JP3376430B2 - 高度にグリコシル化された蛋白質の精製方法 - Google Patents
高度にグリコシル化された蛋白質の精製方法Info
- Publication number
- JP3376430B2 JP3376430B2 JP02794092A JP2794092A JP3376430B2 JP 3376430 B2 JP3376430 B2 JP 3376430B2 JP 02794092 A JP02794092 A JP 02794092A JP 2794092 A JP2794092 A JP 2794092A JP 3376430 B2 JP3376430 B2 JP 3376430B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- crude preparation
- mixture
- metal ion
- calcium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高度にグリコシル化さ
れた蛋白質の精製方法に関する。
れた蛋白質の精製方法に関する。
【０００２】定義によれば、蛋白質は、アミノ酸の鎖か
ら実質的になっている。また、多くの場合、該鎖は、多
かれ少なかれ、かなりの量の各種サイズの炭水化物基を
含んでいる。かかる基を含む蛋白質は、グリコシル化さ
れた蛋白質(glycosylated proteins) と呼ばれる。
ら実質的になっている。また、多くの場合、該鎖は、多
かれ少なかれ、かなりの量の各種サイズの炭水化物基を
含んでいる。かかる基を含む蛋白質は、グリコシル化さ
れた蛋白質(glycosylated proteins) と呼ばれる。
【０００３】
【従来の技術】一般に、亜鉛、銅、コバルト、カルシウ
ムまたはニッケルなどの金属が、蛋白様化合物(protein
aceous compounds)とコンプレックスを形成することは
知られている。従って、これら金属は、蛋白質を精製す
る方法において、例えばアフィニティクロマトグラフィ
ー時のカップリング剤として、又は液体媒体中の蛋白質
を沈殿させるのに、一般に使用されている。
ムまたはニッケルなどの金属が、蛋白様化合物(protein
aceous compounds)とコンプレックスを形成することは
知られている。従って、これら金属は、蛋白質を精製す
る方法において、例えばアフィニティクロマトグラフィ
ー時のカップリング剤として、又は液体媒体中の蛋白質
を沈殿させるのに、一般に使用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高度
にグリコシル化された蛋白質の精製方法を提供すること
にある。
にグリコシル化された蛋白質の精製方法を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者の研究によれ
ば、驚くべきことに、高度にグリコシル化された蛋白質
は、上記金属とコンプレックスを形成することができな
いことが見出された。
ば、驚くべきことに、高度にグリコシル化された蛋白質
は、上記金属とコンプレックスを形成することができな
いことが見出された。
【０００６】従って、本発明は、真核細胞の培養物由来
の粗製標品(crude preparation) から高度にグリコシル
化された蛋白質を精製する方法であって、（ｉ）該標品
に、沈殿する混合物を形成するのに充分な量の二価金属
イオンを添加する工程、および（ｉｉ）沈殿後、該混合
物の上清から上記蛋白質を回収する工程を包含する方法
を提供するものである。
の粗製標品(crude preparation) から高度にグリコシル
化された蛋白質を精製する方法であって、（ｉ）該標品
に、沈殿する混合物を形成するのに充分な量の二価金属
イオンを添加する工程、および（ｉｉ）沈殿後、該混合
物の上清から上記蛋白質を回収する工程を包含する方法
を提供するものである。
【０００７】高度にグリコシル化された蛋白質とは、グ
リコシル化レベルが２０％以上、好ましくは３０％以
上、最も好ましくは４０％以上の蛋白質を意味するもの
として理解されるものである。
リコシル化レベルが２０％以上、好ましくは３０％以
上、最も好ましくは４０％以上の蛋白質を意味するもの
として理解されるものである。
【０００８】グリコシル化レベル(level of glycosylat
ion)とは、グリコシル化重量(glycosylation mass)と蛋
白質の全重量との比をパーセンテージで表したものであ
る。このグリコシル化レベルは、グリコシル化された蛋
白質の重量と、エンドグルコシダーゼ〔endoglucosidas
e 、例えば、ベーリンガー (Boehringer) から販売され
ているエンドグルコシダーゼＦ又はＨ(endoglucosidase
F or H)〕を用いて供給者により特定された条件下で処
理した後に得られる当該蛋白質の非グリコシル化形態の
重量とを比較することにより決定できる。グリコシル化
形態と非グリコシル化形態との相対的な重量は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で泳動することにより、測定できる。
ion)とは、グリコシル化重量(glycosylation mass)と蛋
白質の全重量との比をパーセンテージで表したものであ
る。このグリコシル化レベルは、グリコシル化された蛋
白質の重量と、エンドグルコシダーゼ〔endoglucosidas
e 、例えば、ベーリンガー (Boehringer) から販売され
ているエンドグルコシダーゼＦ又はＨ(endoglucosidase
F or H)〕を用いて供給者により特定された条件下で処
理した後に得られる当該蛋白質の非グリコシル化形態の
重量とを比較することにより決定できる。グリコシル化
形態と非グリコシル化形態との相対的な重量は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で泳動することにより、測定できる。
【０００９】これに代えて、もしグリコシル化された蛋
白質のアミノ酸配列が分かっている場合は、ペプチド鎖
の重量は計算できる。糖質の定量は、グリコシル化され
た蛋白質のヒドラジン分解後に、並行して行うことがで
きる。
白質のアミノ酸配列が分かっている場合は、ペプチド鎖
の重量は計算できる。糖質の定量は、グリコシル化され
た蛋白質のヒドラジン分解後に、並行して行うことがで
きる。
【００１０】例えば、フェチュイン(fetuin)、ＨＩＶウ
ィルスの糖蛋白質ｇｐ１２０およびｇｐ１６０、ムチン
(mucins)、ヒトインターロイキン−２、グリコホリン様
蛋白質(glycophorin-likeproteins) 及び血清中に存在
する酸アルファ−１−糖蛋白質(acid alpha-1-glycopro
tein) は、当然に高いグリコシル化レベルを示す蛋白質
である。本発明の目的には、精製を所望される蛋白質
は、均質なグリコシル化プロフィール（グリコシル化が
ペプチド鎖全体に亘っている）又は不均質なグリコシル
化プロフィール（グリコシル化がペプチド鎖の或る領域
に局在化している）のいずれを有していても良い。好ま
しくは、グリコシル化は均質であるのが良い。
ィルスの糖蛋白質ｇｐ１２０およびｇｐ１６０、ムチン
(mucins)、ヒトインターロイキン−２、グリコホリン様
蛋白質(glycophorin-likeproteins) 及び血清中に存在
する酸アルファ−１−糖蛋白質(acid alpha-1-glycopro
tein) は、当然に高いグリコシル化レベルを示す蛋白質
である。本発明の目的には、精製を所望される蛋白質
は、均質なグリコシル化プロフィール（グリコシル化が
ペプチド鎖全体に亘っている）又は不均質なグリコシル
化プロフィール（グリコシル化がペプチド鎖の或る領域
に局在化している）のいずれを有していても良い。好ま
しくは、グリコシル化は均質であるのが良い。
【００１１】高度にグリコシル化された蛋白質を精製す
ることが所望される粗製標品（crude preparation ）
は、この蛋白質を合成し得る真核細胞の培養物に由来す
るものである。培養培地の組成は、特に重要ではなく、
任意の適当な成分を含んでおれば良い。収得すべき蛋白
質の合成を組換法により可能とする方法が種々知られて
おり、細胞内に導入されるべき基本的エレメントは、こ
の蛋白質の合成用に設計された発現カセット（expressi
on cassette ）である。発現カセットは、高度にグリコ
シル化された蛋白質の前駆体（シグナルペプチド＋成熟
蛋白質）をコードすると共に、その発現に必要なエレメ
ントの制御下に置かれたＤＮＡフラグメントを含んでい
るのが有利である。
ることが所望される粗製標品（crude preparation ）
は、この蛋白質を合成し得る真核細胞の培養物に由来す
るものである。培養培地の組成は、特に重要ではなく、
任意の適当な成分を含んでおれば良い。収得すべき蛋白
質の合成を組換法により可能とする方法が種々知られて
おり、細胞内に導入されるべき基本的エレメントは、こ
の蛋白質の合成用に設計された発現カセット（expressi
on cassette ）である。発現カセットは、高度にグリコ
シル化された蛋白質の前駆体（シグナルペプチド＋成熟
蛋白質）をコードすると共に、その発現に必要なエレメ
ントの制御下に置かれたＤＮＡフラグメントを含んでい
るのが有利である。
【００１２】本発明の枠内において、高度にグリコシル
化された蛋白質は、真核細胞の培養物、好ましくは酵母
又は哺乳類細胞の培養物に由来する無細胞抽出物(acell
uarextract)から精製するのが有利である。該無細胞抽
出物は、蛋白質が培養培地に分泌される場合又は細胞が
培養中にウィルスによって細胞溶解される場合は、細胞
培養上清である。或いは、該無細胞抽出物は、細胞懸濁
液に、化学的、機械的又は酵素的な細胞溶解処理を施
し、細胞断片(cell debris) から液体成分を分離するこ
とによっても得ることができる。
化された蛋白質は、真核細胞の培養物、好ましくは酵母
又は哺乳類細胞の培養物に由来する無細胞抽出物(acell
uarextract)から精製するのが有利である。該無細胞抽
出物は、蛋白質が培養培地に分泌される場合又は細胞が
培養中にウィルスによって細胞溶解される場合は、細胞
培養上清である。或いは、該無細胞抽出物は、細胞懸濁
液に、化学的、機械的又は酵素的な細胞溶解処理を施
し、細胞断片(cell debris) から液体成分を分離するこ
とによっても得ることができる。
【００１３】本発明の枠内において、二価金属イオン
は、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+及びＣａ2+から選
ばれるのが有利である。該金属イオンは、塩の形態で添
加されるのが好ましい。該塩としては、例えば、ＺｎＣ
ｌ2、ＣｕＳＯ4、ＣｏＳＯ4、ＮｉＳＯ4及びＣａＣｌ2
などを例示することができる。
は、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+及びＣａ2+から選
ばれるのが有利である。該金属イオンは、塩の形態で添
加されるのが好ましい。該塩としては、例えば、ＺｎＣ
ｌ2、ＣｕＳＯ4、ＣｏＳＯ4、ＮｉＳＯ4及びＣａＣｌ2
などを例示することができる。
【００１４】一般に、粗製標品に添加されるべき上記金
属イオンの使用量は、当該金属イオン及び除去すべき成
分の性質により変わり得る。当業者であれば、特定のパ
ラメーターの関数として最終的な最適濃度を調整するこ
とができる。しかしながら、粗製標品中に存在する夾雑
物は、金属イオンを最終濃度１０ｍＭ以上、好ましくは
４０ｍＭ以上、より好ましくは６０ｍＭ以上、最も好ま
しくは８０ｍＭ以上に添加すると、直ちに沈殿させるこ
とができる。上記金属イオンを大量に添加することも可
能であるが、一般には、最終濃度約１００〜１２０ｍＭ
を越える必要はない。
属イオンの使用量は、当該金属イオン及び除去すべき成
分の性質により変わり得る。当業者であれば、特定のパ
ラメーターの関数として最終的な最適濃度を調整するこ
とができる。しかしながら、粗製標品中に存在する夾雑
物は、金属イオンを最終濃度１０ｍＭ以上、好ましくは
４０ｍＭ以上、より好ましくは６０ｍＭ以上、最も好ま
しくは８０ｍＭ以上に添加すると、直ちに沈殿させるこ
とができる。上記金属イオンを大量に添加することも可
能であるが、一般には、最終濃度約１００〜１２０ｍＭ
を越える必要はない。
【００１５】本発明の方法は、酸性ｐＨないし中性ｐＨ
において、一般にはｐＨ７．５又は７．５未満において
実施するのが有利であり、若干酸性のｐＨ６〜７の範囲
において実施するのが好ましい。
において、一般にはｐＨ７．５又は７．５未満において
実施するのが有利であり、若干酸性のｐＨ６〜７の範囲
において実施するのが好ましい。
【００１６】沈殿後、上清は、混合物を遠心分離し、次
いでデカンテーションすることにより回収するのが有利
である。
いでデカンテーションすることにより回収するのが有利
である。
【００１７】この方法により、粗製標品中に存在する可
能性のあるビリオン(virions) を、簡単にかつ効率よく
除去できる。次いで、必要ならば、沈殿上清（precipit
ation supernatant ）中に存在する高度にグルコシル化
された蛋白質の精製を、各種の方法を用いてより精密に
行っても良い。
能性のあるビリオン(virions) を、簡単にかつ効率よく
除去できる。次いで、必要ならば、沈殿上清（precipit
ation supernatant ）中に存在する高度にグルコシル化
された蛋白質の精製を、各種の方法を用いてより精密に
行っても良い。
【００１８】本発明の特定の実施態様によれば、本発明
は、ＨＩＶウィルスｇｐ１２０又はＨＩＶウィルスｇｐ
１６０の可溶性の変異体(variant) を精製する方法が提
供される。ｇｐ１６０の変異体の幾つかは、例えば、特
許出願ＥＰＡ２４５ １３６に記載されている。上記ｇ
ｐ１２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体は、特に組換Ｄ
ＮＡ技術を用いて製造することができる。該製造用に設
計されたベクターとしては、例えば、ゲノム中にｇｐ１
２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体をコードするＤＮＡ
フラグメントが挿入されたプラスミド又はワクシニアウ
ィルス(vaccinia virus)であって、該フラグメントが、
その発現（転写及び翻訳）を可能とする適当な領域の制
御下に置かれているものを挙げることができる。
は、ＨＩＶウィルスｇｐ１２０又はＨＩＶウィルスｇｐ
１６０の可溶性の変異体(variant) を精製する方法が提
供される。ｇｐ１６０の変異体の幾つかは、例えば、特
許出願ＥＰＡ２４５ １３６に記載されている。上記ｇ
ｐ１２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体は、特に組換Ｄ
ＮＡ技術を用いて製造することができる。該製造用に設
計されたベクターとしては、例えば、ゲノム中にｇｐ１
２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体をコードするＤＮＡ
フラグメントが挿入されたプラスミド又はワクシニアウ
ィルス(vaccinia virus)であって、該フラグメントが、
その発現（転写及び翻訳）を可能とする適当な領域の制
御下に置かれているものを挙げることができる。
【００１９】最後に、本発明は、標品、例えば、ポック
スウィルスにより細胞培養物を感染させることにより得
られる細胞溶解物の上清から、ポックスウィルスを精製
又は濃縮する方法であって、（ｉ）該標品に、沈殿する
混合物を形成するのに充分な量の二価金属イオンを添加
する工程、及び（ｉｉ）沈殿後、沈殿物の形態で該ポッ
クスウィルスを回収することを特徴とする方法を提供す
るものでもある。
スウィルスにより細胞培養物を感染させることにより得
られる細胞溶解物の上清から、ポックスウィルスを精製
又は濃縮する方法であって、（ｉ）該標品に、沈殿する
混合物を形成するのに充分な量の二価金属イオンを添加
する工程、及び（ｉｉ）沈殿後、沈殿物の形態で該ポッ
クスウィルスを回収することを特徴とする方法を提供す
るものでもある。
【００２０】
【実施例】実施例１Ａ．リコンビナントワクシニアウィ
ルス（recombinant vaccinia virus）に感染した細胞の
培養におけるＨＩＶ１−ＢＲＵからのｇｐ１２０の産生
ＢＨＫ−２１細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有Ｇ
ＭＥＭ培地（ギブコ(Gibco) ）中で培養する。細胞が集
密的（confluent ）になると（５．８×１０6 細胞／ｍ
ｌ）、培地を除去し、細胞層（cellular lawn ）を５０
ｍｌのＰＢＳ（ダベルッコーの食塩加リン酸緩衝液(Dub
elcco's phosphate buffer salt)、セロムド(Seromed)
）で２回洗浄し、ＦＣＳを含有しない新鮮なＧＭＥＭ
培地を添加する。特許出願ＥＰＡ ２４５１３６に記載
されているワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１３２を、感
染度１０-1ｐｆｕ（プラークフォーミングユニット(pla
queforming units)）まで添加し、７２時間感染させ
る。溶解産物を２０分間１０，０００ｇで遠心分離し、
細胞の破片（cell debris ）を除去し、特にｇｐ１２０
とウィルス粒子（virions ）を含有する上清を回収す
る。
ルス（recombinant vaccinia virus）に感染した細胞の
培養におけるＨＩＶ１−ＢＲＵからのｇｐ１２０の産生
ＢＨＫ−２１細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有Ｇ
ＭＥＭ培地（ギブコ(Gibco) ）中で培養する。細胞が集
密的（confluent ）になると（５．８×１０6 細胞／ｍ
ｌ）、培地を除去し、細胞層（cellular lawn ）を５０
ｍｌのＰＢＳ（ダベルッコーの食塩加リン酸緩衝液(Dub
elcco's phosphate buffer salt)、セロムド(Seromed)
）で２回洗浄し、ＦＣＳを含有しない新鮮なＧＭＥＭ
培地を添加する。特許出願ＥＰＡ ２４５１３６に記載
されているワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１３２を、感
染度１０-1ｐｆｕ（プラークフォーミングユニット(pla
queforming units)）まで添加し、７２時間感染させ
る。溶解産物を２０分間１０，０００ｇで遠心分離し、
細胞の破片（cell debris ）を除去し、特にｇｐ１２０
とウィルス粒子（virions ）を含有する上清を回収す
る。
【００２１】Ｂ．ｇｐ１２０の精製１Ｍ塩化亜鉛（ZnCl
2 ）溶液１．３ｍｌを、上記で得られた培養上清２０ｍ
ｌに添加し、ZnCl2 の最終濃度を６０ｍＭとする。この
混合物のｐＨは約６．８である。混合物を氷上に１時間
放置し、沈殿上清（precipitation supernatant ）を３
０００ｒ／分で２０分間、ヘラエウス（Heraeus） ア
ールエフ（RF） ミニフュージ（Minifuge） 遠心分離
機にて遠心分離し回収する。上清は、培養上清中に存在
する初期量のｇｐ１２０を含有しているが、ウィルス粒
子はもはや含有していない。分析のため、以下に示す方
法によって、総蛋白、ｇｐ１２０の定量及びワクシニア
ウィルスのタイトレーション（titration ）を行う。こ
れらの量については、ZnCl2 処理をしていない粗培養上
清においても並行して測定する。
2 ）溶液１．３ｍｌを、上記で得られた培養上清２０ｍ
ｌに添加し、ZnCl2 の最終濃度を６０ｍＭとする。この
混合物のｐＨは約６．８である。混合物を氷上に１時間
放置し、沈殿上清（precipitation supernatant ）を３
０００ｒ／分で２０分間、ヘラエウス（Heraeus） ア
ールエフ（RF） ミニフュージ（Minifuge） 遠心分離
機にて遠心分離し回収する。上清は、培養上清中に存在
する初期量のｇｐ１２０を含有しているが、ウィルス粒
子はもはや含有していない。分析のため、以下に示す方
法によって、総蛋白、ｇｐ１２０の定量及びワクシニア
ウィルスのタイトレーション（titration ）を行う。こ
れらの量については、ZnCl2 処理をしていない粗培養上
清においても並行して測定する。
【００２２】総蛋白量の定量は、カデンバッハ ビー
（Kadenbach B ）によって記載されたビウレット法（Bi
uret method, Biochem. Z (1966) 344: 49-75 ）に従っ
て測定する。即ち、ZnCl2 を用いた沈殿処理後得られる
上清３ｍｌを、３００μｌの３Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）で処理する。２０℃で１時間後、蛋白質を沈殿さ
せ、溶液を３０００回転／分で２０分間、ヘラエウス
（Heraeus ） アールエフ（RF） ミニフュージ（Mini
fuge）遠心分離機にて遠心分離する。上清を除去し、ペ
レット（pellet）を１ｍｌのビウレット溶液（12mM硫酸
銅( CuSO4 , 5H2 O)、31.89mM 酒石酸ナトリウムカリウ
ム(KNa tartrate)、200mM 水酸化ナトリウム(NaOH)及び
30.12mM ヨウ化カリウム(IK)）に溶解する。１５分後、
蛋白質をビウレット溶液に溶解し、１ｍｌのミリ−キュ
ウ水（Milli-Q water ）を添加する。５４６ｎｍでの吸
光度（optical density ）（ＯＤ）を１ｃｍのキュベッ
ト中で、空気に対して測定する。又、ビウレット溶液と
水のみを加えた吸収ブランクのＯＤも測定する。ＯＤ値
は、試料の場合ＯＤ．Ｅとし、吸収ブランクの場合Ｏ
Ｄ．Ｔとする。５０〜１００ｍｇのシアン化カリウム
（KCN ）をキュベットに添加し、スパチュラで混合して
溶液とする。２〜５分後、５４６ｎｍでのＯＤを測定
し、その値を試料の場合はＯＤ．Ｅ／ＫＣＮとし、吸収
ブランクの場合ＯＤ．Ｔ／ＫＣＮとする。試料中の総蛋
白量（Ｑ）を、以下の式を用いて計算する。
（Kadenbach B ）によって記載されたビウレット法（Bi
uret method, Biochem. Z (1966) 344: 49-75 ）に従っ
て測定する。即ち、ZnCl2 を用いた沈殿処理後得られる
上清３ｍｌを、３００μｌの３Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）で処理する。２０℃で１時間後、蛋白質を沈殿さ
せ、溶液を３０００回転／分で２０分間、ヘラエウス
（Heraeus ） アールエフ（RF） ミニフュージ（Mini
fuge）遠心分離機にて遠心分離する。上清を除去し、ペ
レット（pellet）を１ｍｌのビウレット溶液（12mM硫酸
銅( CuSO4 , 5H2 O)、31.89mM 酒石酸ナトリウムカリウ
ム(KNa tartrate)、200mM 水酸化ナトリウム(NaOH)及び
30.12mM ヨウ化カリウム(IK)）に溶解する。１５分後、
蛋白質をビウレット溶液に溶解し、１ｍｌのミリ−キュ
ウ水（Milli-Q water ）を添加する。５４６ｎｍでの吸
光度（optical density ）（ＯＤ）を１ｃｍのキュベッ
ト中で、空気に対して測定する。又、ビウレット溶液と
水のみを加えた吸収ブランクのＯＤも測定する。ＯＤ値
は、試料の場合ＯＤ．Ｅとし、吸収ブランクの場合Ｏ
Ｄ．Ｔとする。５０〜１００ｍｇのシアン化カリウム
（KCN ）をキュベットに添加し、スパチュラで混合して
溶液とする。２〜５分後、５４６ｎｍでのＯＤを測定
し、その値を試料の場合はＯＤ．Ｅ／ＫＣＮとし、吸収
ブランクの場合ＯＤ．Ｔ／ＫＣＮとする。試料中の総蛋
白量（Ｑ）を、以下の式を用いて計算する。
【００２３】Ｑ＝７×（ＯＤ．Ｅ−ＯＤ．Ｅ／ＫＣＮ）
−（ＯＤ．Ｔ−ＯＤ．Ｔ／ＫＣＮ）ｇｐ１２０の定量
を、２種の抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を、一次抗
体及び二次抗体として使用し（但し二次抗体はビオチン
化されている）、ＥＬＩＳＡテストに従って測定する。
そのような判定の方法に関する誤差のマージン（margi
n）は、±２０％のオーダーである。
−（ＯＤ．Ｔ−ＯＤ．Ｔ／ＫＣＮ）ｇｐ１２０の定量
を、２種の抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を、一次抗
体及び二次抗体として使用し（但し二次抗体はビオチン
化されている）、ＥＬＩＳＡテストに従って測定する。
そのような判定の方法に関する誤差のマージン（margi
n）は、±２０％のオーダーである。
【００２４】ウィルスのタイトレーションは、ＢＨＫ−
２１細胞で測定する。１０6 個のＢＨＫ−２１細胞を、
２ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ培地中に接種する。
培養は３５×１０ｍｍのディッシュ中で３７℃で行う。
２４時間後、培地を取り除き、２００μｌのワクシニア
ウィルスのＰＢＳ希釈液を細胞に添加する。３７℃で１
時間吸着させ、その後、２ｍｌの５％ＦＣＳ含有ＧＭＥ
Ｍ培地を添加し、感染を３７℃で２４時間維持する。終
了後培地を除去し、細胞を１ｍｌのニュートラルレッド
（neutral red 、ギブコ(Gibco) ）で染色する。白く残
っている溶菌のプラーク（lysisplaque）をカウントす
る。
２１細胞で測定する。１０6 個のＢＨＫ−２１細胞を、
２ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ培地中に接種する。
培養は３５×１０ｍｍのディッシュ中で３７℃で行う。
２４時間後、培地を取り除き、２００μｌのワクシニア
ウィルスのＰＢＳ希釈液を細胞に添加する。３７℃で１
時間吸着させ、その後、２ｍｌの５％ＦＣＳ含有ＧＭＥ
Ｍ培地を添加し、感染を３７℃で２４時間維持する。終
了後培地を除去し、細胞を１ｍｌのニュートラルレッド
（neutral red 、ギブコ(Gibco) ）で染色する。白く残
っている溶菌のプラーク（lysisplaque）をカウントす
る。
【００２５】結果を以下の表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】この結果から、ｇｐ１２０蛋白は、ZnCl2
によって沈殿しないことが判る。一方、ほとんどの不純
物の蛋白は、沈殿する。同時に、ワクシニアウィルス
は、沈殿物のペレット中に除去される。
によって沈殿しないことが判る。一方、ほとんどの不純
物の蛋白は、沈殿する。同時に、ワクシニアウィルス
は、沈殿物のペレット中に除去される。
【００２８】それゆえ、この方法を用いて、一段階でウ
ィルス粒子と５０％以上の不純物蛋白を除去することが
可能である。
ィルス粒子と５０％以上の不純物蛋白を除去することが
可能である。
【００２９】実施例２〜６ｇｐ１２０を含有する無細胞
抽出物（acellular extract ）を実施例１のＡと同様に
して得る。同時に、ZnCl2 の最終濃度のみを５ｍＭから
８０ｍＭに変化させて、実施例１のＢに示される方法と
同様にしてｇｐ１２０を精製する。これら実験の結果を
以下の表２に示す。
抽出物（acellular extract ）を実施例１のＡと同様に
して得る。同時に、ZnCl2 の最終濃度のみを５ｍＭから
８０ｍＭに変化させて、実施例１のＢに示される方法と
同様にしてｇｐ１２０を精製する。これら実験の結果を
以下の表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】これらの結果から、不純物蛋白及びワクシ
ニアウィルスは、５ｍＭのZnCl2 を用いる場合から沈殿
し始めることが判る。ｇｐ１２０は、判定の方法に関す
る±２０％の誤差のマージン（margin）を考慮すると、
沈殿しないと考えられる。
ニアウィルスは、５ｍＭのZnCl2 を用いる場合から沈殿
し始めることが判る。ｇｐ１２０は、判定の方法に関す
る±２０％の誤差のマージン（margin）を考慮すると、
沈殿しないと考えられる。
【００３２】実施例７１Ｍ塩化カルシウム（CaCl2 ）溶
液１．３ｍｌを、実施例１のＡに記載の様にして得られ
た培養上清２０ｍｌに添加し、CaCl2 の最終濃度が６０
ｍＭにする。この混合物のｐＨは約６．８である。混合
物を氷上に１時間放置し、沈殿上清を３０００ｒ／分で
２０分間、ヘラエウス（Heraeus ） アールエフ（RF）
ミニフュージ（Minifuge） 遠心分離機にて遠心分離
し回収する。上清は、培養上清中に存在する初期量のｇ
ｐ１２０を含有しているが、ウィルス粒子はもはや含有
していない。分析のため、実施例１のＢに示す方法によ
って、総蛋白、ｇｐ１２０の量及びワクシニアウィルス
のタイトレーションを測定する。これらの量について
は、CaCl2 処理をしていない粗培養上清においても並行
して測定する。
液１．３ｍｌを、実施例１のＡに記載の様にして得られ
た培養上清２０ｍｌに添加し、CaCl2 の最終濃度が６０
ｍＭにする。この混合物のｐＨは約６．８である。混合
物を氷上に１時間放置し、沈殿上清を３０００ｒ／分で
２０分間、ヘラエウス（Heraeus ） アールエフ（RF）
ミニフュージ（Minifuge） 遠心分離機にて遠心分離
し回収する。上清は、培養上清中に存在する初期量のｇ
ｐ１２０を含有しているが、ウィルス粒子はもはや含有
していない。分析のため、実施例１のＢに示す方法によ
って、総蛋白、ｇｐ１２０の量及びワクシニアウィルス
のタイトレーションを測定する。これらの量について
は、CaCl2 処理をしていない粗培養上清においても並行
して測定する。
【００３３】これら実験の結果を以下の表３にまとめ
る。
る。
【００３４】
【表３】
【００３５】これらの結果から、CaCl2 は、ZnCl2 と同
様にほとんど全てののワクシニアウィルスを沈殿させる
が、ｇｐ１２０は溶液中に残留することが判る。
様にほとんど全てののワクシニアウィルスを沈殿させる
が、ｇｐ１２０は溶液中に残留することが判る。
【００３６】実施例８〜１０ｇｐ１２０を含有する無細
胞抽出物を実施例１のＡの記載と同様にして得る。同時
に、CaCl2 の最終濃度のみを２０ｍＭから８０ｍＭに変
化させて、実施例７に示される方法と同様にしてｇｐ１
２０を精製する。これら実験の結果を以下の表４に示
す。
胞抽出物を実施例１のＡの記載と同様にして得る。同時
に、CaCl2 の最終濃度のみを２０ｍＭから８０ｍＭに変
化させて、実施例７に示される方法と同様にしてｇｐ１
２０を精製する。これら実験の結果を以下の表４に示
す。
【００３７】
【表４】
【００３８】これらの結果から、不純物蛋白及びワクシ
ニアウィルスは、１０ｍＭ CaCl2 の時から沈殿し始め
ることが判る。
ニアウィルスは、１０ｍＭ CaCl2 の時から沈殿し始め
ることが判る。
【００３９】実施例１１ＨＩＶ１−ＢＲＵ由来のｇｐ１
６０の可溶性の変異体を含有する無細胞抽出物を、特許
出願ＥＰＡ ２４５１３５に記載のワクシニアウィルス
ＶＶＴＧ１１６３を、実施例１のＡに記載の方法に従っ
てＢＨＫ−２１細胞に感染させて得る。
６０の可溶性の変異体を含有する無細胞抽出物を、特許
出願ＥＰＡ ２４５１３５に記載のワクシニアウィルス
ＶＶＴＧ１１６３を、実施例１のＡに記載の方法に従っ
てＢＨＫ−２１細胞に感染させて得る。
【００４０】１Ｍ塩化亜鉛（ZnCl2 ）溶液８８０μｌ
を、上記記載の様にして得られたｇｐ１６０の可溶性の
変異体を含有する培養上清２０ｍｌに添加し、ZnCl2 の
最終濃度を４０ｍＭにする。混合物を氷上に１時間放置
し、沈殿上清を３０００ｒ／分で２０分間、ヘラエウス
（Heraeus ） アールエフ（RF） ミニフュージ（Mini
fuge） 遠心分離機にて遠心分離し回収する。ZnCl2 で
の沈殿処理後の上清中に存在するｇｐ１６０変異体の量
は、培養上清中に存在する量に匹敵する。一方、ほとん
どの不純物蛋白及びすべてのウィルス粒子は除去され
る。
を、上記記載の様にして得られたｇｐ１６０の可溶性の
変異体を含有する培養上清２０ｍｌに添加し、ZnCl2 の
最終濃度を４０ｍＭにする。混合物を氷上に１時間放置
し、沈殿上清を３０００ｒ／分で２０分間、ヘラエウス
（Heraeus ） アールエフ（RF） ミニフュージ（Mini
fuge） 遠心分離機にて遠心分離し回収する。ZnCl2 で
の沈殿処理後の上清中に存在するｇｐ１６０変異体の量
は、培養上清中に存在する量に匹敵する。一方、ほとん
どの不純物蛋白及びすべてのウィルス粒子は除去され
る。
【００４１】実施例１２ＣＨＯ細胞をプラスミドｐＧＴ
３５５４を用いて形質転換する。このプラスミドは、予
めHindIII で切断しＤＮＡポリメラーゼＩ由来のクレノ
ーフラグメント（Klenow fragment ）で処理された（特
許出願ＦＲ ２，６００，３３４に記載の）プラスミド
ｐＴＧ３８４中に、PstIフラグメントを挿入し、（特許
出願ＷＯ８７／６２６０に記載の）ワクシニアベクター
ＶＶＴＧ１１６３由来の可溶性のＨＩＶ−１ ＢＲＵ
ｇｐ１６０変異体をコードするクレノーポリメラーゼで
処理することによって得られる。このようにクローン化
されたフラグメントは、アデノウィルス２（adenovirus
2）の後期主要プロモーター（late major promotor ）
の支配下に置かれる。
３５５４を用いて形質転換する。このプラスミドは、予
めHindIII で切断しＤＮＡポリメラーゼＩ由来のクレノ
ーフラグメント（Klenow fragment ）で処理された（特
許出願ＦＲ ２，６００，３３４に記載の）プラスミド
ｐＴＧ３８４中に、PstIフラグメントを挿入し、（特許
出願ＷＯ８７／６２６０に記載の）ワクシニアベクター
ＶＶＴＧ１１６３由来の可溶性のＨＩＶ−１ ＢＲＵ
ｇｐ１６０変異体をコードするクレノーポリメラーゼで
処理することによって得られる。このようにクローン化
されたフラグメントは、アデノウィルス２（adenovirus
2）の後期主要プロモーター（late major promotor ）
の支配下に置かれる。
【００４２】約１０6 個の細胞を、１０％の透析された
ＦＣＳ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポキ
サンチン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌの
キサンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５ｍ
ｇ／ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを添
加したＭＥＭα２０００培地（ギブコ）中に接種し、３
７℃で３日間５％ＣＯ2 の雰囲気下で培養する。培地は
２日間毎日、（５６℃で不活性化された）１０％のＦＣ
Ｓ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポキサン
チン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌのキサ
ンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５ｍｇ／
ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを添加し
た新鮮なＭＥＭα２０００培地で交換する。
ＦＣＳ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポキ
サンチン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌの
キサンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５ｍ
ｇ／ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを添
加したＭＥＭα２０００培地（ギブコ）中に接種し、３
７℃で３日間５％ＣＯ2 の雰囲気下で培養する。培地は
２日間毎日、（５６℃で不活性化された）１０％のＦＣ
Ｓ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポキサン
チン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌのキサ
ンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５ｍｇ／
ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを添加し
た新鮮なＭＥＭα２０００培地で交換する。
【００４３】終了後培養上清を除去し、実施例１１に記
載のように精製する。ZnCl2 での沈殿処理後の上清中に
存在するｇｐ１６０変異体の量は、培養上清中に存在す
る量に匹敵する。これに対して、全蛋白質の量はかなり
減少した。このことは、多くの割合の不純物蛋白質が除
去されることを示している。
載のように精製する。ZnCl2 での沈殿処理後の上清中に
存在するｇｐ１６０変異体の量は、培養上清中に存在す
る量に匹敵する。これに対して、全蛋白質の量はかなり
減少した。このことは、多くの割合の不純物蛋白質が除
去されることを示している。
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 1/30
C07K 14/16
C07K 14/55
C12P 21/00 - 21/02
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 真核細胞の培養物由来の粗製標品から高
度にグリコシル化された蛋白質を精製する方法であっ
て、(i)該粗製標品に、沈殿する混合物を形成するのに
充分な量の、亜鉛、銅、コバルト、ニッケル及びカルシ
ウムからなる群より選ばれる二価金属イオンを添加する
工程、および(ii)沈殿後、該混合物の上清から上記蛋白
質を回収する工程を包含する方法。 - 【請求項２】 細胞培養物に由来する無細胞抽出物の粗
製標品から高度にグリコシル化された蛋白質を精製する
請求項１に記載の方法であって、(i)該粗製標品に、沈
殿する混合物を形成するのに充分な量の、亜鉛、銅、コ
バルト、ニッケル及びカルシウムからなる群より選ばれ
る二価金属イオンを添加する工程、および(ii)沈殿後、
該混合物の上清から上記蛋白質を回収する工程を包含す
る方法。 - 【請求項３】 高度にグリコシル化された蛋白質を発現
するワクシニアウィルスを感染させた細胞培養物に由来
する無細胞抽出物の粗製標品から該高度にグリコシル化
された蛋白質を精製する請求項２に記載の方法であっ
て、(i)該粗製標品に、沈殿する混合物を形成するのに
充分な量の、亜鉛、銅、コバルト、ニッケル及びカルシ
ウムからなる群より選ばれる二価金属イオンを添加する
工程、および(ii)沈殿後、該混合物の上清から上記蛋白
質を回収する工程を包含する方法。 - 【請求項４】 蛋白質のグリコシル化レベルが４０％以
上の粗製標品から精製する請求項１乃至請求項３のいず
れかに記載の方法であって、(i)該粗製標品に、沈殿す
る混合物を形成するのに充分な量の、亜鉛、銅、コバル
ト、ニッケル及びカルシウムからなる群より選ばれる二
価金属イオンを添加する工程、および(ii)沈殿後、該混
合物の上清から上記蛋白質を回収する工程を包含する方
法。 - 【請求項５】 粗製標品に、亜鉛、銅、コバルト、ニッ
ケル及びカルシウムからなる群より選ばれる二価金属イ
オンを添加し、該金属イオンの最終濃度が１０ｍＭ以上
の混合物を形成する工程を包含する粗製標品から高度に
グリコシル化された蛋白質を精製する請求項１乃至請求
項４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 粗製標品に、亜鉛、銅、コバルト、ニッ
ケル及びカルシウムからなる群より選ばれる二価金属イ
オンを添加し、該金属イオンの最終濃度が２０ｍＭ以上
の混合物を形成する工程を包含する粗製標品から高度に
グリコシル化された蛋白質を精製する請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】 粗製標品に、亜鉛、銅、コバルト、ニッ
ケル及びカルシウムからなる群より選ばれる二価金属イ
オンを添加する工程を包含する粗製標品から高度にグリ
コシル化された蛋白質を精製する請求項１乃至請求項６
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 粗製標品に、塩の形態で、亜鉛、銅、コ
バルト、ニッケル及びカルシウムからなる群より選ばれ
る二価金属イオンを添加する工程を包含する粗製標品か
ら高度にグリコシル化された蛋白質を精製する請求項１
乃至請求項７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 高度にグリコシル化された蛋白質が、Ｈ
ＩＶウィルス由来のｇｐ１２０蛋白であることを特徴と
する、請求項１乃至請求項８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 高度にグリコシル化された蛋白質が、
ＨＩＶウィルス由来のｇｐ１６０蛋白の可溶性の変異体
であることを特徴とする、請求項１乃至請求項９のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項１１】 標品からポックスウィルスを精製又は
濃縮する方法であって、(i)該標品に、沈殿する混合物
を形成するのに充分な量の、亜鉛、銅、コバルト、ニッ
ケル及びカルシウムからなる群より選ばれる二価金属イ
オンを添加する工程、および(ii)沈殿後、沈殿物の形態
で上記ポックスウィルスを回収する工程を包含する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9101830A FR2672895B1 (fr) | 1991-02-15 | 1991-02-15 | Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee. |
| FR9101830 | 1991-02-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04312600A JPH04312600A (ja) | 1992-11-04 |
| JP3376430B2 true JP3376430B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=9409766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02794092A Expired - Fee Related JP3376430B2 (ja) | 1991-02-15 | 1992-02-14 | 高度にグリコシル化された蛋白質の精製方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5276141A (ja) |
| EP (1) | EP0499541B1 (ja) |
| JP (1) | JP3376430B2 (ja) |
| AT (1) | ATE141283T1 (ja) |
| CA (1) | CA2061167C (ja) |
| DE (1) | DE69212660T2 (ja) |
| DK (1) | DK0499541T3 (ja) |
| ES (1) | ES2092067T3 (ja) |
| FR (1) | FR2672895B1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284874B1 (en) * | 1994-06-17 | 2001-09-04 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste |
| US5760189A (en) * | 1995-06-02 | 1998-06-02 | Genetics Institute, Inc. | Protein recovery & purification methods |
| US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
| ES2315234T3 (es) * | 1999-06-25 | 2009-04-01 | Wyeth Holdings Corporation | Extraccion de proteinas de la membrana intrega. |
| AU1198701A (en) * | 1999-10-13 | 2001-04-23 | Lexicon Genetics Incorporated | Novel human membrane proteins |
| US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| AU2004309177A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Bharat Biotech International Limited | A process for the preparation and purification of recombinant proteins |
| CN101343315B (zh) * | 2007-05-29 | 2012-06-13 | 厦门大学 | 截短的人乳头瘤病毒6型l1蛋白 |
| US20160130324A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof |
| BR112018010160A8 (pt) | 2015-11-19 | 2019-02-26 | Shire Human Genetic Therapies | inibidor da c1 esterase humana recombinante e usos do mesmo |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3947324A (en) * | 1975-04-21 | 1976-03-30 | G. D. Searle And Co. | Method for isolating high purity peroxidase |
| JPS6098988A (ja) * | 1983-11-01 | 1985-06-01 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| EP0213099A3 (de) * | 1985-08-23 | 1989-07-19 | Cederroth Nordic Aktiebolag | Mittel mit antiphlogistischer, immunstimulierender und zytoprotektiver Wirkung, ihre Herstellung und pharmazeutische Verwendungen |
| US4798886A (en) * | 1986-03-24 | 1989-01-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Mutual separation of proteins |
| FR2597344B1 (fr) * | 1986-04-16 | 1989-06-23 | Merieux Inst | Perfectionnement au procede de purification d'antigenes proteiques de bacteries appartenant au genre bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire. |
| DD270466A5 (de) * | 1987-01-30 | 1989-08-02 | �������������@��������@�K@���������@����Kk�� | Verfahren zur rueckgewinnung von somatropinen aus verduennten waessrigen loesungen |
| ATE95188T1 (de) * | 1987-12-23 | 1993-10-15 | Immuno Ag | Zellulaere amphipatische proteine in aggregierten formen und verfahren zur herstellung und reinigung diese proteine. |
| US4992372A (en) * | 1989-02-02 | 1991-02-12 | Pokora Alexander R | Method for removing impurities from peroxidase solutions |
| US5101014A (en) * | 1989-02-10 | 1992-03-31 | United States Of America | Process for the purification of a 69,000 da outer membrane protein of Bordetella pertussis |
-
1991
- 1991-02-15 FR FR9101830A patent/FR2672895B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-02-13 DE DE69212660T patent/DE69212660T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-13 ES ES92400381T patent/ES2092067T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-13 DK DK92400381.7T patent/DK0499541T3/da active
- 1992-02-13 AT AT92400381T patent/ATE141283T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-13 CA CA002061167A patent/CA2061167C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-13 EP EP92400381A patent/EP0499541B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-14 JP JP02794092A patent/JP3376430B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-14 US US07/835,392 patent/US5276141A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69212660D1 (de) | 1996-09-19 |
| EP0499541B1 (fr) | 1996-08-14 |
| DE69212660T2 (de) | 1997-03-13 |
| ES2092067T3 (es) | 1996-11-16 |
| EP0499541A1 (fr) | 1992-08-19 |
| US5276141A (en) | 1994-01-04 |
| JPH04312600A (ja) | 1992-11-04 |
| FR2672895B1 (fr) | 1995-05-12 |
| ATE141283T1 (de) | 1996-08-15 |
| CA2061167C (fr) | 2002-06-11 |
| CA2061167A1 (fr) | 1992-08-16 |
| DK0499541T3 (da) | 1996-12-02 |
| FR2672895A1 (fr) | 1992-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2755817B2 (ja) | パルボウイルスキャプシド | |
| JP3376430B2 (ja) | 高度にグリコシル化された蛋白質の精製方法 | |
| JPH09503396A (ja) | 診断用及び治療用の精製ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白 | |
| HU197357B (en) | Process for cleaning and reactivating precipitated heterologous proteins | |
| HU228076B1 (en) | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products | |
| US5550052A (en) | Hybrid cell line formed between T4 lymphocytes and tumoral lymphoid type cells | |
| Woodworth et al. | Expression and initial characterization of five site-directed mutants of the N-terminal half-molecule of human transferrin | |
| EP0361902B1 (en) | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies | |
| Adair et al. | Cell wall regeneration in Chlamydomonas: accumulation of mRNAs encoding cell wall hydroxyproline-rich glycoproteins. | |
| FI98704C (fi) | Menetelmä valmistaa reseptoreita, joilla on sitomisaktiivisuus pienen reseptoriryhmän nuhaviruksiin ja niiden käyttö | |
| JPH04502106A (ja) | 第ｘ３因子の精製 | |
| Cantell et al. | [7] Production and partial purification of human immune interferon | |
| JP3009458B2 (ja) | ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターをコードするｄｎａ配列を含むプラスミド | |
| JPS6229975A (ja) | 粗ｔＰＡの精製法 | |
| JPH023696A (ja) | ポリペプチドのメチオニンでの開裂方法 | |
| Sowadski | Crystallization of membrane proteins | |
| CZ34797A3 (en) | Process for preparing soluble recombinant proteins from bacterial cells | |
| FI96864B (fi) | Ei-terapeuttisesti käytettävä HIV:n glykoproteiini GP 160 ja menetelmä sen valmistamiseksi | |
| JP3040189B2 (ja) | タンパクの抽出方法 | |
| KR100201760B1 (ko) | 사람 면역결핍 바이러스 타입 1항원 단백질 지피 1(gp41) 및 지에이지 3(gag3)의 제조방법 | |
| JPS59144796A (ja) | 単一クロ−ン抗体 | |
| JPH0413698A (ja) | 生理活性ペプチド | |
| US4758513A (en) | Human T or B cell lines and a process for producing immunologically active substances using the same | |
| JP2852672B2 (ja) | 抗ヒトジストロフィンモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ | |
| RU2045535C1 (ru) | Способ получения проинсулина человека |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |