JP2001155035A - 遺伝子発現の逐次分析法 - Google Patents
遺伝子発現の逐次分析法Info
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- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ中の限定された位置
からの短いヌクレオチド配列を用いて、データベース中
のヌクレオチド配列に一致させるおよび／またはライブ
ラリー中のｃＤＮＡクローンを選択する方法を提供す
る。 【解決手段】 第１ヌクレオチド配列を第２ヌクレオチ
ド配列により同定する方法であって、メッセンジャーＲ
ＮＡ中の限定された位置を有する第１ヌクレオチド配列
を予め選択し、第１ヌクレオチド配列をヌクレオチド配
列のデータベースと比較し、第１ヌクレオチド配列に一
致する該データベース中の第２ヌクレオチド配列を選択
し、第２ヌクレオチド配列がそのメッセンジャーＲＮＡ
中の該限定された位置に存在することを確認し、それに
より、第１ヌクレオチド配列を、限定された位置および
共通ヌクレオチド配列を共有する第２ヌクレオチド配列
により同定する、各ステップを含む上記方法。
からの短いヌクレオチド配列を用いて、データベース中
のヌクレオチド配列に一致させるおよび／またはライブ
ラリー中のｃＤＮＡクローンを選択する方法を提供す
る。 【解決手段】 第１ヌクレオチド配列を第２ヌクレオチ
ド配列により同定する方法であって、メッセンジャーＲ
ＮＡ中の限定された位置を有する第１ヌクレオチド配列
を予め選択し、第１ヌクレオチド配列をヌクレオチド配
列のデータベースと比較し、第１ヌクレオチド配列に一
致する該データベース中の第２ヌクレオチド配列を選択
し、第２ヌクレオチド配列がそのメッセンジャーＲＮＡ
中の該限定された位置に存在することを確認し、それに
より、第１ヌクレオチド配列を、限定された位置および
共通ヌクレオチド配列を共有する第２ヌクレオチド配列
により同定する、各ステップを含む上記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的には遺伝子
発現の分野に関し、より特定すると、発現された遺伝子
の領域に対応する転写産物の限定領域を同定することに
より多数の転写産物を分析するための遺伝子発現の逐次
分析（serial analysis of gene expression: SAGE) 法
に関する。
発現の分野に関し、より特定すると、発現された遺伝子
の領域に対応する転写産物の限定領域を同定することに
より多数の転写産物を分析するための遺伝子発現の逐次
分析（serial analysis of gene expression: SAGE) 法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトを含めた高等生物のゲノム配列の解
析は今や現実に到達できる目標となっている。しかし、
この解析は遺伝子の複雑性の一つのレベルを表すにすぎ
ない。順序づけられた、時宜を得た遺伝子の発現は、生
物の定義および生物学にとって等しく重要な、もう一つ
の複雑性のレベルを表している。
析は今や現実に到達できる目標となっている。しかし、
この解析は遺伝子の複雑性の一つのレベルを表すにすぎ
ない。順序づけられた、時宜を得た遺伝子の発現は、生
物の定義および生物学にとって等しく重要な、もう一つ
の複雑性のレベルを表している。
【０００３】ヒト・ゲノムプロジェクトの一部として、
ｍＲＮＡから逆転写される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
配列を解析することの役割が討論されてきた。というの
は、ゲノム配列決定の提唱者が、あらゆる組織、細胞型
および発生段階で発現されるｍＲＮＡを一つのこらず見
つけ出すことは至難の技であると主張し、さらにイント
ロン領域と遺伝子間領域（制御および調節配列を含む）
からの多くの価値ある情報がｃＤＮＡ配列決定により失
われるだろうと指摘してきたからである（ヒトゲノムの
地図作成および配列決定に関する委員会報告(Report of
the Committeeon Mapping and Sequencing the Human
Genome), National Academy Press, Washington, D.C.,
1988）。それゆえ、ｃＤＮＡライブラリーを用いるゲ
ノムの転写領域の配列決定では不十分であると考えられ
ている。ｃＤＮＡのライブラリーは反復性エレメント、
ミトコンドリア遺伝子、リボソームＲＮＡ遺伝子、およ
び共通遺伝子やハウスキーピング遺伝子を含む他の核遺
伝子が優勢であると考えられる。ｃＤＮＡのライブラリ
ーは構造および調節ポリペプチドまたはペプチドに対応
する配列をすべて提供するとは限らないのである(Putne
yら, Nature, 302:718, 1983)。
ｍＲＮＡから逆転写される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の
配列を解析することの役割が討論されてきた。というの
は、ゲノム配列決定の提唱者が、あらゆる組織、細胞型
および発生段階で発現されるｍＲＮＡを一つのこらず見
つけ出すことは至難の技であると主張し、さらにイント
ロン領域と遺伝子間領域（制御および調節配列を含む）
からの多くの価値ある情報がｃＤＮＡ配列決定により失
われるだろうと指摘してきたからである（ヒトゲノムの
地図作成および配列決定に関する委員会報告(Report of
the Committeeon Mapping and Sequencing the Human
Genome), National Academy Press, Washington, D.C.,
1988）。それゆえ、ｃＤＮＡライブラリーを用いるゲ
ノムの転写領域の配列決定では不十分であると考えられ
ている。ｃＤＮＡのライブラリーは反復性エレメント、
ミトコンドリア遺伝子、リボソームＲＮＡ遺伝子、およ
び共通遺伝子やハウスキーピング遺伝子を含む他の核遺
伝子が優勢であると考えられる。ｃＤＮＡのライブラリ
ーは構造および調節ポリペプチドまたはペプチドに対応
する配列をすべて提供するとは限らないのである(Putne
yら, Nature, 302:718, 1983)。
【０００４】標準的なｃＤＮＡクローニングのもう一つ
の欠点は、一部のｍＲＮＡが豊富であるのに対し、他が
稀であるということである。さまざまな遺伝子に由来す
るｍＲＮＡの細胞量は数桁分も変化することがある。
の欠点は、一部のｍＲＮＡが豊富であるのに対し、他が
稀であるということである。さまざまな遺伝子に由来す
るｍＲＮＡの細胞量は数桁分も変化することがある。
【０００５】ｃＤＮＡサブトラクションまたはディファ
レンシャルディスプレーに基づいた技術は、２つの細胞
型間の遺伝子発現を比較する上で極めて有用である(Hed
rickら, Nature, 308:149, 1984; Liang and Pardee, S
cience, 257:967, 1992)。しかし、この技術は部分的な
分析を提供するにすぎず、メッセンジャーＲＮＡの量に
関する直接的な情報をなにも提供しない。エクスプレス
ド・シークエンス・タグ(expressed sequence tag: ES
T) 法は遺伝子を検索するための有用なツールであるこ
とがわかった(Adamsら, Science 252:1656, 1991; Adam
sら, Nature, 355:632, 1992; Okuboら, Nature Geneti
cs, 2:173, 1992) ものの、ノーザンブロッティング、
ＲＮアーゼプロテクション、および逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 分析(Alwineら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 74:5550, 1977; Zinnら, Cell, 3
4:865, 1983; Veresら, Science, 237:415, 1987) と同
様に、一度に限られた数の遺伝子しか評価できない。さ
らに、ＥＳＴ法は、好ましくは、類似性検索やマッピン
グのために150塩基対またはそれより長いヌクレオチド
配列を使用する。
レンシャルディスプレーに基づいた技術は、２つの細胞
型間の遺伝子発現を比較する上で極めて有用である(Hed
rickら, Nature, 308:149, 1984; Liang and Pardee, S
cience, 257:967, 1992)。しかし、この技術は部分的な
分析を提供するにすぎず、メッセンジャーＲＮＡの量に
関する直接的な情報をなにも提供しない。エクスプレス
ド・シークエンス・タグ(expressed sequence tag: ES
T) 法は遺伝子を検索するための有用なツールであるこ
とがわかった(Adamsら, Science 252:1656, 1991; Adam
sら, Nature, 355:632, 1992; Okuboら, Nature Geneti
cs, 2:173, 1992) ものの、ノーザンブロッティング、
ＲＮアーゼプロテクション、および逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 分析(Alwineら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 74:5550, 1977; Zinnら, Cell, 3
4:865, 1983; Veresら, Science, 237:415, 1987) と同
様に、一度に限られた数の遺伝子しか評価できない。さ
らに、ＥＳＴ法は、好ましくは、類似性検索やマッピン
グのために150塩基対またはそれより長いヌクレオチド
配列を使用する。
【０００６】また、配列標識部位(sequence tagged sit
e: STS) (Olsonら, Science, 245:1434, 1989)は、ゲノ
ムの物理的地図を作成するためのゲノムマーカーを同定
するのに利用されてきた。物理的にマップされたクロー
ンからのこうした短い配列がゲノムにおける唯一同定さ
れた地図位置を表す。対照的に、発現された遺伝子の同
定は、in vivo で実際に転写され発現された遺伝子のマ
ーカーである、発現された配列のタグをあてにしてい
る。
e: STS) (Olsonら, Science, 245:1434, 1989)は、ゲノ
ムの物理的地図を作成するためのゲノムマーカーを同定
するのに利用されてきた。物理的にマップされたクロー
ンからのこうした短い配列がゲノムにおける唯一同定さ
れた地図位置を表す。対照的に、発現された遺伝子の同
定は、in vivo で実際に転写され発現された遺伝子のマ
ーカーである、発現された配列のタグをあてにしてい
る。
【０００７】さまざまな生物学的応用を研究するため
に、特に、いろいろな生理的または病理的状態下にある
異なる細胞型もしくは同じ細胞型における全体的な遺伝
子発現パターンを確立するために、何千もの発現された
遺伝子を迅速かつ詳細に分析することを可能とする改良
法が必要とされている。異なる発現パターンの同定は、
適切な治療ターゲットの同定、遺伝子治療（例えば、遺
伝子置換）用の候補遺伝子の同定、組織タイピング、法
的確認、疾病関連遺伝子の位置決定、診断・予診用のイ
ンジケーター遺伝子の同定を含めて、いくつかの実用性
を有している。
に、特に、いろいろな生理的または病理的状態下にある
異なる細胞型もしくは同じ細胞型における全体的な遺伝
子発現パターンを確立するために、何千もの発現された
遺伝子を迅速かつ詳細に分析することを可能とする改良
法が必要とされている。異なる発現パターンの同定は、
適切な治療ターゲットの同定、遺伝子治療（例えば、遺
伝子置換）用の候補遺伝子の同定、組織タイピング、法
的確認、疾病関連遺伝子の位置決定、診断・予診用のイ
ンジケーター遺伝子の同定を含めて、いくつかの実用性
を有している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、さまざまな
生理的状態、発生段階または疾病状態にある異なる細胞
型もしくは同じ細胞型における全体的な遺伝子発現パタ
ーンを同定するために、多数の転写産物を迅速に分析す
る方法を提供する。この方法はメッセンジャーＲＮＡの
限定された位置にある短いヌクレオチド配列のタグを同
定することに基づいている。このタグを用いて、対応す
る転写産物および遺伝子（該遺伝子から該転写産物が転
写される）を同定する。「ジタグ」(ditag) と称する二
量体化されたタグを利用することで、本発明の方法は、
クローニングおよび／または増幅中に生じ、おそらくは
データの評価中にも生じうる、いくつかのタイプの偏り
(bias)を排除することができる。これらの短いヌクレオ
チド配列のタグを鎖状に連結することで、単一のＤＮＡ
分子（例えば、ベクターまたは単一クローンに挿入され
たＤＮＡ分子）上の複数のタグの配列決定を行うことに
より逐次的に転写産物を効率よく分析することが可能で
ある。
生理的状態、発生段階または疾病状態にある異なる細胞
型もしくは同じ細胞型における全体的な遺伝子発現パタ
ーンを同定するために、多数の転写産物を迅速に分析す
る方法を提供する。この方法はメッセンジャーＲＮＡの
限定された位置にある短いヌクレオチド配列のタグを同
定することに基づいている。このタグを用いて、対応す
る転写産物および遺伝子（該遺伝子から該転写産物が転
写される）を同定する。「ジタグ」(ditag) と称する二
量体化されたタグを利用することで、本発明の方法は、
クローニングおよび／または増幅中に生じ、おそらくは
データの評価中にも生じうる、いくつかのタイプの偏り
(bias)を排除することができる。これらの短いヌクレオ
チド配列のタグを鎖状に連結することで、単一のＤＮＡ
分子（例えば、ベクターまたは単一クローンに挿入され
たＤＮＡ分子）上の複数のタグの配列決定を行うことに
より逐次的に転写産物を効率よく分析することが可能で
ある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本明細書に記載する方法
は、多数の転写産物の分析を可能とする新規な方法とし
ての遺伝子発現の逐次分析(SAGE)法である。この戦略を
検証するために、膵臓から単離したｍＲＮＡから短いｃ
ＤＮＡ配列タグを作製し、ランダムに対合させてジタグ
を形成し、鎖状に連結（コンカテマー化）してクローン
化した。1000個のタグの手動配列決定により、膵臓の機
能に特徴的な遺伝子発現パターンが明らかになった。こ
のようなパターンの同定は例えば診断上および治療上重
要である。さらに、遺伝子検索用ツールとしてのSAGEの
使用を、新規なタグに対応する膵臓の新たな転写産物を
同定・単離することで証明した。SAGEはさまざまな正常
状態、発生段階および疾病状態における発現遺伝子の定
量的目録作成(cataloging)および比較のための広範に応
用可能な手段を提供する。好適な実施態様の説明 本発明は、発現された遺伝子に対応する転写産物の量お
よび性質を決定するための迅速で定量的な方法を提供す
る。遺伝子発現の逐次分析(SAGE)と名づけられたこの方
法は、遺伝子セグメントに対応する転写産物の限定され
た部分配列の同定および特性決定を土台とするものであ
る。これらの限定された転写産物配列「タグ」は、例え
ば細胞、組織または抽出物において発現される遺伝子の
マーカーに相当する。
は、多数の転写産物の分析を可能とする新規な方法とし
ての遺伝子発現の逐次分析(SAGE)法である。この戦略を
検証するために、膵臓から単離したｍＲＮＡから短いｃ
ＤＮＡ配列タグを作製し、ランダムに対合させてジタグ
を形成し、鎖状に連結（コンカテマー化）してクローン
化した。1000個のタグの手動配列決定により、膵臓の機
能に特徴的な遺伝子発現パターンが明らかになった。こ
のようなパターンの同定は例えば診断上および治療上重
要である。さらに、遺伝子検索用ツールとしてのSAGEの
使用を、新規なタグに対応する膵臓の新たな転写産物を
同定・単離することで証明した。SAGEはさまざまな正常
状態、発生段階および疾病状態における発現遺伝子の定
量的目録作成(cataloging)および比較のための広範に応
用可能な手段を提供する。好適な実施態様の説明 本発明は、発現された遺伝子に対応する転写産物の量お
よび性質を決定するための迅速で定量的な方法を提供す
る。遺伝子発現の逐次分析(SAGE)と名づけられたこの方
法は、遺伝子セグメントに対応する転写産物の限定され
た部分配列の同定および特性決定を土台とするものであ
る。これらの限定された転写産物配列「タグ」は、例え
ば細胞、組織または抽出物において発現される遺伝子の
マーカーに相当する。
【００１０】SAGEはいくつかの原理に基づいている。ま
ず第一に、短いヌクレオチド配列のタグ (９〜10 bp)
は、それが転写産物内の限定された位置から単離される
という条件で、その転写産物を唯一無二に同定するのに
十分な情報量を含むものである。例えば、９ bp 程度に
短い配列は、タグ部位でのランダムヌクレオチド分布を
仮定すれば、262,144 の転写産物（４9）を識別するこ
とができ、一方推定値はヒト・ゲノムが約80,000〜200,
000 の転写産物をコードすることを示唆する(Fieldsら,
Nature Genetics, 7:345, 1994) 。下等な真核生物や
原核生物の場合、例えばゲノムによりコードされる転写
産物の数がより少ない場合は、タグのサイズをもっと短
くすることができる。例えば、酵母では転写産物を識別
するのに６〜７ bp ほどの短いタグで十分である。
ず第一に、短いヌクレオチド配列のタグ (９〜10 bp)
は、それが転写産物内の限定された位置から単離される
という条件で、その転写産物を唯一無二に同定するのに
十分な情報量を含むものである。例えば、９ bp 程度に
短い配列は、タグ部位でのランダムヌクレオチド分布を
仮定すれば、262,144 の転写産物（４9）を識別するこ
とができ、一方推定値はヒト・ゲノムが約80,000〜200,
000 の転写産物をコードすることを示唆する(Fieldsら,
Nature Genetics, 7:345, 1994) 。下等な真核生物や
原核生物の場合、例えばゲノムによりコードされる転写
産物の数がより少ない場合は、タグのサイズをもっと短
くすることができる。例えば、酵母では転写産物を識別
するのに６〜７ bp ほどの短いタグで十分である。
【００１１】第二に、タグのランダム二量体化により偏
り（増幅および／またはクローニングにより引き起こさ
れる）を減らすことができる。第三に、これら短い配列
のタグを鎖状に連結（コンカテマー化）することで、単
一のベクターまたはクローン内の複数のタグの配列決定
を行うことにより逐次的に転写産物を効率よく分析する
ことができる。情報がデータの連続したつながりとして
伝達されるコンピュータによる逐次コミュニケーション
と同様に、配列タグの逐次分析は各タグの記録および境
界を確立するための手段を必要とする。これらの原理は
すべてを独立に使用しても、組み合わせて使用しても、
他の公知の配列同定法と組み合わせて使用してもよい。
り（増幅および／またはクローニングにより引き起こさ
れる）を減らすことができる。第三に、これら短い配列
のタグを鎖状に連結（コンカテマー化）することで、単
一のベクターまたはクローン内の複数のタグの配列決定
を行うことにより逐次的に転写産物を効率よく分析する
ことができる。情報がデータの連続したつながりとして
伝達されるコンピュータによる逐次コミュニケーション
と同様に、配列タグの逐次分析は各タグの記録および境
界を確立するための手段を必要とする。これらの原理は
すべてを独立に使用しても、組み合わせて使用しても、
他の公知の配列同定法と組み合わせて使用してもよい。
【００１２】第一の実施態様において、本発明は、例え
ば特定の発生段階または特定の疾病状態での、特定の細
胞もしくは組織または細胞抽出物における遺伝子発現を
検出する方法を提供する。この方法は、相補的デオキシ
リボ核酸（ｃＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを作製し、第
１ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドから限定されたヌクレオ
チド配列の第１タグを、そして第２ｃＤＮＡオリゴヌク
レオチドから限定されたヌクレオチド配列の第２タグを
単離し、第１タグを第１オリゴヌクレオチドリンカー
（該第１オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマー
のハイブリダイゼーションのための第１配列を含む）に
結合し、第２タグを第２オリゴヌクレオチドリンカー
（該第２オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマー
のハイブリダイゼーションのための第２配列を含む）に
結合し、そして１以上の該タグのヌクレオチド配列を決
定することを含んでなり、ここで該タグは発現された遺
伝子に対応する。
ば特定の発生段階または特定の疾病状態での、特定の細
胞もしくは組織または細胞抽出物における遺伝子発現を
検出する方法を提供する。この方法は、相補的デオキシ
リボ核酸（ｃＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを作製し、第
１ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドから限定されたヌクレオ
チド配列の第１タグを、そして第２ｃＤＮＡオリゴヌク
レオチドから限定されたヌクレオチド配列の第２タグを
単離し、第１タグを第１オリゴヌクレオチドリンカー
（該第１オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマー
のハイブリダイゼーションのための第１配列を含む）に
結合し、第２タグを第２オリゴヌクレオチドリンカー
（該第２オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマー
のハイブリダイゼーションのための第２配列を含む）に
結合し、そして１以上の該タグのヌクレオチド配列を決
定することを含んでなり、ここで該タグは発現された遺
伝子に対応する。
【００１３】図１は、本発明の方法において記載したSA
GEを用いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分析す
ることを示した模式図である。ｍＲＮＡの逆転写による
二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成のために、対象となる
細胞または組織からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの作
製された二本鎖ＤＮＡ相補体を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）という。
GEを用いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分析す
ることを示した模式図である。ｍＲＮＡの逆転写による
二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成のために、対象となる
細胞または組織からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの作
製された二本鎖ＤＮＡ相補体を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）という。
【００１４】本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチ
ド」とは、２以上（好ましくは３以上）のデオキシリボ
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなるプライマ
ーまたはオリゴマー断片のことである。その正確なサイ
ズは多くの要因に左右され、こうした要因もまたオリゴ
ヌクレオチドの最終的な機能または用途次第で変化す
る。
ド」とは、２以上（好ましくは３以上）のデオキシリボ
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなるプライマ
ーまたはオリゴマー断片のことである。その正確なサイ
ズは多くの要因に左右され、こうした要因もまたオリゴ
ヌクレオチドの最終的な機能または用途次第で変化す
る。
【００１５】本方法はさらに、第１オリゴヌクレオチド
リンカーに結合された第１タグを、第２オリゴヌクレオ
チドリンカーに結合された第２タグに結合して、「ジタ
グ」を形成することを含んでなる。それぞれのジタグは
少なくとも１つの遺伝子を代表する少なくとも１つの転
写産物の２つの限定されたヌクレオチド配列に相当す
る。典型的には、ジタグは２つの異なる遺伝子からの２
つの転写産物を表す。ジタグ内の限定されたｃＤＮＡタ
グの存在は、そのタグの配列を有する遺伝子の発現を示
すこととなる。
リンカーに結合された第１タグを、第２オリゴヌクレオ
チドリンカーに結合された第２タグに結合して、「ジタ
グ」を形成することを含んでなる。それぞれのジタグは
少なくとも１つの遺伝子を代表する少なくとも１つの転
写産物の２つの限定されたヌクレオチド配列に相当す
る。典型的には、ジタグは２つの異なる遺伝子からの２
つの転写産物を表す。ジタグ内の限定されたｃＤＮＡタ
グの存在は、そのタグの配列を有する遺伝子の発現を示
すこととなる。
【００１６】増幅工程に先立って形成されたジタグを分
析することにより、増幅（例えば、ＰＣＲ）により導入
される可能性があるひずみ(distortion)を排除すること
ができる。ジタグの形成のためにタグを対合させること
はランダムな事象である。異なるタグの数は多いと予想
されるので、２つのタグが同一のジタグに結合される確
率は豊富な転写産物のときでさえ低い。それゆえ、偏り
のある(biased)標準的な増幅および／またはクローニン
グ法により生成される可能性のある反復ジタグが本発明
の方法による分析からは除外される。
析することにより、増幅（例えば、ＰＣＲ）により導入
される可能性があるひずみ(distortion)を排除すること
ができる。ジタグの形成のためにタグを対合させること
はランダムな事象である。異なるタグの数は多いと予想
されるので、２つのタグが同一のジタグに結合される確
率は豊富な転写産物のときでさえ低い。それゆえ、偏り
のある(biased)標準的な増幅および／またはクローニン
グ法により生成される可能性のある反復ジタグが本発明
の方法による分析からは除外される。
【００１７】「限定された」ヌクレオチド配列または
「限定された」ヌクレオチド配列のタグなる用語は、転
写産物の5'または3'末端から誘導されたヌクレオチド配
列を指す。このヌクレオチド配列は第１制限エンドヌク
レアーゼを用いて切断することにより限定され、どちら
の末端が捕捉のために用いられるかに応じて、第１制限
エンドヌクレアーゼ部位の5'または3'側のヌクレオチド
を表す（例えば、本明細書に記載されるように、捕捉の
ためにオリゴ−ｄＴを用いる場合は3'側のヌクレオチ
ド）。
「限定された」ヌクレオチド配列のタグなる用語は、転
写産物の5'または3'末端から誘導されたヌクレオチド配
列を指す。このヌクレオチド配列は第１制限エンドヌク
レアーゼを用いて切断することにより限定され、どちら
の末端が捕捉のために用いられるかに応じて、第１制限
エンドヌクレアーゼ部位の5'または3'側のヌクレオチド
を表す（例えば、本明細書に記載されるように、捕捉の
ためにオリゴ−ｄＴを用いる場合は3'側のヌクレオチ
ド）。
【００１８】本明細書中で用いる「制限エンドヌクレア
ーゼ」および「制限酵素」なる用語は、認識部位または
認識ヌクレオチド配列と称する特定の二本鎖ＤＮＡ配列
と結合し、その特定の認識部位でまたはその近傍で二本
鎖ＤＮＡを切断する細菌の酵素を意味する。
ーゼ」および「制限酵素」なる用語は、認識部位または
認識ヌクレオチド配列と称する特定の二本鎖ＤＮＡ配列
と結合し、その特定の認識部位でまたはその近傍で二本
鎖ＤＮＡを切断する細菌の酵素を意味する。
【００１９】「アンカリング酵素」または図１では「Ａ
Ｅ」と記される第１エンドヌクレアーゼは、転写産物を
少なくとも１回切断して転写産物の5'または3'末端に由
来する限定された配列のタグを生成する該酵素の能力に
より選択される。好ましくは、少なくとも１つの認識部
位を有し、それゆえ大多数のｃＤＮＡを切断できる制限
エンドヌクレアーゼが利用される。例えば、本明細書に
例示するように、４塩基対の認識部位を有する酵素は平
均して256塩基対（４4）ごとに切断すると予想される
が、大部分の転写産物はそれよりかなり大きい。４塩基
対の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとしては、
本発明の実施例に例示されるようなNlaIIIがある。ＤＮ
Ａ分子（例えば、ｃＤＮＡ）内に少なくとも１つの認識
部位をもつ他の同様なエンドヌクレアーゼは当業者に公
知である（例えば、Current Protocols in Molecular B
iology, Vol. 2, 1995, Ausubelら編, Greene Publish
Assoc. & Wiley Interscience, Unit 3.1.15; New Engl
and Biolabs Catalog, 1995を参照のこと）。
Ｅ」と記される第１エンドヌクレアーゼは、転写産物を
少なくとも１回切断して転写産物の5'または3'末端に由
来する限定された配列のタグを生成する該酵素の能力に
より選択される。好ましくは、少なくとも１つの認識部
位を有し、それゆえ大多数のｃＤＮＡを切断できる制限
エンドヌクレアーゼが利用される。例えば、本明細書に
例示するように、４塩基対の認識部位を有する酵素は平
均して256塩基対（４4）ごとに切断すると予想される
が、大部分の転写産物はそれよりかなり大きい。４塩基
対の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとしては、
本発明の実施例に例示されるようなNlaIIIがある。ＤＮ
Ａ分子（例えば、ｃＤＮＡ）内に少なくとも１つの認識
部位をもつ他の同様なエンドヌクレアーゼは当業者に公
知である（例えば、Current Protocols in Molecular B
iology, Vol. 2, 1995, Ausubelら編, Greene Publish
Assoc. & Wiley Interscience, Unit 3.1.15; New Engl
and Biolabs Catalog, 1995を参照のこと）。
【００２０】アンカリング酵素で切断した後、切断ｃＤ
ＮＡの最も5'または3'側の領域を、捕捉媒体に結合させ
ることで単離することができる。例えば、本実施例に例
示されるように、ｃＤＮＡ合成用のオリゴｄＴプライマ
ーがビオチン化されている場合は、限定された3'ヌクレ
オチド配列タグをストレプトアビジンビーズを使って単
離する。この実施例では、第１酵素すなわちアンカリン
グ酵素で切断すると、ポリＡ尾部の最も近くにある制限
部位に対応する各転写産物上のユニーク部位が得られ
る。同様に、転写産物（そのｃＤＮＡ）の5'キャップ
を、限定された5'ヌクレオチド配列タグを単離するため
の捕捉手段を標識または結合するために利用することが
できる。当業者であれば、ここに記載するような限定さ
れた配列のタグを単離するための他の同様な捕捉系（例
えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン
／抗ジゴキシゲニン）について熟知しているだろう。
ＮＡの最も5'または3'側の領域を、捕捉媒体に結合させ
ることで単離することができる。例えば、本実施例に例
示されるように、ｃＤＮＡ合成用のオリゴｄＴプライマ
ーがビオチン化されている場合は、限定された3'ヌクレ
オチド配列タグをストレプトアビジンビーズを使って単
離する。この実施例では、第１酵素すなわちアンカリン
グ酵素で切断すると、ポリＡ尾部の最も近くにある制限
部位に対応する各転写産物上のユニーク部位が得られ
る。同様に、転写産物（そのｃＤＮＡ）の5'キャップ
を、限定された5'ヌクレオチド配列タグを単離するため
の捕捉手段を標識または結合するために利用することが
できる。当業者であれば、ここに記載するような限定さ
れた配列のタグを単離するための他の同様な捕捉系（例
えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン
／抗ジゴキシゲニン）について熟知しているだろう。
【００２１】本発明は単一の「アンカリング」エンドヌ
クレアーゼすなわち第１制限エンドヌクレアーゼの使用
に制限されない。本発明の方法は、細胞または組織の完
全な転写パターンを同定するために、別個の調製物サン
プルに対して異なる酵素を用いて逐次的に実施すること
が望ましい。さらに、２以上のアンカリング酵素を用い
ると、第１アンカリング酵素から得られた発現パターン
の確認が得られる。それゆえ、豊富な転写産物を表すｃ
ＤＮＡがほとんどまたは全く切断されないように第１ま
たはアンカリングエンドヌクレアーゼはｃＤＮＡをめっ
たに切断しないことが想定される。かくして、切断され
る転写産物は「ユニーク」な転写産物に相当する。例え
ば、７〜８ bp の認識部位をもつ制限酵素はｃＤＮＡを
めったに切断しない酵素であるだろう。同様に、完全な
転写パターンを同定するために、以下に記載する２以上
のタギング酵素を利用することができる。
クレアーゼすなわち第１制限エンドヌクレアーゼの使用
に制限されない。本発明の方法は、細胞または組織の完
全な転写パターンを同定するために、別個の調製物サン
プルに対して異なる酵素を用いて逐次的に実施すること
が望ましい。さらに、２以上のアンカリング酵素を用い
ると、第１アンカリング酵素から得られた発現パターン
の確認が得られる。それゆえ、豊富な転写産物を表すｃ
ＤＮＡがほとんどまたは全く切断されないように第１ま
たはアンカリングエンドヌクレアーゼはｃＤＮＡをめっ
たに切断しないことが想定される。かくして、切断され
る転写産物は「ユニーク」な転写産物に相当する。例え
ば、７〜８ bp の認識部位をもつ制限酵素はｃＤＮＡを
めったに切断しない酵素であるだろう。同様に、完全な
転写パターンを同定するために、以下に記載する２以上
のタギング酵素を利用することができる。
【００２２】本明細書中で用いる「単離された」なる用
語には、ポリヌクレオチドが自然界でもともと結合して
いる他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の
物質を実質的に含まないポリヌクレオチドが含まれる。
ｃＤＮＡはそのままでは自然界に存在していないが、部
分精製された天然に存在するｍＲＮＡを操作することで
得られる。限定された配列のタグを単離するとは、切断
された他のｃＤＮＡから5'または3'タグを精製すること
をいう。
語には、ポリヌクレオチドが自然界でもともと結合して
いる他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の
物質を実質的に含まないポリヌクレオチドが含まれる。
ｃＤＮＡはそのままでは自然界に存在していないが、部
分精製された天然に存在するｍＲＮＡを操作することで
得られる。限定された配列のタグを単離するとは、切断
された他のｃＤＮＡから5'または3'タグを精製すること
をいう。
【００２３】一つの実施態様では、単離された限定ヌク
レオチド配列タグを、リンカーの配列が異なるときは２
つのｃＤＮＡプールに分ける。各プールをアンカリング
すなわち第１制限エンドヌクレアーゼ部位で２つのリン
カーのうちの１つに連結する。リンカーが同じ配列をも
つときは、タグを２つのプールに分ける必要はない。第
１オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーのハイ
ブリダイゼーションのための第１配列を含み、そして第
２オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーのハイ
ブリダイゼーションのための第２配列を含む。さらに、
リンカーは「タギング酵素」または「ＴＥ」と記される
第２制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。本発明
の方法は連結後にジタグオリゴヌクレオチドを増幅する
必要がないが、増幅工程を含むことが好ましい。
レオチド配列タグを、リンカーの配列が異なるときは２
つのｃＤＮＡプールに分ける。各プールをアンカリング
すなわち第１制限エンドヌクレアーゼ部位で２つのリン
カーのうちの１つに連結する。リンカーが同じ配列をも
つときは、タグを２つのプールに分ける必要はない。第
１オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーのハイ
ブリダイゼーションのための第１配列を含み、そして第
２オリゴヌクレオチドリンカーは増幅プライマーのハイ
ブリダイゼーションのための第２配列を含む。さらに、
リンカーは「タギング酵素」または「ＴＥ」と記される
第２制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。本発明
の方法は連結後にジタグオリゴヌクレオチドを増幅する
必要がないが、増幅工程を含むことが好ましい。
【００２４】第２制限エンドヌクレアーゼはその認識部
位から離れた部位でまたは認識部位の外側で切断する。
例えば、第２制限エンドヌクレアーゼはIIS型の制限酵
素でありうる。IIS型制限エンドヌクレアーゼはその非
対称認識部位から最大20 bp離れた一定の距離で切断す
る(Szybalski, W., Gene, 40:169, 1985)。IIS型制限エ
ンドヌクレアーゼの例として、BsmFI およびFokIが挙げ
られる。その他の類似の酵素は当業者に公知である(Cur
rent Protocols in Molecular Biology,前掲を参照のこ
と）。
位から離れた部位でまたは認識部位の外側で切断する。
例えば、第２制限エンドヌクレアーゼはIIS型の制限酵
素でありうる。IIS型制限エンドヌクレアーゼはその非
対称認識部位から最大20 bp離れた一定の距離で切断す
る(Szybalski, W., Gene, 40:169, 1985)。IIS型制限エ
ンドヌクレアーゼの例として、BsmFI およびFokIが挙げ
られる。その他の類似の酵素は当業者に公知である(Cur
rent Protocols in Molecular Biology,前掲を参照のこ
と）。
【００２５】限定されたヌクレオチド配列のタグに連結
される第１および第２「リンカー」は同一のまたは異な
るヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドである。
例えば、本発明の実施例に示したリンカーには次のよう
な異なる配列をもつリンカーが含まれる： 5'-TTTTACCAGCTTATTCAATTCGGTCCTCTCGCACAGGGACATG-3' （配列番号１） 3'-ATGGTCGAATAAGTTAAGCCAGGAGAGCGTGTCCCT-5' （配列番号２） および 5'-TTTTTGTAGACATTCTAGTATCTCGTCAAGTCGGAAGGGACATG-3' （配列番号３） 3'-AACATCTGTAAGATCATAGAGCAGTTCAGCCTTCCCT-5' （配列番号４）、ここでＡはジデオキシヌクレオチド
（例えば、ジデオキシＡ）である。本発明の方法では他
の類似のリンカーを用いてもよく、当業者であれば、そ
のような代わりのリンカーを設計することができよう。
される第１および第２「リンカー」は同一のまたは異な
るヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドである。
例えば、本発明の実施例に示したリンカーには次のよう
な異なる配列をもつリンカーが含まれる： 5'-TTTTACCAGCTTATTCAATTCGGTCCTCTCGCACAGGGACATG-3' （配列番号１） 3'-ATGGTCGAATAAGTTAAGCCAGGAGAGCGTGTCCCT-5' （配列番号２） および 5'-TTTTTGTAGACATTCTAGTATCTCGTCAAGTCGGAAGGGACATG-3' （配列番号３） 3'-AACATCTGTAAGATCATAGAGCAGTTCAGCCTTCCCT-5' （配列番号４）、ここでＡはジデオキシヌクレオチド
（例えば、ジデオキシＡ）である。本発明の方法では他
の類似のリンカーを用いてもよく、当業者であれば、そ
のような代わりのリンカーを設計することができよう。
【００２６】リンカーを設計するには、第２制限酵素す
なわちタギング酵素による連結産物の切断により、限定
されたヌクレオチド配列のタグ（例えば、本明細書に例
示されるような制限エンドヌクレアーゼ切断部位の3'
側）をもつリンカーが放出されるようにする。限定され
たヌクレオチド配列のタグは約６〜30塩基対でありう
る。好ましくは、タグは約９〜11塩基対である。したが
って、ジタグは約12〜60塩基対となり、18〜22塩基対と
することが好ましい。
なわちタギング酵素による連結産物の切断により、限定
されたヌクレオチド配列のタグ（例えば、本明細書に例
示されるような制限エンドヌクレアーゼ切断部位の3'
側）をもつリンカーが放出されるようにする。限定され
たヌクレオチド配列のタグは約６〜30塩基対でありう
る。好ましくは、タグは約９〜11塩基対である。したが
って、ジタグは約12〜60塩基対となり、18〜22塩基対と
することが好ましい。
【００２７】同じ配列をもつリンカーに連結した限定タ
グの１つのプール、または異なるヌクレオチド配列をも
つリンカーに連結した限定ヌクレオチド配列タグの２つ
のプールは互いとランダムに「尾−尾」連結させる。リ
ンカーから最も遠いｃＤＮＡタグの部分を「尾」とい
う。図１に示されるように、連結されたタグ対すなわち
ジタグは、ジタグの上流（5'側）に第１制限エンドヌク
レアーゼ部位および下流（3'側）に第１制限エンドヌク
レアーゼ部位、ジタグの上流と下流に第２制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位、そしてジタグの上流と下流に第２
制限酵素認識部位および増幅プライマーハイブリダイゼ
ーション部位の両方を含むリンカーオリゴヌクレオチド
をもっている。言い換えると、このジタグはそれぞれ第
１制限エンドヌクレアーゼ部位、第２制限酵素認識部位
およびリンカーにより挟まれている。
グの１つのプール、または異なるヌクレオチド配列をも
つリンカーに連結した限定ヌクレオチド配列タグの２つ
のプールは互いとランダムに「尾−尾」連結させる。リ
ンカーから最も遠いｃＤＮＡタグの部分を「尾」とい
う。図１に示されるように、連結されたタグ対すなわち
ジタグは、ジタグの上流（5'側）に第１制限エンドヌク
レアーゼ部位および下流（3'側）に第１制限エンドヌク
レアーゼ部位、ジタグの上流と下流に第２制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位、そしてジタグの上流と下流に第２
制限酵素認識部位および増幅プライマーハイブリダイゼ
ーション部位の両方を含むリンカーオリゴヌクレオチド
をもっている。言い換えると、このジタグはそれぞれ第
１制限エンドヌクレアーゼ部位、第２制限酵素認識部位
およびリンカーにより挟まれている。
【００２８】ジタグは各リンカーの一鎖に特異的にハイ
ブリダイズするプライマーを利用することで増幅するこ
とができる。好ましくは、米国特許第4,683,195 号に記
載されるような標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法により増幅を行う。あるいはまた、原核生物に適
合するベクターへのクローニングまたは当業者に公知の
他の増幅法によりジタグを増幅してもよい。
ブリダイズするプライマーを利用することで増幅するこ
とができる。好ましくは、米国特許第4,683,195 号に記
載されるような標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法により増幅を行う。あるいはまた、原核生物に適
合するベクターへのクローニングまたは当業者に公知の
他の増幅法によりジタグを増幅してもよい。
【００２９】本明細書中で用いる「プライマー」とは、
核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導され
る条件（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラ
ーゼのような重合剤の存在下に適当な温度およびｐＨの
条件）下に置かれたとき、合成の開始点として作用する
ことができる、天然に存在するまたは合成的に製造され
たオリゴヌクレオチドのことである。最大の増幅効率を
あげるためにプライマーは一本鎖で、しかもオリゴデオ
キシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマ
ーは重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるに足
る長さのものでなければならない。プライマーの正確な
長さは温度およびプライマー源を含めた多くの要因によ
り左右されるだろう。
核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導され
る条件（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラ
ーゼのような重合剤の存在下に適当な温度およびｐＨの
条件）下に置かれたとき、合成の開始点として作用する
ことができる、天然に存在するまたは合成的に製造され
たオリゴヌクレオチドのことである。最大の増幅効率を
あげるためにプライマーは一本鎖で、しかもオリゴデオ
キシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマ
ーは重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるに足
る長さのものでなければならない。プライマーの正確な
長さは温度およびプライマー源を含めた多くの要因によ
り左右されるだろう。
【００３０】ここで用いるプライマーは増幅しようとす
る特定配列のそれぞれの鎖に「実質的に」相補的となる
ように選択される。このことは、プライマーがそれぞれ
の鎖とハイブリダイズするのに十分な相補性をもたねば
ならないことを意味する。それゆえ、プライマー配列は
鋳型の正確な配列を反映する必要はない。本発明におい
て、プライマーはオリゴヌクレオチドリンカーに対し実
質的に相補的なものである。
る特定配列のそれぞれの鎖に「実質的に」相補的となる
ように選択される。このことは、プライマーがそれぞれ
の鎖とハイブリダイズするのに十分な相補性をもたねば
ならないことを意味する。それゆえ、プライマー配列は
鋳型の正確な配列を反映する必要はない。本発明におい
て、プライマーはオリゴヌクレオチドリンカーに対し実
質的に相補的なものである。
【００３１】配列番号１〜４で示されるリンカーを増幅
するのに有用なプライマーとしては、5'-CCAGCTTATTCAA
TTCGGTCC-3' （配列番号５）および 5'-GTAGACATTCTAGT
ATCTCGT-3'（配列番号６）が挙げられる。当業者であれ
ば、過度の実験を行わなくとも、リンカーのヌクレオチ
ド配列に基づいて類似の増幅用プライマーを作製するこ
とができよう。
するのに有用なプライマーとしては、5'-CCAGCTTATTCAA
TTCGGTCC-3' （配列番号５）および 5'-GTAGACATTCTAGT
ATCTCGT-3'（配列番号６）が挙げられる。当業者であれ
ば、過度の実験を行わなくとも、リンカーのヌクレオチ
ド配列に基づいて類似の増幅用プライマーを作製するこ
とができよう。
【００３２】第１制限エンドヌクレアーゼで増幅ＰＣＲ
産物を切断することにより、鎖状に連結することでコン
カテマー化しうるジタグを単離することができる。連結
後、コンカテマーをクローニングすることが望ましい場
合があるが、本発明の方法では必要でない。増幅を行お
うと行うまいと、ジタグまたはコンカテマーは標準的な
配列決定法により分析できる。コンカテマーは一般的に
約２〜200のジタグからなり、約８〜20のジタグからな
ることが好ましい。これらは好適なコンカテマーである
が、コンカテマー化され得るジタグの数は個々のタグの
長さに依存し、過度の実験を行わなくとも当業者であれ
ば容易に決定できよう。コンカテマーの形成後、複数の
タグを配列分析のためにベクターにクローニングするこ
とができ、またジタグもしくはコンカテマーをクローニ
ングを行わずに当業者に公知の方法で直接配列決定にか
けてもよい。
産物を切断することにより、鎖状に連結することでコン
カテマー化しうるジタグを単離することができる。連結
後、コンカテマーをクローニングすることが望ましい場
合があるが、本発明の方法では必要でない。増幅を行お
うと行うまいと、ジタグまたはコンカテマーは標準的な
配列決定法により分析できる。コンカテマーは一般的に
約２〜200のジタグからなり、約８〜20のジタグからな
ることが好ましい。これらは好適なコンカテマーである
が、コンカテマー化され得るジタグの数は個々のタグの
長さに依存し、過度の実験を行わなくとも当業者であれ
ば容易に決定できよう。コンカテマーの形成後、複数の
タグを配列分析のためにベクターにクローニングするこ
とができ、またジタグもしくはコンカテマーをクローニ
ングを行わずに当業者に公知の方法で直接配列決定にか
けてもよい。
【００３３】本発明の限定されたヌクレオチド配列のタ
グをクローニングする標準的な方法は、特に、プラスミ
ドやファージのようなベクターにタグを挿入することで
ある。ここに記載の方法により作製されたジタグまたは
ジタグのコンカテマーは、配列分析、タグをプローブと
して用いるプラーク／プラスミドハイブリダイゼーショ
ンといった後続の分析のために組換えベクター中に当業
者に公知の方法でクローニングされる。
グをクローニングする標準的な方法は、特に、プラスミ
ドやファージのようなベクターにタグを挿入することで
ある。ここに記載の方法により作製されたジタグまたは
ジタグのコンカテマーは、配列分析、タグをプローブと
して用いるプラーク／プラスミドハイブリダイゼーショ
ンといった後続の分析のために組換えベクター中に当業
者に公知の方法でクローニングされる。
【００３４】「組換えベクター」なる用語は、ジタグ遺
伝子配列の挿入または組み込みにより操作された当技術
分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を
指す。このようなベクターは例えばマーカー遺伝子配列
の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含有す
る。典型的には、ベクターは複製起点、プロモーター、
および形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺
伝子を含有する。本発明で用いるのに適したベクターと
して、例えば、pBlue Script (Stratagene, LaJolla, C
A)、pBC 、pSL301 (Invitrogen) および当業者に公知の
他の同様なベクターがある。好ましくは、ジタグまたは
そのコンカテマーは配列決定用のベクターに連結され
る。
伝子配列の挿入または組み込みにより操作された当技術
分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を
指す。このようなベクターは例えばマーカー遺伝子配列
の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含有す
る。典型的には、ベクターは複製起点、プロモーター、
および形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺
伝子を含有する。本発明で用いるのに適したベクターと
して、例えば、pBlue Script (Stratagene, LaJolla, C
A)、pBC 、pSL301 (Invitrogen) および当業者に公知の
他の同様なベクターがある。好ましくは、ジタグまたは
そのコンカテマーは配列決定用のベクターに連結され
る。
【００３５】ジタグをクローニングするためのベクター
は適当な宿主細胞に移入できるものである。「宿主細
胞」とは、その細胞内でベクターが増殖できかつそのＤ
ＮＡが発現され得る細胞のことである。この用語は宿主
細胞自体の子孫をも意味する。複製の間に突然変異が起
こることがあるので、すべての子孫が親細胞と同一であ
るとは限らないことが理解されよう。しかしながら、
「宿主細胞」なる用語が用いられるとき、この用語には
この種の子孫も含まれる。安定した移入法（外来ＤＮＡ
が宿主内に連続して維持されることを意味する）は当技
術分野で公知である。
は適当な宿主細胞に移入できるものである。「宿主細
胞」とは、その細胞内でベクターが増殖できかつそのＤ
ＮＡが発現され得る細胞のことである。この用語は宿主
細胞自体の子孫をも意味する。複製の間に突然変異が起
こることがあるので、すべての子孫が親細胞と同一であ
るとは限らないことが理解されよう。しかしながら、
「宿主細胞」なる用語が用いられるとき、この用語には
この種の子孫も含まれる。安定した移入法（外来ＤＮＡ
が宿主内に連続して維持されることを意味する）は当技
術分野で公知である。
【００３６】ジタグを含有するベクターによる宿主細胞
の形質転換は、当業者には周知であるような、慣用の技
法により行うことができる。宿主が大腸菌のような原核
細胞である場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて当技
術分野で公知の手法によるCaCl２法で処理した細胞か
ら、ＤＮＡ取込み能のあるコンピテント細胞を調製す
る。これとは別に、MgCl２またはRbClを使用してもよ
い。また、エレクトロポレーションや当技術分野で常用
される他の方法により形質転換を行うこともできる。
の形質転換は、当業者には周知であるような、慣用の技
法により行うことができる。宿主が大腸菌のような原核
細胞である場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて当技
術分野で公知の手法によるCaCl２法で処理した細胞か
ら、ＤＮＡ取込み能のあるコンピテント細胞を調製す
る。これとは別に、MgCl２またはRbClを使用してもよ
い。また、エレクトロポレーションや当技術分野で常用
される他の方法により形質転換を行うこともできる。
【００３７】個々のクローン内に存在するジタグは、手
動でまたは自動化法を使って、標準的な方法（例えば、
Current Protocols in Molecular Biology, 前掲, Unit
7）により配列決定することができる。
動でまたは自動化法を使って、標準的な方法（例えば、
Current Protocols in Molecular Biology, 前掲, Unit
7）により配列決定することができる。
【００３８】もう一つの実施態様において、本発明は、
限定されたヌクレオチドタグまたはジタグの存在が該タ
グの配列を有する遺伝子の発現を示すことからなる、遺
伝子発現を検出するためのキットを提供し、このキット
は、増幅プライマーをハイブリダイズさせるための第１
配列をもつ第１オリゴヌクレオチドリンカーを含有する
第１容器、増幅プライマーをハイブリダイズさせるため
の第２配列をもつ第２オリゴヌクレオチドリンカーを含
有する第２容器（これらのリンカーは制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断するため
の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む）、お
よび該リンカーのユニークな第１および第２配列にハイ
ブリダイズさせるための核酸プライマーを含有する第３
および第４容器を含んでなる１以上の容器から構成され
る。オリゴヌクレオチドリンカーが同じヌクレオチド配
列をもつのであれば、本発明のキットではリンカーを含
有する容器が１つだけ必要となる。
限定されたヌクレオチドタグまたはジタグの存在が該タ
グの配列を有する遺伝子の発現を示すことからなる、遺
伝子発現を検出するためのキットを提供し、このキット
は、増幅プライマーをハイブリダイズさせるための第１
配列をもつ第１オリゴヌクレオチドリンカーを含有する
第１容器、増幅プライマーをハイブリダイズさせるため
の第２配列をもつ第２オリゴヌクレオチドリンカーを含
有する第２容器（これらのリンカーは制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断するため
の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む）、お
よび該リンカーのユニークな第１および第２配列にハイ
ブリダイズさせるための核酸プライマーを含有する第３
および第４容器を含んでなる１以上の容器から構成され
る。オリゴヌクレオチドリンカーが同じヌクレオチド配
列をもつのであれば、本発明のキットではリンカーを含
有する容器が１つだけ必要となる。
【００３９】さらに別の実施態様において、本発明は、
少なくとも２つの限定されたヌクレオチド配列のタグを
有するオリゴヌクレオチド組成物であって、前記タグの
少なくとも１つが少なくとも１つの発現された遺伝子に
対応している前記組成物を提供する。この組成物は約１
〜200のジタグ、好ましくは約８〜20のジタグからな
る。このような組成物は、例えば細胞、組織または細胞
抽出物中の発現遺伝子に対応する限定されたヌクレオチ
ド配列のタグを同定することにより遺伝子発現を分析す
るのに有用である。
少なくとも２つの限定されたヌクレオチド配列のタグを
有するオリゴヌクレオチド組成物であって、前記タグの
少なくとも１つが少なくとも１つの発現された遺伝子に
対応している前記組成物を提供する。この組成物は約１
〜200のジタグ、好ましくは約８〜20のジタグからな
る。このような組成物は、例えば細胞、組織または細胞
抽出物中の発現遺伝子に対応する限定されたヌクレオチ
ド配列のタグを同定することにより遺伝子発現を分析す
るのに有用である。
【００４０】本発明のSAGE法を用いて示差的に発現され
た遺伝子を同定するにあたって、他のゲノム法と組み合
わせて使用することが考えられる。例えば、個々のタグ
（好ましくはジタグ）を固相支持体（例えば、ニトロセ
ルロースフィルター、ガラススライド、シリコンチッ
プ）上に固定したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
させることができる。こうした技法として、以下に記載
するような「平行配列分析」(parallel sequence analy
sis)すなわちＰＳＡがある。本発明の方法により形成さ
れたジタグの配列はまた、クローン配列決定（ＣＳ）を
含めた方法により限界希釈を用いて決定することもでき
る。
た遺伝子を同定するにあたって、他のゲノム法と組み合
わせて使用することが考えられる。例えば、個々のタグ
（好ましくはジタグ）を固相支持体（例えば、ニトロセ
ルロースフィルター、ガラススライド、シリコンチッ
プ）上に固定したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
させることができる。こうした技法として、以下に記載
するような「平行配列分析」(parallel sequence analy
sis)すなわちＰＳＡがある。本発明の方法により形成さ
れたジタグの配列はまた、クローン配列決定（ＣＳ）を
含めた方法により限界希釈を用いて決定することもでき
る。
【００４１】簡単に述べると、ＰＳＡはジタグの作製後
に行われるが、その際ジタグがハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチド配列は標識せずに、ジタグを検出可能に
標識することが好ましい。あるいはまた、ジタグではな
くオリゴヌクレオチドを標識してもよい。例えば、ラジ
オアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発
光化合物、金属キレート剤、または酵素によりジタグを
検出可能に標識することができる。当業者であれば、ジ
タグに結合させるのに適した他の標識について熟知して
おり、ルーチンな実験操作を用いてそれを確かめること
ができよう。例えば、標識した（例えば、フルオレセイ
ンで標識した）プライマーを用いてＰＣＲを行ってもよ
い。ジタグは蛍光末端標識をもつことが好ましい。
に行われるが、その際ジタグがハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチド配列は標識せずに、ジタグを検出可能に
標識することが好ましい。あるいはまた、ジタグではな
くオリゴヌクレオチドを標識してもよい。例えば、ラジ
オアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発
光化合物、金属キレート剤、または酵素によりジタグを
検出可能に標識することができる。当業者であれば、ジ
タグに結合させるのに適した他の標識について熟知して
おり、ルーチンな実験操作を用いてそれを確かめること
ができよう。例えば、標識した（例えば、フルオレセイ
ンで標識した）プライマーを用いてＰＣＲを行ってもよ
い。ジタグは蛍光末端標識をもつことが好ましい。
【００４２】標識したまたは未標識のジタグを一本鎖分
子に分離し、それを好ましくは段階的に希釈し、そし
て、例えば10-merのあらゆる可能な順列を表すオリゴヌ
クレオチドを（例えば、シリコンチップの各グリッド中
に）含有する固相支持体（例えば、Fodorら, Science,
251:767, 1991に記載されるシリコンチップ）に添加す
る。次に、固相支持体上のオリゴヌクレオチドを、異な
る状態にある細胞（例えば、異なる発生段階、増殖因子
の不在下および存在下での細胞の増殖、正常細胞対形質
転換細胞、さまざまな組織発現の比較など）から得られ
たタグとハイブリダイズさせることにより、該支持体内
（例えば、チップのグリッド上）に含まれるタグの示差
的発現を決定する。フルオレセインで末端標識したタグ
の場合は、蛍光の分析が特定の10-merへのハイブリダイ
ゼーションを示す。例えば、固定したオリゴヌクレオチ
ドがフルオレセインで標識されている場合は、（標識オ
リゴにハイブリダイズしたジタグの接近による）消光ゆ
えの蛍光の減少が観察され、遺伝子発現のパターンに関
して分析される。この方法の代表例を本明細書中の実施
例４に示す。
子に分離し、それを好ましくは段階的に希釈し、そし
て、例えば10-merのあらゆる可能な順列を表すオリゴヌ
クレオチドを（例えば、シリコンチップの各グリッド中
に）含有する固相支持体（例えば、Fodorら, Science,
251:767, 1991に記載されるシリコンチップ）に添加す
る。次に、固相支持体上のオリゴヌクレオチドを、異な
る状態にある細胞（例えば、異なる発生段階、増殖因子
の不在下および存在下での細胞の増殖、正常細胞対形質
転換細胞、さまざまな組織発現の比較など）から得られ
たタグとハイブリダイズさせることにより、該支持体内
（例えば、チップのグリッド上）に含まれるタグの示差
的発現を決定する。フルオレセインで末端標識したタグ
の場合は、蛍光の分析が特定の10-merへのハイブリダイ
ゼーションを示す。例えば、固定したオリゴヌクレオチ
ドがフルオレセインで標識されている場合は、（標識オ
リゴにハイブリダイズしたジタグの接近による）消光ゆ
えの蛍光の減少が観察され、遺伝子発現のパターンに関
して分析される。この方法の代表例を本明細書中の実施
例４に示す。
【００４３】本発明のSAGE法は、細胞系のクローニング
に用いられる限界希釈法と類似したクローン配列決定に
も有用である。例えば、ジタグまたはそのコンカテマー
を希釈して、各受け器が１未満のＤＮＡ分子を含むよう
に各受け器に入れる。各受け器中のＤＮＡを増幅し、マ
ススペクトロスコピーを含めた当技術分野で公知の標準
方法により配列決定する。示差的発現の評価はSAGEに関
して上述したように行う。
に用いられる限界希釈法と類似したクローン配列決定に
も有用である。例えば、ジタグまたはそのコンカテマー
を希釈して、各受け器が１未満のＤＮＡ分子を含むよう
に各受け器に入れる。各受け器中のＤＮＡを増幅し、マ
ススペクトロスコピーを含めた当技術分野で公知の標準
方法により配列決定する。示差的発現の評価はSAGEに関
して上述したように行う。
【００４４】当業者であれば、過度の実験によらなくと
も、本発明において記載したSAGEにより得られたジタグ
または個々のタグを分析するための他の方法を簡単に決
定できるだろう。
も、本発明において記載したSAGEにより得られたジタグ
または個々のタグを分析するための他の方法を簡単に決
定できるだろう。
【００４５】本発明にしたがってある配列から限定され
たタグを導き出す概念は、配列データベースにサンプル
のタグを一致させるのに有用である。好適な実施態様で
は、サンプル配列と既知配列とを一致させるためにコン
ピュータ法が用いられる。
たタグを導き出す概念は、配列データベースにサンプル
のタグを一致させるのに有用である。好適な実施態様で
は、サンプル配列と既知配列とを一致させるためにコン
ピュータ法が用いられる。
【００４６】一つの実施態様では、サンプルの配列タグ
を、配列データベース中の対応する情報と比較して、サ
ンプル配列と一致する既知配列を同定する。配列データ
ベース中の各配列につき１以上のタグを該配列内の各ア
ンカリング酵素部位に隣接するＮ個の塩基対として決定
することができる。しかし、好適な実施態様では、3'末
端から最初のアンカリング酵素部位のみを用いてタグを
決定する。好ましくは、タグを限定する隣接塩基対はア
ンカリング酵素部位の3'側にあり、かつＮは９である。
を、配列データベース中の対応する情報と比較して、サ
ンプル配列と一致する既知配列を同定する。配列データ
ベース中の各配列につき１以上のタグを該配列内の各ア
ンカリング酵素部位に隣接するＮ個の塩基対として決定
することができる。しかし、好適な実施態様では、3'末
端から最初のアンカリング酵素部位のみを用いてタグを
決定する。好ましくは、タグを限定する隣接塩基対はア
ンカリング酵素部位の3'側にあり、かつＮは９である。
【００４７】このようなデータベースに対しての線形検
索(linear search) を用いることができる。しかし、好
適な実施態様では、Ｎ塩基タグの各塩基対（Ａ、Ｃ、Ｇ
またはＴ）を数字または「タグコード」（例えば、Ａ＝
０、Ｃ＝１、Ｇ＝２、Ｔ＝３、または他の適当な符号）
に変換することで、サンプルからの配列タグをユニーク
な数値表示に変える。上記のような配列データベースの
各配列につき１つのタグを決定し、そのタグを同様な方
法でタグコードに変換する。好適な実施態様では、配列
データベースのタグコードのセットをポインターファイ
ル(pointer file)に保存する。サンプル配列のタグコー
ドをポインターファイル中のタグコードと比較して、サ
ンプルタグコードに対応する配列の配列データベース中
の位置を決定する。（配列データベースが冗長性(redun
dancy)をもつ場合は複数の対応配列が存在しうる。）
索(linear search) を用いることができる。しかし、好
適な実施態様では、Ｎ塩基タグの各塩基対（Ａ、Ｃ、Ｇ
またはＴ）を数字または「タグコード」（例えば、Ａ＝
０、Ｃ＝１、Ｇ＝２、Ｔ＝３、または他の適当な符号）
に変換することで、サンプルからの配列タグをユニーク
な数値表示に変える。上記のような配列データベースの
各配列につき１つのタグを決定し、そのタグを同様な方
法でタグコードに変換する。好適な実施態様では、配列
データベースのタグコードのセットをポインターファイ
ル(pointer file)に保存する。サンプル配列のタグコー
ドをポインターファイル中のタグコードと比較して、サ
ンプルタグコードに対応する配列の配列データベース中
の位置を決定する。（配列データベースが冗長性(redun
dancy)をもつ場合は複数の対応配列が存在しうる。）
【００４８】図４は、本発明によるタグコード・データ
ベース・アクセスシステムの構成図である。配列データ
ベース10（例えば、ヒト・ゲノム配列データベース）を
上記のように処理して、各配列が決定されてポインター
ファイル12に保存されたタグコードをもつようにする。
サンプルのタグコードＸを上記のように決定し、コンピ
ュータの記憶位置14に保存する。一致する配列タグコー
ドに関してサンプルのタグコードＸとポインターファイ
ル12とを比較する。一致が見つかれば、その一致する配
列タグコードと関連したポインターを用いて、配列デー
タベース10中の対応配列にアクセスする。
ベース・アクセスシステムの構成図である。配列データ
ベース10（例えば、ヒト・ゲノム配列データベース）を
上記のように処理して、各配列が決定されてポインター
ファイル12に保存されたタグコードをもつようにする。
サンプルのタグコードＸを上記のように決定し、コンピ
ュータの記憶位置14に保存する。一致する配列タグコー
ドに関してサンプルのタグコードＸとポインターファイ
ル12とを比較する。一致が見つかれば、その一致する配
列タグコードと関連したポインターを用いて、配列デー
タベース10中の対応配列にアクセスする。
【００４９】ポインターファイル12はいくつかのフォー
マットのいずれであってもよい。一つのフォーマットで
は、ポインターファイル12の各エントリーがタグコード
と、配列データベース10中の対応する記録に対するポイ
ンターを含む。サンプルのタグコードＸは配列タグコー
ドと線形検索で比較することができる。あるいはまた、
配列タグコードを分類して、バイナリー検索(binary se
arch) を用いてもよい。もう一つの代替フォーマットと
して、分類体系的な樹木構造（例えば、Ｂ樹木）に、ま
たは単一にもしくは二重にリンクされたリストとして、
あるいは他の簡便に検索できるデータ構造もしくはフォ
ーマットで、配列タグコードを構造化することもでき
る。
マットのいずれであってもよい。一つのフォーマットで
は、ポインターファイル12の各エントリーがタグコード
と、配列データベース10中の対応する記録に対するポイ
ンターを含む。サンプルのタグコードＸは配列タグコー
ドと線形検索で比較することができる。あるいはまた、
配列タグコードを分類して、バイナリー検索(binary se
arch) を用いてもよい。もう一つの代替フォーマットと
して、分類体系的な樹木構造（例えば、Ｂ樹木）に、ま
たは単一にもしくは二重にリンクされたリストとして、
あるいは他の簡便に検索できるデータ構造もしくはフォ
ーマットで、配列タグコードを構造化することもでき
る。
【００５０】好ましい実施態様において、ポインターフ
ァイル12の各エントリーは配列データベース10中の対応
する記録に対するポインターだけを含む。ポインターフ
ァイル12を構築するにあたって、タグコードの数値に対
応するポインターファイル12中のエントリー位置に各配
列タグコードを割り当てる。例えば、配列タグコードが
「1043」であったとすると、配列データベース10中の対
応する記録に対するポインターはポインターファイル12
のエントリー＃1043に保存されるだろう。サンプルのタ
グコードＸの数値を用いて、サンプルタグコードＸに対
応するポインターファイル12中の該位置を直接アドレス
指定し、ひいては配列データベース10をアドレス指定す
るために該位置に保存されたポインターに迅速にアクセ
スすることができる。
ァイル12の各エントリーは配列データベース10中の対応
する記録に対するポインターだけを含む。ポインターフ
ァイル12を構築するにあたって、タグコードの数値に対
応するポインターファイル12中のエントリー位置に各配
列タグコードを割り当てる。例えば、配列タグコードが
「1043」であったとすると、配列データベース10中の対
応する記録に対するポインターはポインターファイル12
のエントリー＃1043に保存されるだろう。サンプルのタ
グコードＸの数値を用いて、サンプルタグコードＸに対
応するポインターファイル12中の該位置を直接アドレス
指定し、ひいては配列データベース10をアドレス指定す
るために該位置に保存されたポインターに迅速にアクセ
スすることができる。
【００５１】すべての可能な塩基対を表すのにたった４
つの数値しか必要でないので、好適なポインターファイ
ル12構造体と共にタグコードのバイナリー・コーディド
・デシマル(binary coded decimal: BCD) 数を用いるこ
とは、記憶または蓄積スペースをむだにする「希薄」な
ポインターファイル12をもたらす。したがって、本発明
は公知の様式で各タグコードを基数４（すなわち、コー
ドディジットにつき２ビット）に変換して、結果的にコ
ンパクトなポインターファイル12構造体が得られる。例
えば、タグ配列「ＡＧＣＴ」（ただし、Ａ＝002 、Ｃ＝
012 、Ｇ＝102、Ｔ＝112 ）に関して、バイナリーでの
基数４表示は「00011011」となるだろう。これに対し
て、ＢＣＤ表示は「00000000 0000001 00000010 000000
11」となるだろう。もちろん、塩基対の他の符号化も同
様の機能を与えることを理解すべきである。
つの数値しか必要でないので、好適なポインターファイ
ル12構造体と共にタグコードのバイナリー・コーディド
・デシマル(binary coded decimal: BCD) 数を用いるこ
とは、記憶または蓄積スペースをむだにする「希薄」な
ポインターファイル12をもたらす。したがって、本発明
は公知の様式で各タグコードを基数４（すなわち、コー
ドディジットにつき２ビット）に変換して、結果的にコ
ンパクトなポインターファイル12構造体が得られる。例
えば、タグ配列「ＡＧＣＴ」（ただし、Ａ＝002 、Ｃ＝
012 、Ｇ＝102、Ｔ＝112 ）に関して、バイナリーでの
基数４表示は「00011011」となるだろう。これに対し
て、ＢＣＤ表示は「00000000 0000001 00000010 000000
11」となるだろう。もちろん、塩基対の他の符号化も同
様の機能を与えることを理解すべきである。
【００５２】本発明にしたがってサンプル配列から限定
されたタグを導き出す概念は、さまざまなサンプルを類
似性に関して比較するにも有用である。好ましい実施態
様では、異なるサンプルからの配列タグを一致させるた
めにコンピュータ法を用いる。例えば、多数の配列を含
む材料（例えば、組織）を比較するにあたって、第１サ
ンプル中の種々のタグの存在頻度を、分布またはヒスト
グラム型のデータ構造中に保存されたタグコードとして
しるすことができる。例えば、図４のポインターファイ
ル12と同様に構造化された表を使用でき、この表では各
エントリーが存在頻度の値を含む。その後、第２サンプ
ル中の種々のタグを作製し、タグコードに変換し、その
タグコードにより表エントリーを直接アドレス指定する
ことで表と比較することができる。出力装置にテキスト
またはグラフの形で情報を出力するために、および／ま
たは、あとで使用するべくデータ保存システムに保存す
るために、一致した数のみならず一致した位置を計測し
ていく。
されたタグを導き出す概念は、さまざまなサンプルを類
似性に関して比較するにも有用である。好ましい実施態
様では、異なるサンプルからの配列タグを一致させるた
めにコンピュータ法を用いる。例えば、多数の配列を含
む材料（例えば、組織）を比較するにあたって、第１サ
ンプル中の種々のタグの存在頻度を、分布またはヒスト
グラム型のデータ構造中に保存されたタグコードとして
しるすことができる。例えば、図４のポインターファイ
ル12と同様に構造化された表を使用でき、この表では各
エントリーが存在頻度の値を含む。その後、第２サンプ
ル中の種々のタグを作製し、タグコードに変換し、その
タグコードにより表エントリーを直接アドレス指定する
ことで表と比較することができる。出力装置にテキスト
またはグラフの形で情報を出力するために、および／ま
たは、あとで使用するべくデータ保存システムに保存す
るために、一致した数のみならず一致した位置を計測し
ていく。
【００５３】本発明のタグ比較の面はハードウェアもし
くはソフトウェア、または両者の組合せで実行すること
ができる。好ましくは、本発明のこれらの面は、プロセ
ッサ、データ保存システム（揮発性および非揮発性の記
憶および／または蓄積素子を含む）、少なくとも１つの
入力装置、および少なくとも１つの出力装置から構成さ
れるプログラム可能なコンピュータで作成するコンピュ
ータプログラムにより実行される。データ保存システム
への一時的または永久的な保存のための１以上の入力装
置からのデータ入力は配列を含み、また既知および／ま
たは未知配列の以前に作製されたタグおよびタグコード
を含みうる。入力データにプログラムコードを当てはめ
て、上記の機能を遂行しかつ出力情報を引き出す。この
出力情報を公知の様式で１以上の出力装置に適用する。
くはソフトウェア、または両者の組合せで実行すること
ができる。好ましくは、本発明のこれらの面は、プロセ
ッサ、データ保存システム（揮発性および非揮発性の記
憶および／または蓄積素子を含む）、少なくとも１つの
入力装置、および少なくとも１つの出力装置から構成さ
れるプログラム可能なコンピュータで作成するコンピュ
ータプログラムにより実行される。データ保存システム
への一時的または永久的な保存のための１以上の入力装
置からのデータ入力は配列を含み、また既知および／ま
たは未知配列の以前に作製されたタグおよびタグコード
を含みうる。入力データにプログラムコードを当てはめ
て、上記の機能を遂行しかつ出力情報を引き出す。この
出力情報を公知の様式で１以上の出力装置に適用する。
【００５４】このようなコンピュータプログラムはそれ
ぞれを、蓄積媒体または装置をコンピュータで読み取っ
てここに記載の手順を実行するときそのコンピュータを
コンフィギュア(configuring)して操作するために、一
般用または専門用のプログラム可能なコンピュータで読
み取り可能な蓄積媒体または装置（例えば、ＲＯＭまた
はフロッピー（登録商標）ディスク）に保存することが
好ましい。本発明のシステムはまた、コンピュータプロ
グラムを伴った、コンピュータで読み取り可能な蓄積媒
体として実施することも考えられ、その場合は、このよ
うな蓄積媒体により、上記の機能を果たすように予め決
められた特別なやり方でコンピュータを操作する。
ぞれを、蓄積媒体または装置をコンピュータで読み取っ
てここに記載の手順を実行するときそのコンピュータを
コンフィギュア(configuring)して操作するために、一
般用または専門用のプログラム可能なコンピュータで読
み取り可能な蓄積媒体または装置（例えば、ＲＯＭまた
はフロッピー（登録商標）ディスク）に保存することが
好ましい。本発明のシステムはまた、コンピュータプロ
グラムを伴った、コンピュータで読み取り可能な蓄積媒
体として実施することも考えられ、その場合は、このよ
うな蓄積媒体により、上記の機能を果たすように予め決
められた特別なやり方でコンピュータを操作する。
【００５５】以下の実施例は本発明を例示するもので限
定するものではない。それらは用いることのできる手順
を代表するが、当業者に公知の他の手順も代わりに使用
できるだろう。
定するものではない。それらは用いることのできる手順
を代表するが、当業者に公知の他の手順も代わりに使用
できるだろう。
【００５６】
【実施例】例示目的のために、本発明のSAGE法を用いて
ヒト膵臓における遺伝子発現を特性づけた。第１制限エ
ンドヌクレアーゼすなわちアンカリング酵素としてNlaI
IIを、第２制限エンドヌクレアーゼすなわちタギング酵
素としてBsmFIを使用して９ bp のタグを得た。BsmFI
は認識部位 GGGACの14 bp 3'側の相補鎖を切断し、４ b
p の5'突出部分を生成させると予測された(New England
BioLabs)。示した(GGGACATG) ようにBsmFI部位とNlaII
I (CATG) 部位を重ね合わせると11 bp のタグが得られ
ると予測される。しかし、用いた切断条件 (37℃) 下
で、BsmFIはしばしばその認識部位のより近くで切断し
て、その認識部位の3'側の最小 12 bpを残すことが分析
から示唆された。それゆえ、タグの分析のためにアンカ
リング酵素部位に最も近い９ bp だけを使用した。65℃
で切断すると、より一貫して11 bp のタグが得られる。
ヒト膵臓における遺伝子発現を特性づけた。第１制限エ
ンドヌクレアーゼすなわちアンカリング酵素としてNlaI
IIを、第２制限エンドヌクレアーゼすなわちタギング酵
素としてBsmFIを使用して９ bp のタグを得た。BsmFI
は認識部位 GGGACの14 bp 3'側の相補鎖を切断し、４ b
p の5'突出部分を生成させると予測された(New England
BioLabs)。示した(GGGACATG) ようにBsmFI部位とNlaII
I (CATG) 部位を重ね合わせると11 bp のタグが得られ
ると予測される。しかし、用いた切断条件 (37℃) 下
で、BsmFIはしばしばその認識部位のより近くで切断し
て、その認識部位の3'側の最小 12 bpを残すことが分析
から示唆された。それゆえ、タグの分析のためにアンカ
リング酵素部位に最も近い９ bp だけを使用した。65℃
で切断すると、より一貫して11 bp のタグが得られる。
【００５７】Gen Bankから得られたヒト転写産物のコン
ピュータ分析は、９ bp の長さのタグの95％以上がユニ
ークであるらしく、追加の２個の塩基を含めても更なる
分解能がほとんど得られないことがわかった。IntelliG
enetics Bionetオンラインサービスで提供されたFindse
qプログラムを使って、GenBank 87データベースからヒ
ト配列(84,300)を抽出した。以後の分析はすべてMicros
oft Windows 操作システム用のMicrosoft Visual Basic
に書かれたSAGEプログラムグループを用いて行った。SA
GEデータベース分析プログラムは位置記載(locus descr
iption) 中に「ＲＮＡ」として示した配列のみを含め、
「ＥＳＴ」として示したエントリーを除くようにセット
し、その結果13,241の配列に減少した。アンカリング酵
素としてNlaIIIを用いてこのサブセットの配列を分析し
たところ、4,127 の９ bp タグがユニークである一方
で、1,511 のタグは１より多いエントリーで見いだせる
ことがわかった。後者のエントリーの無作為選択したサ
ブセット(100) のヌクレオチド比較から、少なくとも83
％が同一の遺伝子または高度に関連した遺伝子（少なく
とも250 bpにわたって＞95％の同一性）の冗長データベ
ースのエントリーによることが示された。これにより、
９ bp タグのうち 5381 (95.5%) が転写産物または高度
に保存された転写産物ファミリーに対しユニークである
と示唆された。同様に、11 bp タグによるGenBankの同
じサブセットの分析は、反復タグが関連のない転写産物
によるとするときに予測される94％の減少の代わりに、
反復タグの６％減少(1511 から1425へ減少) をもたらし
たにすぎなかった。
ピュータ分析は、９ bp の長さのタグの95％以上がユニ
ークであるらしく、追加の２個の塩基を含めても更なる
分解能がほとんど得られないことがわかった。IntelliG
enetics Bionetオンラインサービスで提供されたFindse
qプログラムを使って、GenBank 87データベースからヒ
ト配列(84,300)を抽出した。以後の分析はすべてMicros
oft Windows 操作システム用のMicrosoft Visual Basic
に書かれたSAGEプログラムグループを用いて行った。SA
GEデータベース分析プログラムは位置記載(locus descr
iption) 中に「ＲＮＡ」として示した配列のみを含め、
「ＥＳＴ」として示したエントリーを除くようにセット
し、その結果13,241の配列に減少した。アンカリング酵
素としてNlaIIIを用いてこのサブセットの配列を分析し
たところ、4,127 の９ bp タグがユニークである一方
で、1,511 のタグは１より多いエントリーで見いだせる
ことがわかった。後者のエントリーの無作為選択したサ
ブセット(100) のヌクレオチド比較から、少なくとも83
％が同一の遺伝子または高度に関連した遺伝子（少なく
とも250 bpにわたって＞95％の同一性）の冗長データベ
ースのエントリーによることが示された。これにより、
９ bp タグのうち 5381 (95.5%) が転写産物または高度
に保存された転写産物ファミリーに対しユニークである
と示唆された。同様に、11 bp タグによるGenBankの同
じサブセットの分析は、反復タグが関連のない転写産物
によるとするときに予測される94％の減少の代わりに、
反復タグの６％減少(1511 から1425へ減少) をもたらし
たにすぎなかった。
【００５８】実施例１ 上記で概説したように、ヒト膵臓由来のｍＲＮＡを用い
てジタグを作製した。簡単に説明すると、５μgの全膵
臓由来のｍＲＮＡ(Clontech)を、BRL ｃＤＮＡ合成キッ
トを用いて、製造業者のプロトコールに従い、プライマ
ーとしてビオチン-５′Ｔ18-３′を用いて二本鎖ｃＤＮ
Ａに変換した。次に、このｃＤＮＡをNlaIIIで切断し、
磁気ストレプトアビジン・ビーズ（Dynal）に結合する
ことにより３′制限断片を単離した。結合したＤＮＡを
２つのプールに分け、以下のリンカーの中の１つを各プ
ールに連結した： 5'-TTTTACCAGCTTATTCAATTCGGTCCTCTCGCACAGGGACATG-3' 3'-ATGGTCGAATAAGTTAAGCCAGGAGAGCGTGTCCCT-5' （配列番号１および２） 5'-TTTTTGTAGACATTCTAGTATCTCGTCAAGTCGGAAGGGACATG-3' 3'-AACATCTGTAAGATCATAGAGCAGTTCAGCCTTCCCT-5' （配列番号３および４） （ここで、Ａはジデオキシヌクレオチド（例えば、ジデ
オキシＡ）である。）
てジタグを作製した。簡単に説明すると、５μgの全膵
臓由来のｍＲＮＡ(Clontech)を、BRL ｃＤＮＡ合成キッ
トを用いて、製造業者のプロトコールに従い、プライマ
ーとしてビオチン-５′Ｔ18-３′を用いて二本鎖ｃＤＮ
Ａに変換した。次に、このｃＤＮＡをNlaIIIで切断し、
磁気ストレプトアビジン・ビーズ（Dynal）に結合する
ことにより３′制限断片を単離した。結合したＤＮＡを
２つのプールに分け、以下のリンカーの中の１つを各プ
ールに連結した： 5'-TTTTACCAGCTTATTCAATTCGGTCCTCTCGCACAGGGACATG-3' 3'-ATGGTCGAATAAGTTAAGCCAGGAGAGCGTGTCCCT-5' （配列番号１および２） 5'-TTTTTGTAGACATTCTAGTATCTCGTCAAGTCGGAAGGGACATG-3' 3'-AACATCTGTAAGATCATAGAGCAGTTCAGCCTTCCCT-5' （配列番号３および４） （ここで、Ａはジデオキシヌクレオチド（例えば、ジデ
オキシＡ）である。）
【００５９】丹念に洗浄して未連結のリンカーを除去し
た後、BsmFIで切断することによってこれらのリンカー
および隣接するタグを遊離させた。生成した突出部分を
T4ポリメラーゼでフィルインし、これらのプールを合わ
せて互いに連結した。次に、目的の連結産物を、プライ
マーとして5'-CCAGCTTATTCAATTCGGTCC-3'および5'-GTAG
ACATTCTAGTATCTCGT-3'（それぞれ配列番号５および６）
を用いて25サイクルにわたって増幅した。次に、このＰ
ＣＲ反応をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、
目的の産物を切り出した。次に、さらに15サイクルのＰ
ＣＲを行い、効率的な連結およびクローニングに十分な
量の産物を得た。
た後、BsmFIで切断することによってこれらのリンカー
および隣接するタグを遊離させた。生成した突出部分を
T4ポリメラーゼでフィルインし、これらのプールを合わ
せて互いに連結した。次に、目的の連結産物を、プライ
マーとして5'-CCAGCTTATTCAATTCGGTCC-3'および5'-GTAG
ACATTCTAGTATCTCGT-3'（それぞれ配列番号５および６）
を用いて25サイクルにわたって増幅した。次に、このＰ
ＣＲ反応をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、
目的の産物を切り出した。次に、さらに15サイクルのＰ
ＣＲを行い、効率的な連結およびクローニングに十分な
量の産物を得た。
【００６０】ＰＣＲジタグ産物をNlaIIIで切断し、これ
らジタグを含有するバンドを切り出し、自己連結させ
た。連結後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
コンカテマー形成ジタグを分離し、200bpより大きな産
物を切り出した。これらの産物をpSL301(Invitrogen)の
SphI部位にクローニングした。クローニング部位の外側
のT7およびT3配列をプライマーとして用いるＰＣＲによ
り、コロニーをインサートについてスクリーニングし
た。少なくとも10（10〜50の範囲）のタグを含有するク
ローンを、記載（Del Salら、Biotechniques 7:514、19
89）のようにして、5'-GACGTCGACCTGAGGTAATTATAACC-3'
（配列番号７）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅
によって同定し、手操作により配列決定した。ＳＡＧＥ
ソフトウエア・グループを用いて配列のファイルを分析
した。このソフトウエア・グループは、適切なスペーシ
ングを有するアンカリング酵素部位を同定し、２つの介
在タグを抽出し、それらをデータベースに記録するもの
である。413のユニークなジタグおよび87の反復ジタグ
から1,000のタグを誘導した。後者（反復ジタグ）は1回
だけ計測することで、定量で起こりうるＰＣＲの偏りを
排除した。ＳＡＧＥソフトウエアの機能は、単に、遺伝
子配列の検索を最適化することだけである。
らジタグを含有するバンドを切り出し、自己連結させ
た。連結後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
コンカテマー形成ジタグを分離し、200bpより大きな産
物を切り出した。これらの産物をpSL301(Invitrogen)の
SphI部位にクローニングした。クローニング部位の外側
のT7およびT3配列をプライマーとして用いるＰＣＲによ
り、コロニーをインサートについてスクリーニングし
た。少なくとも10（10〜50の範囲）のタグを含有するク
ローンを、記載（Del Salら、Biotechniques 7:514、19
89）のようにして、5'-GACGTCGACCTGAGGTAATTATAACC-3'
（配列番号７）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅
によって同定し、手操作により配列決定した。ＳＡＧＥ
ソフトウエア・グループを用いて配列のファイルを分析
した。このソフトウエア・グループは、適切なスペーシ
ングを有するアンカリング酵素部位を同定し、２つの介
在タグを抽出し、それらをデータベースに記録するもの
である。413のユニークなジタグおよび87の反復ジタグ
から1,000のタグを誘導した。後者（反復ジタグ）は1回
だけ計測することで、定量で起こりうるＰＣＲの偏りを
排除した。ＳＡＧＥソフトウエアの機能は、単に、遺伝
子配列の検索を最適化することだけである。
【００６１】表１は、最初の1,000タグの分析を示す。1
6％が配列のアンビギュイティー(ambiguity)を有してい
たか、あるいはリンカー配列から誘導されたものである
ので、それらを除外した。残りの840のタグは、一回存
在した351のタグおよび複数回見出された77のタグを含
んでいた。最も豊富なタグ10のうち９がGenBank R87中
の少なくとも１つのエントリーに一致した。その後、残
りのタグはアミラーゼに由来することがわかった。10の
転写産物の全部が既知の膵臓機能の遺伝子に由来し、そ
れらの存在は、慣用のアプローチを用いたこれまでの膵
臓ＲＮＡの分析と一致した（Hanら、Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 83,:110, 1986; Takedaら、Hum. Mol. Ge
n. 2:1793, 1993）。
6％が配列のアンビギュイティー(ambiguity)を有してい
たか、あるいはリンカー配列から誘導されたものである
ので、それらを除外した。残りの840のタグは、一回存
在した351のタグおよび複数回見出された77のタグを含
んでいた。最も豊富なタグ10のうち９がGenBank R87中
の少なくとも１つのエントリーに一致した。その後、残
りのタグはアミラーゼに由来することがわかった。10の
転写産物の全部が既知の膵臓機能の遺伝子に由来し、そ
れらの存在は、慣用のアプローチを用いたこれまでの膵
臓ＲＮＡの分析と一致した（Hanら、Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 83,:110, 1986; Takedaら、Hum. Mol. Ge
n. 2:1793, 1993）。
【００６２】
【表１】 表１ 膵臓ＳＡＧＥタグ タグ 遺伝子 Ｎ ハ゜ーセント GAGCACACC プロカルボキシペプチダーゼA1(X67318) 64 7.6 TTCTGTGTG 膵臓トリプシノーゲン2(M27602) 46 5.5 GAACACAAA キモトリプシノーゲン(M24400) 37 4.4 TCAGGGTGA 膵臓トリプシン1(M22612) 31 3.7 GCGTGACCA エラスターゼIIIB(M18692) 20 2.4 GTGTGTGCT プロテアーゼE(D00306) 16 1.9 TCATTGGCC 膵臓リパーゼ(M93285) 16 1.9 CCAGAGAGT プロカルボキシペプチダーゼB(M81057) 14 1.7 TCCTCAAAA 一致なし、表２、P1参照 14 1.7 AGCCTTGGT 胆汁塩刺激リパーゼ(X54457) 12 1.4 GTGTGCGCT 一致なし 11 1.3 TGCGAGACC 一致なし、表２、P2参照 9 1.1 GTGAAACCC 21 Aluエントリー 8 1.0 GGTGACTCT 一致なし 8 1.0 AAGGTAACA 分泌トリプシンインヒビター (M11949) 6 0.7 TCCCCTGTG 一致なし 5 0.6 GTGACCACG 一致なし 5 0.6 CCTGTAATC M91159, M29366, 11 Aluエントリー 5 0.6 CACGTTGGA 一致なし 5 0.6 AGCCCTACA 一致なし 5 0.6 AGCACCTCC 伸長因子2 (Z11692) 5 0.6 ACGCAGGGA 一致なし、表２、P3参照 5 0.6 AATTGAAGA 一致なし、表２、P4参照 5 0.6 TTCTGTGGG 一致なし 4 0.5 TTCATACAC 一致なし 4 0.5 GTGGCAGGC NF-kB(X61499), Aluエントリー(S94541) 4 0.5 GTAAAACCC TNF受容体II (M55994)、 Aluエントリー(X01448) 4 0.5 GAACACACA 一致なし 4 0.5 CCTGGGAAG 膵臓ムチン(J05582) 4 0.5 CCCATCGTC ミトコンドリアCytCオキシダーゼ(X15759) 4 0.5 （配列番号８〜37）まとめ ＳＡＧＥタグ ３回より多い 380 45.2 存在 3回（15ｘ3＝） 45 5.4 2回（32ｘ2＝） 64 7.6 1回 351 41.8 総ＳＡＧＥタグ 840 100.0
【００６３】「タグ」は、４bpのアンカリングNlaIII部
位に隣接する、各タグに固有の９bpの配列を示す。
「N」および「パーセント」は、それぞれ、タグを同定
した回数およびその頻度を示す。「遺伝子」は、ＳＡＧＥ
ソフトウエア・グループを用いて表示のタグに一致する
ことがわかったGenBank R87エントリーの受け入れ番号
および記載を示し、以下の例外がある。すなわち、重複
するエントリーのために複数のエントリーが同定される
場合には、１つのエントリーのみを掲載する。キモトリ
プシノーゲンおよびトリプシノーゲン1の場合、同じタ
グを含有すると予想される他の遺伝子が同定されたが、
続いて行ったハイブリダイゼーションおよび配列分析に
よって、掲載の遺伝子をタグの供給源として同定した。
「Aluエントリー(Alu entry)」とは、alu共通配列（Dei
ningerら、J. Mol. Biol. 151,:17,1981）の少なくとも
１コピーを含有していた転写産物のためのGenBankエン
トリーと一致したことを示す。
位に隣接する、各タグに固有の９bpの配列を示す。
「N」および「パーセント」は、それぞれ、タグを同定
した回数およびその頻度を示す。「遺伝子」は、ＳＡＧＥ
ソフトウエア・グループを用いて表示のタグに一致する
ことがわかったGenBank R87エントリーの受け入れ番号
および記載を示し、以下の例外がある。すなわち、重複
するエントリーのために複数のエントリーが同定される
場合には、１つのエントリーのみを掲載する。キモトリ
プシノーゲンおよびトリプシノーゲン1の場合、同じタ
グを含有すると予想される他の遺伝子が同定されたが、
続いて行ったハイブリダイゼーションおよび配列分析に
よって、掲載の遺伝子をタグの供給源として同定した。
「Aluエントリー(Alu entry)」とは、alu共通配列（Dei
ningerら、J. Mol. Biol. 151,:17,1981）の少なくとも
１コピーを含有していた転写産物のためのGenBankエン
トリーと一致したことを示す。
【００６４】実施例２ ＳＡＧＥの定量的性質は、オリゴ-dTプライマーを用い
て作製 (oligo-dT primed)膵臓ｃＤＮＡライブラリー
（トリプシノーゲン1/2、プロカルボキシペプチダーゼA
1、キモトリプシノーゲンおよびエラスターゼI〜IIB／
プロテアーゼEに対するｃＤＮＡプローブでスクリーニ
ングした）を構築することによって評価した。実施例１
においてＳＡＧＥに用いたのと同じ調製物から得られた
膵臓ｍＲＮＡを用いて、ZAP Express ｃＤＮＡ合成キッ
ト（Stratagene）を用いて製造業者のプロトコールにし
たがって、ZAP ExpressベクターにｃＤＮＡライブラリ
ーを構築した。ランダムに選んだ15のクローンを分析す
ることにより、100％がｃＤＮＡインサートを含有する
ことがわかった。250〜500のプラークを含有するプレー
トを、先に記載されている（Ruppertら、Mol. Cell. Bi
ol.8:3104, 1988）ようにしてハイブリダイズさせた。
トリプシノーゲン１、トリプシノーゲン２、プロカルボ
キシペプチダーゼA1、キモトリプシノーゲンおよびエラ
スターゼIIIBに対するｃＤＮＡプローブを、ＲＴ-ＰＣ
Ｒによって膵臓ＲＮＡから誘導した。トリプシノーゲン
１および２のプローブは93％同一であり、使用条件下で
同じプラークにハイブリダイズした。同様に、エラスタ
ーゼIIIBプローブとプロテアーゼEプローブは95％以上
同一であり、同じプラークにハイブリダイズした。
て作製 (oligo-dT primed)膵臓ｃＤＮＡライブラリー
（トリプシノーゲン1/2、プロカルボキシペプチダーゼA
1、キモトリプシノーゲンおよびエラスターゼI〜IIB／
プロテアーゼEに対するｃＤＮＡプローブでスクリーニ
ングした）を構築することによって評価した。実施例１
においてＳＡＧＥに用いたのと同じ調製物から得られた
膵臓ｍＲＮＡを用いて、ZAP Express ｃＤＮＡ合成キッ
ト（Stratagene）を用いて製造業者のプロトコールにし
たがって、ZAP ExpressベクターにｃＤＮＡライブラリ
ーを構築した。ランダムに選んだ15のクローンを分析す
ることにより、100％がｃＤＮＡインサートを含有する
ことがわかった。250〜500のプラークを含有するプレー
トを、先に記載されている（Ruppertら、Mol. Cell. Bi
ol.8:3104, 1988）ようにしてハイブリダイズさせた。
トリプシノーゲン１、トリプシノーゲン２、プロカルボ
キシペプチダーゼA1、キモトリプシノーゲンおよびエラ
スターゼIIIBに対するｃＤＮＡプローブを、ＲＴ-ＰＣ
Ｒによって膵臓ＲＮＡから誘導した。トリプシノーゲン
１および２のプローブは93％同一であり、使用条件下で
同じプラークにハイブリダイズした。同様に、エラスタ
ーゼIIIBプローブとプロテアーゼEプローブは95％以上
同一であり、同じプラークにハイブリダイズした。
【００６５】これらの転写産物に対するＳＡＧＥタグの
相対的存在量は、ライブラリー・スクリーニングを用い
て得た結果と非常によく一致した（図２）。さらに、ト
リプシノーゲン１と２も、エラスターゼIIIBとプロテア
ーゼＥも、ライブラリーをスクリーニングするのに用い
たｃＤＮＡプローブによって区別することはできなかっ
たが、４つの転写産物の全ては、それらのＳＡＧＥタグ
に基づいて容易に区別できた（表１）。
相対的存在量は、ライブラリー・スクリーニングを用い
て得た結果と非常によく一致した（図２）。さらに、ト
リプシノーゲン１と２も、エラスターゼIIIBとプロテア
ーゼＥも、ライブラリーをスクリーニングするのに用い
たｃＤＮＡプローブによって区別することはできなかっ
たが、４つの転写産物の全ては、それらのＳＡＧＥタグ
に基づいて容易に区別できた（表１）。
【００６６】実施例３ ＳＡＧＥは、既知の転写産物の存在量についての定量的
情報を提供するためだけでなく、新規な発現遺伝子の同
定にも用いることができる。本実施例におけるＳＡＧＥ
分析の目的では、各転写産物に固有の９bpの配列のみを
考慮したが、各ＳＡＧＥタグでは、アンカリング酵素
(４bp)部位および９bpのタグから成る13bpの配列が確定
された。この可能性を説明するために、13bpのオリゴヌ
クレオチドを用いて、４つの指定を受けていないタグ
（P1〜P4）（すなわち、GenBank R87からのエントリー
に対応しないタグ）に対応する転写産物を単離した（表
１）。それら４つの場合の各々において、13bpのオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとし
て用いて膵臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
るだけで、タグに対する複数のｃＤＮＡクローンを単離
することが可能であった（図３の例）。
情報を提供するためだけでなく、新規な発現遺伝子の同
定にも用いることができる。本実施例におけるＳＡＧＥ
分析の目的では、各転写産物に固有の９bpの配列のみを
考慮したが、各ＳＡＧＥタグでは、アンカリング酵素
(４bp)部位および９bpのタグから成る13bpの配列が確定
された。この可能性を説明するために、13bpのオリゴヌ
クレオチドを用いて、４つの指定を受けていないタグ
（P1〜P4）（すなわち、GenBank R87からのエントリー
に対応しないタグ）に対応する転写産物を単離した（表
１）。それら４つの場合の各々において、13bpのオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとし
て用いて膵臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
るだけで、タグに対する複数のｃＤＮＡクローンを単離
することが可能であった（図３の例）。
【００６７】250〜2,000のプラークを含有するプレート
を、ハイブリダイゼーション温度を室温まで低下させた
以外は標準的なプローブについて以前に記載されている
ものと同じ条件を用いて、オリゴヌクレオチド・プロー
ブにハイブリダイズした。洗浄を６ｘSSC／0.1％ SDS中
で30分間室温で行った。これらのプローブは、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてγ32Ｐ−ＡＴＰで標識され
た13bpのオリゴヌクレオチドから構成された。それぞれ
の場合、誘導したクローンを配列決定することにより、
同定した転写産物の想定３′末端に正しいＳＡＧＥタグ
が同定された。13-merとのハイブリダイゼーションによ
って同定されたプラークの存在量は、ＳＡＧＥによって
予測されたものとよく一致した(表２)。タグP1およびP2
は、それぞれアミラーゼおよびプレプロカルボキシペプ
チダーゼA2に対応することがわかった。GenBank R87に
は、プレプロカルボキシペプチダーゼA2に対するエント
リーが全く存在せず、アミラーゼに対しては末端の切断
された(truncated)エントリーだけしか存在せず、これ
により、それらの指定を受けていない特性表示を説明で
きる。タグP3は、GenBankに含まれる既知の機能の遺伝
子のいずれとも一致しなかったが、多数のESTと一致
し、このことにより、タグP3が真の(bona fide)転写産
物を表すことがさらに明らかになった。P4によって同定
されたｃＤＮＡは有意な相同性を全く示さず、このこと
は、そのｃＤＮＡがこれまでに特性決定されていない膵
臓転写産物を表すことを示唆した。
を、ハイブリダイゼーション温度を室温まで低下させた
以外は標準的なプローブについて以前に記載されている
ものと同じ条件を用いて、オリゴヌクレオチド・プロー
ブにハイブリダイズした。洗浄を６ｘSSC／0.1％ SDS中
で30分間室温で行った。これらのプローブは、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてγ32Ｐ−ＡＴＰで標識され
た13bpのオリゴヌクレオチドから構成された。それぞれ
の場合、誘導したクローンを配列決定することにより、
同定した転写産物の想定３′末端に正しいＳＡＧＥタグ
が同定された。13-merとのハイブリダイゼーションによ
って同定されたプラークの存在量は、ＳＡＧＥによって
予測されたものとよく一致した(表２)。タグP1およびP2
は、それぞれアミラーゼおよびプレプロカルボキシペプ
チダーゼA2に対応することがわかった。GenBank R87に
は、プレプロカルボキシペプチダーゼA2に対するエント
リーが全く存在せず、アミラーゼに対しては末端の切断
された(truncated)エントリーだけしか存在せず、これ
により、それらの指定を受けていない特性表示を説明で
きる。タグP3は、GenBankに含まれる既知の機能の遺伝
子のいずれとも一致しなかったが、多数のESTと一致
し、このことにより、タグP3が真の(bona fide)転写産
物を表すことがさらに明らかになった。P4によって同定
されたｃＤＮＡは有意な相同性を全く示さず、このこと
は、そのｃＤＮＡがこれまでに特性決定されていない膵
臓転写産物を表すことを示唆した。
【００６８】
【表２】 表２ 指定を受けていないＳＡＧＥタグの特性決定 タグ SAGE存在量 13mer Hyb SAGEタク゛ 記載 P1 TCCTCAAAA 1.7% 1.5% (6/388) ＋ 膵臓アミラーセ゛の3'末端 (配列番号38) (M28443) P2 TGCGAGACC 1.1% 1.2%(43/3700) ＋ フ゜レフ゜ロカルホ゛キシ (配列番号39) ヘ゜フ゜チタ゛ーセ゛A2の 3'末端(U19977) P3 ACGCAGGGA 0.6% 0.2%(5/2772) ＋ EST一致(R45808) (配列番号40) P4 AATTGAAGA 0.6% 0.4%(6/1587) ＋ 一致なし (配列番号41)
【００６９】「タグ」および「ＳＡＧＥ存在量」は表１
で説明したとおりであり、「13merHyb」は、上記のよう
な13merでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことによって得られた結果を示す。スクリーニングした
総プラーク数で除した陽性プラークの数を、存在量パー
セントの後ろのカッコ内に示す。「ＳＡＧＥタグ」の欄
の＋の符号は、発現されたＳＡＧＥタグ配列が、単離し
たクローンの３′末端付近で同定されたことを示す。
「記載」とは、1995年６月９日のNCBIで毎日更新されて
いるGenBankエントリーのBLAST検索の結果を示す（Alts
chul, ら, J. Mol. Biol. 215:403, 1990）。記載およ
び受け入れ番号は最も顕著な一致をみたものについて示
してある。P1は、末端の切断されたアミラーゼに対する
エントリーに一致することがわかり、P2はプレプロカル
ボキシペプチダーゼA2に対する未発表のエントリー（こ
れを、GenBank R87の後に参加させた）に一致すること
がわかった。
で説明したとおりであり、「13merHyb」は、上記のよう
な13merでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことによって得られた結果を示す。スクリーニングした
総プラーク数で除した陽性プラークの数を、存在量パー
セントの後ろのカッコ内に示す。「ＳＡＧＥタグ」の欄
の＋の符号は、発現されたＳＡＧＥタグ配列が、単離し
たクローンの３′末端付近で同定されたことを示す。
「記載」とは、1995年６月９日のNCBIで毎日更新されて
いるGenBankエントリーのBLAST検索の結果を示す（Alts
chul, ら, J. Mol. Biol. 215:403, 1990）。記載およ
び受け入れ番号は最も顕著な一致をみたものについて示
してある。P1は、末端の切断されたアミラーゼに対する
エントリーに一致することがわかり、P2はプレプロカル
ボキシペプチダーゼA2に対する未発表のエントリー（こ
れを、GenBank R87の後に参加させた）に一致すること
がわかった。
【００７０】実施例４ ＳＡＧＥによって得られたジタグを、本明細書に記載さ
れているように、ＰＳＡまたはＣＳにより分析できる。
ＰＳＡの１つの好ましい実施形態では、ジタグを用いて
以下の工程を行う。
れているように、ＰＳＡまたはＣＳにより分析できる。
ＰＳＡの１つの好ましい実施形態では、ジタグを用いて
以下の工程を行う。
【００７１】すなわち、先の実施例に記載したようにジ
タグを調製し、増幅し、アンカリング酵素で切断する。
タグを調製し、増幅し、アンカリング酵素で切断する。
【００７２】突出部分に相補的な、確認物質（例えば、
蛍光成分、FL）を含有する４塩基のオリゴマー(例え
ば、FL-CATG)を調製する。過剰のFL-CATGオリゴマーを
上記のジタグに以下のように連結する：
蛍光成分、FL）を含有する４塩基のオリゴマー(例え
ば、FL-CATG)を調製する。過剰のFL-CATGオリゴマーを
上記のジタグに以下のように連結する：
【００７３】次にそれらのジタグを精製し溶融して、例
えば、式：
えば、式：
【００７４】を有する一本鎖ＤＮＡを得る。この一本鎖
ＤＮＡの混合物は好ましくは連続希釈する。各連続希釈
物を、適切なストリンジェントな条件下で、グリッドに
分注した一本鎖オリゴを含有する固相マトリックスとハ
イブリダイズさせる。それらのオリゴヌクレオチドの全
部がアンカリング酵素切断配列の半分の部位を含有して
いる。ここで用いた例では、オリゴヌクレオチド配列は
５′末端にCATG配列を含有する： CATGOOOOOOOOOO、CATGXXXXXXXXXX、等 （または、３′末端にCATGを含有する： OOOOOOOOOOCAT
G）
ＤＮＡの混合物は好ましくは連続希釈する。各連続希釈
物を、適切なストリンジェントな条件下で、グリッドに
分注した一本鎖オリゴを含有する固相マトリックスとハ
イブリダイズさせる。それらのオリゴヌクレオチドの全
部がアンカリング酵素切断配列の半分の部位を含有して
いる。ここで用いた例では、オリゴヌクレオチド配列は
５′末端にCATG配列を含有する： CATGOOOOOOOOOO、CATGXXXXXXXXXX、等 （または、３′末端にCATGを含有する： OOOOOOOOOOCAT
G）
【００７５】マトリックスは当業界で公知の如何なる物
質から構成されていてもよく、オリゴヌクレオチド担持
チップは当業界で公知の手順によって作製することがで
き、例えば、VLSIP法（Fodor ら, 前掲）によって作製
されたオリゴヌクレオチドを含有するシリコンチップが
挙げられる。
質から構成されていてもよく、オリゴヌクレオチド担持
チップは当業界で公知の手順によって作製することがで
き、例えば、VLSIP法（Fodor ら, 前掲）によって作製
されたオリゴヌクレオチドを含有するシリコンチップが
挙げられる。
【００７６】オリゴヌクレオチド担持マトリックスは、
グリッド内の各位置における蛍光ジタグの存在または不
存在について評価する。
グリッド内の各位置における蛍光ジタグの存在または不
存在について評価する。
【００７７】１つの好ましい実施態様では、グリッドに
は４10または1,048,576の一般配列CATGOOOOOOOOOOのオ
リゴヌクレオチドが存在し、あらゆる可能性のある10塩
基配列がCATGの３′側に表示されるようになっている
（ここでは、CATGは、ジタグの３′末端にあるアンカリ
ング酵素の半分の部位に相補的であるアンカリング酵素
の半分の部位の一例として用いられている）。ヒト・ゲ
ノムには100,000〜200,000ほどの様々な発現遺伝子があ
ると推定されるので、ヒト・ゲノムにおける発現遺伝子
由来のｃＤＮＡにおいて見出される最も３′側のアンカ
リング酵素部位に隣接している可能な配列の全部を検出
するのに十分なオリゴヌクレオチド配列がある。
は４10または1,048,576の一般配列CATGOOOOOOOOOOのオ
リゴヌクレオチドが存在し、あらゆる可能性のある10塩
基配列がCATGの３′側に表示されるようになっている
（ここでは、CATGは、ジタグの３′末端にあるアンカリ
ング酵素の半分の部位に相補的であるアンカリング酵素
の半分の部位の一例として用いられている）。ヒト・ゲ
ノムには100,000〜200,000ほどの様々な発現遺伝子があ
ると推定されるので、ヒト・ゲノムにおける発現遺伝子
由来のｃＤＮＡにおいて見出される最も３′側のアンカ
リング酵素部位に隣接している可能な配列の全部を検出
するのに十分なオリゴヌクレオチド配列がある。
【００７８】さらに別の実施態様では、次の配列： プライマーＡ−GGAGCATG(X)10(O)10CATGCATCC−プライ
マーＢ、 プライマーＡ−CCTCGTAC(X)10(O)10GTACGTAGG−プライ
マーB を含有する上記の配列を増幅し、タギング酵素、次にア
ンカリング酵素で切断して、次の構造： (O)10CATG-3' を有するタグ相補体を生成させる。次に、このタグ相補
体を、標識し、融解し、固相支持体上でオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせることが可能である。
マーＢ、 プライマーＡ−CCTCGTAC(X)10(O)10GTACGTAGG−プライ
マーB を含有する上記の配列を増幅し、タギング酵素、次にア
ンカリング酵素で切断して、次の構造： (O)10CATG-3' を有するタグ相補体を生成させる。次に、このタグ相補
体を、標識し、融解し、固相支持体上でオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせることが可能である。
【００７９】様々なライブラリー（示差的スクリーニン
グプローブを表す）間で、様々な希釈率で、グリッド上
での蛍光プロフィールを比較することにより、示差的発
現を測定した。例えば、
グプローブを表す）間で、様々な希釈率で、グリッド上
での蛍光プロフィールを比較することにより、示差的発
現を測定した。例えば、
【００８０】かくして、個々のオリゴヌクレオチドは以
下の特性を有するジタグにハイブリダイズする。
下の特性を有するジタグにハイブリダイズする。
【００８１】
【表３】
【００８２】表３は、示差的ハイブリダイゼーションの
結果をまとめたものである。１Aおよび３Bにハイブリダ
イズしたタグは、示差的には発現されない、高い存在量
のｍＲＮＡを反映し（その理由は、これらのタグが、全
ての希釈率において双方のライブラリーにハイブリダイ
ズするからである）；タグ2Cは、高い存在量のｍＲＮＡ
（しかし、ライブラリーＢのみ）を同定する。2Eは、示
差的に発現されることがわかっていない、低い存在量の
転写産物を反映し（その理由は、それが最低の希釈率で
のみ検出されるからである）；3Cは、ライブラリーＢで
の中程度の存在量の転写産物を反映し（その理由は、そ
れが低いほうの２つの希釈率で発現されるからであ
る）、この転写産物はライブラリーＡでは低い存在量で
発現される。4Dは、ライブラリーＡに限って示差的に発
現される高い存在量の転写産物を反映し；5Aは、ライブ
ラリーＡでは高い存在量で発現されるが、ライブラリー
Ｂでは低い存在量でしか発現されない転写産物を反映
し；5Eは、ライブラリーＢでのみ検出可能な、示差的に
発現される転写産物を反映する。
結果をまとめたものである。１Aおよび３Bにハイブリダ
イズしたタグは、示差的には発現されない、高い存在量
のｍＲＮＡを反映し（その理由は、これらのタグが、全
ての希釈率において双方のライブラリーにハイブリダイ
ズするからである）；タグ2Cは、高い存在量のｍＲＮＡ
（しかし、ライブラリーＢのみ）を同定する。2Eは、示
差的に発現されることがわかっていない、低い存在量の
転写産物を反映し（その理由は、それが最低の希釈率で
のみ検出されるからである）；3Cは、ライブラリーＢで
の中程度の存在量の転写産物を反映し（その理由は、そ
れが低いほうの２つの希釈率で発現されるからであ
る）、この転写産物はライブラリーＡでは低い存在量で
発現される。4Dは、ライブラリーＡに限って示差的に発
現される高い存在量の転写産物を反映し；5Aは、ライブ
ラリーＡでは高い存在量で発現されるが、ライブラリー
Ｂでは低い存在量でしか発現されない転写産物を反映
し；5Eは、ライブラリーＢでのみ検出可能な、示差的に
発現される転写産物を反映する。
【００８３】別のＰＳＡの実施態様では、上記の工程３
で蛍光性または他の確認物を使用する必要はないが、そ
の代わりに、ジタグの最後の増幅のラウンドにおいて、
標識ｄＮＴＰを用いて、融解後に全分子の半分が標識さ
れて、チップ上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズさせるためのプローブとして役立つようにす
る。
で蛍光性または他の確認物を使用する必要はないが、そ
の代わりに、ジタグの最後の増幅のラウンドにおいて、
標識ｄＮＴＰを用いて、融解後に全分子の半分が標識さ
れて、チップ上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズさせるためのプローブとして役立つようにす
る。
【００８４】さらに別のＰＳＡの実施態様では、ジタグ
の代わりに、転写産物の特定の部分（例えば、転写産物
の３′末端と第１アンカリング酵素部位との間の配列）
を用いる。そのような特定の場合、「詳細な説明」で記載
したように、二本鎖ｃＤＮＡ逆転写産物が作製される。
この転写産物はアンカリング酵素で切断し、ＰＣＲプラ
イマーを含有するリンカーを付加して、（このプライマ
ーを一方の末端で用い、ポリＡ尾部を他方の末端で用い
て）増幅を開始するが、この転写産物は依然としてスト
レプトアビジン・ビーズの上に存在したままである。増
幅の最後のラウンドで、フルオレセイン化ｄＮＴＰを用
いて、分子の半分が標識されるようにする。この時点
で、場合によっては、断片のサイズを小さくするため
に、リンカー−プライマーをアンカリング酵素を用いて
除去してもよい。次に、先の実施例のように、これらの
可溶性の断片を融解し、CATGOOOOOOOOOOを含有する固相
マトリックスの上で捕捉する。（フルオレセイン化塩基
を含有する断片の半分のみの）分析および評価は上記と
同様である。
の代わりに、転写産物の特定の部分（例えば、転写産物
の３′末端と第１アンカリング酵素部位との間の配列）
を用いる。そのような特定の場合、「詳細な説明」で記載
したように、二本鎖ｃＤＮＡ逆転写産物が作製される。
この転写産物はアンカリング酵素で切断し、ＰＣＲプラ
イマーを含有するリンカーを付加して、（このプライマ
ーを一方の末端で用い、ポリＡ尾部を他方の末端で用い
て）増幅を開始するが、この転写産物は依然としてスト
レプトアビジン・ビーズの上に存在したままである。増
幅の最後のラウンドで、フルオレセイン化ｄＮＴＰを用
いて、分子の半分が標識されるようにする。この時点
で、場合によっては、断片のサイズを小さくするため
に、リンカー−プライマーをアンカリング酵素を用いて
除去してもよい。次に、先の実施例のように、これらの
可溶性の断片を融解し、CATGOOOOOOOOOOを含有する固相
マトリックスの上で捕捉する。（フルオレセイン化塩基
を含有する断片の半分のみの）分析および評価は上記と
同様である。
【００８５】クローンの配列決定で使用するためには、
（細胞クローニングのための限界希釈法において行われ
るように）ジタグまたはコンカテマーを希釈し、例えば
マルチウエルプレートのウエルまたは他の受け器に添加
して、ウエルが統計学上平均してウエル当たり１個未満
のＤＮＡ分子を含有するようにする。次に、各ウエルに
は、ＰＣＲまたは他の増幅プロセス用の試薬を加え、各
受け器中のＤＮＡを例えばマススペクトルスコピーによ
って配列決定する。その結果は、単一の配列（その受け
器中に単一の配列が存在していた）か、「ヌル」配列
（ＤＮＡは存在していなかった）であるか、あるいは二
重配列（１より多いＤＮＡ分子）のいずれかであり、こ
れは、二重配列はデータ分析の際には考慮から外される
であろう。その後、示差的発現の評価を、ここに記載し
たとおりに行う。
（細胞クローニングのための限界希釈法において行われ
るように）ジタグまたはコンカテマーを希釈し、例えば
マルチウエルプレートのウエルまたは他の受け器に添加
して、ウエルが統計学上平均してウエル当たり１個未満
のＤＮＡ分子を含有するようにする。次に、各ウエルに
は、ＰＣＲまたは他の増幅プロセス用の試薬を加え、各
受け器中のＤＮＡを例えばマススペクトルスコピーによ
って配列決定する。その結果は、単一の配列（その受け
器中に単一の配列が存在していた）か、「ヌル」配列
（ＤＮＡは存在していなかった）であるか、あるいは二
重配列（１より多いＤＮＡ分子）のいずれかであり、こ
れは、二重配列はデータ分析の際には考慮から外される
であろう。その後、示差的発現の評価を、ここに記載し
たとおりに行う。
【００８６】これらの結果は、ＳＡＧＥが遺伝子発現に
ついての定量的および定性的の両方のデータを提供する
ことを実証するものである。種々の認識エレメントをも
つ異なるアンカリング酵素および／またはタギング酵素
を使用することにより、この戦略が大きな融通性を伴う
ようになる。特に、異なるアンカリング酵素は異なる部
位でｃＤＮＡを切断するので、同じｃＤＮＡ調製物の個
々のサンプルに対して少なくとも２つの異なるアンカリ
ング酵素を用いることにより、結果の確認が可能とな
り、またそれら酵素の１つに対する認識部位を含有しな
い可能性がある配列の分析の確認が可能となる。
ついての定量的および定性的の両方のデータを提供する
ことを実証するものである。種々の認識エレメントをも
つ異なるアンカリング酵素および／またはタギング酵素
を使用することにより、この戦略が大きな融通性を伴う
ようになる。特に、異なるアンカリング酵素は異なる部
位でｃＤＮＡを切断するので、同じｃＤＮＡ調製物の個
々のサンプルに対して少なくとも２つの異なるアンカリ
ング酵素を用いることにより、結果の確認が可能とな
り、またそれら酵素の１つに対する認識部位を含有しな
い可能性がある配列の分析の確認が可能となる。
【００８７】完成に近づいているゲノムを十分に特性決
定するための試みとして、ＳＡＧＥは、あらゆる所与の
細胞型または組織における発現の直接的な解読を可能に
しなければらならない。当座の間、ＳＡＧＥの主な用途
は、組織間での、および所与の細胞または組織の様々な
発生段階および疾病状態での遺伝子発現パターンの比較
であろう。ＰＣＲおよび手操作による配列決定を行う能
力のある当業者であれば、この目的のためにＳＡＧＥを
実施することが可能であろう。この技術を自動化配列決
定装置に適用することにより、3時間の運転を1回行うだ
けで1,000個以上の転写産物を分析することが可能とな
ろう。ABI377型配列決定装置では、3時間の運転で36の
鋳型について451bpの解読が得られる（451bp／11bp／タ
グ×36＝1476タグ）。測定すべきタグの適切な数は、そ
の応用例に依存する。例えば、１つの組織では比較的高
レベル（0.5％以上）で発現されるが他の組織では低い
レベルで発現される遺伝子の決定には、たった1日あれ
ばよいであろう。細胞当たり100以上のｍＲＮＡ（0.025
％以上）で発現される転写産物の測定は、１つの測定装
置で２、３ヶ月以内に定量可能でなければならない。２
種の異なるアンカリング酵素を用いることにより、所望
の存在量の転写産物のほどんど全てが確実に同定される
であろう。それらの示差的提示(differential represen
tation)に基づいて最も興味深いものであることがわか
っているタグをコードする遺伝子は、表２で実証されて
いるように、データベース検索とハイブリダイゼーショ
ンと配列分析とを組合せることによってポジティブに同
定できる。明らかに、ＳＡＧＥはヒト以外の生物の分析
にも応用可能であり、特定の生物学的状態で発現される
遺伝子の方に研究を導くであろう。
定するための試みとして、ＳＡＧＥは、あらゆる所与の
細胞型または組織における発現の直接的な解読を可能に
しなければらならない。当座の間、ＳＡＧＥの主な用途
は、組織間での、および所与の細胞または組織の様々な
発生段階および疾病状態での遺伝子発現パターンの比較
であろう。ＰＣＲおよび手操作による配列決定を行う能
力のある当業者であれば、この目的のためにＳＡＧＥを
実施することが可能であろう。この技術を自動化配列決
定装置に適用することにより、3時間の運転を1回行うだ
けで1,000個以上の転写産物を分析することが可能とな
ろう。ABI377型配列決定装置では、3時間の運転で36の
鋳型について451bpの解読が得られる（451bp／11bp／タ
グ×36＝1476タグ）。測定すべきタグの適切な数は、そ
の応用例に依存する。例えば、１つの組織では比較的高
レベル（0.5％以上）で発現されるが他の組織では低い
レベルで発現される遺伝子の決定には、たった1日あれ
ばよいであろう。細胞当たり100以上のｍＲＮＡ（0.025
％以上）で発現される転写産物の測定は、１つの測定装
置で２、３ヶ月以内に定量可能でなければならない。２
種の異なるアンカリング酵素を用いることにより、所望
の存在量の転写産物のほどんど全てが確実に同定される
であろう。それらの示差的提示(differential represen
tation)に基づいて最も興味深いものであることがわか
っているタグをコードする遺伝子は、表２で実証されて
いるように、データベース検索とハイブリダイゼーショ
ンと配列分析とを組合せることによってポジティブに同
定できる。明らかに、ＳＡＧＥはヒト以外の生物の分析
にも応用可能であり、特定の生物学的状態で発現される
遺伝子の方に研究を導くであろう。
【００８８】ＳＡＧＥは、本明細書で記載したように、
組織間での、または同じ組織の異なる段階間での、また
は病的な組織とその正常なものとの間での多数の遺伝子
の発現の比較を可能にする。そのような分析は、例えば
治療上、診断上および予後上関連のある遺伝子を同定す
るのに有用である。ＳＡＧＥ技術の多くの有用性の中で
も、とりわけ治療上有用でありうる適切なアンチセンス
試薬または３重らせん試薬の同定がある。さらに、遺伝
子治療の候補もこのＳＡＧＥ技術によって同定すること
が可能である。他の用途としては、遺伝子の発現が例え
ば疾病に対する素質、疾病の存在および疾病の予後と相
関性があることがわかっている個々の遺伝子または遺伝
子群を同定するための診断的使用が挙げられる。表１に
示されるような存在量のプロフィールは、上記の用途に
有用である。ＳＡＧＥは、宿主内の生物（例えば、病原
体）の検出、または宿主内で病原体によって発現される
感染特異的遺伝子の検出にも有用である。
組織間での、または同じ組織の異なる段階間での、また
は病的な組織とその正常なものとの間での多数の遺伝子
の発現の比較を可能にする。そのような分析は、例えば
治療上、診断上および予後上関連のある遺伝子を同定す
るのに有用である。ＳＡＧＥ技術の多くの有用性の中で
も、とりわけ治療上有用でありうる適切なアンチセンス
試薬または３重らせん試薬の同定がある。さらに、遺伝
子治療の候補もこのＳＡＧＥ技術によって同定すること
が可能である。他の用途としては、遺伝子の発現が例え
ば疾病に対する素質、疾病の存在および疾病の予後と相
関性があることがわかっている個々の遺伝子または遺伝
子群を同定するための診断的使用が挙げられる。表１に
示されるような存在量のプロフィールは、上記の用途に
有用である。ＳＡＧＥは、宿主内の生物（例えば、病原
体）の検出、または宿主内で病原体によって発現される
感染特異的遺伝子の検出にも有用である。
【００８９】本発明におけるＳＡＧＥによって説明され
るように、多数の発現遺伝子を短時間で同定できるとい
うことは、無限の用途を提供する。
るように、多数の発現遺伝子を短時間で同定できるとい
うことは、無限の用途を提供する。
【００９０】本発明は、現在好ましいとされる実施態様
について記載してきたが、本発明の精神を逸脱すること
なしに種々の改変が可能であると理解すべきである。し
たがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によっての
み限定される。
について記載してきたが、本発明の精神を逸脱すること
なしに種々の改変が可能であると理解すべきである。し
たがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によっての
み限定される。
【図１】SAGEの模式図である。この例において、第１制
限酵素すなわちアンカリング酵素(anchoring enzyme)は
NlaIIIであり、第２制限酵素すなわちタギング酵素(tag
ging enzyme)はFokIである。配列はプライマー由来の配
列および転写産物由来の配列を表し、ここで「Ｘ」およ
び「Ｏ」は異なるタグのヌクレオチドを表す。
限酵素すなわちアンカリング酵素(anchoring enzyme)は
NlaIIIであり、第２制限酵素すなわちタギング酵素(tag
ging enzyme)はFokIである。配列はプライマー由来の配
列および転写産物由来の配列を表し、ここで「Ｘ」およ
び「Ｏ」は異なるタグのヌクレオチドを表す。
【図２】転写産物の存在量の比較を示した図である。棒
線はSAGE（黒線）またはハイブリダイゼーション分析
（白線）で測定した存在量パーセント(percent abundan
ce)を表す。SAGE数量化は表１から次のように誘導され
た。TRY1/2はトリプシノーゲン１および２のタグを含
み、PROCARはプロカルボキシペプチダーゼA1のタグを示
し、CHYMO はキモトリプシノーゲンのタグを示し、そし
てELA/PRO はエラスターゼIIIBおよびプロテアーゼＥの
タグを含む。誤差線は、カウントした事象の平方根をと
り、それを存在量パーセントに換算する（想定上のポア
ソン分布）ことで決定した標準偏差を表す。
線はSAGE（黒線）またはハイブリダイゼーション分析
（白線）で測定した存在量パーセント(percent abundan
ce)を表す。SAGE数量化は表１から次のように誘導され
た。TRY1/2はトリプシノーゲン１および２のタグを含
み、PROCARはプロカルボキシペプチダーゼA1のタグを示
し、CHYMO はキモトリプシノーゲンのタグを示し、そし
てELA/PRO はエラスターゼIIIBおよびプロテアーゼＥの
タグを含む。誤差線は、カウントした事象の平方根をと
り、それを存在量パーセントに換算する（想定上のポア
ソン分布）ことで決定した標準偏差を表す。
【図３】SAGEタグによりｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングした結果を示した図である。P2は実施例に記載
したような13 bp のオリゴヌクレオチドを用いて得られ
た典型的なハイブリダイゼーション結果を示す。P1およ
びP2は表２に記載した転写産物に対応する。画像はMole
cular Dynamics Phosphor Imager を使って得られ、円
はハイブリダイゼーションに先立って組換え体ファージ
を移行させたフィルターメンブランのアウトラインを示
す。
ーニングした結果を示した図である。P2は実施例に記載
したような13 bp のオリゴヌクレオチドを用いて得られ
た典型的なハイブリダイゼーション結果を示す。P1およ
びP2は表２に記載した転写産物に対応する。画像はMole
cular Dynamics Phosphor Imager を使って得られ、円
はハイブリダイゼーションに先立って組換え体ファージ
を移行させたフィルターメンブランのアウトラインを示
す。
【図４】本発明によるタグコード・データベース・アク
セスシステムの構成図である。
セスシステムの構成図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月６日（２０００．１１．
６）
６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】SAGEの模式図である。この例において、第１制
限酵素すなわちアンカリング酵素(anchoring enzyme)は
NlaIIIであり、第２制限酵素すなわちタギング酵素(tag
ging enzyme)はFokIである。配列はプライマー由来の配
列および転写産物由来の配列を表し、ここで「Ｘ」およ
び「Ｏ」は異なるタグのヌクレオチドを表す。
限酵素すなわちアンカリング酵素(anchoring enzyme)は
NlaIIIであり、第２制限酵素すなわちタギング酵素(tag
ging enzyme)はFokIである。配列はプライマー由来の配
列および転写産物由来の配列を表し、ここで「Ｘ」およ
び「Ｏ」は異なるタグのヌクレオチドを表す。
【図２】転写産物の存在量の比較を示した図である。棒
線はSAGE（黒線）またはハイブリダイゼーション分析
（白線）で測定した存在量パーセント(percent abundan
ce)を表す。SAGE数量化は表１から次のように誘導され
た。TRY1/2はトリプシノーゲン１および２のタグを含
み、PROCARはプロカルボキシペプチダーゼA1のタグを示
し、CHYMO はキモトリプシノーゲンのタグを示し、そし
てELA/PRO はエラスターゼIIIBおよびプロテアーゼＥの
タグを含む。誤差線は、カウントした事象の平方根をと
り、それを存在量パーセントに換算する（想定上のポア
ソン分布）ことで決定した標準偏差を表す。
線はSAGE（黒線）またはハイブリダイゼーション分析
（白線）で測定した存在量パーセント(percent abundan
ce)を表す。SAGE数量化は表１から次のように誘導され
た。TRY1/2はトリプシノーゲン１および２のタグを含
み、PROCARはプロカルボキシペプチダーゼA1のタグを示
し、CHYMO はキモトリプシノーゲンのタグを示し、そし
てELA/PRO はエラスターゼIIIBおよびプロテアーゼＥの
タグを含む。誤差線は、カウントした事象の平方根をと
り、それを存在量パーセントに換算する（想定上のポア
ソン分布）ことで決定した標準偏差を表す。
【図３】SAGEタグによりｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングした結果を示した図である。P2は実施例に記載
したような13 bp のオリゴヌクレオチドを用いて得られ
た典型的なハイブリダイゼーション結果を示す。P1およ
びP2は表２に記載した転写産物に対応する。画像はMole
cular Dynamics Phosphor Imager を使って得られ、円
はハイブリダイゼーションに先立って組換え体ファージ
を移行させたフィルターメンブランのアウトラインを示
す。
ーニングした結果を示した図である。P2は実施例に記載
したような13 bp のオリゴヌクレオチドを用いて得られ
た典型的なハイブリダイゼーション結果を示す。P1およ
びP2は表２に記載した転写産物に対応する。画像はMole
cular Dynamics Phosphor Imager を使って得られ、円
はハイブリダイゼーションに先立って組換え体ファージ
を移行させたフィルターメンブランのアウトラインを示
す。
【図４】本発明によるタグコード・データベース・アク
セスシステムの構成図である。
セスシステムの構成図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴォゲルステイン，バート アメリカ合衆国 21208 メリーランド州 バルチモア，ブレトン ウェイ 3700 (72)発明者 ヴェルヴレスク，ヴィクター，イー. アメリカ合衆国 21202 メリーランド州 バルチモア，エヌ． カルバート スト リート 650，アパートメント シー (72)発明者 ツァン，リン アメリカ合衆国 21218 メリーランド州 バルチモア，セント ポール ストリー ト 3100， アパートメント 405
Claims (24)
- 【請求項１】 第１ヌクレオチド配列を第２ヌクレオチ
ド配列により同定する方法であって、 メッセンジャーＲＮＡ中の限定された位置を有する第１
ヌクレオチド配列を予め選択し、 第１ヌクレオチド配列をヌクレオチド配列のデータベー
スと比較し、 第１ヌクレオチド配列に一致する該データベース中の第
２ヌクレオチド配列を選択し、 第２ヌクレオチド配列がそのメッセンジャーＲＮＡ中の
該限定された位置に存在することを確認し、それによ
り、第１ヌクレオチド配列を、限定された位置および共
通ヌクレオチド配列を共有する第２ヌクレオチド配列に
より同定する、各ステップを含む上記方法。 - 【請求項２】 比較するステップがコンピュータを使っ
て行なわれる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 予め選択するステップが限定された位置
のメッセンジャーＲＮＡの部分のヌクレオチド配列を決
定することを含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 第１ヌクレオチド配列が生物に由来する
ものであり、該第１ヌクレオチド配列が、配列のみに基
づいてその生物の全転写産物を含む配列データベース中
の１つのヌクレオチド配列によりそれを特異的に同定す
るために必要とされる長さよりも短いものである、請求
項１記載の方法。 - 【請求項５】 第１ｍＲＮＡ分子または該第１ｍＲＮＡ
分子由来の第１ｃＤＮＡ分子をデータベース中の既知配
列により同定する方法であって、 第１ｍＲＮＡ分子または第１ｃＤＮＡ分子中の限定され
た位置にある第１ヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡまたは
ｃＤＮＡ分子中の限定された位置にそれぞれ存在するｍ
ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ配列からなるデータベー
ス中の第２ヌクレオチド配列に一致させ、それにより、
第１ヌクレオチド配列を該データベース中の既知配列に
より同定する、ステップを含む上記方法。 - 【請求項６】 第１ヌクレオチド配列が６〜７bpの長さ
である、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 第１ヌクレオチド配列が９〜10bpの長さ
である、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 第１ヌクレオチド配列が13bpの長さであ
る、請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 一致させるステップがコンピュータを使
って行なわれる、請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子中の限定
された位置にそれぞれ存在するｍＲＮＡおよび／または
ｃＤＮＡ配列のデータベースがポインターファイル中に
記憶されている、請求項５記載の方法。 - 【請求項１１】 一致させるステップが、第１ヌクレオ
チド配列をポインターファイル中のヌクレオチド配列と
比較することにより行なわれる、請求項10記載の方法。 - 【請求項１２】 第１ヌクレオチド配列が生物に由来す
るものであり、該第１ヌクレオチド配列が、配列のみに
基づいてその生物の全転写産物を含む配列データベース
中の１つのヌクレオチド配列によりそれを特異的に同定
するために必要とされる長さよりも短いものである、請
求項５記載の方法。 - 【請求項１３】 短いヌクレオチド配列タグをライブラ
リー中のｃＤＮＡクローンにより同定する方法であっ
て、 第１ｍＲＮＡ分子中の限定された位置にある短いヌクレ
オチド配列タグのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレ
オチドを、ライブラリー中のｃＤＮＡクローンにハイブ
リダイズさせ、 該ヌクレオチド配列が該ｃＤＮＡクローン中の該限定さ
れた位置にあることを確認し、それにより、短いヌクレ
オチド配列タグを、該ｃＤＮＡクローンがコピーされた
第２ｍＲＮＡ分子に対応するものとして同定する、各ス
テップを含む上記方法。 - 【請求項１４】 前記タグが生物に由来するものであ
り、該タグが、配列のみに基づいてその生物の全転写産
物を含む配列データベース中の１つのヌクレオチド配列
によりそれを特異的に同定するために必要とされる長さ
よりも短いものである、請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】 前記ヌクレオチド配列が前記限定され
た位置にあるか否かを調べるために、ｃＤＮＡクローン
を配列決定する、請求項13記載の方法。 - 【請求項１６】 前記タグが６〜７bpの長さである、請
求項13記載の方法。 - 【請求項１７】 前記タグが９〜10bpの長さである、請
求項13記載の方法。 - 【請求項１８】 前記タグが13bpの長さである、請求項
13記載の方法。 - 【請求項１９】 第１ｍＲＮＡ分子または該第１ｍＲＮ
Ａ分子由来の第１ｃＤＮＡ分子をデータベース中の既知
配列により同定する方法であって、 第１ｍＲＮＡ分子または第１ｃＤＮＡ分子中の限定され
た位置にある第１ヌクレオチド配列を、データベース中
の第２ヌクレオチド配列に一致させ、ここで、該限定さ
れた位置は第１ｍＲＮＡ分子または第１ｃＤＮＡ分子中
の最も３'側の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の３'側
または最も５'側の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の
５'側であり、 該データベース中の第２ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ分
子またはｃＤＮＡ分子中の該限定された位置にあること
を確認し、それにより、第１ヌクレオチド配列を該デー
タベース中の既知配列により同定する、各ステップを含
む上記方法。 - 【請求項２０】 第１ヌクレオチド配列が６〜７bpの長
さである、請求項19記載の方法。 - 【請求項２１】 第１ヌクレオチド配列が９〜10bpの長
さである、請求項19記載の方法。 - 【請求項２２】 第１ヌクレオチド配列が13bpの長さで
ある、請求項19記載の方法。 - 【請求項２３】 一致させるステップがコンピュータを
使って行なわれる、請求項19記載の方法。 - 【請求項２４】 データベース中に表示されないｃＤＮ
Ａ分子を同定する方法であって、 メッセンジャーＲＮＡ中の予め限定された位置を有する
第１ヌクレオチド配列を予め選択し、 第１ヌクレオチド配列をヌクレオチド配列のデータベー
スと比較し、 第１ヌクレオチド配列に一致しかつｍＲＮＡ中の限定さ
れた位置に存在するヌクレオチド配列が該データベース
中に見出されない場合は、第１ヌクレオチド配列を含む
オリゴヌクレオチドをライブラリー中のｃＤＮＡクロー
ンにハイブリダイズさせ、 第１ヌクレオチド配列が該ｃＤＮＡクローン中の該限定
された位置にあることを確認し、それにより、該データ
ベース中に存在しなかったｃＤＮＡを同定する、各ステ
ップを含む上記方法。
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