JPH04312600A - 高度にグリコシル化された蛋白質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高度にグリコシル化さ
れた蛋白質の精製方法に関する。

【０００２】定義によれば、蛋白質は、アミノ酸の鎖か
ら実質的になっている。また、多くの場合、該鎖は、多
かれ少なかれ、かなりの量の各種サイズの炭水化物基を
含んでいる。かかる基を含む蛋白質は、グリコシル化さ
れた蛋白質（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ）　と呼ばれる。

【０００３】

【従来の技術】一般に、亜鉛、銅、コバルト、カルシウ
ムまたはニッケルなどの金属が、蛋白様化合物（ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）とコンプ
レックスを形成することは知られている。従って、これ
ら金属は、蛋白質を精製する方法において、例えばアフ
ィニティクロマトグラフィー時のカップリング剤として
、又は液体媒体中の蛋白質を沈殿させるのに、一般に使
用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高度
にグリコシル化された蛋白質の精製方法を提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者の研究によれば
、驚くべきことに、高度にグリコシル化された蛋白質は
、上記金属とコンプレックスを形成することができない
ことが見出された。

【０００６】従って、本発明は、真核細胞の培養物由来
の粗製標品（ｃｒｕｄｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　
から高度にグリコシル化された蛋白質を精製する方法で
あって、（ｉ）該標品に、沈殿する混合物を形成するの
に充分な量の二価金属イオンを添加する工程、および（
ｉｉ）沈殿後、該混合物の上清から上記蛋白質を回収す
る工程を包含する方法を提供するものである。

【０００７】高度にグリコシル化された蛋白質とは、グ
リコシル化レベルが２０％以上、好ましくは３０％以上
、最も好ましくは４０％以上の蛋白質を意味するものと
して理解されるものである。

【０００８】グリコシル化レベル（ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、グリコシル化重量
（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｍａｓｓ）と蛋白質の
全重量との比をパーセンテージで表したものである。こ
のグリコシル化レベルは、グリコシル化された蛋白質の
重量と、エンドグルコシダーゼ〔ｅｎｄｏｇｌｕｃｏｓ
ｉｄａｓｅ　、例えば、ベーリンガー　（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）　から販売されているエンドグルコシダーゼ
Ｆ又はＨ（ｅｎｄｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｆ　ｏｒ
　Ｈ）〕を用いて供給者により特定された条件下で処理
した後に得られる当該蛋白質の非グリコシル化形態の重
量とを比較することにより決定できる。グリコシル化形
態と非グリコシル化形態との相対的な重量は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上で泳動することにより、測定できる。

【０００９】これに代えて、もしグリコシル化された蛋
白質のアミノ酸配列が分かっている場合は、ペプチド鎖
の重量は計算できる。糖質の定量は、グリコシル化され
た蛋白質のヒドラジン分解後に、並行して行うことがで
きる。

【００１０】例えば、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、
ＨＩＶウィルスの糖蛋白質ｇｐ１２０およびｇｐ１６０
、ムチン（ｍｕｃｉｎｓ）、ヒトインターロイキン−２
、グリコホリン様蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−ｌ
ｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）　及び血清中に存在する酸ア
ルファ−１−糖蛋白質（ａｃｉｄ　ａｌｐｈａ−１−ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）　は、当然に高いグリコシル
化レベルを示す蛋白質である。本発明の目的には、精製
を所望される蛋白質は、均質なグリコシル化プロフィー
ル（グリコシル化がペプチド鎖全体に亘っている）又は
不均質なグリコシル化プロフィール（グリコシル化がペ
プチド鎖の或る領域に局在化している）のいずれを有し
ていても良い。好ましくは、グリコシル化は均質である
のが良い。

【００１１】高度にグリコシル化された蛋白質を精製す
ることが所望される粗製標品（ｃｒｕｄｅ　ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ　）は、この蛋白質を合成し得る真核細胞
の培養物に由来するものである。培養培地の組成は、特
に重要ではなく、任意の適当な成分を含んでおれば良い
。収得すべき蛋白質の合成を組換法により可能とする方
法が種々知られており、細胞内に導入されるべき基本的
エレメントは、この蛋白質の合成用に設計された発現カ
セット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　）
である。発現カセットは、高度にグリコシル化された蛋
白質の前駆体（シグナルペプチド＋成熟蛋白質）をコー
ドすると共に、その発現に必要なエレメントの制御下に
置かれたＤＮＡフラグメントを含んでいるのが有利であ
る。

【００１２】本発明の枠内において、高度にグリコシル
化された蛋白質は、真核細胞の培養物、好ましくは酵母
又は哺乳類細胞の培養物に由来する無細胞抽出物（ａｃ
ｅｌｌｕａｒｅｘｔｒａｃｔ）から精製するのが有利で
ある。該無細胞抽出物は、蛋白質が培養培地に分泌され
る場合又は細胞が培養中にウィルスによって細胞溶解さ
れる場合は、細胞培養上清である。或いは、該無細胞抽
出物は、細胞懸濁液に、化学的、機械的又は酵素的な細
胞溶解処理を施し、細胞断片（ｃｅｌｌ　ｄｅｂｒｉｓ
）　から液体成分を分離することによっても得ることが
できる。

【００１３】本発明の枠内において、二価金属イオンは
、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋及びＣａ２
＋から選ばれるのが有利である。該金属イオンは、塩の
形態で添加されるのが好ましい。該塩としては、例えば
、ＺｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＣｏＳＯ４、ＮｉＳＯ４及
びＣａＣｌ２などを例示することができる。

【００１４】一般に、粗製標品に添加されるべき上記金
属イオンの使用量は、当該金属イオン及び除去すべき成
分の性質により変わり得る。当業者であれば、特定のパ
ラメーターの関数として最終的な最適濃度を調整するこ
とができる。しかしながら、粗製標品中に存在する夾雑
物は、金属イオンを最終濃度１０ｍＭ以上、好ましくは
４０ｍＭ以上、より好ましくは６０ｍＭ以上、最も好ま
しくは８０ｍＭ以上に添加すると、直ちに沈殿させるこ
とができる。上記金属イオンを大量に添加することも可
能であるが、一般には、最終濃度約１００〜１２０ｍＭ
を越える必要はない。

【００１５】本発明の方法は、酸性ｐＨないし中性ｐＨ
において、一般にはｐＨ７．５又は７．５未満において
実施するのが有利であり、若干酸性のｐＨ６〜７の範囲
において実施するのが好ましい。

【００１６】沈殿後、上清は、混合物を遠心分離し、次
いでデカンテーションすることにより回収するのが有利
である。

【００１７】この方法により、粗製標品中に存在する可
能性のあるビリオン（ｖｉｒｉｏｎｓ）　を、簡単にか
つ効率よく除去できる。次いで、必要ならば、沈殿上清
（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎ
ｔ　）中に存在する高度にグルコシル化された蛋白質の
精製を、各種の方法を用いてより精密に行っても良い。

【００１８】本発明の特定の実施態様によれば、本発明
は、ＨＩＶウィルスｇｐ１２０又はＨＩＶウィルスｇｐ
１６０の可溶性の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）　を精製す
る方法が提供される。ｇｐ１６０の変異体の幾つかは、
例えば、特許出願ＥＰＡ２４５　　１３６に記載されて
いる。上記ｇｐ１２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体は
、特に組換ＤＮＡ技術を用いて製造することができる。 該製造用に設計されたベクターとしては、例えば、ゲノ
ム中にｇｐ１２０又はｇｐ１６０の可溶性変異体をコー
ドするＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミド又は
ワクシニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）
であって、該フラグメントが、その発現（転写及び翻訳
）を可能とする適当な領域の制御下に置かれているもの
を挙げることができる。

【００１９】最後に、本発明は、標品、例えば、ポック
スウィルスにより細胞培養物を感染させることにより得
られる細胞溶解物の上清から、ポックスウィルスを精製
又は濃縮する方法であって、（ｉ）該標品に、沈殿する
混合物を形成するのに充分な量の二価金属イオンを添加
する工程、及び（ｉｉ）沈殿後、沈殿物の形態で該ポッ
クスウィルスを回収することを特徴とする方法を提供す
るものでもある。

【００２０】

【実施例】実施例１Ａ．リコンビナントワクシニアウィ
ルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖ
ｉｒｕｓ）に感染した細胞の培養におけるＨＩＶ１−Ｂ
ＲＵからのｇｐ１２０の産生ＢＨＫ−２１細胞を１０％
牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＧＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉ
ｂｃｏ）　）中で培養する。細胞が集密的（ｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ　）になると（５．８×１０６　細胞／ｍｌ）
、培地を除去し、細胞層（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌａｗｎ
　）を５０ｍｌのＰＢＳ（ダベルッコーの食塩加リン酸
緩衝液（Ｄｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｔ）、セロムド（Ｓｅｒｏｍｅｄ
）　）で２回洗浄し、ＦＣＳを含有しない新鮮なＧＭＥ
Ｍ培地を添加する。特許出願ＥＰＡ　　２４５１３６に
記載されているワクシニアウィルスＶＶＴＧ１１３２を
、感染度１０−１ｐｆｕ（プラークフォーミングユニッ
ト（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ））まで
添加し、７２時間感染させる。溶解産物を２０分間１０
，０００ｇで遠心分離し、細胞の破片（ｃｅｌｌ　ｄｅ
ｂｒｉｓ　）を除去し、特にｇｐ１２０とウィルス粒子
（ｖｉｒｉｏｎｓ　）を含有する上清を回収する。

【００２１】Ｂ．ｇｐ１２０の精製１Ｍ塩化亜鉛（Ｚｎ
Ｃｌ２　）溶液１．３ｍｌを、上記で得られた培養上清
２０ｍｌに添加し、ＺｎＣｌ２　の最終濃度を６０ｍＭ
とする。この混合物のｐＨは約６．８である。混合物を
氷上に１時間放置し、沈殿上清（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ
ｉｏｎ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　）を３０００ｒ／分
で２０分間、ヘラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）　　アール
エフ（ＲＦ）　　ミニフュージ（Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）　
　遠心分離機にて遠心分離し回収する。上清は、培養上
清中に存在する初期量のｇｐ１２０を含有しているが、
ウィルス粒子はもはや含有していない。分析のため、以
下に示す方法によって、総蛋白、ｇｐ１２０の定量及び
ワクシニアウィルスのタイトレーション（ｔｉｔｒａｔ
ｉｏｎ　）を行う。これらの量については、ＺｎＣｌ２
　処理をしていない粗培養上清においても並行して測定
する。

【００２２】総蛋白量の定量は、カデンバッハ　　ビー
（Ｋａｄｅｎｂａｃｈ　Ｂ　）によって記載されたビウ
レット法（Ｂｉｕｒｅｔ　ｍｅｔｈｏｄ，　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．　Ｚ　（１９６６）　３４４：　４９−７５　）
に従って測定する。即ち、ＺｎＣｌ２　を用いた沈殿処
理後得られる上清３ｍｌを、３００μｌの３Ｍトリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）で処理する。２０℃で１時間後、蛋白
質を沈殿させ、溶液を３０００回転／分で２０分間、ヘ
ラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ　）　　アールエフ（ＲＦ）
　　ミニフュージ（Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）遠心分離機にて
遠心分離する。上清を除去し、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ
）を１ｍｌのビウレット溶液（１２ｍＭ硫酸銅（　Ｃｕ
ＳＯ４　，　５Ｈ２　Ｏ）、３１．８９ｍＭ　酒石酸ナ
トリウムカリウム（ＫＮａ　ｔａｒｔｒａｔｅ）、２０
０ｍＭ　水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）及び３０．１２
ｍＭ　ヨウ化カリウム（ＩＫ））に溶解する。１５分後
、蛋白質をビウレット溶液に溶解し、１ｍｌのミリ−キ
ュウ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ　ｗａｔｅｒ　）を添加する。 ５４６ｎｍでの吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔ
ｙ　）（ＯＤ）を１ｃｍのキュベット中で、空気に対し
て測定する。又、ビウレット溶液と水のみを加えた吸収
ブランクのＯＤも測定する。ＯＤ値は、試料の場合ＯＤ
．Ｅとし、吸収ブランクの場合ＯＤ．Ｔとする。５０〜
１００ｍｇのシアン化カリウム（ＫＣＮ　）をキュベッ
トに添加し、スパチュラで混合して溶液とする。２〜５
分後、５４６ｎｍでのＯＤを測定し、その値を試料の場
合はＯＤ．Ｅ／ＫＣＮとし、吸収ブランクの場合ＯＤ．
Ｔ／ＫＣＮとする。試料中の総蛋白量（Ｑ）を、以下の
式を用いて計算する。

【００２３】Ｑ＝７×（ＯＤ．Ｅ−ＯＤ．Ｅ／ＫＣＮ）
−（ＯＤ．Ｔ−ＯＤ．Ｔ／ＫＣＮ）ｇｐ１２０の定量を
、２種の抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を、一次抗体
及び二次抗体として使用し（但し二次抗体はビオチン化
されている）、ＥＬＩＳＡテストに従って測定する。 そのような判定の方法に関する誤差のマージン（ｍａｒ
ｇｉｎ）は、±２０％のオーダーである。

【００２４】ウィルスのタイトレーションは、ＢＨＫ−
２１細胞で測定する。１０６　個のＢＨＫ−２１細胞を
、２ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ培地中に接種する
。 培養は３５×１０ｍｍのディッシュ中で３７℃で行う。 ２４時間後、培地を取り除き、２００μｌのワクシニア
ウィルスのＰＢＳ希釈液を細胞に添加する。３７℃で１
時間吸着させ、その後、２ｍｌの５％ＦＣＳ含有ＧＭＥ
Ｍ培地を添加し、感染を３７℃で２４時間維持する。終
了後培地を除去し、細胞を１ｍｌのニュートラルレッド
（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　
）で染色する。白く残っている溶菌のプラーク（ｌｙｓ
ｉｓｐｌａｑｕｅ）をカウントする。

【００２５】結果を以下の表１に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】この結果から、ｇｐ１２０蛋白は、ＺｎＣ
ｌ２　によって沈殿しないことが判る。一方、ほとんど
の不純物の蛋白は、沈殿する。同時に、ワクシニアウィ
ルスは、沈殿物のペレット中に除去される。

【００２８】それゆえ、この方法を用いて、一段階でウ
ィルス粒子と５０％以上の不純物蛋白を除去することが
可能である。

【００２９】実施例２〜６ｇｐ１２０を含有する無細胞
抽出物（ａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　）を実
施例１のＡと同様にして得る。同時に、ＺｎＣｌ２　の
最終濃度のみを５ｍＭから８０ｍＭに変化させて、実施
例１のＢに示される方法と同様にしてｇｐ１２０を精製
する。これら実験の結果を以下の表２に示す。

【００３０】

【表２】

【００３１】これらの結果から、不純物蛋白及びワクシ
ニアウィルスは、５ｍＭのＺｎＣｌ２　を用いる場合か
ら沈殿し始めることが判る。ｇｐ１２０は、判定の方法
に関する±２０％の誤差のマージン（ｍａｒｇｉｎ）を
考慮すると、沈殿しないと考えられる。

【００３２】実施例７１Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２
　）溶液１．３ｍｌを、実施例１のＡに記載の様にして
得られた培養上清２０ｍｌに添加し、ＣａＣｌ２　の最
終濃度が６０ｍＭにする。この混合物のｐＨは約６．８
である。混合物を氷上に１時間放置し、沈殿上清を３０
００ｒ／分で２０分間、ヘラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ　
）　　アールエフ（ＲＦ）　　ミニフュージ（Ｍｉｎｉ
ｆｕｇｅ）　　遠心分離機にて遠心分離し回収する。上
清は、培養上清中に存在する初期量のｇｐ１２０を含有
しているが、ウィルス粒子はもはや含有していない。分
析のため、実施例１のＢに示す方法によって、総蛋白、
ｇｐ１２０の量及びワクシニアウィルスのタイトレーシ
ョンを測定する。これらの量については、ＣａＣｌ２　
処理をしていない粗培養上清においても並行して測定す
る。

【００３３】これら実験の結果を以下の表３にまとめる
。

【００３４】

【表３】

【００３５】これらの結果から、ＣａＣｌ２　は、Ｚｎ
Ｃｌ２　と同様にほとんど全てののワクシニアウィルス
を沈殿させるが、ｇｐ１２０は溶液中に残留することが
判る。

【００３６】実施例８〜１０ｇｐ１２０を含有する無細
胞抽出物を実施例１のＡの記載と同様にして得る。同時
に、ＣａＣｌ２　の最終濃度のみを２０ｍＭから８０ｍ
Ｍに変化させて、実施例７に示される方法と同様にして
ｇｐ１２０を精製する。これら実験の結果を以下の表４
に示す。

【００３７】

【表４】

【００３８】これらの結果から、不純物蛋白及びワクシ
ニアウィルスは、１０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　の時から沈
殿し始めることが判る。

【００３９】実施例１１ＨＩＶ１−ＢＲＵ由来のｇｐ１
６０の可溶性の変異体を含有する無細胞抽出物を、特許
出願ＥＰＡ　　２４５１３５に記載のワクシニアウィル
スＶＶＴＧ１１６３を、実施例１のＡに記載の方法に従
ってＢＨＫ−２１細胞に感染させて得る。

【００４０】１Ｍ塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２　）溶液８８０
μｌを、上記記載の様にして得られたｇｐ１６０の可溶
性の変異体を含有する培養上清２０ｍｌに添加し、Ｚｎ
Ｃｌ２　の最終濃度を４０ｍＭにする。混合物を氷上に
１時間放置し、沈殿上清を３０００ｒ／分で２０分間、
ヘラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ　）　　アールエフ（ＲＦ
）　　ミニフュージ（Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）　　遠心分離
機にて遠心分離し回収する。ＺｎＣｌ２　での沈殿処理
後の上清中に存在するｇｐ１６０変異体の量は、培養上
清中に存在する量に匹敵する。一方、ほとんどの不純物
蛋白及びすべてのウィルス粒子は除去される。

【００４１】実施例１２ＣＨＯ細胞をプラスミドｐＧＴ
３５５４を用いて形質転換する。このプラスミドは、予
めＨｉｎｄＩＩＩ　で切断しＤＮＡポリメラーゼＩ由来
のクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ　）で処理された（特許出願ＦＲ　　２，６００，
３３４に記載の）プラスミドｐＴＧ３８４中に、Ｐｓｔ
Ｉフラグメントを挿入し、（特許出願ＷＯ８７／６２６
０に記載の）ワクシニアベクターＶＶＴＧ１１６３由来
の可溶性のＨＩＶ−１　　ＢＲＵ　　ｇｐ１６０変異体
をコードするクレノーポリメラーゼで処理することによ
って得られる。このようにクローン化されたフラグメン
トは、アデノウィルス２（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　２）
の後期主要プロモーター（ｌａｔｅ　ｍａｊｏｒ　ｐｒ
ｏｍｏｔｏｒ　）の支配下に置かれる。

【００４２】約１０６　個の細胞を、１０％の透析され
たＦＣＳ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポ
キサンチン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌ
のキサンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５
ｍｇ／ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを
添加したＭＥＭα２０００培地（ギブコ）中に接種し、
３７℃で３日間５％ＣＯ２　の雰囲気下で培養する。培
地は２日間毎日、（５６℃で不活性化された）１０％の
ＦＣＳ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｍｇ／ｌのヒポキ
サンチン、１０ｍｇ／ｌのチミジン、２５０ｍｇ／ｌの
キサンチン、０．２ｍｇ／ｌのアミノプテリン、２５ｍ
ｇ／ｌのミコフェノール酸及び２ｍＭのグルタミンを添
加した新鮮なＭＥＭα２０００培地で交換する。

【００４３】終了後培養上清を除去し、実施例１１に記
載のように精製する。ＺｎＣｌ２　での沈殿処理後の上
清中に存在するｇｐ１６０変異体の量は、培養上清中に
存在する量に匹敵する。これに対して、全蛋白質の量は
かなり減少した。このことは、多くの割合の不純物蛋白
質が除去されることを示している。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　真核細胞の培養物由来の粗製標品から
   高度にグリコシル化された蛋白質を精製する方法であっ
   て、（ｉ）該粗製標品に、沈殿する混合物を形成するの
   に充分な量の二価金属イオンを添加する工程、および（
   ｉｉ）沈殿後、該混合物の上清から上記蛋白質を回収す
   る工程を包含する方法。
2. 【請求項２】　　細胞培養物に由来する無細胞抽出物の
   粗製標品から高度にグリコシル化された蛋白質を精製す
   る請求項１に記載の方法であって、（ｉ）該粗製標品に
   、沈殿する混合物を形成するのに充分な量の二価金属イ
   オンを添加する工程、および（ｉｉ）沈殿後、該混合物
   の上清から上記蛋白質を回収する工程を包含する方法。
3. 【請求項３】　　高度にグリコシル化された蛋白質を発
   現するワクシニアウィルスを感染させた細胞培養物に由
   来する無細胞抽出物の粗製標品から該高度にグリコシル
   化された蛋白質を精製する請求項２に記載の方法であっ
   て、（ｉ）該粗製標品に、沈殿する混合物を形成するの
   に充分な量の二価金属イオンを添加する工程、および（
   ｉｉ）沈殿後、該混合物の上清から上記蛋白質を回収す
   る工程を包含する方法。
4. 【請求項４】　　蛋白質のグリコシル化レベルが４０％
   以上の粗製標品から精製する請求項１乃至請求項３のい
   ずれかに記載の方法であって、（ｉ）該粗製標品に、沈
   殿する混合物を形成するのに充分な量の二価金属イオン
   を添加する工程、および（ｉｉ）沈殿後、該混合物の上
   清から上記蛋白質を回収する工程を包含する方法。
5. 【請求項５】　　粗製標品に、二価金属イオンを添加し
   、該金属イオンの最終濃度が１０ｍＭ以上の混合物を形
   成する工程を包含する粗製標品から高度にグリコシル化
   された蛋白質を精製する請求項１乃至請求項４のいずれ
   かに記載の方法。
6. 【請求項６】　　粗製標品に、二価金属イオンを添加し
   、該金属イオンの最終濃度が２０ｍＭ以上の混合物を形
   成する工程を包含する粗製標品から高度にグリコシル化
   された蛋白質を精製する請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】　　粗製標品に、亜鉛、銅、コバルト又は
   ニッケルから選ばれる二価金属イオンを添加する工程を
   包含する粗製標品から高度にグリコシル化された蛋白質
   を精製する請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の方
   法。
8. 【請求項８】　　粗製標品に、塩の形態で二価金属イオ
   ンを添加する工程を包含する粗製標品から高度にグリコ
   シル化された蛋白質を精製する請求項１乃至請求項７の
   いずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】　　高度にグリコシル化された蛋白質が、
   ＨＩＶウィルス由来のｇｐ１２０蛋白であることを特徴
   とする、請求項１乃至請求項８のいずれかに記載の方法
   。
10. 【請求項１０】　　高度にグリコシル化された蛋白質が
    、ＨＩＶウィルス由来のｇｐ１６０蛋白の可溶性の変異
    体であることを特徴とする、請求項１乃至請求項９のい
    ずれかに記載の方法。
11. 【請求項１１】　　標品からポックスウィルスを精製又
    は濃縮する方法であって、（ｉ）該標品に、沈殿する混
    合物を形成するのに充分な量の二価金属イオンを添加す
    る工程、および（ｉｉ）沈殿後、沈殿物の形態で上記ポ
    ックスウィルスを回収する工程を包含する方法。