JP3142627B2 - ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の立体異性富化 - Google Patents
２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の立体異性富化Info
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Description
【０００１】具体的な説明 本発明は２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプ
ロピオン酸の立体異性富化に関する。キラル中心を有す
る医薬及び農業製品のような多くの化合物の生物活性は
通常主に１つのキラル形で存在することがわかってい
る。ほとんどの化学合成は本来的に立体選択的でないた
め、これは深刻な化学的処理問題を生じる。このため１
つのキラル形に優勢な富化がある段階、即ち最終キラル
化合物又は同じキラル中心を有する化学前駆体のいずれ
かで要求される。どんな段階が富化に選択されても及び
望ましくない立体異性体の再循環方法の欠如のために、
そのプロセスは望ましい立体異性体に関して１／
（２ｎ）×１００％の最大収率に本来的に制限される
が、ここでｎは分子中におけるキラル中心の総数であ
る。２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸及びその誘導体はいくつかの生物学上有用な化合
物の合成において中間体として用いられる。このように
Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐（４‐
メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸は抗生物質の
Ｄ‐トレオ １‐フルオロ‐２‐（ジクロロアセトアミ
ド）‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロパン
‐１‐オール（フロルフェニコールとしても知られる）
及びＤ‐トレオ ２‐（ジクロロアセトアミド）‐３‐
（４‐メチルスルホニルフェニル）プロパン‐１，３‐
ジオール（チアムフェニコールとしても知られる）の合
成における中間体である。加えて、Ｌ‐トレオ ２‐ア
ミノ‐３‐（４‐メチルチオフェニル）‐３‐ヒドロキ
シプロピオン酸も抗生物質の合成における中間体であ
る。同様に、Ｌ‐トレオ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐
ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸はＬ‐２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐（３，４‐ジヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸（Ｌ‐メチルドパとしても知られる）
の製造における中間体である。２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸及びその誘導体は２つ
のキラル中心を有するため、４つの立体異性体が存在す
る。これらは２対のエナンチオマー、即ちＤ，Ｌ‐エリ
トロ及びＤ，Ｌ‐トレオ エナンチオマーである。最終
生成物が２つのキラル中心を有する場合、通常唯一の立
体異性体、典型的にはＬ‐トレオ立体異性体が生物活性
化合物の製造上有用である（Ｌ‐メチルドパの製造にお
いて、水素添加は２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸の３‐ヒドロキシ基に
関するキラル中心を除くため、即ち最終生成物は１つの
キラル中心しか有しないため、“エリトロ”及び“トレ
オ”の区別は重要でない。しかしながら同じく、唯一の
エナンチオマー、Ｌ形が有用である）。２つのキラル中
心が存在する場合、望ましい立体異性体は更に効率的に
高い光学純度で最終生成物を製造するためにＤ，Ｌ‐エ
リトロ及びＤ，Ｌ‐トレオ立体異性体の混合物から分離
又は富化されねばならない。参考のためここに組み込ま
れるアキヤマらの英国特許第１，２６８，８６７号明細
書では、グリシンのアルカリ金属塩のアルコール溶液が
（Ｄ，Ｌ‐エリトロ形よりもむしろ）Ｄ，Ｌ‐トレオ
エナンチオマー形のβ‐（４‐メチルスルホニルフェニ
ル）セリンに富む混合物を製造するため炭酸アルカリ金
属の存在下でグリシンのモル当たり２モルのｐ‐メチル
スルホニルベンズアルデヒドと接触されることからなる
チアムフェニコールの製造操作について記載している。
次いでＤ‐トレオ エナンチオマーからＬ‐トレオ エ
ナンチオマーの分離が慣用的化学分割を用いて行われ
る。しかしながら収率は本来的に低く、トレオ混合物の
５０％以下に制限される。
ロピオン酸の立体異性富化に関する。キラル中心を有す
る医薬及び農業製品のような多くの化合物の生物活性は
通常主に１つのキラル形で存在することがわかってい
る。ほとんどの化学合成は本来的に立体選択的でないた
め、これは深刻な化学的処理問題を生じる。このため１
つのキラル形に優勢な富化がある段階、即ち最終キラル
化合物又は同じキラル中心を有する化学前駆体のいずれ
かで要求される。どんな段階が富化に選択されても及び
望ましくない立体異性体の再循環方法の欠如のために、
そのプロセスは望ましい立体異性体に関して１／
（２ｎ）×１００％の最大収率に本来的に制限される
が、ここでｎは分子中におけるキラル中心の総数であ
る。２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸及びその誘導体はいくつかの生物学上有用な化合
物の合成において中間体として用いられる。このように
Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐（４‐
メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸は抗生物質の
Ｄ‐トレオ １‐フルオロ‐２‐（ジクロロアセトアミ
ド）‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロパン
‐１‐オール（フロルフェニコールとしても知られる）
及びＤ‐トレオ ２‐（ジクロロアセトアミド）‐３‐
（４‐メチルスルホニルフェニル）プロパン‐１，３‐
ジオール（チアムフェニコールとしても知られる）の合
成における中間体である。加えて、Ｌ‐トレオ ２‐ア
ミノ‐３‐（４‐メチルチオフェニル）‐３‐ヒドロキ
シプロピオン酸も抗生物質の合成における中間体であ
る。同様に、Ｌ‐トレオ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐
ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸はＬ‐２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐（３，４‐ジヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸（Ｌ‐メチルドパとしても知られる）
の製造における中間体である。２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸及びその誘導体は２つ
のキラル中心を有するため、４つの立体異性体が存在す
る。これらは２対のエナンチオマー、即ちＤ，Ｌ‐エリ
トロ及びＤ，Ｌ‐トレオ エナンチオマーである。最終
生成物が２つのキラル中心を有する場合、通常唯一の立
体異性体、典型的にはＬ‐トレオ立体異性体が生物活性
化合物の製造上有用である（Ｌ‐メチルドパの製造にお
いて、水素添加は２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸の３‐ヒドロキシ基に
関するキラル中心を除くため、即ち最終生成物は１つの
キラル中心しか有しないため、“エリトロ”及び“トレ
オ”の区別は重要でない。しかしながら同じく、唯一の
エナンチオマー、Ｌ形が有用である）。２つのキラル中
心が存在する場合、望ましい立体異性体は更に効率的に
高い光学純度で最終生成物を製造するためにＤ，Ｌ‐エ
リトロ及びＤ，Ｌ‐トレオ立体異性体の混合物から分離
又は富化されねばならない。参考のためここに組み込ま
れるアキヤマらの英国特許第１，２６８，８６７号明細
書では、グリシンのアルカリ金属塩のアルコール溶液が
（Ｄ，Ｌ‐エリトロ形よりもむしろ）Ｄ，Ｌ‐トレオ
エナンチオマー形のβ‐（４‐メチルスルホニルフェニ
ル）セリンに富む混合物を製造するため炭酸アルカリ金
属の存在下でグリシンのモル当たり２モルのｐ‐メチル
スルホニルベンズアルデヒドと接触されることからなる
チアムフェニコールの製造操作について記載している。
次いでＤ‐トレオ エナンチオマーからＬ‐トレオ エ
ナンチオマーの分離が慣用的化学分割を用いて行われ
る。しかしながら収率は本来的に低く、トレオ混合物の
５０％以下に制限される。
【０００２】本発明はフェニル環において非置換である
か又は置換されたＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸、２‐アミノ‐２‐メ
チル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸及び
それらの誘導体の製造に関して有意の改善を示す。通常
必ずしもラセミ体でないＤ‐トレオ及びＬ‐トレオ形の
２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン
酸の混合物をＤ‐トレオニンアルドラーゼの作用に付す
ことにより、Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ
‐３‐フェニルプロピオン酸からグリシン及び対応ベン
ズアルデヒドへの選択的開裂がＬ‐トレオ ２‐アミノ
‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の実質的
開裂なしに生じる。同様に、Ｄ，Ｌ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸のエナンチオマー混合物を本発明に従いＤ‐トレ
オニンアルドラーゼの作用に付すことにより、Ｄ‐トレ
オ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェ
ニルプロピオン酸からアラニン及び対応ベンズアルデヒ
ドへの選択的開裂がＬ‐トレオ ２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の実質
的開裂なしに生じる。各々の場合において、対応ベンズ
アルデヒド及びアミノ酸は再循環のため反応混合物から
容易に回収することができる。
か又は置換されたＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸、２‐アミノ‐２‐メ
チル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸及び
それらの誘導体の製造に関して有意の改善を示す。通常
必ずしもラセミ体でないＤ‐トレオ及びＬ‐トレオ形の
２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン
酸の混合物をＤ‐トレオニンアルドラーゼの作用に付す
ことにより、Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ
‐３‐フェニルプロピオン酸からグリシン及び対応ベン
ズアルデヒドへの選択的開裂がＬ‐トレオ ２‐アミノ
‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の実質的
開裂なしに生じる。同様に、Ｄ，Ｌ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸のエナンチオマー混合物を本発明に従いＤ‐トレ
オニンアルドラーゼの作用に付すことにより、Ｄ‐トレ
オ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェ
ニルプロピオン酸からアラニン及び対応ベンズアルデヒ
ドへの選択的開裂がＬ‐トレオ ２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の実質
的開裂なしに生じる。各々の場合において、対応ベンズ
アルデヒド及びアミノ酸は再循環のため反応混合物から
容易に回収することができる。
【０００３】本発明は、Ｄ‐トレオニンアルドラーゼの
作用がＤ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐
フェニルプロピオン酸又はＤ‐トレオ ２‐アミノ‐２
‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸
において２位の炭素原子（アミノ基を有する炭素原子）
及び３位の炭素原子（ヒドロキシ基を有する炭素原子）
間の結合を選択的に開裂させ、一方で対応Ｌ‐トレオ異
性体を実質上そのままに残すという発見に基づいてい
る。このため本発明は前記生物学的化合物、例えばフロ
ルフェニコール、チアムフェニコール及びＬ‐メチルド
ーパの製造用に特に適している。
作用がＤ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐
フェニルプロピオン酸又はＤ‐トレオ ２‐アミノ‐２
‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸
において２位の炭素原子（アミノ基を有する炭素原子）
及び３位の炭素原子（ヒドロキシ基を有する炭素原子）
間の結合を選択的に開裂させ、一方で対応Ｌ‐トレオ異
性体を実質上そのままに残すという発見に基づいてい
る。このため本発明は前記生物学的化合物、例えばフロ
ルフェニコール、チアムフェニコール及びＬ‐メチルド
ーパの製造用に特に適している。
【０００４】最広義の意味において、本発明は下記式の
Ｄ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸又はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐
２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン
酸の混合物をエナンチオマー上富化することに関する：
Ｄ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸又はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐
２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン
酸の混合物をエナンチオマー上富化することに関する：
【化３】 上記式中Ｒ１及びＲ２の各々は他方から独立して水素、
ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリフルオロメチル、低級
アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルホニル、
低級アルキルスルフィニル又は低級アルキルチオであ
る；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４は水素又は
カルボン酸保護基である。前記２‐アミノ‐２‐メチル
‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の慣用的
な塩も含まれる。
ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリフルオロメチル、低級
アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルホニル、
低級アルキルスルフィニル又は低級アルキルチオであ
る；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４は水素又は
カルボン酸保護基である。前記２‐アミノ‐２‐メチル
‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の慣用的
な塩も含まれる。
【０００５】低級アルキルという用語は炭素原子１〜６
を有する一価の飽和分岐鎖状又は直鎖状炭化水素鎖を表
す。このようなアルキル基の例はメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチ
ル、 tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペン
チル、 tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等であ
る。低級アルコキシという用語は、例えばメトキシ、エ
トキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペン
トキシ、ヘキソキシ等のようなエーテル性酸素結合で分
子の残部に結合された低級アルキルをいう。ハロとはク
ロロ、ブロモ、フルオロ及びヨードをいう。カルボキシ
基は、分子の望ましい構造を破壊しない充分に穏やかな
条件下で選択的に除去しうるエステル基、特に、メチル
又はエチル及びとりわけ tert-ブチルのような１位で分
岐されたもののような炭素原子１〜１２のアルキルエス
テル；並びに（ｉ）例えばメトキシメチル、１‐メトキ
シエチル及びエトキシメチルのような低級アルコキシ、
（ii）例えばメチルチオメチル及び１‐エチルチオエチ
ルのような低級アルキルチオ、（iii)２，２，２‐トリ
クロロエチル、２‐ブロモエチル及び２‐ヨードエトキ
シカルボニルのようなハロゲン、（iv）例えばベンジ
ル、４‐ニトロベンジル、ジフェニルメチル、ジ（４‐
メトキシフェニル）メチルのような、例えば tert-ブチ
ルのような低級アルキル、メトキシのような低級アルコ
キシ、ヒドロキシ、クロロのようなハロ及びニトロで各
々が一、二もしくは三置換された又は非置換である１又
は２のフェニル基、又は（ｖ）フェナシルのようなアロ
イルで、１又は２位において置換されたこのような低級
アルキルエステルとして、Ｒ４で保護することができ
る。カルボキシ基は、例えばトリメチルシリルオキシカ
ルボニルとしてトリ低級アルキルシリルのような有機シ
リル基の形で保護することもできる。
を有する一価の飽和分岐鎖状又は直鎖状炭化水素鎖を表
す。このようなアルキル基の例はメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチ
ル、 tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペン
チル、 tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等であ
る。低級アルコキシという用語は、例えばメトキシ、エ
トキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペン
トキシ、ヘキソキシ等のようなエーテル性酸素結合で分
子の残部に結合された低級アルキルをいう。ハロとはク
ロロ、ブロモ、フルオロ及びヨードをいう。カルボキシ
基は、分子の望ましい構造を破壊しない充分に穏やかな
条件下で選択的に除去しうるエステル基、特に、メチル
又はエチル及びとりわけ tert-ブチルのような１位で分
岐されたもののような炭素原子１〜１２のアルキルエス
テル；並びに（ｉ）例えばメトキシメチル、１‐メトキ
シエチル及びエトキシメチルのような低級アルコキシ、
（ii）例えばメチルチオメチル及び１‐エチルチオエチ
ルのような低級アルキルチオ、（iii)２，２，２‐トリ
クロロエチル、２‐ブロモエチル及び２‐ヨードエトキ
シカルボニルのようなハロゲン、（iv）例えばベンジ
ル、４‐ニトロベンジル、ジフェニルメチル、ジ（４‐
メトキシフェニル）メチルのような、例えば tert-ブチ
ルのような低級アルキル、メトキシのような低級アルコ
キシ、ヒドロキシ、クロロのようなハロ及びニトロで各
々が一、二もしくは三置換された又は非置換である１又
は２のフェニル基、又は（ｖ）フェナシルのようなアロ
イルで、１又は２位において置換されたこのような低級
アルキルエステルとして、Ｒ４で保護することができ
る。カルボキシ基は、例えばトリメチルシリルオキシカ
ルボニルとしてトリ低級アルキルシリルのような有機シ
リル基の形で保護することもできる。
【０００６】示されたように、本発明は例えば陽イオン
がナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム又
はエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミ
ン、ジエチルアミノエタノール、エチレンジアミン、ピ
ペリジン、モルホリン、２‐ピペリジノエタノール、ベ
ンジルアミン、プロカイン等から得られるようなプロト
ン化アミンである塩として、前記化合物と例えばアルカ
リ金属、アルカリ土類金属、アンモニア及び有機アミン
との塩にも関する。塩は化学中間体として利用されるた
め、それらは、通常生理学上許容されるものであるが必
ずしもそうでなくてもよい。
がナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム又
はエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミ
ン、ジエチルアミノエタノール、エチレンジアミン、ピ
ペリジン、モルホリン、２‐ピペリジノエタノール、ベ
ンジルアミン、プロカイン等から得られるようなプロト
ン化アミンである塩として、前記化合物と例えばアルカ
リ金属、アルカリ土類金属、アンモニア及び有機アミン
との塩にも関する。塩は化学中間体として利用されるた
め、それらは、通常生理学上許容されるものであるが必
ずしもそうでなくてもよい。
【０００７】本プロセスは下記式の化合物を製造する上
で特によく適している：
で特によく適している：
【化４】 上記式中Ｒ１及びＲ２の各々は他方から独立して水素、
ヒドロキシ、メトキシ、メチルスルホニル又はメチルチ
オである；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４は水
素、Ｃ１‐Ｃ３アルキル又は陽イオン（即ち、その塩）
である。ここで用いられる“エナンチオマー富化”とい
う用語は、他方と比較して一方のエナンチオマーの量が
多いことをいう。達成されたエナンチオマー富化を示す
上で便利な方法は下記式で示されるエナンチオマー過
剰、即ち“ｅｅ”の概念である： 上記においてＥ１は（Ｌ‐トレオ形のような）一方のキ
ラル形の量であり、Ｅ２は（Ｄ‐トレオ形のような）他
方のキラル形の量である。このため２つのキラル形の初
期比率が５０：５０（１：１）でありかつＬ‐トレオ形
対Ｄ‐トレオ形の最終比率５０：３０（５：３）を得る
上で充分なエナンチオマー富化が達成された場合、Ｌ‐
トレオ形に関するｅｅは２５％である。Ｌ‐トレオ形対
Ｄ‐トレオ形の最終比率が７０：３０（７：３）である
場合、Ｌ‐トレオ形に関するｅｅは４０％である。典型
的には本発明のプロセスに関して、８５％以上のｅｅが
達成可能である。
ヒドロキシ、メトキシ、メチルスルホニル又はメチルチ
オである；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４は水
素、Ｃ１‐Ｃ３アルキル又は陽イオン（即ち、その塩）
である。ここで用いられる“エナンチオマー富化”とい
う用語は、他方と比較して一方のエナンチオマーの量が
多いことをいう。達成されたエナンチオマー富化を示す
上で便利な方法は下記式で示されるエナンチオマー過
剰、即ち“ｅｅ”の概念である： 上記においてＥ１は（Ｌ‐トレオ形のような）一方のキ
ラル形の量であり、Ｅ２は（Ｄ‐トレオ形のような）他
方のキラル形の量である。このため２つのキラル形の初
期比率が５０：５０（１：１）でありかつＬ‐トレオ形
対Ｄ‐トレオ形の最終比率５０：３０（５：３）を得る
上で充分なエナンチオマー富化が達成された場合、Ｌ‐
トレオ形に関するｅｅは２５％である。Ｌ‐トレオ形対
Ｄ‐トレオ形の最終比率が７０：３０（７：３）である
場合、Ｌ‐トレオ形に関するｅｅは４０％である。典型
的には本発明のプロセスに関して、８５％以上のｅｅが
達成可能である。
【０００８】立体異性形の２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ
‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の混合
物は、通常周知の操作を用いて各々グリシン又はアラニ
ンと適切なベンズアルデヒドとの単純な縮合により製造
することができる。この合成は立体選択的でないため、
Ｄ‐トレオ及びＬ‐トレオ異性体の対応２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸のラセミ混合物が生じる。
‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の混合
物は、通常周知の操作を用いて各々グリシン又はアラニ
ンと適切なベンズアルデヒドとの単純な縮合により製造
することができる。この合成は立体選択的でないため、
Ｄ‐トレオ及びＬ‐トレオ異性体の対応２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸のラセミ混合物が生じる。
【０００９】本プロセスにおいて、Ｄ，Ｌ‐トレオ ２
‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸
又はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒ
ドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の混合物はＤ‐ト
レオニンアルドラーゼの作用に付される。酵素プロセス
は一方のキラル形のみで機能する（又は他方よりも実質
上大きな程度に一方のキラル形で機能する）。こうして
Ｄ‐トレオニンアルドラーゼは望ましくないＤ‐異性体
を開裂することで望ましいエナンチオマーの富化を促進
するばかりでなく、プロピオン酸の２‐炭素原子及び３
‐炭素原子間の結合も開裂することで対応ベンズアルデ
ヒド及びアミノ酸のグリシン又はアラニンを産生する。
しかしながら、ベンズアルデヒド及びアミノ酸酵素反応
生成物はＤ，Ｌ‐トレオ形の２‐アミノ‐３‐ヒドロキ
シ‐３‐フェニルプロピオン酸及び２‐アミノ‐２‐メ
チル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸を合
成する上で用いられる出発物質でもある。反応生成物は
それ自体回収されて、各々２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ
‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の追加
合成に関する縮合ステップに逆再循環させることができ
る。
‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸
又はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒ
ドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の混合物はＤ‐ト
レオニンアルドラーゼの作用に付される。酵素プロセス
は一方のキラル形のみで機能する（又は他方よりも実質
上大きな程度に一方のキラル形で機能する）。こうして
Ｄ‐トレオニンアルドラーゼは望ましくないＤ‐異性体
を開裂することで望ましいエナンチオマーの富化を促進
するばかりでなく、プロピオン酸の２‐炭素原子及び３
‐炭素原子間の結合も開裂することで対応ベンズアルデ
ヒド及びアミノ酸のグリシン又はアラニンを産生する。
しかしながら、ベンズアルデヒド及びアミノ酸酵素反応
生成物はＤ，Ｌ‐トレオ形の２‐アミノ‐３‐ヒドロキ
シ‐３‐フェニルプロピオン酸及び２‐アミノ‐２‐メ
チル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸を合
成する上で用いられる出発物質でもある。反応生成物は
それ自体回収されて、各々２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ
‐３‐フェニルプロピオン酸又は２‐アミノ‐２‐メチ
ル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の追加
合成に関する縮合ステップに逆再循環させることができ
る。
【００１０】例えば、式ＩのＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸はＤ‐
トレオニンアルドラーゼの作用に付される：
ノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸はＤ‐
トレオニンアルドラーゼの作用に付される：
【化５】 上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はここで定義された
とおりである。Ｄ‐トレオニンアルドラーゼ酵素は公知
であり、例えば下記カトーら及びヤマダらの操作に従い
得られる。その酵素はトレオニンとの具体的接触歴のな
い土壌でみられる汎存微生物から得ることもできる。こ
の後者の技術において、その微生物は培養され、適切な
増殖培地及びＤ‐トレオニン中でインキュベートされ、
しかる後継代培養され、増殖培地及びＤ‐トレオニンの
ケモスタット中でインキュベートされる。更にインキュ
ベート後、Ｄ‐トレオニンアルドラーゼ酵素を産生する
単一コロニーが単離できる。その酵素は、例えば細胞を
破壊して酵素含有上澄を回収するようなそれ自体公知の
操作を用いて細胞から抽出することができる。最終的酵
素は無細胞抽出物又は全細胞調製物のいずれかとして遊
離未結合形で使用できるか、あるいは架橋デキストラ
ン、アガロース、シリカ、ポリアミド又はセルロースの
ような適切な支持体又はマトリックス上に固定すること
ができる。酵素はポリアクリルアミド、アルギネート、
ファイバー等でカプセル化してもよい。このような固定
化方法は文献で記載されている（例えば、Methods of E
nzymology,44,1976 参照）。
とおりである。Ｄ‐トレオニンアルドラーゼ酵素は公知
であり、例えば下記カトーら及びヤマダらの操作に従い
得られる。その酵素はトレオニンとの具体的接触歴のな
い土壌でみられる汎存微生物から得ることもできる。こ
の後者の技術において、その微生物は培養され、適切な
増殖培地及びＤ‐トレオニン中でインキュベートされ、
しかる後継代培養され、増殖培地及びＤ‐トレオニンの
ケモスタット中でインキュベートされる。更にインキュ
ベート後、Ｄ‐トレオニンアルドラーゼ酵素を産生する
単一コロニーが単離できる。その酵素は、例えば細胞を
破壊して酵素含有上澄を回収するようなそれ自体公知の
操作を用いて細胞から抽出することができる。最終的酵
素は無細胞抽出物又は全細胞調製物のいずれかとして遊
離未結合形で使用できるか、あるいは架橋デキストラ
ン、アガロース、シリカ、ポリアミド又はセルロースの
ような適切な支持体又はマトリックス上に固定すること
ができる。酵素はポリアクリルアミド、アルギネート、
ファイバー等でカプセル化してもよい。このような固定
化方法は文献で記載されている（例えば、Methods of E
nzymology,44,1976 参照）。
【００１１】そのプロセスの実施に際して、酵素はＤ‐
及びＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸又はＤ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸の混合物に加えられ、しかる後反応混合物は望ま
しいエナンチオマー過剰のＬ‐エナンチオマーが得られ
るまで酵素上活性な温度（約４０℃）で維持される。こ
のポイントは例えばキラルＨＰＬＣで容易に調べること
ができる。質量作用によりより高いｅｅを得るため反応
混合物から一方の反応物質を除去することが普通有利で
ある。反応物質は物理的に除去する必要はないが、但し
酵素反応環境から簡単に単離される。例えば、一方の反
応生成物が優先的に可溶的な共溶媒の利用はｅｅを増加
させる。ベンズアルデヒドは塩化メチレン及びクロロホ
ルムのようなハロゲン化アルカン、ペンタン‐２‐オン
又はメチルイソブチルケトンのような低級アルカノン
（即ち炭素原子３〜１０を有する）及びベンゼンのよう
な芳香族炭化水素に高度に可溶性である。反応混合物中
へのかかる溶媒の配合は有利な効果を有する。一方、ア
ルデヒドが吸着されるアンバーライト(Amberlite) 又は
ダウエックス(Dowex) のような非イオン系吸着剤タイプ
樹脂の添加も同様の原理でｅｅを改善する。
及びＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸又はＤ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピ
オン酸の混合物に加えられ、しかる後反応混合物は望ま
しいエナンチオマー過剰のＬ‐エナンチオマーが得られ
るまで酵素上活性な温度（約４０℃）で維持される。こ
のポイントは例えばキラルＨＰＬＣで容易に調べること
ができる。質量作用によりより高いｅｅを得るため反応
混合物から一方の反応物質を除去することが普通有利で
ある。反応物質は物理的に除去する必要はないが、但し
酵素反応環境から簡単に単離される。例えば、一方の反
応生成物が優先的に可溶的な共溶媒の利用はｅｅを増加
させる。ベンズアルデヒドは塩化メチレン及びクロロホ
ルムのようなハロゲン化アルカン、ペンタン‐２‐オン
又はメチルイソブチルケトンのような低級アルカノン
（即ち炭素原子３〜１０を有する）及びベンゼンのよう
な芳香族炭化水素に高度に可溶性である。反応混合物中
へのかかる溶媒の配合は有利な効果を有する。一方、ア
ルデヒドが吸着されるアンバーライト(Amberlite) 又は
ダウエックス(Dowex) のような非イオン系吸着剤タイプ
樹脂の添加も同様の原理でｅｅを改善する。
【００１２】酵素反応後又はその最中に、産生されたベ
ンズアルデヒド及びアミノ酸は前記のように再循環させ
ることができる。未開裂のＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸自体は単離さ
れて、公知技術に従い処理される。例えばそれは対応２
‐アミノ‐３‐フェニルプロパン‐１，３‐ジオールを
得るため前記技術に従いエステル化され、しかる後還元
できる。フェニル基が４位にメチルスルホニル基を有す
る場合、このジオールはチアムフェニコールを得る上で
単にジクロロアセチル化されることを要する。フェニル
基が４位にメチルチオ基を有する場合、ジオールはジク
ロロアセチル化でき、しかる後再度チアムフェニコール
を得るため過酢酸で酸化される。フロルフェニコールの
製造において、チアムフェニコールはＤ‐トレオ ２‐
（ジクロロアセトアミド）‐３‐（３‐メチルスルホニ
ルフェニル）‐３‐フルオロプロパン‐１‐オールを得
るため再び慣用的な条件を用いて直接フッ素化すること
ができる。一方、Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸は前記のようにエステ
ル化及び還元され、しかる後アミノ基は例えばフタルイ
ミド誘導体の形成で保護され、これがフッ素化され、ア
ミノ保護基の除去後にＤ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
（３‐メチルスルホニルフェニル）‐３‐フルオロプロ
パン‐１‐オールが前記のようにジクロロアセチル化さ
れる。
ンズアルデヒド及びアミノ酸は前記のように再循環させ
ることができる。未開裂のＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸自体は単離さ
れて、公知技術に従い処理される。例えばそれは対応２
‐アミノ‐３‐フェニルプロパン‐１，３‐ジオールを
得るため前記技術に従いエステル化され、しかる後還元
できる。フェニル基が４位にメチルスルホニル基を有す
る場合、このジオールはチアムフェニコールを得る上で
単にジクロロアセチル化されることを要する。フェニル
基が４位にメチルチオ基を有する場合、ジオールはジク
ロロアセチル化でき、しかる後再度チアムフェニコール
を得るため過酢酸で酸化される。フロルフェニコールの
製造において、チアムフェニコールはＤ‐トレオ ２‐
（ジクロロアセトアミド）‐３‐（３‐メチルスルホニ
ルフェニル）‐３‐フルオロプロパン‐１‐オールを得
るため再び慣用的な条件を用いて直接フッ素化すること
ができる。一方、Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロ
キシ‐３‐フェニルプロピオン酸は前記のようにエステ
ル化及び還元され、しかる後アミノ基は例えばフタルイ
ミド誘導体の形成で保護され、これがフッ素化され、ア
ミノ保護基の除去後にＤ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
（３‐メチルスルホニルフェニル）‐３‐フルオロプロ
パン‐１‐オールが前記のようにジクロロアセチル化さ
れる。
【００１３】下記例は本発明を更に説明するために役立
つが、但しその範囲に関する制限として解釈されるべき
でなく、その範囲は請求の範囲のみで規定される。例１ ラセミＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸（０．７
ｇ）を５０mMホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．４）２０ml、
８mMピリドキサール‐５‐リン酸１ml及びＤ‐トレオニ
ンアルドラーゼ抽出物４mlの混合液に加える。反応液は
９８％以上のエナンチオマー過剰（キラルＨＰＬＣによ
り測定）のＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸が得られ
るまで、通常約６０〜７０分間にわたりこれらの条件下
４０℃で維持する。
つが、但しその範囲に関する制限として解釈されるべき
でなく、その範囲は請求の範囲のみで規定される。例１ ラセミＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸（０．７
ｇ）を５０mMホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．４）２０ml、
８mMピリドキサール‐５‐リン酸１ml及びＤ‐トレオニ
ンアルドラーゼ抽出物４mlの混合液に加える。反応液は
９８％以上のエナンチオマー過剰（キラルＨＰＬＣによ
り測定）のＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸が得られ
るまで、通常約６０〜７０分間にわたりこれらの条件下
４０℃で維持する。
【００１４】例２ Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐（４‐メチルチオフェニ
ル）プロパン‐１，３‐ジオール（例１の操作で得られ
た）２．５ｇ及びジクロロ酢酸エチル３．６mlの混合液
を約１００℃で約３時間加熱する。反応生成物をエチレ
ンクロリドに溶解し、活性炭で濾過する。濾液を冷却
し、濾液をニトロエタンから再結晶化して、Ｄ‐トレオ
２‐ジクロロアセトアミド‐３‐（４‐メチルチオフ
ェニル）プロパン‐１，３‐ジオールを得る；m.p.１１
１．６‐１１２．６℃，〔α〕Ｄ 25＋１２゜（エタノー
ル中１％）
ル）プロパン‐１，３‐ジオール（例１の操作で得られ
た）２．５ｇ及びジクロロ酢酸エチル３．６mlの混合液
を約１００℃で約３時間加熱する。反応生成物をエチレ
ンクロリドに溶解し、活性炭で濾過する。濾液を冷却
し、濾液をニトロエタンから再結晶化して、Ｄ‐トレオ
２‐ジクロロアセトアミド‐３‐（４‐メチルチオフ
ェニル）プロパン‐１，３‐ジオールを得る；m.p.１１
１．６‐１１２．６℃，〔α〕Ｄ 25＋１２゜（エタノー
ル中１％）
【００１５】例３ Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐（４‐
メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸を例１の操作
に従いＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸か
ら得る。次いでＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキ
シ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン
酸を前記のようにエステル化及び還元し、Ｄ‐トレオ
２‐アミノ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プ
ロパン‐１，３‐ジオールを得る；m.p.２０１‐２０２
℃，〔α〕Ｄ 20−２５．５゜ Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐（４‐メチルスルホニル
フェニル）プロパン‐１，３‐ジオールを例２の操作と
同様の方式でジクロロアセチル化に付し、チアムフェニ
コールを得る；m.p.１６４．３‐１６６．３℃，〔α〕
Ｄ 25＋１２．９゜（エタノール中１％） 一方、チアムフェニコールは慣用的条件下で過酢酸での
酸化により例２のＤ‐トレオ ２‐ジクロロアセトアミ
ド‐３‐（４‐メチルチオフェニル）プロパン‐１，３
‐ジオールから得ることができる。
メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸を例１の操作
に従いＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸か
ら得る。次いでＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキ
シ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン
酸を前記のようにエステル化及び還元し、Ｄ‐トレオ
２‐アミノ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プ
ロパン‐１，３‐ジオールを得る；m.p.２０１‐２０２
℃，〔α〕Ｄ 20−２５．５゜ Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐（４‐メチルスルホニル
フェニル）プロパン‐１，３‐ジオールを例２の操作と
同様の方式でジクロロアセチル化に付し、チアムフェニ
コールを得る；m.p.１６４．３‐１６６．３℃，〔α〕
Ｄ 25＋１２．９゜（エタノール中１％） 一方、チアムフェニコールは慣用的条件下で過酢酸での
酸化により例２のＤ‐トレオ ２‐ジクロロアセトアミ
ド‐３‐（４‐メチルチオフェニル）プロパン‐１，３
‐ジオールから得ることができる。
【００１６】例４ 水酸化ナトリウム（６ｇ、１５０mmol）及びＤ，Ｌ‐ア
ラニン８．９ｇ（１００mmol）を水２５mlに溶解し、溶
液を窒素雰囲気下で攪拌しながら約５．５℃に冷却す
る。その溶液にベンズアルデヒド２１．２ｇ（２００mm
ol）を加え、混合液を５．５℃で約１時間攪拌する。次
いで混合液を室温まで加温し、約２０時間維持する。次
いで濃塩酸を反応混合液に加えてｐＨ２．０にする。酸
性溶液を２時間攪拌した後、水相を分離し、酢酸エチル
で抽出し、真空下で蒸発させる。得られた物質を熱無水
エタノール８０mlで２回抽出し、しかる後エタノールを
蒸発させる。得られた物質を無水エタノール４０mlで再
度抽出し、しかる後エタノールを除去する。次いで抽出
物を少くとも１：１メタノール：水の溶液に溶解し、ポ
リメタクリレートカラムに吸着させる。次いでカラムを
同一の１：１メタノール：水の溶液で溶出させ、３０ml
画分を合わせて蒸発させる。次いでポリメタクリレート
カラムによる精製を９５％エタノールで繰り返して、ラ
セミ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸を得る。
ラニン８．９ｇ（１００mmol）を水２５mlに溶解し、溶
液を窒素雰囲気下で攪拌しながら約５．５℃に冷却す
る。その溶液にベンズアルデヒド２１．２ｇ（２００mm
ol）を加え、混合液を５．５℃で約１時間攪拌する。次
いで混合液を室温まで加温し、約２０時間維持する。次
いで濃塩酸を反応混合液に加えてｐＨ２．０にする。酸
性溶液を２時間攪拌した後、水相を分離し、酢酸エチル
で抽出し、真空下で蒸発させる。得られた物質を熱無水
エタノール８０mlで２回抽出し、しかる後エタノールを
蒸発させる。得られた物質を無水エタノール４０mlで再
度抽出し、しかる後エタノールを除去する。次いで抽出
物を少くとも１：１メタノール：水の溶液に溶解し、ポ
リメタクリレートカラムに吸着させる。次いでカラムを
同一の１：１メタノール：水の溶液で溶出させ、３０ml
画分を合わせて蒸発させる。次いでポリメタクリレート
カラムによる精製を９５％エタノールで繰り返して、ラ
セミ２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フ
ェニルプロピオン酸を得る。
【００１７】例５ 下記操作はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐２‐メチル‐
３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸のラセミ混
合物のＬ‐異性体への分割を行うためのＤ‐トレオニン
アルドラーゼの使用について例示する。Ｄ，Ｌ‐トレオ
２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェ
ニルプロピオン酸（１４．１mM）を５０mMホウ酸緩衝液
及び０．８mMピリドキサールリン酸中で酵素約３００μ
Ｌ含有破壊細胞と共にｐＨ８．７５でインキュベートす
る。約３０、１２０及び２１０分間の時間間隔で、イン
キュベート混合物２００μＬを取出し、１％過塩素酸８
００μＬで希釈する。この混合液の遠心後、上澄をＨＰ
ＬＣで分析する。以下はラセミ混合物の分割に関する酵
素の有効性について示している。 30min 120min 210min 基質 酵素 全面積1 ％2 全面積 ％ 全面積 ％ αＭφＳ3 0 223 0 227 3.1 229 3.5 αＭφＳ 300μL 221 0 237 4.6 252 10.7 αＭφＳ＋ＴφＳ4 300μL 528 18.6 535 21.1 540 22.4 ＴφＳ 150μL 300 27.3 302 32.1 301 34.6ＴφＳ 0 400 0 400 2.2 382 3.7 １．基質、対応ベンズアルデヒド及び安息香酸の全積分
面積 ２．ベンズアルデヒド及び安息香酸に関する全面積の％ ３．αＭφＳ＝α‐メチルフェニルセリン（２‐アミノ
‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオ
ン酸）；１４．１mM ４．ＴφＳ＝トレオ フェニルセリン（２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸）；１３．９
mM 次いでこうして得られたＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
ヒドロキシ‐３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオ
ン酸は公知の方法に従いエステル化されて水素化ホウ素
ナトリウムで還元され、Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
（４‐メチルチオフェニル）プロパン‐１，３‐ジオー
ルを生じる；m.p.１５１．９‐１５２．９℃，〔α〕Ｄ
25−２１゜（エタノール中１％）
３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸のラセミ混
合物のＬ‐異性体への分割を行うためのＤ‐トレオニン
アルドラーゼの使用について例示する。Ｄ，Ｌ‐トレオ
２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェ
ニルプロピオン酸（１４．１mM）を５０mMホウ酸緩衝液
及び０．８mMピリドキサールリン酸中で酵素約３００μ
Ｌ含有破壊細胞と共にｐＨ８．７５でインキュベートす
る。約３０、１２０及び２１０分間の時間間隔で、イン
キュベート混合物２００μＬを取出し、１％過塩素酸８
００μＬで希釈する。この混合液の遠心後、上澄をＨＰ
ＬＣで分析する。以下はラセミ混合物の分割に関する酵
素の有効性について示している。 30min 120min 210min 基質 酵素 全面積1 ％2 全面積 ％ 全面積 ％ αＭφＳ3 0 223 0 227 3.1 229 3.5 αＭφＳ 300μL 221 0 237 4.6 252 10.7 αＭφＳ＋ＴφＳ4 300μL 528 18.6 535 21.1 540 22.4 ＴφＳ 150μL 300 27.3 302 32.1 301 34.6ＴφＳ 0 400 0 400 2.2 382 3.7 １．基質、対応ベンズアルデヒド及び安息香酸の全積分
面積 ２．ベンズアルデヒド及び安息香酸に関する全面積の％ ３．αＭφＳ＝α‐メチルフェニルセリン（２‐アミノ
‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオ
ン酸）；１４．１mM ４．ＴφＳ＝トレオ フェニルセリン（２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸）；１３．９
mM 次いでこうして得られたＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
ヒドロキシ‐３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオ
ン酸は公知の方法に従いエステル化されて水素化ホウ素
ナトリウムで還元され、Ｄ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐
（４‐メチルチオフェニル）プロパン‐１，３‐ジオー
ルを生じる；m.p.１５１．９‐１５２．９℃，〔α〕Ｄ
25−２１゜（エタノール中１％）
【００１８】例６ Ｄ‐トレオニンアルドラーゼはアルカリゲネス・ファエ
カリス(Alcaligenes faecalis)（受託番号ＩＦＯ‐１
２，６６９として日本、大阪の微生物研究所に寄託）、
シュードモナスＤＫ‐２(Pseudomonas DK-2)（受託番号
ＦＥＲＭ‐Ｐ No.６２００として日本の通産省、工業技
術院、微生物工業技術研究所に寄託）及びＦＥＲＭ‐Ｐ
No.６２０１のアルスロバクターＤＫ‐１９(Arthrobac
ter DK-19)のような様々な微生物により産生される。例
えばカトーらの米国特許第４，４９２，７５７号明細書
及びヤマダらの日本特許出願第５６‐２０９９８３号明
細書参照。
カリス(Alcaligenes faecalis)（受託番号ＩＦＯ‐１
２，６６９として日本、大阪の微生物研究所に寄託）、
シュードモナスＤＫ‐２(Pseudomonas DK-2)（受託番号
ＦＥＲＭ‐Ｐ No.６２００として日本の通産省、工業技
術院、微生物工業技術研究所に寄託）及びＦＥＲＭ‐Ｐ
No.６２０１のアルスロバクターＤＫ‐１９(Arthrobac
ter DK-19)のような様々な微生物により産生される。例
えばカトーらの米国特許第４，４９２，７５７号明細書
及びヤマダらの日本特許出願第５６‐２０９９８３号明
細書参照。
【００１９】加えて、Ｄ‐トレオニンアルドラーゼ産生
微生物は土壌サンプルから下記のように単離することが
できる。トレオニンとの具体的接触歴のない土壌サンプ
ルを水性培地（以下“培地Ａ”と称される）５０ml含有
のシェイクフラスコに播種するが、その培地は典型的に
は下記組成濃度を有する： ＮＨ４Ｃｌ 1 g/L ＭｇＣｌ 1 g/L ＣａＣｌ２ 0.015g/L ＫＨ２ＰＯ４ 2.7 g/L ＮａＯＨ 0.5 g/L 及び標準微量元素溶液 1 mL/L ： ＭｇＳＯ４ 1 g/L ＣａＣｌ２ 0.21 g/L ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 0.2 mg/L ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ 0.1 mg/L Ｈ３ＢＯ３ 0.02mg/L ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ 0.10mg/L ＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ 0.05mg/L ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ 0.01mg/L ＦｅＳＯ４ 1.5 mg/L ＮａＭｏＯ４ 2.0 mg/L Ｆｅ ＥＤＴＡ 5.0 mg/L ＫＨ２ＰＯ４ 20.0 mM ＮａＯＨ pH 7まで 標準微量元素溶液の組成は重要でないが、但し変数とし
てのそれを除去するためにすべての操作に対して標準化
される。培地Ａ及び微生物含有土壌を３．０g/L Ｄ‐ト
レオニンで播種し、３０℃で５日間振盪（２００rpm)し
ながらインキュベートする。次いで１mlサンプルを同様
のシェイク‐フラスコ内に継代培養し、混濁するまで上
記のように再びインキュベートする。次いで混濁培養物
の５mlサンプルを培地Ａ及び３．０g/L Ｄ‐トレオニン
含有のケモスタットに播種し、希釈速度０．０３/minで
２週間にわたり継続的に維持する。液体培地をケモスタ
ットから培地Ａ及び１５g/L ノーブル(Noble) 寒天含有
の寒天プレート上に継代培養する。３０℃で５日間イン
キュベート後、単一コロニーを単離する。単離された株
はグラム陰性、棒形であり、細胞壁脂肪酸組成からアル
カリゲネス・デントリフィカンス・キシロソキシダンス
(Alcaligenes dentrificans xylosoxydans) として同定
される。６．０g/L Ｄ‐トレオニン含有培地Ａ５０mlを
アルカリゲネス・デントリフィカンス・キシロソキシダ
ンスで播種する。混合液を３７℃で４８時間インキュベ
ートした後、混合液１０mlを６．０g/L Ｄ‐トレオニン
含有培地Ａ２５０mlに継代培養する。３７℃で４０時間
インキュベート後、細胞を１０，０００Ｇで遠心により
ペーストに濃縮し、ｐＨ７のリン酸緩衝液５０mlで洗浄
し、再び１０，０００Ｇで遠心によりペーストに濃縮す
る。次いで洗浄されたペーストを１７，０００psi （約
１２００ kg/cm2 ）でフレンチプレス(French Press)に
通して細胞を破壊し、細胞抽出物を得る。細胞砕片を１
００，０００Ｇで１時間の遠心により除去し、酵素含有
上澄を集める。
微生物は土壌サンプルから下記のように単離することが
できる。トレオニンとの具体的接触歴のない土壌サンプ
ルを水性培地（以下“培地Ａ”と称される）５０ml含有
のシェイクフラスコに播種するが、その培地は典型的に
は下記組成濃度を有する： ＮＨ４Ｃｌ 1 g/L ＭｇＣｌ 1 g/L ＣａＣｌ２ 0.015g/L ＫＨ２ＰＯ４ 2.7 g/L ＮａＯＨ 0.5 g/L 及び標準微量元素溶液 1 mL/L ： ＭｇＳＯ４ 1 g/L ＣａＣｌ２ 0.21 g/L ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 0.2 mg/L ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ 0.1 mg/L Ｈ３ＢＯ３ 0.02mg/L ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ 0.10mg/L ＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ 0.05mg/L ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ 0.01mg/L ＦｅＳＯ４ 1.5 mg/L ＮａＭｏＯ４ 2.0 mg/L Ｆｅ ＥＤＴＡ 5.0 mg/L ＫＨ２ＰＯ４ 20.0 mM ＮａＯＨ pH 7まで 標準微量元素溶液の組成は重要でないが、但し変数とし
てのそれを除去するためにすべての操作に対して標準化
される。培地Ａ及び微生物含有土壌を３．０g/L Ｄ‐ト
レオニンで播種し、３０℃で５日間振盪（２００rpm)し
ながらインキュベートする。次いで１mlサンプルを同様
のシェイク‐フラスコ内に継代培養し、混濁するまで上
記のように再びインキュベートする。次いで混濁培養物
の５mlサンプルを培地Ａ及び３．０g/L Ｄ‐トレオニン
含有のケモスタットに播種し、希釈速度０．０３/minで
２週間にわたり継続的に維持する。液体培地をケモスタ
ットから培地Ａ及び１５g/L ノーブル(Noble) 寒天含有
の寒天プレート上に継代培養する。３０℃で５日間イン
キュベート後、単一コロニーを単離する。単離された株
はグラム陰性、棒形であり、細胞壁脂肪酸組成からアル
カリゲネス・デントリフィカンス・キシロソキシダンス
(Alcaligenes dentrificans xylosoxydans) として同定
される。６．０g/L Ｄ‐トレオニン含有培地Ａ５０mlを
アルカリゲネス・デントリフィカンス・キシロソキシダ
ンスで播種する。混合液を３７℃で４８時間インキュベ
ートした後、混合液１０mlを６．０g/L Ｄ‐トレオニン
含有培地Ａ２５０mlに継代培養する。３７℃で４０時間
インキュベート後、細胞を１０，０００Ｇで遠心により
ペーストに濃縮し、ｐＨ７のリン酸緩衝液５０mlで洗浄
し、再び１０，０００Ｇで遠心によりペーストに濃縮す
る。次いで洗浄されたペーストを１７，０００psi （約
１２００ kg/cm2 ）でフレンチプレス(French Press)に
通して細胞を破壊し、細胞抽出物を得る。細胞砕片を１
００，０００Ｇで１時間の遠心により除去し、酵素含有
上澄を集める。
【００２０】例７ ラセミＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸混合物又
はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐
（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸混合物
のＬ‐トレオへの富化後に、水溶液から対応する各々の
４‐メチルチオベンズアルデヒド又は４‐メチルスルホ
ニルベンズアルデヒドの再生はシッフ塩基を開裂させる
ため塩酸でｐＨを０．５に低下させることで行う。こう
して形成されたアルデヒドを濾取し、縮合ステップに逆
再循環させる。
３‐（４‐メチルチオフェニル）プロピオン酸混合物又
はＤ，Ｌ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐
（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸混合物
のＬ‐トレオへの富化後に、水溶液から対応する各々の
４‐メチルチオベンズアルデヒド又は４‐メチルスルホ
ニルベンズアルデヒドの再生はシッフ塩基を開裂させる
ため塩酸でｐＨを０．５に低下させることで行う。こう
して形成されたアルデヒドを濾取し、縮合ステップに逆
再循環させる。
【００２１】例８ Ｄ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸
（０．８ｇ）の混合物を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）１０ml、０．５mMピリドキサール‐５‐リン酸
及び塩化メチレン２０mlと混ぜる。粗製Ｄ‐トレオニン
アルドラーゼ１０mlを加えて、反応を開始させる。９０
分間後、ｅｅは９４％であった。
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸
（０．８ｇ）の混合物を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）１０ml、０．５mMピリドキサール‐５‐リン酸
及び塩化メチレン２０mlと混ぜる。粗製Ｄ‐トレオニン
アルドラーゼ１０mlを加えて、反応を開始させる。９０
分間後、ｅｅは９４％であった。
【００２２】例９ Ｄ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸
（２．０ｇ）の混合物を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）、０．８mMピリドキサール‐５‐リン酸及び１
００mM塩化ナトリウムの１０ml溶液に加える。湿潤アン
バーライトＸＡＤ‐１６樹脂２０ｇを粗製Ｄ‐トレオニ
ンアルドラーゼ１０mlと一緒に加える。反応混合液を激
しくミックスしながら４２℃で１２０分間攪拌し、ｅｅ
９６％でＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸を産
生する。
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸
（２．０ｇ）の混合物を５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）、０．８mMピリドキサール‐５‐リン酸及び１
００mM塩化ナトリウムの１０ml溶液に加える。湿潤アン
バーライトＸＡＤ‐１６樹脂２０ｇを粗製Ｄ‐トレオニ
ンアルドラーゼ１０mlと一緒に加える。反応混合液を激
しくミックスしながら４２℃で１２０分間攪拌し、ｅｅ
９６％でＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸を産
生する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マッパラ、エス、ラジュ アメリカ合衆国ニュージャージー州、ブ リッジウォーター、パペン、ロード、 896 (72)発明者 デイビッド、アイ、スターリング アメリカ合衆国ニュージャージー州、フ ァンウッド、ロイス、プレイス、４ (56)参考文献 特開 昭58−116691（ＪＰ，Ａ) 仏国特許出願公開2378746（ＦＲ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 41/00 C12P 13/04 C12P 11/00 C12P 7/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (17)
- 【請求項１】下記式のＤ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミノ
‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の混合
物： 【化１】 〔上記式中Ｒ１及びＲ２の各々は他方から独立して水
素、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリフルオロメチル、
低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルスルホニ
ル、低級アルキルスルフィニル又は低級アルキルチオで
ある；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４は水素又
はカルボン酸保護基である〕又はＲ４が水素である場合
塩基とのその塩のエナンチオマー富化方法であって、 実質的量のＤ‐トレオエナンチオマーが対応ベンズアル
デヒド及び式Ｒ３ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＲ４のアミノ酸
誘導体に変換されるまで、Ｄ‐トレオエナンチオマーに
は酵素的に活性であるが但しＬ‐トレオエナンチオマー
には実質上不活性であるＤ‐トレオニンアルドラーゼと
水性媒体中で上記混合物を接触させることからなり、一
方でＬ‐トレオエナンチオマーが実質上未変換のままで
あることを特徴とする方法。 - 【請求項２】Ｄ‐及びＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒ
ドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸が下記式： 【化２】 〔上記式中Ｒ１及びＲ２の各々は他方から独立して水
素、ヒドロキシ、メトキシ、メチルスルホニル又はメチ
ルチオである；Ｒ３は水素又はメチルである；及びＲ４
は水素、Ｃ１‐Ｃ３アルキル又は陽イオンである〕のも
のである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】Ｒ１がメチルチオ、Ｒ２が水素である、請
求項２に記載の方法。 - 【請求項４】Ｒ１がメチルスルホニル、Ｒ２が水素であ
る、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】Ｒ３がメチルである、請求項２に記載の方
法。 - 【請求項６】Ｌ‐トレオエナンチオマーが反応混合物か
ら回収される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】ベンズアルデヒド及びアミノ酸誘導体のう
ち少なくとも一方が実質的量で反応混合物から回収され
る、請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】混合物が反応混合物からベンズアルデヒド
及びアミノ酸誘導体双方のうちいずれかを除去するよう
に作用しうる少なくとも１種の物質の存在下でＤ‐トレ
オニンアルドラーゼと接触される、請求項２に記載の方
法。 - 【請求項９】除去物質は反応生成物のうち一方が優先的
に可溶性である有機溶媒である、請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】有機溶媒が少なくとも１種のハロゲン化
アルカン、低級アルカノン又は芳香族炭化水素を含む、
請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】除去物質が非イオン系吸着剤タイプ樹脂
である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】（ｉ）２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸のエ
ステルを形成するため立体異性に富むＬ‐トレオ ２‐
アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐（４‐メチルスルホニル
フェニル）プロピオン酸をエステル化する；（ii）２‐
アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐（４‐メチルスルホニル
フェニル）プロパン‐１，３‐ジオールを形成するため
そのエステルを還元する；及び（iii)チアムフェニコー
ルを形成するため上記ジオールをジクロロアセチル化す
るステップを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】（ｉ）２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸のエ
ステルを形成するためＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒ
ドロキシ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロ
ピオン酸をエステル化する；（ii）３‐（４‐メチルス
ルホニルフェニル）‐２‐アミノプロパン‐１，３‐ジ
オールを形成するためそのエステルを還元する；（iii)
Ｄ‐トレオ ３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）‐
２‐（ジクロロアセトアミド）プロパン‐１，３‐ジオ
ールを形成するためそのジオールをジクロロアセチル化
する；及び（iv）フロルフェニコールを形成するためＤ
‐トレオ ３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）‐２
‐（ジクロロアセトアミド）プロパン‐１，３‐ジオー
ルをフッ素化するステップを含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１４】（ｉ）２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３
‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロピオン酸のエ
ステルを形成するためＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒ
ドロキシ‐３‐（４‐メチルスルホニルフェニル）プロ
ピオン酸をエステル化する；（ii）２‐アミノ‐３‐
（４‐メチルスルホニルフェニル）プロパン‐１，３‐
ジオールを形成するためそのエステルを還元する；（ii
i)ジオールの２‐アミノ基をアミノ保護基で保護する；
（iv）保護ジオールの３‐ヒドロキシ基をフッ素化す
る；（ｖ）アミノ保護基を除去する；及び（vi）フロル
フェニコールを形成するため非保護アミノ基をジクロロ
アセチル化するステップを含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１５】対応非置換又は置換ベンズアルデヒドが
グリシンと縮合され、しかる後得られた２‐アミノ‐３
‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸のＤ，Ｌ‐ト
レオエナンチオマー形が分離される、フェニル環におい
て非置換であるか又は置換されたＬ‐トレオ ２‐アミ
ノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の製造
方法であって、 改善がＬ‐トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐
フェニルプロピオン酸の実質的開裂なしに選択的にＤ‐
トレオ ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプ
ロピオン酸をグリシン及び対応ベンズアルデヒドに開裂
するために上記エナンチオマー形のＤ，Ｌ‐トレオ ２
‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸
をＤ‐トレオニンアルドラーゼの作用に付すことからな
る方法。 - 【請求項１６】改善が更にベンズアルデヒド及びグリシ
ンを除去して少なくとも一つを縮合ステップに再循環さ
せることからなる、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】α‐炭素原子でＤ‐及びＬ‐配置を有す
る２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐ヒドロキシ‐３‐
（３，４‐ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸の異性
体混合物が分割され、α‐炭素原子でＬ‐配置を有する
中間体が３位のヒドロキシ基を除去するために水素添加
される２‐アミノ‐２‐メチル‐３‐（３，４‐ジヒド
ロキシフェニル）プロピオン酸の製造方法であって、 改善がα‐炭素原子でＤ‐配置を有する異性体を選択的
に開裂するため上記異性体混合物をＤ‐トレオニンアル
ドラーゼの作用に付すことからなる方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67610291A | 1991-03-27 | 1991-03-27 | |
| US68930091A | 1991-04-22 | 1991-04-22 | |
| US844724 | 1992-03-02 | ||
| US676102 | 1992-03-02 | ||
| US07/844,724 US5346828A (en) | 1991-03-27 | 1992-03-02 | Stereoisomeric enrichment of 2-amino-3-hydroxy-3-phenylpropionic acids using d-threonine aldolase |
| US689300 | 1992-03-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125790A JPH06125790A (ja) | 1994-05-10 |
| JP3142627B2 true JP3142627B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04065132A Expired - Lifetime JP3142627B2 (ja) | 1991-03-27 | 1992-03-23 | ２‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐３‐フェニルプロピオン酸の立体異性富化 |
Country Status (17)
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| EP (1) | EP0507153B1 (ja) |
| JP (1) | JP3142627B2 (ja) |
| KR (1) | KR100250513B1 (ja) |
| AT (1) | ATE155175T1 (ja) |
| AU (1) | AU645895B2 (ja) |
| CA (1) | CA2064349C (ja) |
| CZ (1) | CZ289218B6 (ja) |
| DE (1) | DE69220701T2 (ja) |
| DK (1) | DK0507153T3 (ja) |
| ES (1) | ES2106101T3 (ja) |
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| IE (1) | IE920866A1 (ja) |
| IL (1) | IL101268A (ja) |
| NZ (1) | NZ242040A (ja) |
| SK (1) | SK282932B6 (ja) |
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| EP0734453A1 (en) * | 1993-12-17 | 1996-10-02 | Dsm N.V. | Phenylserine amides and the preparation of phenylserines/phenylserine amides |
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| CN115611785B (zh) * | 2022-12-19 | 2023-03-14 | 天津工微生物科技有限公司 | (2r,3s)-2-氨基-3-羟基-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)丙酸的纯化方法 |
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-
1992
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