JP6836586B2 - びまん性大細胞型b細胞性リンパ腫(dlbcl)を亜型決定するための方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2015年9月29日に出願された米国仮出願第62/234,491号(これは、参考として本明細書に援用される)に対する優先権を主張する。
本明細書において列挙されている核酸配列は、ヌクレオチド塩基については37C.F.R.1.822において定義されている標準の文字略語を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのあらゆる言及によって相補鎖が含まれると理解される。本明細書と共に出願される配列表は参照により組み込まれる(2016年9月1日作成、3.62KB)。提供されている配列中:
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Pressにより出版、1994年(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.より出版、1994年(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.より出版、1995年(ISBN 1−56081−569−8)において見いだすことができる。
DLBCLは、成人における非ホジキンリンパ腫の最も一般的な型である。DLBCLには2種の主要な亜型、胚中心B細胞様(GCB)および非GCB(一般には、活性化B細胞様(ABC))が存在する。GCBには一般に好ましい予後が伴い、ABCまたは非GBCには一般に不良な予後が伴う(例えば、より侵攻的な疾患である)。原発性縦隔B細胞性リンパ腫(PMBCL)は一部の実務者からは別のDLBCLの亜型であると考えられている(Lossos, J. Clin. Oncol.、23巻:6351〜6357頁、2005年)。PMBCLは胸腺において生じ、一般には縦隔内に塊として存在する。DLBCLの非GCB亜型には、GCB亜型以外の全てのDLBCL亜型が含まれる。同様に、DLBCLの非ABC亜型にはABC亜型以外の全てのDLBCL亜型が含まれる。
DLBCLの亜型(例えば、GCBまたは非GCB(例えば、ABC)亜型)を、DLBCLを有する対象由来の試料中の2種またはそれより多い遺伝子(2種またはそれより多いDLBCLシグネチャー遺伝子など)の遺伝子発現に基づいて決定する方法が本明細書に開示されている。一般に、評価された各シグネチャー遺伝子の発現データに値を割り当てる(例えば、所与の試料についての総読み取りのうちの比例的な数量に基づいてまたは数量の割合として表す)。評価されたシグネチャー遺伝子に割り当てられた値に重み付けし、組み合わせてスコア(または確率スコア)をもたらす。次いで、スコアから、カットオフ、閾値、または他の判定基準に基づいてDLBCLの亜型を決定する(例えば、GCBまたは非GCBのコール(call))。
遺伝子発現は、ゲノム(遺伝子)内にコードされている情報が対応する遺伝子産物(例えば、RNAおよびタンパク質)(これらは、相互に関連して機能して、特徴のセット(別称、表現型)を生じさせる)に変換される(例えば、転写および翻訳プロセスによって)プロセスである。本開示の目的に関して、遺伝子発現は、現在公知のまたは今後公知になる任意の技法によって測定することができる。一般に、遺伝子発現は、目的の対象(DLBCLを有する対象など)から収集した試料中の発現された遺伝子の産物(例えば、RNAおよび/またはタンパク質)を検出することによって測定する。したがって、2種またはそれより多いDLBCLシグネチャー遺伝子またはマーカーなどの2種またはそれより多い標的遺伝子の発現を測定することができる。一例では、遺伝子発現を、標的mRNAに特異的に結合する1種または複数のプローブを検出し(例えば、配列決定によって)、mRNA標的に結合したプローブの数(相対的または絶対的)を決定することによって測定する。したがって、検出されるプローブの数が、遺伝子発現の尺度としての機能を果たす。DLBCLマーカー(複数可)の例としては、CD47、CD86、IL16、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの2種またはそれより多く、例えば、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの2種もまたはそれより多く(例えば、全て)が挙げられる。DLBCLマーカー(複数可)の他の具体的な例としては、CD47、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、NF2、PIM1、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの2種もしくはそれより多く(2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種など)(ABC分類に関連付けられる)、またはCD86、ITPKB、LRMP、MME、PTPRC、およびRELの2種もしくはそれより多く(2種、3種、4種、5種、または6種など)(GCB分類に関連付けられる)が挙げられる。開示されている方法を用いて分析することができる対象としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物(例えば、ネコ、イヌ、およびマウスなどの獣医学の対象)が挙げられる。一例では、対象は、腫瘍、例えば、DLBCLなどのリンパ腫を有することが分かっているまたはその疑いがある。
本明細書に開示されている方法における使用に適した試料としては、遺伝子またはタンパク質発現(表1のものなど)に関する情報が望まれる腫瘍(例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、脳および/または脊髄における腫瘍)に由来する細胞(例えば、B細胞)を含有する対象由来の任意の生体試料が挙げられる。試料として、対象から得た試料、例えば、対象(健康なもしくは見たところ健康なヒト対象、または、DLBCL、より詳細にはABCもしくはGCBなどの、診断もしくは調査すべき状態もしくは疾患に罹患したヒト患者に由来する試料を含む)から得た臨床試料などが挙げられる。一例では、対象はDLBCLを有することが分かっているまたは有する疑いがある。例示的な試料は、正常細胞もしくは組織(例えば、対照試料として)から、および/または腫瘍細胞もしくは組織から得ることができる。特定の例では、生体試料として、リンパ腫の細胞を含有する試料などの腫瘍試料が挙げられる。一例では、試料として、mRNAなどのRNAが挙げられる。一部の実施形態では、試料は、以前に、本明細書に記載されている以外の組織学または臨床的方法(例えば、IHCまたはin situハイブリダイゼーション(ISH))によってDLBCLと診断された対象に由来する。
対照試料を開示されている方法と並行して使用することができ、対照試料としては、表1に示されているバイオマーカーの発現と比較する任意の適切な対照試料を挙げることができる。一部の実施形態では、対照試料は、複数の非腫瘍組織試料などの非腫瘍組織である。一例では、非腫瘍組織は、組織学的に正常なリンパ組織などの、良性であることが分かっている組織である。一部の例では、非腫瘍組織は、正常だと思われるリンパ系または骨髄試料を含む、すなわち、細胞異形成または他の公知の疾患(例えば、DLBCLなどのリンパ腫)の指標が存在しない。一部の例では、非腫瘍組織は、リンパ系悪性疾患(DLBCLなど)に近接するまたはさらには遠位の非腫瘍組織などの、同じ対象から得られる。他の例では、非腫瘍組織は、健康な対照対象または数体の健康な対照対象から得られる。例えば、非腫瘍組織は、複数の健康な対照対象(例えば、リンパ腫がん(例えば、DLBCL)を含めたいかなるがんも有さない対象から、例えば、複数のそのような対象由来の正常細胞または組織(例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、脳および/または脊髄に由来する)を含有する試料から得ることができる。一部の実施形態では、表1に示されているバイオマーカーの発現レベルについての参照(例えば、正常対照)値または値の範囲を得るために、1種または複数(例えば、複数の)対照試料を使用する。一部の実施形態では、対照試料から得る参照値は、母集団中心傾向(population central tendency)(平均(mean)、中央値または平均値(average)など)、または母集団中心傾向の周囲±0.5、1.0、1.5もしくは2.0標準偏差(複数可)などの値の参照範囲であってよい。
一部の方法の実施形態では、固定された試料(例えば、FFPE組織試料)を使用する。固定技法は、場所ごと、国ごと、研究者ごとなどで変動し得(Dissecting the Molecular Anatomy of Tissue、Emmert−Buck、GillespieおよびChuaqui編、New York: Springer−Verlag、244頁(2010年))、検出しようとする遺伝子産物(複数可)の完全性および/またはそれへの接近可能性に影響を及ぼす可能性がある。一部のそのような方法(例えば、PCRを伴う)では、RNA回収(例えば、可逆的な架橋結合剤、エタノールに基づく固定液および/またはRNA抽出もしくは精製(全体的にまたは部分的に)を使用)が有利であり得、一方、他の代表的な方法(例えば、qNPAまたはqNPSを伴う)では、RNA回収は任意選択であるまたはRNA回収は特に必要ない。同様に、固定された組織からタンパク質遺伝子産物を回収し、それにより、そのようなタンパク質産物の検出を補助するために、組織前処理(tissue conditioning)を使用することができる。
本明細書に開示されている革新の中には、DLBCLの亜型を区別するために有用な遺伝子(バイオマーカーとも称される)および遺伝子のセット(遺伝子シグネチャーとも称される)がある。特定の実施形態では、ABC DLBCLおよびGCB DLBCLの亜型決定するための遺伝子および遺伝子セットが開示されている(表1参照)。そのような遺伝子および遺伝子のセットの発現は、DLBCLの分類指標およびアルゴリズムにおいて、ならびに/またはアレイもしくは他の開示されている組成物に対する、分析物に特異的な試薬(例えば、核酸プローブまたは抗体)を設計するために有用である。
A.DLBCLシグネチャー遺伝子
a.CD47、CD86、IL16、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの1種または複数(例えば、少なくともまたはそれに固定して、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種);
b.CD47、CD86、IL16、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの全て;
c.CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの1種または複数(例えば、少なくともまたはそれに固定して、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、または16種);
d.CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの1種または複数(例えば、少なくともまたはそれに固定して、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種);
e.CD86、ITPKB、LRMP、MME、PTPRC、およびRELの1種または複数(例えば、少なくともまたはそれに固定して、2種、3種、4種、5種、または6種);
f.以下の2種の遺伝子の組み合わせの任意の1つまたは任意の2つ(重複しない範囲で)を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット:{CD47、CD86}{CD47、IL16}{CD47、NF2}{CD47、PIM1}{CD47、PTPRC}{CD47、REL}{CD47、STAT3}{CD47、TNFRSF8}{CD47、TYMS}{CD86、IL16}{CD86、NF2}{CD86、PIM1}{CD86、PTPRC}{CD86、REL}{CD86、STAT3}{CD86、TNFRSF8}{CD86、TYMS}{IL16、NF2}{IL16、PIM1}{IL16、PTPRC}{IL16、REL}{IL16、STAT3}{IL16、TNFRSF8}{IL16、TYMS}{NF2、PIM1}{NF2、PTPRC}{NF2、REL}{NF2、STAT3}{NF2、TNFRSF8}{NF2、TYMS}{PIM1、PTPRC}{PIM1、REL}{PIM1、STAT3}{PIM1、TNFRSF8}{PIM1、TYMS}{PTPRC、REL}{PTPRC、STAT3}{PTPRC、TNFRSF8}{PTPRC、TYMS}{REL、STAT3}{REL、TNFRSF8}{REL、TYMS}{STAT3、TNFRSF8}{STAT3、TYMS}{TNFRSF8、TYMS};
g.以下の3種の遺伝子の組み合わせの任意の1つまたは任意の2つ(重複しない範囲で)を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット:{CD47、CD86、IL16}{CD47、CD86、NF2}{CD47、CD86、PIM1}{CD47、CD86、PTPRC}{CD47、CD86、REL}{CD47、CD86、STAT3}{CD47、CD86、TNFRSF8}{CD47、CD86、TYMS}{CD47、IL16、NF2}{CD47、IL16、PIM1}{CD47、IL16、PTPRC}{CD47、IL16、REL}{CD47、IL16、STAT3}{CD47、IL16、TNFRSF8}{CD47、IL16、TYMS}{CD47、NF2、PIM1}{CD47、NF2、PTPRC}{CD47、NF2、REL}{CD47、NF2、STAT3}{CD47、NF2、TNFRSF8}{CD47、NF2、TYMS}{CD47、PIM1、PTPRC}{CD47、PIM1、REL}{CD47、PIM1、STAT3}{CD47、PIM1、TNFRSF8}{CD47、PIM1、TYMS}{CD47、PTPRC、REL}{CD47、PTPRC、STAT3}{CD47、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、PTPRC、TYMS}{CD47、REL、STAT3}{CD47、REL、TNFRSF8}{CD47、REL、TYMS}{CD47、STAT3、TNFRSF8}{CD47、STAT3、TYMS}{CD47、TNFRSF8、TYMS}{CD86、IL16、NF2}{CD86、IL16、PIM1}{CD86、IL16、PTPRC}{CD86、IL16、REL}{CD86、IL16、STAT3}{CD86、IL16、TNFRSF8}{CD86、IL16、TYMS}{CD86、NF2、PIM1}{CD86、NF2、PTPRC}{CD86、NF2、REL}{CD86、NF2、STAT3}{CD86、NF2、TNFRSF8}{CD86、NF2、TYMS}{CD86、PIM1、PTPRC}{CD86、PIM1、REL}{CD86、PIM1、STAT3}{CD86、PIM1、TNFRSF8}{CD86、PIM1、TYMS}{CD86、PTPRC、REL}{CD86、PTPRC、STAT3}{CD86、PTPRC、TNFRSF8}{CD86、PTPRC、TYMS}{CD86、REL、STAT3}{CD86、REL、TNFRSF8}{CD86、REL、TYMS}{CD86、STAT3、TNFRSF8}{CD86、STAT3、TYMS}{CD86、TNFRSF8、TYMS}{IL16、NF2、PIM1}{IL16、NF2、PTPRC}{IL16、NF2、REL}{IL16、NF2、STAT3}{IL16、NF2、TNFRSF8}{IL16、NF2、TYMS}{IL16、PIM1、PTPRC}{IL16、PIM1、REL}{IL16、PIM1、STAT3}{IL16、PIM1、TNFRSF8}{IL16、PIM1、TYMS}{IL16、PTPRC、REL}{IL16、PTPRC、STAT3}{IL16、PTPRC、TNFRSF8}{IL16、PTPRC、TYMS}{IL16、REL、STAT3}{IL16、REL、TNFRSF8}{IL16、REL、TYMS}{IL16、STAT3、TNFRSF8}{IL16、STAT3、TYMS}{IL16、TNFRSF8、TYMS}{NF2、PIM1、PTPRC}{NF2、PIM1、REL}{NF2、PIM1、STAT3}{NF2、PIM1、TNFRSF8}{NF2、PIM1、TYMS}{NF2、PTPRC、REL}{NF2、PTPRC、STAT3}{NF2、PTPRC、TNFRSF8}{NF2、PTPRC、TYMS}{NF2、REL、STAT3}{NF2、REL、TNFRSF8}{NF2、REL、TYMS}{NF2、STAT3、TNFRSF8}{NF2、STAT3、TYMS}{NF2、TNFRSF8、TYMS}{PIM1、PTPRC、REL}{PIM1、PTPRC、STAT3}{PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{PIM1、PTPRC、TYMS}{PIM1、REL、STAT3}{PIM1、REL、TNFRSF8}{PIM1、REL、TYMS}{PIM1、STAT3、TNFRSF8}{PIM1、STAT3、TYMS}{PIM1、TNFRSF8、TYMS}{PTPRC、REL、STAT3}{PTPRC、REL、TNFRSF8}{PTPRC、REL、TYMS}{PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{PTPRC、STAT3、TYMS}{PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{REL、STAT3、TNFRSF8}{REL、STAT3、TYMS}{REL、TNFRSF8、TYMS}{STAT3、TNFRSF8、TYMS;
h.以下の4種の遺伝子の組み合わせの任意の1つまたは任意の2つ(重複しない範囲で)を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット:{CD47、CD86、IL16、NF2}{CD47、CD86、IL16、PIM1}{CD47、CD86、IL16、PTPRC}{CD47、CD86、IL16、REL}{CD47、CD86、IL16、STAT3}{CD47、CD86、IL16、TNFRSF8}{CD47、CD86、IL16、TYMS}{CD47、CD86、NF2、PIM1}{CD47、CD86、NF2、PTPRC}{CD47、CD86、NF2、REL}{CD47、CD86、NF2、STAT3}{CD47、CD86、NF2、TNFRSF8}{CD47、CD86、NF2、TYMS}{CD47、CD86、PIM1、PTPRC}{CD47、CD86、PIM1、REL}{CD47、CD86、PIM1、STAT3}{CD47、CD86、PIM1、TNFRSF8}{CD47、CD86、PIM1、TYMS}{CD47、CD86、PTPRC、REL}{CD47、CD86、PTPRC、STAT3}{CD47、CD86、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、CD86、PTPRC、TYMS}{CD47、CD86、REL、STAT3}{CD47、CD86、REL、TNFRSF8}{CD47、CD86、REL、TYMS}{CD47、CD86、STAT3、TNFRSF8}{CD47、CD86、STAT3、TYMS}{CD47、CD86、TNFRSF8、TYMS}{CD47、IL16、NF2、PIM1}{CD47、IL16、NF2、PTPRC}{CD47、IL16、NF2、REL}{CD47、IL16、NF2、STAT3}{CD47、IL16、NF2、TNFRSF8}{CD47、IL16、NF2、TYMS}{CD47、IL16、PIM1、PTPRC}{CD47、IL16、PIM1、REL}{CD47、IL16、PIM1、STAT3}{CD47、IL16、PIM1、TNFRSF8}{CD47、IL16、PIM1、TYMS}{CD47、IL16、PTPRC、REL}{CD47、IL16、PTPRC、STAT3}{CD47、IL16、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、IL16、PTPRC、TYMS}{CD47、IL16、REL、STAT3}{CD47、IL16、REL、TNFRSF8}{CD47、IL16、REL、TYMS}{CD47、IL16、STAT3、TNFRSF8}{CD47、IL16、STAT3、TYMS}{CD47、IL16、TNFRSF8、TYMS}{CD47、NF2、PIM1、PTPRC}{CD47、NF2、PIM1、REL}{CD47、NF2、PIM1、STAT3}{CD47、NF2、PIM1、TNFRSF8}{CD47、NF2、PIM1、TYMS}{CD47、NF2、PTPRC、REL}{CD47、NF2、PTPRC、STAT3}{CD47、NF2、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、NF2、PTPRC、TYMS}{CD47、NF2、REL、STAT3}{CD47、NF2、REL、TNFRSF8}{CD47、NF2、REL、TYMS}{CD47、NF2、STAT3、TNFRSF8}{CD47、NF2、STAT3、TYMS}{CD47、NF2、TNFRSF8、TYMS}{CD47、PIM1、PTPRC、REL}{CD47、PIM1、PTPRC、STAT3}{CD47、PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、PIM1、PTPRC、TYMS}{CD47、PIM1、REL、STAT3}{CD47、PIM1、REL、TNFRSF8}{CD47、PIM1、REL、TYMS}{CD47、PIM1、STAT3、TNFRSF8}{CD47、PIM1、STAT3、TYMS}{CD47、PIM1、TNFRSF8、TYMS}{CD47、PTPRC、REL、STAT3}{CD47、PTPRC、REL、TNFRSF8}{CD47、PTPRC、REL、TYMS}{CD47、PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{CD47、PTPRC、STAT3、TYMS}{CD47、PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{CD47、REL、STAT3、TNFRSF8}{CD47、REL、STAT3、TYMS}{CD47、REL、TNFRSF8、TYMS}{CD47、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{CD86、IL16、NF2、PIM1}{CD86、IL16、NF2、PTPRC}{CD86、IL16、NF2、REL}{CD86、IL16、NF2、STAT3}{CD86、IL16、NF2、TNFRSF8}{CD86、IL16、NF2、TYMS}{CD86、IL16、PIM1、PTPRC}{CD86、IL16、PIM1、REL}{CD86、IL16、PIM1、STAT3}{CD86、IL16、PIM1、TNFRSF8}{CD86、IL16、PIM1、TYMS}{CD86、IL16、PTPRC、REL}{CD86、IL16、PTPRC、STAT3}{CD86、IL16、PTPRC、TNFRSF8}{CD86、IL16、PTPRC、TYMS}{CD86、IL16、REL、STAT3}{CD86、IL16、REL、TNFRSF8}{CD86、IL16、REL、TYMS}{CD86、IL16、STAT3、TNFRSF8}{CD86、IL16、STAT3、TYMS}{CD86、IL16、TNFRSF8、TYMS}{CD86、NF2、PIM1、PTPRC}{CD86、NF2、PIM1、REL}{CD86、NF2、PIM1、STAT3}{CD86、NF2、PIM1、TNFRSF8}{CD86、NF2、PIM1、TYMS}{CD86、NF2、PTPRC、REL}{CD86、NF2、PTPRC、STAT3}{CD86、NF2、PTPRC、TNFRSF8}{CD86、NF2、PTPRC、TYMS}{CD86、NF2、REL、STAT3}{CD86、NF2、REL、TNFRSF8}{CD86、NF2、REL、TYMS}{CD86、NF2、STAT3、TNFRSF8}{CD86、NF2、STAT3、TYMS}{CD86、NF2、TNFRSF8、TYMS}{CD86、PIM1、PTPRC、REL}{CD86、PIM1、PTPRC、STAT3}{CD86、PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{CD86、PIM1、PTPRC、TYMS}{CD86、PIM1、REL、STAT3}{CD86、PIM1、REL、TNFRSF8}{CD86、PIM1、REL、TYMS}{CD86、PIM1、STAT3、TNFRSF8}{CD86、PIM1、STAT3、TYMS}{CD86、PIM1、TNFRSF8、TYMS}{CD86、PTPRC、REL、STAT3}{CD86、PTPRC、REL、TNFRSF8}{CD86、PTPRC、REL、TYMS}{CD86、PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{CD86、PTPRC、STAT3、TYMS}{CD86、PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{CD86、REL、STAT3、TNFRSF8}{CD86、REL、STAT3、TYMS}{CD86、REL、TNFRSF8、TYMS}{CD86、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{IL16、NF2、PIM1、PTPRC}{IL16、NF2、PIM1、REL}{IL16、NF2、PIM1、STAT3}{IL16、NF2、PIM1、TNFRSF8}{IL16、NF2、PIM1、TYMS}{IL16、NF2、PTPRC、REL}{IL16、NF2、PTPRC、STAT3}{IL16、NF2、PTPRC、TNFRSF8}{IL16、NF2、PTPRC、TYMS}{IL16、NF2、REL、STAT3}{IL16、NF2、REL、TNFRSF8}{IL16、NF2、REL、TYMS}{IL16、NF2、STAT3、TNFRSF8}{IL16、NF2、STAT3、TYMS}{IL16、NF2、TNFRSF8、TYMS}{IL16、PIM1、PTPRC、REL}{IL16、PIM1、PTPRC、STAT3}{IL16、PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{IL16、PIM1、PTPRC、TYMS}{IL16、PIM1、REL、STAT3}{IL16、PIM1、REL、TNFRSF8}{IL16、PIM1、REL、TYMS}{IL16、PIM1、STAT3、TNFRSF8}{IL16、PIM1、STAT3、TYMS}{IL16、PIM1、TNFRSF8、TYMS}{IL16、PTPRC、REL、STAT3}{IL16、PTPRC、REL、TNFRSF8}{IL16、PTPRC、REL、TYMS}{IL16、PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{IL16、PTPRC、STAT3、TYMS}{IL16、PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{IL16、REL、STAT3、TNFRSF8}{IL16、REL、STAT3、TYMS}{IL16、REL、TNFRSF8、TYMS}{IL16、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{NF2、PIM1、PTPRC、REL}{NF2、PIM1、PTPRC、STAT3}{NF2、PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{NF2、PIM1、PTPRC、TYMS}{NF2、PIM1、REL、STAT3}{NF2、PIM1、REL、TNFRSF8}{NF2、PIM1、REL、TYMS}{NF2、PIM1、STAT3、TNFRSF8}{NF2、PIM1、STAT3、TYMS}{NF2、PIM1、TNFRSF8、TYMS}{NF2、PTPRC、REL、STAT3}{NF2、PTPRC、REL、TNFRSF8}{NF2、PTPRC、REL、TYMS}{NF2、PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{NF2、PTPRC、STAT3、TYMS}{NF2、PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{NF2、REL、STAT3、TNFRSF8}{NF2、REL、STAT3、TYMS}{NF2、REL、TNFRSF8、TYMS}{NF2、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{PIM1、PTPRC、REL、STAT3}{PIM1、PTPRC、REL、TNFRSF8}{PIM1、PTPRC、REL、TYMS}{PIM1、PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{PIM1、PTPRC、STAT3、TYMS}{PIM1、PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{PIM1、REL、STAT3、TNFRSF8}{PIM1、REL、STAT3、TYMS}{PIM1、REL、TNFRSF8、TYMS}{PIM1、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8}{PTPRC、REL、STAT3、TYMS}{PTPRC、REL、TNFRSF8、TYMS}{PTPRC、STAT3、TNFRSF8、TYMS}{REL、STAT3、TNFRSF8、TYMS};
i.以下の2種の遺伝子の組み合わせの任意の1つまたは任意の2つ(重複しない範囲で)を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット:{CD47、CD86}{CD47、ENTPD1}{CD47、FOXP1}{CD47、FUT8}{CD47、IL16}{CD47、ITPKB}{CD47、LRMP}{CD47、MME}{CD47、NF2}{CD47、PIM1}{CD47、PTPRC}{CD47、REL}{CD47、STAT3}{CD47、TNFRSF8}{CD47、TYMS}{CD86、ENTPD1}{CD86、FOXP1}{CD86、FUT8}{CD86、IL16}{CD86、ITPKB}{CD86、LRMP}{CD86、MME}{CD86、NF2}{CD86、PIM1}{CD86、PTPRC}{CD86、REL}{CD86、STAT3}{CD86、TNFRSF8}{CD86、TYMS}{ENTPD1、FOXP1}{ENTPD1、FUT8}{ENTPD1、IL16}{ENTPD1、ITPKB}{ENTPD1、LRMP}{ENTPD1、MME}{ENTPD1、NF2}{ENTPD1、PIM1}{ENTPD1、PTPRC}{ENTPD1、REL}{ENTPD1、STAT3}{ENTPD1、TNFRSF8}{ENTPD1、TYMS}{FOXP1、FUT8}{FOXP1、IL16}{FOXP1、ITPKB}{FOXP1、LRMP}{FOXP1、MME}{FOXP1、NF2}{FOXP1、PIM1}{FOXP1、PTPRC}{FOXP1、REL}{FOXP1、STAT3}{FOXP1、TNFRSF8}{FOXP1、TYMS}{FUT8、IL16}{FUT8、ITPKB}{FUT8、LRMP}{FUT8、MME}{FUT8、NF2}{FUT8、PIM1}{FUT8、PTPRC}{FUT8、REL}{FUT8、STAT3}{FUT8、TNFRSF8}{FUT8、TYMS}{IL16、ITPKB}{IL16、LRMP}{IL16、MME}{IL16、NF2}{IL16、PIM1}{IL16、PTPRC}{IL16、REL}{IL16、STAT3}{IL16、TNFRSF8}{IL16、TYMS}{ITPKB、LRMP}{ITPKB、MME}{ITPKB、NF2}{ITPKB、PIM1}{ITPKB、PTPRC}{ITPKB、REL}{ITPKB、STAT3}{ITPKB、TNFRSF8}{ITPKB、TYMS}{LRMP、MME}{LRMP、NF2}{LRMP、PIM1}{LRMP、PTPRC}{LRMP、REL}{LRMP、STAT3}{LRMP、TNFRSF8}{LRMP、TYMS}{MME、NF2}{MME、PIM1}{MME、PTPRC}{MME、REL}{MME、STAT3}{MME、TNFRSF8}{MME、TYMS}{NF2、PIM1}{NF2、PTPRC}{NF2、REL}{NF2、STAT3}{NF2、TNFRSF8}{NF2、TYMS}{PIM1、PTPRC}{PIM1、REL}{PIM1、STAT3}{PIM1、TNFRSF8}{PIM1、TYMS}{PTPRC、REL}{PTPRC、STAT3}{PTPRC、TNFRSF8}{PTPRC、TYMS}{REL、STAT3}{REL、TNFRSF8}{REL、TYMS}{STAT3、TNFRSF8}{STAT3、TYMS}{TNFRSF8、TYMS};ならびに
j.以下の3種の遺伝子の組み合わせの任意の1つまたは任意の2つ(重複しない範囲で)を含む、またはそれからなる任意の遺伝子セット:{CD47、CD86、ENTPD1}{CD47、CD86、FOXP1}{CD47、CD86、FUT8}{CD47、CD86、IL16}{CD47、CD86、ITPKB}{CD47、CD86、LRMP}{CD47、CD86、MME}{CD47、CD86、NF2}{CD47、CD86、PIM1}{CD47、CD86、PTPRC}{CD47、CD86、REL}{CD47、CD86、STAT3}{CD47、CD86、TNFRSF8}{CD47、CD86、TYMS}{CD47、ENTPD1、FOXP1}{CD47、ENTPD1、FUT8}{CD47、ENTPD1、IL16}{CD47、ENTPD1、ITPKB}{CD47、ENTPD1、LRMP}{CD47、ENTPD1、MME}{CD47、ENTPD1、NF2}{CD47、ENTPD1、PIM1}{CD47、ENTPD1、PTPRC}{CD47、ENTPD1、REL}{CD47、ENTPD1、STAT3}{CD47、ENTPD1、TNFRSF8}{CD47、ENTPD1、TYMS}{CD47、FOXP1、FUT8}{CD47、FOXP1、IL16}{CD47、FOXP1、ITPKB}{CD47、FOXP1、LRMP}{CD47、FOXP1、MME}{CD47、FOXP1、NF2}{CD47、FOXP1、PIM1}{CD47、FOXP1、PTPRC}{CD47、FOXP1、REL}{CD47、FOXP1、STAT3}{CD47、FOXP1、TNFRSF8}{CD47、FOXP1、TYMS}{CD47、FUT8、IL16}{CD47、FUT8、ITPKB}{CD47、FUT8、LRMP}{CD47、FUT8、MME}{CD47、FUT8、NF2}{CD47、FUT8、PIM1}{CD47、FUT8、PTPRC}{CD47、FUT8、REL}{CD47、FUT8、STAT3}{CD47、FUT8、TNFRSF8}{CD47、FUT8、TYMS}{CD47、IL16、ITPKB}{CD47、IL16、LRMP}{CD47、IL16、MME}{CD47、IL16、NF2}{CD47、IL16、PIM1}{CD47、IL16、PTPRC}{CD47、IL16、REL}{CD47、IL16、STAT3}{CD47、IL16、TNFRSF8}{CD47、IL16、TYMS}{CD47、ITPKB、LRMP}{CD47、ITPKB、MME}{CD47、ITPKB、NF2}{CD47、ITPKB、PIM1}{CD47、ITPKB、PTPRC}{CD47、ITPKB、REL}{CD47、ITPKB、STAT3}{CD47、ITPKB、TNFRSF8}{CD47、ITPKB、TYMS}{CD47、LRMP、MME}{CD47、LRMP、NF2}{CD47、LRMP、PIM1}{CD47、LRMP、PTPRC}{CD47、LRMP、REL}{CD47、LRMP、STAT3}{CD47、LRMP、TNFRSF8}{CD47、LRMP、TYMS}{CD47、MME、NF2}{CD47、MME、PIM1}{CD47、MME、PTPRC}{CD47、MME、REL}{CD47、MME、STAT3}{CD47、MME、TNFRSF8}{CD47、MME、TYMS}{CD47、NF2、PIM1}{CD47、NF2、PTPRC}{CD47、NF2、REL}{CD47、NF2、STAT3}{CD47、NF2、TNFRSF8}{CD47、NF2、TYMS}{CD47、PIM1、PTPRC}{CD47、PIM1、REL}{CD47、PIM1、STAT3}{CD47、PIM1、TNFRSF8}{CD47、PIM1、TYMS}{CD47、PTPRC、REL}{CD47、PTPRC、STAT3}{CD47、PTPRC、TNFRSF8}{CD47、PTPRC、TYMS}{CD47、REL、STAT3}{CD47、REL、TNFRSF8}{CD47、REL、TYMS}{CD47、STAT3、TNFRSF8}{CD47、STAT3、TYMS}{CD47、TNFRSF8、TYMS}{CD86、ENTPD1、FOXP1}{CD86、ENTPD1、FUT8}{CD86、ENTPD1、IL16}{CD86、ENTPD1、ITPKB}{CD86、ENTPD1、LRMP}{CD86、ENTPD1、MME}{CD86、ENTPD1、NF2}{CD86、ENTPD1、PIM1}{CD86、ENTPD1、PTPRC}{CD86、ENTPD1、REL}{CD86、ENTPD1、STAT3}{CD86、ENTPD1、TNFRSF8}{CD86、ENTPD1、TYMS}{CD86、FOXP1、FUT8}{CD86、FOXP1、IL16}{CD86、FOXP1、ITPKB}{CD86、FOXP1、LRMP}{CD86、FOXP1、MME}{CD86、FOXP1、NF2}{CD86、FOXP1、PIM1}{CD86、FOXP1、PTPRC}{CD86、FOXP1、REL}{CD86、FOXP1、STAT3}{CD86、FOXP1、TNFRSF8}{CD86、FOXP1、TYMS}{CD86、FUT8、IL16}{CD86、FUT8、ITPKB}{CD86、FUT8、LRMP}{CD86、FUT8、MME}{CD86、FUT8、NF2}{CD86、FUT8、PIM1}{CD86、FUT8、PTPRC}{CD86、FUT8、REL}{CD86、FUT8、STAT3}{CD86、FUT8、TNFRSF8}{CD86、FUT8、TYMS}{CD86、IL16、ITPKB}{CD86、IL16、LRMP}{CD86、IL16、MME}{CD86、IL16、NF2}{CD86、IL16、PIM1}{CD86、IL16、PTPRC}{CD86、IL16、REL}{CD86、IL16、STAT3}{CD86、IL16、TNFRSF8}{CD86、IL16、TYMS}{CD86、ITPKB、LRMP}{CD86、ITPKB、MME}{CD86、ITPKB、NF2}{CD86、ITPKB、PIM1}{CD86、ITPKB、PTPRC}{CD86、ITPKB、REL}{CD86、ITPKB、STAT3}{CD86、ITPKB、TNFRSF8}{CD86、ITPKB、TYMS}{CD86、LRMP、MME}{CD86、LRMP、NF2}{CD86、LRMP、PIM1}{CD86、LRMP、PTPRC}{CD86、LRMP、REL}{CD86、LRMP、STAT3}{CD86、LRMP、TNFRSF8}{CD86、LRMP、TYMS}{CD86、MME、NF2}{CD86、MME、PIM1}{CD86、MME、PTPRC}{CD86、MME、REL}{CD86、MME、STAT3}{CD86、MME、TNFRSF8}{CD86、MME、TYMS}{CD86、NF2、PIM1}{CD86、NF2、PTPRC}{CD86、NF2、REL}{CD86、NF2、STAT3}{CD86、NF2、TNFRSF8}{CD86、NF2、TYMS}{CD86、PIM1、PTPRC}{CD86、PIM1、REL}{CD86、PIM1、STAT3}{CD86、PIM1、TNFRSF8}{CD86、PIM1、TYMS}{CD86、PTPRC、REL}{CD86、PTPRC、STAT3}{CD86、PTPRC、TNFRSF8}{CD86、PTPRC、TYMS}{CD86、REL、STAT3}{CD86、REL、TNFRSF8}{CD86、REL、TYMS}{CD86、STAT3、TNFRSF8}{CD86、STAT3、TYMS}{CD86、TNFRSF8、TYMS}{ENTPD1、FOXP1、FUT8}{ENTPD1、FOXP1、IL16}{ENTPD1、FOXP1、ITPKB}{ENTPD1、FOXP1、LRMP}{ENTPD1、FOXP1、MME}{ENTPD1、FOXP1、NF2}{ENTPD1、FOXP1、PIM1}{ENTPD1、FOXP1、PTPRC}{ENTPD1、FOXP1、REL}{ENTPD1、FOXP1、STAT3}{ENTPD1、FOXP1、TNFRSF8}{ENTPD1、FOXP1、TYMS}{ENTPD1、FUT8、IL16}{ENTPD1、FUT8、ITPKB}{ENTPD1、FUT8、LRMP}{ENTPD1、FUT8、MME}{ENTPD1、FUT8、NF2}{ENTPD1、FUT8、PIM1}{ENTPD1、FUT8、PTPRC}{ENTPD1、FUT8、REL}{ENTPD1、FUT8、STAT3}{ENTPD1、FUT8、TNFRSF8}{ENTPD1、FUT8、TYMS}{ENTPD1、IL16、ITPKB}{ENTPD1、IL16、LRMP}{ENTPD1、IL16、MME}{ENTPD1、IL16、NF2}{ENTPD1、IL16、PIM1}{ENTPD1、IL16、PTPRC}{ENTPD1、IL16、REL}{ENTPD1、IL16、STAT3}{ENTPD1、IL16、TNFRSF8}{ENTPD1、IL16、TYMS}{ENTPD1、ITPKB、LRMP}{ENTPD1、ITPKB、MME}{ENTPD1、ITPKB、NF2}{ENTPD1、ITPKB、PIM1}{ENTPD1、ITPKB、PTPRC}{ENTPD1、ITPKB、REL}{ENTPD1、ITPKB、STAT3}{ENTPD1、ITPKB、TNFRSF8}{ENTPD1、ITPKB、TYMS}{ENTPD1、LRMP、MME}{ENTPD1、LRMP、NF2}{ENTPD1、LRMP、PIM1}{ENTPD1、LRMP、PTPRC}{ENTPD1、LRMP、REL}{ENTPD1、LRMP、STAT3}{ENTPD1、LRMP、TNFRSF8}{ENTPD1、LRMP、TYMS}{ENTPD1、MME、NF2}{ENTPD1、MME、PIM1}{ENTPD1、MME、PTPRC}{ENTPD1、MME、REL}{ENTPD1、MME、STAT3}{ENTPD1、MME、TNFRSF8}{ENTPD1、MME、TYMS}{ENTPD1、NF2、PIM1}{ENTPD1、NF2、PTPRC}{ENTPD1、NF2、REL}{ENTPD1、NF2、STAT3}{ENTPD1、NF2、TNFRSF8}{ENTPD1、NF2、TYMS}{ENTPD1、PIM1、PTPRC}{ENTPD1、PIM1、REL}{ENTPD1、PIM1、STAT3}{ENTPD1、PIM1、TNFRSF8}{ENTPD1、PIM1、TYMS}{ENTPD1、PTPRC、REL}{ENTPD1、PTPRC、STAT3}{ENTPD1、PTPRC、TNFRSF8}{ENTPD1、PTPRC、TYMS}{ENTPD1、REL、STAT3}{ENTPD1、REL、TNFRSF8}{ENTPD1、REL、TYMS}{ENTPD1、STAT3、TNFRSF8}{ENTPD1、STAT3、TYMS}{ENTPD1、TNFRSF8、TYMS}{FOXP1、FUT8、IL16}{FOXP1、FUT8、ITPKB}{FOXP1、FUT8、LRMP}{FOXP1、FUT8、MME}{FOXP1、FUT8、NF2}{FOXP1、FUT8、PIM1}{FOXP1、FUT8、PTPRC}{FOXP1、FUT8、REL}{FOXP1、FUT8、STAT3}{FOXP1、FUT8、TNFRSF8}{FOXP1、FUT8、TYMS}{FOXP1、IL16、ITPKB}{FOXP1、IL16、LRMP}{FOXP1、IL16、MME}{FOXP1、IL16、NF2}{FOXP1、IL16、PIM1}{FOXP1、IL16、PTPRC}{FOXP1、IL16、RE
L}{FOXP1、IL16、STAT3}{FOXP1、IL16、TNFRSF8}{FOXP1、IL16、TYMS}{FOXP1、ITPKB、LRMP}{FOXP1、ITPKB、MME}{FOXP1、ITPKB、NF2}{FOXP1、ITPKB、PIM1}{FOXP1、ITPKB、PTPRC}{FOXP1、ITPKB、REL}{FOXP1、ITPKB、STAT3}{FOXP1、ITPKB、TNFRSF8}{FOXP1、ITPKB、TYMS}{FOXP1、LRMP、MME}{FOXP1、LRMP、NF2}{FOXP1、LRMP、PIM1}{FOXP1、LRMP、PTPRC}{FOXP1、LRMP、REL}{FOXP1、LRMP、STAT3}{FOXP1、LRMP、TNFRSF8}{FOXP1、LRMP、TYMS}{FOXP1、MME、NF2}{FOXP1、MME、PIM1}{FOXP1、MME、PTPRC}{FOXP1、MME、REL}{FOXP1、MME、STAT3}{FOXP1、MME、TNFRSF8}{FOXP1、MME、TYMS}{FOXP1、NF2、PIM1}{FOXP1、NF2、PTPRC}{FOXP1、NF2、REL}{FOXP1、NF2、STAT3}{FOXP1、NF2、TNFRSF8}{FOXP1、NF2、TYMS}{FOXP1、PIM1、PTPRC}{FOXP1、PIM1、REL}{FOXP1、PIM1、STAT3}{FOXP1、PIM1、TNFRSF8}{FOXP1、PIM1、TYMS}{FOXP1、PTPRC、REL}{FOXP1、PTPRC、STAT3}{FOXP1、PTPRC、TNFRSF8}{FOXP1、PTPRC、TYMS}{FOXP1、REL、STAT3}{FOXP1、REL、TNFRSF8}{FOXP1、REL、TYMS}{FOXP1、STAT3、TNFRSF8}{FOXP1、STAT3、TYMS}{FOXP1、TNFRSF8、TYMS}{FUT8、IL16、ITPKB}{FUT8、IL16、LRMP}{FUT8、IL16、MME}{FUT8、IL16、NF2}{FUT8、IL16、PIM1}{FUT8、IL16、PTPRC}{FUT8、IL16、REL}{FUT8、IL16、STAT3}{FUT8、IL16、TNFRSF8}{FUT8、IL16、TYMS}{FUT8、ITPKB、LRMP}{FUT8、ITPKB、MME}{FUT8、ITPKB、NF2}{FUT8、ITPKB、PIM1}{FUT8、ITPKB、PTPRC}{FUT8、ITPKB、REL}{FUT8、ITPKB、STAT3}{FUT8、ITPKB、TNFRSF8}{FUT8、ITPKB、TYMS}{FUT8、LRMP、MME}{FUT8、LRMP、NF2}{FUT8、LRMP、PIM1}{FUT8、LRMP、PTPRC}{FUT8、LRMP、REL}{FUT8、LRMP、STAT3}{FUT8、LRMP、TNFRSF8}{FUT8、LRMP、TYMS}{FUT8、MME、NF2}{FUT8、MME、PIM1}{FUT8、MME、PTPRC}{FUT8、MME、REL}{FUT8、MME、STAT3}{FUT8、MME、TNFRSF8}{FUT8、MME、TYMS}{FUT8、NF2、PIM1}{FUT8、NF2、PTPRC}{FUT8、NF2、REL}{FUT8、NF2、STAT3}{FUT8、NF2、TNFRSF8}{FUT8、NF2、TYMS}{FUT8、PIM1、PTPRC}{FUT8、PIM1、REL}{FUT8、PIM1、STAT3}{FUT8、PIM1、TNFRSF8}{FUT8、PIM1、TYMS}{FUT8、PTPRC、REL}{FUT8、PTPRC、STAT3}{FUT8、PTPRC、TNFRSF8}{FUT8、PTPRC、TYMS}{FUT8、REL、STAT3}{FUT8、REL、TNFRSF8}{FUT8、REL、TYMS}{FUT8、STAT3、TNFRSF8}{FUT8、STAT3、TYMS}{FUT8、TNFRSF8、TYMS}{IL16、ITPKB、LRMP}{IL16、ITPKB、MME}{IL16、ITPKB、NF2}{IL16、ITPKB、PIM1}{IL16、ITPKB、PTPRC}{IL16、ITPKB、REL}{IL16、ITPKB、STAT3}{IL16、ITPKB、TNFRSF8}{IL16、ITPKB、TYMS}{IL16、LRMP、MME}{IL16、LRMP、NF2}{IL16、LRMP、PIM1}{IL16、LRMP、PTPRC}{IL16、LRMP、REL}{IL16、LRMP、STAT3}{IL16、LRMP、TNFRSF8}{IL16、LRMP、TYMS}{IL16、MME、NF2}{IL16、MME、PIM1}{IL16、MME、PTPRC}{IL16、MME、REL}{IL16、MME、STAT3}{IL16、MME、TNFRSF8}{IL16、MME、TYMS}{IL16、NF2、PIM1}{IL16、NF2、PTPRC}{IL16、NF2、REL}{IL16、NF2、STAT3}{IL16、NF2、TNFRSF8}{IL16、NF2、TYMS}{IL16、PIM1、PTPRC}{IL16、PIM1、REL}{IL16、PIM1、STAT3}{IL16、PIM1、TNFRSF8}{IL16、PIM1、TYMS}{IL16、PTPRC、REL}{IL16、PTPRC、STAT3}{IL16、PTPRC、TNFRSF8}{IL16、PTPRC、TYMS}{IL16、REL、STAT3}{IL16、REL、TNFRSF8}{IL16、REL、TYMS}{IL16、STAT3、TNFRSF8}{IL16、STAT3、TYMS}{IL16、TNFRSF8、TYMS}{ITPKB、LRMP、MME}{ITPKB、LRMP、NF2}{ITPKB、LRMP、PIM1}{ITPKB、LRMP、PTPRC}{ITPKB、LRMP、REL}{ITPKB、LRMP、STAT3}{ITPKB、LRMP、TNFRSF8}{ITPKB、LRMP、TYMS}{ITPKB、MME、NF2}{ITPKB、MME、PIM1}{ITPKB、MME、PTPRC}{ITPKB、MME、REL}{ITPKB、MME、STAT3}{ITPKB、MME、TNFRSF8}{ITPKB、MME、TYMS}{ITPKB、NF2、PIM1}{ITPKB、NF2、PTPRC}{ITPKB、NF2、REL}{ITPKB、NF2、STAT3}{ITPKB、NF2、TNFRSF8}{ITPKB、NF2、TYMS}{ITPKB、PIM1、PTPRC}{ITPKB、PIM1、REL}{ITPKB、PIM1、STAT3}{ITPKB、PIM1、TNFRSF8}{ITPKB、PIM1、TYMS}{ITPKB、PTPRC、REL}{ITPKB、PTPRC、STAT3}{ITPKB、PTPRC、TNFRSF8}{ITPKB、PTPRC、TYMS}{ITPKB、REL、STAT3}{ITPKB、REL、TNFRSF8}{ITPKB、REL、TYMS}{ITPKB、STAT3、TNFRSF8}{ITPKB、STAT3、TYMS}{ITPKB、TNFRSF8、TYMS}{LRMP、MME、NF2}{LRMP、MME、PIM1}{LRMP、MME、PTPRC}{LRMP、MME、REL}{LRMP、MME、STAT3}{LRMP、MME、TNFRSF8}{LRMP、MME、TYMS}{LRMP、NF2、PIM1}{LRMP、NF2、PTPRC}{LRMP、NF2、REL}{LRMP、NF2、STAT3}{LRMP、NF2、TNFRSF8}{LRMP、NF2、TYMS}{LRMP、PIM1、PTPRC}{LRMP、PIM1、REL}{LRMP、PIM1、STAT3}{LRMP、PIM1、TNFRSF8}{LRMP、PIM1、TYMS}{LRMP、PTPRC、REL}{LRMP、PTPRC、STAT3}{LRMP、PTPRC、TNFRSF8}{LRMP、PTPRC、TYMS}{LRMP、REL、STAT3}{LRMP、REL、TNFRSF8}{LRMP、REL、TYMS}{LRMP、STAT3、TNFRSF8}{LRMP、STAT3、TYMS}{LRMP、TNFRSF8、TYMS}{MME、NF2、PIM1}{MME、NF2、PTPRC}{MME、NF2、REL}{MME、NF2、STAT3}{MME、NF2、TNFRSF8}{MME、NF2、TYMS}{MME、PIM1、PTPRC}{MME、PIM1、REL}{MME、PIM1、STAT3}{MME、PIM1、TNFRSF8}{MME、PIM1、TYMS}{MME、PTPRC、REL}{MME、PTPRC、STAT3}{MME、PTPRC、TNFRSF8}{MME、PTPRC、TYMS}{MME、REL、STAT3}{MME、REL、TNFRSF8}{MME、REL、TYMS}{MME、STAT3、TNFRSF8}{MME、STAT3、TYMS}{MME、TNFRSF8、TYMS}{NF2、PIM1、PTPRC}{NF2、PIM1、REL}{NF2、PIM1、STAT3}{NF2、PIM1、TNFRSF8}{NF2、PIM1、TYMS}{NF2、PTPRC、REL}{NF2、PTPRC、STAT3}{NF2、PTPRC、TNFRSF8}{NF2、PTPRC、TYMS}{NF2、REL、STAT3}{NF2、REL、TNFRSF8}{NF2、REL、TYMS}{NF2、STAT3、TNFRSF8}{NF2、STAT3、TYMS}{NF2、TNFRSF8、TYMS}{PIM1、PTPRC、REL}{PIM1、PTPRC、STAT3}{PIM1、PTPRC、TNFRSF8}{PIM1、PTPRC、TYMS}{PIM1、REL、STAT3}{PIM1、REL、TNFRSF8}{PIM1、REL、TYMS}{PIM1、STAT3、TNFRSF8}{PIM1、STAT3、TYMS}{PIM1、TNFRSF8、TYMS}{PTPRC、REL、STAT3}{PTPRC、REL、TNFRSF8}{PTPRC、REL、TYMS}{PTPRC、STAT3、TNFRSF8}{PTPRC、STAT3、TYMS}{PTPRC、TNFRSF8、TYMS}{REL、STAT3、TNFRSF8}{REL、STAT3、TYMS}{REL、TNFRSF8、TYMS}{STAT3、TNFRSF8、TYMS}
の発現を決定または測定することを含む。
遺伝子発現は、生物体のゲノム内の遺伝した情報(例えば、遺伝子;DNA領域)が具体的な機能的産物(時には遺伝子産物と呼ばれる)に変換されるプロセスである。遺伝子産物としては、RNA(リボ核酸)およびタンパク質が挙げられる。特定の生体試料中の遺伝子発現は、そのような試料中のRNA(mRNA、tRNA、rRNAおよび/またはmiRNAなど)またはタンパク質を含めた遺伝子産物の発現を検出することによって測定することができる。一部の例では、遺伝子発現を、標的核酸(例えば、mRNA)に結合する1種または複数のプローブについて配列決定することによって測定する。
核酸遺伝子産物は、名称が示す通り、核酸である遺伝子発現の産物である。例示的な核酸としては、DNAまたはRNA、例えば、cDNA、タンパク質コードRNA(例えば、mRNA)または非コードRNA(例えば、長い、非コード(lnc)RNA)が挙げられる。RNAまたはDNAの相補鎖間の塩基対合(すなわち、核酸ハイブリダイゼーション)により、核酸遺伝子産物を検出するための技法の大きな代表的なクラスについて基礎の全部または一部が形成される。他の代表的な検出技法は、核酸配列決定を伴い、これは、ハイブリダイゼーションステップおよび/またはバイオインフォマティクスステップ(例えば、核酸配列情報をその対応する遺伝子に関連付けるため)を伴っても伴わなくてもよい。これらおよび他の核酸を検出する方法は、当技術分野で公知であり、代表的な技法が本明細書に記載されているが、本開示は特定の核酸検出方法に限定されない。
一部の例では、核酸を、試料中のそのような核酸を相補的な核酸プローブもしくはプライマーと接触させ、かつ/または他の様式で試料中のそのような核酸を検出する前に、試験試料から単離または抽出する。核酸(RNA(例えば、mRNAまたはlncRNA)またはDNAなど)は、いくつかの方法のいずれかに従って試料から単離することができる。核酸を単離および精製する代表的な方法は、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation、P. Tijssen編、Elsevier、N.Y.(1993年)の第3章およびLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes、Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen編、Elsevier、N.Y.(1993年)の第3章に詳しく記載されている。RNA(例えば、mRNAまたはlncRNA)抽出の代表的な方法も同様に当技術分野で周知であり、Ausubelら、Current Protocols of Molecular Biology、John Wiley and Sons(1997年)を含めた分子生物学の標準的な教本に開示されている。
一部の例では、本明細書において提供される方法において、2種またはそれより多い開示されているDLBCLバイオマーカー(表1のDLBCLバイオマーカーの2種またはそれより多くなど)の発現レベルを決定することは、試料を、それぞれが表1のバイオマーカーに特異的でありそれと相補的である複数の核酸プローブ(NPPまたはNPPF+CFSなど)または増幅プライマーの対と、複数の核酸プローブまたはプライマーの対が、表1の、それ/それらの相補的なバイオマーカーとハイブリダイズすることが可能になる条件下で接触させることを含んでよい。一例では、方法は、試料を複数の核酸プローブ(NPPまたはNPPF+CFSなど)と接触させた後、試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることも含んでよい。他の例では、表2の少なくとも2種のバイオマーカーのそれぞれを、そのようなバイオマーカーのそれぞれに特異的な多数の(例えば、少なくとも2種、少なくとも5種、または少なくとも10種のプローブ、例えば、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種の)プローブ(例えば、NPPまたはNPPF)からなる「タイル状プローブ」と接触させ、この設計は、例えば、そのような遺伝子産物から得られるシグナルを増大させるため、または同じ遺伝子産物の多数のバリアントを検出するために有用であり得る。例えば、タイル状プローブセット内の各プローブは、標的核酸分子の異なる領域に結合し得る(またはわずかに重複する)。
一部の例では、標的核酸分子(核酸遺伝子産物(例えば、mRNAまたはlncRNA)など)を、それらを検出するための手段として(またはそれらの検出におけるステップとして)増幅する。一部の例では、増幅の間に、例えば、リアルタイムRT−PCRを使用することによって核酸発現レベルを決定する。したがって、増幅方法および適切なプライマーを使用して試料中の表1のDLBCLバイオマーカーの1種または複数を検出することができる(例えば、定量的に)。
RNA配列決定を使用して、多重化され、かつ一部の実施形態ではハイスループットな、遺伝子発現情報、例えば、表1のマーカーの発現に関する情報を得ることができる。RNA配列決定の方法は公知である(例えば、ChuおよびCorey、Nuc. Acid Therapeutics、22巻:271頁(2012年)を参照されたい)。全トランスクリプトーム配列決定および標的化RNA配列決定技法のそれぞれが、開示されている方法において利用可能であり、有用である。配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現連鎖分析(SAGE)、大規模並列処理シグネチャー配列決定(MPSS)による遺伝子発現分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定(別称、WTSSまたはRNA−Seq)、またはヌクレアーゼ保護配列決定(別称、qNPSまたはNPSeq;PCT公開第WO2012/151111号参照;以下でより詳細に考察されている)が挙げられる。
一部の例では、試料中の、発現を測定しようとする核酸分子を、例えば、全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第WO99/032663号;同第WO00/037683号;同第WO00/037684号;同第WO00/079008号;同第WO03/002750号;同第WO08/121927号;および同第WO2012/151111号ならびに米国特許第6,238,869号;同第6,458,533号;同第7,659,063号、および同第8,741,564号に記載されている通り、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを利用して試料中で検出する。Martelら、Assay and Drug Development Technologies.、2002年、1巻(1−1号):61〜71頁;Martelら、Progress in Biomedical Optics and Imaging、2002年、3巻:35〜43頁;Martelら、Gene Cloning and Expression Technologies、Q. LuおよびM. Weiner編、Eaton Publishing、Natick(2002年);Seligmann PharmacoGenomics、2003年、3巻:36〜43頁;Martelら、「Microarray Technologies and Applications」中の「Array Formats」、U.R. MullerおよびD. Nicolau編、Springer−Verlag、Heidelberg(2005年);Sawadaら、Toxicology in Vitro、20巻:1506〜1513頁、2006年;Bakirら、Bioorg. & Med. Chem Lett、17巻:3473〜3479頁、2007年;Krisら、Plant Physiol.、144巻:1256〜1266頁、2007年;Robertsら、Laboratory Investigation、87巻:979〜997頁、2007年;Rimszaら、Blood、2008年10月15日、112巻(8号):3425〜3433頁;Pechholdら、Nature Biotechnology、27巻:1038〜1042頁、2009年も参照されたい。これらの全てが参照により本明細書に完全に組み込まれる。
一部の例では、対象に由来する試料(例えば、細胞または組織)をまず水溶液中で溶解させるまたは透過処理する(例えば、溶解緩衝液を使用して)。細胞を水溶液中で十分な期間(例えば、約1分〜約60分、例えば、約5分〜約20分、または約10分)、十分な温度(例えば、約22℃〜約115℃、例えば、約37℃〜約105℃、または約90℃〜約110℃)でインキュベートして、細胞を溶解させるまたは透過処理する。一部の例では、溶解を約95℃で実施する。一部の例では、溶解ステップは、試料を約95℃で約5〜15分間インキュベートして、試料中のRNAを変性させ、しかしゲノムDNAは変性させないことを含む。他の例では、溶解ステップは、試料を約105℃で約5〜15分間インキュベートして試料中の核酸を変性させることを含む。一例では、溶解緩衝液中にプロテイナーゼKを含める。
当業者は、NPPまたはNPPF(+CFS)が試験試料中に存在するその標的と特異的にハイブリダイズするのに十分な条件を同定することができる。例えば、当業者は、選択されたストリンジェンシーの条件下で核酸(例えば、融合プローブ)が別の核酸(例えば、表2〜8のいずれかの標的核酸)とハイブリダイズすることを可能にする一方で、他の物質または分子との非特異的なハイブリダイゼーションを最小化する特色(長さ、塩基組成、および相補性の程度など)を実験的に決定することができる。一般には、NPPの核酸配列は、対応する標的配列に対して、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすること、例えば、約37℃またはそれより高く(例えば、約37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、またはそれより高く)でハイブリダイズすることを可能にするために十分な相補性を有する。変動し得るハイブリダイゼーション反応パラメーターの中では、塩濃度、緩衝液、pH、温度、インキュベーションの時間、ホルムアミドなどの変性剤の量および型がある。
試料中で1種または複数のNPPまたはNPPF(+CFS)と核酸をハイブリダイズさせた後、試料をヌクレアーゼ保護手順に供する。標的核酸とハイブリダイズしたNPPまたはNPPFはヌクレアーゼによって加水分解されず、後で検出することができる。
一部の例では、NPPまたはNPPFの検出の前にそれらを増幅する。例えば、結果として得られたNPP、NPPF、またはNPPもしくはNPPFから分離された結果として得られた標的核酸分子を、例えば、PCRもしくは他の形態の酵素的増幅またはライゲーションに基づく増幅方法などの常套的な方法を使用して増幅することができる。
NPPまたはNPPF(または残存する標的、標的:NPP複合体、または標的:NPPF:CFS複合体)、NPPアンプリコン、またはNPPFアンプリコンの存在を検出することができる。NPPもしくはNPPFプローブまたはアンプリコン(または残存する標的 標的:NPP複合体、または標的:NPPF:CFS複合体)の検出のために、任意の適切な方法を使用することができる。一部の例では、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)は検出可能な標識を含み、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)の存在の検出は、検出可能な標識を検出することを含む。一部の例では、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)を同じ検出可能な標識で標識する。他の例では、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)を異なる検出可能な標識(各標識に対して異なる標識など)で標識する。他の例では、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)を間接的に、例えば、標識された核酸を用いたハイブリダイゼーションによって検出する。
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理(および任意選択の増幅)の後、試料を、それぞれが捕捉用分子を含む多数の空間的に別個の領域を含む表面と接触させる、または、それぞれが捕捉用分子を含む複数の表面と接触させる。例えば、表面は、ビーズの集団であり、ここで、ビーズの亜集団がそれぞれ少なくとも1種の捕捉用分子を含む。例えば、第1の亜集団は少なくとも1種の捕捉用分子を含んでよく、一方、第2の亜集団は第1のものとは異なる配列を有する少なくとも1種の捕捉用分子を含んでよく、他も同様である。一部の例では、捕捉用分子は、二機能性リンカー(「プログラミングリンカー」とも称される)と結びついた少なくとも1種のアンカーを含む。あるいは、捕捉用分子は、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)の少なくとも一部分と相補的な配列、例えば、NPPFまたはそのアンプリコンの隣接領域の全部または一部分と相補的な配列を有する核酸捕捉用プローブを含む。
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ処理、および任意選択の増幅の後、ハイスループットなプラットフォームなどの代替方法を利用してNPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)を検出する。一部の例では、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、配列決定、従来のマイクロアレイ分析、増幅中の検出、またはハイブリッド捕捉を利用してNPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)を検出する。一部の実施形態では、NPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)は検出可能な標識を含まず、間接的な検出方法を利用する。そのような方法は、当業者には公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、本明細書に記載の方法が挙げられる。
一部の例では、結果として得られたNPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)について、例えば、NPPもしくはNPPF(もしくはそのアンプリコン)全体、またはその一部分(標的核酸分子の同定を可能にするために十分な量など)について配列決定することによって配列決定する。本開示は特定の配列決定方法に限定されない。一部の例では、多数の異なるNPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)について単一反応において配列決定する。一例では、特定の標的配列に対応するように設計することができるNPPまたはNPPF(またはそのアンプリコン)の実験タグについて配列決定することができる。したがって、NPPFアンプリコンの3’末端が末端の2〜25ヌクレオチド(例えば、末端の2〜5または2〜7、例えば、末端の2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド)に、測定される各標識に独特の配列を表す配列を有する場合には、これは、配列決定して標的を同定する必要があるNPPFアンプリコンの全てであり、配列決定されたそのような実験タグの数を計数することにより、試料中の各標的の量を決定することができる。
一部の例では、発現を測定しようとする試料中の核酸分子を、試料において、例えば、米国仮出願第62/294,143号、2016年2月11日出願(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている通り、上記の定量的ヌクレアーゼ保護アッセイの代替法を利用して検出する(図9A)。この方法でもNPPFおよびCFSを使用するが、NPPF代理物を検出または配列決定する代わりに、この方法では、標的核酸分子の直接配列決定が可能になる。
開示されている方法の一部の実施形態では、試料中の遺伝子発現レベルを決定するステップは、試料中の1つまたは複数のタンパク質を検出すること(例えば、そのようなタンパク質の相対的なまたは実際の量を決定することによって)を含む。常套的なタンパク質の検出方法は、当技術分野で公知であり、本開示は特定のタンパク質検出方法に限定されない。
任意選択で、遺伝子発現産物(例えば、核酸(mRNA、lncRNAなど)またはタンパク質)を検出するために使用するアッセイは、アッセイの性能を評価するために使用される陽性および陰性プロセス対照エレメントを含む。
遺伝子発現データは、「疾患の予防および治癒、生物学的進化機構ならびに薬物の発見に関する基本的な問題に取り組むための鍵を含有する」(LuおよびHan、Information Systems、28巻:243〜268頁(2003年))。一部の例では、そのようなデータから情報を引き出すことは、検出された1種または複数の遺伝子産物の有無または定性的な量(例えば、高い、中程度である、低い)から定性的決定を行うほど単純である。他の例では、未加工の遺伝子発現データを前処理すること(例えば、バックグラウンドを差し引くこと、対数変換すること、および/または補正すること)、正規化すること、および/または分類アルゴリズムに適用することができる。しかし、そのようなデータの前処理は任意選択である。
本明細書に記載の分類指標を伴うものなどの方法は、多数の様式で実装することができる。いくつかの代表的な非限定的な実施形態が下に記載されている。一部の方法の実施形態では、遺伝子発現データを、多数の遺伝子発現データ点を収集し、処理する場合に特に有利である、本明細書に記載の種々のアルゴリズムを適用するためのコンピューターまたは他のデバイス、マシンもしくは器具にインプットする(例えば、手動でまたは自動的に)。したがって、一部の例では、開示されている方法を使用して得られる遺伝子発現データまたは確率の値をコンピューターメモリに記憶させる。他の実施形態は、通信基盤、例えば、インターネットの使用を伴う。特定の分類指標および方法の実施形態を実装するために様々な形態のハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサー、またはこれらの組み合わせが有用である。ソフトウェアは、プログラムストレージデバイス、または、ユーザーの計算処理環境(例えば、アプレットとして)および関連するリモートサイト(例えば、サービス提供者の施設)に位置していてよいレビュアーの計算処理環境で実装されるソフトウェアの異なる部分に明確に具体化されたアプリケーションプログラムとして実装することができる。
本開示は、計算処理環境において実行されると本明細書に記載の応答可能性評価の結果の全部または一部分を行うためのアルゴリズムの実装をもたらすプログラムが記憶されたコンピューター可読記憶媒体(例えば、CD−ROM、メモリキー、フラッシュメモリカード、ディスケットなど)も意図している。コンピューター可読媒体が本明細書に記載の方法を行うための完全なプログラムを含有する場合、プログラムは、アウトプットを収集、分析、および生成するためのプログラム指示を含み、一般に、本明細書に記載の通りユーザーと対話し、そのデータを分析情報と併せて処理し、そのユーザーに対する独特の印刷されたまたは電子媒体を生成するためのコンピューター可読コードデバイスを含む。
一部の実施形態では、特定の試料(患者)についてのスコアが決定されたら、そのスコアの表示を臨床医または他の介護者に提示および/または伝えることができる。例えば、試験の結果を、ユーザー(臨床医または他の医療関係者、検査室職員、または患者など)に、試験の結果に関する情報をもたらす知覚可能なアウトプットで提供する。一部の例では、アウトプットは、紙アウトプット(例えば、書面によるまたは印刷されたアウトプット)、スクリーン上での提示、図式的なアウトプット(例えば、グラフ、チャート、または他の図表)、または可聴アウトプットである。したがって、アウトプットは、作成されたレポートを含んでよい。
開示されている遺伝子セットまたは分類指標により、DLBCL試料をGCB亜型または非GCB亜型(ABCなど)、または不確定として特徴付ける(例えば、診断する)ことができる。これら(および他の可能性のある)結果のそれぞれは、訓練された臨床専門家にとって有用である。一部の代表的な臨床使用を以下により詳細に記載する。これだけに限定されないが、物理的、可聴、または電子的手段(例えば、郵便物、電話、ファクシミリ伝達、電子メール、または電子医療記録への通信による)を含めた任意の適切な手段によって診断または予後判定を対象(例えば、患者または医師)に提供することができる。
診断により、対象(例えば、患者)に、どんな疾患または状態を有しているまたは有している可能性があるかが通知される。本開示全体にわたってより詳細に記載されている通り、DLBCL亜型を分類する任意の開示されている方法の任意の結果を、例えば対象または医療従事者に、診断として提供することができる。したがって、診断は、DLBCLがGCB亜型であるか非GCB亜型(ABCなど)であるか、または不確定であるかを決定することを含む。
予後判定は、その試料について特定の試験結果(例えば、DLBCLのGCB亜型または非GCB亜型(ABCなど))を受け取った対象についての可能性のある健康転帰である。予後不良とは、対象についての長期間の見通しが良好でないこと、例えば、1年、2年、3年または5年生存率が50%またはそれ未満(例えば、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%または1%またはそれ未満)であることを意味する。他方では、予後良好とは、対象についての長期間の見通しがまあまあ〜良好である、例えば、1年、2年、3年または5年生存率が30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%または90%より高いことを意味する。
開示されている方法は、対象を、それらの対応する試料がGCB亜型のDLBCLまたはABC亜型のDLBCLなどの非GCB亜型のDLBCLとして亜型決定された場合、GCB亜型のDLBCLまたはABC亜型のDLBCLなどの非GCB亜型のDLBCLに対する処置のために選択すること(または選択しないこと)をさらに含んでよい。例示的な処置方法を以下のセクションに提供する。したがって、一例では、試料がGCB亜型のDLBCLであると決定される場合、試料を得た対象を、(1)シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン(CHOP)化学療法、(2)リツキシマブ+CHOP(R−CHOP)化学療法、または(3)エトポシド+R−CHOP(R−EPOCH)を用いて処置する。別の例では、試料がABC亜型のDLBCLであることが決定される場合、試料を得た対象は、CHOPまたはR−CHOP療法に応答する可能性が低く、そのような対象を、1種または複数の代替療法(本明細書に開示されているものなど)を用いた処置のために選択することができる。
一部の実施形態では、DLBCL亜型の分類後、例えば、対象由来の試料がGCB DLBCLまたは非GCB(例えば、ABC)DLBCLとしてスコア化された場合、対象を、1種または複数の療法を用いた処置のために選択することができる。さらに、その後、選択された対象に1種または複数の療法を投与することができる。
例えば、DLBCLを有する対象におけるDLBCL亜型の決定における使用のための、遺伝子発現(表1のバイオマーカーの2種またはそれより多い発現など)を検出または測定するために使用することができるアレイが本明細書に開示されている。一部の実施形態では、1種または複数の対照遺伝子(例えば、正規化バイオマーカー)の発現を検出するためにも開示されているアッセイを使用することができる。特定の例では、アレイ表面は、プレート、ビーズ、またはフローセルを含む。
例えば、試料を本明細書で考察されている通りABC、GCB、または未分類のDLBCLとして特徴付けることにおいて使用するために、DLBCLシグネチャー遺伝子のレベル(例えば、表1のバイオマーカーの2種またはそれより多い発現など)を検出または測定するために使用することができるキットも本明細書に開示されている。一部の実施形態では、開示されているキットを、1種または複数の対照マーカー(例えば、ANT)の発現を検出するために使用することもできる。特定の例では、キットは、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSのそれぞれと直接的または間接的に特異的にハイブリダイズすることが可能な捕捉用プローブを含むアレイなどの、本明細書において提供されるアレイの1つまたは複数を含む。
DLBCLシグネチャー遺伝子一覧の同定
本実施例では、DLBCLを2つのクラス、ABCおよびGCBに亜型決定するための分類指標を構築するために使用した統計学的方法を記載する。さらに、未分類と表示される、不確実な領域を含む第3の亜型を分類に追加した。データ分析は全てRプログラミング言語バージョン3.2.2およびBioconductorパッケージバージョン3.1(64ビットバージョン)を使用して実施した。
配列決定の完了後、3つの品質管理(QC)測定基準(metrics)を各試料に適用した。順番に評価した相互排他的QC測定基準のそれぞれについて故障モード(failure mode)を同定した。第1のQC測定基準は、プローブ配列に対してマッピングされた読み取りのアラインメント率(Bowtieに基づく)である。期待値は、全アラインメントが≧85%であることであり、これが満たされない場合、試料はQC1の故障モードを有する。QC1品質測定基準を満たす全事例に適用される第2のQC測定基準は、試料が示差的な発現を有することである。発現は、発現の第1の四分位数(Q1)におけるプローブと発現の第3の四分位数(Q3)におけるプローブの間の発現差異を評価することによって確立され、発現の平均値間の比が2.0未満(Q1/Q3<2.0)であれば、試料は第2のQC測定基準(QC2)に不合格となる(S1不良または数の壁と称される)。QC1およびQC2に合格した試料/事例に適用される第3のQC測定基準(QC3)には、陰性対照:ANTプローブ(ANT1、ANT2、ANT3)が関与した。陰性対照に対する統計的プロセス制御(SPC)測定基準は、SUDHL6細胞株溶解物からの90ウェルの単一の技術的反復について配列決定したベースライン研究において確立した。SPC特徴付け研究により、陰性対照についての許容値の上限が確立され、次いで、この許容値を新しい試料全てに適用して、期待性能の範囲内に入る性能を実証した。期待性能を、ANTシグナル変動性の平均値を評価することによって確立した。期待値は、平均レベルと比較したANTの平均値が所定のカットオフを超えて変動しないというものである。カットオフは、log2(CPM)で7.75であった。試料のANTの平均値がこの値を超える試料はいずれも第3のQC測定基準(QC3)に不合格になる。これらの故障モードのいずれかを有する試料は全て、分類指標コールを損なう可能性がある。
全部で257の事例が、配列決定のために十分な代表的な組織を有し、上記の配列決定の品質管理手順に合格し、遺伝子発現プロファイリング(GEP)によって確認されたDLBCLステータスを有した。分析に使用した試料は、ANT値(陰性対照)の平均値についての品質管理測定基準に合格し、配列アラインメントが≧85%のプローブを有した。RNAseqは、特定の配列にマッピングされる読み取りの数を計数する方法体系である。アラインメント率は、PCRにより生成されたRNAコピーに正確にマッピングされている塩基対の数を定量化するための方法であり、試料中で入手可能な読み取りの少なくとも85%がマッピングされることが予想される。この量を下回ることは、マッピングされていない産物が試料中に存在することを暗示する。図2は、入手可能な全事例からの事例選択についてのデータフロー図を示す。
各溶解した反応混合物28μlを96ウェルプレートのウェルに入れ、非水層70μlをオーバーレイした。各ウェルに、5’および3’隣接配列ならびに各隣接配列に対する適切な相補的な隣接配列(CFS)を有するヌクレアーゼ保護プローブ(NPPF)を含有する混合物5μlを添加した。NPPFの配列は、標的、ならびに3’および5’隣接配列に特異的に結合する捕捉用配列を含んだ。表2は、DLBCL分類指標の16種の遺伝子に対するNPPFの捕捉用配列部分を示す。したがって、標的配列は、示されている配列の相補物である。ミックス中には、検出しようとする複数のmRNA標的のそれぞれと相補的なNPPFを1nM(過剰量)で存在させた。各96ウェルプレートに30例(それぞれ3連)の異なるDLBCL溶解物および6例の対照試料(2例の非試料対照および4例の細胞株溶解物)を含めた。DLBCL試料をプレート上に盲検式でランダム化した(すなわち、盲検試料アノテーション)。
分類指標アルゴリズムの構築における第1のステップとして、遺伝子発現(GEP)コールが入手可能であった257例の品質管理されたDLBCL試料を、分類指標の開発のための172例のランダムな試料を含む2つの重複しないデータセットにランダムにサブセット(subset)し、残りの86例を検証セットとして使用した。ランダムな選択によって偏りが導入されていないことを確実にするために、これらの2例のランダムな試料の類似性を評価した。表3に、GEPコールによるこれらの2つのサブセットの分布を記載する。
最適な標的および重みが得られたら、予測確率のためのカットオフを得た。ちょうど2つの分類が存在する場合、クラスを定義する確率は、予測確率の範囲全体にわたって感度(試料がABCと正確に特定される確率)および特異性(試料がGCBと正確に特定される確率)を最大にすることによって得られる。DLBCL分類指標は、「未分類」の試料のサブセットも含んだ。これらの試料は、おそらくABCでもGCBでもなく、それにより、別の亜型(例えば、ABCまたはGCBコールを行うことができない)に潜在的に入る試料のセットとして同定される。感度+特異性(これらの組み合わせは正確度と呼ばれる)が、誤分類率(misclassification rate)が上昇するのと同じ点である、最大点から低下し始める点を決定した。これを下限と呼んだ。上限は、この値に関連して対称となる最高点(high point)である。図4は、この決定点(decision point)を図表で示す。数値的には、カットオフは下の点が0.43であり、上の点が0.57である。結果として得られたABC/GCBコールは、推定確率<0.43である事例がABCであり、推定確率>0.57である事例がGCBであり、両端を含んで0.43〜0.57の間に入る全てが未分類である。
独立した試料へのDLBCL分類指標の適用
本実施例は、実施例1において開発されたDLBCL分類指標により、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料においてDLBCLのGCB亜型およびABC亜型を同定することが可能になることを実証する。
in vitroにおけるDLBCL診断アッセイ
本実施例では、Illumina MiSeq次世代シークエンサーで実施する検出を伴うHTG EdgeSeqシステムを使用してFFPE組織からびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)腫瘍の起源細胞(COO)亜型を決定するために使用することができる方法を記載する。プロファイルされたデータを、分類アルゴリズムによって評価し、腫瘍が、活性化B細胞様(ABC)、胚B細胞様(GCB)、または未分類の亜型のものであるかを決定する。
試料インプット:FFPE試料からの反復試料溶解物(1つのABCおよび1つのGCB)をウェル当たり12.5〜0.39mm2の間の2倍希釈物にわたって試験した。分類は、6つの試験した希釈点の100%で、推奨される1.56mm2を下回る組織であっても一貫したままであった。この一貫性を2種の低発現プローブ、CD274(PD−L1)およびPDCD1(PD−1)でも評価した。図6および7は、試料発現を、ABC試料およびGCB試料のどちらにおいても低試料インプット量から高試料インプット量まで示す。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)を分類する方法であって、
対象から得た試料中のCD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの発現を測定し、それにより、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSについての発現値を得るステップと、
各発現値に重み付けし、それにより、重み付き発現値を生成するステップと、
前記重み付き発現値を合計し、それにより、合計重み付き発現値を生成するステップと、
前記合計重み付き発現値を使用して確率スコアを算出するステップと、
前記確率スコアを閾値と比較するステップと、
前記確率スコアがABCの範囲内の値であれば前記DLBCLを活性化B細胞様(ABC)に分類する、
前記確率スコアがGCBの範囲内の値であれば前記DLBCLを胚中心B細胞様(GCB)に分類する、または
前記確率スコアが未分類の範囲内の値であれば前記DLBCLを未分類に分類するステップと
を含む、方法。
(項目2)
核酸発現を測定する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記核酸が、mRNAおよび/またはmiRNAである、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記試料が、固定された試料である、項目1から3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
発現を測定するステップが、ヌクレアーゼに基づくアッセイを使用して前記試料を分析することを含む、項目1から4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
発現を測定するステップが、配列決定することを含み、前記発現値が、前記試料中に存在する分子の数を表す計数である、項目1から5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
発現を測定するステップが、発現を定量化することを含む、項目1から6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
各発現値に重み付けするステップが、前記発現値に表5に示されている係数を掛けることを含む、項目1から7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
確率スコアを算出するステップが、式:
(項目10)
前記閾値が、確率スコアtカットオフである、項目1から9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記確率スコアtカットオフが、ABCについて<0.43、GCBについて>0.57、未分類について0.43〜0.57である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記対象が、DLBCLを有することが分かっているまたは有する疑いがある、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記試料の6%未満を未分類に分類する、項目1から12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記発現値が、
前記試料を、隣接配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ(NPPF)と、各NPPFがその標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、前記隣接配列と相補的な配列(CFS)を含む核酸分子と、前記隣接配列が前記CFSに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子および前記CFS(複数可)とハイブリダイズしたNPPFを含む消化された試料を生成すること、
前記消化された試料中のNPPFを、増幅プライマーを用いて増幅し、それにより、NPPFアンプリコンを生成すること、
前記NPPFアンプリコンの少なくとも一部について配列決定すること、ならびに
NPPFアンプリコンの数を計数し、それにより、前記試料中のCD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSについての発現値を決定すること、
によって得られる、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記発現値が、
前記試料を、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子に特異的なNPPFと接触させることであって、
各NPPFが、
5’末端および3’末端、
前記NPPFと前記標的核酸分子との特異的な結合を可能にする、前記CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子の領域と相補的な配列
を含み、
前記隣接配列が、前記標的核酸分子と相補的な配列に対して5’側、3’側、またはその両方に位置し、5’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の5’側にあり、3’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の3’側にあり、
前記隣接配列が、前記試料中に存在する核酸分子には見いだされない少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み、
前記NPPFが5’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記5’隣接配列と相補的な配列(5CFS)、5’末端リン酸を含む核酸分子と、前記5’隣接配列が前記5CFSと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記NPPFが3’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記3’隣接配列と相補的な配列(3CFS)を含む核酸分子と、前記3’隣接配列が前記3CFSと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記3CFSおよび前記5CFSの少なくとも一方が、捕捉用部分を含む、接触させること、
前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズしたNPPFを生成すること、
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズしたNPPFを含む、消化された試料を生成すること、
前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズした前記NPPFを捕捉すること、
前記3CFSの5’リン酸と前記標的核酸分子の3’末端をライゲーションし、そして前記5CFSの3’末端と前記標的核酸分子の5’末端をライゲーションし、それにより、ライゲーションした標的核酸分子を生成すること、
前記ライゲーションした標的核酸分子から前記NPPFを分離し、それにより、一本鎖のNPPFと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む混合物を生成すること、ならびに
前記一本鎖のライゲーションした標的核酸分子の少なくとも一部分の配列決定をして、それにより、前記試料中の前記CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子の配列を決定すること
によって得られる、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記NPPFが少なくとも1つのdUTPを含み、前記方法が、変性後かつ配列決定前に、一本鎖のNPPFと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む前記混合物を、ウラシルDNAデグリコシラーゼ(UDG)と、前記一本鎖のNPPFを分解するために十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記DLBCLがGCBに分類される場合に、前記対象に、治療有効量の(1)シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン(CHOP)化学療法、(2)リツキシマブ+CHOP(R−CHOP)化学療法、または(3)エトポシド+R−CHOP(R−EPOCH)化学療法を投与するステップをさらに含む、項目1から16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記DLBCLがABCに分類される場合に、前記対象に、治療有効量の、ベンダムスチン、ピキサントロン、ゲムシタビン/オキサリプラチン、リポソームビンクリスチン、抗CD20 mAb、抗CD22 mAb、抗CD74 mAb、抗CD40 mAb、単鎖二重特異性抗CD19およびCD3 mAb構築物、I−131トシツモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、90Y−エプラツズマブテトラキセタン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブ、NPI−0052、エベロリムス、テムシロリムス、ボリノスタット、オブリメルセンナトリウム、PF−3512676、17−AAG、ベバシズマブ、アフリベルセプト、CAL−101、バルプロ酸、ジナシクリブ、ホスタマチニブ、ダサチニブ、エンザスタウリン、PCI−32765、SB1518、ならびにソラフェニブの1つまたは複数を投与するステップをさらに含む、項目1から16のいずれかに記載の方法。
(項目19)
プログラムされたときにそれにより計算処理システムに項目1から16のいずれか一項に記載の方法を実施させるための、コンピューターで実行可能な指示が記憶された1つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体。
(項目20)
項目1から16のいずれか一項に記載の方法の実施に適合させた計算処理システム。
(項目21)
以下:
少なくとも16種の異なるNPPFおよび対応するCFSを含む容器であって、前記少なくとも16種の異なるNPPFが、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSに特異的である、容器、ならびに、
前記少なくとも16種の異なるNPPFのアンプリコンに特異的に結合することが可能なビーズを含む容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、
洗浄緩衝液を含む容器、
PCR用試薬を含む容器、
エタノールを含む容器、
リガーゼを含む容器、
ライゲーション緩衝液を含む容器、
変性用油を含む容器、および
プロテイナーゼKを含む容器
の1つまたは複数
を含む、キット。
(項目22)
少なくとも16種の異なるNPPFおよび対応するCFSを含む前記容器であって、前記少なくとも16種の異なるNPPFが、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSに特異的である、容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、ならびに
ヌクレアーゼ終結緩衝液を含む容器
を含む、項目21に記載のキット。
(項目23)
DLBCLの亜型に対する分類指標を実装する計算処理システムをさらに含む、項目21または22に記載のキット。
(項目24)
前記計算処理システムが、2種またはそれより多いDLBCLシグネチャー遺伝子についての発現値を受信し、多数の値を各遺伝子についての対応する閾値に対してスコア化し、試料を前記試料のDLBCLの亜型を示すフレームワーク内に分類するソフトウェアまたはコンピューター可読媒体を含む、項目23に記載のキット。
Claims (24)
- 確率スコアをびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)を分類するための指標とする方法であって、
対象から得た試料中のCD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSの発現を測定し、それにより、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSについての発現値を得るステップと、
各発現値に重み付けし、それにより、重み付き発現値を生成するステップと、
前記重み付き発現値を合計し、それにより、合計重み付き発現値を生成するステップと、
前記合計重み付き発現値を使用して確率スコアを算出するステップと、
前記確率スコアを閾値と比較するステップと
を含み、
活性化B細胞様(ABC)の範囲内の前記確率スコアの値は、前記DLBCLがABCに分類できることの指標であり、
胚中心B細胞様(GCB)の範囲内の前記確率スコアの値は、前記DLBCLがGCBに分類できることの指標であり、または
未分類の範囲内の前記確率スコアの値は、前記DLBCLが未分類に分類できることの指標である、方法。 - 核酸発現を測定する、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が、mRNAおよび/またはmiRNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記試料が、固定された試料である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 発現を測定するステップが、ヌクレアーゼに基づくアッセイを使用して前記試料を分析することを含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 発現を測定するステップが、配列決定することを含み、前記発現値が、前記試料中に存在する分子の数を表す計数である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 発現を測定するステップが、発現を定量化することを含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 各発現値に重み付けするステップが、前記発現値に以下の係数:
CD47について−0.16
CD86について0.83
ENTPD1について−0.71
FOXP1について−0.56
FUT8について−0.30
IL16について−0.51
ITPKBについて1.16
LRMPについて0.16
MMEについて0.59
NF2について−0.70
PIM1について−0.13
PTPRCについて0.07
RELについて0.20
STAT3について−0.17
TNFRSF8について−0.01、および
TYMSについて−0.25
を掛けることを含む、請求項1から7のいずれかに記載の方法。 - 確率スコアを算出するステップが、式:
- 前記閾値が、確率スコアtカットオフである、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 前記確率スコアtカットオフが、ABCについて<0.43、GCBについて>0.57、未分類について0.43〜0.57である、請求項10に記載の方法。
- 前記対象が、DLBCLを有することが分かっているまたは有する疑いがある、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料の6%未満を未分類に分類する、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記発現値が、
前記試料を、隣接配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ(NPPF)と、各NPPFがその標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、前記隣接配列と相補的な配列(CFS)を含む核酸分子と、前記隣接配列が前記CFSに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させること、
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子および前記CFS(複数可)とハイブリダイズしたNPPFを含む消化された試料を生成すること、
前記消化された試料中のNPPFを、増幅プライマーを用いて増幅し、それにより、NPPFアンプリコンを生成すること、
前記NPPFアンプリコンの少なくとも一部について配列決定すること、ならびに
NPPFアンプリコンの数を計数し、それにより、前記試料中のCD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSについての発現値を決定すること、
によって得られる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記発現値が、
(1)前記試料を、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子に特異的なNPPFと接触させることであって、
各NPPFが、
5’末端および3’末端、
前記NPPFと前記標的核酸分子との特異的な結合を可能にする、前記CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子の領域と相補的な配列
を含み、
前記隣接配列が、前記標的核酸分子と相補的な配列に対して5’側、3’側、またはその両方に位置し、5’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の5’側にあり、3’隣接配列は前記標的核酸分子と相補的な配列の3’側にあり、
前記隣接配列が、前記試料中に存在する核酸分子には見いだされない少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み、
前記NPPFが5’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記5’隣接配列と相補的な配列(5CFS)、5’末端リン酸を含む核酸分子と、前記5’隣接配列が前記5CFSと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記NPPFが3’隣接配列を含む場合には、前記試料を、前記3’隣接配列と相補的な配列(3CFS)を含む核酸分子と、前記3’隣接配列が前記3CFSと特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させ、
前記3CFSおよび前記5CFSの少なくとも一方が、捕捉用部分を含む、
接触させること、
(2)前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズしたNPPFを生成すること、
(3)前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、結合していない核酸分子を除去するために十分な条件下で接触させ、それにより、前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズしたNPPFを含む、消化された試料を生成すること、
(4)前記標的核酸分子とハイブリダイズした、前記3CFSとハイブリダイズした、前記5CFSとハイブリダイズした、または前記3CFSおよび前記5CFSの両方とハイブリダイズした前記NPPFを捕捉すること、
(5)前記3CFSの5’リン酸と前記標的核酸分子の3’末端をライゲーションし、そして前記5CFSの3’末端と前記標的核酸分子の5’末端をライゲーションし、それにより、ライゲーションした標的核酸分子を生成すること、
(6)前記ライゲーションした標的核酸分子から前記NPPFを分離し、それにより、一本鎖のNPPFと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む混合物を生成すること、ならびに
(7)前記一本鎖のライゲーションした標的核酸分子の少なくとも一部分の配列決定をして、それにより、前記試料中の前記CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMS標的核酸分子の配列を決定すること
によって得られる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記NPPFが少なくとも1つのdUTPを含み、前記方法が、変性後かつ配列決定前に、一本鎖のNPPFと一本鎖のライゲーションした標的核酸分子とを含む前記混合物を、ウラシルDNAデグリコシラーゼ(UDG)と、前記一本鎖のNPPFを分解するために十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記DLBCLがGCBに分類されることは、治療有効量の(1)シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンもしくはプレドニゾロン(CHOP)化学療法、(2)リツキシマブ+CHOP(R−CHOP)化学療法、または(3)エトポシド+R−CHOP(R−EPOCH)化学療法が前記対象に投与されるべきであることの指標である、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 前記DLBCLがABCに分類されることは、治療有効量の、ベンダムスチン、ピキサントロン、ゲムシタビン/オキサリプラチン、リポソームビンクリスチン、抗CD20 mAb、抗CD22 mAb、抗CD74 mAb、抗CD40 mAb、単鎖二重特異性抗CD19およびCD3 mAb構築物、I−131トシツモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、90Y−エプラツズマブテトラキセタン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブ、NPI−0052、エベロリムス、テムシロリムス、ボリノスタット、オブリメルセンナトリウム、PF−3512676、17−AAG、ベバシズマブ、アフリベルセプト、CAL−101、バルプロ酸、ジナシクリブ、ホスタマチニブ、ダサチニブ、エンザスタウリン、PCI−32765、SB1518、ならびにソラフェニブの1つまたは複数が前記対象に投与されるべきであることの指標である、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- プログラムされたときにそれにより計算処理システムに請求項1から16のいずれか一項に記載の方法を実施させるための、コンピューターで実行可能な指示が記憶された1つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の方法の実施に適合させた計算処理システム。
- 以下:
少なくとも16種の異なるNPPFおよび対応するCFSを含む容器であって、前記少なくとも16種の異なるNPPFが、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSに特異的である、容器、ならびに、
前記少なくとも16種の異なるNPPFのアンプリコンに特異的に結合することが可能なビーズを含む容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、
洗浄緩衝液を含む容器、
PCR用試薬を含む容器、
エタノールを含む容器、
リガーゼを含む容器、
ライゲーション緩衝液を含む容器、
変性用油を含む容器、および
プロテイナーゼKを含む容器
の1つまたは複数
を含む、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)を分類するためのキット。 - 少なくとも16種の異なるNPPFおよび対応するCFSを含む前記容器であって、前記少なくとも16種の異なるNPPFが、CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8、およびTYMSに特異的である、容器、
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含む容器、
溶解緩衝液を含む容器、ならびに
ヌクレアーゼ終結緩衝液を含む容器
を含む、請求項21に記載のキット。 - DLBCLの亜型に対する分類指標を実装する計算処理システムをさらに含む、請求項21または22に記載のキット。
- 前記計算処理システムが、2種またはそれより多いDLBCLシグネチャー遺伝子についての発現値を受信し、多数の値を各遺伝子についての対応する閾値に対してスコア化し、試料を前記試料のDLBCLの亜型を示すフレームワーク内に分類するソフトウェアまたはコンピューター可読媒体を含む、請求項23に記載のキット。
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