JP3334806B2

JP3334806B2 - 遺伝子発現の逐次分析法

Info

Publication number: JP3334806B2
Application number: JP51210397A
Authority: JP
Inventors: キンズラー，ケネス，ダブリュ．; ヴォゲルステイン，バート; ヴェルヴレスク，ヴィクター，イー．; ツァン，リン
Original assignee: ザジョーズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1995-09-12
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 2002-10-15
Anticipated expiration: 2016-09-12
Also published as: IE80465B1; AU7018896A; ES2194957T3; DK0761822T3; EP0761822A2; DE69627768D1; US20030049653A1; DE761822T1; WO1997010363A1; GB2305241A; US6383743B1; ATE239093T1; EP0761822B1; EP1231284A2; CA2185379A1; AU6561496A; GB9619024D0; US6746845B2; JP2001155035A; DE69627768T2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、米国立衛生研究所の認可番号CA57345、CA3
5494およびGM07309からの援助により行われたものであ
る。米国政府は本発明に対していくらかの権利を有す
る。

本出願は、1995年９月12日付けの米国特許出願第08/5
27,154号の一部継続出願である。

発明の利用分野本発明は、一般的には遺伝子発現の分野に関し、より
特定すると、発現された遺伝子の領域に対応する転写産
物の限定領域を同定することにより多数の転写産物を分
析するための遺伝子発現の逐次分析（serial analysis
of gene expression:SAGE）法に関する。

発明の背景ヒトを含めた高等生物のゲノム配列の解析は今や現実
に到達できる目標となっている。しかし、この解析は遺
伝子の複雑性の一つのレベルを表すにすぎない。順序づ
けられた、時宜を得た遺伝子の発現は、生物の定義およ
び生物学にとって等しく重要な、もう一つの複雑性のレ
ベルを表している。

ヒト・ゲノムプロジェクトの一部として、mRNAから逆
転写される相補的DNA（cDNA）の配列を解析することの
役割が討論されてきた。というのは、ゲノム配列決定の
提唱者が、あらゆる組織、細胞型および発生段階で発現
されるmRNAを一つのこらず見つけ出すことは至難の技で
あると主張し、さらにイントロン領域と遺伝子間領域
（制御および調節配列を含む）からの多くの価値ある情
報がcDNA配列決定により失われるだろうと指摘してきた
からである（ヒトゲノムの地図作成および配列決定に関
する委員会報告（Report of the Committee on Mapping
and Sequencing the Human Genome）,National Academ
y Press,Washington,D.C.,1988）。それゆえ、cDNAライ
ブラリーを用いるゲノムの転写領域の配列決定では不十
分であると考えられている。cDNAのライブラリーは反復
性エレメント、ミトコンドリア遺伝子、リボソームRNA
遺伝子、および共通遺伝子やハウスキーピング遺伝子を
含む他の核遺伝子が優勢であると考えられる。cDNAのラ
イブラリーは構造および調節ポリペプチドまたはペプチ
ドに対応する配列をすべて提供するとは限らないのであ
る（Putneyら,Nature,302:718,1983）。

標準的なcDNAクローニングのもう一つの欠点は、一部
のmRNAが豊富であるのに対し、他が稀であるということ
である。さまざまな遺伝子に由来するmRNAの細胞量は数
桁分も変化することがある。

cDNAサブトラクションまたはディファレンシャルディ
スプレーに基づいた技術は、２つの細胞型間の遺伝子発
現を比較する上で極めて有用である（Hedrickら,Natur
e,308:149,1984;Liang and Pardee,Science,257:967,19
92）。しかし、この技術は部分的な分析を提供するにす
ぎず、メッセンジャーRNAの量に関する直接的な情報を
なにも提供しない。エクスプレスド・シークエンス・タ
グ（expressed sequence tag:EST）法は遺伝子を検索す
るための有用なツールであることがわかった（Adamsら,
Science 252:1656,1991;Adamsら,Nature,355:632,1992;
Okuboら,Nature Genetics,2:173,1992）ものの、ノーザ
ンブロッティング、RNアーゼプロテクション、および逆
転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）分析（Alw
ineら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74:5550,1977;Zinn
ら,Cell,34:865,1983;Veresら,Science,237:415,1987）
と同様に、一度に限られた数の遺伝子しか評価できな
い。さらに、EST法は、好ましくは、類似性検索やマッ
ピングのために150塩基対またはそれより長いヌクレオ
チド配列を使用する。

また、配列標識部位（sequence tagged site:STS）
（Olsonら,Science,245:1434,1989）は、ゲノムの物理
的地図を作成するためのゲノムマーカーを同定するのに
利用されてきた。物理的にマップされたクローンからの
こうした短い配列がゲノムにおける唯一同定された地図
位置を表す。対照的に、発現された遺伝子の同定は、in
vivoで実際に転写され発現された遺伝子のマーカーで
ある、発現された配列のタグをあてにしている。

さまざまな生物学的応用を研究するために、特に、い
ろいろな生理的または病理的状態下にある異なる細胞型
もしくは同じ細胞型における全体的な遺伝子発現パター
ンを確立するために、何千もの発現された遺伝子を迅速
かつ詳細に分析することを可能とする改良法が必要とさ
れている。異なる発現パターンの同定は、適切な治療タ
ーゲットの同定、遺伝子治療（例えば、遺伝子置換）用
の候補遺伝子の同定、組織タイピング、法的確認、疾病
関連遺伝子の位置決定、診断・予診用のインジケーター
遺伝子の同定を含めて、いくつかの実用性を有してい
る。

発明の概要本発明は、さまざまな生理的状態、発生段階または疾
病状態にある異なる細胞型もしくは同じ細胞型における
全体的な遺伝子発現パターンを同定するために、多数の
転写産物を迅速に分析する方法を提供する。この方法は
メッセンジャーRNAの限定された位置にある短いヌクレ
オチド配列のタグを同定することに基づいている。この
タグを用いて、対応する転写産物および遺伝子（該遺伝
子から該転写産物が転写される）を同定する。「ジタ
グ」（ditag）と称する二量体化されたタグを利用する
ことで、本発明の方法は、クローニングおよび／または
増幅中に生じ、おそらくはデータの評価中にも生じう
る、いくつかのタイプの偏り（bias）を排除することが
できる。これらの短いヌクレオチド配列のタグを鎖状に
連結することで、単一のDNA分子（例えば、ベクターま
たは単一クローンに挿入されたDNA分子）上の複数のタ
グの配列決定を行うことにより逐次的に転写産物を効率
よく分析することが可能である。

本明細書に記載する方法は、多数の転写産物の分析を
可能とする新規な方法としての遺伝子発現の逐次分析
（SAGE）法である。この戦略を検証するために、膵臓か
ら単離したmRNAから短いcDNA配列タグを作製し、ランダ
ムに対合させてジタグを形成し、鎖状に連結（コンカテ
マー化）してクローン化した。1000個のタグの手動配列
決定により、膵臓の機能に特徴的な遺伝子発現パターン
が明らかになった。このようなパターンの同定は例えば
診断上および治療上重要である。さらに、遺伝子検索用
ツールとしてのSAGEの使用を、新規なタグに対応する膵
臓の新たな転写産物を同定・単離することで証明した。
SAGEはさまざまな正常状態、発生段階および疾病状態に
おける発現遺伝子の定量的目録作成（cataloging）およ
び比較のための広範に応用可能な手段を提供する。

図面の簡単な説明図１は、SAGEの模式図を示す。この例において、第１
制限酵素すなわちアンカリング酵素（anchoring enzym
e）はNla IIIであり、第２制限酵素すなわちタギング酵
素（tagging enzyme）はFok Iである。配列はプライマ
ー由来の配列および転写産物由来の配列を表し、ここで
「Ｘ」および「Ｏ」は異なるタグのヌクレオチドを表
す。

図２は、転写産物の存在量の比較を示す。棒線はSAGE
（黒線）またはハイブリダイゼーション分析（白線）で
測定した存在量パーセント（percent abundance）を表
す。SAGE数量化は表１から次のように誘導された。TRY1
/2はトリプシノーゲン１および２のタグを含み、PROCAR
はプロカルボキシペプチダーゼAlのタグを示し、CHYMO
はキモトリプシノーゲンのタグを示し、そしてELA/PRO
はエラスターゼIII BおよびプロテアーゼＥのタグを含
む。誤差線は、カウントした事象の平方根をとり、それ
を存在量パーセントに換算する（想定上のポアソン分
布）ことで決定した標準偏差を表す。

図３は、SAGEタグにより、cDNAライブラリーをスクリ
ーニングした結果を示す。P2は実施例に記載したような
13bpのオリゴヌクレオチドを用いて得られた典型的なハ
イブリダイゼーション結果を示す。P1およびP2は表２に
記載した転写産物に対応する。画像はMolecular Dynami
cs PhosphorImagerを使って得られ、円はハイブリダイ
ゼーションに先立って組換え体ファージを移行させたフ
ィルターメンブランのアウトラインを示す。

図４は、本発明によるタグコード・データベース・ア
クセスシステムの構成図である。

好適な実施態様の説明本発明は、発現された遺伝子に対応する転写産物の量
および性質を決定するための迅速で定量的な方法を提供
する。遺伝子発現の逐次分析（SAGE）と名づけられたこ
の方法は、遺伝子セグメントに対応する転写産物の限定
された部分配列の同定および特性決定を土台とするもの
である。これらの限定された転写産物配列「タグ」は、
例えば細胞、組織または抽出物において発現される遺伝
子のマーカーに相当する。

SAGEはいくつかの原理に基づいている。まず第一に、
短いヌクレオチド配列のタグ（９〜10bp）は、それが転
写産物内の限定された位置から単離されるという条件
で、その転写産物を唯一無二に同定するのに十分な情報
量を含むものである。例えば、9bp程度に短い配列は、
タグ部位でのランダムヌクレオチド分布を仮定すれば、
262,144の転写産物（4⁹）を識別することができ、一方
推定値はヒト・ゲノムが約80,000〜200,000の転写産物
をコードすることを示唆する（Fieldsら,Nature Geneti
cs,7:345,1994）。下等な真核生物や原核生物の場合、
例えばゲノムによりコードされる転写産物の数がより少
ない場合は、タグのサイズをもっと短くすることができ
る。例えば、酵母では転写産物を識別するのに６〜7bp
ほどの短いタグで十分である。

第二に、タグのランダム二量体化により偏り（増幅お
よび／またはクローニングにより引き起こされる）を減
らすことができる。第三に、これら短い配列のタグを鎖
状に連結（コンカテマー化）することで、単一のベクタ
ーまたはクローン内の複数のタグの配列決定を行うこと
により逐次的に転写産物を効率よく分析することができ
る。情報がデータの連続したつながりとして伝達される
コンピュータによる逐次コミュニケーションと同様に、
配列タグの逐次分析は各タグの記録および境界を確立す
るための手段を必要とする。これらの原理はすべてを独
立に使用しても、組み合わせて使用しても、他の公知の
配列同定法と組み合わせて使用してもよい。

第一の実施態様において、本発明は、例えば特定の発
生段階または特定の疾病状態での、特定の細胞もしくは
組織または細胞抽出物における遺伝子発現を検出する方
法を提供する。この方法は、相補的デオキシリボ核酸
（cDNA）オリゴヌクレオチドを作製し、第1cDNAオリゴ
ヌクレオチドから限定されたヌクレオチド配列の第１タ
グを、そして第2cDNAオリゴヌクレオチドから限定され
たヌクレオチド配列の第２タグを単離し、第２タグを第
１オリゴヌクレオチドリンカー（該第１オリゴヌクレオ
チドリンカーは増幅プライマーのハイブリダイゼーショ
ンのための第１配列を含む）に結合し、第２タグを第２
オリゴヌクレオチドリンカー（該第２オリゴヌクレオチ
ドリンカーは増幅プライマーのハイブリダイゼーション
のための第２配列を含む）に結合し、そして１以上の該
タグのヌクレオチド配列を決定することを含んでなり、
ここで該タグは発現された遺伝子に対応する。

図１は、本発明の方法において記載したSAGEを用いて
メッセンジャーRNA（mRNA）を分析することを示した模
式図である。mRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のin vi
tro合成のために、対象となる細胞または組織からmRNA
を単離する。mRNAの作製された二本鎖DNA相補体を相補
的DNA（cDNA）という。

本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」とは、２
以上（好ましくは３以上）のデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドからなるプライマーまたはオリ
ゴマー断片のことである。その正確なサイズは多くの要
因に左右され、こうした要因もまたオリゴヌクレオチド
の最終的な機能または用途次第で変化する。

本方法はさらに、第１オリゴヌクレオチドリンカーに
結合された第１タグを、第２オリゴヌクレオチドリンカ
ーに結合された第２タグに結合して、「ジタグ」を形成
することを含んでなる。それぞれのジタグは少なくとも
１つの遺伝子を代表する少なくとも１つの転写産物の２
つの限定されたヌクレオチド配列に相当する。典型的に
は、ジタグは２つの異なる遺伝子からの２つの転写産物
を表す。ジタグ内の限定されたcDNAタグの存在は、その
タグの配列を有する遺伝子の発現を示すこととなる。

増幅工程に先立って形成されたジタグを分析すること
により、増幅（例えば、PCR）により導入される可能性
があるひずみ（distortion）を排除することができる。
ジタグの形成のためにタグを対合させることはランダム
な事象である。異なるタグの数は多いと予想されるの
で、２つのタグが同一のジタグに結合される確率は豊富
な転写産物のときでさえ低い。それゆえ、偏りのある
（biased）標準的な増幅および／またはクローニング法
により生成される可能性のある反復ジタグが本発明の方
法による分析からは除外される。

「限定された」ヌクレオチド配列または「限定され
た」ヌクレオチド配列のタグなる用語は、転写産物の5'
または3'末端から誘導されたヌクレオチド配列を指す。
このヌクレオチド配列は第１制限エンドヌクレアーゼを
用いて切断することにより限定され、どちらの末端が捕
捉のために用いられるかに応じて、第１制限エンドヌク
レアーゼ部位の5'または3'側のヌクレオチドを表す（例
えば、本明細書に記載されるように、捕捉のためにオリ
ゴ−dTを用いる場合は3'側のヌクレオチド）。

本明細書中で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」およ
び「制限酵素」なる用語は、認識部位または認識ヌクレ
オチド配列と称する特定の二本鎖DNA配列と結合し、そ
の特定の認識部位でまたはその近傍で二本鎖DNAを切断
する細菌の酵素を意味する。

「アンカリング酵素」または図１では「AE」と記され
る第１エンドヌクレアーゼは、転写産物を少なくとも１
回切断して転写産物の5'または3'末端に由来する限定さ
れた配列のタグを生成する該酵素の能力により選択され
る。好ましくは、少なくとも１つの認識部位を有し、そ
れゆえ大多数のcDNAを切断できる制限エンドヌクレアー
ゼが利用される。例えば、本明細書に例示するように、
４塩基対の認識部位を有する酵素は平均して256塩基対
（4⁴）ごとに切断すると予想されるが、大部分の転写産
物はそれよりかなり大きい。４塩基対の部位を認識する
制限エンドヌクレアーゼとしては、本発明の実施例に例
示されるようなNla IIIがある。DNA分子（例えば、cDN
A）内に少なくとも１つの認識部位をもつ他の同様なエ
ンドヌクレアーゼは当業者に公知である（例えば、Curr
ent Protocols in Molecular Biology,Vol.2,1995,Ausu
belら編,Greene Publish Assoc.＆ Wiley Interscienc
e,Unit 3.1.15;New England Biolabs Catalog,1995を参
照のこと）。

アンカリング酵素で切断した後、切断cDNAの最も5'ま
たは3'側の領域を、捕捉媒体に結合させることで単離す
ることができる。例えば、本実施例に例示されるよう
に、cDNA合成用のオリゴdTプライマーがビオチン化され
ている場合は、限定された3'ヌクレオチド配列タグをス
トレプトアビジンビーズを使って単離する。この実施例
では、第１酵素すなわちアンカリング酵素で切断する
と、ポリＡ尾部の最も近くにある制限部位に対応する各
転写産物上のユニーク部位が得られる。同様に、転写産
物（そのcDNA）の5'キャップを、限定された5'ヌクレオ
チド配列タグを単離するための捕捉手段を標識または結
合するために利用することができる。当業者であれば、
ここに記載するような限定された配列のタグを単離する
ための他の同様な捕捉系（例えば、ビオチン／ストレプ
トアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン）につ
いて熟知しているだろう。

本発明は単一の「アンカリング」エンドヌクレアーゼ
すなわち第１制限エンドヌクレアーゼの使用に制限され
ない。本発明の方法は、細胞または組織の完全な転写パ
ターンを同定するために、別個の調製物サンプルに対し
て異なる酵素を用いて逐次的に実施することが望まし
い。さらに、２以上のアンカリング酵素を用いると、第
１アンカリング酵素から得られた発現パターンの確認が
得られる。それゆえ、豊富な転写産物を表すcDNAがほと
んどまたは全く切断されないように第１またはアンカリ
ングエンドヌクレアーゼはcDNAをめったに切断しないこ
とが想定される。かくして、切断される転写産物は「ユ
ニーク」な転写産物に相当する。例えば、７〜8bpの認
識部位をもつ制限酵素はcDNAをめったに切断しない酵素
であるだろう。同様に、完全な転写パターンを同定する
ために、以下に記載する２以上のタギング酵素を利用す
ることができる。

本明細書中で用いる「単離された」なる用語には、ポ
リヌクレオチドが自然界でもともと結合している他の核
酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質
的に含まないポリヌクレオチドが含まれる。cDNAはその
ままでは自然界に存在していないが、部分精製された天
然に存在するmRNAを操作することで得られる。限定され
た配列のタグを単離するとは、切断された他のcDNAから
5'または3'タグを精製することをいう。

一つの実施態様では、単離された限定ヌクレオチド配
列タグを、リンカーの配列が異なるときは２つのcDNAプ
ールに分ける。各プールをアンカリングすなわち第１制
限エンドヌクレアーゼ部位で２つのリンカーのうちの１
つに連結する。リンカーが同じ配列をもつときは、タグ
を２つのプールに分ける必要はない。第１オリゴヌクレ
オチドリンカーは増幅プライマーのハイブリダイゼーシ
ョンのための第１配列を含み、そして第２オリゴヌクレ
オチドリンカーは増幅プライマーのハイブリダイゼーシ
ョンのための第２配列を含む。さらに、リンカーは「タ
ギング酵素」または「TE」と記される第２制限エンドヌ
クレアーゼの認識部位を含む。本発明の方法は連結後に
ジタグオリゴヌクレオチドを増幅する必要がないが、増
幅工程を含むことが好ましい。

第２制限エンドヌクレアーゼはその認識部位から離れ
た部位でまたは認識部位の外側で切断する。例えば、第
２制限エンドヌクレアーゼはII S型の制限酵素でありう
る。II S型制限エンドヌクレアーゼはその非対称認識部
位から最大20bp離れた一定の距離で切断する（Szybalsk
i,W.,Gene,40:169,1985）。II S型制限エンドヌクレア
ーゼの例として、BsmF IおよびFok Iが挙げられる。そ
の他の類似の酵素は当業者に公知である（Current Prot
ocols in Molecular Biology,前掲を参照のこと）。

限定されたヌクレオチド配列のタグに連結される第１
および第２「リンカー」は同一のまたは異なるヌクレオ
チド配列をもつオリゴヌクレオチドである。例えば、本
発明の実施例に示したリンカーには次のような異なる配
列をもつリンカーが含まれる。

（配列番号１）（配列番号２）および（配列番号３）（配列番号４）、ここでＡはジデオキシヌクレオチド
（例えば、ジデオキシＡ）である。本発明の方法では他
の類似のリンカーを用いてもよく、当業者であれば、そ
のような代わりのリンカーを設計することができよう。

リンカーを設計するには、第２制限酵素すなわちタギ
ング酵素による連結産物の切断により、限定されたヌク
レオチド配列のタグ（例えば、本明細書に例示されるよ
うな制限エンドヌクレアーゼ切断部位の3'側）をもつリ
ンカーが放出されるようにする。限定されたヌクレオチ
ド配列のタグは約６〜30塩基対でありうる。好ましく
は、タグは約９〜11塩基対である。したがって、ジタグ
は約12〜60塩基対となり、18〜22塩基対とすることが好
ましい。

同じ配列をもつリンカーに連結した限定タグの１つの
プール、または異なるヌクレオチド配列をもつリンカー
に連結した限定ヌクレオチド配列タグの２つのプールは
互いとランダムに「尾−尾」連結させる。リンカーから
最も遠いcDNAタグの部分を「尾」という。図１に示され
るように、連結されたタグ対すなわちジタグは、ジタグ
の上流（5'側）に第１制限エンドヌクレアーゼ部位およ
び下流（3'側）に第１制限エンドヌクレアーゼ部位、ジ
タグの上流と下流に第２制限エンドヌクレアーゼ切断部
位、そしてジタグの上流と下流に第２制限酵素認識部位
および増幅プライマーハイブリダイゼーション部位の両
方を含むリンカーオリゴヌクレオチドをもっている。言
い換えると、このジタグはそれぞれ第１制限エンドヌク
レアーゼ部位、第２制限酵素認識部位およびリンカーに
より挟まれている。

ジタグは各リンカーの一鎖に特異的にハイブリダイズ
するプライマーを利用することで増幅することができ
る。好ましくは、米国特許第4,683,195号に記載される
ような標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により
増幅を行う。あるいはまた、原核生物に適合するベクタ
ーへのクローニングまたは当業者に公知の他の増幅法に
よりジタグを増幅してもよい。

本明細書中で用いる「プライマー」とは、核酸鎖に相
補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（す
なわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような
重合剤の存在下に適当な温度およびpHの条件）下に置か
れたとき、合成の開始点として作用することができる、
天然に存在するまたは合成的に製造されたオリゴヌクレ
オチドのことである。最大の増幅効率をあげるためにプ
ライマーは一本鎖で、しかもオリゴデオキシリボヌクレ
オチドであることが好ましい。プライマーは重合剤の存
在下で伸長産物の合成を開始させるに足る長さのもので
なければならない。プライマーの正確な長さは温度およ
びプライマー源を含めた多くの要因により左右されるだ
ろう。

ここで用いるプライマーは増幅しようとする特定配列
のそれぞれの鎖に「実質的に」相補的となるように選択
される。このことは、プライマーがそれぞれの鎖とハイ
ブリダイズするのに十分な相補性をもたねばならないこ
とを意味する。それゆえ、プライマー配列は鋳型の正確
な配列を反映する必要はない。本発明において、プライ
マーはオリゴヌクレオチドリンカーに対し実質的に相補
的なものである。

配列番号１〜４で示されるリンカーを増幅するのに有
用なプライマーとしては、5'−CCAGCTTATTCAATTCGGTCC
−3'（配列番号５）および5'−GTAGACATTCTAGTATCTCGT
−3'（配列番号６）が挙げられる。当業者であれば、過
度の実験を行わなくとも、リンカーのヌクレオチド配列
に基づいて類似の増幅用プライマーを作製することがで
きよう。

第１制限エンドヌクレアーゼで増幅PCR産物を切断す
ることにより、鎖状に連結することでコンカテマー化し
うるジタグを単離することができる。連結後、コンカテ
マーをクローニングすることが望ましい場合があるが、
本発明の方法では必要でない。増幅を行おうと行うまい
と、ジタグまたはコンカテマーは標準的な配列決定法に
より分析できる。コンカテマーは一般的に約２〜200の
ジタグからなり、約８〜20のジタグからなることが好ま
しい。これらは好適なコンカテマーであるが、コンカテ
マー化され得るジタグの数は個々のタグの長さに依存
し、過度の実験を行わなくとも当業者であれば容易に決
定できよう。コンカテマーの形成後、複数のタグを配列
分析のためにベクターにクローニングすることができ、
またジタグもしくはコンカテマーをクローニングを行わ
ずに当業者に公知の方法で直接配列決定にかけてもよ
い。

本発明の限定されたヌクレオチド配列のタグをクロー
ニングする標準的な方法は、特に、プラスミドやファー
ジのようなベクターにタグを挿入することである。ここ
に記載の方法により作製されたジタグまたはジタグのコ
ンカテマーは、配列分析、タグをプローブとして用いる
プラーク／プラスミドハイブリダイゼーションといった
後続の分析のために組換えベクター中に当業者に公知の
方法でクローニングされる。

「組換えベクター」なる用語は、ジタグ遺伝子配列の
挿入または組み込みにより操作された当技術分野で公知
のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。この
ようなベクターは例えばマーカー遺伝子配列の効率のよ
い転写を促進するプロモーター配列を含有する。典型的
には、ベクターは複製起点、プロモーター、および形質
転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子を含有
する。本発明で用いるのに適したベクターとして、例え
ば、pBlueScript（Stratagene,LaJolla,CA）、pBC、pSL
301（Invitrogen）および当業者に公知の他の同様なベ
クターがある。好ましくは、ジタグまたはそのコンカテ
マーは配列決定用のベクターに連結される。

ジタグをクローニングするためのベクターは適当な宿
主細胞に移入できるものである。「宿主細胞」とは、そ
の細胞内でベクターが増殖できかつそのDNAが発現され
得る細胞のことである。この用語は宿主細胞自体の子孫
をも意味する。複製の間に突然変異が起こることがある
ので、すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らない
ことが理解されよう。しかしながら、「宿主細胞」なる
用語が用いられるとき、この用語にはこの種の子孫も含
まれる。安定した移入法（外来DNAが宿主内に連続して
維持されることを意味する）は当技術分野で公知であ
る。

ジタグを含有するベクターによる宿主細胞の形質転換
は、当業者には周知であるような、慣用の技法により行
うことができる。宿主が大腸菌のような原核細胞である
場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて当技術分野で公
知の手法によるCaCl₂法で処理した細胞から、DNA取込み
能のあるコンピテント細胞を調製する。これとは別に、
MgCl₂またはRbClを使用してもよい。また、エレクトロ
ポレーションや当技術分野で常用される他の方法により
形質転換を行うこともできる。

個々のクローン内に存在するジタグは、手動でまたは
自動化法を使って、標準的な方法（例えば、Current Pr
otocols in Molecular Biology,前掲,Unit 7）により配
列決定することができる。

もう一つの実施態様において、本発明は、限定された
ヌクレオチドタグまたはジタグの存在が該タグの配列を
有する遺伝子の発現を示すことからなる、遺伝子発現を
検出するためのキットを提供し、このキットは、増幅プ
ライマーをハイブリダイズさせるための第１配列をもつ
第１オリゴヌクレオチドリンカーを含有する第１容器、
増幅プライマーをハイブリダイズさせるための第２配列
をもつ第２オリゴヌクレオチドリンカーを含有する第２
容器（これらのリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識
部位から離れた部位でDNAを切断するための制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位をさらに含む）、および該リンカ
ーのユニークな第１および第２配列にハイブリダイズさ
せるための核酸プライマーを含有する第３および第４容
器を含んでなる１以上の容器から構成される。オリゴヌ
クレオチドリンカーが同じヌクレオチド配列をもつので
あれば、本発明のキットではリンカーを含有する容器が
１つだけ必要となる。

さらに別の実施態様において、本発明は、少なくとも
２つの限定されたヌクレオチド配列のタグを有するオリ
ゴヌクレオチド組成物であって、前記タグの少なくとも
１つが少なくとも１つの発現された遺伝子に対応してい
る前記組成物を提供する。この組成物は約１〜200のジ
タグ、好ましくは約８〜20のジタグからなる。このよう
な組成物は、例えば細胞、組織または細胞抽出物中の発
現遺伝子に対応する限定されたヌクレオチド配列のタグ
を同定することにより遺伝子発現を分析するのに有用で
ある。

本発明のSAGE法を用いて示差的に発現された遺伝子を
同定するにあたって、他のゲノム法と組み合わせて使用
することが考えられる。例えば、個々のタグ（好ましく
はジタグ）を固相支持体（例えば、ニトロセルロースフ
ィルター、ガラススライド、シリコンチップ）上に固定
したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることが
できる。こうした技法として、以下に記載するような
「平行配列分析」（parallel sequence analysis）すな
わちPSAがある。本発明の方法により形成されたジタグ
の配列はまた、クローン配列決定（CS）を含めた方法に
より限界希釈を用いて決定することもできる。

簡単に述べると、PSAはジタグの作製後に行われる
が、その際ジタグがハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チド配列は標識せずに、ジタグを検出可能に標識するこ
とが好ましい。あるいはまた、ジタグではなくオリゴヌ
クレオチドを標識してもよい。例えば、ラジオアイソト
ープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、
金属キレート剤、または酵素によりジタグを検出可能に
標識することができる。当業者であれば、ジタグに結合
させるのに適した他の標識について熟知しており、ルー
チンな実験操作を用いてそれを確かめることができよ
う。例えば、標識した（例えば、フルオレセインで標識
した）プライマーを用いてPCRを行ってもよい。ジタグ
は蛍光末端標識をもつことが好ましい。

標識したまたは未標識のジタグを一本鎖分子に分離
し、それを好ましくは段階的に希釈し、そして、例えば
10−merのあらゆる可能な順列を表すオリゴヌクレオチ
ドを（例えば、シリコンチップの各グリッド中に）含有
する固相支持体（例えば、Fodorら,Science,251:767,19
91に記載されるシリコンチップ）に添加する。次に、固
相支持体上のオリゴヌクレオチドを、異なる状態にある
細胞（例えば、異なる発生段階、増殖因子の不在下およ
び存在下での細胞の増殖、正常細胞対形質転換細胞、さ
まざまな組織発現の比較など）から得られたタグとハイ
ブリダイズさせることにより、該支持体内（例えば、チ
ップのグリッド上）に含まれるタグの示差的発現を決定
する。フルオレセインで末端標識したタグの場合は、蛍
光の分析が特定の10−merへのハイブリダイゼーション
を示す。例えば、固定したオリゴヌクレオチドがフルオ
レセインで標識されている場合は、（標識オリゴにハイ
ブリダイズしたジタグの接近による）消光ゆえの蛍光の
減少が観察され、遺伝子発現のパターンに関して分析さ
れる。この方法の代表例を本明細書中の実施例４に示
す。

本発明のSAGE法は、細胞系のクローニングに用いられ
る限界希釈法と類似したクローン配列決定にも有用であ
る。例えば、ジタグまたはそのコンカテマーを希釈し
て、各受け器が１未満のDNA分子を含むように各受け器
に入れる。各受け器中のDNAを増幅し、マススペクトロ
スコピーを含めた当技術分野で公知の標準方法により配
列決定する。示差的発現の評価はSAGEに関して上述した
ように行う。

当業者であれば、過度の実験によらなくとも、本発明
において記載したSAGEにより得られたジタグまたは個々
のタグを分析するための他の方法を簡単に決定できるだ
ろう。

本発明にしたがってある配列から限定されたタグを導
き出す概念は、配列データベースにサンプルのタグを一
致させるのに有用である。好適な実施態様では、サンプ
ル配列と既知配列とを一致させるためにコンピュータ法
が用いられる。

一つの実施態様では、サンプルの配列タグを、配列デ
ータベース中の対応する情報と比較して、サンプル配列
と一致する既知配列を同定する。配列データベース中の
各配列につき１以上のタグを該配列内の各アンカリング
酵素部位に隣接するＮ個の塩基対として決定することが
できる。しかし、好適な実施態様では、3'末端から最初
のアンカリング酵素部位のみを用いてタグを決定する。
好ましくは、タグを限定する隣接塩基対はアンカリング
酵素部位の3'側にあり、かつＮは９である。

このようなデータベースに対しての線形検索（linear
search）を用いることができる。しかし、好適な実施
態様では、Ｎ塩基タグの各塩基対（Ａ、Ｃ、Ｇまたは
Ｔ）を数字または「タグコード」（例えば、Ａ＝０、Ｃ
＝１、Ｇ＝２、Ｔ＝３、または他の適当な符号）に変換
することで、サンプルからの配列タグをユニークな数値
表示に変える。上記のような配列データベースの各配列
につき１つのタグを決定し、そのタグを同様な方法でタ
グコードに変換する。好適な実施態様では、配列データ
ベースのタグコードのセットをポインターファイル（po
inter file）に保存する。サンプル配列のタグコードを
ポインターファイル中のタグコードと比較して、サンプ
ルタグコードに対応する配列の配列データベース中の位
置を決定する。（配列データベースが冗長性（redundan
cy）をもつ場合は複数の対応配列が存在しうる）。

図４は、本発明によるタグコード・データベース・ア
クセスシステムの構成図である。配列データベース10
（例えば、ヒト・ゲノム配列データベース）を上記のよ
うに処理して、各配列が決定されてポインターファイル
12に保存されたタグコードをもつようにする。サンプル
のタグコードＸを上記のように決定し、コンピュータの
記憶位置14に保存する。一致する配列タグコードに関し
てサンプルのタグコードＸとポインターファイル12とを
比較する。一致が見つかれば、その一致する配列タグコ
ードと関連したポインターを用いて、配列データベース
10中の対応配列にアクセスする。

ポインターファイル12はいくつかのフォーマットのい
ずれかであってもよい。一つのフォーマットでは、ポイ
ンターファイル12の各エントリーがタグコードと、配列
データベース10中の対応する記録に対するポインターを
含む。サンプルのタグコードＸは配列タグコードと線形
検索で比較することができる。あるいはまた、配列タグ
コードを分類して、バイナリー検索（binary search）
を用いてもよい。もう一つの代替フォーマットとして、
分類体系的な樹木構造（例えば、Ｂ樹木）に、または単
一にもしくは二重にリンクされたリストとして、あるい
は他の簡便に検索できるデータ構造もしくはフォーマッ
トで、配列タグコードを構造化することもできる。

好ましい実施態様において、ポインターファイル12の
各エントリーは配列データベース10中の対応する記録に
対するポインターだけを含む。ポインターファイル12を
構築するにあたって、タグコードの数値に対応するポイ
ンターファイル12中のエントリー位置に各配列タグコー
ドを割り当てる。例えば、配列タグコードが「1043」で
あったとすると、配列データベース10中の対応する記録
に対するポインターはポインターファイル12のエントリ
ー＃1043に保存されるだろう。サンプルのタグコードＸ
の数値を用いて、サンプルタグコードＸに対応するポイ
ンターファイル12中の該位置を直接アドレス指定し、ひ
いては配列データベース10をアドレス指定するために該
位置に保存されたポインターに迅速にアクセスすること
ができる。

すべての可能な塩基対を表すのにたった４つの数値し
か必要でないので、好適なポインターファイル12構造体
と共にタグコードのバイナリー・コーディド・デシマル
（binary coded decimal:BCD）数を用いることは、記憶
または蓄積スペースをむだにする「希薄」なポインター
ファイル12をもたらす。したがって、本発明は公知の様
式で各タグコードを基数４（すなわち、コードディジッ
トにつき２ビット）に変換して、結果的にコンパクトな
ポインターファイル12構造体が得られる。例えば、タグ
配列「AGCT」（ただし、Ａ＝00₂、Ｃ＝01₂、Ｇ＝10₂、
Ｔ＝11₂）に関して、バイナリーでの基数４表示は「000
11011」となるだろう。これに対して、BCD表示は「0000
0000 0000001 00000010 00000011」となるだろう。もち
ろん、塩基対の他の符号化も同様の機能を与えることを
理解すべきである。

本発明にしたがってサンプル配列から限定されたタグ
を導き出す概念は、さまざまなサンプルを類似性に関し
て比較するにも有用である。好ましい実施態様では、異
なるサンプルからの配列タグを一致させるためにコンピ
ュータ法を用いる。例えば、多数の配列を含む材料（例
えば、組織）を比較するにあたって、第１サンプル中の
種々のタグの存在頻度を、分布またはヒストグラム型の
データ構造中に保存されたタグコードとしてしるすこと
ができる。例えば、図４のポインターファイル12と同様
に構造化された表を使用でき、この表では各エントリー
が存在頻度の値を含む。その後、第２サンプル中の種々
のタグを作製し、タグコードに変換し、そのタグコード
により表エントリーを直接アドレス指定することで表と
比較することができる。出力装置にテキストまたはグラ
フの形で情報を出力するために、および／または、あと
で使用するべくデータ保存システムに保存するために、
一致した数のみならず一致した位置を計測していく。

本発明のタグ比較の面はハードウェアもしくはソフト
ウェア、または両者の組合せで実行することができる。
好ましくは、本発明のこれらの面は、プロセッサ、デー
タ保存システム（揮発性および非揮発性の記憶および／
または蓄積素子を含む）、少なくとも１つの入力装置、
および少なくとも１つの出力装置から構成されるプログ
ラム可能なコンピュータで作成するコンピュータプログ
ラムにより実行される。データ保存システムへの一時的
または永久的な保存のための１以上の入力装置からのデ
ータ入力は配列を含み、また既知および／または未知配
列の以前に作製されたタグおよびタグコードを含みう
る。入力データにプログラムコードを当てはめて、上記
の機能を遂行しかつ出力情報を引き出す。この出力情報
を公知の様式で１以上の出力装置に適用する。

このようなコンピュータプログラムはそれぞれを、蓄
積媒体または装置をコンピュータで読み取ってここに記
載の手順を実行するときそのコンピュータをコンフィギ
ュア（configuring）して操作するために、一般用また
は専門用のプログラム可能なコンピュータで読み取り可
能な蓄積媒体または装置（例えば、ROMまたはフロッピ
ーディスク）に保存することが好ましい。本発明のシス
テムはまた、コンピュータプログラムを伴った、コンピ
ュータで読み取り可能な蓄積媒体として実施することも
考えられ、その場合は、このような蓄積媒体により、上
記の機能を果たすように予め決められた特別なやり方で
コンピュータを操作する。

以下の実施例は本発明を例示するもので限定するもの
ではない。それらは用いることのできる手順を代表する
が、当業者に公知の他の手順も代わりに使用できるだろ
う。

実施例例示目的のために、本発明のSAGE法を用いてヒト膵臓
における遺伝子発現を特性づけた。第１制限エンドヌク
レアーゼすなわちアンカリング酵素としてNla IIIを、
第２制限エンドヌクレアーゼすなわちタギング酵素とし
てBsmF Iを使用して9bpのタグを得た。BsmF Iは認識部
位GGGACの14bp3'側の相補鎖を切断し、4bpの5'突出部分
を生成させると予測された（New England BioLabs）。
示した（GGGACATG）のようにBsmF I部位とNla III（CAT
G）部位を重ね合わせると11bpのタグが得られると予測
される。しかし、用いた切断条件（37℃）下で、BsmF I
はしばしばその認識部位のより近くで切断して、その認
識部位の3'側の最小12bpを残すことが分析から示唆され
た。それゆえ、タグの分析のためにアンカリング酵素部
位に最も近い9bpだけを使用した。65℃で切断すると、
より一貫して11bpのタグが得られる。

Gen Bankから得られたヒト転写産物のコンピュータ分
析は、9bpの長さのタグの95％以上がユニークであるら
しく、追加の２個の塩基を含めても更なる分解能がほと
んど得られないことがわかった。IntelliGenetics Bion
etオンラインサービスで提供されたFindseqプログラム
を使って、GenBank 87データベースからヒト配列（84,3
00）を抽出した。以後の分析はすべてMicrosoft Window
s操作システム用のMicrosoft Visual Basicに書かれたS
AGEプログラムグループを用いて行った。SAGEデータベ
ース分析プログラムは位置記載（locus description）
中に「RNA」として示した配列のみを含め、「EST」とし
て示したエントリーを除くようにセットし、その結果1
3,241の配列に減少した。アンカリング酵素としてNla I
IIを用いてこのサブセットの配列を分析したところ、4,
127の9bpタグがユニークである一方で、1,511のタグは
１より多いエントリーで見いだせることがわかった。後
者のエントリーの無作為選択したサブセット（100）の
ヌクレオチド比較から、少なくとも83％が同一の遺伝子
または高度に関連した遺伝子（少なくとも250bpにわた
って＞95％の同一性）の冗長データベースのエントリー
によることが示された。これにより、9bpタグのうち538
1（95.5％）が転写産物または高度に保存された転写産
物ファミリーに対しユニークであると示唆された。

実施例１上記で概説したように、ヒト膵臓由来のmRNAを用いて
ジタグを作製した。簡単に説明すると、５μｇの全膵臓
由来のmRNA（Clontech）を、BRL cDNA合成キットを用い
て、製造業者のプロトコールに従い、プライマーとして
ビオチン−５′T₁₈−３′を用いて二本鎖cDNAに変換し
た。次に、このcDNAをNla IIIで切断し、磁気ストレプ
トアビジン・ビーズ（Dynal）に結合することにより
３′制限断片を単離した。結合したDNAを２つのプール
に分け、以下のリンカーの中の１つを各プールに連結し
た。

（配列番号１および２）（配列番号３および４）（ここで、Ａはジデオキシヌクレオチド（例えば、ジデ
オキシＡ）である。）丹念に洗浄して未連結のリンカーを除去した後、BsmF
Iで切断することによってこれらのリンカーおよび隣接
するタグを遊離させた。生成した突出部分をT4ポリメラ
ーゼでフィルインし、これらのプールを合わせて互いに
連結した。次に、目的の連結産物を、プライマーとしておよび（それぞれ配列番号５および６）を用いて25サイクルに
わたって増幅した。次に、このPCR反応をポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分析し、目的の産物を切り出し
た。次に、さらに15サイクルのPCRを行い、効率的な連
結およびクローニングに十分な量の産物を得た。

PCRジタグ産物をNla IIIで切断し、これらジタグを含
有するバンドを切り出し、自己連結させた。連結後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によってコンカテマー形
成ジタグを分離し、200bpより大きな産物を切り出し
た。これらの産物をpSL301（Invitrogen）のSph I部位
にクローニングした。クローニング部位の外側のT7およ
びT3配列をプライマーとして用いるPCRにより、コロニ
ーをインサートについてスクリーニングした。少なくと
も10（10〜50の範囲）のタグを含有するクローンを、記
載（Del Salら、Biotechniques ７:514、1989）のよう
にして、（配列番号７）をプライマーとして用いて、PCR増幅に
よって同定し、手操作により配列決定した。SAGEソフト
ウエア・グループを用いて配列のファイルを分析した。
このソフトウエア・グループは、適切なスペーシングを
有するアンカリング酵素部位を同定し、２つの介在タグ
を抽出し、それらをデータベースに記録するものであ
る。413のユニークなジタグおよび87の反復ジタグから
1,000のタグを誘導した。後者（反復ジタグ）は１回だ
け計測することで、定量で起こりうるPCRの偏りを排除
した。SAGEソフトウエアの機能は、単に、遺伝子配列の
検索を最適化することだけである。

表１は、最初の1,000タグの分析を示す。16％が配列
のアンビギュイティー（ambiguity）を有していたか、
あるいはリンカー配列から誘導されたものであるので、
それらを除外した。残りの840のタグは、一回存在した5
31のタグおよび複数回見出された77のタグを含んでい
た。最も豊富なタグ10のうち９がGenBankR87中の少なく
とも１つのエントリーに一致した。その後、残りのタグ
はアミラーゼに由来することがわかった。10の転写産物
の全部が既知の膵臓機能の遺伝子に由来し、それらの存
在は、慣用のアプローチを用いたこれまでの膵臓RNAの
分析と一致した（Hanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
3,:110,1986;Takedaら、Hum.Mol.Gen.2:1793,1993）。

「タグ」は、4bpのアンカリングNla III部位に隣接す
る、各タグに固有の9bpの配列を示す。「Ｎ」および
「パーセント」は、それぞれ、タグを同定した回数およ
びその頻度を示す。「遺伝子」は、SAGEソフトウエア・
グループを用いて表示のタグに一致することがわかった
GenBank R87エントリーの受け入れ番号および記載を示
し、以下の例外がある。すなわち、重複するエントリー
のために複数のエントリーが同定される場合には、１つ
のエントリーのみを掲載する。キモトリプシノーゲンお
よびトリプシノーゲン１の場合、同じタグを含有すると
予想される他の遺伝子が同定されたが、続いて行ったハ
イブリダイゼーションおよび配列分析によって、掲載の
遺伝子をタグの供給源として同定した。「Aluエントリ
ー（Aluentry）」とは、alu共通配列（Deiningerら、J.
Mol.Biol.151,:17,1981）の少なくとも１コピーを含有
していた転写産物のためのGenBankエントリーと一致し
たことを示す。

実施例２ SAGEの定量的性質は、オリゴ−dTプライマーを用いて
作製（oligo−dT primed）膵臓cDNAライブラリー（トリ
プシノーゲン1/2、プロカルボキシペプチダーゼAl、キ
モトリプシノーゲンおよびエラスターゼＩ〜II B/プロ
テアーゼＥに対するcDNAプローブでスクリーニングし
た）を構築することによって評価した。実施例１におい
てSAGEに用いたのと同じ調製物から得られた膵臓mRNAを
用いて、ZAP Express cDNA合成キット（Stratagene）を
用いて製造業者のプロトコールにしたがって、ZAP Expr
essベクターにcDNAライブラリーを構築した。ランダム
に選んだ15のクローンを分析することにより、100％がc
DNAインサートを含有することがわかった。250〜500の
プラークを含有するプレートを、先に記載されている
（Ruppertら、Mol.Cell.Biol.８:3104,1988）ようにし
てハイブリダイズさせた。トリプシノーゲン１、トリプ
シノーゲン２、プロカルボキシペプチダーゼAl、キモト
リプシノーゲンおよびエラスターゼIII Bに対するcDNA
プローブを、RT−PCRによって膵臓RNAから誘導した。ト
リプシノーゲン１および２のプローブは93％同一であ
り、使用条件下で同じプラークにハイブリダイズした。
同様に、エラスターゼIII BプローブとプロテアーゼＥ
プローブは95％以上同一であり、同じプラークにハイブ
リダイズした。

これらの転写産物に対するSAGEタグの相対的存在量
は、ライブラリー・スクリーニングを用いて得た結果と
非常によく一致した（図２）。さらに、トリプシノーゲ
ン１と２も、エラスターゼIII BとプロテアーゼＥも、
ライブラリーをスクリーニングするのに用いたcDNAプロ
ーブによって区別することはできなかったが、４つの転
写産物の全ては、それらのSAGEタグに基づいて容易に区
別できた（表１）。

実施例３ SAGEは、既知の転写産物の存在量についての定量的情
報を提供するためだけでなく、新規な発現遺伝子の同定
にも用いることができる。本実施例におけるSAGE分析の
目的では、各転写産物に固有の9bpの配列のみを考慮し
たが、各SAGEタグでは、アンカリング酵素（4bp）部位
および9bpのタグから成る13bpの配列が確定された。こ
の可能性を説明するために、13bpのオリゴヌクレオチド
を用いて、４つの指定を受けていないタグ（P1〜P4）
（すなわち、GenBank R87からのエントリーに対応しな
いタグ）に対応する転写産物を単離した（表１）。それ
ら４つの場合の各々において、13bpのオリゴヌクレオチ
ドをハイブリダイゼーション・プローブとして用いて膵
臓cDNAライブラリーをスクリーニングするだけで、タグ
に対する複数のcDNAクローンを単離することが可能であ
った（図３の例）。

250〜2,000のプラークを含有するプレートを、ハイブ
リダイゼーション温度を室温まで低下させた以外は標準
的なプローブについて以前に記載されているものと同じ
条件を用いて、オリゴヌクレオチド・プローブにハイブ
リダイズした。洗浄を6xSSC/0.1％SDS中で30分間室温で
行った。これらのプローブは、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてγ³²P−ATPで標識された13bpのオリゴヌク
レオチドから構成された。それぞれの場合、誘導したク
ローンを配列決定することにより、同定した転写産物の
想定３′末端に正しいSAGEタグが同定された。13−mer
とのハイブリダイゼーションによって同定されたプラー
クの存在量は、SAGEによって予測されたものとよく一致
した（表２）。タグP1およびP2は、それぞれアミラーゼ
およびプレプロカルボキシペプチダーゼA2に対応するこ
とがわかった。GenBank R87には、プレプロカルボキシ
ペプチダーゼA2に対するエントリーが全く存在せず、ア
ミラーゼに対しては末端の切断された（truncated）エ
ントリーだけしか存在せず、これにより、それらの指定
を受けていない特性表示を説明できる。タグP3は、GenB
ankに含まれる既知の機能の遺伝子のいずれとも一致し
なかったが、多数のESTと一致し、このことにより、タ
グP3が真の（bona fide）転写産物を表すことがさらに
明らかになった。P4によって同定されたcDNAは有意な相
同性を全く示さず、このことは、そのcDNAがこれまでに
特性決定されていない膵臓転写産物を表すことを示唆し
た。

「タグ」および「SAGE存在量」は表１で説明したとお
りであり、「13mer Hyb」は、上記のような13merでcDNA
ライブラリーをスクリーニングすることによって得られ
た結果を示す。スクリーニングした総プラーク数で除し
た陽性プラークの数を、存在量パーセントの後ろのカッ
コ内に示す。「SAGEタグ」の欄の＋の符号は、発現され
たSAGEタグ配列が、単離したクローンの３′末端付近で
同定されたことを示す。「記載」とは、1995年６月９日
のNCBIで毎日更新されているGenBankエントリーのBLAST
検索の結果を示す（Altschul,ら,J.Mol.Biol.215:403,1
990）。記載および受け入れ番号は最も顕著な一致をみ
たものについて示してある。P1は、末端の切断されたア
ミラーゼに対するエントリーに一致することがわかり、
P2はプレプロカルボキシペプチダーゼA2に対する未発表
のエントリー（これを、GenBank R87の後に参加させ
た）に一致することがわかった。

実施例４ SAGEによって得られたジタグを、本明細書に記載され
ているように、PSAまたはCSにより分析できる。PSAの１
つの好ましい実施形態では、ジタグを用いて以下の工程
を行う。

すなわち、先の実施例に記載したようにジタグを調製
し、増幅し、アンカリング酵素で切断する。

突出部分に相補的な、確認物質（例えば、蛍光成分、F
L）を含有する４塩基のオリゴマー（例えば、FL−CAT
G）を調製する。過剰のFL−CATGオリゴマーを上記のジ
タグに以下のように連結する。

次にそれらのジタグを精製し溶融して、例えば、式：を有する一本鎖DNAを得る。この一本鎖DNAの混合物は好
ましくは連続希釈する。各連続希釈物を、適切なストリ
ンジェントな条件下で、グリッドに分注した一本鎖オリ
ゴを含有する固相マトリックスとハイブリダイズさせ
る。それらのオリゴヌクレオチドの全部がアンカリング
酵素切断配列の半分の部位を含有している。ここで用い
た例では、オリゴヌクレオチド配列は５′末端にCATG配
列を含有する。

GATGOOOOOOOOOO、CATGXXXXXXXXXX、等（または、３′末端にCATGを含有する:OOOOOOOOOOCAT
G）マトリックスは当業界で公知の如何なる物質から構成
されていてもよく、オリゴヌクレオチド担持チップは当
業界で公知の手順によって作製することができ、例え
ば、VLSIP法（Fodorら，前掲）によって作製されたオリ
ゴヌクレオチドを含有するシリコンチップが挙げられ
る。

オリゴヌクレオチド担持マトリックスは、グリッド内
の各位置における蛍光ジタグの存在または不存在につい
て評価する。

１つの好ましい実施態様では、グリッドには4¹⁰また
は1,048,576の一般配列CATGOOOOOOOOOOのオリゴヌクレ
オチドが存在し、あらゆる可能性のある10塩基配列がCA
TGの３′側に表示されるようになっている（ここでは、
CATGは、ジタグの３′末端にあるアンカリング酵素の半
分の部位に相補的であるアンカリング酵素の半分の部位
の一例として用いられている）。ヒト・ゲノムには100,
000〜200,000ほどの様々な発現遺伝子があると推定され
るので、ヒト・ゲノムにおける発現遺伝子由来のcDNAに
おいて見出される最も３′側のアンカリング酵素部位に
隣接している可能な配列の全部を検出するのに十分なオ
リゴヌクレオチド配列がある。

さらに別の実施態様では、次の配列：を含有する上記の配列を増幅し、タギング酵素、次にア
ンカリング酵素で切断して、次の構造：（Ｏ）₁₀CATG−3' を有するタグ相補体を生成させる。次に、このタグ相補
体を、標識し、融解し、固相支持体上でオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせることが可能である。

様々なライブラリー（示差的スクリーニングプローブ
を表す）間で、様々な希釈率で、グリッド上での蛍光プ
ロフィールを比較することにより、示差的発現を測定し
た。例えば、かくして、個々のオリゴヌクレオチドは以下の特性を
有するジタグにハイブリダイズする。

表３は、示差的ハイブリダイゼーションの結果をまと
めたものである。1Aおよび3Bにハイブリダイズしたタグ
は、示差的には発現されない、高い存在量のmRNAを反映
し（その理由は、これらのタグが、全ての希釈率におい
て双方のライブラリーにハイブリダイズするからであ
る）；タグ2Cは、高い存在量のmRNA（しかし、ライブラ
リーＢのみ）を同定する。2Eは、示差的に発現されるこ
とがわかっていない、低い存在量の転写産物を反映し
（その理由は、それが最低の希釈率でのみ検出されるか
らである）;3Cは、ライブラリーＢでの中程度の存在量
の転写産物を反映し（その理由は、それが低いほうの２
つの希釈率で発現されるからである）、この転写産物は
ライブラリーＡでは低い存在量で発現される。4Dは、ラ
イブラリーＡに限って示差的に発現される高い存在量の
転写産物を反映し;5Aは、ライブラリーＡでは高い存在
量で発現されるが、ライブラリーＢでは低い存在量でし
か発現されない転写産物を反映し;5Eは、ライブラリー
Ｂでのみ検出可能な、示差的に発現される転写産物を反
映する。

別のPSAの実施態様では、上記の工程３で蛍光性また
は他の確認物を使用する必要はないが、その代わりに、
ジタグの最後の増幅のラウンドにおいて、標識dNTPを用
いて、融解後に全分子の半分が標識されて、チップ上に
固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる
ためのプローブとして役立つようにする。

さらに別のPSAの実施態様では、ジタグの代わりに、
転写産物の特定の部分（例えば、転写産物の３′末端と
第１アンカリング酵素部位との間の配列）を用いる。そ
のような特定の場合、「詳細な説明」で記載したよう
に、二本鎖cDNA逆転写産物が作製される。この転写産物
なアンカリング酵素で切断し、PCRプライマーを含有す
るリンカーを付加して、（このプライマーを一方の末端
で用い、ポリＡ尾部を他方の末端で用いて）増幅を開始
するが、この転写産物は依然としてストレプトアビジン
・ビーズの上に存在したままである。増幅の最後のラウ
ンドで、フルオレセイン化dNTPを用いて、分子の半分が
標識されるようにする。この時点で、場合によっては、
断片のサイズを小さくするために、リンカー−プライマ
ーをアンカリング酵素を用いて除去してもよい。次に、
先の実施例のように、これらの可溶性の断片を融解し、
CATGOOOOOOOOOOを含有する固相マトリックスの上で捕捉
する。（フルオレセイン化塩基を含有する断片の半分の
みの）分析および評価は上記と同様である。

クローンの配列決定で使用するためには、（細胞クロ
ーニングのための限界希釈法において行われるように）
ジタグまたはコンカテマーを希釈し、例えばマルチウエ
ルプレートのウエルまたは他の受け器に添加して、ウエ
ルが統計学上平均してウエル当たり１個未満のDNA分子
を含有するようにする。次に、各ウエルには、PCRまた
は他の増幅プロセス用の試薬を加え、各受け器中のDNA
を例えばマススペクトルスコピーによって配列決定す
る。その結果は、単一の配列（その受け器中に単一の配
列が存在していた）か、「ヌル」配列（DNAは存在して
いなかった）であるか、あるいは二重配列（１より多い
DNA分子）のいずれかであり、これは、二重配列はデー
タ分析の際には考慮から外されるであろう。その後、示
差的表現の評価を、ここに記載したとおりに行う。

これらの結果は、SAGEが遺伝子発現についての定量的
および定性的の両方のデータを提供することを実証する
ものである。種々の認識エレメントをもつ異なるアンカ
リング酵素および／またはタギング酵素を使用すること
により、この戦略が大きな融通性を伴うようになる。特
に、異なるアンカリング酵素は異なる部位でcDNAを切断
するので、同じcDNA調製物の個々のサンプルに対して少
なくとも２つの異なるアンカリング酵素を用いることに
より、結果の確認が可能となり、またそれら酵素の１つ
に対する認識部位を含有しない可能性がある配列の分析
の確認が可能となる。

完成に近づいているゲノムを十分に特性決定するため
の試みとして、SAGEは、あらゆる所与の細胞型または組
織における発現の直接的な解読を可能にしなければなら
ない。当座の間、SAGEの主な用途は、組織間での、およ
び所与の細胞または組織の様々な発生段階および疾病状
態での遺伝子発現パターンの比較であろう。PCRおよび
手操作による配列決定を行う能力のある当業者であれ
ば、この目的のためにSAGEを実施することが可能であろ
う。この技術を自動化配列決定装置に適用することによ
り、３時間の運転を１回行うだけで1,000個以上の転写
産物を分析することが可能となろう。ABI377型配列決定
装置では、３時間の運転で36の鋳型について451bpの解
読が得られる（451bp/11bp/タグx36＝1476タグ）。測定
すべきタグの適切な数は、その応用例に依存する。例え
ば、１つの組織では比較的高レベル（0.5％以上）で発
現されるが他の組織では低いレベルで発現される遺伝子
の決定には、たった１日あればよいであろう。細胞当た
り100以上のmRNA（0.025％以上）で発現される転写産物
の測定は、１つの測定装置で２、３ヶ月以内に定量可能
でなければならない。２種の異なるアンカリング酵素を
用いることにより、所望の存在量の転写産物のほどんど
全てが確実に同定されるであろう。それらの示差的提示
（differential representation）に基づいて最も興味
深いものであることがわかっているタグをコードする遺
伝子は、表２で実証されているように、データベース検
索とハイブリダイゼーションと配列分析とを組合せるこ
とによってポジティブに同定できる。明らかに、SAGEは
ヒト以外の生物の分析にも応用可能であり、特定の生物
学的状態で発現される遺伝子の方に研究を導くであろ
う。

SAGEは、本明細書で記載したように、組織間での、ま
たは同じ組織の異なる段階間での、または病的な組織と
その正常なものとの間での多数の遺伝子の発現の比較を
可能にする。そのような分析は、例えば治療上、診断上
および予後上関連のある遺伝子を同定するのに有用であ
る。SAGE技術の多くの有用性の中でも、とりわけ治療上
有用でありうる適切なアンチセンス試薬または３重らせ
ん試薬の同定がある。さらに、遺伝子治療の候補もこの
SAGE技術によって同定することが可能である。他の用途
としては、遺伝子の発現が例えば疾病に対する素質、疾
病の存在および疾病の予後と相関性があることがわかっ
ている個々の遺伝子または遺伝子群を同定するための診
断的使用が挙げられる。表１に示されるような存在量の
プロフィールは、上記の用途に有用である。SAGEは、宿
主内の生物（例えば、病原体）の検出、または宿主内で
病原体によって発現される感染特異的遺伝子の検出にも
有用である。

本発明におけるSAGEによって説明されるように、多数
の発現遺伝子を短時間で同定できるということは、無限
の用途を提供する。

本発明は、現在好ましいとされる実施態様について記
載してきたが、本発明の精神を逸脱することなしに種々
の改変が可能であると理解すべきである。したがって、
本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヴェルヴレスク，ヴィクター，イー. アメリカ合衆国 21202 メリーランド州バルチモア，エヌ．カルバートストリート 650，アパートメントシー (72)発明者ツァン，リンアメリカ合衆国 21218 メリーランド州バルチモア，セントポールストリート 3100，アパートメント 405 審査官本間夏子 (56)参考文献国際公開95／14772（ＷＯ，Ａ１) ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．199，ｐ．184− 190（1991) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．145，ｐ．163− 169（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも２つの限定されたヌクレオチド
配列タグを含む単離されたジタグオリゴヌクレオチドで
あって、該限定されたヌクレオチド配列タグが全長cDNA
中の最も5'側の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の5'側
の配列または最も3'側の制限エンドヌクレアーゼ切断部
位の3'側の配列を含み、各タグが各々別の発現遺伝子に
由来している上記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】前記オリゴヌクレオチドが約１〜200のジ
タグからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】前記オリゴヌクレオチドが約８〜20のジタ
グからなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】遺伝子発現を検出する方法であって、発現遺伝子を含む細胞のmRNAから相補的デオキシリボ核
酸（cDNA）オリゴヌクレオチドを作製し、第1cDNAオリゴヌクレオチドから第１の限定されたヌク
レオチド配列タグを単離し、かつ第2cDNAオリゴヌクレ
オチドから第２の限定されたヌクレオチド配列タグを単
離し、ここで、該限定されたヌクレオチド配列タグは全
長cDNA中の最も5'側の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
の5'側の配列または最も3'側の制限エンドヌクレアーゼ
切断部位の3'側の配列を含み、第１タグを第１オリゴヌクレオチドリンカー（該第１オ
リゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーへのハイブ
リダイゼーションのための第１配列を含む）に結合し、
かつ第２タグを第２オリゴヌクレオチドリンカー（該第
２オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーへのハ
イブリダイゼーションのための第２配列を含む）に結合
し、第１オリゴヌクレオチドリンカーに結合した第１タグ
を、第２オリゴヌクレオチドリンカーに結合した第２タ
グに連結させてジタグを形成し、該ジタグのヌクレオチド配列を決定する、ことを含んでなり、その際ジタグにおける第１または第
２タグの同定が、該第１または第２タグに対応する遺伝
子が該細胞において発現されることを示すものである上
記方法。
【請求項５】ジタグオリゴヌクレオチドを増幅すること
をさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】ジタグのコンカテマー（鎖状体）を作製す
ることをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】前記コンカテマーが約２〜200のジタグか
らなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記コンカテマーが約８〜20のジタグから
なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】第１および第２オリゴヌクレオチドリンカ
ーが同じヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の
方法。
【請求項１０】第１および第２オリゴヌクレオチドリン
カーが異なるヌクレオチド配列を有する、請求項４に記
載の方法。
【請求項１１】第１および第２オリゴヌクレオチドリン
カーが次の配列：または（ここで、ＡはジデオキシＡである）を有する、請求項
10に記載の方法。
【請求項１２】前記のリンカーが認識部位から離れた部
位での切断を可能にする第２制限エンドヌクレアーゼ認
識部位を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】第２制限エンドヌクレアーゼがII S型エ
ンドヌクレアーゼである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】II S型エンドヌクレアーゼがBsmF Iおよ
びFok Iよりなる群から選択される、請求項13に記載の
方法。
【請求項１５】ジタグが約12〜60塩基対である、請求項
４に記載の方法。
【請求項１６】ジタグが約18〜22塩基対である、請求項
15に記載の方法。
【請求項１７】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増
幅する、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】PCR用のプライマーがよりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】遺伝子発現を検出する方法であって、遺伝子を発現する細胞のmRNAに由来するcDNAサンプルを
第１制限エンドヌクレアーゼで切断し、ここで該エンド
ヌクレアーゼはcDNAの5'または3'末端の限定された位置
でcDNAを切断することにより限定された配列タグを生成
するものであり、該限定された位置と隣接末端との間に位置する該限定さ
れた5'または3'cDNAタグを単離し、該限定された配列タグの少なくとも一部を、増幅プライ
マーにハイブリダイズさせるための第１配列をもつ第１
オリゴヌクレオチドリンカーと連結し、かつ残りの該限
定された配列タグの少なくとも一部を、増幅プライマー
にハイブリダイズさせるための第２配列をもつ第２オリ
ゴヌクレオチドリンカーと連結し、ここで、各リンカー
は第２制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含
み、該第２制限エンドヌクレアーゼは該認識部位から離
れた部位で切断するものであり、該第１および第２オリ
ゴヌクレオチドリンカーは同一であっても異なっていて
もよく、該タグを第２制限エンドヌクレアーゼで切断し、該限定された配列タグを連結してジタグを形成し、該ジタグのヌクレオチド配列を決定する、ことを含んでなり、その際該ジタグにおける第１または
第２タグの同定が、該第１または第２タグに対応する遺
伝子が該細胞において発現されることを示すものである
上記方法。
【請求項２０】ジタグを増幅することをさらに含んでな
る、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】第１制限エンドヌクレアーゼが４塩基対
の認識部位を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】第１制限エンドヌクレアーゼがNla III
である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】cDNAが捕捉手段を含む、請求項19に記載
の方法。
【請求項２４】捕捉手段が結合エレメントである、請求
項23に記載の方法。
【請求項２５】結合エレメントがビオチンである、請求
項24に記載の方法。
【請求項２６】第１および第２オリゴヌクレオチドリン
カーが同じヌクレオチド配列を有する、請求項19に記載
の方法。
【請求項２７】第１および第２オリゴヌクレオチドリン
カーが異なるヌクレオチド配列を有する、請求項19に記
載の方法。
【請求項２８】第１および第２オリゴヌクレオチドリン
カーが次の配列：または（ここで、ＡはジデオキシＡである）を有する、請求項
27に記載の方法。
【請求項２９】第２制限エンドヌクレアーゼがII S型エ
ンドヌクレアーゼである、請求項19に記載の方法。
【請求項３０】II S型エンドヌクレアーゼがBsmF Iおよ
びFok Iよりなる群から選択される、請求項29に記載の
方法。
【請求項３１】ジタグが約12〜60塩基対である、請求項
19に記載の方法。
【請求項３２】ジタグが約14〜22塩基対である、請求項
31に記載の方法。
【請求項３３】ジタグを連結してコンカテマーを作製す
ることをさらに含んでなる、請求項19に記載の方法。
【請求項３４】前記コンカテマーが約２〜200のジタグ
からなる、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】前記コンカテマーが約８〜20のジタグか
らなる、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増
幅する、請求項19に記載の方法。
【請求項３７】PCR用のプライマーがよりなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】cDNAジタグの存在が該ジタグのタグの配
列を有する遺伝子の発現を示すことからなる、遺伝子発
現を検出するためのキットであって、増幅プライマーに
ハイブリダイズさせるための第１配列をもつ第１オリゴ
ヌクレオチドリンカーを含有する第１容器、増幅プライ
マーにハイブリダイズさせるための第２配列をもつ第２
オリゴヌクレオチドリンカーを含有する第２容器（ただ
し、これらのリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識部
位から離れた部位でDNAを切断するための制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位をさらに含む）、および該リンカー
の第１および第２配列にハイブリダイズさせるための核
酸プライマーを含有する第３および第４容器を含んでな
る、１以上の容器から構成される上記キット。
【請求項３９】前記のリンカーが次の配列：または（ここで、ＡはジデオキシＡである）を有する、請求項
38に記載のキット。
【請求項４０】制限エンドヌクレアーゼがII S型エンド
ヌクレアーゼである、請求項38に記載のキット。
【請求項４１】II S型エンドヌクレアーゼがBsmF Iであ
る、請求項40に記載のキット。
【請求項４２】増幅用プライマーがよりなる群から選択される、請求項38に記載のキット。
【請求項４３】２つの限定されたヌクレオチド配列タグ
が末端−末端結合で連結され、ここで、連結される末端
は制限エンドヌクレアーゼの切断部位に対して遠位にあ
る末端である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】前記のジタグが各末端に切断された制限
エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１に記載の
オリゴヌクレオチド。