JP2003079370A - ベロ毒素ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマーおよびその取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腸管出血性大腸菌が産生するベロ毒素のＩ型
を標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフ
ィニティーリガンド、すなわちアプタマーを取得する方
法およびアプタマーを提供する。 【解決手段】 アフィニティークロマトグラフィーを利
用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ
型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であ
って、上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ
毒素Ｉ型のアミノ酸配列、好ましくはベロ毒素Ｉ型のア
ミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸から
なるアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した担体を
用いる方法、およびそれによって得られたアプタマーで
ある一本鎖核酸分子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ベロ毒素Ｉ型に特
異的に吸着し得る一本鎖核酸分子（アプタマー）ならび
にその取得方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ベロ毒素(Verotoxin)は、腸管出血性大
腸菌が産生する毒素であり、アミノ酸配列の違いからＩ
型とＩＩ型とに類別される。これら毒素は１個のＡサブ
ユニットと５個のＢサブユニットとから形成されてお
り、Ｂサブユニットにより腸管上皮細胞上に存在するレ
セプターを認識して結合し、細胞内でＡサブユニットが
ｒＲＮＡに結合してタンパク合成阻害を起こすことが知
られている。ベロ毒素Ｉ型とベロ毒素ＩＩ型とは、生物
学的性状が非常に類似しているが、物理化学的性状およ
び免疫学的性状を互いに異にするものであり、ベロ毒素
Ｉ型は、志賀赤痢菌（Shigella dysenterae）１型菌の
産生する志賀毒素(Shiga toxin)と同一の毒素であり、S
higa-like toxin(SLT)などとも呼ばれるものである。こ
のようなベロ毒素Ｉ型を選択的に認識することができる
高アフィニティーリガンドの開発は、ベロ毒素Ｉ型の検
出や定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好
適に使用できる点から、非常に重要である。

【０００３】従来、高アフィニティーリガンドを取得す
る方法としては、抗原抗体反応の高い特異性を利用して
抗体を作製する手法が一般に採られていた。しかし毒素
に対する抗体作製の場合、感作動物への毒性から、ホル
ムアルデヒド処理や熱処理により無毒化した形で免疫を
行うのが常法である。ただしこの場合、上記処理による
構造変化から、親和性の高いアフィニティーリガンドの
取得は困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決するためになされたものであり、その目的とすると
ころは、腸管出血性大腸菌が産生するベロ毒素のＩ型を
標的分子として特異的に認識して吸着し得る新規アフィ
ニティーリガンドを取得する方法およびアフィニティー
リガンドを提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、近年の進化分子
工学の発達により開発された、ランダムなオリゴヌクレ
オチドライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高
いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマ
ーをスクリーニングする、インビトロセレクション法
（in vitro selection method）、あるいはＳＥＬＥＸ
（Systematic evolution of ligands by exponential e
nrichment）などと呼ばれる技術を利用して上記のアフ
ィニティーリガンドを取得し得ることを見出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明は以下のとおりである。 （１）アフィニティークロマトグラフィーを利用したイ
ンビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異
的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、上
記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型
のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した担体を用
いることを特徴とする方法。 （２）ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチド
が、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜
３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチ
ドである、上記（１）記載の方法。 （３）該ペプチドを固定化した担体を充填してなるアフ
ィニティーカラムを用いることを特徴とする、上記
（１）記載の方法。 （４）該ペプチドが、配列表配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列を有するものである、上記（１）記載の方法。 （５）該ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個の
ヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介して担体に
固定化されてなることを特徴とする、上記（１）記載の
方法。 （６）上記（１）記載の方法によって取得されたアプタ
マーである一本鎖核酸分子。 （７）アフィニティークロマトグラフィーを利用したイ
ンビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ型に特異
的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であって、上
記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ型
のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ酸
からなるアミノ酸配列を有するペプチドを固定化したア
フィニティーカラムを用いることを特徴とする方法。 （８）上記ペプチドが、配列表配列番号１に示されるア
ミノ酸配列を有するものである、上記（７）記載の方
法。 （９）上記ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端に６個
のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介してアフ
ィニティーカラムに固定化されていることを特徴とす
る、上記（７）または（８）に記載の方法。 （１０）上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法に
よって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分子。 （１１）ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るアプタマー
であって、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列を
含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。 （ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号
３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｂ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号
３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｃ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号
４０〜８８で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｄ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号
３９〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列におい
て、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
された配列 （１２）核酸がＤＮＡである上記（１１）記載の一本鎖
核酸分子。

【０００７】本明細書において「インビトロセレクショ
ン法(in vitro selectionmethod)」とは、ランダムに合
成した一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーから、特
定の機能を有する（たとえば、標的物質に特異的に吸着
する）一本鎖オリゴヌクレオチドを分離し、これを増幅
し、さらに上記特定の機能を有する一本鎖オリゴヌクレ
オチドを分離するという選抜プロセスを繰り返し実施す
ることによって、特定の機能を有する核酸分子を取得す
る方法を指す。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリ
ーから、特定の標的物質に特異的に吸着し得る核酸分子
（アプタマー）を取得したい場合、上記吸着能を有する
核酸分子を分離する方法としては、たとえば、標的物質
を固定化したアフィニティーカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーが挙げられる。

【０００８】また本明細書中における「アプタマー」と
は、特定の標的物質に対する特異的な吸着能を有する一
本鎖核酸分子を指すものとする。本明細書中におけるア
プタマーは、上記のインビトロセレクション法によって
取得されたものに限定されない。

【０００９】本明細書において「アフィニティークロマ
トグラフィー」とは、生体物質の示す特異的な相互作用
（親和性）を利用した分離法を指し、その分離手段は特
に限定されず、通常当分野で実施される種々の手法が用
いられる。具体的にはアフィニティーカラムを用いたア
フィニティークロマトグラフィーが挙げられ、当該方法
は標的物質を固定化した担体を充填したアフィニティ
ーカラム（以下、便宜上標的物質を固定化したアフィニ
ティーカラムということもある）に、該標的物質に特異
的に吸着可能な物質および／または吸着できない物質を
アプライする処理と、アプライ後、洗浄用緩衝液にて
カラムを洗浄して上記吸着可能物質と非吸着物質とを分
離する処理（洗浄処理）と、洗浄処理の後に溶出用緩
衝液にて、吸着可能物質とカラムに固定化した標的物質
との間の結合力を弱めて、吸着可能物質を溶出させる処
理（溶出処理）とを少なくとも含有するものとする。こ
こで、標的物質を固定化する担体としては、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、特にアフィニティーカラムク
ロマトグラフィーで用いられる公知のものが挙げられ
る。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るア
プタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説
明するためのフローチャートである。まずステップｓ１
では、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、常法に従って
約３０塩基〜約８０塩基の予め決められた長さのランダ
ム領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｓｓＮ
ｔという場合もある。）のライブラリーを作成する。該
ライブラリーには１０¹³〜１０¹⁴種類もしくはそれ以上
のｓｓＮｔが含まれていることが好ましい。

【００１１】後述するステップｓ２、ｓ３におけるＰＣ
Ｒ増幅を容易にするために、各ｓｓＮｔはランダム領域
の両端に共通のプライミング部位（すなわち、５’末端
にセンスプライマーと相同な配列および３’末端にアン
チセンスプライマーと相補的な配列）を有するように設
計することが好ましい（ここで「センス」および「アン
チセンス」プライマーは、それぞれ元のｓｓＮｔおよび
その相補鎖を増幅するためのプライマーである。）。こ
のようなプライミング部位は、それぞれ約１５塩基〜約
４０塩基、好ましくは約１５塩基〜約３０塩基で、それ
らに対応するＰＣＲプライマーが好適なプライマーの一
般的条件を満たすように設計することが好ましい。

【００１２】また、選抜後のアプタマーを適当なベクタ
ーにサブクローニングする必要がある場合、当該クロー
ニングを容易にするために、該プライミング部位は適当
な制限酵素認識部位を含んでいてもよい。しかしなが
ら、図１に示す例のように非対称ＰＣＲにより一本鎖オ
リゴヌクレオチドが大部分となるように増幅を行う場合
には、サブクローニングすることなくダイレクトにアプ
タマーの配列を決定することができる。

【００１３】続くステップｓ２では、得られたｓｓＮｔ
ライブラリーを鋳型として、ｓｓＮｔの両端のプライミ
ング部位に対応するセンスおよびアンチセンスプライマ
ーを用い、二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、ｄｓＮｔ
という場合もある。）を増幅する。このｄｓＮｔの増幅
は、常法に従ってＰＣＲにて実施できる。

【００１４】図１に示す例では、続くステップｓ３にお
いて、上記ＰＣＲにより増幅ｄｓＮｔライブラリーにつ
いてセンスプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲを行
い、センス鎖（すなわち元のｓｓＮｔ）のみが増幅され
たｓｓＮｔのプールを調製する。これは、アプタマー
が、特有の二次構造を形成し得る一本鎖核酸分子である
という構造的、配列的特徴に基づいて、標的物質への特
異的な吸着能を有すると考えられており、したがって後
述するステップｓ４〜ｓ６におけるアフィニティークロ
マトグラフィーの前に所定の二次構造を形成した一本鎖
の状態で存在しなければならないためである。

【００１５】非対称ＰＣＲにより増幅されたｓｓＮｔは
アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製することができる。所望により、電気泳動に先立
ってＰＣＲ産物をエタノール沈殿して濃縮することもで
きる。所望のｓｓＮｔに対応するバンドを含むゲル部分
を回収し、常法に従ってｓｓＮｔを精製する。アフィニ
ティークロマトグラフィーに先立って、ｓｓＮｔを９０
℃以上で変性させ、常温になるまで放冷して適切な二次
構造を形成させる。

【００１６】なお本発明においては、上記例のステップ
ｓ２のＰＣＲおよびステップｓ３の非対称ＰＣＲに換え
て、センスプライマーをアンチセンスプライマーに対し
て大過剰（たとえば５０〜１００：１程度）に加えてＰ
ＣＲを行うことによって、センス鎖のみが増幅されたｓ
ｓＮｔプールを調製してもよい。

【００１７】続くステップｓ４、ステップｓ５およびス
テップｓ６は、特定のペプチドを固定化したアフィニテ
ィーカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィ
ーの一連の処理である。本発明において重要なことは、
このアフィニティーカラムに固定化するペプチドとし
て、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペプチド、特
にベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３
０個のアミノ酸、好ましくは５個〜２５個のアミノ酸か
らなるアミノ酸配列を有するペプチドを使用することで
ある。かかるペプチドは、高次構造下では外側に位置し
アプタマ−の認識が可能な部分であることが好ましい。
ベロ毒素Ｉ型は、１個のＡサブユニットと５個のＢサブ
ユニットとから形成されるが、これらＡサブユニット、
Ｂサブユニットともにそのアミノ酸配列は当分野におい
て公知である（Ａサブユニットは２９３個のアミノ酸か
らなり、Ｂサブユニットは６９個のアミノ酸からな
る。）。本発明においては、このベロ毒素Ｉ型のアミノ
酸配列を有するペプチドを担体に固定化する。当該ペプ
チドはその大きさや親和性の強さ等により好ましくはベ
ロ毒素Ｉ型の部分アミノ酸配列であり、より好ましく
は、３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を選
択し、このアミノ酸配列を有するペプチドをアフィニテ
ィーカラムに固定化する。本発明において使用されるペ
プチドは、当業者が通常行うように、ペプチド自動合成
装置で合成できるが、天然由来のものであっても、また
半合成のものであってもかまわず、任意の方法により入
手可能である。上記ベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配列に
おけるアミノ酸が３個未満であると、アフィニティーク
ロマトグラフィーによりアプタマーを選抜するためのア
フィニティーを充分に発揮することができないというよ
うな不具合がある。またベロ毒素Ｉ型由来のアミノ酸配
列におけるアミノ酸が３０個を超えると、該ペプチドの
合成が困難となってしまい、また非特異的な吸着が増加
してアプタマーの選抜が困難となってしまう不具合があ
る。当該ペプチドのアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＡ
サブユニット、Ｂサブユニットのどちら由来のアミノ酸
配列であってもよい。

【００１８】なお本発明において使用するペプチドは、
上記のベロ毒素Ｉ型由来でアフィニティーの呈示を阻害
しないものであればよい。例えばベロ毒素Ｉ型由来の３
個〜３０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列（以下、
「高アフィニティー領域」ということがある。）による
アフィニティーの呈示を阻害しないものであれば、Ｎ側
末端および／またはＣ側末端にさらにアミノ酸残基を有
していてよい。但し、上記高アフィニティー領域による
アフィニティーの観点からは、上記アミノ酸残基が付加
されているか否かに関わらず、ペプチドの総アミノ酸数
が３個〜３０個のアミノ酸を有するものであるのが好ま
しく、５個〜２５個のアミノ酸を有するものであるのが
より好ましい。

【００１９】本発明において使用されるペプチドにおけ
る高アフィニティー領域は、下記のアミノ酸配列である
ことが好ましい。 N-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-
Lys-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号１） 上記配列番号１のアミノ酸配列は、ベロ毒素Ｉ型のＢサ
ブユニットの一部のアミノ酸配列であるが、高次構造を
とるベロ毒素Ｉ型において外側に位置し、抗原性を呈示
する領域であると考えられる。

【００２０】また本発明においては、上記ペプチドは、
Ｎ側末端またはＣ側末端に６個のヒスチジン（ヒスチジ
ンタグ）を有し、該ヒスチジンタグを介して固定化され
ているのが好ましい。言い換えると、ペプチドの高アフ
ィニティー領域を除く残余のアミノ酸残基において、該
アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域のＮ側末端にある
場合にはそのＮ側末端が、該アミノ酸残基が上記アミノ
酸配列領域のＣ側末端にある場合にはそのＣ側末端が、
該アミノ酸残基が上記アミノ酸配列領域の両方の末端に
ある場合にはそのＮ側末端またはＣ側末端が、ヒスチジ
ンタグを有するものであり、このヒスチジンタグを介し
てアフィニティーカラムに固定化されているのが好まし
い。上記ヒスチジンタグをさらに有することによって、
ヒスチジンのイミダゾール基がニッケルイオン錯体また
はコバルトイオン錯体と強く結合することができ、さら
にイミダゾールの添加またはｐＨの低下によって容易に
アフィニティーリガンドの溶出が行えるので、ニッケル
イオン錯体またはコバルトイオン錯体を安定に保持した
支持体を用いたアフィニティーカラムにより、調整が容
易で安定したアフィニティークロマトグラフィーが可能
となる。上記ニッケルイオン錯体またはコバルトイオン
錯体としては、従来公知のものを好適に使用することが
できる。本発明において使用されるペプチドは、上記の
配列番号１のアミノ酸配列のＮ側末端に６個のヒスチジ
ンが付加した配列からなり（配列表配列番号２）、ヒス
チジンタグを介して、ニッケルイオン錯体との結合によ
ってアフィニティーカラムに固定化されるのが好まし
い。

【００２１】本発明においては、ステップｓ４〜ｓ６の
アフィニティーカラムクロマトグラフィーに、上記ペプ
チドを固定化したビーズやゲル固相を充填したアフィニ
ティーカラムを使用する。カラム充填剤としては、シリ
カゲル、セファロースゲルなどが挙げられる。

【００２２】上記のようにステップｓ４、ステップｓ５
およびステップｓ６は、上記ペプチドを固定化したアフ
ィニティーカラムを用いた、アフィニティークロマトグ
ラフィーの一連の処理である。すなわち、ステップｓ４
ではステップｓ３で得られた適切な二次構造をとったｓ
ｓＮｔを、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカ
ラムへアプライする処理、ステップｓ５ではアフィニテ
ィーカラムを洗浄して上記ペプチドに吸着しなかった核
酸分子（以下、「非吸着核酸分子」ということがあ
る。）を分離させる処理（洗浄処理）、ステップｓ６で
は上記ペプチドに特異的に吸着した核酸分子（以下、
「吸着核酸分子」ということがある。）をアフィニティ
ーカラムから溶出させる処理（溶出処理）が行われる。
このように本発明におけるインビトロセレクション法
は、上記ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを
用いた、アフィニティークロマトグラフィーを利用し
て、吸着核酸分子と非吸着核酸分子とを分離する。上記
洗浄処理に用いる洗浄用の緩衝液、ならびに上記溶出処
理に用いる溶出用の緩衝液は、当分野において従来から
広く用いられてきているものをそれぞれ用いればよい。
溶出用緩衝液は、洗浄用緩衝液にイミダゾールを添加し
たものであってもよい。

【００２３】上記のようなステップｓ４〜ｓ６を経て得
られた吸着核酸分子について、上記のＰＣＲ増幅（ステ
ップｓ２）、非対称ＰＣＲ（ステップｓ３）および上記
ペプチドを固定化してなるアフィニティーカラムを用い
たアフィニティークロマトグラフィー（ステップｓ４〜
ｓ６）のサイクルを、少なくとも５回、好ましくは７〜
１５回程度行うことにより、本発明のアプタマーを得る
ことができる。

【００２４】得られたアプタマーは、常法にしたがって
二本鎖とした後、プライミング部位中に構築された制限
酵素認識部位を用いて、また平滑末端化して、あるいは
ＴＡクローニング法により適当なベクター中にサブクロ
ーニングすることができ、マキサム・ギルバート法また
はジデオキシ法によりその塩基配列を決定することがで
きる。あるいは得られた一本鎖アプタマーをサブクロー
ニングすることなくダイレクトにシークエンスすること
もできる。

【００２５】上記のような本発明の方法によれば、従来
取得が困難であった、ベロ毒素Ｉ型を標的物質として特
異的に認識して吸着し得るアフィニティーリガンドを効
率よく取得することができる。

【００２６】ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得る本発明
のアプタマーは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好まし
くは一本鎖ＤＮＡである。その長さは特に制限されない
が、好ましくは約３０塩基〜約１２０塩基である。

【００２７】本発明のアプタマーは、その好ましい実施
態様において、配列表配列番号３に示される塩基配列中
塩基番号３８〜９６で示される塩基配列、配列表配列番
号４に示される塩基配列中塩基番号３８〜９６で示され
る塩基配列、配列表配列番号５に示される塩基配列中塩
基番号４０〜８８で示される塩基配列、配列表配列番号
６に示される塩基配列中塩基番号３９〜８２で示される
塩基配列からなる群より選択される塩基配列（但し、該
核酸分子がＲＮＡの場合、該配列中のＴはＵである。）
を実質的に含むものである。ここで「実質的に含む」と
は、上記のいずれかの塩基配列そのものを含むか、ある
いは上記のいずれかの塩基配列において、１または数個
の塩基が欠失、置換、挿入または付加され且つベロ毒素
Ｉ型特異的な吸着能を保持する配列を含むことを意味す
る。

【００２８】上記の塩基配列を実質的に含む一本鎖核酸
分子（アプタマー）は、上述した本発明の方法によって
調製されたものでなくてもよく、いかなる方法によって
も調製することができるが、上述した本発明の方法によ
って調製されたものであるのが好ましい。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲
を何ら限定するものではない。

【００３０】実施例１ 〔１〕増幅された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラ
リーの作製 （１）ＤＮＡ自動合成機を用いて、５９ｍｅｒをランダ
ム領域とした以下の鋳型ＤＮＡと、センス（Ｐ１）プラ
イマーおよびアンチセンス（Ｐ２）プライマーを合成し
た（ステップｓ１）。 鋳型：5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N₅₉-CTGCAGGTCGACGC
ATGCGCCG-3’（配列番号７） Ｐ１：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTCGACGGAT-3'
（配列番号８） Ｐ２：5'-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3' （配列番号９） （２）上記の鋳型ＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマー
を用いてＰＣＲにより増幅した（ステップｓ２）。反応
液組成および反応条件は以下の通りである。 反応液組成 蒸留水 ７３．５μｌ １０×ＰＣＲバッファー* １０ μｌ ２０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １ μｌ １０μＭ Ｐ１プライマー ５ μｌ １０μＭ Ｐ２プライマー ５ μｌ １μｇ／ｍｌ 鋳型ＤＮＡ ５ μｌ Ｅｘ Ｔａｑ^TM ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μｌ（２．５単位） * １０×ＰＣＲバッファー組成 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ５００ｍＭ ＫＣｌ ２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 反応条件 最初の変性 ：９４℃，１分 変性 ：９４℃，１５秒 アニーリング：５５℃，１５秒 １０サイクル 伸長 ：７２℃，１５秒 最後の伸長 ：７２℃，６分 （３）上記ＰＣＲ産物を鋳型として、Ｐ１のみをプライ
マーに用いて非対称ＰＣＲを行った（ステップｓ３）。
最終的にＰＣＲ産物が２ｍｌ得られるように調製した
（１００μｌ×２０本）。反応液組成および反応条件は
以下の通りである。 反応液組成 蒸留水 ７８．５μｌ １０×ＰＣＲバッファー １０ μｌ ２０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １ μｌ １０μＭ Ｐ１プライマー ５ μｌ １μｇ／ｍｌ 鋳型ＤＮＡ ５ μｌ Ｅｘ Ｔａｑ^TM ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μｌ（２．５単位） 反応条件 最初の変性 ：９４℃，１分 変性 ：９４℃，１５秒 アニーリング：５５℃，１５秒 ４０サイクル 伸長 ：７２℃，１５秒 最後の伸長 ：７２℃，６分

【００３１】ＰＣＲ反応液を４００μｌずつ５本のマイ
クロチューブに分注し、それぞれに１０Ｍ酢酸アンモニ
ウム８０μｌ、９９．５％エタノール１ｍｌを加えて軽
く混和し、−８０℃で２０分間放置した。１５，０００
ｒｐｍで１５分間遠心し、７０％エタノールでリンス、
１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈澱を減圧
乾燥した。滅菌蒸留水２０μｌを加え、激しくボルテッ
クスして沈澱を溶解した後、ゲルローディングバッファ
ー（９５％ホルムアミド，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０），０．０２５％ ＳＴＳ，０．０２５％キシレ
ンシアノール，０．０２５％ブロモフェノールブルー）
２０μｌを加えてさらによくボルテックスした。これを
９０℃で３分間処理して変性させ氷中で急冷した後、ポ
リアクリルアミドゲル上の電気泳動（１５０Ｖ，５０
分）に付した。エチジウムブロマイド液中に約５分間浸
漬した後水洗し、トランスイルミネーター上でバンドを
検出し、目的のバンドを含むゲル部分を切り出して破砕
した。溶出バッファー（０．５Ｍ酢酸アンモニウム，１
０ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０），０．１％ ＳＴＳ）８００μｌを加えて３時間振
盪した後、フィルターに通して濾液を回収した。

【００３２】〔２〕アフィニティーカラムクロマトグラ
フィー （１）上記〔１〕で得られたＤＮＡをエタノール沈殿さ
せ、減圧乾燥後、蒸留水１００μｌに溶解し、２×結合
バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂（ｐＨ８．０））１００μｌを加えてよく混合し、２
６０ｎｍでの吸光度を測定した。該ＤＮＡ溶液を９０℃
で５分間処理して変性させた後、そのままゆっくりと自
然冷却してホールディングさせた。吸光度の変化により
二次構造の形成を確認した。 （２）ベロ毒素Ｉ型Ｂサブユニット内のペプチドを、ペ
プチド自動合成装置を用いて合成した。Ｎ側末端に６個
のヒスチジンを付加して合成を行い、以下のアミノ酸配
列の合成ペプチドを得た。N-His-His-His-His-His-His-
Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Thr-Gly-Met-Thr-Val-Thr-Ile-Ly
s-Thr-Asn-Ala-Cys-His-C（配列番号２） （３）カラム材への上記ペプチドの固定化は、以下のよ
うに行った。１０μｇの上記ペプチドを１×結合バッフ
ァー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（ｐ
Ｈ８．０））８００μｌに溶解し、ＮＴＡ−Ｎｉ²⁺アガ
ロースゲル２００μｌを加え、室温で１時間振盪した。
固定化したゲルを８ｍｍ×５ｍｍのカラムに充填し、約
２０倍量の１×結合バッファーで洗浄し、平衡化した
（このときに出てくる液をベースラインとして用い
た。）。 （４）上記（１）で得られたＤＮＡサンプルをカラムに
アプライした後、コックを開いて溶出液をマイクロチュ
ーブに受け取り、再度カラムにアプライした（ステップ
ｓ４）。この操作を３回繰り返した後、室温にて３０分
間放置した。１×結合バッファー５ｍｌを注いでコック
を開き、約１２滴（約６５０μｌ）ずつ６フラクション
をマイクロチューブに分取した（ステップｓ５）。一度
コックを閉じた後、溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＫＣ
ｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（ｐＨ８．０）＋２５０ｍＭ
イミダゾール）を注ぎコックを開いた。溶出液をマイク
ロチューブに受け取り、再度カラムに戻した。この操作
を３回繰り返すことによりバッファーを溶出バッファー
で置換した。再びコックを開き、１２滴ずつ３フラクシ
ョンをマイクロチューブに分取した（ステップｓ６）。
該溶出液を４００μｌずつに分け、それぞれグリコーゲ
ン２μｌを加えた後、エタノール沈殿させ、減圧乾燥さ
せた。該沈殿を水１５μｌによく溶解させた。

【００３３】〔３〕ベロ毒素Ｉ型特異的ＤＮＡアプタマ
ーの同定 上記〔１〕（２）〜〔２〕（４）の各操作（ステップｓ
２〜ｓ６）の各操作を１２回繰り返して行った。該操作
により選抜された５種のベロ毒素Ｉ型特異的な一本鎖Ｄ
ＮＡアプタマーの塩基配列を、ジデオキシ法により決定
した。決定された各クローンのランダム領域の塩基配列
は、以下のとおりであった。 クローン１：5'-GACATTTGAAACCGTCCTATACGGGTCGGTGGGCT
TAGACGTCTTCTTCGCCCTAAATT-3’（配列番号３の塩基番号
３８〜９６） クローン２：5'-GTGTTGGGAGTTGGCCTTGGGCGACCCATGCACAG
TAGGGCATCACGCTTGGGCTAAAC-3’（配列番号４の塩基番号
３８〜９６） クローン３：5'-AGGGTTTCGGGAGGTCAACTAATGGGTTGTCGTTT
ACTGGGCCGCCCAA-3’（配列番号５の塩基番号４０〜８
８） クローン４：5'-TTTAATTAATTCAAGTAAATCGGGCACCTTCGTCT
CTTATGTTT-3’（配列番号６の塩基番号３９〜８２）

【００３４】

【発明の効果】以上の説明で明らかなように、本発明に
よれば、ベロ毒素Ｉ型を標的分子として認識して特異的
に吸着し得る新規アフィニティーリガンド、すなわちア
プタマーを取得する方法およびアプタマーを提供するこ
とができる。本発明のアプタマーは、ベロ毒素Ｉ型を特
異的に認識して吸着できるので、ベロ毒素Ｉ型の検出、
定量、さらにはベロ毒素Ｉ型の中和や捕捉などに好適に
使用でき、極めて有用である。

【００３５】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：インビトロセレ
クション法によりスクリーニングされた、ベロ毒素Ｉ型
に対する一本鎖ＤＮＡアプタマー。 配列番号４：インビトロセレクション法によりスクリー
ニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプ
タマー。 配列番号５：インビトロセレクション法によりスクリー
ニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプ
タマー。 配列番号６：インビトロセレクション法によりスクリー
ニングされた、ベロ毒素Ｉ型に対する一本鎖ＤＮＡアプ
タマー。 配列番号７：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴＰＣＲプライミング部
位に挟まれた５９ｍｅｒランダム領域を含む一本鎖ＤＮ
Ａ。 配列番号８：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するための
ＰＣＲプライマー（センス）として作用すべく設計され
たオリゴＤＮＡ。 配列番号９：配列番号７のＤＮＡ配列を増幅するための
ＰＣＲプライマー（アンチセンス）として作用すべく設
計されたオリゴＤＮＡ。

【００３６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nitto Denko Corporation <120> Aptamer capable of specifically adsorbing to Verotoxin-I and meth od for obtaining the aptamer <130> A5513 <150> JP 2001-203856 <151> 2001-07-04 <160> 10 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala 1 5 10 15 Cys His <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 His His His His His His Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val 1 5 10 15 Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His 20 <210> 3 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA aptamer to Verotoxin-I, screened by in vitro sel ection method. <400> 3 taatacgact cactataggg aattcgtcga cggatccgac atttgaaacc gtcctatacg 60 ggtcggtggg cttagacgtc ttcttcgccc taaattctgc aggtcgacgc atgctgccg 119 <210> 4 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA aptamer to Verotoxin-I, screened by in vitro sel ection method. <400> 4 taatacgact cactataggg aattcgtcga cggatccgtg ttgggagttg gccttgggcg 60 acccatgcac agtagggcat cacgcttggg ctaaacctac aggtcgacgc atgcgccg 118 <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA aptamer to Verotoxin-I, screened by in vitro sel ection method. <400> 5 gtaatacgac tcactatagg gaattcgtcc gacggatcca gggtttcggg aggtcaacta 60 atgggttgtc gtttactggg ccgcccaact gcaggtcgac gcatgcgccg 110 <210> 6 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA aptamer to Verotoxin-I, screened by in vitro sel ection method. <400> 6 taatacgact cactataggg aattcgtcga cggattcctt taattaattc aagtaaatcg 60 ggcaccttcg tctcttatgt ttctgcaggt cgacgcatgc gccg 104 <210> 7 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> (23)..(81) <223> A,G,C or T <220> <223> Single strand DNA containing 59mer random region flanked with PCR priming sites. <400> 7 tagggaattc gtcgacggat ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nctgcaggtc gacgcatgcg ccg 103 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo-DNA designed to act as PCR primer (sense) for amplification of DNA sequence of SEQ ID NO: 7. <400> 8 taatacgact cactataggg aattcgtcga cggat 35 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo-DNA designed to act as PCR primer (antisense) for amplificat ion of DNA sequence of SEQ ID NO: 7. <400> 9 cggcgcatgc gtcgacctg 19

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るア
プタマーを取得する方法の好ましい一例の処理動作を説
明するためのフローチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 昭雄 大阪府豊中市上野坂１−10−22 (72)発明者 福崎 英一郎 大阪府吹田市佐竹台４−２−２ (72)発明者 本田 武司 大阪府茨木市西中条町３−29 (72)発明者 柳原 格 大阪府吹田市山田北14−37−105 (72)発明者 中西 豪 大阪府八尾市陽光園１−９−15 秀和レジ デンス204 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA05 CA11 HA14

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アフィニティークロマトグラフィーを利
   用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ
   型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であ
   って、 上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ
   型のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した担体を
   用いることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列を有するペ
   プチドが、ベロ毒素Ｉ型のアミノ酸配列から選ばれる、
   ３個〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する
   ペプチドである、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該ペプチドを固定化した担体を充填して
   なるアフィニティーカラムを用いることを特徴とする、
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 該ペプチドが、配列表配列番号１に示さ
   れるアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載の
   方法。
5. 【請求項５】 該ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末端
   に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介し
   て担体に固定化されてなることを特徴とする、請求項１
   記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の方法によって取得された
   アプタマーである一本鎖核酸分子。
7. 【請求項７】 アフィニティークロマトグラフィーを利
   用したインビトロセレクション法によって、ベロ毒素Ｉ
   型に特異的に吸着し得るアプタマーを取得する方法であ
   って、 上記アフィニティークロマトグラフィーに、ベロ毒素Ｉ
   型のアミノ酸配列から選ばれる、３個〜３０個のアミノ
   酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した
   アフィニティーカラムを用いることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 上記ペプチドが、配列表配列番号１に示
   されるアミノ酸配列を有するものである、請求項７記載
   の方法。
9. 【請求項９】 上記ペプチドが、Ｎ側末端またはＣ側末
   端に６個のヒスチジンを有し、該６個のヒスチジンを介
   してアフィニティーカラムに固定化されていることを特
   徴とする、請求項７または８記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか１項に記載の
    方法によって取得されたアプタマーである一本鎖核酸分
    子。
11. 【請求項１１】 ベロ毒素Ｉ型に特異的に吸着し得るア
    プタマーであって、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩
    基配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。 （ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号
    ３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
    ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｂ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号
    ３８〜９６で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
    ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｃ）配列表配列番号５に示される塩基配列中塩基番号
    ４０〜８８で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
    ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｄ）配列表配列番号６に示される塩基配列中塩基番号
    ３９〜８２で示される塩基配列（但し、該核酸分子がＲ
    ＮＡの場合、配列中のＴはＵである。） （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列におい
    て、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
    された配列
12. 【請求項１２】 核酸がＤＮＡである請求項１１記載の
    一本鎖核酸分子。