではあるが本発明においてはこれを使用せず、アフィニティーカラムに固定化されたビスフェノールＡに特異的に吸着した吸着核酸分子を拮抗溶出させるために、ビスフェノールＡを溶解し得る上記の両性有機溶媒を溶出用の緩衝液に使用する。
【００１９】
ステップｓ６における拮抗溶出用の緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が２％未満であると、アプタマーの選択効率が低下するという問題が発生する。また拮抗溶出用緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が５０％を超えると、核酸が沈殿してしまう、カラム樹脂が変性してしまうなどカラムマトリックスに悪影響を与えてしまう。なお上記濃度は、緩衝液の体積あたりの両性有機溶媒の体積の割合（体積％（ｖ／ｖ））である。また両性有機溶媒が混合物である場合には、上記濃度は混合物全体の最終濃度を指すものとする。
【００２０】
また本発明においては、さらにステップｓ５の洗浄処理においても、両性有機溶媒を含有する緩衝液、好ましくは両性有機溶媒を２％〜５０％、好ましくは５％〜３０％含有する緩衝液を用いることが好ましい。洗浄用の緩衝液に用いられる両性有機溶媒としては、上述した拮抗溶出用緩衝液と同様のものが挙げられ、中でもビスフェノールＡの溶解性やカラムマトリックスの耐性の観点から、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびエタノールから選ばれる両性有機溶媒を用いるのが好ましい。洗浄用緩衝液中における両性有機溶媒と、拮抗溶出用緩衝液中における両性有機溶媒とは、同じものを用いても、互いに異なるものを用いてもよい。
【００２１】
ステップｓ５における洗浄用の緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が２％未満であると、アプタマーの選択効率が低下するという傾向にあるため好ましくない。また洗浄用緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が５０％を超えると、カラム樹脂が変性してしまうなどカラムマトリックスに悪影響を与えてしまう傾向にあるため好ましくない。
【００２２】
上記のようなステップｓ４〜ｓ６を経て得られた吸着核酸分子について、上記のＰＣＲ増幅（ステップｓ２）、非対称ＰＣＲ（ステップｓ３）およびビスフェノールアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ステップｓ４〜ｓ６）のサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜１５回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得ることができる。
【００２３】
得られたアプタマーは、常法にしたがって二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限酵素認識部位を用いて、また平滑末端化して、あるいはＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクローニングすることができ、マキサム・ギルバート法またはジデオキシ法によりその塩基配列を決定することができる。あるいは得られた一本鎖アプタマーをサブクローニングすることなくダイレクトにシークエンスすることもできる。
【００２４】
上記のような本発明の方法によれば、従来取得が困難であった、水に不溶な低分子量の有機化合物であるビスフェノールＡを標的物質として特異的に認識して吸着し得るアプタマーを効率よく取得することができる。
【００２５】
ビスフェノールＡに特異的に吸着し得る本発明のアプタマーは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは約３０塩基〜約１２０塩基である。
【００２６】
本発明のアプタマーは、その好ましい実施態様において、配列表配列番号１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９１で示される塩基配列、配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列、配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号３８〜９４で示される塩基配列、配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号７に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列、配列表配列番号８に示される塩基配列中塩基番号３８〜８７で示される塩基配列、配列表配列番号９に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号１０に示される塩基配列中塩基番号３８〜８６で示される塩基配列、配列表配列番号１１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９７で示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである。）を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」とは、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、あるいは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つビスフェノールＡ特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味する。
【００２７】
上記の塩基配列を実質的に含む一本鎖核酸分子（アプタマー）は、上述した本発明の方法によって調製されたものでなくてもよく、いかなる方法によっても調製することができるが、上述した本発明の方法によって調製されたものであるのが好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
実施例１
〔１〕増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの作製
（１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）プライマーおよびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成した（ステップｓ１）。
鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N59-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’（配列番号12）
Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3' （配列番号13）
Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3' （配列番号14）
（２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（ステップｓ２）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
反応条件
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 １０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分（３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライマーに用いて非対称ＰＣＲを行った（ステップｓ３）。最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
反応条件
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 ４０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
【００３０】
ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイクロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテックスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０２５％ ＳＴＳ，０．０２５％キシレンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％ ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。
【００３１】
〔２〕アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（１）上記〔１〕で得られたＤＮＡをエタノール沈殿させ、減圧乾燥後、蒸留水１００μｌに溶解し、２×結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０），１０％ジオキサン（ｐＨ８．０））１００μｌを加えてよく混合し、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと自然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により二次構造の形成を確認した。
（２）カラムへのビスフェノールＡ固定化は以下のように行った。まず、炭酸カリウムを塩基性触媒とし、ビスフェノールＡと４−ブロモ−ｎ−酪酸エチルエステルのカップリング反応を行った。反応条件はジメチルホルムアミド中、室温にて、４時間攪拌を続けた。反応後、薄層クロマトグラフィーにて生成物を確認した後、生成物をエーテルで抽出した。副生成物を除くために反応物をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０（ＭＥＲＣＫ社製）にて精製した。次に、得られた化合物のアルカリ加水分解を行った。反応条件は９５％エタノール中、水酸化ナトリウム存在下にて還流を２時間続けた。反応後のサンプルを薄膜クロマトグラフィーに供し、基質が完全に加水分解したことを確認した。最後に、カルボジイミドを用いたカップリング反応にて合成したビスフェノールＡ誘導体をＥＡＨセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア社製）に固定化した。固定化の結果、ゲル１ｍｌあたり７．９６μｍｏｌのビスフェノールＡが結合した。固定化した樹脂を８ｍｍ×５ｍｍのカラムに充填し、約２０倍量の水で洗浄、さらに約２０倍量の１×結合バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５％ジオキサン（ｐＨ８．０））で平衡化した（このとき出てくる液をベースラインとして用いた。）。
（３）上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムにアプライした後、コックを開いて溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムにアプライした（ステップｓ４）。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分間放置した。１×結合バッファー（洗浄用緩衝液）５ｍｌを注いでコックを開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ５）。一度コックを閉じた後、溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，３０％ジオキサン（ｐＨ８．０），３５．１ｍＭビスフェノールＡ）（拮抗溶出用緩衝液）を注ぎコックを開いた。溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作を３回繰り返すことによりバッファーを溶出バッファーで置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ６）。該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれにグリコーゲンを２μｌ加えた後、エタノールを沈殿させ、減圧乾燥させた。該沈殿を水１５μｌによく溶解させた。
【００３２】
〔３〕ビスフェノールＡ特異的ＤＮＡアプタマーの同定
上記〔１〕（２）〜〔２〕（３）の各操作（ステップｓ２〜ｓ６）の各操作を１２回繰り返して行った。該操作により選抜された１３種のビスフェノールＡ特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定した。
決定された各クローンのランダム領域の塩基配列は、以下のとおりであった。クローン１：5'-TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTTTTTATTTCTGGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3’（配列番号１の塩基番号３８〜９６）
クローン２：5'-CAAGGGCCGAGCGTACCTGGTTTGCTCGTTTTTTGTCGAATTTTTGGCGCCTTATATTT-3’（配列番号２の塩基番号３８〜９６）
クローン３：5'-TTGTGTAGGATTTAGGGGATATTTTTTATCTTATTCTTTGACGCGCAAATTCTA-3’（配列番号３の塩基番号３８〜９１）
クローン４：5'-AAAGTGGCCTGCAATCCCTCGGTATTTTAGTCTTTTGTTTTTGCTGTATTCCTTTCAT-3’（配列番号４の塩基番号３８〜９５）
クローン５：5'-GGCCTGTATGGCATGCTGCGCTATTTTCACTCACATGTTCTTTTTATTCTTTTGGTT-3’（配列番号５の塩基番号３８〜９４）
クローン６：5'-GGTCCATTCAGCCTCTATTAATCCCCTAGTCTACTACTTTTCTCGTCTGGTTTTCTTTC-3’（配列番号６の塩基番号３８〜９６）
クローン７：5'-GGTGAATCAGTCTCTTATCATTTTTTCGATTCTTAGCCGGATTAACAATTCTTTACTC-3’（配列番号７の塩基番号３８〜９５）
クローン８：5'-GGATGTGGTCTTTATTTTTGTATCCTCGGCATCCTCCTCCGGCCCGTTCC-3’（配列番号８の塩基番号３８〜８７）
クローン９：5'-TCTCGAATATTATTTTCCCGTAAACTCTTCGGAGGGTAGCCATTTTTCCTCGTTGAGTA-3’（配列番号９の塩基番号３８〜９６）
クローン１０：5'-GATATTTAGGGCGCGTCCGGCACCTTTTATTTTTTCTTGATTGGTTTTT-3’（配列番号１０の塩基番号３８〜８６）
クローン１１：5'-GATTGTTGCGGAGTTCTGTTTTCTTTGGCGGTTATTTTTTCTATTTCTTAGCAGGTCGAC-3’（配列番号１１の塩基番号３８〜９７）
【００３３】
比較例１
上記〔２〕（３）における溶出バッファー（拮抗溶出用緩衝液）に換えて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％ジオキサン（ｐＨ８．０）およびビスフェノールＡからなるバッファーを用いた以外は実施例１と同様にしたところ、ビスフェノールＡが溶解しなかったため、カラムマトリックスからのアプタマーの回収が不能であった。
【００３４】
比較例２
上記〔２〕（３）における溶出バッファー（拮抗溶出用緩衝液）に換えて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０％ジオキサン（ｐＨ８．０）および３５．１ｍＭビスフェノールＡからなるバッファーを用いた以外は実施例１と同様にしたところ、溶出処理時に核酸分子が凝集沈殿してしまい、カラムより溶出を行うことができず、アプタマーの回収が不能であった。
【００３５】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、ビスフェノールＡを標的分子として認識して特異的に吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することができる。本発明のアプタマーは、ビスフェノールＡを特異的に認識して吸着できるので、ビスフェノールＡの検出、定量に使用することができる他、内分泌撹乱物質の疑いのあるビスフェノールＡの生体へ及ぼす影響の研究などへの応用が可能であり、極めて有用である。
【００３６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号２：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号３：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号４：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号５：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号６：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号７：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号８：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号９：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１０：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１１：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１２：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ
ＰＣＲプライミング部位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮＡ。
配列番号１３：配列番号１２のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号１２のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフェノールＡに特異的に吸着し得る一本鎖核酸分子（アプタマー）ならびにその取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある種の化学物質が環境中に放出されると、ヒトや野生動物の生殖に悪影響を及ぼすことが知られている。このような化学物質は、生体がもつホルモンと類似の作用を示し、これが野生動物やヒトの内分泌作用を撹乱すると考えられていることから、「内分泌撹乱物質」と呼ばれている（「環境ホルモン」とも通称される。）。この内分泌撹乱物質の疑いがある化学物質の中で、身近に使用されている代表的なものとして、ビスフェノールＡがある。
【０００３】
ビスフェノールＡは、酸性触媒の存在下でフェノールとアセトンとの縮合反応によって製造される対称型２価フェノールであり、ポリカーボネート樹脂やエポキシ樹脂などの汎用プラスチックの原料として広く用いられている。ポリカーボネート樹脂は、たとえば哺乳瓶や給食用の食器、コンパクトディスク（ＣＤ）、携帯電話、ＯＡ機器などに使用されている。エポキシ樹脂は、たとえば缶詰や水道配管などの腐食防止用被覆材、接着剤、電気製品の配線基板などに使用されている。
【０００４】
上記樹脂製品の中には未反応のビスフェノールＡが含まれているが、樹脂製品の使用状況によっては、ビスフェノールＡが環境中に溶出する。樹脂製品から溶出したレベルのビスフェノールＡが生体に及ぼす悪影響については現時点では不明であるが、内分泌撹乱物質との疑いが持たれている該ビスフェノールＡを研究するための道具として、異なる低分子量の有機化合物の中からビスフェノールＡを選択的に認識することができる高アフィニティーリガンドの開発は非常に重要である。
【０００５】
近年、進化分子工学の発達により、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマーをスクリーニングする技術が開発された。この方法は、インビトロセレクション法（in vitro selection method）、あるいはＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）などと呼ばれ、この方法を用いた、抗体よりも迅速且つ容易な高アフィニティーリガンドの調製が数多く報告されている（例えば、Nature, 355: 564 (1992) 、国際特許出願WO92/14843号公報、特開平8-252100号公報(EP 0533838)、特開平9-216895号公報(US 5780449)等）。
【０００６】
しかし、低分子量の有機化合物の認識においては、分子量が小さくエピトープ部分が限られる事から、アフィニティーリガンドを取得する事は一般的に困難とされており、ビスフェノールＡについても、未だそれを選択的に認識し得る高アフィニティーアプタマーを得るに至っていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、内分泌撹乱物質の疑いが持たれているビスフェノールＡを標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。本発明は以下のとおりである。
（１）ビスフェノールＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によってビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出処理を行うことを特徴とする方法。
（２）両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける洗浄処理を行うことを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）ビスフェノールＡを固定化した担体を充填してなるアフィニティーカラムを用いることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（４）該両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液が、２％〜５０％の両性有機溶媒を含有するものである、上記（１）記載の方法。
（５）該両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液が、２％〜５０％の両性有機溶媒を含有するものである、上記（２）記載の方法。
（６）両性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランおよびエタノールのうちから選ばれる少なくともいずれかであることを特徴とする上記（１）または（２）記載の方法。
（７）上記（１）記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（８）ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用したインビトロセレクション法によってビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、
２％〜５０％の両性有機溶媒を含有する拮抗溶出用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける溶出処理を行うことを特徴とする方法。
（９）２％〜５０％の両性有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液を用いて、上記アフィニティークロマトグラフィーにおける洗浄処理を行うことを特徴とする上記（８）記載の方法。
（１０）上記両性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランおよびエタノールのうちから選ばれる少なくともいずれかであることを特徴とする上記（８）または（９）に記載の方法。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。
（１２）ビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｃ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９１で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｄ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｅ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号３８〜９４で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｆ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｇ）配列表配列番号７に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｈ）配列表配列番号８に示される塩基配列中塩基番号３８〜８７で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｉ）配列表配列番号９に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｊ）配列表配列番号１０に示される塩基配列中塩基番号３８〜８６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｋ）配列表配列番号１１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９７で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、配列中のＴはＵである。）
（ｌ）上記（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
（１３）核酸がＤＮＡである上記（１２）に記載の一本鎖核酸分子。
【０００９】
本明細書において「インビトロセレクション法(in vitro selection method)」とは、ランダムに合成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の機能を有する（たとえば、標的物質に特異的に吸着し得る）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施することによって、特定の機能を有する核酸分子を取得する方法を指す。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから、特定の標的物質に特異的に吸着し得る核酸分子（アプタマー）を取得したい場合、上記吸着能を有する核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
また本明細書中における「アプタマー」とは、特定の標的物質に対する特異的な吸着能を有する一本鎖核酸分子を指すものとする。本明細書中におけるアプタマーは、上記のインビトロセレクション法によって取得されたものに限定されない。
【００１０】
本明細書において「アフィニティークロマトグラフィー」とは、生体物質の示す特異的な相互作用（親和性）を利用した分離法を指し、その分離手段は特に限定されず、通常当分野で実施される種々の手法が用いられる。具体的にはアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、当該方法は▲１▼標的物質を固定化した担体を充填したアフィニティーカラム（以下、便宜上標的物質を固定化したアフィニティーカラムということもある）に、該標的物質に特異的に吸着可能な物質および／または吸着できない物質をアプライする処理と、▲２▼アプライ後、洗浄用緩衝液にてカラムを洗浄して上記吸着可能物質と非吸着物質とを分離する処理（洗浄処理）と、▲３▼洗浄処理の後に溶出用緩衝液にて、吸着可能物質とカラムに固定化した標的物質との間の結合力を弱めて、吸着可能物質を溶出させる処理（溶出処理）とを少なくとも含有するものとする。ここで、標的物質を固定化する担体としては、アフィニティークロマトグラフィー、特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーで用いられる公知のものが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
まずステップｓ１では、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って約３０塩基〜約８０塩基の予め決められた長さのランダム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮｔという場合もある。）のライブラリーを作成する。該ライブラリーには１０13〜１０14種類もしくはそれ以上のｓｓＮｔが含まれていることが好ましい。
【００１２】
後述するステップｓ２，ｓ３におけるＰＣＲ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアンチセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設計することが好ましい（ここで「センス」および「アンチセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよびその相補鎖を増幅するためのプライマーである。）。このようなプライミング部位は、それぞれ約１５塩基〜約４０塩基、好ましくは約１５塩基〜約３０塩基で、それらに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一般的条件を満たすように設計することが好ましい。
また、選抜後のアプタマーを適当なベクターにサブクローニングする必要がある場合、当該クローニングを容易にするために、該プライミング部位は適当な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしながら、図１に示す例のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オリゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプタマーの配列を決定することができる。
【００１３】
続くステップｓ２では、得られたｓｓＮｔライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔという場合もある。）を増幅する。このｄｓＮｔの増幅は、常法に従ってＰＣＲにて実施できる。
【００１４】
図１に示す例では、続くステップｓ３において、上記ＰＣＲにより増幅ｄｓＮｔライブラリーについてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行い、センス鎖（すなわち元のｓｓＮｔ）のみが増幅されたｓｓＮｔのプールを調製する。これは、アプタマーが、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子であるという構造的、配列的特徴に基づいて、標的物質への特異的な吸着能を有すると考えられており、したがって後述するステップｓ４〜ｓ６におけるビスフェノールＡカラムアフィニティークロマトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖の状態で存在しなければならないためである。
【００１５】
非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製することができる。所望により、電気泳動に先立ってＰＣＲ産物をエタノール沈殿して濃縮することもできる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次構造を形成させる。
【００１６】
なお本発明においては、上記例のステップｓ２のＰＣＲおよびステップｓ３の非対称ＰＣＲに換えて、センスプライマーをアンチセンスプライマーに対して大過剰（たとえば５０〜１００：１程度）に加えてＰＣＲを行うことによって、センス鎖のみが増幅されたｓｓＮｔプールを調製してもよい。
【００１７】
続くステップｓ４、ステップｓ５およびステップｓ６は、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーの一連の処理である。すなわち、ステップｓ４ではステップｓ３で得られた適切な二次構造をとったｓｓＮｔを、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムへアプライする処理、ステップｓ５ではアフィニティーカラムを洗浄してビスフェノールＡに吸着しなかった核酸分子（以下、「非吸着核酸分子」ということがある。）を分離させる処理（洗浄処理）、ステップｓ６ではビスフェノールＡに特異的に吸着した核酸分子（以下、「吸着核酸分子」ということがある。）をアフィニティーカラムから溶出させる処理（溶出処理）が行われる。このように本発明におけるインビトロセレクション法は、ビスフェノールＡを固定化したアフィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーを利用して、吸着核酸分子と非吸着核酸分子とを分離する。ステップｓ４でｓｓＮｔをアプライするアフィニティーカラムとしては、従来公知の方法によって、ビスフェノールＡを予め固定化したビーズやゲル固相を充填したカラムを用いればよい。
【００１８】
本発明において重要なことは、両性有機溶媒を含有する緩衝液を用いて、少なくともステップｓ６の溶出処理を行うことである。好ましくは、両性有機溶媒を２％〜５０％、好ましくは５％〜４０％含有する緩衝液を用いて、少なくともステップｓ６の溶出処理を行うことである。上記「両性有機溶媒」とは、活性溶媒のうちで、酸性と塩基性とを共に有し、かつそのいずれもが顕著ではないような有機溶媒をいう。本発明においては、たとえばジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール、メタノールなどを用いる。上記中でも、ビスフェノールＡの溶解性やカラムマトリックスの耐性などの観点から、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびエタノールから選ばれる両性有機溶媒を用いるのが好ましい。両性有機溶媒は、上記で例示した互いに異なる両性有機溶媒の混合物であってもよい。ここで、本発明において標的物質とされるビスフェノールＡは、芳香環を有する対称構造の化学物質であり、水に不溶な性質を有する。したがって、水も両性溶媒ではあるが本発明においてはこれを使用せず、アフィニティーカラムに固定化されたビスフェノールＡに特異的に吸着した吸着核酸分子を拮抗溶出させるために、ビスフェノールＡを溶解し得る上記の両性有機溶媒を溶出用の緩衝液に使用する。
【００１９】
ステップｓ６における拮抗溶出用の緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が２％未満であると、アプタマーの選択効率が低下するという問題が発生する。また拮抗溶出用緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が５０％を超えると、核酸が沈殿してしまう、カラム樹脂が変性してしまうなどカラムマトリックスに悪影響を与えてしまう。なお上記濃度は、緩衝液の体積あたりの両性有機溶媒の体積の割合（体積％（ｖ／ｖ））である。また両性有機溶媒が混合物である場合には、上記濃度は混合物全体の最終濃度を指すものとする。
【００２０】
また本発明においては、さらにステップｓ５の洗浄処理においても、両性有機溶媒を含有する緩衝液、好ましくは両性有機溶媒を２％〜５０％、好ましくは５％〜３０％含有する緩衝液を用いることが好ましい。洗浄用の緩衝液に用いられる両性有機溶媒としては、上述した拮抗溶出用緩衝液と同様のものが挙げられ、中でもビスフェノールＡの溶解性やカラムマトリックスの耐性の観点から、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびエタノールから選ばれる両性有機溶媒を用いるのが好ましい。洗浄用緩衝液中における両性有機溶媒と、拮抗溶出用緩衝液中における両性有機溶媒とは、同じものを用いても、互いに異なるものを用いてもよい。
【００２１】
ステップｓ５における洗浄用の緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が２％未満であると、アプタマーの選択効率が低下するという傾向にあるため好ましくない。また洗浄用緩衝液中における両性有機溶媒の濃度が５０％を超えると、カラム樹脂が変性してしまうなどカラムマトリックスに悪影響を与えてしまう傾向にあるため好ましくない。
【００２２】
上記のようなステップｓ４〜ｓ６を経て得られた吸着核酸分子について、上記のＰＣＲ増幅（ステップｓ２）、非対称ＰＣＲ（ステップｓ３）およびビスフェノールアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ステップｓ４〜ｓ６）のサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜１５回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得ることができる。
【００２３】
得られたアプタマーは、常法にしたがって二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限酵素認識部位を用いて、また平滑末端化して、あるいはＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクローニングすることができ、マキサム・ギルバート法またはジデオキシ法によりその塩基配列を決定することができる。あるいは得られた一本鎖アプタマーをサブクローニングすることなくダイレクトにシークエンスすることもできる。
【００２４】
上記のような本発明の方法によれば、従来取得が困難であった、水に不溶な低分子量の有機化合物であるビスフェノールＡを標的物質として特異的に認識して吸着し得るアプタマーを効率よく取得することができる。
【００２５】
ビスフェノールＡに特異的に吸着し得る本発明のアプタマーは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されないが、好ましくは約３０塩基〜約１２０塩基である。
【００２６】
本発明のアプタマーは、その好ましい実施態様において、配列表配列番号１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３８〜９１で示される塩基配列、配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列、配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号３８〜９４で示される塩基配列、配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号７に示される塩基配列中塩基番号３８〜９５で示される塩基配列、配列表配列番号８に示される塩基配列中塩基番号３８〜８７で示される塩基配列、配列表配列番号９に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番号１０に示される塩基配列中塩基番号３８〜８６で示される塩基配列、配列表配列番号１１に示される塩基配列中塩基番号３８〜９７で示される塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである。）を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」とは、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、あるいは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つビスフェノールＡ特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味する。
【００２７】
上記の塩基配列を実質的に含む一本鎖核酸分子（アプタマー）は、上述した本発明の方法によって調製されたものでなくてもよく、いかなる方法によっても調製することができるが、上述した本発明の方法によって調製されたものであるのが好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
実施例１
〔１〕増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの作製
（１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）プライマーおよびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成した（ステップｓ１）。
鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N59-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’（配列番号12）
Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3' （配列番号13）
Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3' （配列番号14）
（２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（ステップｓ２）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 １０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分（３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライマーに用いて非対称ＰＣＲを行った（ステップｓ３）。最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は以下の通りである。
反応液組成
最初の変性 ：９４℃，１分
変性 ：９４℃，１５秒
アニーリング：５５℃，１５秒 ４０サイクル
伸長 ：７２℃，１５秒
最後の伸長 ：７２℃，６分
【００３０】
ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイクロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテックスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０２５％ ＳＴＳ，０．０２５％キシレンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％ ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。
【００３１】
〔２〕アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（１）上記〔１〕で得られたＤＮＡをエタノール沈殿させ、減圧乾燥後、蒸留水１００μｌに溶解し、２×結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ2（ｐＨ８．０），１０％ジオキサン（ｐＨ８．０））１００μｌを加えてよく混合し、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと自然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により二次構造の形成を確認した。
（２）カラムへのビスフェノールＡ固定化は以下のように行った。まず、炭酸カリウムを塩基性触媒とし、ビスフェノールＡと４−ブロモ−ｎ−酪酸エチルエステルのカップリング反応を行った。反応条件はジメチルホルムアミド中、室温にて、４時間攪拌を続けた。反応後、薄層クロマトグラフィーにて生成物を確認した後、生成物をエーテルで抽出した。副生成物を除くために反応物をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０（ＭＥＲＣＫ社製）にて精製した。次に、得られた化合物のアルカリ加水分解を行った。反応条件は９５％エタノール中、水酸化ナトリウム存在下にて還流を２時間続けた。反応後のサンプルを薄膜クロマトグラフィーに供し、基質が完全に加水分解したことを確認した。最後に、カルボジイミドを用いたカップリング反応にて合成したビスフェノールＡ誘導体をＥＡＨセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア社製）に固定化した。固定化の結果、ゲル１ｍｌあたり７．９６μｍｏｌのビスフェノールＡが結合した。固定化した樹脂を８ｍｍ×５ｍｍのカラムに充填し、約２０倍量の水で洗浄、さらに約２０倍量の１×結合バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５％ジオキサン（ｐＨ８．０））で平衡化した（このとき出てくる液をベースラインとして用いた。）。
（３）上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムにアプライした後、コックを開いて溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムにアプライした（ステップｓ４）。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分間放置した。１×結合バッファー（洗浄用緩衝液）５ｍｌを注いでコックを開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ５）。一度コックを閉じた後、溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，３０％ジオキサン（ｐＨ８．０），３５．１ｍＭビスフェノールＡ）（拮抗溶出用緩衝液）を注ぎコックを開いた。溶出液をマイクロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作を３回繰り返すことによりバッファーを溶出バッファーで置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクションをマイクロチューブに分取した（ステップｓ６）。該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれにグリコーゲンを２μｌ加えた後、エタノールを沈殿させ、減圧乾燥させた。該沈殿を水１５μｌによく溶解させた。
【００３２】
〔３〕ビスフェノールＡ特異的ＤＮＡアプタマーの同定
上記〔１〕（２）〜〔２〕（３）の各操作（ステップｓ２〜ｓ６）の各操作を１２回繰り返して行った。該操作により選抜された１３種のビスフェノールＡ特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定した。
決定された各クローンのランダム領域の塩基配列は、以下のとおりであった。クローン１：5'-TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTTTTTATTTCTGGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3’（配列番号１の塩基番号３８〜９６）
クローン２：5'-CAAGGGCCGAGCGTACCTGGTTTGCTCGTTTTTTGTCGAATTTTTGGCGCCTTATATTT-3’（配列番号２の塩基番号３８〜９６）
クローン３：5'-TTGTGTAGGATTTAGGGGATATTTTTTATCTTATTCTTTGACGCGCAAATTCTA-3’（配列番号３の塩基番号３８〜９１）
クローン４：5'-AAAGTGGCCTGCAATCCCTCGGTATTTTAGTCTTTTGTTTTTGCTGTATTCCTTTCAT-3’（配列番号４の塩基番号３８〜９５）
クローン５：5'-GGCCTGTATGGCATGCTGCGCTATTTTCACTCACATGTTCTTTTTATTCTTTTGGTT-3’（配列番号５の塩基番号３８〜９４）
クローン６：5'-GGTCCATTCAGCCTCTATTAATCCCCTAGTCTACTACTTTTCTCGTCTGGTTTTCTTTC-3’（配列番号６の塩基番号３８〜９６）
クローン７：5'-GGTGAATCAGTCTCTTATCATTTTTTCGATTCTTAGCCGGATTAACAATTCTTTACTC-3’（配列番号７の塩基番号３８〜９５）
クローン８：5'-GGATGTGGTCTTTATTTTTGTATCCTCGGCATCCTCCTCCGGCCCGTTCC-3’（配列番号８の塩基番号３８〜８７）
クローン９：5'-TCTCGAATATTATTTTCCCGTAAACTCTTCGGAGGGTAGCCATTTTTCCTCGTTGAGTA-3’（配列番号９の塩基番号３８〜９６）
クローン１０：5'-GATATTTAGGGCGCGTCCGGCACCTTTTATTTTTTCTTGATTGGTTTTT-3’（配列番号１０の塩基番号３８〜８６）
クローン１１：5'-GATTGTTGCGGAGTTCTGTTTTCTTTGGCGGTTATTTTTTCTATTTCTTAGCAGGTCGAC-3’（配列番号１１の塩基番号３８〜９７）
【００３３】
比較例１
上記〔２〕（３）における溶出バッファー（拮抗溶出用緩衝液）に換えて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％ジオキサン（ｐＨ８．０）およびビスフェノールＡからなるバッファーを用いた以外は実施例１と同様にしたところ、ビスフェノールＡが溶解しなかったため、カラムマトリックスからのアプタマーの回収が不能であった。
【００３４】
比較例２
上記〔２〕（３）における溶出バッファー（拮抗溶出用緩衝液）に換えて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０％ジオキサン（ｐＨ８．０）および３５．１ｍＭビスフェノールＡからなるバッファーを用いた以外は実施例１と同様にしたところ、溶出処理時に核酸分子が凝集沈殿してしまい、カラムより溶出を行うことができず、アプタマーの回収が不能であった。
【００３５】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、ビスフェノールＡを標的分子として認識して特異的に吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方法およびアプタマーを提供することができる。本発明のアプタマーは、ビスフェノールＡを特異的に認識して吸着できるので、ビスフェノールＡの検出、定量に使用することができる他、内分泌撹乱物質の疑いのあるビスフェノールＡの生体へ及ぼす影響の研究などへの応用が可能であり、極めて有用である。
【００３６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号２：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号３：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号４：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号５：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号６：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号７：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号８：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号９：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１０：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１１：インビトロセレクション法によりスクリーニングされた、ビスフェノールＡに対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。
配列番号１２：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ
ＰＣＲプライミング部位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮＡ。
配列番号１３：配列番号１２のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号１２のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設計されたオリゴＤＮＡ。
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説明するためのフローチャートである。
Claims (1)
- ビスフェノールＡに特異的に吸着し得るアプタマーであって、下記（ａ）〜（ｌ）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とする一本鎖ＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号１に示される塩基配列
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列
（ｃ）配列表配列番号３に示される塩基配列
（ｄ）配列表配列番号４に示される塩基配列
（ｅ）配列表配列番号５に示される塩基配列
（ｆ）配列表配列番号６に示される塩基配列
（ｇ）配列表配列番号７に示される塩基配列
（ｈ）配列表配列番号８に示される塩基配列
（ｉ）配列表配列番号９に示される塩基配列
（ｊ）配列表配列番号１０に示される塩基配列
（ｋ）配列表配列番号１１に示される塩基配列
（ｌ）上記（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列
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