ES2315234T3

ES2315234T3 - Extraccion de proteinas de la membrana intrega.

Info

Publication number: ES2315234T3
Application number: ES00941593T
Authority: ES
Inventors: Sanjay Lakhotia; Michael R. Biehl
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2020-06-20
Also published as: DE60040602D1; DK1189935T3; WO2001000668A1; CN1358196A; AU777738B2; EP1189935A1; ATE412007T1; BR0011817B1; US7553634B1; PT1189935E; CA2370694A1; JP2003503041A; IL146894A0; KR100644494B1; CA2370694C; AU5628400A; CN1181093C; MXPA01013264A; EP1189935B1; KR20020026462A

Abstract

Procedimiento para la extracción de proteínas de la membrana interna gram-negativas, expresadas de manera natural o recombinante de bacterias o células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, que comprende: (a) lisar las bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante en un caldo de fermentación; (b) diafiltrar el caldo de fermentación lisado de (a) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho tampón elimina los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado, y que utiliza un agente quelante para impedir la proteólisis; (c) diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración; en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución; y (d) recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (c).

Description

Extracción de proteínas de la membrana íntegra.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción de proteínas de la membrana íntegra gram-negativas de bacterias o de células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante por diafiltración diferencial de flujo tangencial en detergente.

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Antecedentes de la invención

Las bacterias gram-negativas poseen tanto una membrana interna como una membrana externa. En conjunto, las proteínas contenidas en estas membranas se denominan proteínas de la membrana íntegra. Las proteínas de la membrana íntegra naturales pueden extraerse de bacterias gram-negativas en cantidades relativamente pequeñas. Las técnicas de expresión recombinantes permiten que estas proteínas se expresen en bacterias en cantidades aumentadas.

La purificación discontinua a pequeña escala de dichas proteínas de la membrana íntegra recombinantes ha implicado una etapa de extracción utilizando la centrifugación para extraer las proteínas del lisado de la célula bacteriana, seguido de purificación corriente abajo utilizando técnicas convencionales.

Sin embargo, la centrifugación no se prefiere para la extracción de dichas proteínas a gran escala, porque es un procedimiento molesto. Un procedimiento de extracción a mayor escala es deseable a fin de obtener cantidades de proteínas suficientes para la fabricación económica.

Por lo tanto, hay necesidad de un procedimiento para extraer proteínas de la membrana íntegra gram-negativas naturales o recombinantes que impida la utilización de la centrifugación y sea por consiguiente más adecuado al aumento de escala. Dos de dichas proteínas son las proteínas de la membrana externa lipidadas P4 y P6 de Haemophilus influenzae.

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Sumario de la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en desarrollar un procedimiento para extraer proteínas de la membrana íntegra gram-negativas naturales o recombinantes que impidan la utilización de centrifugación y por consiguiente sea más adecuado para el aumento de la escala.

Otro objetivo de la presente invención consiste en desarrollar un procedimiento para disolver selectivamente las proteínas de la membrana interna y externa de bacterias gram-negativas.

Otro objetivo más de la presente invención consiste en desarrollar procedimientos para extraer las formas lipidadas de las proteínas recombinantes P4 y P6 de la membrana externa de H. influenzae procedentes de E. coli.

Estos y otros objetivos de la invención expuestos a continuación se consiguen mediante procedimientos que utilizan diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente e impiden la utilización de la centrifugación. Estos procedimientos proporcionan también la extracción continua de las proteínas deseadas.

Para la extracción de proteínas de la membrana interna gram-negativas, expresadas de manera natural o recombinante de bacterias o células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante, respectivamente, por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, se utiliza un procedimiento que comprende:

(a): lisar las bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante en un caldo de fermentación;

(b): diafiltrar el caldo de fermentación lisado de (a) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho tampón elimina los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado, y que utiliza un agente quelante para impedir la proteólisis;

(c): diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución; y

(d): recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (c).

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Para la extracción de proteínas gram-negativas de la membrana externa, expresadas de manera natural o recombinante de bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante, respectivamente, por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, se utiliza un procedimiento que comprende:

(d): diafiltrar el lisado procedente de (c) con el tampón procedente de (c), y utilizar un catión divalente procedente de (c) en ausencia de detergente, para reducir la concentración del detergente procedente de (c);

(e): diafiltrar el lisado procedente de (d) con el tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante y un detergente para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa; y

(f): recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (e).

Si se desea, puede realizarse la extracción adicional añadiendo las etapas siguientes al procedimiento anterior:

(g): diafiltrar el lisado procedente de (e) con los reactivos de (e), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;

(h): diafiltrar el lisado procedente de (g) con los reactivos de (e); y

(i): recoger las proteínas de la membrana externa eliminadas en (h).

Para la extracción de la proteína P4 recombinante lipidada (rP4 lipidada) de H. influenzae de las células hospedadoras bacterianas por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, se utiliza un procedimiento que comprende:

(a): lisar las células hospedadoras bacterianas en un caldo de fermentación;

(c): diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución;

(e): diafiltrar el lisado procedente de (d) con el tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante y un detergente para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa;

(f): diafiltrar el lisado procedente de (e) con el tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante y un detergente para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(g): recoger la rP4 lipidada eliminada en (f).

Si se desea, puede realizarse la extracción adicional de rP4 lipidada añadiendo las etapas siguientes al procedimiento anterior:

(h): diafiltrar el lisado procedente de (f) con los reactivos de (f), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;

(i): diafiltrar el lisado procedente de (h) con los reactivos de (f) para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(j): recoger la rP4 lipidada eliminada en (i).

Si se desea también, puede realizarse todavía la extracción adicional de rP4 lipidada añadiendo las etapas siguientes al procedimiento anterior:

(k): diafiltrar el lisado procedente de (j) con los reactivos de (f), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;

(l): diafiltrar el lisado procedente de (k) con los reactivos de (f) para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(m): recoger la rP4 lipidada eliminada en (l).

Si se desea se pueden utilizar unos ciclos adicionales de la extracción de la rP4 lipidada.

Para la extracción de la proteína P6 recombinante lipidada (rP6 lipidada) de H. influenzae de las células hospedadoras bacterianas por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, se utiliza un procedimiento que comprende:

(d): diafiltrar el lisado procedente de (c) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante para secuestrar el catión divalente e impedir la proteólisis y un disolvente para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa distintas de la rP6 lipidada;

(e): diafiltrar el lisado procedente de (d) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante para impedir la proteólisis, un detergente para eliminar las proteínas adicionales de la membrana externa y una sal para descomponer el complejo de la proteína de la membrana/membrana externa;

(f): diafiltrar el lisado procedente de (e) con los reactivos de (e), a excepción del detergente y la sal, con objeto de reducir la concentración de detergente;

(g): diafiltrar el lisado procedente de (f) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas adicionales unidas a la membrana celular externa y utilizar un agente quelante para impedir la proteólisis;

(h): diafiltrar el lisado procedente de (g) con el tampón procedente de (g) y el agente quelante de (g) para reducir la concentración del detergente procedente de (g);

(i): diafiltrar el lisado procedente de (h) con un compuesto de fosfato y un detergente para disolver y eliminar las proteínas adicionales unidas a la membrana celular externa;

(j): diafiltrar el lisado procedente de (i) con un compuesto de fosfato para reducir la concentración de detergente procedente de (i);

(k): calentar el lisado procedente de (j) para eliminar la rP6 lipidada de la membrana mientras se diafiltra este lisado con un compuesto de fosfato y un detergente para disolver, extraer y eliminar la rP6 lipidada; y

(l): recoger la rP6 lipidada eliminada en (k).

Si se desea, el procedimiento para extraer rP6 lipidada puede modificarse concentrando el lisado procedente de (j) antes de proceder a (k).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un análisis SDS-PAGE de las muestras tomadas de las corrientes de permeado durante el proceso de extracción para rP4 lipidada, tal como se describe en el Ejemplo 1 a continuación. Bandas: 1 - Marcadores de bajo peso molecular de Pharmacia; 2 - 0,1 \mug de patrón rP4 lipidada; 3 - 0,3 \mug de patrón rP4 lipidada; 4 - 1 \mug de patrón rP4 lipidada; 5 - Permeado de diafiltración con tampón de lisis (Hepes 10 mM, EDTA 1 mM); 6 - Permeado de diafiltración con Triton^{TM} X-100; 7 - Permeado de diafiltración con tampón Tris^{TM}; 8 - Permeado de 1\times diafiltración con tampón Zwittergent^{TM} 3-12; 9 - Permeado de 10\times diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12.

La Figura 2 representa el caudal de permeado de cuatro series durante el transcurso del procedimiento de extracción para rP4 lipidada tal como se describe en el Ejemplo 2 a continuación. El caudal se mide en litros/metros^{2} de área de la membrana/hora (lmh).

La Figura 3 representa un análisis SDS-PAGE de las muestras tomadas de las corrientes de permeado durante la primera parte del proceso de extracción para rP6 lipidada, tal como se describe en el Ejemplo 3 a continuación. Bandas: 1 - Marca 12 convencional; 2 - Permeado de diafiltración con tampón de lisis; 3 - Permeado de diafiltración con Triton^{TM} X-100; 4 - Permeado de diafiltración con tampón Tris^{TM}; 5 - Permeado de 1\times diafiltración con tampón Zwittergent^{TM} 3-14; 6 - Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-14/NaCl 0,5 N; 7 - Permeado de diafiltración con tampón Tris^{TM}; 8 - Permeado de diafiltración con Sarcosil.

La Figura 4 representa un análisis SDS-PAGE de las muestras tomadas de las corrientes de permeado durante la segunda parte del proceso de extracción para rP6 lipidada, tal como se describe en el Ejemplo 3 a continuación. Bandas: 1 - Marca 12 convencional; 2 - Permeado de diafiltración con tampón de tampón Tris^{TM}; 3 - Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12 a temperatura ambiente; 4 - Permeado de diafiltración con tampón Tris^{TM}; 5 - Permeado de la etapa de concentración; 6 - Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC; 7 - Permeado de diafiltración con tampón Tris^{TM} a 55ºC; 8 - Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC.

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Descripción detallada de la invención

Este procedimiento de la presente invención para extraer proteínas de la membrana íntegra presenta varias ventajas sobre los procedimientos alternativos. En primer lugar, este procedimiento combina los procedimientos de clarificación y extracción en una operación unitaria. El producto se extrae de las células y se separa del residuo celular con solamente un procedimiento continuo de diafiltración. Los métodos alternativos por lo general requieren una operación unitaria para la extracción y una segunda operación unitaria para la clarificación. La segunda ventaja es que las proteínas de la membrana se extraen en un estado semipurificado, que simplifica las etapas de tratamiento corriente abajo. Por último, este procedimiento es muy realizable a escala porque el único requisito es que el área superficial de las membranas aumente proporcionalmente con la cantidad de células.

Antes del comienzo del proceso de extracción de la presente invención, una proteína de la membrana íntegra de una bacteria gram-negativa se expresa en una célula hospedadora bacteriana homóloga o heteróloga por procedimientos convencionales, o se aísla la bacteria natural. El caldo de fermentación se lisa a continuación pasándolo a través de un homogeneizador para comenzar el proceso de extracción. En una forma de realización preferida de la presente invención, el homogeneizador es un microfluidizador.

El caldo de fermentación lisado se somete a continuación a un proceso diferencial de extracción con detergente utilizando tecnología de filtración de flujo tangencial. En este proceso, las células lisadas se diafiltran con una secuencia específica de soluciones tampón utilizando un sistema de flujo tangencial que incluye una membrana permeable con un corte o apertura de tamaño definido. Se selecciona la secuencia de las soluciones tampón para disolver las proteínas de la membrana interna en primer lugar y a continuación para disolver las proteínas de la membrana externa. Durante la diafiltración, las proteínas disueltas de tamaño aproximado menor del corte del peso molecular de la membrana pasan a través con el permeado, mientras que las proteínas mayores y las proteínas no disueltas se retienen.

Las soluciones tampón se cambian a continuación y se introduce un detergente para disolver y extraer las proteínas de la membrana externa. La secuencia de las etapas con tampón y detergente se controla para extraer la proteína deseada de la membrana externa de manera selectiva. La proteína extraída se purifica a continuación por medios convencionales tales como cromatografía de intercambio iónico.

Por lo tanto, los procesos de extracción de la presente invención permiten la disolución selectiva de las proteínas de la membrana interna y externa de bacterias gram-negativas. Las proteínas disueltas pasan a través de la membrana de ultrafiltración con el permeado, mientras que las proteínas no disueltas son retenidas por la membrana.

Las proteínas naturales de la membrana íntegra extraídas utilizando este procedimiento de la invención son extraídas de cualquier bacteria gram-negativa adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, Haemophilus influenzae (por ejemplo, las proteínas P4 y P6), Moraxella catarrhalis (por ejemplo, las proteínas UspA1 y UspA2) y Neisseria meningitidis del Grupo B.

Las proteínas recombinantes de la membrana íntegra extraídas utilizando el proceso de la invención se expresan en cualquier célula hospedadora bacteriana adecuada que contenga un vector recombinante, que a su vez contiene una secuencia nucleotídica que codifica la proteína deseada de la membrana íntegra recombinante. Ejemplos de dichas células hospedadoras bacterianas incluyen, pero no se limitan a, E. coli, Salmonella, Shigella y B. subtilis.

Las proteínas naturales o recombinantes que tienen un tamaño grande monomérico, multimérico o de agregado que se aproximan al del corte de la membrana, no deberían extraerse con esta membrana. Sin embargo, las proteínas gram-negativas que se expresan como cuerpos de inclusión en E. coli, tales como las proteínas gonocócicas o meningocócicas, pueden extraerse también mediante este procedimiento. Los cuerpos de inclusión son mayores que el tamaño de corte de la membrana y de este modo son retenidos por la membrana, mientras que otras proteínas son extraídas. Se añade a continuación urea o un agente desnaturalizante similar para disolver los cuerpos de inclusión. Se extraen a continuación las proteínas deseadas y se vuelven a naturalizar y se purifican por métodos convencionales.

El procedimiento de extracción de la presente invención está ejemplificado con las formas recombinantes de las proteínas P4 y P6 de Haemophilus influenzae, expresada en la célula hospedadora E. coli.

La proteína P4 (conocida también como proteína "e") de Haemophilus influenzae tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kD y se describe en la patente US nº 5.601.831. En su forma natural, la proteína P4 está lipidada. Para expresar de manera recombinante la proteína P4 lipidada, el gen P4 se extrae de la bacteria y se inserta en un vector de expresión apropiado. En los Ejemplos 1 y 2 a continuación, se utilizó el vector de expresión pBAD18-Cm (Guzman, L.-M., et al., J. Bacteriol., 177, 4121-4130 (1995)). Este vector contiene un activador inducible de arabinosa y otros elementos de control apropiados. El vector de expresión se inserta a continuación en una célula hospedadora bacteriana adecuada. En los ejemplos 1 y 2 a continuación, la célula hospedadora era la cepa BLR de E. coli (Novagen, Madison, WI). Si se utiliza un activador inducible, se añade un inductor para dar lugar a que la célula hospedadora exprese la proteína deseada. En los ejemplos 1 y 2 a continuación, el inductor fue L-arabinosa.

La proteína P6 (conocida también como PBOMP-1 y PAL) de Haemophilus influenzae tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kD y se describe en la patente US nº 5.110.908. En su forma natural, la proteína P4 está lipidada. Sin embargo, intentos previos para expresar de manera recombinante rP4 lipidada produjeron bajos niveles de expresión. La solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 60/141.067 pendiente de trámite, asignada comúnmente describe un sistema de expresión que produce rP6 lipidada. A fin de expresar de manera recombinante la proteína rP6 lipidada, el gen P6 se obtiene de la bacteria y se inserta en un vector de expresión apropiado. En los ejemplos 3 y 4 a continuación, se utilizó otra vez el vector de expresión pBAD18-CM. El vector de expresión se inserta a continuación en una célula hospedadora bacteriana adecuada. En los ejemplos 3 y 4 a continuación, la célula hospedadora fue otra vez la cepa BLR de E. coli. Si se utiliza un activador inducible, se añade un inductor para dar lugar a que la célula hospedadora exprese la proteína deseada. En los ejemplos 3 y 4 a continuación, el inductor fue L-arabinosa.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la membrana de diafiltración es de Millipore (Bedford, MA). Esta membrana es de celulosa regenerada, tiene un tamaño de corte de 1.000 kD y tiene un área superficial de 0,002 m^{2}/g de células en peso húmedo.

Puede utilizarse cualquier detergente disolvente de proteínas en el procedimiento de extracción incluyendo, sin limitación, un compuesto Zwittergent^{TM} tal como Zwittergent^{TM} 3-12 o Zwittergent^{TM} 3-14, un compuesto Triton^{TM} no iónico tal como Triton^{TM} X-100, sarcosil, un glucósido tal como octil-glucósido, nonil-glucósido o decil-glucósido, colato o desoxicolato o dodecil-maltósido. En las formas de realización preferidas, los detergentes son Zwittergent^{TM} 3-12, Triton^{TM} X-100 y sarcosil para las etapas específicas descritas en la presente memoria.

Una extensa variedad de compuestos pueden utilizarse como tampones en el procedimiento de extracción, siempre que el compuesto no sea retenido por la membrana de diafiltración. Dichos tampones incluyen, pero no se limitan a, Hepes, ácido 3-(N-morfolino)propano sulfónico (MOPS), Tris^{TM}, fosfato sódico y borato sódico. En las formas de realización preferidas, los tampones son Hepes, Tris^{TM} y fosfato sódico para las etapas específicas descritas en la presente memoria.

Se utilizan agentes quelantes en varias etapas del procedimiento de extracción para impedir la proteólisis y/o para secuestrar cationes divalentes. El agente quelante preferido es EDTA. Se utilizan cationes divalentes en varias etapas del procedimiento de extracción para estabilizar o disolver las proteínas de la membrana externa. Los cationes divalentes incluyen iones metálicos tales como Mg^{+2} y Ca^{+2}, prefiriéndose Mg^{+2}. El cloruro sódico es la sal preferida en la etapa de descomposición con sal en el procedimiento para extraer rP6 lipidada.

La extracción puede modificarse incluyendo por lo menos una operación unitaria con una membrana de diafiltración diferente que tiene un corte diferente de peso molecular, de modo que el lisado pasa en primer lugar a través de una membrana de mayor tamaño y a continuación a través de por lo menos una membrana de tamaño más pequeño. Dicha secuencia de membranas permite al proceso de extracción purificar dos o más proteínas de la membrana íntegra por separado en diferentes etapas (lisados) de la misma serie de diafiltración.

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(d): recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (c).

(f): recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (e).

(h): diafiltrar el lisado procedente de (g) con los reactivos de (e); e

(i): recoger las proteínas de la membrana externa eliminadas en (h).

(g): recoger la rP4 lipidada eliminada en (f).

(j): recoger la rP4 lipidada eliminada en (i).

(m): recoger la rP4 lipidada eliminada en (l).

Si se desea, pueden utilizarse más ciclos de extracción de rP4 lipidada.

(l): recoger la rP6 lipidada eliminada en (k).

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Si se desea, el procedimiento para extraer pR6 lipidada puede modificarse concentrando el lisado procedente de (j) antes de proceder a (k).

A fin de que la presente invención sea mejor entendida, se dan a conocer los ejemplos siguientes. Los ejemplos se proporcionan a título ilustrativo únicamente y no deben considerarse como limitativos del alcance de la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Extracción diferencial en la membrana con detergente de rP4 lipidada

El procedimiento general para extraer rP4 lipidada de células bacterianas, tales como las células E. coli, conllevó la microfluidización o la lisis celular y la extracción con detergente diferencial de la membrana. Se recogió el caldo de cultivo de fermentación y se ajustó a EDTA 5 mM para inhibir la posible degradación de las proteínas procedentes de las metaloproteasas. Se diluyó a continuación el caldo de cultivo a menos del 5% p/v de concentración de peso de células en húmedo y se lisó con un microfluidizador a alta presión (Microfluidics, Newton, MA). Se diafiltraron las células filtradas con una secuencia específica de soluciones tampón utilizando un sistema de flujo tangencial que incluye membranas Millipore de celulosas regeneradas de 1.000 kD de células de 0,002 m^{2}/g de área superficial en peso en húmedo. La secuencia de las soluciones tampón se seleccionó para disolver las proteínas de la membrana interna en primer lugar y a continuación para disolver las proteínas de la membrana externa que incluyen rP4. Durante la diafiltracion, las proteínas disueltas de tamaño aproximado menor del corte del peso molecular de la membrana pasaron a través del permeado, mientras que las moléculas mayores y las proteínas no disueltas se retuvieron. La secuencia de las etapas de diafiltración fue la siguiente:

(1): Se diafiltró el caldo de fermentación lisado con Hepes 10 mM/EDTA 1 mM/pH 8,0 a un volumen igual a tres veces el volumen de lo retenido para eliminar los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado.

(2): Se diafiltró el lisado cinco veces con Hepes 10 mM/MgCl_{2} 1 mM/Triton^{TM} X-100 al 1%, pH 8, para disolver y eliminar las proteínas de la membrana interna. Los iones Mg^{+2} estabilizaron la membrana externa; por consiguiente, las proteínas de la membrana externa no se disolvieron en presencia de Triton^{TM} X-100.

(3): Se diafiltró el lisado tres veces con Hepes 10 mM/MgCl_{2} 1 mM/pH 8, para reducir la concentración de Triton^{TM} X-100.

(4): Se diafiltró el lisado tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 1%/pH 8, para disolver las proteínas de la membrana externa, incluyendo rP4 lipidada, y a continuación comenzar a extraer y recoger la rP4 lipidada de la membrana externa.

(5): Se diafiltró el lisado tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM, pH 8. Esta etapa se realizó sin Zwittergent^{TM} 3-12, porque los compuestos de Zwittergent^{TM} no atraviesan la membrana del corte de 1.000 kD tan fácilmente como los compuestos más pequeños tales como las sales. Esta etapa sirvió para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} en la membrana; la concentración de Zwittergent^{TM} de la etapa (4) reduciría de otro modo el caudal a través de la membrana durante las etapas (6) y (8) a continuación.

(6): Se diafiltró el lisado dos veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 1%, pH 8, para continuar extrayendo y recogiendo la rP4 lipidada de la membrana externa.

(7): Se diafiltró el lisado dos veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/pH 8 para reducir de nuevo la concentración de Zwittergent^{TM}.

(8): Se diafiltró el lisado dos veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 1%, pH 8, para continuar extrayendo y recogiendo la rP4 lipidada de la membrana externa.

(9): Se diafiltró el lisado dos veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/pH 8 para reducir de nuevo la concentración de Zwittergent^{TM}.

Durante las etapas de diafiltración, se mantuvo la presión transmembranaria en aproximadamente 5 psi (5 \times 0,068948 bares) y el caudal en flujo cruzado se mantuvo a 150 litros/metro^{2} de área de membrana/hora (lmh). Los procedimientos de diafiltración se realizaron a temperatura ambiente. El caudal de permeado osciló entre 30 y 40 lmh, que era suficientemente alto como para que el proceso de extracción sea práctico y realizable a escala.

Durante la extracción se tomaron muestras en varios puntos para análisis por SDS-PAGE para evaluar el efecto de varias etapas de diafiltración en la extracción de proteínas. Se precipitaron las muestras mediante adición de alcohol, se centrifugaron y después se volvieron a disolver en el 20% del volumen original en el tampón de preparación de la muestra SDS. Este procedimiento de preparación de muestras concentró la muestra y redujo la concentración de Triton^{TM} o Zwittergent^{TM} 3-12 de las muestras. El Triton^{TM} X-100 o el Zwittergent^{TM} 3-12 interfieren con la unión de SDS a la muestra y reducen la resolución de las bandas en los geles. Se cargaron diez \mul de cada muestra en geles de acrilamida al 10% Novex (Encinitas, CA) y los geles se introdujeron durante 60 a 90 minutos a 125 voltios.

Un análisis SDS-PAGE típico de las muestras extraídas de las corrientes de permeado durante el proceso de extracción para rP4 lipidada se presenta en la Figura 1. La rP4 lipidada se introdujo a aproximadamente 30 kD en estos geles. El gel demuestra que algunas proteínas contaminantes se eliminaron durante la diafiltración con tampón de lisis (banda 5) y tampón que contenía Triton^{TM} X-100 (banda 6). Hubo muy poca pérdida de rP4 lipidada durante estas etapas de diafiltración. Durante la etapa de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12, se extrajo la rP4 lipidada en estado parcialmente purificado (banda 8). Al final de la etapa de diafiltración con Zwittergent^{TM} estaba presente muy poca rP4 lipidada en la corriente del permeado (banda 9). Esto indicaba que la mayor parte de la rP4 lipidada disuelta se había recuperado a través del permeado. Otros experimentos han demostrado que muy poca rP4 lipidada no disuelta permanece en lo retenido después de la terminación del proceso de extracción (datos no mostrados). La banda de 30 kD del extracto del Zwittergent^{TM} 3-12 se ha demostrado que era rP4 lipidada mediante análisis Western (datos no mostrados).

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Ejemplo 2

Series de extracción adicionales para rP4 lipidada

Este Ejemplo presenta los datos generados en cuatro series de extracción adicionales para rP4 lipidada. En cada serie, un caldo de cultivo de fermentación de E. coli recombinante se ajustó en primer lugar a EDTA 5 mM para inhibir la posible degradación de proteínas de las metaloproteasas. El caldo de cultivo de fermentación se ajustó a continuación a una concentración de células en húmedo del diez por ciento y se lisó pasando a través de un microfluidizador de Microfluidics. De este lisado celular se tomaron a continuación alícuotas en porciones que contenían un equivalente de 500 gramos de células y se congeló a -70ºC.

Una porción de 500 gramos del caldo de fermentación de E. coli lisado se eliminó a continuación desde -70ºC y se descongeló en un baño de agua una temperatura no superior a 40ºC. El lisado celular se diluyó a continuación a un peso de células en húmedo de cinco por ciento. Este lisado celular del cinco por ciento se sometió a continuación a un proceso diferencial de extracción con detergente utilizando diafiltración de flujo tangencial tal como se describe en el Ejemplo 1. La única diferencia ligera fue que en la etapa (4) la diafiltración se realizó dos veces en lugar de tres veces.

El análisis SDS-PAGE de las muestras tomadas en varios puntos durante la extracción dio resultados comparables a los observados en la Figura 1 (datos no mostrados). Se calculó la cantidad de rP4 lipidada recuperada en cada una de las cuatro series. Se determinó el porcentaje de rP4 lipidada en el lisado celular antes y después de la extracción introduciendo las muestras en geles de SDS-PAGE y a continuación escaneándolas en un densitómetro. Estos datos ilustraron que había una reducción media en gramos del 78% de proteína rP4 lipidada en el lisado celular antes y después de la extracción. Estos datos también demostraron que la recuperación total de proteína rP4 lipidada en el grupo de extracción en comparación con el lisado celular fue del 18%.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los resultados se presentan en la Tabla 1:

TABLA 1

1

La reproducibilidad del procedimiento de diafiltración se ilustra en la Figura 2. El flujo de permeado de las cuatro series durante el transcurso del proceso de extracción se controló. La similitud en los caudales en todo el proceso de muestra que el proceso de extracción es controlable y reproducible.

Para purificar la rP4 lipidada extraída, el extracto del lisado celular que contiene rP4 lipidada se procesó a continuación a través de columnas de intercambio iónico en tándem constituidas por una columna DEAE Sepharose^{TM} Fast Flow y una columna SP Sepharose^{TM} Fast Flow (Pharmacia & Upjohn, Piscataway, NJ). Se lavaron las columnas con tampón de equilibrio adicional y la columna DEAE se separó a continuación de la corriente del proceso. Se lavó a continuación la columna SP con 20 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y a continuación se eluyó con un gradiente de la etapa de NaCl, proporcionando proteína LrP4 de 30 K purificada. La concentración de NaCl 20 mM eluyó una forma agregada purificada de proteína rP4 lipidada (Forma I). La concentración de NaCl 140 mM eluyó una mezcla de la forma agregada y no agregada de la proteína rP4 lipidada (Forma II).

La proteína de 30 K rP4 lipidada de la Forma II se convirtió a continuación en el estado de la Forma I más agregado sometiendo la proteína a una congelación lenta controlada. Las dos formas purificadas pueden purificarse y almacenarse por separado o pueden purificarse por separado y a continuación combinarse. El procedimiento de conversión fue el siguiente:

(1): Obtener alícuotas filtradas estériles de la Forma II de rP4 lipidada.

(2): Congelar lentamente a -6ºC.

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Ejemplo 3

Extracción diferencial en la membrana con detergente de rP6 lipidada

El procedimiento para extraer rP6 lipidada fue similar al procedimiento para extraer rP4 lipidada. Sin embargo, el procedimiento de diafiltración requería más etapas porque la rP6 lipidada estaba asociada íntimamente con los peptidoglucanos. El caldo de cultivo de fermentación de las células E. coli que expresan rP6 lipidada se ajustó a EDTA 10 mM y se diluyó a menos de o igual al 10% de células en peso húmedo/volumen antes de la homogeneizacion. Se lisaron a continuación las células con un microfluidizador a alta presión y se diafiltraron a temperatura ambiente con una secuencia de tampón utilizando un dispositivo de filtración por membrana en flujo cruzado. Se determinó que el área de la membrana mínimo que permite el transporte de masa eficaz de las proteínas disueltas a través de la membrana era aproximadamente de 0,002 m^{2}/g de células en peso húmedo. Las proteínas disueltas de tamaño aproximado inferior al valor de corte del peso molecular de 1.000 kD de la membrana pasaban a través con el permeado, mientras que las moléculas mayores y las proteínas no disueltas se retenían. La secuencia de las etapas de diafiltración fue la siguiente:

(1): Se diafiltró el caldo de fermentación lisado con Hepes 10 mM/EDTA 1 mM/pH 8,0 (tampón de lisis) a un volumen igual a tres veces el volumen de lo retenido para eliminar los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado.

(2): Se diafiltró el lisado tres veces con Hepes 10 mM/MgCl_{2} 1 mM/Triton^{TM} X-100 al 0,2% para disolver y eliminar las proteínas de la membrana interna. Los iones Mg^{+2} estabilizaron la membrana externa; por consiguiente, las proteínas de la membrana externa no se disolvieron en presencia de Triton^{TM} X-100.

(3): Se diafiltró tres veces el lisado con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent^{TM} 3-14 al 0,2% para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa (menos la rP6 no lipidada). El EDTA sirve para secuestrar los iones Mg^{+2} de la etapa (2), así como para impedir la proteólisis.

(4): Se diafiltró el lisado tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 0,5 M/Zwittergent^{TM} 3-14 al 0,2% para disolver y eliminar las proteínas adicionales. Se añadió NaCl al tampón en esta etapa para destruir algunas interacciones iónicas entre las proteínas de la membrana y las membranas. Esta etapa se realizó debido a que la rP6 lipidada es una lipoproteína asociada a peptidoglucano y la sal sirve para eliminar las proteínas unidas a la membrana (menos la rP6 lipidada) del complejo proteico de la membrana/membrana externa (rP4 lipidada no está así asociada; por lo tanto esta etapa no se realizó para la extracción de esta proteína). Se continuó la diafiltración con tres volúmenes del retenido de Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} en lo retenido.

(5): Se diafiltró el lisado tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/sarcosil al 0,2% para eliminar las proteínas adicionales unidas a la membrana (menos la rP6 lipidada) y a continuación se diafiltraron tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración de sarcosil en lo retenido.

(6): Se diafiltró el lisado tres veces con fosfato sódico 10 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2% para eliminar las proteínas adicionales unidas a la membrana (menos la rP6 no lipidada) y a continuación se diafiltraron tres veces con fosfato sódico 10 mM para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} 3-12 en lo retenido.

(7): Se concentró el lisado al 20% de su volumen original y a continuación se diafiltró tres veces con fosfato sódico 10 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2% a 55ºC para disolver la rP6 lipidada, que se recogió a través del permeado. Se realizó la concentración antes de la diafiltración para aumentar la concentración de rP6 lipidada en el permeado. Se continuó la diafiltración durante tres volúmenes de retenido adicionales con fosfato sódico 10 mM a 55ºC para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} 3-12 en lo retenido. Esta etapa de calentamiento se realizó porque (como en la etapa (4) anterior)) la rP6 lipidada es una lipoproteína asociada a peptidoglucano y el calentamiento sirve para eliminar la rP6 lipidada del complejo membrana/proteína de la membrana (rP4 lipidada no está así asociada; de este modo esta etapa no se realizó para extraer esta proteína). Por último, se concluyó la diafiltración con tres volúmenes de retenido de fosfato sódico 10 mM a 55ºC.

Durante las etapas de diafiltración, se mantuvo la presión transmembranaria en aproximadamente 10 psi (10 \times 0,068948 bares) y el caudal en flujo cruzado se mantuvo en 120 a 180 lmh. Todos procedimientos de diafiltración se realizaron a temperatura ambiente excepto la etapa de extracción final a 55ºC, que se llevó a cabo a una temperatura más elevada para disolver la rP6 lipidada. El caudal de permeado osciló entre 30 y 50 lmh, que era suficientemente alto como para que el proceso de extracción sea práctico y realizable a escala.

Durante la extracción, se tomaron muestras en varios puntos para análisis por SDS-PAGE para evaluar el efecto de varias etapas de diafiltración en la extracción de proteínas. Se prepararon muestras y se introdujeron en geles tal como se describe en el Ejemplo 1.

Un análisis SDS-PAGE típico de las muestras extraídas de las corrientes de permeado durante el proceso de extracción de la rP6 lipidada se presenta en las Figuras 3 y 4. La rP6 lipidada se introdujo a aproximadamente 15 kD en estos geles. Los geles demostraron que algunas proteínas contaminantes se eliminaron durante la diafiltración con tampón de lisis (Figura 3, banda 2) y tampón que contenía varios detergentes (Figura 3, bandas 5-6 y Figura 4, banda 3). Hubo muy poca pérdida de rP6 lipidada durante estas etapas de diafiltración. Durante la etapa de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC, se extrajo la rP6 lipidada en estado parcialmente purificado (Figura 4, banda 6). Al final de la segunda etapa de diafiltración con Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC estaba presente muy poca rP6 lipidada en la corriente del permeado (Figura 4, banda 8). Esto sugirió que la mayor parte de la rP6 lipidada disuelta había sido recuperada por el permeado. Otros experimentos han demostrado que muy poca rP6 lipidada permanece no disuelta en lo retenido después de la terminación del proceso de extracción (datos no mostrados). La banda de 15 kD del extracto del Zwittergent^{TM} 3-12/55ºC se ha demostrado que era rP6 lipidada mediante análisis Western (datos no mostrados).

El procedimiento descrito anteriormente se repitió para extraer la rP6 lipidada del caldo de cultivo y otro de fermentación de E. coli. El análisis por SDS-PAGE fue similar al observado en las Figuras 3 y 4 (datos no mostrados) y la banda de 15 kD del extracto a 55ºC con Zwittergent^{TM} 3-12 se demostró otra vez que era rP6 lipidada por análisis Western (datos no mostrados).

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Ejemplo 4

Series de extracción adicionales para rP6 lipidada

Este Ejemplo presenta los datos generados de tres series de extracción adicionales para rP6 lipidada. En cada serie, el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 se utilizó para extraer la rP6 lipidada procedente de un caldo de fermentación de E. coli recombinante.

Los resultados se presentan en la Tabla 2:

TABLA 2

2

Claims

```
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```
1. Procedimiento para la extracción de proteínas de la membrana interna gram-negativas, expresadas de manera natural o recombinante de bacterias o células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, que comprende:

(a)

lisar las bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante en un caldo de fermentación;

(b)

diafiltrar el caldo de fermentación lisado de (a) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho tampón elimina los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado, y que utiliza un agente quelante para impedir la proteólisis;

(c)

diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración; en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución; y

(d)

recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (c).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que: la lisis de (a) se produce en un microfluidizador; en (b) y (c), el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por Hepes, ácido 3-(N-morfolino)propano sulfónico (MOPS), Tris^{TM}, fosfato sódico y borato sódico; y en (c), el detergente se selecciona de entre el grupo constituido por un compuesto Zwittergent^{TM}, un compuesto Triton^{TM} no iónico, sarcosil, un compuesto glucosídico, un compuesto de colato y dodecil-maltósido y el catión divalente se selecciona de entre el grupo constituido por Mg^{+2} y Ca^{+2}.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que en (b), el tampón es Hepes y el agente quelante es EDTA; y en (c), el tampón es Hepes, el detergente es Triton^{TM} X-100 y el catión divalente es Mg^{+2}.
4. Procedimiento para la extracción de proteínas gram-negativas de la membrana externa, expresadas de manera natural o recombinante de bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, que comprende:

(a)

lisar las bacterias o las células hospedadoras bacterianas que contienen un vector recombinante en un caldo de fermentación;

(b)

diafiltrar el caldo de fermentación lisado de (a) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho tampón elimina los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado, y que utiliza un agente quelante para impedir la proteólisis;

(c)

diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución;

(d)

diafiltrar el lisado procedente de (c) con el tampón procedente de (c), y utilizar un catión divalente procedente de (c) en ausencia de detergente, para reducir la concentración del detergente procedente de (c);

(e)

diafiltrar el lisado procedente de (d) con el tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante y un detergente para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa; y

(f)

recoger las proteínas de la membrana interna eliminadas en (e).
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que: la lisis de (a) se produce en un microfluidizador; en (b), (c), (d) y (e), el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por Hepes, MOPS, Tris^{TM}, fosfato sódico y borato sódico; en (c) y (e), el detergente se selecciona de entre el grupo constituido por un compuesto Zwittergent^{TM}, un compuesto Triton^{TM} no iónico, sarcosil, un compuesto glucosídico, un compuesto de colato y dodecil-maltósido; y en (c) y (d) el catión divalente se selecciona de entre el grupo constituido por Mg^{+2} y Ca^{2+}.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que en (b), el tampón es Hepes y el agente quelante es EDTA; en (c), el tampón es Hepes, el detergente es Triton^{TM} X-100 y el catión divalente es Mg^{+2}; en (d), el tampón es Hepes y el catión divalente es Mg^{+2} y en (e), el tampón es Tris^{TM}, el agente quelante es EDTA y el detergente es Zwittergent^{TM} 3-12.
7. Procedimiento de la reivindicación 4, que comprende asimismo:

(g)

diafiltrar el lisado procedente de (e) con los reactivos de (e), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;
```
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```
(h)

diafiltrar el lisado procedente de (g) con los reactivos de (e); y

(i)

recoger las proteínas de la membrana externa eliminadas en (h).
8. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la proteína gram-negativa de la membrana externa es la proteína P4 lipidada recombinante de la membrana externa (rP4) de Haemophilus influenzae, y en el que la etapa (f) se sustituye por las etapas siguientes:

(f)

diafiltrar el lisado procedente de (e) con el tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante y un detergente para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(g)

recoger la rP4 lipidada eliminada en (f).
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que: la lisis de (a) se produce en un microfluidizador; en (b), (c), (d), (e) y (f), el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por Hepes, MOPS, Tris^{TM}, fosfato sódico y borato sódico; en (c), (e) y (f) el detergente se selecciona de entre el grupo constituido por un compuesto Zwittergent^{TM}, un compuesto Triton^{TM} no iónico, sarcosil, un compuesto glucosídico, un compuesto de colato y dodecil-maltósido; y en (c) y (d) el catión divalente se selecciona de entre el grupo constituido por Mg^{+2} y Ca^{+2}.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que en (b), el tampón es Hepes y el agente quelante es EDTA; en (c), el tampón es Hepes, el detergente es Triton^{TM} X-100 y el catión divalente es Mg^{+2}; en (d) el tampón es Hepes y el catión divalente es Mg^{+2}; en (e), el tampón es Tris^{TM}, el agente quelante es EDTA y el detergente es Zwittergent^{TM} 3-12; y en (f), el tampón es Tris^{TM}, el agente quelante es EDTA y el detergente es Zwittergent^{TM} 3-12.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende asimismo:

(h)

diafiltrar el lisado procedente de (f) con los reactivos de (f), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;

(i)

diafiltrar el lisado procedente de (h) con los reactivos de (f) para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(j)

recoger la rP4 lipidada eliminada en (i).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, que comprende asimismo:

(k)

diafiltrar el lisado procedente de (j) con los reactivos de (f), a excepción del detergente, a fin de reducir la concentración de detergente;

(l)

diafiltrar el lisado procedente de (k) con los reactivos de (f) para extraer y eliminar la rP4 lipidada; y

(m)

recoger la rP4 lipidada eliminada en (l).
13. Procedimiento para la extracción de la proteína P6 recombinante lipidada (rP6) de Haemophilus influenzae de las células hospedadoras bacterianas por diafiltración diferencial de flujo tangencial de detergente, que comprende:

(a)

lisar las células hospedadoras bacterianas en un caldo de fermentación;

(b)

diafiltrar el caldo de fermentación lisado de (a) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho tampón elimina los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del permeado, y utilizar un agente quelante para impedir la proteólisis;

(c)

diafiltrar el lisado procedente de (b) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas de la membrana interna, y utilizar un catión divalente para estabilizar las proteínas de la membrana externa, impidiendo de este modo su disolución;

(d)

diafiltrar el lisado procedente de (c) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante para secuestrar el catión divalente e impedir la proteólisis y un disolvente para disolver y eliminar las proteínas de la membrana externa distintas de la rP6 lipidada;

(e)

diafiltrar el lisado procedente de (d) con un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, un agente quelante para impedir la proteólisis, un detergente para eliminar las proteínas adicionales de la membrana externa y una sal para descomponer el complejo de la proteína de la membrana/membrana externa;

(f)

diafiltrar el lisado procedente de (e) con los reactivos de (e), a excepción del detergente y la sal, para reducir la concentración de detergente;

(g)

diafiltrar el lisado procedente de (f) con un detergente y un tampón que no es retenido por la membrana de diafiltración, en el que dicho detergente disuelve y elimina las proteínas adicionales unidas a la membrana celular externa y utilizar un agente quelante para impedir la proteólisis;

(h)

diafiltrar el lisado procedente de (g) con el tampón procedente de (g) para reducir la concentración del detergente procedente de (g);

(i)

diafiltrar el lisado procedente de (h) con un compuesto de fosfato y un detergente para disolver y eliminar las proteínas adicionales unidas a la membrana celular externa;

(j)

diafiltrar el lisado procedente de (i) con un compuesto de fosfato para reducir la concentración de detergente procedente de (i);

(k)

calentar el lisado procedente de (j) para eliminar la rP6 lipidada de la membrana mientras se diafiltra este lisado con un compuesto de fosfato y un detergente para disolver, extraer y eliminar la rP6 lipidada; y

(l)

recoger la rP6 lipidada eliminada en (k).
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que: la lisis de (a) se produce en un microfluidizador; en (b), (c), (d), (e), (f), (g) y (h), el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por Hepes, MOPS, Tris^{TM}, fosfato sódico y borato sódico; en (b) y (c), el catión divalente se selecciona de entre el grupo constituido por Mg^{+2} y Ca^{+2}; en (c), (d), (e), (g), (i) y (k), el detergente se selecciona de entre el grupo constituido por un compuesto Zwittergent^{TM}, un compuesto Triton^{TM} no iónico, sarcosil, un compuesto glucosídico, un compuesto de colato y dodecil-maltósido; y en (e), la sal es una sal sódica.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que en (b), el tampón es Hepes y el agente quelante es EDTA; en (c), el tampón es Hepes, el detergente es Triton^{TM} X-100 y el catión divalente es Mg^{+2}; en (d) el tampón es Hepes, el agente quelante es EDTA, y el detergente es Zwittergent^{TM} 3-14; en (e), el tampón es Hepes, el agente quelante es EDTA, la sal es cloruro sódico, y el detergente es Zwittergent^{TM} 3-14; en (f), el tampón es Tris^{TM} y el agente quelante es EDTA; en (g), el tampón es Tris^{TM}, el detergente es sarcosil, y el agente quelante es EDTA; en (h), el tampón es Tris^{TM} y el agente quelante es EDTA; en (i), el detergente es Zwittergent^{TM} 3-12 y el fosfato es fosfato sódico; en (j), el fosfato es fosfato sódico; y en (k), el detergente es Zwittergent^{TM} 3-12.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que antes de (k) se concentra el lisado de (j).