JP2702376B2 - α−Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸が修飾されたヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン - Google Patents

α−Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸が修飾されたヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、α−Ｌ−イズロン酸−
２−Ｏ−硫酸が修飾されたヘパリンまたはヘパラン構造
を有する新規半合成グリコサミノグリカン、より詳しく
は、α−Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸が２位において
硫酸基の全部もしくは一部が求核基で置換されることに
より修飾されたヘパリンまたはヘパラン構造を有する新
規半合成グリコサミノグリカンおよびその製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】欧州
特許出願公開第０３４７５８８号明細書（以下、ＥＰ−
０３４７５８８という）において、塩基性媒体中ヘパリ
ンおよびヘパラン構造を有するグリコサミノグリカンの
構造修飾を行ない、つづいて化学的および物理的性質に
より、とくに13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより間違いなく
証明されるように、当時の技術に関して新規な誘導体を
反応混合物から単離することが記載されている。
【０００３】つづく欧州特許出願公開第０３８０９４３
号明細書（以下、ＥＰ−０３８０９４３という）におい
て、塩基性または中性媒体中、ＥＰ−０３４７５８８に
記載の反応条件で形成される生成物から、およびＥＰ−
０３４７５８８で出発物質として用いられるヘパリンま
たはヘパラン構造を有するグリコサミノグリカンから出
発して、化学的および物理的性質により、とくに13Ｃ−
ＮＭＲスペクトルにより間違いなく証明されるように、
ＥＰ−０３４７５８８に記載される化合物とは異なり、
当時の技術に関して新規な一組の生成物をつくるさらな
る構造修飾が記載されている。
【０００４】ＥＰ−０３４７５８８に記載されている生
成物の化学的および物理的性質およびカナディアン ジ
ャーナル オブ ケミストリー(Can. J. Chem.) 67，14
49〜56(1989)においてジャセイア エム(Jaseia M.) 、
レジ アール(Rej R.)、ソウリオル エフ(Sauriol
F.)、パーリン エイエス(Perlin A.S.) により記載さ
れた塩基性媒体中の構造修飾の反応のメカニズムを説明
するという特定の目的をもったのちの構造研究の結果に
より、これらの誘導体はヘパリンまたはヘパラン構造を
有するグリコサミノグリカンに特有な糖単位のうちただ
１つ、さらに詳しくは２位において硫酸化されたα−Ｌ
−イズロン酸の単位に関する、２，３−エポキシグロニ
ック単位への変換を含む修飾を示すということが証明さ
れた。
【０００５】同様に、１つの２，３−エポキシグロニッ
ク単位を有する半合成グリコサミノグリカンならびにヘ
パリンまたはヘパラン構造を有するグリコサミノグリカ
ンも、ＥＰ−０３８０９４３に記載されているのと同様
の反応の条件で、２位において硫酸化されたα−Ｌ−イ
ズロン酸糖単位に関する、用いられる反応の条件に従っ
てこの糖単位を非硫酸化α−Ｌ−イズロン酸またはα−
Ｌ−ガラクツロン酸の単位へ変換することを含む構造修
飾を受けることが証明されている。
【０００６】それゆえ、ＥＰ−０３４７５８８には出発
点として必要とされるα−Ｌ−イズロン酸−２−ｏ−硫
酸の単位の２および３位の間にエポキシ基を含む半合成
グリコサミノグリカンならびにそれらをえるために必要
な反応の条件が記載されている。一方、ＥＰ−０３８０
９４３には、１単位の非硫酸化α−Ｌ−イズロン酸また
はα−Ｌ−ガラクツロン酸を有するとして確認される、
エポキシドのさらなる変換に由来する生成物ならびにエ
ポキシド自体から出発して、またはその代わりにＥＰ−
０３４７５８８において出発物質として用いられている
ヘパリンまたはヘパラン構造を有するグリコサミノグリ
カン自体から出発して前記生成物をえるために必要な反
応の条件が記載されている。
【０００７】本発明の主題は、求核基によって２位を置
換されたα−イズロン酸を含むことを特徴とするヘパリ
ンまたはヘパラン構造を有する新規な半合成グリコサミ
ノグリカンである。
【０００８】この出願の特許請求の範囲に記載の新規誘
導体は、技術水準に関して、とくに前記の公開された２
つの欧州特許出願に関してさらなる進歩を表わすもので
ある。実際、後者の特許においては、塩基性水性媒体
中、水を求核剤として用いてえられた生成物が特許請求
の範囲に記載されている。この特許出願では、一連の、
注意深く選択された求核剤で、ウロニック単位の２位に
おいて対応する求核基の導入がえられるような条件で反
応させることにより新規生成物がえられる。
【０００９】本発明の別の目的は、適切な求核剤からお
よびＥＰ−０３４７５８８に記載のエポキシ化合物から
出発して前記生成物をえるための方法からなる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式（Ｉ
Ｖ）：
【００１１】
【化５】
【００１２】（式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋
ｑ＝ｍで表わされるｍおよびｎは１から１００の間のい
ずれかの整数を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部
（ＳＯ3 - ）を、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 は求核基を表わす。
ただし、この一般式は主な糖単位の組成を示すことを意
図するものであり、それらの配列に言及するものではな
い）で示されるヘパリンまたはヘパラン構造を有する半
合成グリコサミノグリカン、ならびにＥＰＯ−３４７５
８８記載の製法によりえられる一般式（ＩＩＩ）：
【００１３】
【化６】
【００１４】（式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋
ｑ＝ｍで表わされるｍおよびｎは１から１００の間のい
ずれかの整数を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部
（ＳＯ3 - ）を表わす。ただし、この一般式は主な糖単
位の組成を示すことを意図するものであり、それらの配
列に言及するものではない）で示される２，３−エポキ
シグロニック構造を有する半合成グリコサミノグリカン
を、一般式（ＩＩ）：
【００１５】
【化７】
【００１６】で示される求核基を有する求核剤と、溶媒
ならびに求核剤中に存在するいかなる酸基も塩にするの
におよび（または）求核剤が酸性の物質と形成しうるい
かなる塩からも同じ求核剤を放出するのに充分な量の無
機もしくは有機塩基の存在下で、任意に不活性ガス雰囲
気中で、２から１２０時間の間、０℃から７０℃の間の
温度で撹拌下に保って反応させて、反応溶媒が水以外で
あるときには水で反応混合物を希釈し、塩酸水溶液を加
えて水溶液のｐＨを中和し、任意に水に混和しない溶媒
で抽出するかまたは濾過によって過量の求核剤を除き、
任意にその水溶液を流水および蒸留水で透析し、ならび
にその水溶液を凍結乾燥または適切な溶媒を加えて沈殿
させることにより単離する一般式（ＩＶ）：
【００１７】
【化８】
【００１８】（式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋
ｑ＝ｍで表わされるｍおよびｎは１から１００の間のい
ずれかの整数を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部
（ＳＯ3 - ）を、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 は求核基を表わす）
で示されるヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成
グリコサミノグリカンの製造法に関する。
【００１９】
【実施例】本発明の分野をよりよく定義するために、
「ヘパリンまたはヘパラン構造を有するグリコサミノグ
リカン」の語は、スロンボシス アンド ヘモスタシス
(Thrombosis and Haemostasis)66，44〜48(1991)におい
てリンダール ユー(Lindhal U.)、クジェレン エル(K
jellen L.)によりおよびバイオケミカル ジャーナル(B
iochem. J.) 273 、553 〜559(1991) においてターンブ
ル ジェイイー(Turnbull J. E.)、ガラジャー ジェイ
ティー(Gallagher J. T.) により記載されているよう
に、１，４−グリコシド結合により互い違いに連なっ
た、ウロン酸（α−Ｌ−イズロン酸またはβ−Ｄ−グル
クロン酸であってよい）とα−Ｄ−グルコサミンとから
なる二糖単位を有することを特徴とする、約 3,000から
約50,000ダルトンの間の分子量を有する多糖類を示すこ
とを意図するものであることを指摘しておきたい。α−
Ｌ−イズロン酸は２位を硫酸化することができ、グルコ
サミンはＮ−アセチル化、Ｎ−硫酸化、６−Ｏ−硫酸
化、３−Ｏ−硫酸化が可能であるので、置換基の様々な
位置により、少なくとも１０の異なる二糖単位が可能で
あり、その組合せにより多数の異なる配列がえられる。
最も代表的な二糖単位および最も頻繁な配列を心に留め
つつ、合理的な近似でもって、ヘパリンまたはヘパラン
構造を有するグリコサミノグリカンは一般式（Ｉ）：
【００２０】
【化９】
【００２１】（式中、Ｒは水素原子または硫酸残部（Ｓ
Ｏ3 - ）を表わし、ｍおよびｎは１から１００の間のい
ずれかの整数を表わす）で示されうると言うことができ
る。
【００２２】天然のヘパリン構造のグリコサミノグリカ
ンでは、ｍの値は高く、二糖単位Ａは二糖単位の約８０
％を示す。これに対して天然のヘパラン構造のグリコサ
ミノグリカンでは、ｎの値が高く、二糖単位Ｂが二糖単
位の約８０％を示す。
【００２３】一般式（Ｉ）および後述の一般式（ＩＩ
Ｉ）および（ＩＶ）は主な糖単位の組成を示すことを意
図するものであり、それらの配列に言及するものではな
い。
【００２４】当業者に知られているように、天然のグリ
コサミノグリカンを、たとえばＮ−脱硫酸の反応によ
り、あるいはつづくＮ−アセチル化反応により、化学修
飾することが可能である。このようにして、半合成Ｎ−
脱硫酸化ヘパリンまたはＮ−脱硫酸化−Ｎ−アセチル化
ヘパリンをえることもできる。さらに、これらのグリコ
サミノグリカンは、天然であろうと半合成であろうと、
解重合の工程に付すことができ、それによって分子量は
概して3,000 から10,000ダルトンの間の水準をとる。
【００２５】ヘパリンまたはヘパラン構造を有する新規
な半合成グリコサミノグリカンをえるための本発明にお
いて記載される構造修飾は、どんなヘパリンまたはヘパ
ラン構造を有する所望の化合物であっても、求核基によ
る２位のＯ−硫酸基の部分的または全体的選択的置換が
起こるα−Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸の単位に帰す
る。実際、選択的であるほかにも、本発明において記載
される化学的方法は、起こりうるすべての配列のヘパリ
ンまたはヘパラン構造を有するグリコサミノグリカンに
適用可能である。すなわち、構造修飾の反応の目的であ
るα−Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸の単位の前または
後に連なる糖単位のタイプおよび官能基の水準によらな
い。
【００２６】新規生成物の構造は、一般式（ＩＶ）：
【００２７】
【化１０】
【００２８】（式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋
ｑ＝ｍである。ｍ、ｎおよびＲは前記と同じ、−Ｚ（Ｒ
2 ）Ｒ1 はこの発明の方法により導入される求核基を表
わす）で示される。このようにしてえられる化合物を、
「一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有す
る半合成グリコサミノグリカン」として示す。
【００２９】部分的にまたは全体的にα−Ｌ−イズロン
酸の２位にの求核基を導入することを含む構造修飾の反
応の結果、グリコサミノグリカンの解重合またはそれら
を形成する多糖鎖の分子量分布の変換は起こらない。こ
のため、本反応は、いかなる分子量のヘパリンまたはヘ
パラン構造を有するグリコサミノグリカンに対しても適
用可能である。しかしながら、えられる生成物は既知の
化学的または酵素的解重合の工程に付すことができる。
【００３０】本発明の主題は、ヘパリンまたはヘパラン
構造を有する、新規な半合成グリコサミノグリカンおよ
び、一般式（Ｉ）：
【００３１】
【化１１】
【００３２】（式中、Ｒは水素原子または硫酸残部（Ｓ
Ｏ3 - ）を表わし、ｍおよびｎは１から１００の間のい
ずれかの整数を表わす）で示される最初の構造が、α−
Ｌ−イズロン酸−２−Ｏ−硫酸の２位で−Ｏ−硫酸基の
一般式（ＩＩ）：
【００３３】
【化１２】
【００３４】で示される求核基への部分的または全体的
変換が起こって、一般式（ＩＶ）：
【００３５】
【化１３】
【００３６】（式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋
ｑ＝ｍで表わされるｍおよびｎは１から１００の間のす
べての整数を表わす。Ｒは水素原子または硫酸基（ＳＯ
3 - ）を、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 は求核基を表わす）で示さ
れるヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコ
サミノグリカンが形成されることに関する。すべての求
核剤が本発明を行なうにおいて役に立つ。実際、−Ｚ
（Ｒ2 ）Ｒ1 基はあらゆるタイプの求核剤を含む。
【００３７】または、Ｚは酸素原子、硫黄原子、または
チッ素原子、Ｒ1 は置換されたまたは非置換の、直鎖も
しくは分枝鎖状Ｃ１〜12のアルキル基、アミノ基、アリ
ール基、ジアゾ基または水酸基であって、ならびにＲ2
は存在しないか、または水素原子または直鎖もしくは分
枝鎖状Ｃ１〜６のアルキル基を表わすかまたはＲ1 と共
にヘテロ環を形成する。Ｒ1 で表わされる置換基は、置
換されたもしくは非置換の、ハロゲン原子、アミノ基、
アリール基、カルボキシル基、グアニジノ基、ニトロ
基、水酸基、スルホン基、スルフリック(sulfuric)基、
チオール基またはウレイド基でありうる。
【００３８】前記の求核基としては、一級もしくは二級
アミン、二級ヘテロ環式アミン、アミノアルコール、ア
ミノチオール、アミノ酸、アミノエステル、ペプチド、
アルコール、フェノール、メルカプタン、ジチオール、
チオフェノール、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒ
ドラジドおよびアジ化ナトリウムから誘導される基が本
発明を実施するうえで好ましい。
【００３９】本発明を実施するうえで実際に好ましいの
は、以下の求核剤から生じる、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 であ
る：グリシン、グリシルグリシン、Ｌ−システイン、ア
セチル−Ｌ−システイン、Ｌ−システインエチルエステ
ル、２−アミノチオフェノール、１，３−プロパンジチ
オール、システアミン、アジ化ナトリウム、２−アミノ
エチル重硫酸塩、タウリン、チオグリコール酸、β−ア
ラニンエチルエステル、Ｌ−シスチン、ヒドロキシルア
ミン、グリシルタウリン、システイニルタウリン、グリ
シルシステイン、グリシルフェニルアラニン、グリシル
チロシン、２−アミノエタノール、２−アミノエタノー
ルとグリシンのエステル、２−アミノエタノールとグリ
シンのアミド、アルギニルリジン、アルギニン、リジ
ン、酢酸と２−アミノエタノールのエステル、サリチル
酸、メチオニン、グリシルプロリン、γ−アミノ酪酸、
リジルプロリルアルギニン、スレオニルリジルプロリ
ン、スレオニルリジン、プロリルアルギニン、リジルプ
ロリン、コリン、４−（３−アミノプロピル）−２−ヒ
ドロキシ安息香酸または４−（２−アミノエチル）−２
−ヒドロキシ安息香酸。
【００４０】本発明の別の目的は、ＥＰ−０３４７５８
８記載の製法によりえられる一般式（ＩＩＩ）：
【００４１】
【化１４】
【００４２】（式中、ｐ、ｑ、ｎおよびＲは前記と同
じ）で示される２，３−エポキシグロニック構造を有す
る半合成グリコサミノグリカンから出発する、一般式
（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成
グリコサミノグリカンの合成のために用いる方法であ
る。
【００４３】一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン
構造を有する半合成グリコサミノグリカンをえるための
方法は、溶媒ならびに求核剤中に存在するいかなる酸基
も塩にするのにおよび（または）求核剤が酸の性質を有
する物質と形成しうるいかなる塩からも同じ求核剤を放
出するのに充分な量の無機もしくは有機塩基の存在下
で、一般式（ＩＩＩ）の２，３−エポキシグロニック構
造を有する半合成グリコサミノグリカンを、一般式（Ｉ
Ｉ）に含まれる基を有する求核剤と反応させることを包
含する。求核剤は酸の性質を有する基を含まず、および
（または）酸の性質を有する物質で塩化されないばあい
は、いかなる塩基を用いることも明らかに不要である。
その反応は、一般式（ＩＩＩ）の２，３−エポキシグロ
ニック構造を有するグリコサミノグリカンを溶媒に溶解
させること、ならびに求核剤および無機もしくは有機塩
基を含有する溶液を加えることにより行なわれる。
【００４４】反応混合物は撹拌下に、求核剤は容易に酸
化されうるばあいはできる限り不活性ガス、好ましくは
チッ素中で、０℃から７０℃、好ましくは１０℃から３
０℃の間の温度に、２から１２０時間、好ましくは２４
から９６時間の間保たれる。
【００４５】反応の終わりに、用いられる溶媒が水でな
いときには反応混合物を水で希釈し、つぎに水溶液に塩
酸の水溶液を加えてｐＨを中性にする。過量の求核剤は
任意に、たとえば水と混和しない溶媒、クロロホルムま
たはジエチルエーテルで抽出するか、または中性のｐＨ
では水性媒体に溶けないときは濾過により除いてもよ
い。澄明な水溶液を、最初流水中で、つぎに蒸留水中
で、３０００ダルトン以下を除く透析を行なうことによ
り、のちの段階で精製してもよい。最後に、一般式（Ｉ
Ｖ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリ
コサミノグリカンを、それを含む水溶液の凍結乾燥によ
り、または適切な溶媒を加えて沈殿させることにより単
離する。
【００４６】用いる求核剤の量は、エポキシ基を有する
一般式（ＩＩＩ）で示される半合成グリコサミノグリカ
ンの二量体単位に関して、１から２００モル当量の間で
あり、好ましくは１０から１００当量が用いられる。溶
媒は、水ならびに、ジメチルアセトアミド、ジメチルホ
ルムアミド、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒド
ロフランのような極性溶媒またはそれらと水との混合物
から選ばれる。好ましい無機塩基は、アルカリもしくは
アルカリ土類水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムも
しくは水酸化カリウムであり、一方、好ましい有機塩基
はトリエチルアミンのような三級アミンである。
【００４７】本発明の好ましい態様では、反応は、まず
一般式（ＩＩＩ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有す
る半合成グリコサミノグリカンを水中に溶解し、撹拌
下、エポキシ基を含む一般式（ＩＩＩ）のグリコサミノ
グリカンの二量体単位に関して１０から１００モル当量
の求核剤ならびに求核剤中に存在するいかなる酸基も塩
にするのにおよび（または）求核剤が酸の性質を有する
物質と共に形成しうる塩から同じ求核剤を放出するのに
充分な量の水酸化ナトリウムを含有する水溶液に加える
ことにより行なわれる。反応混合物中、半合成グリコサ
ミノグリカンの濃度は、好ましくは１％から５％の間で
あり、その反応混合物を撹拌下、任意に不活性ガス雰囲
気中で、２４から９６時間の間室温に保つ。反応の最後
に、混合物のｐＨを塩酸水溶液にて中和し、水と混合し
ない溶媒による受動抽出によるかまたは濾過によって過
量の求核剤を除いてもよく、反応溶液を最初に流水でつ
ぎに蒸留水で６から２４時間の間３０００ダルトン以下
を除く透析に付してもよい。その溶液を凍結乾燥に付す
ことより、または適切な溶媒をそれに加えることによ
り、一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有
する半合成グリコサミノグリカンをえる。
【００４８】このようにしてえられる半合成グリコサミ
ノグリカンの特徴は、α−Ｌ−イズロン酸の２−Ｏ−硫
酸基を欠いており、これがアミン、アミノ酸、アミノエ
ステル、ペプチド、アルコール、メルカプタン、フェノ
ール、チオフェノールのような求核剤の一部である、ヘ
テロ原子、チッ素、硫黄もしくは酸素原子により置換さ
れていることである。このようにして共有結合が、ヘパ
リンまたはヘパラン構造を有するグリコサミノグリカン
の分子と求核基の間に導入される。求核基で前記グリコ
サミノグリカンの構造特性を修飾することにより、グリ
コサミノグリカンの経口で吸収される可能性が向上し、
かつ出血時間および抗凝血活性の有意な減少を示すとい
う利点と共に抗血栓特性を維持する。こうして本発明に
記載されるヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成
グリコサミノグリカンは、動物においてインビボで行な
われる薬理学的出血テストにより明らかに証明されるよ
うに、出血の危険性が低くありながら天然のヘパリンま
たはヘパラン構造を有するグリコサミノグリカンに関し
て、根本的に等しい抗血栓および血栓溶解活性という、
および経口で吸収されるという利点を有している。
【００４９】本発明の課題である新規半合成グリコサミ
ノグリカンの生物学的活性は、いくつかの典型的ヘパリ
ンテストで明らかにされた；より詳しくは、ＡＰＴＴに
関するテスト、出血時間に関するテストおよび抗血栓活
性に関するテストを行なった。
【００５０】ＡＰＴＴ活性は、ラリー エムジェイ(Lar
rieu M. J.) およびウェイランドジー(Weiland G.)のレ
ビュー ド エマトロジー(Rev. Hematol.) 12、 199、
(1957)に従って定義された。
【００５１】試験する各生成物を、絶食ラットより採集
した血漿中に溶かし、つぎにスカラー希釈を行なって、
この方法に必要な濃度とする。各生成物につき１０測定
を行ない、各生成物の活性を、ＡＰＴＴの時間を二倍に
する濃度ｍｃｇ／ｍｌによって表わした。
【００５２】えられた値により、新規な半合成グリコサ
ミノグリカンは標準ヘパリンに関して、抗凝血力におい
て減少が見られることが確かめられる。
【００５３】出血時間は、デジャナー イー(Dejana
E.) らによりスロンボシス アンドヘモスタシス48、 1
08、(1982)に記載された方法に従ってラットで測定し、
結果は、コントロールのラットに対して新規半合成グリ
コサミノグリカンで処置されたラットにおける出血の時
間の延長の割合を計算することにより表わした。
【００５４】新規半合成グリコサミノグリカンでは、標
準ヘパリンに対して出血時間における減少が見られる。
抗血栓活性は、ラットにおけるレイヤーズ エス(Reyer
s S.) らによりスロンボシス リサーチ(Thromb. Res.)
18、 669〜 674(1980)に記載された、うっ血静脈血栓テ
スト(stasis venous thrombosis test) によって測定さ
れた。血栓の形成を妨げる能力を評価するため、生成物
を、下大静脈の結紮を行なう１０分前、大腿部へ静脈注
射する。２時間後に血栓を除き、乾燥させて重量を測定
する。
【００５５】抗血栓活性は発生率（血栓を示すラットの
割合）として、およびコントロール血栓に対する血栓の
重量の減少としての両方により表わされた。
【００５６】いずれのばあいにも、結果はＥＤ50（ｍｇ
／ｋｇ）として表わされた。
【００５７】えられた結果より、新規半合成グリコサミ
ノグリカンの抗血栓活性は標準ヘパリンの活性と同様で
あることが証明された。
【００５８】遊離アミノ基の測定は、サタケ ケー(Sat
ake K.) らによりジャーナル オブバイオケミストリー
(J. Biochem.) 、47、 654、(1960)に記載された方法に
従って、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と
反応させることによりえられた生成物について３５８ｎ
ｍで紫外／可視分光測光により行なった。一方、硫黄の
測定は電位差測定によって行なった。比施光度は１％濃
度の水溶液で測定した。
【００５９】13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、５０．３ＭＨ
ｚにて、バリアン ジェミニ２００スペクトロメーター
（商品名、バリアン アソシエーツ アナリティカル
インスツルメンツ(VARIAN ASSOCIATES ANALYTICAL INST
RUMENTS)社製）で、２，２位および３，３位で重水素化
（Ｄ4 ）された３−（トリメチルシリル）プロピオン酸
のナトリウム塩を内部標準試料として用いて行なった。
【００６０】本発明に記載された新規グリコサミノグリ
カンの生物学的活性を評価するために基準として採用さ
れた標準ヘパリンは、前記のテストにより以下の薬理学
的活性の値を示した： ＡＰＴＴ（２Ｔ）＝２．５ｍｃｇ／ｍｌ 出血時間：０．５ｍｇ／ｋｇで１１１％ 抗血栓活性（ＥＤ50）： 重量減少＝０．２０ｍｇ／ｋｇ 発生率％＝０．４０ｍｇ／ｋｇ 基準として採用された標準ヘパリンに関する、前記の方
法で測定された化学的および物理的データは：
【００６１】
【化１５】
【００６２】以下の実施例は本発明の限定としてではな
く、説明として考えられなくてはならない。
【００６３】実施例１ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がグリシルに相当する一般式（ＩＶ）
のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサ
ミノグリカン ２２．５ｍｌの水に３７６０ｍｇのグリシンおよび２０
００ｍｇの水酸化ナトリウムを含有する溶液を、室温に
て、２．５ｍｌの水に、後述の参考例１でえられた２，
３−エポキシグロニック構造を有する半合成グリコサミ
ノグリカン（ヘパリン由来２，３−エポキシグロン酸含
有グリコサミノグリカン）を５００ｍｇ含有する溶液に
加えた。
【００６４】反応混合物を撹拌下に室温で４８時間保
ち、つぎに塩酸を加えてｐＨを中性にし、その溶液を流
水中で１２時間、蒸留水中で６時間、３０００ダルトン
以下を除く透析に付し、最後に凍結乾燥した。以下の分
析的、薬理学的特性を有する、５２０ｍｇの標題の生成
物がえられた：
【００６５】
【化１６】
【００６６】実施例２ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がグリコシルグリシルに相当する一般
式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合
成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに６６００ｍｇのグリ
シルグリシンを用いて、反応時間を９６時間に延長し
て、実施例１に記載したと同じ条件で反応を行なった。
【００６７】以下の分析的特性を有する６３０ｍｇの標
題の生成物がえられた：
【００６８】
【化１７】
【００６９】実施例３ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｓ）−Ｌ−システイニルに相当す
る一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有す
る半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに８７８０ｍｇの塩酸
Ｌ−システイン１水和物および水酸化ナトリウムを２０
００ｍｇでなく４０００ｍｇ用いて、実施例１に記載し
たと同じ条件で反応を行なった。
【００７０】以下の分析的および薬理学的特性を有する
５７０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００７１】
【化１８】
【００７２】実施例４ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｓ）−Ｌ−システイニルエチルエ
ステルに相当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパ
ラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに９２８０ｍｇの塩酸
Ｌ−システインエチルエステルを用いて、実施例１に記
載したと同じ条件で反応を行なった。
【００７３】以下の分析的および薬理学的特性を有する
５５０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００７４】
【化１９】
【００７５】実施例５ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｓ）−２−アミノフェニルチオに
相当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造
を有する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに６３００ｍｇの２−
アミノチオフェノールを用いて、反応時間を７２時間に
延長して、実施例１に記載したと同じ条件で反応を行な
った。反応の最後に、塩酸を加えてｐＨを中和したの
ち、クロロホルムで抽出することにより過量のアミノチ
オフェノールを除去した。つぎにその水溶液を実施例１
に記載したように透析および凍結乾燥に付して、以下の
分析的および薬理学的特性を有する６９０ｍｇの標題の
生成物がえられた：
【００７６】
【化２０】
【００７７】実施例６ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が１，３−プロパンジチオ−１−イル
に相当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構
造を有する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに５３９０ｍｇの１，
３−プロパンジチオールを用いて、反応時間を９０時間
に延長して、チッ素雰囲気中実施例１に記載したと同じ
条件で反応を行なった。
【００７８】以下の分析的特性を有する６３０ｍｇの標
題の生成物がえられた：
【００７９】
【化２１】
【００８０】実施例７ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｎ）−２−アミノエチル二硫酸に
相当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造
を有する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに７０５０ｍｇの２−
アミノエチル二硫酸塩を用いて、反応混合物を透析する
前に濾過して、実施例１に記載したと同じ条件で反応を
行なった。
【００８１】以下の分析的および薬理学的特性を有する
５１０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００８２】
【化２２】
【００８３】実施例８ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がタウリニルに相当する一般式（Ｉ
Ｖ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリ
コサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに６２６０ｍｇのタウ
リンを用いて、反応時間を７２時間に延長して、実施例
１に記載したと同じ条件で反応を行なった。
【００８４】以下の分析的および薬理学的特性を有する
５６０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００８５】
【化２３】
【００８６】実施例９ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｓ）−カルボキシメチルチオに相
当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を
有する半合成グリコサミノグリカン ２０ｍｌの水に７４１６ｍｇのチオグリコール酸および
６４５０ｍｇの水酸化ナトリウムを含有する溶液を用い
て、反応時間を７２時間に延長して、チッ素雰囲気中
で、実施例１に記載したと同じ条件で反応を行なった。
【００８７】以下の分析的および薬理学的特性を有する
４５０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００８８】
【化２４】
【００８９】実施例１０ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｓ）−２−アミノエチルチオに相
当する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を
有する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに５７００ｍｇの塩酸
システアミンを用いて、反応時間を７２時間に延長し
て、チッ素雰囲気中で、実施例１に記載したと同じ条件
で反応を行なった。
【００９０】以下の分析的および薬理学的特性を有する
４９０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００９１】
【化２５】
【００９２】実施例１１ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がβ−アラニンエチルエステルに相当
する一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有
する半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに７６８０ｍｇの塩酸
β−アラニンエチルエステルを用いて、反応時間を７２
時間に延長して、実施例１に記載したと同じ条件で反応
を行なった。
【００９３】以下の分析的特性を有する４８０ｍｇの標
題の生成物がえられた：
【００９４】
【化２６】
【００９５】実施例１２ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がアジドに相当する一般式（ＩＶ）の
ヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサミ
ノグリカン チッ素雰囲気中で、２０ｍｌの水に後述の参考例１でえ
られた２，３−エポキシグロニック構造を有する半合成
グリコサミノグリカン（ヘパリン由来２，３−エポキシ
グロン酸含有グリコサミノグリカン）５００ｍｇおよび
６５００ｍｇのアジ化ナトリウムを溶解させた。反応混
合物を撹拌下に室温で９６時間保ち、つぎに塩酸水溶液
で中和したのちにその溶液を１２時間流水中で、および
６時間蒸留水中で透析に付した。えられた溶液を凍結乾
燥して、以下の分析的および薬理学的特性を有する４１
０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【００９６】
【化２７】
【００９７】実施例１３ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 が（Ｎ）−ヒドロキシアミノに相当す
る一般式（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有す
る半合成グリコサミノグリカン ３７６０ｍｇのグリシンのかわりに３４７０ｍｇの塩酸
ヒドロキシルアミンを用いて、実施例１に記載したと同
じ条件で反応を行なった。反応の最後に、溶液のｐＨは
中性になるので、塩酸水溶液を加えて溶液を中和するこ
とは必要でない。
【００９８】以下の分析的および薬理学的特性を有する
５００ｍｇの標題の生成物がえられた。
【００９９】
【化２８】
【０１００】実施例１４ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がＬ−シスチニルに相当する一般式
（ＩＶ）のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成
グリコサミノグリカン ７０ｍｌの水に４０００ｍｇの水酸化ナトリウムおよび
１２０１０ｍｇのＬ−シスチンを溶解させ、２．５ｍｌ
の水に後述の参考例１でえられた２，３−エポキシグロ
ニック構造を有する半合成グリコサミノグリカン（ヘパ
リン由来２，３−エポキシグロン酸含有グリコサミノグ
リカン）を５００ｍｇ含んだ溶液を加えた。反応混合物
を撹拌下に室温で４８時間保ち、つぎに塩酸水溶液を加
えることにより中和した。生じた固体残渣を濾過して除
き、澄明な溶液を流水で１２時間、蒸留水で６時間透析
し、最後に凍結乾燥した。
【０１０１】以下の分析的および薬理学的特性を有する
７３０ｍｇの標題の生成物がえられた：
【０１０２】
【化２９】
【０１０３】実施例１５ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がグリシルに相当する一般式（ＩＶ）
のヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサ
ミノグリカン 後述の参考例２記載の２，３−エポキシグロニック構造
を有する半合成グリコサミノグリカン（ヘパリン由来
２，３−エポキシグロン酸含有グリコサミノグリカン）
を５００ｍｇを用いて実施例１に記載したと同じ条件で
反応を行なった。
【０１０４】以下の分析的特性を有する５１０ｍｇの標
題の生成物がえられた：
【０１０５】
【化３０】
【０１０６】実施例１６ −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 がグリシルに相当する一般式（ＩＶ）
のヘパラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン 市販のヘパリンナトリウムに代えて、ウシ脾臓からえら
れた市販ヘパラン（オポクリン（ＯＰＯＣＲＩＮ）、商
品名、オポクリン エッセ ピー アー（ＯＰＯＣＲＩ
Ｎ Ｓ．ｐ．Ａ）製）を用いて後述の参考例１の方法に
したがって以下の分析的特性を有する、一般式（ＩＩ
Ｉ）の２，３−エポキシグロニック構造を有する半合成
グリコサミノグリカンが製造された：
【０１０７】
【化３１】
【０１０８】この一般式（ＩＩＩ）の２，３−エポキシ
グロニック構造を有する半合成グリコサミノグリカン５
００ｍｇを、実施例１に記載したと同じ条件でグリシン
と反応させる。
【０１０９】以下の分析的特性を有する４８０ｍｇの標
題の生成物がえられた：
【０１１０】
【化３２】
【０１１１】参考例１ ２，３−エポキシグロニック構造を有する半合成グリコ
サミノグリカン 市販のヘパリンナトリウム２５ｇを水２０００ｍｌに溶
解し、水２０００ｍｌに溶解させた酢酸カルシウム一水
和物１１１．２ｇ、酢酸５７ｍｌおよびエチルアルコー
ル６００ｍｌを含有する溶液中に、前記水溶液を温度を
８〜１０℃に保ちながら、約３０分間かけて注いだ。５
℃で１５時間放置したのち、えられた懸濁液をろ過し、
ろ液にエチルアルコール１０００ｍｌを加える。５℃で
３時間放置したのち、えられた沈殿をろ過した。沈殿物
を水２００ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を
用いてｐＨ ７．０にした。そののち、Ｄｏｗｅｘ ５
０ＷＸ８（ナトリウム型）樹脂１００ｍｌおよび水７０
ｍｌを用いて２０分間処理した。溶液および樹脂を、同
じ樹脂８０ｍｌをつめたクロマトグラフィー用のカラム
（直径：１．６ｃｍ、長さ：１０ｃｍ）に移した。溶液
を浸出し、全溶液量が４００ｍｌになるまで蒸留水で溶
出したのち、この溶液と、酢酸ナトリウム三水和物１２
ｇおよびエチルアルコール１０００ｍｌとを合わせた。
沈殿をろ過し、真空下で乾燥して、精製されたヘパリン
ナトリウムを１９．２ｇえ、ＡＬＦＡ ８７−７８とし
た。以下に用いた市販のヘパリンナトリウムおよびえら
れたＡＬＦＡ ８７−７８の物理化学的特性を示す。
【０１１２】
【化３３】
【０１１３】ヘパリンＡＬＦＡ ８７−７８ １．８ｇ
を水酸化ナトリウム４．８ｇ（１Ｎ）を含有する水溶液
１２０ｍｌに加えた。３．５時間６０℃に保温し、酢酸
で中性にしたのち、流水で一夜、および蒸留水で６時間
透析した。溶液に酢酸ナトリウム３．５ｇを加え、酢酸
で中性にし、エタノールを２．５倍量加えた。沈殿をろ
過し、エタノール６に対して水１の割合の混合液で洗浄
したのち、乾燥して生成物を１．７ｇえた。以下に特徴
的なシグナルをもつ13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１１４】δ（ｐｐｍ）： 177.4、 104.6、 101.7、
98.6、98.4、97.2、96.8、79.7、79.1、78.6、73.5、7
2.5、72.3、72.1、71.5、68.8、62.6、60.4、60.2、54.
0、53.1 参考例２ ２，３−エポキシグロニック構造を有する半合成グリコ
サミノグリカン 低分子量ヘパリンナトリウムＬＭＷ ＡＬＦＡ ８６−
０２は、国際特許公開公報(international patent publ
ication)第86／06729 号明細書記載の方法にしたがっ
て、銅イオンの存在下、過酸化水素を用いた解重合反応
によってえた。以下に物理化学的特性を示す。
【０１１５】
【化３４】
【０１１６】ヘパリンＬＭＷ ＡＬＦＡ ８６−０２
１．８ｇを、水酸化ナトリウム０．０８ｇ（０．０４
Ｎ）、酢酸ナトリウム２．６ｇ（０．６２５Ｎ）および
水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇを含有する水溶液５０
ｍｌに加えた。２１０分間６０℃に保温し、室温に冷却
したのち、まずアニオン樹脂Ｄｏｗｅｘ １ Ｘ４（Ｏ
Ｈ- 型）をつめたカラム（直径：１．２ｃｍ、長さ：１
０ｃｍ）で、次にカチオン樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ ＷＸ
８（Ｈ+ 型）をつめたカラムで浸出を行なった。浸出液
および洗液を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中性にした
のち、酢酸ナトリウム４ｇを加えて、エタノールを２．
５倍量加えた。えられた沈殿を、エタノール６に対して
水１の割合の混合液で洗浄したのち、乾燥して生成物
１．４ｇをえた。特徴的なピークを示す13Ｃ−ＮＭＲス
ペクトルを以下に示す。
【０１１７】δ（ｐｐｍ）： 177.4、 104.6、 101.9、
99.4、98.6、98.4、97.2、96.8、79.9、78.6、72.3、7
1.9、68.8、62.6、60.3、54.1、53.1
【０１１８】
【発明の効果】本発明により、経口的にも吸収可能で、
出血の危険性が低く、抗凝血活性の少ない良好な抗血栓
性を有する新規なグリコサミノグリカンがえられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャンフランコ タマニョーネ イタリア共和国、40033 カサレッキオ ジ レーノ ボローニャ、ビア ロン ザニ、55 (72)発明者 ファブリツィオ ウンガレルリ イタリア共和国、40134 ボローニャ、 ビア デルラ クロセッタ、11

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式（ＩＶ）： 【化１】 （式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋ｑ＝ｍで表わ
    されるｍおよびｎは１から１００の間のいずれかの整数
    を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部（ＳＯ3 - ）
    を、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 は求核基を表わす。ただし、この
    一般式は主な糖単位の組成を示すことを意図するもので
    あり、それらの配列に言及するものではない）で示され
    るヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサ
    ミノグリカン。
  2. 【請求項２】 Ｚが酸素原子、硫黄原子またはチッ素原
    子であって、Ｒ1 が置換されたまたは非置換の、直鎖も
    しくは分枝鎖状Ｃ１〜12のアルキル基、アミノ基、アリ
    ール基、ジアゾ基または水酸基であって、ならびにＲ2
    が存在しないか、または水素原子または直鎖もしくは分
    枝鎖状Ｃ１〜６のアルキル基であるかまたはＲ1 と共に
    ヘテロ環を形成する請求項１記載のヘパリンまたはヘパ
    ラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン。
  3. 【請求項３】 Ｒ1 で表わされる置換基が、置換された
    もしくは非置換の、ハロゲン原子、アミノ基、アリール
    基、カルボキシル基、グアニジノ基、ニトロ基、水酸
    基、スルホン基、スルフリック基、チオール基またはウ
    レイド基である請求項１記載のヘパリンまたはヘパラン
    構造を有する半合成グリコサミノグリカン。
  4. 【請求項４】 −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 で表わされる基が、一
    級もしくは二級アミン、二級ヘテロ環式アミン、アミノ
    アルコール、アミノチオール、アミノ酸、アミノエステ
    ル、ペプチド、アルコール、フェノール、メルカプタ
    ン、ジチオール、チオフェノール、ヒドロキシルアミ
    ン、ヒドラジン、ヒドラジドまたはアジ化ナトリウムに
    由来する請求項１、２または３記載のヘパリンまたはヘ
    パラン構造を有する半合成グリコサミノグリカン。
  5. 【請求項５】 −Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 で表わされる基が、グ
    リシン、グリシルグリシン、Ｌ−システイン、アセチル
    −Ｌ−システイン、Ｌ−システインエチルエステル、２
    −アミノチオフェノール、１，３−プロパンジチオー
    ル、システアミン、アジ化ナトリウム、２−アミノエチ
    ル重硫酸塩、タウリン、チオグリコール酸、β−アラニ
    ンエチルエステル、Ｌ−シスチン、ヒドロキシルアミ
    ン、グリシルタウリン、システイニルタウリン、グリシ
    ルシステイン、グリシルフェニルアラニン、グリシルチ
    ロシン、２−アミノエタノール、２−アミノエタノール
    とグリシンのエステル、２−アミノエタノールとグリシ
    ンのアミド、アルギニルリジン、アルギニン、リジン、
    酢酸と２−アミノエタノールのエステル、サリチル酸、
    メチオニン、グリシルプロリン、γ−アミノ酪酸、リジ
    ルプロリルアルギニン、スレオニルリジルプロリン、ス
    レオニルリジン、プロリルアルギニン、リジルプロリ
    ン、コリン、４−（３−アミノプロピル）−２−ヒドロ
    キシ安息香酸または４−（２−アミノエチル）−２−ヒ
    ドロキシ安息香酸に由来する請求項４記載のヘパリンま
    たはヘパラン構造を有する半合成グリコサミノグリカ
    ン。
  6. 【請求項６】 一般式（ＩＩＩ）： 【化２】 （式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋ｑ＝ｍで表わ
    されるｍおよびｎは１から１００の間のいずれかの整数
    を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部（ＳＯ3 - ）を
    表わす。ただし、この一般式は主な糖単位の組成を示す
    ことを意図するものであり、それらの配列に言及するも
    のではない）で示される２，３−エポキシグロニック構
    造を有する半合成グリコサミノグリカンを、一般式（Ｉ
    Ｉ）： 【化３】 で示される求核基を有する求核剤と、溶媒、ならびに求
    核剤中に存在するいかなる酸基も塩にするのにおよび
    （または）求核剤が酸の性質を有する物質と形成しうる
    いかなる塩からも同じ求核剤を放出するのに充分な量の
    無機もしくは有機塩基の存在下で、２ないし１２０時間
    の間、０℃から７０℃の間の温度で撹拌下に保って反応
    させて、反応溶媒が水以外であるときには水で反応混合
    物を希釈し、塩酸水溶液を加えて水溶液のｐＨを中和
    し、その水溶液を流水および蒸留水で透折し、ならびに
    その水溶液を凍結乾燥または適切な溶媒を加えて沈殿さ
    せることにより生成物を単離する一般式（ＩＶ）： 【化４】 （式中、ｐは０でない整数であって、ｐ＋ｑ＝ｍで表わ
    されるｍおよびｎは１から１００の間のいずれかの整数
    を表わす。Ｒは水素原子または硫酸残部（ＳＯ3 - ）
    を、−Ｚ（Ｒ2 ）Ｒ1 は求核基を表わす。ただし、この
    一般式は主な糖単位の組成を示すことを意図するもので
    あり、それらの配列に言及するものではない）で示され
    るヘパリンまたはヘパラン構造を有する半合成グリコサ
    ミノグリカンの製造法。
  7. 【請求項７】 求核剤の量が、エポキシ基を有する一般
    式（ＩＩＩ）で示される半合成グリコサミノグリカンの
    二量体単位に関して１から２００モル当量の間である請
    求項６記載の製造法。
  8. 【請求項８】 溶媒が、水ならびに、ジメチルアセトア
    ミド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジオキ
    サン、テトラヒドロフランから選ばれた極性溶媒または
    それらと水との混合物から選ばれたものである請求項６
    記載の製造法。
  9. 【請求項９】 用いられる塩基が、水酸化ナトリウム、
    水酸化カリウム、またはトリエチルアミンから選ばれた
    ものである請求項６記載の製造法。
  10. 【請求項１０】 一般式（ＩＩＩ）の２，３−エポキシ
    グロニック構造を有する半合成グリコサミノグリカンを
    水中に溶解し、撹拌下、エポキシ基を有する一般式（Ｉ
    ＩＩ）のグリコサミノグリカンの二量体単位に関して１
    ０から１００モル当量の求核剤ならびに求核剤中に存在
    するいかなる酸基も塩にするのにおよび（または）求核
    剤が酸の性質を有する物質と形成しうる塩から求核剤を
    放出するのに充分な量の水酸化ナトリウムを含有する水
    溶液に加え、つぎにその反応混合物を２４から９６時間
    の間室温に保ち、その時間ののち、反応混合物のｐＨが
    中性でないときには反応混合物のｐＨを塩酸水溶液で中
    和し、その反応溶液を流水および蒸留水で６から２４時
    間の間透折し、生成物を凍結乾燥により、または適切な
    溶媒を加えることによりその水溶液から単離する、請求
    項６記載の製造法。
  11. 【請求項１１】 反応後に反応混合物のｐＨを中和した
    のち、水と混和しない溶媒で抽出するかまたは濾過によ
    って過量の求核剤を除いてからその水溶液を流水および
    蒸留水で透析し、生成物の単離を行なう請求項６または
    １０記載の製造法。
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